JP2020506932A - 持続性が増加した生理活性物質の結合体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、生理活性物質、リンカー、及び生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質を含む、結合体、その製造方法、及びその製剤に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、生理活性物質、リンカー、及び生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質を含む、結合体、その製造方法、及びその製剤に関する。
生理活性ポリペプチドは、一般的に安定性が低くて容易に変性され、体内のタンパク質加水分解酵素によって分解されたり、比較的小さな大きさのために腎臓を介して容易に除去されるため、薬理成分として生理活性ポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質の薬物を患者に頻繁な投与する必要がある。しかし、ほとんど注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、生理活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために注射を介した頻繁な投薬が必要であるが、これは患者に苦痛を引き起こし、高い治療費用の原因となる。これらの問題点を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を増加させて、血中の薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。
一方、インスリンは人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンであって、血液内の余剰ブドウ糖を細胞に移して細胞にエネルギー源を供給する一方、血糖を正常レベルに維持させる役割をする。しかし、糖尿病患者の場合、これらのインスリンが不足したり、インスリン抵抗性及びベータ細胞の機能消失により、インスリンが正常な機能を示さず、血液内のブドウ糖をエネルギー源として用いることができなくなる。その結果、血中のブドウ糖のレベルが高い高血糖症状を示し、結局、尿に糖を排出することになる。これは、複数の合併症と連携されている。
したがって、インスリンの生成に異常がある（Ｔｙｐｅ Ｉ）、またはインスリン耐性による（Ｔｙｐｅ ＩＩ）糖尿病患者にはインスリン治療が必須的であり、インスリン投与により血糖を正常レベルに調節することができる。しかし、インスリンの場合、他のタンパク質及びペプチドホルモンと同様に、体内の半減期が極めて短く、継続的に反復投与をしなければならないという欠点がある。このような頻繁な投与は、患者に多大な苦痛や不便さを引き起こすことになる。したがって、タンパク質の生体内半減期を増加させて投与回数を減らすことにより、患者の生活の質を高めるための様々なタンパク質の剤形化研究と化学的結合体など（脂肪酸結合体、ポリエチレン重合体結合体）に対する研究が進められてきた。現在、市販中の持続型インスリンとして、サノフィ−アベンティス社（Sanofi-Aventis）の インスリングラルギン（insulin glargine、lantus、持続時間約２０〜２２時間）とノボノルディスク社（Novo Nordisk）のインスリンデテミル（insulin detemir 、levemir、持続時間約１８〜２２時間）及びトレシーバ（degludec、tresiba、持続時間約４０時間）がある。これらの持続性インスリンは血中インスリン濃度のピークがなく、基底インスリンとして適しているが、これらも半減期が十分に長くなくて、毎日１回または２回投与しなければならない不便さが依然として存在する。したがって、長期間投与する必要のある糖尿病患者における、投与頻度を大幅に下げて、患者の利便性を増加させるという目的を達成するには限界がある。
複数の先行論文（非特許文献１〜３）などは、体内インスリンの除去過程について記述されている。これを見ると、５０％以上のインスリンは腎臓から除去され、残りのインスリンは筋肉、脂肪、肝臓などの作用部位（target site）で受容体媒介クリアランス（receptor mediated clearance、ＲＭＣ）を介して除去されることが知られている。
したがって、前記ＲＭＣを避けながら、血中半減期が画期的に増加されて、患者の投与頻度を減らすことができる生理活性物質の製剤、特にインスリン製剤の開発の必要性はますます大きくなる状況である。
韓国公開特許第１０−２００９−０００８１５１号 国際公開特許ＷＯ２００９−０１１５４４ Ａ２ 韓国公開特許第１０−２０１２−０１３９５７９号 国際公開特許ＷＯ２０１２−１７３４２２ Ａ９ 韓国公開特許第１０−２０１２−０１３７２７１号 国際公開特許ＷＯ２０１２−１６９７９８ Ａ２ 韓国公開特許第１０−２００１−０００９１７１号 国際公開特許ＷＯ２００１−００４３２９ Ａ１ 国際公開特許ＷＯ２０１７／１１６２０５ Ａ１ 国際公開特許ＷＯ２０１７／１１６２０４ Ａ１ 国際公開特許ＷＯ２０１５／１８３０５４ 国際公開特許ＷＯ２０１６／０４３５３３ 国際公開特許ＷＯ２０１６／１０８５８６ 国際公開特許ＷＯ２０１７／００３１９１ 韓国公開特許第１０−２０１５−００８７１３０号 国際公開特許ＷＯ２０１５−１０８３９８ Ａ１ 韓国公開特許第１０−２０１７−００２６２８４号 国際公開特許ＷＯ２０１７−０３９２６７ Ａ１ 韓国特許公開番号第１０−２０１４−０１０６４５２号 国際特許公開第ＷＯ９７/３４６３１号 国際特許公開第ＷＯ９６/３２４７８号
Authier F et al (Biochem J. 1998 Jun 1;332 ( Pt 2):421-30.) Duckworth WC et al (Endocr Rev. 1998 Oct;19(5):608-24.) Valera Mora ME et al (J Am Coll Nutr. 2003 Dec;22(6):487-93.) H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 197 9
本発明の一つの目的は、生理活性物質の体内半減期延長のための目的を有した、生理活性物質の結合体を提供することにある。
具体的には、本発明は生理活性物質及びその生体内半減期を増加させうる物質がポリエチレングリコールを介して連結され、前記ポリエチレングリコールは、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさであることを特徴とする生理活性物質の結合体を提供する。
本発明のもう一つの目的は、前記結合体を含む、組成物を提供することにある。
具体的には、本発明は前記結合体を含む生体内持続性及び安定性が増加した持続性製剤を提供する。
また、本発明は前記結合体を含む、糖尿病の予防または治療用製剤を提供する。 本発明のもう一つの目的は、前記結合体を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、薬剤の製造に用いるための、前記結合体またはこれを含む組成物の用途を提供することにある。
前記課題を解決するための本発明の一つの様態は、生理活性物質の体内半減期延長のための目的を有した、生理活性物質の結合体を提供する。
一つの具体例において、本発明は生理活性物質及びその生体内半減期を増加させうる物質がポリエチレングリコールを介して連結され、前記ポリエチレングリコールは、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさであることを特徴とする生理活性物質の結合体に関する。
前記具体例に係る結合体において、前記結合体は下記式（１）で表されることを特徴とする：
Ｘ−Ｌ−Ｆ （１）；
ここで、
Ｘは、生理活性物質であり、
Ｌは、リンカーであって、０ｋＤａを超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールであり、
Ｆは、生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質である。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記結合体とＬが３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールであることだけが、他の結合体と比較して前記結合体は増加した生体内半減期を示すことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記Ｌは０ｋＤａ超え〜３ｋＤａ以下の大きさを有するポリエチレングリコールであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記生理活性物質は生理活性ポリペプチドであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記生理活性物質は、トキシン；またはＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト；グルカゴン受容体アゴニスト；ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）受容体アゴニスト；ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）受容体アゴニスト；コレシストキニン（Cholecystokinin）受容体アゴニスト；ガストリン（gastrin）受容体アゴニスト；メラノコルチン（melanocortin）受容体アゴニスト；ＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して結合する物質；ソマトスタチン；ＰＹＹ（peptide YY）；ＮＰＹ（neuropeptide Y）；オキシントモジュリン；繊維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor）；ブラジキニン；エレドイシン（Eledoisin）；オキシトシン（Oxytocin）；バソプレシン（vasopressin）； セルモレリン（Sermorelin）；プロラクチン放出ペプチド；オレキシン（Orexin）；甲状腺放出ペプチド；カルモジュリン；モチリン（Motilin）；血管作用性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）；心房性ナトリウム利尿ペプチド （Atrial natriuretic peptide；ＡＮＰ）； Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；ＣＮＰ）；ニューロキニン（Neurokinin）Ａ；ニューロメディン（Neuromedin）；レニン（Renin）； エンドセリン（Endothelin）；サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）；カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin peptide）；デルモルフィン（Dermorphin）；ダイノルフィン（Dynorphin）；エンドルフィン（Endorphin）；エンケファリン（Enkepalin）；腫瘍壊死因子受容体；ウロキナーゼ受容体；チモポエチン（Thymopoietin）；サイムリン（Thymulin）；チモペンチン（Thymopentin）；チモシン（Tymosin）；胸腺液性因子（Thymic humoral factor）；アドレノメデュリン（Adrenomodullin）；アラトスタチン（Allatostatin）； アミロイドβ−プロテイン断片（Amyloid beta-protein fragment）；抗菌性ペプチド； 抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１（Intercellular Adhesion Molecule 1）、ＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule 1）、ロイコカイン（Leucokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）、フューゼオン（Fuzeon）；グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２）；Ｇプロテイン関連受容体（Gprotein-coupled receptor）；赤血球増殖因子；白血球増殖因子；アミリン；ヒト成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン放出ペプチド；インターフェロン；インターフェロン受容体；コロニー刺激因子；インターロイキン；インターロイキン受容体；酵素；インターロイキン結合タンパク質；サイトカイン結合タンパク質；マクロファージ活性因子；マクロファージペプチド；Ｂ細胞因子；Ｔ細胞因子；タンパク質Ａ；アレルギー抑制因子；細胞壊死糖タンパク質；免疫毒素；リンホトキシン；腫瘍壊死因子；腫瘍抑制因子；転移成長因子；α−１アンチトリプシン；アルブミン；α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）；アポリポタンパク質Ｅ；赤血球生成因子；高糖鎖化赤血球生成因子；アンジオポエチン（angiopoietin）；ヘモグロビン；トロンビン（thrombin）；トロンビン受容体活性ペプチド；トロンボモジュリン（thrombomodulin）；血液因子ＶＩＩ；血液因子ＶＩＩａ；血液因子ＶＩＩＩ；血液因子ＩＸ；血液因子ＸＩＩＩ；プラスミノーゲン活性因子；フィブリン結合ペプチド；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；ヒルディン（hirudin）；タンパク質Ｃ；Ｃ反応性タンパク質；レニン抑制剤；コラゲナーゼ抑制剤；スーパーオキシドジスムターゼ；レプチン；血小板由来成長因子；上皮細胞成長因子；表皮細胞成長因子；アンジオスタチン（angiostatin）；アンジオテンシン（angiotensin）；骨形成成長因子；骨形成促進タンパク質；カルシトニン；インスリン；アトリオペプチン；軟骨誘導因子；エルカトニン（elcatonin）；結合組織活性因子；組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）；卵胞刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；神経成長因子類；アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）；脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）；グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）；ネトリン（netrin）；好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）；神経栄養因子；ニュールツリン（neuturin）；副甲状腺ホルモン；リラキシン；セクレチン；ソマトメジン；インスリン様成長因子；副腎皮質ホルモン；グルカゴン；コレシストキニン；膵臓ポリペプチド；ガストリン放出ペプチド；ガストリン抑制ペプチド；コルチコトロピン放出因子；甲状腺刺激ホルモン；オートタキシン（autotaxin）；ラクトフェリン（lactoferrin）；ミオスタチン（myostatin）； ＡＤＮＰ（activity-dependent neuroprotective protein）、ＢＡＣＥ１（beta-secretase1）、ＡＰＰ（Amyloid Precursor Protein）、ＮＣＡＭ（Neural cell adhesion molecule）、アミロイドβ（Amyloid beta）、タウ（Tau）、ＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts ）、α−シヌクレイン（alpha-synuclein）、またはこれらのアゴニストまたはアンタゴニスト；受容体類、受容体アゴニスト；細胞表面抗原；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；抗体断片；ウイルス由来ワクチン抗原；１つ以上の受容体アゴニストを活性化させるハイブリッドポリペプチドまたはキメラ（chimeric）ポリペプチド；及びこれらのアナログであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記生理活性物質は２つ以上の受容体を同時に活性化させることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記トキシンは、メイタンシン（Maytansine）またはその誘導体、オーリスタチン（Auristatin）またはその誘導体、デュオカルマイシン（Duocarmycin）またはその誘導体、及びＰＢＤ（Pyrrolobenzodiazepine）またはその誘導体からなる群から選択され、
ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニストは、天然型ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）、天然型エキセンジン−３、天然型エキセンジン−４、及びこれらのアナログからなる群から選択されたものであり、
ＦＧＦ受容体アゴニストは、ＦＧＦ１またはそのアナログ、ＦＧＦ１９またはそのアナログ、ＦＧＦ２１またはそのアナログ、及びＦＧＦ２３またはそのアナログからなる群から選択され、
インターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγからなる群から選択され、
インターフェロン受容体は、インターフェロンα受容体、インターフェロンβ受容体、インターフェロンγ受容体、及び水溶性タイプＩインターフェロン受容体からなる群から選択され、
インターロイキンは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６、インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、及びインターロイキン−３０からなる群から選択され、
インターロイキン受容体は、インターロイキン−１受容体またはインターロイキン−４受容体であり、
酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパリンＮ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、アガルシダーゼβ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択され、
インターロイキン結合タンパク質は、ＩＬ−１８ｂｐであり、
サイトカイン結合タンパク質は、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor）結合タンパク質であり、
神経成長因子類は、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、及びニュールツリン（neuturin）からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体は、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、及びＢ細胞活性因子受容体からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体アンタゴニストは、ＩＬ１−Ｒａであり、
細胞表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、及びＣＤ６９からなる群から選択され、
抗体断片類は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｄからなる群から選択されることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記生理活性物質は、天然型エキセンジン−３またはそのアナログ、天然型エキセンジン−４またはそのアナログ、天然型インスリンまたはそのアナログ、天然型ＧＬＰ−１またはそのアナログ、天然型ＧＬＰ−２またはそのアナログ、天然型オキシントモジュリンまたはそのアナログ、天然型グルカゴンまたはそのアナログ、天然型繊維芽細胞成長因子またはそのアナログ、天然型グレリンまたはそのアナログ、天然型カルシトニンまたはそのアナログ、天然型顆粒球コロニー刺激因子またはそのアナログ、またはＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して結合する物質であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記生理活性物質は、天然型インスリンまたは天然型インスリンに比べてインスリン受容体結合力が減少したインスリンアナログであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記インスリンアナログは、Ａ鎖及びＢ鎖をすべて含む、二本鎖形態であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記インスリンアナログは、天然型インスリンに比べて減少したインスリン受容体結合力を有して、天然型インスリンのＢ鎖またはＡ鎖の１つ以上のアミノ酸の変異または欠失を含むことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記インスリンアナログは、インスリンＢ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、３番アミノ酸、５番アミノ酸、８番アミノ酸、１０番アミノ酸、１２番アミノ酸、１６番アミノ酸、２３番アミノ酸、２４番アミノ酸、２５番アミノ酸、２６番アミノ酸、２７番アミノ酸、２８番アミノ酸、２９番アミノ酸、３０番アミノ酸、Ａ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、５番アミノ酸、８番アミノ酸、１０番アミノ酸、１２番アミノ酸、１４番アミノ酸、１６番アミノ酸、１７番アミノ酸、1８番アミノ酸、１９番アミノ酸及び２１番アミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたり欠失されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記インスリンアナログは、天然型インスリンＢ鎖の８番アミノ酸、２３番アミノ酸、２４番アミノ酸、２５番アミノ酸、天然型インスリンＡ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、１４番アミノ酸及び１９番アミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記置換する他のアミノ酸は、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン、イソロイシン、バリン、グルタミン、グリシン、リジン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン及びアスパラギン酸からなる群から選択されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記インスリンアナログは、天然型インスリンＡ鎖またはＢ鎖の１つ以上のアミノ酸が欠失（deletion）され、天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少したことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記インスリンアナログは、下記一般式１で表される配列番号：３のＡ鎖と下記一般式２で表される配列番号：４のＢ鎖とを含むことを特徴とする（ただし、前記インスリンアナログのうち、そのＡ鎖が配列番号：１と一致しつつ、同時にＢ鎖が配列番号：２と一致することは除外される）：
〔一般式１〕
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号：３）
前記一般式１において、
Ｘａａ１は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２は、イソロイシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ１４は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９は、チロシンまたはアラニンである。
〔一般式２〕
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５− Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：４）
前記一般式２において、
Ｘａａ８は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２３は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２４は、フェニルアラニンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２５は、フェニルアラニンまたはアラニンである。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記インスリンアナログは、
（ｉ）前記一般式１でＸａａ１はアラニンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はアラニンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｉｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸またはアスパラギンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｉｖ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はアラニンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はアラニンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はアラニンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖｉｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はアラニンであるＢ鎖を含むことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記インスリンアナログは、下記一般式３で表される配列番号：５のＡ鎖と下記一般式４で表される配列番号：６のＢ鎖を含むことを特徴とする（ただし、前記インスリンアナログのうち、そのＡ鎖が配列番号：１と一致しつつ、同時にＢ鎖が配列番号：２と一致するものは除外される）：
〔一般式３〕
Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｌｅu−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ｘａａ２１（配列番号：５）
前記一般式３において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１２は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１４は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１６は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ２１は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、またはアラニンである。
〔一般式４〕
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌu−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘａａ２５− Ｔｙｒ−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：６）
前記一般式４において、
Ｘａａ１６は、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であるか、不存在であり、
Ｘａａ２５は、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であるか、不存在であり、
Ｘａａ２７は、トレオニンであるか、不存在であり、
Ｘａａ２８は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在である。前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記インスリンアナログは、
前記一般式３でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸またはアスパラギンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるか、不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であることを特徴とするが、特にこれに制限されない。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記インスリンアナログは、
（１）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であり；
（２）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であり；
（３）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であるもの；または
（４）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であること
を特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記インスリンアナログは、
（１）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；（２）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（３）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はヒスチジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（４）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はリジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（５）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（６）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（７）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（８）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４において、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（９）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はセリンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１０）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はトレオニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１１）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１２）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１３）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１４）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８は、プロリンであるか；
（１５）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであること
を特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記結合体は、下記式（２）で表されることを特徴とする：
Ｘ−Ｌ−Ｆ （２）；
ここで、
Ｘは、天然型インスリンまたは天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログであり、
Ｌは、リンカーであって、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールであり、
Ｆは、Ｘの生体内半減期を増加させうる物質である。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記式（２）で表される結合体は、ＲＭＣ（receptor mediated clearance）が減少したインスリン結合体であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記式（２）でＬはＸである天然型インスリンまたはそのアナログのβ鎖のアミノ末端領域に連結されることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記ＸとＦは共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせでＬによって互いに結合されていることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質は生体適合性物質であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、多糖類（saccharide）、ヘパリン、及びエラスチンからなる群から選択されことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、
前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール - プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むポリペプチドであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、ＦはＩｇＧ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る結合体において、前記式（１）または式（２）で前記Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、ＬはＦのＮ末端領域に連結されていることを特徴とする。
本発明を具現する他の一つの様態は、前記結合体の製造方法である。
一つの具体例において、本発明は、
（ａ）少なくとも２つの末端官能基を保有する０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールと生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質のいずれかとを反応させて、生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質のいずれかが共有結合で連結されており、少なくとも１つの末端官能基を保有する、ポリエチレングリコールを製造する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で製造された生理活性物質またはその生体内半減期を増加させうる物質のいずれかが共有結合で連結されており、少なくとも１つの末端官能基を保有するポリエチレングリコールと生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質の他の一つとを反応させて、
生理活性物質及びその生体内半減期を増加させうる物質が０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールを介して共有結合で連結された結合体を製造する段階を含む、結合体の製造方法に関する。
前記具体例による製造方法において、
前記生理活性物質はポリエチレングリコールの末端官能基と反応して共有結合を形成する官能基を保有し、前記官能基はアミン基またはチオール基であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかによる製造方法において、
前記生理活性物質の半減期を増加させる物質はポリエチレングリコールの末端官能基と反応して共有結合を形成する官能基を保有し、前記官能基はアミン基またはチオール基であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかによる製造方法において、前記ポリエチレングリコールの末端官能基はアミン反応性官能基（amine-reactive functional group）またはチオール反応性官能基（thiol-reactive functional group）であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかによる製造方法において、前記ポリエチレングリコールの末端官能基は、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、ビニルスルホン、チオール、Ｃ6〜Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5〜Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、及びハロゲン化アセトアミドからなる群から選択されることを特徴とする。
前記具体例のいずれかによる製造方法において、前記ポリエチレングリコールの末端官能基は、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィド（Ortho-pyridyl disulfide）、及びヨウ化アセトアミドからなる群から選択されることを特徴とする。
前記具体例のいずれかによる製造方法において、前記スクシンイミドは、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートであることを特徴とする。
本発明を具現する他の一つの様態は、前記結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したインスリン持続性製剤である。
本発明を具現する他の一つの様態は、前記結合体を含む、糖尿病の予防または治療用製剤である。
本発明を具現する他の一つの様態は、前記式（２）で表される結合体またはこれを含む組成物、または製剤を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、インスリン関連疾患の治療方法である。
本発明の生理活性物質の結合体は、当該生理活性が必要な分野に有用に用いることができる。
インスリン−３．４ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。 インスリン−１ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。 インスリン−１、２、２．５、３、３．４ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体のそれぞれのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）の分析結果を示した図である。 インスリン−１、２、２．５、３、３．４ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体のそれぞれの逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の分析結果を示した図である。 インスリン−１、２、２．５、３、３．４ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体のクロマトグラフィーオーバレイ（overlay）のグラフである。 ＰＥＧリンカーの長さに応じる持続型インスリン結合体の薬効持続性の比較結果を示した図である。
以下では、本発明をさらに詳細に説明する。
一方、本願で開示される各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。つまり、本願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記記述される具体的な叙述によって、本発明のカテゴリが制限されることはない。
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用し、本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認識したり確認することができる。また、これらの等価物は本発明に含まれるものと意図される。
本明細書全般を介して、アミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられる。また、本明細書で略語で言及されたアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ命名法に従って記載された。
本発明を具現するための一つの様態は、生理活性物質の体内半減期の延長のための目的を有した生理活性物質の結合体を提供する。
具体的には、本発明は、生理活性物質及びその生体内半減期を増加させうる物質がポリエチレングリコールを介して連結され、前記ポリエチレングリコールは、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさであることを特徴とする生理活性物質の結合体を提供する。
本発明を具現するためのより具体的な様態は、下記式（１）を有する結合体を提供する：
Ｘ−Ｌ−Ｆ （１）；
ここで、
Ｘは、生理活性物質であり、
Ｌは、リンカーであって、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールであり、
Ｆは、生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質である。
本願において、前記式（１）で表される結合体は、本願で「持続型結合体」と混用されて用いられる。
本発明において、「持続型結合体」とは、生理活性物質がその生体内半減期を延長させうる物質、例えば、生体適合性物質がリンカーによって結合された物質をいう。
特にこれに制限されないが、前記結合体は、前記結合体とＬが３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールであることだけが、他の結合体と比較して増加した生体内半減期を示してもよい。
より具体的には、前記結合体とＸ及びＦは同一であり、３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールがＬであることを特徴とする前記結合体は、他の結合体と比較して生理活性物質の受容体に対して減少した結合力を示してもよく、ＲＭＣ（receptor mediated clearance）が弱化されて、これにより血中半減期が増加されてもよいが、特にこれに制限されない。
また、前記効果に加えて、または独立して、前記結合体はＸ及びＦを連結する０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールによってＸ及びＦが近接して存在しても、前記結合体とＸ及びＦは同一であり、３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールをＬであることを特徴とし、他の結合体と比較してＸ自体の生理活性及びＦ自体の活性それぞれが実質的に同等であるか、それ以上の活性を示してもよいが、特にこれに制限されるものではない。
本発明において、Ｌはリンカーであって、前記結合体を構成する一部分（moiety）であり、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールを意味するもので、これに制限されないが、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満、０ｋＤａ超え〜３．３ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜３．２ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜３．１ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜３．０ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．９ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．８ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．７ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．６ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．５ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．４ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．３ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．２ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．１ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜２．０ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．９ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．８ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．７ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．６ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．５ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．４ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．３ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．２ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．１ｋＤａ以下、０ｋＤａ超え〜１．０ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜３．４ｋＤａ未満、０．５ｋＤａ以上〜３．３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜３．２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜３．１ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．９ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．８ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．７ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．６ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．５ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．４ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２．１ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．９ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．８ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．７ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．６ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．５ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．４ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１．１ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ以上〜１ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満、０．５ｋＤａ超え〜３．３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜３．２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜３．１ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．９ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．８ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．７ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．６ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．５ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．４ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２．１ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．９ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．８ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．７ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．６ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．５ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．４ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．３ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．２ｋＤａ以下、０．５ｋＤａ超え〜１．１ｋＤａ以下、０．５ｋＤa超え〜１．０ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜３．４ｋＤａ未満、０．７５ｋＤａ以上〜３．３ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜３．２ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜３．１ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜３ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．９ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．８ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．７ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．６ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．５ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．４ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．３ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．２ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２．１ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜２ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．９ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．８ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．７ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．６ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．５ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．４ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．３ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．２ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１．１ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ以上〜１ｋＤａ以下、 ０．７５ｋＤａ超え〜２ｋＤａ以下、０．７５ｋＤａ超え〜２ｋＤａ未満、０．７５ｋＤａ超え〜１．５ｋＤａ以下、約１．０ｋＤａ、または１．０ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールをすべて含む。
本発明において、用語、「約」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であって、約という用語の後に来る数値と同等か類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。
本発明で、Ｘは前記結合体を構成することの一部分（moiety）である生理活性物質である。前記生理活性物質は、生体内で任意の生理作用を有する物質をいう。
前記生理活性物質は、トキシンまたは生理活性ポリペプチドであってもよく、人間の疾病を治療または予防する目的で用いられるサイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体アンタゴニスト、糖尿及び肥満に治療効果を示す小腸及び膵臓から分泌される生理活性ペプチド、ＧＰＣＲ（G protein-coupled receptors）アゴニストもしくはアンタゴニストなどのようなさまざまな生理活性ポリペプチド、これらのアナログを例示してもよいが、これに制限されない。
本発明で用いられる用語、「Ｘのアナログ」は、Ｘと同じ種類の活性を示せる物質であって、Ｘのアゴニスト（agonist）、Ｘの誘導体（derivatives）、Ｘの断片（fragments）、Ｘの変異体（variants）などをすべて含む。
これらのＸは、天然型である生理活性ポリペプチドであってもよい。
具体的には、「天然型である生理活性ポリペプチドの誘導体」は、天然型生理活性ポリペプチドと比較してアミノ酸配列に１つ以上の違いがあるペプチド、天然型生理活性ポリペプチド配列を改質（modification）を介して変形させたペプチド、天然型生理活性ポリペプチドと同じ種類の活性を保有する模倣体を含む。
具体的には、天然型生理活性ポリペプチドの誘導体は、天然型生理活性ポリペプチドで一部のアミノ酸が置換（substitution）、追加（addition）、削除（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法またはこれらの方法の組み合わせを介して変形させて製造してもよく、このような方法で製造された互いに異なる２つ以上の受容体に結合力を有するように操作された人為のペプチド類も前記誘導体のカテゴリに含まれる。
また、天然型生理活性ポリペプチドの誘導体の製造のためのこれらの変形は、Ｌ型またはＤ型アミノ酸、及び／または非天然型アミノ酸を用いた変形；及び／または天然型配列を改質、例えば、側鎖官能基の変形、分子内共有結合、例えば、側鎖間の環の形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などのように改質することにより、変形するものをすべて含む。
また、天然型生理活性ポリペプチドのアミノ及び／またはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたものをすべて含む。
前記置換されたり追加されるアミノ酸は、ヒトタンパク質で通常に観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然発生アミノ酸を用いてもよい。
本発明において、用語、「天然型生理活性ポリペプチドもしくは天然型生理活性ポリペプチドの誘導体の断片」は、天然型生理活性ポリペプチドもしくは天然型生理活性ポリペプチドの誘導体のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去された形態をいう。
前記生理活性物質は、トキシン；またはＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト；グルカゴン受容体アゴニスト；ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）受容体アゴニスト；ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）受容体アゴニスト；コレシストキニン（Cholecystokinin）受容体アゴニスト；ガストリン（gastrin）受容体アゴニスト（ガストリン）；メラノコルチン（melanocortin）受容体アゴニスト；ＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうちの２以上の受容体に対して結合する物質；ソマトスタチン；ＰＹＹ（peptide YY）；ＮＰＹ（neuropeptide Y）；オキシントモジュリン；繊維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor）；ブラジキニン；エレドイシン（Eledoisin）；オキシトシン（Oxytocin）；バソプレシン（vasopressin）； セルモレリン（Sermorelin）；プロラクチン放出ペプチド；オレキシン（Orexin）；甲状腺放出ペプチド；カルモジュリン；モチリン（Motilin）；血管作用性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）；心房性ナトリウム利尿ペプチド （Atrial natriuretic peptide；ＡＮＰ）； Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；ＣＮＰ）；ニューロキニン（Neurokinin）Ａ；ニューロメディン（Neuromedin）；レニン（Renin）； エンドセリン（Endothelin）；サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）；カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin peptide）；デルモルフィン（Dermorphin）；ダイノルフィン（Dynorphin）；エンドルフィン（Endorphin）；エンケファリン（Enkepalin）；腫瘍壊死因子受容体；ウロキナーゼ受容体；チモポエチン（Thymopoietin）；サイムリン（Thymulin）；チモペンチン（Thymopentin）；チモシン（Tymosin）；胸腺液性因子（Thymic humoral factor）；アドレノメデュリン（Adrenomodullin）；アラトスタチン（Allatostatin）； アミロイドβ−プロテイン断片（Amyloid beta-protein fragment）；抗菌性ペプチド； 抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１（Intercellular Adhesion Molecule 1）、ＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule 1）、ロイコカイン（Leucokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）；フューゼオン（Fuzeon）；グルカゴン様ペプチド；Ｇプロテイン関連受容体（Gprotein-coupled receptor）；赤血球増殖因子；白血球増殖因子；アミリン；ヒト成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン放出ペプチド；インターフェロン；インターフェロン受容体；コロニー刺激因子；インターロイキン；インターロイキン受容体；酵素；インターロイキン結合タンパク質；サイトカイン結合タンパク質；マクロファージ活性因子；マクロファージペプチド；Ｂ細胞因子；Ｔ細胞因子；タンパク質Ａ；アレルギー抑制因子；細胞壊死糖タンパク質；免疫毒素；リンホトキシン；腫瘍壊死因子；腫瘍抑制因子；転移成長因子；α−１アンチトリプシン；アルブミン；α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）；アポリポタンパク質Ｅ；赤血球生成因子；高糖鎖化赤血球生成因子；アンジオポエチン（angiopoietin）；ヘモグロビン；トロンビン（thrombin）；トロンビン受容体活性ペプチド；トロンボモジュリン（thrombomodulin）；血液因子ＶＩＩ（血液凝固因子ＶＩＩ）；血液因子ＶＩＩａ（血液凝固因子ＶＩＩａ）；血液因子ＶＩＩＩ（血液凝固因子ＶＩＩＩ）；血液因子ＩＸ（血液凝固因子ＩＸ）；血液因子ＸＩＩＩ（血液凝固因子ＸＩＩＩ）；プラスミノーゲン活性因子；フィブリン結合ペプチド；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；ヒルディン（hirudin）；タンパク質Ｃ；Ｃ反応性タンパク質；レニン抑制剤；コラゲナーゼ抑制剤；スーパーオキシドジスムターゼ；レプチン；血小板由来成長因子；上皮細胞成長因子；表皮細胞成長因子；アンジオスタチン（angiostatin）；アンジオテンシン（angiotensin）；骨形成成長因子；骨形成促進タンパク質；カルシトニン；インスリン；アトリオペプチン；軟骨誘導因子；エルカトニン（elcatonin）；結合組織活性因子；組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）；卵胞刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；神経成長因子類；アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）；脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）；グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）；ネトリン（netrin）；好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）；神経栄養因子；ニュールツリン（neuturin）；副甲状腺ホルモン；リラキシン；セクレチン；ソマトメジン；インスリン様成長因子；副腎皮質ホルモン；グルカゴン；コレシストキニン；膵臓ポリペプチド；ガストリン放出ペプチド；ガストリン抑制ペプチド；コルチコトロピン放出因子；甲状腺刺激ホルモン；オートタキシン（autotaxin）；ラクトフェリン（lactoferrin）；ミオスタチン（myostatin）； ＡＤＮＰ（activity-dependent neuroprotective protein）、ＢＡＣＥ１（beta-secretase1）、ＡＰＰ（Amyloid Precursor Protein）、ＮＣＡＭ（Neural cell adhesion molecule）、アミロイドβ（Amyloid beta）、タウ（Tau）、ＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts ）、α−シヌクレイン（alpha-synuclein）、またはこれらのアゴニストまたはアンタゴニスト；受容体類、受容体アゴニスト；細胞表面抗原；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；抗体断片；ウイルス由来ワクチン抗原；１つ以上の受容体アゴニストを活性化させるハイブリッドポリペプチドまたはキメラ（chimeric）ポリペプチド；及びこれらのアナログであってもよい。
また、前記トキシンは、メイタンシン（Maytansine）またはその誘導体、オーリスタチン（Auristatin）またはその誘導体、デュオカルマイシン（Duocarmycin）またはその誘導体、及びＰＢＤ（Pyrrolobenzodiazepine）またはその誘導体からなる群から選択され、
ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニストは、天然型ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）、天然型ＧＬＰ−２、天然型エキセンジン−３、天然型エキセンジン−４、及びこれらのアナログからなる群から選択されたものであり、
ＦＧＦ受容体アゴニストは、ＦＧＦ１またはそのアナログ、ＦＧＦ１９またはそのアナログ、ＦＧＦ２１またはそのアナログ、及びＦＧＦ２３またはそのアナログからなる群から選択され、
インターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγからなる群から選択され、
インターフェロン受容体は、インターフェロンα受容体、インターフェロンβ受容体、インターフェロンγ受容体、及び水溶性タイプＩインターフェロン受容体からなる群から選択され、
インターロイキンは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６、インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、及びインターロイキン−３０からなる群から選択され、
インターロイキン受容体は、インターロイキン−１受容体またはインターロイキン−４受容体であり、
酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−6−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパリンＮ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、アガルシダーゼβ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択され、
インターロイキン結合タンパク質は、ＩＬ−１８ｂｐであり、
サイトカイン結合タンパク質は、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor）結合タンパク質であり、
神経成長因子類は、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、及びニュールツリン（neuturin）からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体は、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、及びＢ細胞活性因子受容体からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体アンタゴニストは、ＩＬ１−Ｒａであり、
細胞表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、及びＣＤ６９からなる群から選択され、
抗体断片類は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｄからなる群から選択されるものであるが、特にこれに制限されない。
また、前記生理活性物質は、天然型エキセンジン−３またはそのアナログ、天然型エキセンジン−４またはそのアナログ、天然型インスリンまたはそのアナログ、天然型ＧＬＰ−１またはそのアナログ、天然型ＧＬＰ−２またはそのアナログ、天然型オキシントモジュリンまたはそのアナログ、天然型グルカゴンまたはそのアナログ、天然型繊維芽細胞成長因子またはそのアナログ、天然型グレリンまたはそのアナログ、天然型カルシトニンまたはそのアナログ、天然型顆粒球コロニー刺激因子またはそのアナログであってもよいが、特にこれに制限されない。
具体的には、前記生理活性物質として天然型エクセンディン−３のアナログは、天然型エクセンディン−３のＮ末端アミン基が除去されたエクセンディン−３；天然型エクセンディン−３のＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたエクセンディン−３；天然型エクセンディン−３のＮ末端アミン基がジメチル基に修飾されたエクセンディン−３；天然型エクセンディン−３のＮ末端アミン基がカルボキシル基に置換されたエクセンディン−３；及びエクセンディン−３の１番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素を除去（deletion）したエクセンディン−３；及び前記エクセンディン−３で１２番目のアミノ酸（リジン）がセリンに置換されたエクセンディン−３；及び前記エクセンディン−３の１２番目のアミノ酸（リジン）がアルギニンに置換されたエクセンディン−３からなる群から選択されるものであってもよく、
前記生理活性物質として天然型エクセンディン−４のアナログは、天然型エクセンディン−４のＮ末端アミン基が除去されたエクセンディン−４；天然型エクセンディン−４のＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたエクセンディン−４；天然型エクセンディン−４のＮ末端アミン基がジメチル基に修飾されたエクセンディン−４；天然型エクセンディン−４のＮ末端アミン基がカルボキシル基に置換されたエクセンディン−４；及びエクセンディン−４の１番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素が除去（deletion）されたエクセンディン−４；及び前記エクセンディン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がセリンに置換されたエクセンディン−４、及び前記エクセンディン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がアルギニンに置換されたエクセンディン−４からなる群から選択されたものであってもよいが、特にこれに制限されない。
より具体的には、前記天然型エクセンディン−４のアナログは、デスアミノヒスチジル（ＤＡ）−エクセンディン−４、β−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（ＨＹ）−エクセンディン−４、イミダゾアセチル（ＣＡ）−エクセンディン−４及びジメチルヒスチジル（ＤＭ）−エクセンディン−４からなる群から選択されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。
前記エクセンディンのカテゴリに属する天然型エクセンディンの誘導体については、特許文献１（特許文献２）に詳述されている。また、本願の参照資料として前記韓国公開特許及び国際公開特許の全文が含まれる。
また、前記生理活性物質は、天然型オキシントモジュリンまたはその誘導体であってもよい。前記オキシントモジュリンのカテゴリに属する天然型オキシントモジュリンの誘導体については、特許文献３（特許文献４）及び特許文献５（特許文献６）に詳述されている。また、本願の参照資料として前記韓国公開特許及び国際公開特許の全文が含まれる。
また、前記生理活性物質は、天然型顆粒球コロニー刺激因子であったり、天然型顆粒球コロニー刺激因子の誘導体であってもよい。
具体的には、天然型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の１、２、３及び１７番目のアミノ酸の１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された天然型ヒト顆粒球コロニー刺激因子であってもよく、さらに６５番目のプロリン残基がセリンに置換されたものであってもよい。より具体的には、天然型ヒト顆粒球コロニー刺激因子で１７番目のシステイン残基、６５番目のプロリン残基、またはこれら両方の残基のセリンへの置換を含む天然型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の誘導体であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
前記顆粒球コロニー刺激因子のカテゴリに属する天然型顆粒球コロニー刺激因子の誘導体については、特許文献７（特許文献８）に詳述されている。また、本願の参照資料として前記韓国公開特許及び国際公開特許の全文が含まれる。
また、前記生理活性物質は、ＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して結合する物質であってもよい。前記物質はＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して活性を有する物質であってもよい。つまり、当該受容体に物質が結合すると、その受容体が活性を示すことができる。
具体的には、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して結合する物質であってもよく、より具体的には、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対して結合する物質；ＧＬＰ−１受容体及びＧＩＰ受容体に対して結合する物質； ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対して結合する物質；またはグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体すべてに対して結合する物質であってもよいが、特にこれに制限されない。前記３つの受容体に対して結合する物質を三重アゴニスト（もしくは三重活性体）と、２つの受容体に対して結合する物質を二重アゴニストと命名してもよい。
グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの例示については、本出願人の先行出願である 特許文献９及び特許文献１０に記載されており、当該文献の全文は本願に参考資料としてすべて含まれる。
また、グルカゴン／ＧＬＰ−１の二重アゴニストの例示については、本出願人の先行出願である特許文献１１または 特許文献１２などが挙げられ、その文献の全文は本願に参考資料としてすべて含まれる。
また、前記生理活性物質は、天然型グルカゴンの誘導体であってもよい。
前記グルカゴン誘導体の例示については、特許文献１３または特許文献１４などが挙げられ、その文献の全文は本願に参考資料としてすべて含まれる。
また、前記生理活性物質は、天然型インスリンまたはそのアナログであってもよい。より具体的には、前記生理活性物質は、天然型インスリンまたは天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログであってもよい。
本発明において、用語、「インスリンアナログ（insulin analog）」とは、天然型インスリンと異なる非天然型インスリンを意味する。前記インスリンアナログは、天然型ヒトインスリンと異なる非天然型ヒトインスリンを含む。
これらのインスリンアナログは、天然型インスリンの一部のアミノ酸を付加及び／または欠失及び／または置換の形態に変形させたアナログを含む。
具体的には、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリン配列と配列同一性を比較したとき、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％％以上の配列同一性を有するものであってもよい。また、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリン配列と前記の配列同一性を有しながら、天然型インスリンに比べて受容体の結合能力が低下したものであってもよい。また、前記インスリンアナログは、天然型インスリンのようにグルコース吸収能を有するか／有するものであり、生体内で血中グルコースを降下させる能力を有してもよい。
より具体的には、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのインスリン受容体の結合力（１００％）と比較して、約９９％またはそれ以下、約９５％またはそれ以下、約９０％またはそれ以下、約８５％またはそれ以下、約８０％またはそれ以下、約７５％またはそれ以下、約７０％またはそれ以下、約６５％またはそれ以下、約６０％またはそれ以下、約５５％またはそれ以下、約５０％またはそれ以下、約４５％またはそれ以下、約４０％またはそれ以下、約３５％またはそれ以下、約３０％またはそれ以下、約２５％またはそれ以下、約２０％またはそれ以下、約１５％またはそれ以下、約１０％またはそれ以下、約９％またはそれ以下、約８％またはそれ以下、約７％またはそれ以下、約６％またはそれ以下、約５％またはそれ以下、約４％またはそれ以下、約３％またはそれ以下、約２％またはそれ以下、約１％またはそれ以下、または約０．１％またはそれ以下のインスリン受容体に対する結合力を示してもよい（ただし、本発明のインスリンアナログはインスリン受容体に対する結合力が０％に該当しない）。インスリンアナログの受容体結合能力は、組換えヒトインスリン受容体を過発現する細胞膜でインスリンアナログとヨウ素１２５とが結合されたインスリン間の競争反応を利用するＳＰＡ（Scintillation Proximity Assay）法を用いて評価してもよい。
また、前記インスリンアナログは、インスリン受容体に対する結合力の減少により、天然型インスリンに比べて半減期が１０％以上増加したものであってもよいが、これに制限されない。
また、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのようにグルコース吸収能を保有してもよい。
具体的には、本発明に係るインスリンアナログは、天然型インスリンのグルコース吸収能（１００％）に比べて、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％％以上、約１００％以上、約１１０％以上、約１２０％以上、約１３０％以上、約１４０％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１７０％以上、約１８０％以上、約１９０％以上、または約２００％以上のグルコース吸収能を有するものであってもよい。
グルコース吸収能の測定は、当業界に公知された様々なグルコース吸収能の測定方法を用いて達成してもよい。
前記インスリンアナログのカテゴリに属するインスリンアナログについては、特許文献１５（特許文献１６）及び特許文献１７（特許文献１８）に詳述されている。また、本願の参照資料として前記韓国公開特許及び国際公開特許の全文が含まれる。しかし、これに制限されるものではない。また、本発明のインスリンアナログは、その他にも特許文献１９に開示されたインスリンアナログをすべて含むが、これに制限されない。前記特許明細書は、本発明の参照としてすべて含まれる。
具体的には、前記インスリンアナログは短鎖であるか、二重鎖（two polypeptide chains）形態であってもよく、より好ましくは、二重鎖形態であるが、特にこれに制限されない。
前記二重鎖形態であるインスリンアナログは、天然型インスリンのＡ鎖に対応されるポリペプチドと天然型インスリンのＢ鎖に対応されるポリペプチド、２つのポリペプチドで構成されたものであってもよい。ここで、前記天然型インスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖に対応されるということは、前記二重鎖のポリペプチドのいずれかである鎖を天然型インスリンのＡ鎖またはＢ鎖と配列同一性を比較したとき、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の配列同一性を有する場合が挙げられ、特にこれに制限されず、二重鎖を構成する配列と天然型インスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖の配列との比較を介して当業者が容易に把握することができる。
天然型インスリンは膵臓から分泌されるホルモンであって、一般的に細胞内グルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制して、体内の血糖を調節する役割をする。インスリンは血糖調節機能のないプロインスリン（proinsulin）前駆体の形態からプロセッシングを経て、血糖調節機能を有するインスリンになる。インスリンは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ２１個及び３０個のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖で構成されており、これらは２つのジスルフィド架橋で相互連結されている。天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖は、それぞれ下記配列番号：１及び２で表されるアミノ酸配列を含む。
Ａ鎖：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｂ鎖：
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：２）
本発明の一実施様態によれば、本願に記述されたインスリンアナログは、天然型インスリンのように生体内で血糖調節機能を保有しながら、受容体結合能力が低下したものであってもよい。より具体的には、前記インスリンアナログは、生体内での血中グルコースを降下させる能力を保有してもよい。
また、本発明の一実施様態で前記インスリンアナログは、低い受容体媒介内在化（receptor-mediated internalization）及び／または受容体媒介クリアランス（receptor-mediated clearance）を示すことができれば、特にその種類及び大きさに制限されなくてもよい。これにより、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンに比べて増加した血中半減期を示してもよい。
本発明のインスリンアナログは、逆方向インスリン、天然型インスリンの誘導体、天然型インスリンの断片などを含む。これらのインスリンアナログは、遺伝子組換え法だけでなく、固相（solid phase）方法でも製造することができ、これに制限されるものではない。一方、本発明のインスリンアナログは、遺伝子組換え技術で作られたインスリンアナログだけでなく、本発明はこれにだけ制限されず、インスリン受容体の結合力が減少したすべてのインスリンアナログを含む。
本発明において、用語、「天然型インスリンの誘導体」は、天然型インスリンと比較してアミノ酸配列に１つ以上が異なるペプチド、天然型インスリン配列を改質（modification）を介して変形させたペプチド、天然型インスリンのように生体内の血糖調節機能を調節する天然型インスリンの模倣体を含む。これらの天然型インスリンの誘導体は、生体内に血糖調節機能を有するものであってもよい。
具体的には、天然型インスリンの誘導体は、天然型インスリンから一部のアミノ酸が置換（substitution）、追加（addition）、削除（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法またはこれら方法の組み合わせを介して変形させてもよい。
具体的には、天然型インスリンのＡ鎖、Ｂ鎖とそれぞれ少なくとも８０％以上のアミノ酸配列で相同性を示すものであってもよく／示すものであったり、インスリンのアミノ酸の一残基の一部グループが化学的に置換（例えば、α−メチル化、 α−ヒドロキシル化）、削除（例えば、脱アミノ化）または修飾（例えば、Ｎ−メチル化）された形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
誘導体の製造のためのいくつかの方法の組み合わせで本発明に適用される天然型インスリンの誘導体を製造してもよい。
また、天然型インスリンの誘導体の製造のためのこれらの変形は、Ｌ型またはＤ型アミノ酸、及び／または非天然型アミノ酸を用いた変形；及び／または天然型配列を改質あるいは翻訳後変形（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合など）することにより変形するものすべてを含む。
また、天然型インスリンのアミノ及び／またはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたものをすべて含む。
前記置換されたり追加されたアミノ酸は、ヒトタンパク質で通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然発生アミノ酸を用いてもよい。非定型アミノ酸の商業的出所は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐとＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれたペプチドと定型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、または韓国のＡｎｙｇｅｎを介して合成及び購入してもよいが、特にこれに制限されない。
本発明において、用語、「天然型インスリンもしくは天然型インスリンの誘導体の断片」は、天然型インスリンもしくは天然型インスリンの誘導体のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去された形態をいう。これらのインスリン断片は、体内で血糖調節機能を有してもよい。
また、本発明のインスリンアナログは、前記天然型インスリンの誘導体及び断片の製造に用いられたそれぞれの製造方法が独立して用いられたり、組み合わせされて用いられて製造されたものであってもよい。
具体的には、本発明に係るインスリンアナログは、前記のような天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖で特定アミノ酸残基の変形を含むもので、具体的には、天然型インスリンのＡ鎖の特定アミノ酸残基が変形されて/変形されたり、Ｂ鎖の特定アミノ酸残基が変形されたものであってもよい。
具体的には、前記インスリンアナログは、天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少された、天然型インスリンのＢ鎖またはＡ鎖の１つ以上のアミノ酸の変異及び／または欠失を含むインスリンアナログであってもよい。例えば、天然型インスリンの一部のアミノ酸を付加、欠失、置換、及びこれらの組み合わせの形態に変形させて、天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少されたものであってもよい。
具体的には、前記インスリンアナログは、天然型インスリンＢ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、３番アミノ酸、５番アミノ酸、８番アミノ酸、１０番アミノ酸、１２番アミノ酸、１６番アミノ酸、２３番アミノ酸、２４番アミノ酸、２５番アミノ酸、２６番アミノ酸、２７番アミノ酸、２８番アミノ酸、２９番アミノ酸、３０番アミノ酸、Ａ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、５番アミノ酸、８番アミノ酸、１０番アミノ酸、１２番アミノ酸、１４番アミノ酸、１６番アミノ酸、１７番アミノ酸、1８番アミノ酸、１９番アミノ酸及び２１番アミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、より具体的には、Ｂ鎖の８番アミノ酸、２３番アミノ酸、２４番アミノ酸、２５番アミノ酸、Ａ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、１４番アミノ酸及び１９番アミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。具体的には、
前述したアミノ酸で１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、または２７以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
前述した位置のアミノ酸残基は、また、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン、イソロイシン、バリン、グルタミン、グリシン、リジン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、及び／またはアスパラギン酸に置換されてもよい。また、インスリンＡ鎖またはＢ鎖の１つ以上のアミノ酸が欠失（deletion）されてインスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログも本発明のカテゴリに属するが、インスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログは、制限なく含まれてもよい。
より具体的には、前記インスリンアナログは、下記一般式１で表される配列番号３のＡ鎖と下記一般式２で表される配列番号４のＢ鎖を含むものであってもよい。また、前記Ａ鎖及びＢ鎖の配列がジスルフィド結合で相互連結された形態であってもよい。ただし、これに制限されるものではない。
〔一般式１〕
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号：３）
前記一般式１において、
Ｘａａ１は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２は、イソロイシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ１４は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９は、チロシンまたはアラニンである。
〔一般式２〕
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖaｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：４）
前記一般式２において、
Ｘａａ８は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２３は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２４は、フェニルアラニンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２５は、フェニルアラニンまたはアラニンである。
より具体的には、前記インスリンアナログは
（ｉ）前記一般式１でＸａａ１はアラニンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はアラニンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｉｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸またはアスパラギンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｉｖ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はアラニンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はアラニンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はアラニンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はアラニンであり、 Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
（ｖｉｉｉ）前記一般式１でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式２でＸａａ８はグリシンであり、Ｘａａ２３はグリシンであり、Ｘａａ２４はフェニルアラニンであり、 Ｘａａ２５はアラニンであるＢ鎖を含むものであってもよい。
また、前記インスリンアナログは、下記一般式３で表される配列番号：５のＡ鎖と下記一般式４で表される配列番号：６のＢ鎖を含むものであってもよい。また、前記Ａ鎖及びＢ鎖の配列がジスルフィド結合で相互連結された形態であってもよい。ただし、これに制限されるものではない。
〔一般式３〕
Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ−Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ１９−Ｃｙｓ−Ｘａａ２１（配列番号：５）
前記一般式３において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１２は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１４は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１６は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ１９は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ２１は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジン、またはアラニンである。
〔一般式４〕
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌu−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘａａ２５− Ｔｙｒ−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号：６）
前記一般式４において、
Ｘａａ１６は、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはアスパラギン酸であるか、不存在であり、
Ｘａａ２５は、フェニルアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であるか、不存在であり、
Ｘａａ２７は、トレオニンであるか、不存在であり、
Ｘａａ２８は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在である。より具体的には、前記インスリンアナログは、
前記一般式３でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸またはアスパラギンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであるか、不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在することを特徴とするが、特にこれに制限されない。
より具体的には、前記インスリンアナログは、
（１）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であり；
（２）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であり；
（３）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であり；または
（４）前記配列番号：５のＡ鎖でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
配列番号：６のＢ鎖でＸａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不存在であること
を特徴としてもよいが、特にこれに制限されない。
より具体的には、前記インスリンアナログは、
（１）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はグルタミン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（２）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５は不存在であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（３）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２がセリンであり、Ｘａａ１４はヒスチジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（４）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はリジンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（５）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はグルタミン酸であり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（６）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はセリンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（７）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はトレオニンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（８）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４において、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（９）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はセリンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１０）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はトレオニンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１１）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアラニンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１２）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１３）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２５はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであるか；
（１４）前記一般式３において、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４において、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８は、プロリンであるかまたは；
（１５）前記一般式３で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ５はグルタミンであり、Ｘａａ１２はセリンであり、Ｘａａ１４はチロシンであり、Ｘａａ１６はロイシンであり、Ｘａａ１９はチロシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギンであり、
前記一般式４で、Ｘａａ１６はチロシンであり、Ｘａａ２５はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はトレオニンであり、Ｘａａ２８はプロリンであること
を特徴とするものであってもよいが、特にこれに制限されない。
しかし、前記例に制限されるものではない。その例として、前述した特徴的なアミノ酸残基を含みながら、当該インスリンアナログと７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上の相同性を有し、天然型インスリンに比べて減少したインスリン受容体の結合力を有するペプチドも本発明のカテゴリに含まれる。
本発明において、用語、「相同性（homology）」は、天然型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列またはこれをコードするポリヌクレオチド配列との類似な程度を示すためのもので、本発明のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と前記のようなパーセント以上の同一の配列を有する配列を含む。これらの相同性は２つの配列を肉眼で比較して決定してもよいが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析してくれる生物情報アルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定してもよい。前記２つのアミノ酸配列間の相同性はパーセントで示してもよい。有用な自動化されたアルゴリズムは、Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group、Madison、W、USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ＆ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ配列の配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴとＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。
前記インスリンアナログをコードするポリヌクレオチドは、標準分子生物学の技術を用いて分離または製造してもよい。例えば、適切なプライマー配列を用いて天然型インスリン遺伝子配列（ＮＭ_０００２０７．２、ＮＣＢＩ）からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を介して増幅してもよく、自動化されたＤＮＡ合成器を用いる標準合成技術を用いて製造してもよい。前記ポリヌクレオチドは、本発明で核酸と混合して用いられてもよい。
前記インスリンアナログをコードするポリヌクレオチドは、前述したＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むものであってもよい。しかし、前記例に制限されない。その例として、前述したポリヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上の相同性を有し、天然型インスリンに比べて減少したインスリン受容体の結合力を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明のカテゴリに含まれる。
一方、前記した天然型インスリンまたはそのアナログに対する結合体は、次の式（２）で表されるものであってもよい：
Ｘ−Ｌ−Ｆ （２）；
ここで、
Ｘは、天然型インスリンまたは天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログであり、
Ｌは、リンカーであって、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールであり、
Ｆは、Ｘの生体内半減期を増加させうる物質である。
前記式（２）で表される結合体は、ＲＭＣ（receptor mediated clearance）が減少したものであってもよいが、特にこれに制限されない。
前記式（２）で表される結合体において、ＬはＸである天然型インスリンまたはそのアナログのβ鎖のアミノ末端領域に連結されているものであってもよいが、特にこれに制限されない。
本願において、「Ｎ末端領域またはアミノ末端領域」は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ末端領域を意味する。その例として、これに制限されないが、前記「Ｎ末端領域 」は、Ｎ末端領域の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端アミノ酸残基周辺のアミノ酸残基をすべて含んでもよく、具体的には、最末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を含んでもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
一方、本発明に係る結合体において、前記ＸとＦは共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせでＬによって互いに結合されるものであってもよく、より具体的には、共有化学結合によってＸ及びＦがＬによって連結されるものであってもよい。
前記式（１）または式（２）の「−」は、共有化学結合または非共有化学結合であってもよく、より具体的には、共有化学結合であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
前記式（１）または式（２）の結合体は、Ｘ、Ｌ、及びＦの順に結合された構造を有する。
一つの具体的な様態において、前記Ｌの両末端がそれぞれＦ、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域のアミン基またはチオール基及びＸのアミン基またはチオール基に結合して前記結合体が製造されてもよい。前記アミン基は、１級アミンまたは２級アミンであってもよい。
これらのアミン基は生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域のようなポリペプチドのＮ末端またはリジン残基の側鎖に位置し、前記チオール基は生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域のようなポリペプチドのシステイン残基の側鎖に位置してもよい。
前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域のようなポリペプチドのアミン基はアルデヒドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応して共有結合を形成してもよい。
前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域のようなポリペプチドのチオール基は、マレイミド、ヨウ化アセトアミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはチオール基と反応して共有結合を形成してもよい。
具体的には、結合体を形成する前に、前記Ｌは両末端にそれぞれＦ及びＸと結合されうる反応基、具体的には、ＸのＮ末端またはリジンに位置するアミン基、またはシステインのチオール基もしくはＦのＮ末端またはリジンに位置するアミン基、またはシステインのチオール基と結合されうる反応基を含んでもよいが、これに制限されない。
Ｘ及びＦ両方と結合される前に、Ｌは少なくとも２つの末端官能基を有してもよく、具体的には、２つまたは３つの末端官能基を有してもよく、より具体的には、２つの末端官能基を有してもよい。
具体的には、Ｌは少なくとも２つの末端官能基の種類がすべて同一の同種機能性（homofunctional）ＰＥＧであってもよく、少なくとも１つの末端官能基が他の末端官能基と異なる種類である異種機能性（heterofunctional）ＰＥＧであってもよい。例えば、前記ＰＥＧの一末端はアルデヒド基であり、他の末端はマレイミド基である、両末端を有するＰＥＧであってもよい。
また、前記ＰＥＧの両末端または三末端がすべてアルデヒド基である同種機能性ＰＥＧであってもよい。
例えば、前記Ｌは両末端にプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有するＰＥＧであってもよいが、特にこれに制限されない。
前記Ｌが両末端に反応アルデヒド基の官能基を有する場合、非特異的反応を最小化して、Ｌの両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アミン化で生成された最終産物はアミド結合で連結されたものよりもはるかに安定的である。アルデヒド官能基は、低いｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件では、リジン残基と共有結合を形成しうる。
前述したＬの末端官能基は、アミン反応性官能基（amine-reactive functional group）またはチオール反応性官能基（thiol-reactive functional group）であってもよい。
より具体的には、前記Ｌの少なくとも１つの末端官能基は、それぞれ独立して、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、ビニルスルホン、チオール、Ｃ6〜Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5〜Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、及びハロゲン化アセトアミドからなる群から選択されてもよく、より具体的には、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィド（Ortho-pyridyl disulfide）、及びヨウ化アセトアミドからなる群からそれぞれ独立して選択されてもよいが 、特にこれに制限されない。
前記Ｌの官能基は、前述された種類だけでなく、その当該分野で知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造しうる誘導体も、本発明のカテゴリに含まれるものである。
前記アルデヒド基は、アルキルアルデヒドであってもよく、例えば、Ｃ2〜Ｃ6アルキルアルデヒドであってもよく、具体的には、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などであってもよいが、特にこれに制限されない。
前記スクシンイミド基は、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル（具体的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートであってもよい。前記スクシンイミド基は、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に位置する目的とする官能基に結合されるために適切な形態を有してもよい。例えば、前記スクシンイミド基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであってもよい。
また、両末端にヒドロキシ官能基を有するＰＥＧを用いる場合、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記様々な反応基で活性化することができる。
既存インフレームフュージョン（inframe fusion）方法で製造された融合タンパク質で用いられたペプチド性リンカーの場合、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加の効果を期待するほど得られないこともあるため、本発明では、非ペプチドリンカーであるポリエチレングリコールを用いて結合体を製造してもよい。非ペプチドリンカーは、タンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリエチレングリコールを用いて、キャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。ポリエチレングリコールの分子量は、３．４ｋＤａ未満の範囲であるが、これに制限されない。
一方、本発明で用いられるポリエチレングリコールの分子量について前に説明した内容が、前記した内容、後述する内容にすべて適用される。
本発明に係る結合体において、Ｆは生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質をいう。前記用語は、本発明で「生体適合性物質」またはキャリアと互いに混合して用いられてもよい。
本発明において、「生体適合性物質または生体内半減期を増加させうる物質」は、前記結合体を構成する一部分である。
前記生体適合性物質またはキャリアは、目的とする生理活性物質に結合されてその生体内半減期を延長させうる物質であれば、その種類は制限されない。非制限的な例として、前記生体適合性物質またはキャリアは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、多糖類（saccharide）、ヘパリン、及びエラスチンからなる群から選択されるものであってもよい。
前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよいが、特にこれに制限されない。
前記生体適合性物質あるいはキャリアは共有または非共有結合でＸに結合されてもよい。また、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むポリペプチド、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域であってもよく、その例として、ＩｇＧ Ｆｃであってもよい。
アルブミンをキャリアとして用いる場合、アルブミンあるいはアルブミン断片を直接生理活性物質にリンカーを介して直接共有結合して生体内安定性を高める技術が含まれてもよく、アルブミンを直接結合しなくてもアルブミンに結合する物質、例えば、アルブミン特異的結合抗体もしくは抗体断片を生理活性物質に結合させてアルブミンに結合させる技術及びアルブミンに結合力を有する特定ペプチド／タンパク質（例えば、あるいはＡｆｆｉｂｏｄｙ社のａｌｂｕｍｏｄ技術を用いて生産されたアルブミン結合ペプチド）を生理活性物質に結合する技術が含まれてもよく、アルブミンに結合力を有する脂肪酸などを結合させる技術がこれに含まれてもよいが、これに限定されず、アルブミンを用いた生体内安定性を高める任意の技術、結合方式などがこれに含まれてもよい。
生体内半減期を増加させるために抗体もしくは抗体断片をキャリアとして用いて生理活性物質に結合させる技術も本発明に含まれてもよい。ＦｃＲｎ結合部位を有する抗体もしくは抗体断片であってもよく、ＦａｂなどのＦｃＲｎ結合部位を含まない任意の抗体断片であってもよい。触媒抗体を用いるＣｏｖＸ社のＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ技術がこれに含まれてもよく、免疫グロブリンＦｃ領域を用いて、生理活性物質の生体内半減期を増加させる技術も本発明に含まれてもよい。
また、生体内半減期を増加させるために、ペプチドもしくはタンパク質断片をキャリアとして用いて生理活性物質に結合させる技術も本発明に含まれてもよい。用いられるペプチドもしくはタンパク質断片は、特定アミノ酸の組み合わせの繰り返し単位で構成されたエラスチン様ポリペプチド（Elastin like polypeptide、ＥＬＰ）であってもよく、ｖｅｒｓａｒｔｉｓ社の人為的ポリペプチドＰＥＧであるＸｔｅｎ技術も本発明に含まれる。また、Ｚｅａｌａｎｄ社のマルチリジン（multi-Lysine）を用いて生体内半減期を増加させるＳＩＰ（Structure inducing probe）技術もこれに含まれるし、Ｐｒｏｌｏｒ社のＣＴＰ融合技術もこれに含まれており、生体内安定性が高いと知られているトランスフェリン（transferrin）あるいは結合組織の構成成分であるフィブロネクチン（fibronectin）などとその誘導体なども含まれてもよい。生理活性物質に結合させるペプチドまたはタンパク質は、これに限定されず、生理活性物質の生体内半減期を増加させる任意のペプチドもしくはタンパク質は本発明のカテゴリに含まれる。
また、生体内半減期を増加させるために用いられるキャリアは、多糖類もしくは脂肪酸などの非ペプチド性物質であってもよい。
免疫グロブリンＦｃ領域を用いる場合、Ｆｃ領域と生理活性物質を結合させるリンカー及び結合方式は、ポリエチレングリコールを用いた非ペプチド性結合であってもよい。Ｆｃ領域と生理活性物質の結合比は１：１もしくは１：２であってもよいが、これに限定されない。具体的には、前記Ｆｃ領域は、二量体形態であってもよく、二量体形態である免疫グロブリンＦｃ領域の一鎖に一分子の生理活性物質が結合されたり、二量体形態の免疫グロブリンＦｃの２鎖それぞれに生理活性物質が一分子ずつ結合した形態であってもよいが、特にこれに制限されない。
また、前記結合体において、前記式（１）または式（２）で、前記Ｆが免疫グロブリンＦｃ領域である時、ＬはＦのＮ末端領域に連結されているものであってもよいが、特にこれに制限されない。
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして用いるのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製及び収率面で有利であるのみならず、アミノ酸配列が抗体ごとに異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去され、物質の同質性が大幅に増加して血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待できる。
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を含む物質をいう。
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型Ｆｃと実質的に同等または向上された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全体重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインのうち１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域 （またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ（例えば、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインとヒンジ領域またはその一部との組み合わせ、そして前述した組み合わせを有するポリペプチド２つの二量体形態）、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体（mutant）を含む。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適した部位として用いられてもよい。
また、ジスルフィド結合を形成しうる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど、様々な種類の変異体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。これらの免疫グロブリンＦｃ領域配列の誘導体を製造する技術は、特許文献２０及び特許文献２１などに開示されている。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野で知られている（非特許文献４）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（Farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミド化（amidation）などに修飾（modification）されてもよい。
前述したＦｃ変異体は、本発明のＦｃ領域と同様の生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的な安定性を増大させた変異体である。
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、またはモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた遺伝子組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合には、Ｆａb及びＦｃに切断されるし、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いて、ＦｃまたはｐＦ’ｃを分離しうる。
好ましくは、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。これらの免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（c１q）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。この点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により適合する形態は糖鎖が除去されたり、非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域といえる。
本発明において、糖鎖の除去（Deglycosylation）は、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、より具体的には、大腸菌で生産して糖鎖化されないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、好ましくは、ヒト起源である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、ヒト血液中に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知されたＩｇＧ由来である。
一方、本発明において、「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源短鎖の免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
本発明において、「ハイブリッド（hybrid）」とは、短鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなるグループから１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではこれらの組み合わせまたはこれらの混成化も可能である。好ましくは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、Complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。つまり、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域はヒト生体で抗原として作用して、これに対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こしうる非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
より具体的な一つの様態において、前記生理活性物質（例えば、天然型インスリンまたはインスリンアナログ）と生体適合性物質は、その間に介在するリンカーである０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールを介して連結されており、前記生体適合性物質はＦｃＲｎ結合物質であってもよく、その例としてＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域、具体的には、ＩｇＧ Ｆｃ領域であってもよい。
本発明のもう一つの様態は、前記結合体を製造する方法を提供する。
前記結合体及びこれを構成する構成要素については前述した通りである。
一つの具体例において、本発明は、
（ａ）少なくとも２つの末端官能基を保有する０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールと、生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質のいずれかとを反応させて、生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質のいずれかが共有結合で連結されており、少なくとも１つの末端官能基を保有するポリエチレングリコールを製造する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で製造された生理活性物質またはその生体内半減期を増加させうる物質のいずれかが共有結合で連結されており、少なくとも１つの末端官能基を保有するポリエチレングリコールと生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質の他の一つとを反応させて、
生理活性物質及びその生体内半減期を増加させうる物質が０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールを介して共有結合で連結された結合体を製造する段階を含んでもよい。
ここで、前記（ａ）段階は１次反応段階、（ｂ）段階は２次反応段階として命名される。
前記結合体の製造に用いられる生理活性物質、ポリエチレングリコールの大きさ及び末端官能基を含む結合体の連結構成については、先に説明した通りである。
前記製造方法において、前記生理活性物質は、ポリエチレングリコールの末端官能基と反応して共有結合を形成する官能基を保有し、前記官能基は、アミン基またはチオール基であってもよい。
また、前記製造方法において、前記生理活性物質の半減期を増加させる物質は、ポリエチレングリコールの末端官能基と反応して共有結合を形成する官能基を保有し、前記官能基はアミン基またはチオール基であってもよい。
前記製造方法において、前記ポリエチレングリコールの末端官能基は、アミン反応性官能基（amine-reactive functional group）またはチオール反応性官能基（thiol-reactive functional group）であってもよい。
前記製造方法において、前記ポリエチレングリコールの末端官能基は、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、ビニルスルホン、チオール、Ｃ6〜Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5〜Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、及びハロゲン化アセトアミドからなる群から選択されてもよく、より具体的には、前記ポリエチレングリコールの末端官能基は、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィド（Ortho-pyridyl disulfide）、及びヨウ化アセトアミドからなる群から選択されてもよい。
前記スクシンイミドは、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートであってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
本発明の１次反応段階または２次反応段階において、前記ＰＥＧの末端官能基がアルデヒド基である場合、Ｘのアミン基またはＦのアミン基とＰＥＧのアルデヒド基間の還元性アミノ化反応で共有結合を形成してもよい。例えば、ＦのＮ末端に位置する−ＮＨ2とＰＥＧのアルデヒド基が反応して共有結合を形成してもよい。
これらの還元性アミノ化反応は、還元剤の存在下で行われてもよく、前記還元剤は、１次反応段階では１〜２０ｍＭの最終濃度で含まれてもよく、２次反応段階では、１〜１００ｍＭの最終濃度で含まれてもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
本発明において、還元剤はＰＥＧの官能基であるアルデヒド基とポリペプチド（生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域）のアミン基が結合して生成された可逆的イミン二重結合を還元することにより共有結合を生成させうる当該分野で知られているすべての還元剤を意味し、本発明の目的上、ＰＥＧが生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域と共有結合できるようにする反応溶液に含まれてもよい。
本発明において、前記還元剤は当業界で通常に用いる還元剤をすべて用いてもよく、これに制限されないが、具体的には、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium cyanoborohydride、ＳＣＢ）、ボランピリジン錯体（Borane pyridine complex）、水素化ホウ素ナトリウム（Sodium borohydride）、ボランジメチルアミン錯体（Borane dimethylamine complex）、ボラントリメチルアミン錯体（Borane trimethylamine complex）またはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium triacetoxyborohydride）であってもよい。前記還元剤は、ＸまたはＦの種類と反応溶媒に応じて適切な還元剤を自由に選択してもよい。
一方、前記１次反応段階または２次反応段階において、前記ＰＥＧの末端官能基がマレイミド基である場合、前記Ｘのシステイン残基のチオール基またはＦのシステイン残基のチオール基、すなわち、スルフヒドリル基（sulfhydryl moiety ）とＰＥＧのマレイミド基間の反応で共有結合（チオエーテル結合）を形成してもよい。
本発明のもう一つの様態は、前記結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したインスリン持続性製剤を提供する。
前記結合体については、先に説明した通りである。
一方、生体利用率を増加あるいは持続的な活性を維持しうる製剤として、ＰＬＧＡ、ヒアルロン酸、キトサンなどを用いたマイクロ粒子、ナノ粒子などによる徐放性（sustained release）剤形が、前記製剤に含まれてもよい。
また、生体利用率を増加あるいは持続的な活性を維持しうる別の様態の製剤としては、インプラント（implant）、吸入剤（inhalation）、ナザール（nasal）製剤、パッチ（patch）のような形態の製剤であってもよい。
前記持続性製剤は、生体内持続性及び安定性が天然型生理活性物質に比べて増加されたインスリンの持続性製剤であってもよい。
生理活性物質が天然型インスリンまたはそのアナログである場合、前記持続性製剤は、インスリン関連疾患、例えば、糖尿病の予防または治療用薬剤学的組成物であってもよい。ただし、これに制限されない。
本発明において、用語、「インスリン関連疾患」は、インスリンの生理活性がないか、低くて発生または進行する疾患であって、例えば、糖尿病が挙げられるが、特にこれに制限されない。
本発明の結合体を含む薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬剤学的に許容される担体は、経口投与時には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素及び香料などを用いてもよく、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤などを混合して用いてもよく、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、及び保存剤などを用いてもよい。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、前述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造してもよい。例えば、経口投与の時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウエハーなどの形態で製造してもよく、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造してもよい。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、及び徐放型製剤などで剤形化してもよい。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが用いられてもよい。
また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
また、本出願の結合体は、本出願の組成物の総重量に対して０．００１重量％〜１０重量％で含まれてもよいが、特にこれに制限されるものではない。
本発明のもう一つの様態は、前記式（２）で表される結合体またはこれを含む製剤を、これを必要とする個体に投与する段階を含むインスリン関連疾患の治療方法を提供する。
本発明に係る結合体は、糖尿病の治療に有用であり、これを含む薬剤学的組成物を投与することにより、前記疾患の治療を図ることができる。
本発明において、「投与」は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体の投与経路は薬物が目的の組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を介して投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などになってもよいが、これに制限されない。しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが望ましい。好ましくは、注射剤の形態で投与されてもよい。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動しうる任意の装置によって投与されてもよい。
また、本発明の結合体またはこれを含む薬剤学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、及び疾患の中等度などのいくつかの関連因子と一緒に、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。本発明の薬剤学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れているため、本発明の薬剤学的製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させうる。
以下、実施例を介して本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１：インスリン−３．４ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
インスリン粉末（Biocon、India）を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、３．４Ｋ ｐｒｏｐｉｏｎ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を１つずつ有するＰＥＧ、NOF社、米国）をインスリンβ鎖のＮ末端にＰＥＧ化させるために、インスリン：ＰＥＧのモル比を１：４にして、インスリン濃度を５ ｍｇ／ｍＬの４℃で約２時間反応させた。この時、反応は５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と４５％イソプロパノールの混合溶媒で、３ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride（ＮａＣＮＢＨ3））還元剤を添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％ＥｔＯＨを含むバッファーとＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ−ＨＰ（GE Healthcare）カラムを用いて精製した。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化された（mono-PEGylated）インスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２になるようにして、全体タンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、２５℃で１５時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭヘぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ８．２）と塩化ナトリウムに還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。
反応が終結した後、反応液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーとＮａＣｌ濃度勾配を用いて、Ｑ−ＨＰ（GE、米国）カラムに適用し、硫酸アンモニウム（ammoniumsulfate）とＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の濃度勾配を利用して、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（GE、米国）に適用して、インスリン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
前記インスリン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、本願で３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体と混用されて用いられる。
溶出されたインスリン−３．４Ｋ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析し、それぞれ９８．５％、９７．４％の純度を確認し（図３及び図４）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度結果は、図１のとおりである。
実施例２：インスリン−３．０ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
インスリン粉末（Biocon、India）を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、３Ｋ ｂｕｔｙｌ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれブチルアルデヒド基を１つずつ有するＰＥＧ、韓美精密化学、韓国）をインスリンβ鎖と免疫グロブリンＦｃのＮ末端にＰＥＧ化させるために、前記実施例１のようなＰＥＧ化反応条件及び精製条件と免疫グロブリンＦｃ断片との反応条件及び精製条件に沿ってインスリン−３ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造及び精製した。
前記インスリン−３ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、本願で３ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体と混用されて用いられる。
溶出されたインスリン−３ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＩＥ−ＨＰＬＣを用いて分析し、それぞれ９９．７％、９７．９％の純度を確認した（図３及び図４）。
実施例３：インスリン−２．５ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
インスリン粉末（Biocon、India）を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、２．５Ｋ ｂｕｔｙｌ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれブチルアルデヒド基を１つずつ有するＰＥＧ、韓美精密化学、韓国）をインスリンβ鎖と免疫グロブリンＦｃのＮ末端にＰＥＧ化させるために、前記実施例１のようなＰＥＧ化反応条件及び精製条件と免疫グロブリンＦｃ断片との反応条件及び精製条件に沿ってインスリン−２．５ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造及び精製した。
前記インスリン−２．５ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、本願で２．５ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体と混用されて用いられる。
溶出されたインスリン−２．５ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析し、それぞれ９９．４％及び９９．４％の純度を確認した（図３及び図４）。
実施例４：インスリン−２ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
インスリン粉末（Biocon、India）を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、２Ｋ ｂｕｔｙｌ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれブチルアルデヒド基を１つずつ有するＰＥＧ、LAYSAN BIO社、米国）をインスリンβ鎖と免疫グロブリンＦｃのＮ末端にＰＥＧ化させるために、前記実施例１のようなＰＥＧ化反応条件及び精製条件と免疫グロブリンＦｃ断片との反応条件及び精製条件に沿ってインスリン−２ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造及び精製した。ただし、反応が終結した後、反応液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーとＮａＣｌ濃度勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE、米国）カラムを適用し、硫酸アンモニウムとＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の濃度勾配を利用し、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（GE、米国）に適用して、インスリン−２ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
前記インスリン−２ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、本願で２ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体と混用されて用いられる。
溶出されたインスリン−２ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析し、それぞれ９９．９％及び９９．４％の純度を確認した（図３及び図４）。
実施例５：インスリン−１ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
インスリン粉末（Biocon、インド）を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、１Ｋ ｂｕｔｙｌ−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にそれぞれブチルアルデヒド基を１つずつ有するＰＥＧ、NEKTAR社、米国）をインスリンβ鎖のＮ末端にＰＥＧ化させるために、前記実施例１のようなＰＥＧ化反応条件及び精製条件と免疫グロブリンＦｃ断片との反応条件及び精製条件に沿ってインスリン−１ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造及び精製した。
前記インスリン−１ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、本願で１ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体と混用されて用いられる。
溶出されたインスリン−１ｋＤａ ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析し、それぞれ９９．８％及び９９．２％の純度を確認し（図３及び図４）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度結果は、図２のとおりである。
実施例６：持続型インスリン結合体のＰＥＧリンカーの長さに応じた正常ラットでの薬効持続性効果の分析
正常ラットに前記で製造した１ｋＤａ、２ｋＤａ、２．５ｋＤａ、３ｋＤａ、または３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体を投与して、持続型インスリン結合体のＰＥＧリンカーの長さに応じた薬効持続性の違いを確認した。
８週齢の正常ラットを対照群（vehicle）、１ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体の投与群（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ）、２ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体の投与群（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ ） 、２．５ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体の投与群（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ ）、３ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体の投与群（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ）及び３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ ）投与群にそれぞれ分けた。正常ラットに、前記試験物質を各群ごとに３匹ずつ単回皮下投与した後、１、４、８、２４、４８及び７２時間でそれぞれ尾静脈採血を介して全血を１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに入れ、５，０００ｒｐｍで１０分間常温で遠心分離し、血清を分離した後、−２０℃で保管した。保管された各群の血清はＥＬＩＳＡ分析法を用いて血清中のインスリン結合体の濃度を定量化した。ＥＬＩＳＡ分析はインスリンモノクロナール抗体がコーティングされたプレート（ALPCO、＃80-INSHU-E10.1）に各時間に取った血清と抗ヒトＩｇＧ４−ＨＰＲ（Alpha Diagonosis、＃10124）とを同時に入れて、１時間常温で反応させた後、ＴＭＢ試薬で発色反応させ、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定する方式とした。
その結果、３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体の投与群に比べて１ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は、ＡＵＣが１．８４倍、２ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は１．８０倍、２．５ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は１．４１倍、そして３ｋＤａ ＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は、１．４３倍に増加したことを確認した（図６）。
このような結果は、リンカーとして用いられるポリエチレングリコールの大きさが短いほど、インスリン結合体が驚くべきことに生体内で血中半減期が増加して安定的なインスリン製剤として提供することができ、糖尿病の治療剤として効果的に用いられることを示唆する。
また、リンカーとして用いられるポリエチレングリコールの大きさが短いほど、これを用いた生理活性ポリペプチド結合体の生体内での血中半減期が驚くほど増加して、安定的な薬剤として提供することができることを示唆するものである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (19)

  1. 下記式（１）を有する結合体：
    Ｘ-Ｌ-Ｆ （１）；
    ここで、
    Ｘが、生理活性物質であり、
    Ｌが、リンカーであって、０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールであり、
    Ｆが、生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質である。
  2. 前記結合体が、前記結合体とＸ及びＦは同一であり、リンカーであるＬが３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールであることが、他の結合体と比較して増加された生体内半減期を示す、請求項１に記載の結合体。
  3. 前記Ｌが、０ｋＤａ超え〜３ｋＤａ以下の大きさを有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載の結合体。
  4. 前記生理活性物質が、トキシン；またはＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト；グルカゴン受容体アゴニスト；ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）受容体アゴニスト；ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）受容体アゴニスト；コレシストキニン（Cholecystokinin）受容体アゴニスト；ガストリン（gastrin）受容体アゴニスト；メラノコルチン（melanocortin）受容体アゴニスト；ＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して結合する物質；ソマトスタチン；ＰＹＹ（peptide YY）；ＮＰＹ（neuropeptide Y）；オキシントモジュリン；繊維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor）；ブラジキニン；エレドイシン（Eledoisin）；オキシトシン（Oxytocin）；バソプレシン（vasopressin）； セルモレリン（Sermorelin）；プロラクチン放出ペプチド；オレキシン（Orexin）；甲状腺放出ペプチド；カルモジュリン；モチリン（Motilin）；血管作用性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）；心房性ナトリウム利尿ペプチド （Atrial natriuretic peptide；ＡＮＰ）； Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；ＣＮＰ）；ニューロキニン（Neurokinin）Ａ；ニューロメディン（Neuromedin）；レニン（Renin）； エンドセリン（Endothelin）；サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）；カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin peptide）；デルモルフィン（Dermorphin）；ダイノルフィン（Dynorphin）；エンドルフィン（Endorphin）；エンケファリン（Enkepalin）；腫瘍壊死因子受容体；ウロキナーゼ受容体；チモポエチン（Thymopoietin）；サイムリン（Thymulin）；チモペンチン（Thymopentin）；チモシン（Tymosin）；胸腺液性因子（Thymic humoral factor）；アドレノメデュリン（Adrenomodullin）；アラトスタチン（Allatostatin）； アミロイドβ−プロテイン断片（Amyloid beta-protein fragment）；抗菌性ペプチド； 抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１（Intercellular Adhesion Molecule 1）、ＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule 1）、ロイコカイン（Leucokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）、フューゼオン（Fuzeon）；グルカゴン様ペプチド；Ｇプロテイン関連受容体（Gprotein-coupled receptor）；赤血球増殖因子；白血球増殖因子；アミリン；ヒト成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン放出ペプチド；インターフェロン；インターフェロン受容体；コロニー刺激因子；インターロイキン；インターロイキン受容体；酵素；インターロイキン結合タンパク質；サイトカイン結合タンパク質；マクロファージ活性因子；マクロファージペプチド；Ｂ細胞因子；Ｔ細胞因子；タンパク質Ａ；アレルギー抑制因子；細胞壊死糖タンパク質；免疫毒素；リンホトキシン；腫瘍壊死因子；腫瘍抑制因子；転移成長因子；α−１アンチトリプシン；アルブミン；α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）；アポリポタンパク質Ｅ；赤血球生成因子；高糖鎖化赤血球生成因子；アンジオポエチン（angiopoietin）；ヘモグロビン；トロンビン（thrombin）；トロンビン受容体活性ペプチド；トロンボモジュリン（thrombomodulin）；血液凝固因子ＶＩＩ；血液凝固因子ＶＩＩａ；血液凝固因子ＶＩＩＩ；血液凝固因子ＩＸ；血液凝固因子ＸＩＩＩ；プラスミノーゲン活性因子；フィブリン結合ペプチド；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；ヒルディン（hirudin）；タンパク質Ｃ；Ｃ反応性タンパク質；レニン抑制剤；コラゲナーゼ抑制剤；スーパーオキシドジスムターゼ；レプチン；血小板由来成長因子；上皮細胞成長因子；表皮細胞成長因子；アンジオスタチン（angiostatin）；アンジオテンシン（angiotensin）；骨形成成長因子；骨形成促進タンパク質；カルシトニン；インスリン；アトリオペプチン；軟骨誘導因子；エルカトニン（elcatonin）；結合組織活性因子；組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）；卵胞刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；神経成長因子類；アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）；脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）；グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）；ネトリン（netrin）；好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）；神経栄養因子；ニュールツリン（neuturin）；副甲状腺ホルモン；リラキシン；セクレチン；ソマトメジン；インスリン様成長因子；副腎皮質ホルモン；グルカゴン；コレシストキニン；膵臓ポリペプチド；ガストリン放出ペプチド；ガストリン抑制ペプチド；コルチコトロピン放出因子；甲状腺刺激ホルモン；オートタキシン（autotaxin）；ラクトフェリン（lactoferrin）；ミオスタチン（myostatin）； ＡＤＮＰ（activity-dependent neuroprotective protein）、ＢＡＣＥ１（beta-secretase1）、ＡＰＰ（Amyloid Precursor Protein）、ＮＣＡＭ（Neural cell adhesion molecule）、アミロイドβ（Amyloid beta）、タウ（Tau）、ＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts ）、α−シヌクレイン（alpha-synuclein）、またはこれらのアゴニストまたはアンタゴニスト；受容体類、受容体アゴニスト；細胞表面抗原；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；抗体断片；ウイルス由来ワクチン抗原；１つ以上の受容体アゴニストを活性化させるハイブリッドポリペプチドまたはキメラ（chimeric）ポリペプチド；及びこれらのアナログである、請求項１に記載の結合体。
  5. 前記トキシンが、メイタンシン（Maytansine）またはその誘導体、オーリスタチン（Auristatin）またはその誘導体、デュオカルマイシン（Duocarmycin）またはその誘導体、及びＰＢＤ（Pyrrolobenzodiazepine）またはその誘導体からなる群から選択され、
    ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニストが、天然型ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）、天然型エキセンジン−３、天然型エキセンジン−４、及びこれらのアナログからなる群から選択されたものであり、
    ＦＧＦ受容体アゴニストが、ＦＧＦ１またはそのアナログ、ＦＧＦ１９またはそのアナログ、ＦＧＦ２１またはそのアナログ、及びＦＧＦ２３またはそのアナログからなる群から選択され、
    インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγからなる群から選択され、
    インターフェロン受容体が、インターフェロンα受容体、インターフェロンβ受容体、インターフェロンγ受容体、及び水溶性タイプＩインターフェロン受容体からなる群から選択され、
    インターロイキンが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６、インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、及びインターロイキン−３０からなる群から選択され、
    インターロイキン受容体が、インターロイキン−１受容体またはインターロイキン−４受容体であり、
    酵素が、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパリンＮ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、アガルシダーゼβ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択され、
    インターロイキン結合タンパク質が、ＩＬ−１８ｂｐであり、
    サイトカイン結合タンパク質が、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor）結合タンパク質であり、
    神経成長因子類が、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、及びニュールツリン（neuturin）からなる群から選択され、
    ミオスタチン受容体が、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、及びＢ細胞活性因子受容体からなる群から選択され、
    ミオスタチン受容体アンタゴニストが、ＩＬ１−Ｒａであり、
    細胞表面抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、及びＣＤ６９からなる群から選択され、
    抗体断片類が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｄからなる群から選択される、請求項４に記載の結合体。
  6. 前記生理活性物質が、天然型エキセンジン−３またはそのアナログ、天然型エキセンジン−４またはそのアナログ、天然型インスリンまたはそのアナログ、天然型ＧＬＰ−１またはそのアナログ、天然型ＧＬＰ−２またはそのアナログ、天然型オキシントモジュリンまたはそのアナログ、天然型グルカゴンまたはそのアナログ、天然型繊維芽細胞成長因子またはそのアナログ、天然型グレリンまたはそのアナログ、天然型カルシトニンまたはそのアナログ、天然型顆粒球コロニー刺激因子またはそのアナログ、またはＧＬＰ受容体、グルカゴン受容体、及びＧＩＰ受容体のうち２以上の受容体に対して結合する物質；である、請求項１に記載の結合体。
  7. 前記生理活性物質が、天然型インスリンまたは天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログである、請求項１に記載の結合体。
  8. 前記インスリンアナログが、天然型インスリンに比べて減少したインスリン受容体の結合力を有し、天然型インスリンのＢ鎖またはＡ鎖の１つ以上のアミノ酸の変異または欠失を含むものである、請求項７に記載の結合体。
  9. 前記インスリンアナログが、インスリンＢ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、３番アミノ酸、５番アミノ酸、８番アミノ酸、１０番アミノ酸、１２番アミノ酸、１６番アミノ酸、２３番アミノ酸、２４番アミノ酸、２５番アミノ酸、２６番アミノ酸、２７番アミノ酸、２８番アミノ酸、２９番アミノ酸、３０番アミノ酸、Ａ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、５番アミノ酸、８番アミノ酸、１０番アミノ酸、１２番アミノ酸、１４番アミノ酸、１６番アミノ酸、１７番アミノ酸、1８番アミノ酸、１９番アミノ酸及び２１番アミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたり欠失されたものである、請求項８に記載の結合体。
  10. 前記インスリンアナログが、天然型インスリンＢ鎖の８番アミノ酸、２３番アミノ酸、２４番アミノ酸、２５番アミノ酸、天然型インスリンＡ鎖の１番アミノ酸、２番アミノ酸、１４番アミノ酸及び１９番アミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものである、請求項９に記載の結合体。
  11. 前記置換する他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン、イソロイシン、バリン、グルタミン、グリシン、リジン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン及びアスパラギン酸からなる群から選択されたものである、請求項１０に記載の結合体。
  12. Ｆが、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、多糖類（saccharide）、ヘパリン、及びエラスチンからなる群から選択される、請求項１に記載の結合体。
  13. 前記高分子重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の結合体。
  14. 前記Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１に記載の結合体。
  15. Ｆが、ＩｇＧ Ｆｃ領域である、請求項１に記載の結合体。
  16. （ａ）少なくとも２つの末端官能基を保有する０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールと、生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質のいずれかとを反応させて、
    生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質のいずれかが共有結合で連結されており、少なくとも１つの末端官能基を保有するポリエチレングリコールを製造する段階；
    （ｂ）前記（ａ）段階で製造されたポリエチレングリコールと生理活性物質または生理活性物質の生体内半減期を増加させうる物質の他の一つとを反応させて、
    生理活性物質及びその生体内半減期を増加させうる物質が０ｋＤａ超え〜３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールを介して共有結合で連結された結合体を製造する段階を含む、
    請求項１に記載の結合体の製造方法。
  17. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加した持続性製剤。
  18. 請求項７〜１１のいずれか一項に記載の結合体を含む、糖尿病の予防または治療用製剤。
  19. 請求項１８に記載の糖尿病の予防または治療用製剤を糖尿病の治療を必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病の治療方法。
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