JP2020502478A - 試料分析のためのデバイスおよび方法 - Google Patents

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Abstract

ナノポアを用いた検体分析のための方法、デバイス、およびシステムが開示される。該方法、デバイス、およびシステムは、各々が生物学的試料中の検体に特異的に結合する第１および第２の結合メンバーを使用する。この方法はさらに、第２の結合メンバーに付着した切断可能なタグを検出および／またはカウントすることと、タグの存在および／または数を検体の存在および／または濃度と相関させることと、を含む。検出および／またはカウントは、ナノポアを通してタグ／第２の結合メンバーを転位させることによって行われてもよい。本明細書ではまた、液滴を作動させるための電極のアレイを含み、さらに電気化学種感知領域を含むカートリッジを動作させるようにプログラムされた器具が提供される。該器具を使用して、液滴を作動させるための電極のアレイを含み、さらにナノポアを通してタグ／第２の結合メンバーの転位を検出するためのナノポア層を含む、カートリッジ内の試料を分析することができる。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／４０４，７２２号および２０１６年１１月２１日に出願された米国仮出願第６２／４２４，９９６号の優先権を主張し、これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、例えば、マイクロ流体デバイスと動作可能に結合された検体検出デバイスを使用する、検体分析のための方法、デバイス、およびシステムに関する。
試料中の目的の検体（複数可）を正確に分析することができる方法およびデバイスは、診断、予後診断、環境評価、食品の安全性、化学兵器または生物兵器の検出等に不可欠である。そのような方法およびデバイスは、正確で、精密、かつ高感度である必要があるだけでなく、微量試料が迅速にかつ最小の器具使用で分析されるときにも有利である。そのようなものとして、改良された試料分析能力を有する方法およびデバイスに関心がある。
本開示の実施形態は、試料中の検体（複数可）の分析のための方法、システム、およびデバイスに関する。ある特定の実施形態では、試料は、生物学的試料であり得る。
試料中の検体の分析のための方法は、試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、固体支持体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含む、接触させることと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合している第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグの数を決定することと、層を通って転位するタグの数に基づいて試料中の検体の濃度を決定することと、を必要とし得る。ある特定の実施形態では、検体の濃度は、単位時間当たりに層を通って転位するタグの数をカウントすることによって決定され得る。他の実施形態では、検体の濃度は、層を通って転位するタグの数が閾値に達する時間を決定することによって、または期間を設定し、その設定された期間内の累積カウント数をカウントすることによって決定され得る。
別の実施形態では、方法は、標的検体を含有する試料を既知量の標的検体または競合物分子と組み合わせることを含んでもよく、標的検体（試料と組み合わされる）または競合物分子は、切断可能なリンカーを介してタグに付着して、タグ付き検体またはタグ付き競合物分子をそれぞれ産生し、タグ付き検体またはタグ付き競合物分子は、第１の結合メンバーへの結合について標的検体と競合する。この方法はさらに、組み合わせた試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、標的検体（およびタグ付き検体またはタグ付き競合物分子）に特異的に結合する、接触させることと、任意の洗浄ステップのために固体支持体を緩衝液と接触させることと、固体支持体上に固定化された第１の結合メンバーに結合しているタグ付き検体またはタグ付き競合物に付着しているタグを切断することと、切断されたタグを層内のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグの数を決定することと、層を通って転位するタグの数に基づいて試料中の検体の濃度を決定することと、を含み得る。ある特定の実施形態では、検体の濃度は、単位時間当たりに層を通って転位するタグの数をカウントすることによって決定され得る。他の実施形態では、検体の濃度は、層を通って転位するタグの数が閾値に達する時間を決定することによって、または期間を設定し、その設定された期間内の累積カウント数をカウントすることによって決定され得る。この実施形態では、ナノポアを通って転位するタグの数、または層を通って転位するタグの数が閾値に達する時間は、試料中の検体の濃度と逆相関し得る。例えば、カウント数が少ないほど、または閾値に達する時間が長いほど、試料中の標的検体の濃度は高くなる。
一態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関する。この方法は、試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含む、接触させることと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合している第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを測定することが評価され、層を通って転位するタグの数が、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを検出することが評価され、層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関する。この方法は、試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、固体基質に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを測定することが評価され、層を通って転位するアプタマーの数は、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを検出することが評価され、層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
一態様では、本発明は、電極のアレイを含む底部基板、底部基板から離間している上部基板、および底部基板と上部基板との間に配設されたナノポア層を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関する。このデバイスは、近位部分および遠位部分を含み、ナノポア層は、遠位部分に配設されている。近位部分の電極のアレイは、液滴を生成するように構成されている。電極のアレイは、液滴がナノポア層によって第１の部分と第２の部分とに分割されるように、ナノポア層を横切って液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも２つの電極は、ナノポア層を横切って位置付けられ、これらの２つの電極は、アノードおよびカソードを形成し、液滴がナノポア層を横切って位置付けられたときにナノポア層内のナノポアを通して電流を駆動するように動作する。
一態様では、本発明は、電極のアレイを含む底部基板、底部基板から離間し、電極を含む上部基板、および底部基板と上部基板との間に配設されたナノポア層を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関する。このデバイスは、近位部分および遠位部分を含み、ナノポア層は、遠位部分に配設されている。近位部分の電極のアレイおよび電極は、液滴を生成するように構成されている。電極のアレイおよび電極は、ナノポア層が液滴を第１の部分と第２の部分とに分割するように、ナノポア層を横切って液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも１つの電極は、ナノポア層を横切って位置付けられた液滴の第１の部分と接触し、上部基板内の電極は、ナノポア層を横切って位置付けられた液滴の第２の部分と接触するように位置付けられ、２つの電極は、アノードおよびカソードを形成し、液滴がナノポア層を横切って位置付けられたときにナノポア層内のナノポアを通して電流を駆動するように動作する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関する。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを測定することが評価され、層を通って転位するタグの数が、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを検出することが評価され、層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関する。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含む、接触させることと、結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、結合メンバーに結合した標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを測定することが評価され、層を通って転位するアプタマーの数は、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを検出することが評価され、層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関する。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、固定化された検体と接触させることであって、固定化された検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、固定化された検体に結合していない結合メンバーを除去することと、固定化された検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを測定することが評価され、層を通って転位するタグの数が、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグが評価され、層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関する。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、固定化された検体と接触させることであって、固定化された検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、固定化された検体に結合していない結合メンバーを除去することと、固定化された検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを測定することが評価され、層を通って転位するアプタマーの数は、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを検出することが評価され、層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。
ある特定の態様では、タグは、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、またはナノ粒子であり得る。ある特定の場合において、タグは、オリゴヌクレオチドポリマーなどのアニオン性ポリマーを含み得る。ある特定の場合において、オリゴヌクレオチドポリマーは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸であり得る。ある特定の場合において、オリゴヌクレオチドポリマーは、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーであり得、アプタマーは検体に結合しない。例示的な場合において、タグは、正電荷ナノ粒子または負電荷ナノ粒子であり得るナノ粒子を含み得る。
ある特定の実施形態では、タグは、デンドリマー、ビーズ、ナノ粒子、例えばナノビーズ等の球状タグであり得る。ある特定の実施形態では、タグは、リボースまたはデオキシリボース単位のポリマー、オリゴヌクレオチド、および核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどの線状もしくは実質的に線状でないか、または細長い形状でない場合がある。
ある特定の場合において、第１および第２の結合メンバーは、アプタマー、抗体、または受容体であり得る。例えば、第１の結合メンバーは、受容体であり得、第２の結合メンバーは、抗体であり得るか、または第１の結合メンバーは、抗体であり得、第２の結合メンバーは、受容体であり得る。ある特定の例において、第１の結合メンバーは、第１の抗体であり得、第２の結合メンバーは、第２の抗体であり得る。
ある特定の例において、タグは、負電荷であり得、転位は、層を横切って正電位を印加することによって、層を横切ってタグを転位させることを含み得る。
ある特定の例において、タグは、正電荷であり得、転位は、層を横切って負電位を印加することによって、タグを層を横切って転位させることを含み得る。
他の実施形態では、タグは、核酸であり得、タグは、転位前にタグの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。
別の実施形態では、アプタマーを第２の結合メンバーとして使用することによって生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法が提供される。例えば、この方法は、試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、固体基質に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、固体基質に結合している検体からアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内のナノポア（複数可）を通して転位させることと、層を通って転位するアプタマーの数を決定することと、層を通って転位するアプタマーの数に基づいて試料中の検体を測定することと、を含み得る。この実施形態では、第２の結合メンバーが、ナノポア（複数可）によって直接検出されるため、第２の結合メンバーは、タグに付着していない。
アプタマーは、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーであり得る。第１の結合メンバーは、抗体であり得る。ある特定の例において、検体は、リガンドであり得、第１の結合メンバーは、受容体であり得る。
試料中の複数の異なる検体を同時に分析するための方法もまた、本明細書に開示されている。例えば、この方法は、第１および第２の検体、第１、第２、および第３の検体等の分析を含み得る。ある特定の場合において、試料中の複数の異なる検体の分析方法は、試料を複数の異なる第１の結合メンバーと接触させることを含み、異なる第１の結合メンバーの第１の結合メンバーは、複数の異なる検体のうちの第１の検体に特異的に結合し、異なる第１の結合メンバーのうちの第２の結合メンバーは、複数の異なる検体のうちの第２の検体に特異的に結合する等である。この方法は、異なる検体を複数の第２の結合メンバーと接触させることをさらに含み得、複数の第２の結合メンバーのうちの第１の結合メンバーは、第１の検体に結合し、複数の第２の結合メンバーのうちの第２の結合メンバーは、第２の検体に結合する等である。ある特定の例において、複数の異なる第２の結合メンバーの各々は、互いに別個であるかまたは区別可能なタグを含み得る（例えば、異なる第２の結合メンバーの各々は異なるタグを有する）。例えば、複数の第２の結合メンバーのうちの第１の結合メンバーは、第１のタグを含み得、複数の第２の結合メンバーのうちの第２の結合メンバーは、第２のタグを含み得る等であり、第１のタグおよび第２のタグは、互いに区別可能である。タグを区別することは、任意の好適な方法を使用して、例えばタグの性質または特性に基づいて行われ得る。
この方法は、未結合の第２の結合メンバーを除去することと、検体に結合した複数の第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、層内のナノポアを通してタグを転位させることと、層を通って転位する各タグの数を決定することと、層を通って転位する各タグの数に基づいて、試料中の複数の異なる検体を測定することと、をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、検体の濃度は、単位時間当たりに層を通って転位するタグの数をカウントすることによって決定され得る。他の実施形態では、検体の濃度は、層を通って転位するタグの数が閾値に達する時間を決定することによって決定されてもよい。本明細書に記載されるように、ある特定の場合において、第２の結合メンバーは、複数のアプタマーであり得、これらのアプタマーは、アプタマーがカウントされるときにタグに付着されていない。これらの実施形態では、アプタマーは、ナノポア（複数可）を通してまたはそれを横切って転位する前に、検体から解離させることができる。
ある特定の場合において、異なるアプタマーなどの異なるタグは、ナノポア力分光法、光学的手段もしくは電気的手段、またはそれらの組み合わせによって互いに区別可能であり得る。
開示された方法を実行するためのキット、システム、およびデバイスもまた、本明細書で提供される。キット、システム、およびデバイスを使用して、自動化または半自動化された方法で検体分析を実行することができ、任意選択で、検体分析に利用される使い捨て／消耗品構成要素を含んでもよい。自動および半自動デバイスは、マイクロ流体を利用することができる。例示的なマイクロ流体としては、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）、表面音響波（ＳＡＷ）マイクロ流体、液滴ベースのマイクロ流体デバイス等が挙げられる。例示的なマイクロ流体はまた、完全に集積されたＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全に集積されたＳＡＷおよびナノポアデバイスを含む。ある特定の場合において、開示された方法を実行するためのデバイスは、ナノポアデバイスと共に使用されるデジタルマイクロ流体デバイスであり得る。他の実施形態では、開示された方法を実行するためのデバイスは、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであり得る。これらのデバイスは、使い捨てデバイスであり得るか、または再使用可能であり得る（検体分析に複数回使用される）。本明細書に記載のデジタルマイクロ流体デバイスおよびナノポアデバイスは、小型化された低コストの検体分析を提供することができ、低コストの技術を使用して製造され得る。
マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを含む集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスもまた、本明細書に開示され、マイクロ流体モジュールは、電極のアレイの少なくとも一部と重なる大きさの単一電極から離間している電極のアレイを含み、電極のアレイおよび単一電極は、少なくとも１滴の流体を電極のアレイ内の転送電極に輸送し、転送電極は、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとを動作可能に結合する界面に位置付けられ、ナノポアモジュールは、第１の基板の第１の表面上に位置付けられた第１のマイクロチャネルを含み、第２のマイクロチャネルは、第２の基板の第１の表面上に位置付けられ、第１の基板の第１の表面は、第２の基板の第１の表面と接触し、それによって第１のマイクロチャネルおよび第２のマイクロチャネルを取り囲み、第１の毛細管チャネルおよび第２の毛細管チャネルをそれぞれ提供し、少なくとも第１の毛細管チャネルは、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面まで延在し、転送電極に隣接し、転送電極上に位置付けられた液滴を受け取るように位置付けられ、第１の毛細管チャネルは、第２の毛細管チャネルと交差し、ナノポア層は、第１および第２の毛細管チャネルが交差する位置で、第１の基板と第２の基板との間に位置付けられる。
ある特定の実施形態では、電極のアレイは、電極を転送する第１および第２の転送電極を含み得、各々が転送電極の表面上に液滴を位置付けるように構成されており、第１の毛細管チャネルは、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面まで延在し、第１の転送電極に隣接し、第１の転送電極上に位置する液滴を受け取るように位置付けられ、第２の毛細管は、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面まで延在し、第２の転送電極に隣接し、第２の転送電極上に位置する液滴を受け取るように位置付けられている。
ある特定の実施形態では、第２の毛細管チャネルは、界面まで延在していなくてもよく、マイクロ流体モジュールの電極に接続されなくてもよく、第２の毛細管の一方または両方の端部の通気口またはリザーバに接続されてもよい。ある特定の場合において、第２の毛細管は、一端で第１のリザーバに、他端で第２のリザーバに接続されている。
ある特定の実施形態では、第１のリザーバおよび／または第２のリザーバは、交差部で第１の毛細管チャネルを横切って位置付けられる流体を含み、この流体は、ナノポア層の動作を促進してナノポア層のナノポアを通して電流を駆動する。ある特定の実施形態では、第１の毛細管チャネルおよび／または第２の毛細管チャネルは、交差部のいずれかの側の幅と比較して、交差部で幅が減少するように、毛細管の長さを横切って断面幅が変化する。
いくつかの実施形態では、第１の毛細管は、第１の電極対を含み、第２の毛細管は、第２の電極対を含み、第１の電極対は、第１の毛細管チャネル内に位置付けられ、ナノポア層内のナノポアに隣接し、第２の電極対は、第２の毛細管チャネル内に位置付けられ、ナノポア層内のナノポアに隣接する。液滴は、ナノポア層内のナノポアを通して輸送することによって検出および／またはカウントされる分子を含む液滴であり得る。
ある特定の実施形態では、液滴は、異なる組成を有し、第１の液滴および第２の液滴であり、第１の液滴は、ナノポアを通してナノポア層を横切って輸送することにより検出および／またはカウントされる分子を含み、第２の液滴は、その分子を欠く導電性流体を含み、この導電性流体は、ナノポアを介してナノポア層を横切る分子の輸送を容易にする。
ある特定の実施形態では、第１の毛細管チャネルは、ナノポア層に近接して位置付けられた第１の電極を含み、第２の毛細管チャネルは、ナノポア層に近接して位置付けられた第２の電極を含み、第１および第２の電極の各々は、それらが毛細管チャネル内に存在する流体と接触するように毛細管チャネル内で露出され、第１および第２の電極は、液体が第１および第２の毛細管チャネル内のナノポア層を横切って位置付けられると、ナノポア層内のナノポアを通して電流を駆動するように動作する。
ある特定の実施形態では、転送電極および第１の毛細管チャネルは、実質的に同じ平面上にあり、液滴は、第１の毛細管チャネルの開口部と整列している。
いくつかの実施形態では、転送電極は、第１の毛細管チャネルよりも高い平面にあり、デバイスは、液滴を第１の毛細管チャネルの開口部まで転送するための垂直ポートを備えて構成されている。
特定の実施形態では、第１の基板の第１の表面は、電極のアレイが配設される第１の領域と、第１のマイクロチャネルが形成される第２の領域とを含み、電極のアレイは、第１のマイクロチャネルが形成される平面よりも高い平面上にある。
いくつかの実施形態では、第２の基板は、界面に位置する側縁部にノッチを含み、ノッチは、第１の毛細管チャネル上に整列され、転送電極に位置する液滴を第１の毛細管チャネルの開口部に輸送するための垂直ポートを提供する。
場合によって、単一電極は、転送電極上に延在し、転送電極との二平面構成であり、単一電極および転送電極は、液滴を転送電極に移動させるように動作する。
他の場合において、単一電極は、転送電極上に延在し、転送電極との二平面構成であり、単一電極および転送電極は、液滴を転送電極に移動させるように動作する。
ある特定の実施形態では、単一電極は、転送電極上に延在せず、転送電極との二平面構成ではなく、液滴は、共面電極を使用することによって転送電極に移動される。
ある特定の実施形態では、単一電極は、転送電極上に延在せず、転送電極との二平面構成ではなく、液滴は、共面電極を使用することによって転送電極に移動される。
したがって、本明細書に記載のデバイス、キット、システム、および方法を使用して、生物学的試料中に存在する検体を測定することができ、患者を診断することができる。
別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出する方法に関し、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含む、接触させることと、（ｃ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、（ｄ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合した第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出する方法に関し、（ａ）試料を固体支持体、第１の特異的結合メンバー、および第２の特異的結合メンバーと接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、第１の特異的結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、第１の特異的結合メンバーが、目的の検体に特異的に結合し、第２の特異的結合メンバーが、切断可能なタグを含み、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／目的の検体／第２の特異的結合メンバーの複合体が形成される、接触させることと、（ｂ）固体支持体／第１の特異的結合メンバー／検体／第２の特異的結合メンバーの複合体に結合していない第２の特異的結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／第１の特異的結合メンバー／目的の検体／第２の特異的結合メンバーの複合体に結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出する方法に関し、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｃ）固体基材に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、（ｄ）検体に結合したアプタマーを解離させることと、（ｅ）解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｆ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
一態様では、本発明は、電極のアレイを含む第１の基板と、該第１の基板から離間した第２の基板と、第１の基板と第２の基板との間に配設されたナノポア層と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関し、電極のアレイは、液滴がナノポア層によって第１の部分と第２の部分とに分割されるように、ナノポア層を横切って液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも２つの電極が、ナノポア層を横切って位置付けられ、２つの電極が、アノードおよびカソードを形成し、液滴がナノポア層を横切って位置付けられると、ナノポア層内のナノポアを通して電流を流すように動作する。
さらに別の態様では、本発明は、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関する。第２の基板は、第１の基板から離間している。電極のアレイは、ナノポア層が液滴を第１の部分と第２の部分とに分割するように、ナノポア層を横切って液滴を配置するように構成されている。電極のアレイはナノポア層を横切って配置された液滴の第１の部分と接触し、第２の基板内の電極はナノポア層を横切って配置された液滴の第２の部分と接触するように配置される。液滴がナノポア層を横切って配置されているとき、カソードであり、ナノポア層内のナノポアを通して電流を流すように動作する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出する方法に関し、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）結合メンバーに結合された標識検体に付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関し、該方法は、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含む、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上に固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法に関し、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、層内の１つ以上のナノポアを通して解離したアプタマーを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関し、マイクロ流体モジュールが、電極のアレイを含み、該電極のアレイが、少なくとも１つの液滴を、電極のアレイにおける第１の転送位置に輸送し、第１の転送位置が、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面にあり、ナノポアモジュールが、第１の毛細管チャネルと、第２の毛細管チャネルとを備え、少なくとも第１の毛細管チャネルが、界面まで延在し、第１の転送位置に隣接し、該第１の転送位置に位置付けられた液滴を受け取るように位置付けられ、第１の毛細管チャネルが、第２の毛細管チャネルと交差し、ナノポア層が、第１の毛細管チャネルと第２の毛細管チャネルとが交差する位置で、第１の毛細管チャネルと第２の毛細管チャネルとの間に位置付けられる。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含み、（ｃ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、（ｄ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合した第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含み、（ｃ）固体基材に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、（ｄ）検体に結合したアプタマーを解離させることと、（ｅ）解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｆ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位する各アプタマーは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される。
別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含み、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位する各アプタマーは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上に固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上に固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位する各アプタマーは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法に関し、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含み、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準である。
さらに別の態様では、本発明は、マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを備える集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスに関し、マイクロ流体モジュールは、電極のアレイの少なくとも一部と重なる大きさの単一電極から離間している電極のアレイを含み、電極のアレイおよび単一電極は、少なくとも１滴の流体を電極のアレイ内の転送電極に輸送し、転送電極は、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面に位置付けられ、ナノポア対応モジュールは、第１の基板の第１の表面上に位置付けられた第１のマイクロチャネルを含み、第２のマイクロチャネルは、第２の基板の第１の表面上に位置付けられ、第１の基板の第１の表面は、第２の基板の第１の表面と接触し、それによって第１のマイクロチャネルおよび第２のマイクロチャネルを取り囲み、第１の毛細管チャネルおよび第２の毛細管チャネルをそれぞれ提供し、少なくとも第１の毛細管チャネルは、マイクロ流体モジュールとナノポア対応モジュールとの間の界面まで延在し、転送電極に隣接し、転送電極上に位置付けられた液滴を受け取るように位置付けられ、第１の毛細管チャネルは、第２の毛細管チャネルと交差し、層は、第１および第２の毛細管チャネルが交差する位置で、第１の基板と第２の基板との間に位置付けられ、層は、ナノポアを欠き、第１および第２の毛細管チャネル内に存在するイオン性液体を分離し、第１および第２の毛細管チャネルは、第１および第２の毛細管チャネルの交差部で層にナノポアを形成するために、第１の毛細管チャネルから第２の毛細管チャネルへ、またはその逆に電圧を駆動するために電極と電気的に接続している。
さらに別の態様では、本発明は、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスにおいてナノポアを生成するための方法に関し、該方法は、本明細書で前述される集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスを提供することと、第１および第２の毛細管チャネル内に電圧を印加して、層を通して電流を駆動することと、層を横切るコンダクタンスを測定することと、層内のナノポアの生成を示すコンダクタンスの検出時に電圧の印加を終了することと、を含む。
さらに別の態様では、本発明は、電極のアレイを含む第１の基板と、第１の基板から離間した第２の基板と、ナノポアを含むナノポア層と流体連通している第１または第２の基板における開口部と、ナノポアを通して電界を印加するように構成されている電極対と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関し、電極のアレイが、少なくとも１滴の流体を開口部に輸送するように構成されている。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で前述される第１の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、単一電極が、第１の単一電極であり、毛細管チャネルが、第１の毛細管チャネルである、第１の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスと、第５の側面および該第５の側面に対向する第６の側面を含み、第５の側面が、電極のアレイを含む、第３の基板、ならびに該第３の基板から離間した第４の基板を備える、第２の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスと、を含む、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスの対に関し、第４の基板は、第３の基板の第５の側面に面する第７の側面と、該第７の側面に対向する第８の側面とを含み、第７の側面は、第２の単一電極を含み、ナノポア層は、第８の側面上に配設され、第４の基板は、該第４の基板の第７の側面から第８の側面まで延在する第２の毛細管チャネルを含み、ナノポア層は、毛細管チャネルの開口部上に位置付けられ、ナノポア層は、ナノポアが、第１の毛細管チャネルと第２の毛細管チャネルとの間の電気浸透導管を提供するように、第２の基板と第４の基板との間に挿入され、検出電極の対が、第２の単一電極である第２の検出電極を含む。
さらに別の態様では、本発明は、第１の側面および該第１の側面に対向する第２の側面を含み、第１の側面が、電極のアレイを含む、第１の基板と、第１の基板から離間した第２の基板であって、第１の基板の第１の側面に面する第３の側面および該第３の側面に対向する第４の側面を含む第２の基板と、ナノポアを欠き、デバイスの外部側面に配設されたナノポア対応層であって、外部側面が、第２の側面または第４の側面から選択され、外側側面を含む第１の基板または第２の基板の一方が、第１の基板の第１の側面から第２の側面まで、または第２の基板の第３の側面から第４の側面まで延在する毛細管チャネルを含み、ナノポア対応層が、毛細管チャネルの開口部上に位置付けられる、ナノポア対応層と、該ナノポア対応層を横切って電界を印加するように構成された電極対であって、電極のアレイが、少なくとも一滴の流体を毛細管チャネルに輸送するように構成されている、電極対と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスに関する。
さらに別の態様では、本発明は、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスにおいてナノポアを生成するための方法に関し、本明細書で前述される集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスを提供することと、層の各側のイオン性液体が、一対の検出電極のいずれか一方と電気的に接触するように、ナノポア対応層の両側をイオン液体に浸すことと、一対の検出電極間に電圧を印加して層を通して電流を駆動することと、層を横切るコンダクタンスを測定することと、層内にナノポアが生成されたことを示すコンダクタンスの検出時に、電圧の印加を終了することと、を含む。
別の態様では、本発明は、結合メンバー、タグおよびスペーサを含む組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、電極のアレイを含む第１の基板と、第１の基板から離間した第２の基板と、第１の基板と代２の基板との間に配設された第１の表面および第２の表面を有するナノポア層と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関し、電極のアレイは、ナノポア層の第１の表面に第１の液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも２つの電極が、ナノポア層を横切って位置付けられ、２つの電極が、アノードおよびカソードを形成し、液滴がナノポア層の第１の表面にあるとき、ナノポア層内のナノポアを通して電流を駆動するように動作する。
さらに別の態様では、本発明は、マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを備える集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関し、マイクロ流体モジュールは、電極のアレイを含み、該電極のアレイは、少なくとも１滴の流体を電極のアレイ内の転送位置に輸送し、転送位置は、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面にあり、ナノポアモジュールは、転送位置からナノポア層まで延在する第１の毛細管チャネルを含む。
さらに別の態様では、本発明は、電極のアレイを含む第１の基板と、該第１の基板から離間した第２の基板と、その中に１つ以上のナノポアを有する第１のナノポア層と、その中に１つ以上のナノポアを有する第２のナノポア層と、第１および第２のナノポア層内のナノポアを通してタグを駆動する電界を生成するための少なくとも２つの電極と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関する。
さらに別の態様では、本発明は、前述の方法のうちのいずれかに使用するための、前述のデバイスのうちのいずれかを含むキットに関する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する検体を測定もしくは検出するため、または患者を診断するか、もしくは血液供給をスクリーニングするための、前述のデバイスのうちのいずれかを使用する方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法に関し、（ａ）試料を、固体支持体、結合メンバー、および切断可能なタグで標識された標識検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、結合メンバーが、目的の検体に特異的に結合して、固体支持体／結合メンバー／目的の検体の複合体または固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体のいずれかを形成する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｃ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法に関し、（ａ）試料を、固体支持体、結合メンバー、および外因性検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、外因性検体が、固定化剤に対するリガンドを含み、固体支持体／固定化検体の複合体を形成するように、固体支持体に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグを含み、目的の検体に特異的に結合して、固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体を形成する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体のいずれかにおいて結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体中の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法に関し、（ａ）試料を固体支持体、結合メンバー、および切断可能なタグで標識された標識検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、結合メンバーが、固体支持体／結合メンバー／目的の検体の複合体または固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合し、（ｂ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｃ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法に関し、該方法は、（ａ）試料を固体支持体、結合メンバー、および外因性検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、外因性検体が、固定化剤に対するリガンドを含み、固体支持体／固定化検体の複合体を形成するように、固体支持体に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグを含み、固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体のいずれかにおいて結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体中の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法に関し、該方法は、（ａ）試料を、固体支持体、結合メンバー、およびアプタマーで標識された標識検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、結合メンバーが、固体支持体／結合メンバー／目的の検体の複合体または固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｃ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合した標識検体に付着したアプタマーを解離させることと、（ｄ）解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法に関し、該方法は、（ａ）試料を、固体支持体、結合メンバー、および外因性検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、外因性検体が、固定化剤に対するリガンドを含み、固体支持体／固定化検体の複合体を形成するように、固体支持体に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含み、固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体のいずれかにおいて結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体中の結合メンバーに結合したアプタマーを解離させることと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
本明細書ではまた、液滴を作動させるための電極のアレイを含み、さらに電気化学種感知領域を含むカートリッジを動作させるようにプログラムされた器具が提供される。この器具を使用して、液滴を作動させるための電極のアレイを含み、さらにナノポアを通る分子の転位を検出するためのナノポア層を含む、カートリッジ内の試料を分析することができる。液滴を作動させるための電極のアレイを含み、さらに電気化学種感知領域を含む第１のカートリッジと、液滴を作動させるための電極のアレイを含み、さらにナノポアを通る分子の転位を検出するためのナノポア層をさらに含む第２のカートリッジとを動作させるように構成された器具が開示されている。液滴を作動させるための電極のアレイ、電気化学種感知領域、およびナノポアを通る分子の転位を検出するためのナノポア層を含むカートリッジを動作させるように構成された器具が開示されている。
本明細書に記載された主題の詳細は、その構造および動作の両方に関して、添付の図面を検討することによって明らかになり得、図面において、同じ参照番号は同じ部分を指す。図中の構成要素は、必ずしも縮尺どおりではなく、代わりに主題の原理を例示することに重点が置かれている。さらに、全ての図は概念を伝えることを意図しており、相対的なサイズ、形状、および他の詳細な属性は、文字どおりまたは正確にではなく概略的に示され得る。
ナノポアデバイス１５と共に使用されるマイクロ流体デバイス１０を示す。 同上。 チャネル４０を介してナノポアモジュール３０と組み合わされたマイクロ流体モジュール２０を有する可逆的集積デバイスの概略図を示す。 同上。 マイクロ流体モジュールがナノポアモジュールに流体接続されている例示的な集積デバイスの概略図を示す。ナノポアモジュールは、２つのマイクロ流体チャネルが交差する位置で、２つのマイクロ流体チャネルを物理的に分離する層にナノポアを含む。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 マイクロ流体モジュール３００およびナノポアモジュール３２５を含む、例示的な集積デバイスを示す。 デジタルマイクロ流体モジュールが、内蔵ナノポアモジュールを含む、集積デバイス４００を提供する。 集積デバイスの上面図を示す。 図５Ａの集積デバイスの側面図を示す。 本開示の例示的なデバイスおよび方法を示す。 本開示の例示的なデバイスおよび方法を示す。 同上。 本開示の例示的な集積デバイスの側面図を示す。 本開示の例示的なシステムを示す。 低コストＤＭＦチップの製造プロセスの概略図を示す。 図１０の概略図に従って製造された単一のフレキシブルＤＭＦチップを示す。 本開示の実施形態による、ＤＭＦチップ内の液滴の作動を示す。 本開示の実施形態による、ＤＭＦチップにおけるイムノアッセイの性能を示す。 本開示の実施形態による、ナノポアモジュールの製造および設計を示す。 同上。 同上。 リアルタイムで測定した漏れ電流のプロットを示す。 ナノポアの電流−電圧（Ｉ−Ｖ）曲線を示す。 本開示の実施形態による、集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイス内の毛細管チャネルの充填を示す。 同上。 同上。 本開示の実施形態による、集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイス内の液滴転送の概略図を示す。 本開示の実施形態による、ナノポアモジュール設計の概略図を示す。 本開示の実施形態による、受動輸送によってモジュール間で液滴転送を行うように適合された集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスの概略図を示す。 本開示の実施形態による、受動輸送によってモジュール間で液滴転送を行うように適合された集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスの概略図を示す。 本開示の実施形態による、受動輸送によって液滴の受動移動を可能にするシリコンマイクロチャネルを含むシリコンマイクロ流体デバイスの概略図である。 本開示の実施形態による、受動輸送によって液滴の受動移動を可能にするシリコンマイクロ流体デバイスのシリコンマイクロチャネルの画像である。 本開示の実施形態による、集積ナノポアセンサの製造方法の概略図を示す。 同上。 規則的な二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）で構成されたナノポアを示す。 ＤＢＣＯ修飾ｄｓＤＮＡので構成されたナノポアを示す。 ｄｓＤＮＡスターで構成されたナノポアを通る転位事象を使用して得られたプロットの散布図（レベル持続期間対遮断レベル）を示す。 チオール基を介した化学的切断の概略図を示す。 磁性微粒子に対して行われる光切断実験の概略図を示す。 同上。 ＤＭＦチップ上の試薬配置の概略図を示す。 試料に対するナノポア流動（ＤＭＦ切断）（ｓｅｃ−１）の棒グラフを示す。 デジタルシグナルカウントの閾値を決定する手段を示す。 ９４ｎＭ（図３０Ａ）、１８２ｎＭ（図３０Ｂ）、および２６６ｎＭ（図３０Ｃ）の３つの標準についての、異なる期間にわたる電流遮断を示す。 同上。 同上。 一定時間量（５分）にわたる事象数の用量反応曲線を示す。 一定数の事象に要する時間の用量反応曲線を示す。 は、単位時間当たりの事象の用量反応曲線を示す。 Ｓｅｑ３１−ＳＳ−ビオチンを使用した単位時間当たりの事象の用量反応曲線を示す。 本開示の実施形態による、シリコンナノポアモジュール内のナノポアチャンバ設計の概略図を示す。 本開示の実施形態による、シリコンナノポアモジュールのナノポアチャンバ内のＣＯＭＳＯＬ電界シミュレーションに使用される物理パラメータを列挙する表を示す。 本開示の実施形態による、シリコンナノポアモジュール内のナノポア付近の対イオン濃度勾配のシミュレーション結果を示す画像の集合である。 本開示の実施形態による、ナノポアを通る電気浸透流に対する、ナノポアを有するナノポア膜上に作製されたＳｉＯ２ビアの直径の効果を示すグラフである。 本開示の実施形態による、ナノポアを通るコンダクタンスに対する、ナノポアを有するナノポア膜上に作製されたＳｉＯ２ビアの直径の効果を示すグラフである。 本開示の実施形態による、ＤＭＦモジュールの片側に位置付けられたナノポアモジュールを有する集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスの概略図を示す。 本開示の実施形態による、毛細管力によるＤＭＦモジュール基板の穴を通るＤＭＦモジュールからの液体の移動を示す画像の集合である。 本開示の実施形態による、ＤＭＦモジュールの片側に位置付けられたナノポアモジュールと、ナノポア製造のために構成された電極モジュールとを有する、集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスを示す画像の集合である。 本開示の実施形態による、ＤＭＦモジュールの片側に位置付けられたナノポアモジュールを有する、集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスの概略図である。 本開示の実施形態による、２つのＤＭＦモジュールの間に位置付けられたナノポアモジュールを有する、集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスの概略図である。 本開示の実施形態による、ナノポア膜に電圧を印加することによる、および絶縁破壊によって証明されるような、ナノポア膜内のナノポアの製造（透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）ウィンドウ）を示すグラフである。 本開示の実施形態による、調整プロセスの前後における、膜内に形成されたナノポアの電流−電圧（Ｉ−Ｖ）曲線を示すグラフの集合である。 同上。 標識の平均直径とナノポアサイズのカウントの間にプロットされた比とＳＮＲ（シグナル対ノイズ比）との平均の散布図を示す。 一実施形態による、検体検出チップの概略図を提供する。 別の実施形態による、検体検出チップの概略図を提供する。 一実施形態による、検体検出チップの概略図を提供する。 例示的な検体検出チップの側面図を示す。 同上。 ＤＭＦ電極と、光学検出チャンバとを備えるカートリッジを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 別の実施形態による、検体検出チップの上面図の概略図を示す。 代替の例示的な検体検出チップの概略図を示す。 例示的な血液学チップの概略図を提供する。 複数の検出領域を有するＤＭＦチップの代替実施形態を示す。 同上。 （Ａ、Ｂ）例示的な検体検出デバイスの概略図を示す。（Ｃ）ＡおよびＢの検体検出デバイスと適合するカートリッジの概略図である。 （Ｄ）異なる種類のカートリッジの、同じスロットへの挿入を可能にするカートリッジアダプタを示す。 （Ｅ）異なる種類のカートリッジの、同じスロットへの挿入を可能にするカートリッジアダプタを示す。 カートリッジ（Ａ）およびそのカートリッジと適合する検体検出デバイス（Ｂ）の実施形態を示す。 複数のアッセイを実施するための複数の器具を有する例示的な検体検出システムを示す。 同上。
本開示の実施形態は、試料中の検体（複数可）の分析のための方法、システム、およびデバイスに関する。ある特定の実施形態では、試料は、生物学的試料であり得る。
１．定義
本開示の実施形態が説明される前に、本発明が、説明される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびそれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しない無制限の移行句、用語、または単語であることが意図されている。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示された実施形態または要素「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲の列挙のために、同じ程度の精度で、その間の各介在数が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲については、６および９に加えて７および８の数が企図され、６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数が明示的に企図される。
本明細書で互換的に使用される「親和性」および「結合親和性」は、結合メンバーの検体への結合の傾向または強度を指す。例えば、結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）、解離速度（ｋｄ）、または会合速度（ｋａ）によって表すことができる。
本明細書で使用される「類似体」は、目的の分子と類似する構造を有する分子（例えば、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、糖リン酸類似体、検体類似体等）を指す。検体類似体は、検体と構造的に類似しているが、結合メンバーが異なる親和性を有する分子である。
本明細書で使用される「アプタマー」は、とりわけ高親和性および特異性を有する小分子、タンパク質、およびペプチドを含む予め選択された標的に結合し得るオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子を指す。アプタマーは、らせんおよび一本鎖ループを形成する傾向があるために様々な形状を想定し得る。オリゴヌクレオチドまたは核酸アプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子であり得る。ペプチドアプタマーは、両端でタンパク質足場に付着した短い可変ペプチドドメインを含み得る。
「ビーズ」および「粒子」は、本明細書では互換的に使用され、実質的に球形の固体支持体を指す。
「成分」、「複数の成分」、または「少なくとも１つの成分」は、一般に、捕捉抗体、検出試薬または接合体、較正物質、対照、感度パネル、容器、緩衝剤、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止溶液等を指し、これらは本明細書に記載の方法および当技術分野で知られている他の方法に従い、患者の尿、血清、全血、組織吸引物、または血漿試料などの検査試料のアッセイのためのキットに含まれ得る。いくつかの成分は、アッセイに使用するために溶液中に存在するか、または再構成のために凍結乾燥させることができる。
本明細書で使用される「対照」は、当技術分野で知られているかもしくは許容されているか、または一般的に用いられているような許容可能な手段を使用して経験的に決定される検体の参照標準を指す。「参照標準」とは、類似物質の測定基準として使用される標準化物質である。例えば、米国薬局方協会（ＵＳＰ−ＮＦ）、食品用公定化学品集（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｄｅｘ）、および栄養補助食品大全（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ）（全てｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇにおいて入手可能）、ならびに他の周知の情報源に公開されている参照標準が記録されている。参照物を標準化するための方法は、文献に記載されている。検体についての較正曲線の使用によって、または代替の参照標準との比較によって、存在する検体の量を定量するための手段もまた周知である。標準曲線は、質量分析法、重量法、および当技術分野で知られている他の技法によって、既知濃度の検体の段階希釈物または溶液を使用して生成することができる。文献に記載されている代替参照標準には、標準付加（標準付加法としても知られている）、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応が含まれる。
本明細書で互換的に使用される「デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）」、「デジタルマイクロ流体モジュール（ＤＭＦモジュール）」、または「デジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦデバイス）」は、デジタルまたは液滴に基づくマイクロ流体技法を利用して、個別の少量の液体を液滴の形で操作する、モジュールまたはデバイスを指す。デジタルマイクロ流体は、エマルジョンサイエンスの原理を使用して、チャネル内への流体−流体分散を創出する（主に油中水エマルジョン）。それは単分散液滴／泡の産生または非常に低い多分散性を可能にする。デジタルマイクロ流体は、再構成可能なネットワーク内の不連続な液滴の顕微操作に基づいている。複雑な命令は、液滴形成、転位、分割、および合体の基本操作を組み合わせることによってプログラムすることができる。
デジタルマイクロ流体は、バイナリの電気シグナルによって操作され得る個別体積の流体上で作動する。個別の単位体積の液滴を使用することによって、マイクロ流体操作は、一連の繰り返される基本操作、すなわち１単位の流体を１単位の距離にわたって移動させることとして定義することができる。液滴は、液体の表面張力特性を使用して形成することができる。液滴の作動は、液滴が位置している底面の下に配置された電極によって発生する静電力の存在に基づいている。異なる種類の静電力を使用して、液滴の形状および動きを制御することができる。前述の静電力を発生させるために使用することができる１つの技法は、誘電泳動に基づいており、これは液滴と周囲の媒体との間の誘電率の差に依存し、高周波交流電界を利用することができる。前述の静電力を発生させるために使用することができる他の技法は、エレクトロウェッティングに基づいており、これは表面上に存在する液滴とその表面との間の表面張力の、該表面に印加される電界への依存性に依存する。
「ドラッグタグ」は、移動度変更子を指す。ドラッグタグは、大きく、水溶性、かつ完全に単分散であるように設計された、遺伝子操作された高度に反復性のポリペプチド（「タンパク質ポリマー」）であり得る。正電荷アルギニンは、規則的な間隔でアミノ酸配列に意図的に導入されて、ドラッグタグの長さを増加させることなく流体力学的抗力を増加させ得る。ドラッグタグは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２／０１４１９９７号に記載されている。
本明細書で使用される「酵素的切断可能配列」は、酵素によって切断され得る任意の核酸配列を指す。例えば、酵素は、プロテアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素とも呼ばれる）であり得る。制限エンドヌクレアーゼは、所定のヌクレオチド間の特異的ＤＮＡ切断部位でＤＮＡ分子を認識し切断することができる。例えばＦｏｋ１などのいくつかのエンドヌクレアーゼは、この位置に存在するヌクレオチドにかかわらず、ある特定の位置でＤＮＡを非特異的に切断する切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼの特異的ＤＮＡ切断部位およびＤＮＡ認識部位は同一である。
「球状タンパク質」は、ほぼ球形の形状を有する水溶性タンパク質を指す。球状タンパク質の例としては、オボアルブミン、βグロブリン、Ｃ反応性タンパク質、フィブリン、ヘモグロビン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびトロンビンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で互換的に使用される「標識」または「検出可能な標識」は、切断可能なリンカーによって特異的結合メンバーまたは検体に付着したタグを指す。
「ナノ粒子（複数可）」および「ナノビーズ（複数可）」は、本明細書では互換的に使用され、それを通過するナノビーズ／ナノ粒子の数をカウントするために使用されるナノポアを通ってまたは横断して転位するようにサイズ決定されたナノビーズまたはナノ粒子を指す。
「核酸塩基」または「塩基」は、ポリマーを生成するための核酸もしくはポリヌクレオチド技術またはペプチド核酸技術の分野で一般的に知られている天然に存在するものおよび合成複素環式部分を意味する。好適な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が挙げられる。核酸塩基は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびヌクレオシド／チド類似体を形成するために他の部分に結合することができる。
「ヌクレオシド」は、プリン、デアザプリン、またはピリミジン核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシンからなる化合物を指し、１′位におけるペントース糖のアノマー炭素、例えばリボース、２′−デオキシリボース、または２′３′−ジ−デオキシリボースに連結している。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、モノ−、ジ−、またはトリリン酸エステルを指し、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位に付着したヒドロキシル基である。
「核酸塩基ポリマー」または「核酸塩基オリゴマー」は、結合によって接続されてオリゴマーを形成する２つ以上の核酸塩基を指す。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーとしては、ポリおよびオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーおよびオリゴマー）、ポリおよびオリゴヌクレオチド類似体、ならびにポリアミドまたはペプチド核酸などのポリおよびオリゴヌクレオチド模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、数個の核酸塩基から数百個の核酸塩基または数千個の核酸塩基までサイズが変化し得る。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、約２〜１００個の核酸塩基または約８０００〜１００００個の核酸塩基を含み得る。例えば、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、少なくとも約２個の核酸塩基、少なくとも約５個の核酸塩基、少なくとも約１０個の核酸塩基、少なくとも約２０個の核酸塩基、少なくとも約３０個の核酸塩基、少なくとも約４０個の核酸塩基、少なくとも約５０個の核酸塩基、少なくとも約６０個の核酸塩基、少なくとも約７０個の核酸塩基、少なくとも約８０個の核酸塩基、少なくとも約９０個の核酸塩基、少なくとも約１００個の核酸塩基、少なくとも約２００個の核酸塩基、少なくとも約３００個の核酸塩基、少なくとも約４００個の核酸塩基、少なくとも約５００個の核酸塩基、少なくとも約６００個の核酸塩基、少なくとも約７００個の核酸塩基、少なくとも約８００個の核酸塩基、少なくとも約９００個の核酸塩基、少なくとも約１０００個の核酸塩基、少なくとも約２０００個の核酸塩基、少なくとも約３０００個の核酸塩基、少なくとも約４０００個の核酸塩基、少なくとも約５０００個の核酸塩基、少なくとも約６０００個の核酸塩基、少なくとも約７０００個の核酸塩基、少なくとも約８０００個の核酸塩基、少なくとも約９０００個の核酸塩基、または少なくとも約１００００個の核酸塩基を有し得る。
「層内の１つ以上のナノポア」とは、単一の膜構造または複数の膜構造において、１つのナノポアがあるか、または互いに隣接する（例えば、並んでいる）複数のナノポアがあることを意味する。１つ以上のナノポア（例えば、技術的に可能な限り１、２、３、４、５、６、または他の数のナノポア）が存在する場合、任意選択で、それらは並んで（例えば、互いに隣り合って）、または連続して（例えば、存在する１つの層内の１つのナノポアが、別の層内の別のナノポアから離れているか、もしくはその上に（たとえば上または上部に）積層される等）、または例えば当業者に明らかな代替構造で存在する。任意選択で、そのようなナノポアは、例えば、各々がそれ自体の別々の区画内にある（例えば、任意の他のナノポアから壁を隔てている）ことによって、独立してアドレス指定可能であるか、または代替として、独立した検出回路によってアドレス指定することができる。
「ポリマーブラシ」は、表面に一端が付着したポリマーの層を指す。ポリマーは互いに近接しており、それ自体の環境を形成する層またはコーティングを形成する。ブラシは、ぶら下がっている鎖が溶剤に浸されているときは溶媒状態であり得るか、またはぶら下がっている鎖が使用可能な空間を完全に満たすときは溶融状態であり得る。さらに、ポリマー鎖自体が静電荷を帯びている場合、別々のクラスの高分子電解質ブラシがある。ブラシは、高密度のグラフト鎖を特徴とし得る。次いで限定された空間は、鎖の強力な拡張とシステムの異常な特性につながる。ブラシを使用して、コロイドを安定させ、表面間の摩擦を低減し、人工関節に潤滑を提供することができる。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、核酸塩基が糖リン酸結合（糖−リン酸骨格）によって接続されている、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを指す。例示的なポリおよびオリゴヌクレオチドとしては、２′−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマーおよびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチド、完全に２′−デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから構成され得る。「核酸」は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を包含し、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを含む。
「ポリヌクレオチド類似体」または「オリゴヌクレオチド類似体」は、核酸塩基が１つ以上の糖リン酸類似体を含む糖リン酸骨格によって接続されている核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを指す。典型的な糖リン酸類似体としては、糖アルキルホスホネート、糖ホスホルアミダイト、糖アルキル−または置換アルキルホスホトリエステル、糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖リン酸、および糖が２′−デオキシリボースまたはリボース以外の糖リン酸類似体を含み、核酸塩基ポリマーは、米国特許第６，０１３，７８５号および米国特許第５，６９６，２５３号に記載されているものなどの、正電荷糖−グアニジル相互結合を有する。
本明細書で使用されるとき、「細孔」（代替として本明細書では「ナノポア」と称される）または「チャネル」（代替として本明細書では「ナノポア」もしくは「ナノチャネル」と称される）は、膜／層内のオリフィス、ギャップ、導管、または溝を指し、ここで細孔またはチャネルは、一度に（例えば、一連のように１つずつ）単一分子（例えば、タグ）の通過または分析を可能にするのに十分な寸法のものである。
本明細書で使用される「受容体」は、内因性化学シグナルを認識し応答するタンパク質分子を指す。そのような内因性化学シグナルが受容体に結合すると、それらは何らかの形態の細胞／組織応答を引き起こす。受容体の例としては、神経受容体、ホルモン受容体、栄養受容体、および細胞表面受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「スペーサ」は、特異的結合メンバーからの切断可能な基を拡張するか、または結合メンバーと支持体との間に結合を提供するか、またはその光切断可能な部分から標識／タグを拡張する、化学部分を指す。いくつかの実施形態では、特異的結合メンバーから配列を最適に遠ざけるために、ポリペプチドまたはヌクレオチドベースのタグまたは標識のＮ末端またはＣ末端に１つ以上のスペーサを含めることができる。スペーサとしては、６−アミノカプロン酸；６−アミノヘキサン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；１〜５個のアミノ酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー基、短いアミノ酸配列、およびポリグリシン配列などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサは、ニトロベンジル基、ジチオエチルアミノ、６炭素スペーサ、１２炭素スペーサ、または３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートである。
本明細書で互換的に使用される「特異的結合パートナー」または「特異的結合メンバー」は、他の分子の実質的に少ない認識と比較して、他の分子を特異的に認識する２つ以上の異なる分子のうちの１つを指す。２つの異なる分子のうちの１つは、表面上またはキャビティ内に、他の分子の特定の空間的および極性の構成と特異的に結合し、それによって相補的であると定義される領域を有する。分子は特異的結合対のメンバーであり得る。例えば、特異的結合メンバーは、受容体などのタンパク質、酵素、および抗体を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「タグ」または「タグ分子」の両方は、ナノポアを通してまたは横切って転位し、試料中の検体のレベルの指標を提供する分子（例えば、第２の結合メンバーまたは標的検体から解離したアプタマーから切断される）を指す。これらの用語は、単一のタグ分子または複数の同じタグ分子を指す。同様に、「タグ」は、別途特定されない限り、１つまたは１つ以上のタグを指す。
本明細書で使用される場合、「閾値」は、それを超えると取得データが「シグナル」と見なされ、それを下回ると取得データが「ノイズ」と見なされる、経験的に決定された主観的カットオフレベルを指す。デジタルシグナルをカウントするための閾値の使用は、図２９に示されている。ＣＵＳＵＭ（累積合計アルゴリズム）に基づくコンピュータプログラムを用いて、取得したデータを処理し、ユーザからの閾値入力に基づいて事象を検出する。ユーザ間の変動は、可能な限り多くの事象を検出し、続いて特定の目的のために後にデータをフィルタリングすることによって回避される。例えば、この図からわかるように、設定された閾値を超えて検出された事象は、シグナルとしてカウントされる事象の集団に影響を与える。「緩い」閾値では、より少数の事象がシグナルとしてカウントされる。「厳しい」閾値では、より多数の事象がシグナルとしてカウントされる。閾値を緩くまたは厳しく設定することは、アッセイに対する所望の感度または特異性、および所与の評価において偽陽性または偽陰性が好ましいかどうかに基づく主観的選択である。ＤＮＡ転位からの電流遮断サインは、１．２ｎＡであると計算され、これは電流の変化をＤＮＡの直径およびナノポア膜の厚さと関連付ける実験式に基づいていた（Ｈ．Ｋｗｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３），３９２８８０，２０１４）。
本明細書で使用される場合、ナノポアを「通るまたは横切る」（例えば、ナノ粒子、タグ、タグ分子、または他の）移動への言及は、代替として、通してまたは横切ること、言い換えれば、ナノポアの一方から他方へ、例えば、シス側からトランス側へ、またはその逆を意味する。
本明細書で使用される「トレーサ」は、タグまたは標識に接合した検体または検体断片を指し、タグまたは標識に接合した検体は、その検体に特異的な抗体上の部位について検体と効果的に競合し得る。例えば、トレーサは、検体または検体の類似体、例えばシクロスポリンまたはその類似体ＩＳＡ２４７、ビタミンＤおよびその類似体、性ホルモンおよびそれらの類似体等であってもよい。
本明細書で使用される場合、「転位事象」は、タグが層またはナノポアを通ってまたは横切って（例えば、シス側からトランス側へ、またはその逆）転位する事象を指す。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含む本文書が優先するものとする。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料はまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下で説明する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、それらの刊行物が引用されるものに関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照によりそれら全体が組み込まれる。本明細書に開示された材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定的であることを意図しない。
２．検体分析のための方法
検体分析のための方法が本明細書に提供される。この方法は、単一分子のカウントを必要とし得る。ある特定の実施形態では、検体分析のための方法は、試料中に存在する検体を評価することを必要とし得る。ある特定の実施形態では、評価は、試料中の検体の存在および／または濃度を決定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、方法はまた、試料中に存在する複数の異なる検体の存在および／または濃度を決定するためにも使用され得る。
本明細書に提供されるのは、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法である。この方法は、試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含む、接触させることと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合している第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグを検出または測定することと、層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを測定することが評価され、層を通って転位するタグの数が、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを検出することが評価され、層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
本明細書に提供されるのは、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法である。この方法は、試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、固体基質に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを測定することが評価され、層を通って転位するアプタマーの数は、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを検出することが評価され、層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。
いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーなどの各タグは、転位事象である。転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、試料中に存在する検体の量は、設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させることによって決定することができる。標準曲線は、設定された期間中に検体の対照濃度について転位事象の数を測定することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、試料中に存在する検体の量は、設定された数の転位事象が起こるための時間量を測定し、対照と相関させることによって決定され得る。標準曲線は、対照濃度の検体について、設定された数の転位事象が起こるのにかかる時間を測定することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、試料中に存在する検体の量は、転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定することができる。標準曲線は、対照濃度の検体について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり得る。
例示的な場合において、この方法は、試料を第１の結合メンバー（「結合メンバー」、あるいは「特異的結合メンバー」とも称され、下記セクションｃ）に記載される）と接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上で固定され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグ（本明細書に定義され、下記セクションｄ）に記載される「タグ」）を含み、第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、第１の結合メンバーに結合した検体に結合した第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、層内のナノポアを通してタグを転位させることと、層を通って転位するタグの数を決定することと、層を通って転位するタグの数に基づいて試料中の検体の濃度を決定することと、を含み得る。ある特定の実施形態では、検体の濃度は、単位時間当たりに層を通って転位するタグの数をカウントすることによって決定され得る。他の実施形態では、検体の濃度は、層を通って転位するタグの数が閾値に達する時間を決定することによって決定されてもよい。
試料は、目的の検体を含有する、または含有することが疑われる任意の試験試料であり得る。本明細書で使用される場合、「検体」、「標的検体」、「目的の検体」は互換的に使用され、本明細書に開示される方法およびデバイスにおいて測定される検体を指す。目的の検体は、以下でさらに説明される。
本明細書で使用される「接触する」およびその文法上の等価物は、結合メンバーが試料中の目的の検体と十分に接近するようにして、結合メンバーに特異的な目的の検体が試料中に存在する場合に結合相互作用が起こるような任意のタイプの組み合わせ作用を指す。接触は、試料を結合メンバーと組み合わせること、結合メンバーを検体に近接して導入することによって標的検体を結合メンバーに曝露すること等を含む、様々な異なる方法で達成することができる。
ある特定の場合において、第１の結合メンバーは、固体支持体上に固定化され得る。本明細書中で使用される場合、「固定化された」とは、第１の結合メンバーと固体支持体の表面との安定した会合を指す。「安定した会合」とは、例えば生理的条件下で、会合の平均半減期が１日以上である２つの実態間の物理的会合を意味する。ある特定の態様では、２つの実体間の物理的関連は、４℃のＰＢＳ中で２日以上、１週間以上、１ヶ月以上、６ヶ月以上を含めて、例えば１年以上の平均半減期を有する。ある特定の実施形態によれば、安定した会合は、２つの実体間の共有結合、２つの実体間の非共有結合（例えば、イオンもしくは金属結合）、または他の形態の化学誘引、例えば水素結合、ファン・デル・ワールス力等から生じる。
結合試薬が固定化されている表面を有する固体支持体は、マイクロ流体チップの表面、チャンバの内面、ビーズの外面（本明細書で定義される）、または多孔性ビーズの内面および／もしくは外面などの平面もしくは非平面構造の任意の都合のよい表面であり得る。例えば、第１の結合メンバーは、例えば、ラテックス、アガロース、セファロース、ストレプトアビジン、トシル活性化、エポキシ、ポリスチレン、アミノビーズ、アミンビーズ、カルボキシルビーズ等のビーズに共有結合または非共有結合され得る。ある特定の実施形態では、ビーズは、粒子、例えば微粒子であり得る。いくつかの実施形態では、微粒子は、約０．１ｎｍ〜約１０ミクロン、約５０ｎｍ〜約５ミクロン、約１００ｎｍ〜約１ミクロン、約０．１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約１０ミクロン、約５００ｎｍ〜約５ミクロン、約５００ｎｍ〜約３ミクロン、約１００ｎｍ〜７００ｎｍ、または約５００ｎｍ〜７００ｎｍであり得る。例えば、微粒子は、約４〜６ミクロン、約２〜３ミクロン、または約０．５〜１．５ミクロンであり得る。約５００ｎｍ未満の粒子は、ナノ粒子と見なされる場合がある。したがって、微粒子は、任意選択で、約０．１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、または約５００ｎｍであり得る。
ある特定の実施形態では、ビーズは、磁性ビーズまたは磁性粒子であり得る。磁性ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性、または磁性流体であり得る。例示的な強磁性材料としては、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ、ＮｉＯ／Ｆｅが挙げられる。フェリ磁性材料の例としては、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（またはＦｅＯ．Ｆｅ２Ｏ３）が挙げられる。ビーズは、磁性であり、１つ以上の非磁性層によって取り囲まれている中実コア部分を有することができる。あるいは、磁性部分は、非磁性コアの周囲の層であり得る。第１の結合メンバーが固定化されている固体支持体は、乾燥形態または液体で貯蔵されてもよい。磁性ビーズは、第１の結合メンバーが固定化されている磁性ビーズと試料とを接触させる前または後に磁界に曝すことができる。
接触ステップの後、試料および第１の結合メンバーを、結合メンバーと検体との間の結合相互作用が起こることを可能にするのに十分な期間にわたってインキュベートすることができる。さらに、インキュベーションは、特異的結合相互作用を促進する結合緩衝液中であり得る。第１の結合メンバーおよび／または第２の結合メンバーの結合親和性および／または特異性は、結合緩衝液を変えることによってアッセイにおいて操作または変更することができる。いくつかの実施形態では、結合親和性および／または特異性は、結合緩衝液を変えることによって増加させることができる。いくつかの実施形態では、結合親和性および／または特異性は、結合緩衝液を変えることによって減少させることができる。
第１の結合メンバーおよび／または第２の結合メンバーの結合親和性および／または特異性は、以下に記載される開示された方法およびデバイスを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、１アリコートの試料を、一組の条件を使用してアッセイし、異なる組の条件を使用してアッセイされた別のアリコートの試料と比較し、それによって結合親和性および／または特異性に対する条件の影響を決定する。例えば、条件を変更または改変することは、試料から標的検体を除去すること、結合について標的検体またはリガンドと競合する分子を付加すること、およびｐＨ、塩濃度、または温度を変更することのうちの１つ以上であり得る。追加としてまたは代替として、期間は変数であり得、条件を変更することは、検出方法を再度実行する前にその期間を待つことを含み得る。
いくつかの実施形態では、タグまたはアプタマーがナノポアデバイスの細孔を通過した後、例えば、測定結果を確認するための感染症アッセイに関する確認アッセイにおいて、タグまたはアプタマーが再び細孔を通過して再測定または再検出され得るように、タグまたはアプタマーの移動方向を逆にするようにデバイスを再構成することができる。
結合緩衝液は、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）などの抗原−抗体結合緩衝液について標準的な分子を含み得る。ある特定の場合において、結合緩衝液は、試料を添加する前または後に、マイクロ流体チップ、チャンバ等に添加され得る。ある特定の場合において、第１の結合メンバーは、試料と接触する前に結合緩衝液中に存在してもよい。結合メンバーと検体との間の結合相互作用が生じるための時間の長さは、経験的に決定することができ、結合メンバーと検体との間の結合親和性および結合能に依存し得る。ある特定の実施形態では、接触またはインキュベーションは、５秒〜１時間、例えば１０秒〜３０分、または１分〜１５分、または５分〜１０分、例えば１０秒、１５秒、３０秒、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、または２時間の期間であり得る。結合相互作用に関する他の条件、例えば温度、塩濃度もまた経験的に決定され得るか、または製造業者の指示に基づき得る。例えば、接触は、室温（２１℃〜２８℃、例えば、２３℃〜２５℃）、３７℃、または４℃で実行され得る。ある特定の実施形態では、試料と第１の結合メンバーとの任意の混合は、接触ステップ中に実行されてもよい。
固定化された第１の結合メンバーと検体との間の複合体形成に続いて、未結合の検体は、試料と共に第１の結合メンバーの近傍から除去され得るが、第１の結合メンバーおよび検体の複合体は、固体支持体との会合に起因して保持され得る。任意選択で、固体支持体を洗浄緩衝液と接触させて、固体支持体に非特異的に結合したいかなる分子も除去することができる。
第１の接触ステップ、ならびに任意の試料の除去および／または任意の洗浄ステップの後、第１の結合メンバーおよび検体の複合体を第２の結合メンバーと接触させることができ、それにより検体が２つの結合メンバーによって結合されているサンドイッチ複合体の形成につながる。第２のメンバーと第１の結合メンバー−検体の複合体との任意の混合は、第２の接触ステップ中に実行されてもよい。いくつかの実施形態では、表面に対する検体分子の固定化は、表面から検体分子を除去することを懸念することなく、溶液からいかなる超過の第２の結合メンバーも除去するのを助け得る。いくつかの実施形態では、第２の結合メンバーは、それに付着した切断可能なタグなどのタグを含むことができる。
上記のように、第２の接触ステップは、検体と第２の結合メンバーとの間の結合相互作用に十分な条件で実行され得る。第２の接触ステップに続いて、未結合の第２結合メンバーを除去し、続いて任意の洗浄ステップを行ってもよい。任意の未結合の第２の結合メンバーは、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛細管力、クロマトグラフィー、遠心分離、または吸引などの好適な手段によって、第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体から分離され得る。第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体の近傍から未結合の第２の結合メンバーを除去すると、第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体中に存在する第２の結合メンバーに付着したタグは、好適な手段によって分離され得る。いくつかの実施形態では、タグは、未結合試薬の除去後に残る複合体から切断または解離される。例えば、タグは、切断可能なリンカー（以下のセクションｆ）に記載される「切断可能なリンカー」）を介して第２の結合メンバーに付着され得る。第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体は、切断可能なリンカーの切断を媒介する切断剤に曝露されてもよい。
ある特定の実施形態では、第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体からのタグの分離は、複合体の破壊をもたらさず、複合体からタグのみの遊離をもたらす条件下で実行される。他の場合では、第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体からのタグの分離は、複合体の破壊をもたらし得る条件下で実行され、タグ、ならびに第２の結合メンバー、検体、第１の結合メンバーの、複合体からの遊離をもたらす。ある特定の実施形態では、タグをカウントするために使用されるナノポアのサイズは、第２の結合メンバー、検体、第１の結合メンバーがナノポアを通って転位するのを防止し得る。他の実施形態では、第２の結合メンバー、検体、第１の結合メンバーの複合体が固体支持体上に保持される場合、ナノポアは、第２の結合メンバー、検体、および第１の結合メンバーを排除するようにサイズ決定されないことがある。
分離ステップは、電界の影響下で（以下のセクションｆ）に記載される）ナノポアまたはナノポア層を通してまたは横切って転位させることができる遊離タグの生成をもたらす。ある特定の場合において、切断ステップは、第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体中の第２の結合メンバーの各々に付着した実質的に全てのタグ分子（複数可）の分離をもたらし得る。タグ分子の数は、試料中の検体の濃度に比例する複合体中の検体分子の数に相関し得る。ある特定の実施形態では、カウントされたタグと検体濃度との間の相関は、直接的であり得る（より多いタグ分子の数は、より高い検体濃度に関連する）。（本明細書で定義されるような）トレーサなどのタグ付き競合物またはタグ付き検体が、試料と組み合わされ、このタグ付き競合物またはタグ付き検体が、第１の結合メンバーへの結合に関して試料中の検体と競合する試料と組み合わされる実施形態では、カウントされたタグと検体濃度との間の相関は逆でもよい（より少ないタグ分子の数は、より高い検体濃度に関連する）。タグ分子の数と検体濃度との間の相関は、直接的であれ逆であれ、線形または対数的であり得る。したがって、ナノポアを通って転位するタグ分子の数を使用して、試料中の検体濃度を決定することができる。ある特定の実施形態では、検体の濃度は、単位時間当たりに層を通って転位するタグの数をカウントすることによって決定され得る。他の実施形態では、検体の濃度は、層を通って転位するタグの数が閾値に達する時間を決定することによって決定されてもよい。ある特定の実施形態では、ナノポアを通ってまたは横切って転位するタグ分子の数は、単位時間当たりのナノポアでの電流遮断の頻度によって決定され得る。シグナル検出は、以下のセクションｇ）でさらに記載される。以下のセクションｄ）に記載されるように、タグ分子は、ナノ粒子またはナノビーズ（本明細書に定義される「ナノ粒子」および「ナノビーズ」）であり得る。
第２の結合メンバーに組み込まれたタグの数（すなわち、タグ／第２の結合メンバー接合体中のタグの数）は、検体に関して規定の化学量論を提供する。ある特定の実施形態では、タグは、各第２の結合メンバーに付着した一定数のタグ（複数可）を生じる手順を使用して、第２の結合メンバーに付着してもよい。タグの数は、カウントの速度に基づいて最適化することができる。カウントレートは、濃度に依存するため、結合メンバーにより多くのタグを含めることによって、より速い読み取り速度を得ることができる。タグの数は、タグ組み込みの化学量論、例えば１：１または１：４の組み込み速度に基づいて最適化することができる。いくつかの実施形態では、１：５の組み込み速度である。例えば、１つの第２の結合メンバーは、それに付着した１個のタグ分子、２個のタグ分子、３個のタグ分子、４個のタグ分子、または最大１０個のタグ分子を有し得る。いくつかの実施形態では、１つの第２の結合メンバーは、それに付着した５個のタグ分子を有し得る。タグを第２の結合メンバー（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸）に接合するための多数の接合方法が知られており、それらのうちのいずれかを使用して、本方法およびデバイスで使用するためのタグ付きの第２の結合メンバーを調製することができる。例えば、検体特異的抗体へのタグの部位特異的接合は、チオール−マレイミド化学、アミン−スクシンイミジル化学、ＴＨＩＯＢＲＩＤＧＥ（商標）技術を使用し、ＣまたはＮ末端ヘキサヒスチジンタグを有する抗体、アルデヒドを有する抗体、銅を含まないクリック反応等を使用して実行され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、転位事象の数を決定することによって検体の量を測定することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の転位事象（複数可）は、特異的結合メンバーへのタグ組み込みの化学量論に依存して、結合メンバーと検体との間の結合事象に対応し得る。例えば、結合メンバー当たり１つのタグが組み込まれている場合、１つの転位事象が、結合メンバーの検体への結合を表し、結合メンバー当たり２つのタグが組み込まれている場合、２つの転位事象が、結合メンバーの検体への結合を表し、結合メンバー当たり３つのタグが組み込まれている場合、３つの転位事象が、結合メンバーの検体への結合を表す等である。
別の実施形態では、第２の結合メンバーは、検体に特異的に結合するアプタマーであり得る。この実施形態では、タグは、アプタマーに付着していなくてもよい。むしろアプタマーは、それがナノポアを通ってまたは横切って転位するときにカウントされ、すなわち、アプタマーは、第２の結合メンバーであることおよびタグであることの二重の機能を果たす。これらの実施形態では、第１の結合メンバー−検体−アプタマー複合体の複合体中のアプタマーは、任意の好適な方法によって複合体から解離させることができる。例えば、ナノポアを通るまたはナノポアを横切る転位の前に、第１の結合メンバー−検体の複合体に結合したアプタマーは、変性ステップを介して解離され得る。変性ステップは、カオトロピック試薬、高塩溶液、酸性試薬、塩基性試薬、溶媒、または加熱ステップへの曝露を含み得る。次いで、アプタマーは、ナノポアを通ってまたは横切って転位し得、ナノポアを通ってまたは横切って転位するアプタマー分子の数を使用して、試料中の検体の濃度を決定することができる。
本明細書に記載されるように、タグまたはアプタマーは核酸を含み得る。ある特定の実施形態では、ナノポアを使用するカウントステップは、タグ／アプタマー中に存在する核酸配列の少なくとも一部の同一性を決定することによって、タグまたはアプタマーの同一性を決定することを含まない。例えば、カウントステップは、タグ／アプタマーの配列を決定することを含まなくてもよい。他の実施形態では、タグ／アプタマーは配列決定されなくてもよいが、タグ／アプタマーの同一性は、そのサイズ、立体配座、電荷、電荷量等に起因して、タグ／アプタマーに関連する識別可能なシグナルに基づいて１つのタグ／アプタマーが別のタグ／アプタマーから区別され得る程度で決定され得る。タグ／アプタマーの同定は、試料中の複数の異なる検体、例えば試料中の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる検体の同時分析を含む方法において有用であり得る。
ある特定の実施形態では、単一の試料中の複数の検体の同時分析は、一対の第１および第２の結合メンバーが、試料中の単一の検体に特異的である、複数の異なる第１および第２の結合メンバーを使用することによって行われ得る。これらの実施形態では、単一の検体に特異的な第１の結合メンバーと第２の結合メンバーの第１の対の第２の結合メンバーに関連するタグは、異なる検体に特異的な第１の結合メンバーと第２の結合メンバーの第２の対の第２の結合メンバーに関連するタグから区別可能であり得る。上記のように、第１のタグは、寸法、電荷等の違いに基づいて、第２のタグから区別可能であり得る。
いくつかの実施形態では、実質的に正確に決定することができる流体試料中の検体の濃度は、約５０００ｆＭ（フェムトモル）未満、約３０００ｆＭ未満、約２０００ｆＭ未満、約１０００ｆＭ未満、約５００ｆＭ、約３００ｆＭ未満、約２００ｆＭ未満、約１００ｆＭ未満、約５０ｆＭ未満、約２５ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約５ｆＭ未満、約２ｆＭ未満約１ｆＭ未満、約５００ａＭ未満（アトモル）、約１００ａＭ未満、約１０ａＭ未満、約５ａＭ未満、約１ａＭ未満、約０．１ａＭ未満、約５００ｚＭ（ゼプトモル）未満、約１００ｚＭ未満、約１０ｚＭ未満、約５ｚＭ未満、約１ｚＭ未満、約０．１ｚＭ未満、またはそれ以下である。
いくつかの場合において、検出限界（例えば、溶液中で決定され得る検体の最低濃度）は、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、約１ｆＭ、約５００ａＭ（アトモル）、約１００ａＭ、約５０ａＭ、約１０ａＭ、約５ａＭ、約１ａＭ、約０．１μＭ、約５００μＭ（ゼプトモル）、約１００ｚＭ、約５０ｚＭ、約１０ｚＭ、約５ｚＭ、約１ｚＭ、約０．１ｚＭ、またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、実質的に正確に決定することができる流体試料中の検体の濃度は、約５０００ｆＭ〜約０．１ｆＭ、約３０００ｆＭ〜約０．１ｆＭ、約１０００ｆＭ〜約０．１ｆＭ、約１０００ｆＭ〜約０．１μＭ、約１００ｆＭ〜約１ｚＭ、約１００ａＭ〜約０．１ｚＭ、またはそれ以下である。
検出上限（例えば、溶液中で決定され得る検体の最高濃度）は、少なくとも約１００ｆＭ、少なくとも約１０００ｆＭ、少なくとも約１０ｐＭ（ピコモル）、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１０ｎＭ（ナノモル）、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１０００μＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１０００ｍＭ、またはそれ以上である。
いくつかの場合において、試料中の検体の存在および／または濃度は、通常約１時間、例えば４５分、３０分、１５分、１０分、５分、１分、または３０秒未満で迅速に検出され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法のうちの少なくともいくつかのステップは、以下のセクション３に記載されるデバイスなどのデジタルマイクロ流体デバイス上で実行され得る。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ナノポアデバイスと共にデジタルマイクロ流体デバイスを使用して実行される。例えば、デジタルマイクロ流体デバイスおよびナノポアデバイスは、別々のデバイスであり得、切断されたタグ（複数可）または解離したアプタマー（複数可）を含む液滴は、マイクロ流体デバイス中で生成され得、ナノポアデバイスに輸送され得る。ある特定の実施形態では、切断されたタグ（複数可）または解離したアプタマー（複数可）を含む液滴は、マイクロ流体デバイスから吸引され得、ユーザまたはロボットによって操作されるピペットを使用して、ナノポアデバイスに輸送され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、デジタルマイクロ流体モジュールがナノポアモジュールと集積されているデバイス、例えば下記のデバイスを使用して実行される。ある特定の実施形態では、デジタルマイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールは、可逆的に集積されてもよい。例えば、２つのモジュールを物理的に組み合わせて集積デバイスを形成し、次いでそのデバイスを個々のモジュールに分離することができる。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、内蔵ナノポアモジュールを有するマイクロ流体モジュールを含む使い捨てカートリッジを使用して実行される。本明細書で提供される方法を行うために使用されるデバイスの例示的な実施形態は、次のセクションでさらに説明される。
ある特定の場合において、ナノポアモジュールと（可逆的にまたは完全に）集積されたデバイスのマイクロ流体デバイスまたはマイクロ流体モジュールは、間隔を空けて配置された第１の基板および第２の基板を含み得、第１の基板は、ギャップ／空間によって第２の基板から分離され、少なくとも試料を第１の結合メンバーと接触させるステップ、検体を第２の結合メンバーと接触させるステップ、第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去するステップ、および第２の結合メンバーに付着したタグ（第１の結合メンバーに結合した検体に結合したままである）を切断するステップは、第１の基板と第２の基板との間の空間／ギャップで実行される。
本方法の例示的な実施形態は、試料の液滴を生成すること、および試料の液滴を第１の結合メンバーを含む液滴と混合して単一の液滴を生成することを含む。第１の結合メンバーは、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）などの固体基材上に固定化されてもよい。単一の液滴は、試料液滴中に存在する検体への第１の結合メンバーの結合を可能にするのに十分な時間インキュベートされ得る。任意選択で、単一の液滴を撹拌して、試料と第１の結合メンバーとの混合を容易にすることができる。混合は、単一の液滴を前後に移動させること、単一の液滴を複数の電極上で移動させること、液滴を分割し、次いで液滴を合体させること、またはＳＡＷを使用すること等によって達成され得る。次に、液滴を移動させて第２の結合メンバーを含む液滴と交換しながら、単一の液滴に磁力をかけてビーズをデバイス内の位置に保持することができる。第２の結合メンバーを添加する前に、磁力を使用してビーズが保持されている位置に洗浄緩衝液の液滴を移動させることによって、任意選択の洗浄ステップを行うことができる。第２の結合メンバーが第１の結合メンバーに結合した検体に結合するのに十分な期間の後、ビーズが第１の位置に保持されている間に第２の結合メンバーを含有する液滴を移動させることができる。ビーズは、洗浄緩衝液の液滴を使用して洗浄し、続いてビーズを切断試薬を含有する液滴と接触させて、第２の結合メンバーに付着したタグを切断することができる。タグが光切断可能なリンカーを介して第２の結合メンバーに付着している実施形態では、ビーズを適切な波長の光に曝露してリンカーを切断することができる。ある特定の場合において、光切断可能なリンカーの切断前に、ビーズを緩衝液の液滴に曝露してもよい。任意選択で、未結合の第２の結合メンバーを除去する洗浄ステップの後、液滴を含有する緩衝液は、ビーズを被覆したままであり得、ビーズを第１の位置に保持する磁力を除去することができ、ビーズを含む緩衝液の液滴を、光切断が実行され得る第２の位置に移動させることができる。次いで、切断されたタグを含有する液滴を、ナノポアデバイスまたは集積デバイスのナノポアモジュール部分に移動させることができる。第２の結合メンバーとしてアプタマーを使用する実施形態では、未結合アプタマーを除去する洗浄ステップの後、液滴を含有する緩衝液は、ビーズを被覆したままであり得、ビーズを第１の位置に保持する磁力を除去することができ、ビーズを含む緩衝液の液滴を、アプタマーの解離が実行され得る第２の位置に移動させることができる。他の実施形態では、洗浄ステップの後、ビーズを、検体に結合したアプタマーを解離させるための試薬の液滴に曝露してもよい。磁石を使用してビーズを適所に保持しながら、解離したアプタマーを含有する液滴をナノポアに移動させることができる。解離したアプタマーを含有する液滴は、ナノポアデバイスまたは集積デバイスのナノポアモジュール部分に移動させることができる。
代替実施形態では、第１の結合メンバーは、ギャップ／空間内の位置で第１または第２の基板の表面に固定化されてもよい。試料を第１の結合メンバーと接触させるステップは、第１の結合メンバーが固定化されているギャップ／空間内の位置に試料の液滴を移動させることを含み得る。その後のステップは、磁気ビーズ上に固定化された第１の結合メンバーについて上述したものと実質的に同様であり得る。
切断／解離ステップの後、切断したタグ（複数可）／解離したアプタマー（複数可）を含有する液滴を、ナノポアデバイスまたは集積デバイスのナノポアモジュールに移動させることができる。上記のように、液滴（複数可）は、ピペットなどの液体転送システムを使用して移動させることができる。ある特定の場合において、マイクロ流体モジュールは、ナノポアモジュールに流体的に接続されてもよい。流体接続は、マイクロ流体モジュールをチャネルを介してナノポアモジュールに接続することによって、またはナノポアモジュールをマイクロ流体モジュール内に可逆的にまたは集積デバイスの製造プロセス中に配置することによって達成することができる。そのようなデバイスは、以下のセクションでさらに説明される。
上記の実施形態では、任意選択で、組み合わせた後、液滴を操作して（例えば、前後に動かす、円周方向に動かす、振動させる、分割／合体させる、ＳＡＷに曝露する等）、試料とアッセイ試薬、例えば第１の結合メンバー、第２の結合メンバー等との混合を促進する。
集積マイクロ流体ナノポアデバイス内の液滴の移動は、電力（例えば、エレクトロウェッティング、誘電泳動、電極媒介、光エレクトロウェッティング、電界媒介、および静電作動）、圧力、表面弾性波等を使用して実行され得る。液滴を移動させるために使用される力は、以下のセクションａ）〜ｇ）に記載されているデバイスの詳細に基づいて、またセクション３に記載される特定のデバイスについて決定されてもよい。
ａ）多重化
方法は、多重化アッセイにおいて試料中の１つ以上（または代替として２つ以上）の標的検体を検出するための１つ以上（または代替として２つ以上）の特異的結合メンバーを含み得る。１つ以上（または代替として２つ以上）の特異的結合メンバーの各々は、異なる標的検体に結合し、各特異的結合メンバーは、異なるタグおよび／またはアプタマーで標識される。例えば、第１の特異的結合メンバーは、第１の標的検体に結合し、第２の特異的結合メンバーは、第２の標的検体に結合し、第３の特異的結合メンバーは、第３の標的検体に結合する等であり、第１の特異的結合メンバーは、第１のタグおよび／またはアプタマーで標識され、第２の特異的結合メンバーは、第２のタグおよび／またはアプタマーで標識され、第３の特異的結合メンバーは、第３のタグおよび／またはアプタマーで標識される等である。いくつかの実施形態では、第１の状態は、第１の特異的結合メンバーがタグで標識される場合、第１のタグの切断もしくは遊離を引き起こすか、または第１の特異的結合メンバーがアプタマーで標識される場合、第１のアプタマーの解離もしくは遊離を引き起こし、第２の状態は、第２の特異的結合メンバーがタグで標識される場合、第２のタグの切断もしくは遊離を引き起こすか、または第２の特異的結合メンバーがアプタマーで標識される場合、第２のアプタマーの解離もしくは遊離を引き起こし、第３の状態は、第３の特異的結合メンバーがタグで標識される場合、第３のタグの切断もしくは遊離を引き起こすか、または第３の特異的結合メンバーがアプタマーで標識される場合、第３のアプタマーの解離もしくは遊離を引き起こす等である。いくつかの実施形態では、試料の状態は、アッセイの間の様々な時間で変更され得、第１のタグまたはアプタマー、第２のタグまたはアプタマー、第３のタグまたはアプタマー等の検出を可能にし、それによって１つ以上の（代替として２つ以上の）標的検体を検出することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上（代替として２つ以上）の切断タグおよび／または解離アプタマーは、ナノポア内の滞留期間、電流インピーダンスの大きさ、またはそれらの組み合わせに基づいて、細孔を通して同時に検出される。
ｂ）例示的な標的検体
当業者によって理解されるように、第１の結合メンバーおよび第２の結合メンバーによって特異的に結合され得る任意の検体は、本開示の方法およびデバイスを使用して検出され、任意選択で定量され得る。
いくつかの実施形態では、検体は、生体分子であり得る。生体分子の非限定的な例としては、タンパク質、脂質、および炭水化物などの高分子が挙げられる。ある特定の例において、検体は、ホルモン、抗体、成長因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば神経、ホルモン、栄養素、および細胞表面受容体）またはそれらのリガンド、癌マーカー（例えばＰＳＡ、ＴＮＦ−α）、心筋梗塞のマーカー（例えば、トロポニン、クレアチンキナーゼ等）、毒素、薬物（例えば、中毒薬）、代謝剤（例えば、ビタミンを含む）等であり得る。タンパク質検体の非限定的な実施形態としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質等が挙げられる。
ある特定の実施形態では、検体は、翻訳後修飾タンパク質（例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化タンパク質）であり得、第１または第２の結合メンバーは、翻訳後修飾に特異的な抗体であり得る。修飾タンパク質は、固体支持体上に固定化された第１の結合メンバーに結合してもよく、ここで第１の結合メンバーは、修飾タンパク質に結合するが、非修飾タンパク質には結合しない。他の実施形態では、第１の結合メンバーは、未修飾タンパク質および修飾タンパク質の両方に結合し得、第２の結合メンバーは、翻訳後修飾タンパク質に特異的であり得る。
いくつかの実施形態では、検体は、循環腫瘍細胞、病原性細菌、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスを含む）、フィロウイルス（エボラ）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）、ＨＰＶ等、胞子等であり得る。
本明細書に提示される方法によって分析され得る検体の非限定的な一覧には、Ａβ４２アミロイドβタンパク質、フェチュイン−Ａ、タウ、セクレトグラニンＩＩ、プリオンタンパク質、アルファシヌクレイン、タウタンパク質、ニューロフィラメント軽鎖、パーキン、ＰＴＥＮ誘導推定上のキナーゼ１、ＤＪ−１、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、突然変異型ＡＴＰ１３Ａ２、アポＨ、セルロプラスミン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベータ−１α（ＰＧＣ−１α）、トランスサイレチン、ビタミンＤ結合タンパク質、プロアポトーシスキナーゼＲ（ＰＫＲ）およびそのリン酸化ＰＫＲ（ｐＰＫＲ）、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ−１２ｐ４０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ−８、Ｄｋｋ−３（***）、ｐ１４エンドカン断片、血清、ＡＣＥ２、ＣＤ２５に対する自己抗体、ｈＴＥＲＴ、ＣＡＩ２５（ＭＵＣ１６）、ＶｅＧＦ、ｓＩＬ−２、オステオポンチン、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、αフェトプロテイン、アルブミン、アルブミン尿、微量アルブミン尿、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、腎臓損傷分子−１（ＫＩＭ−１）、肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、ＬＭＰ１、ＢＡＲＦ１、ＩＬ−８、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＩ、ＥＧＲＦ、ＦＧＦ１９、ＦＲＳ２、ＧＲＥＢ１、およびＬＺＴＳ１、α−アミラーゼ、癌胎児性抗原、ＣＡ １２５、ＩＬ８、チオレドキシン、β−２ミクログロブリンレベル−ウイルスの活性のモニタリング、腫瘍壊死因子−α受容体−ウイルスの活性のモニタリング、ＣＡ１５−３、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、Ｔ細胞リンパ腫浸潤および転移１（ＴＩＡＭ１）、Ｎ−カドヘリン、ＥＣ３９、アンフィレグリン、ｄＵＴＰａｓｅ、分泌ゲルゾリン（ｐＧＳＮ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、チモシンβ１５、インスリン、血漿Ｃ−ペプチド、グリコシル化ヘモグロビン（ＨＢＡ１ｃ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＡＲＨＧＤＩＢ（Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害剤２）、ＣＦＬ１（コフィリン−１）、ＰＦＮ１（プロフィリン−１）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ）、Ｓ１００Ａ１１（タンパク質Ｓ１００−Ａ１１）、ＰＲＤＸ６（ペルオキシレドキシン−６）、ＨＳＰＥ１（１０ｋＤａ熱ショックタンパク質、ミトコンドリア）、ＬＹＺ（リゾチームＣ前駆体）、ＧＰＩ（グルコース−６−リン酸イソメラーゼ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ（ヒストンＨ２Ａタイプ２−Ａ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＳＰＧ２（基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（ガレクチン−３−結合タンパク質前駆体）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ前駆体）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ前駆体）、ＩＱＧＡＰ１（Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ１）、ＣＰ（セルロプラスミン前駆体）、およびＩＧＬＣ２（ＩＧＬＣ１タンパク質）、ＰＣＤＧＦ／ＧＰ８８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ４、ＩＧＦ−ＩＲ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、Ａｋｔ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＨＩＰ、Ｇｒｂ２、Ｇａｂ２、ＰＤＫ−１（３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１）、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ｍＴＯＲ、ＭＩＧ−６（ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１）、Ｓ６Ｋ、ｓｒｃ、ＫＲＡＳ、ＭＥＫマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１、ｃＭＹＣ、ＴＯＰＯ ＩＩトポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩα１７０ｋＤａ、ＦＲＡＰ１、ＮＲＧ１、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＧＲ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＥＤＤ４−１、ＦＯＸＯ３Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＰＸＮ、ＥＬＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＡＲ、ＥＰＨＢ２、ＫＬＦ６、ＡＮＸＡ７、ＮＫＸ３−１、ＰＩＴＸ２、ＭＫＩ６７、ＰＨＬＰＰ、ＡＤＩＰＯＮＥ、（ＡＤＩＰＯＮ）フィブリノーゲンα鎖（ＦＧＡ）、レプチン（ＬＥＰ）、高度グリコシル化最終産物特異的受容体（ＡＧＥＲ、別名ＲＡＧＥ）、α−２−ＨＳ−糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、ＣＤ１４分子（ＣＤ１４）、フェリチン（ＦＴＨ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インターロイキン２受容体、α（ＩＬ２ＲＡ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＩＬ１α、ＴＮＦα、核周囲抗好中球細胞質抗体（ｐ−ＡＮＣＡ）、ラクトフェリン、カルプロテクチン、ウィルムス腫瘍−１タンパク質、アクアポリン−１、ＭＬＬ３、ＡＭＢＰ、ＶＤＡＣ１、Ｅ．ｃｏｌｉエンテロトキシン（熱不安定性外毒素、熱安定性エンテロトキシン）、インフルエンザＨＡ抗原、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、志賀様毒素Ｉ、志賀様毒素ＩＩ、クロストリジウム−ディフィシル毒素ＡおよびＢ等が含まれる。
対象の方法およびデバイスを使用して、環境試料、必要とする患者または被験体から得られた生物学的試料のような試料中で測定され得る核酸アプタマーの例示的な標的としては、乱用薬物（例えば、コカイン）、タンパク質バイオマーカー（ヌクレオリン、核因子−ｋＢ必須モジュレータ（ＮＥＭＯ）、ＣＤ−３０、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＭＵＣ１グリコフォーム、免疫グロブリンμ重鎖（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンＥ、αｖβ３インテグリン、α−トロンビン、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＮＦ−ｋＢ、Ｅ２Ｆ転写因子、ＨＥＲ３、プラスミノーゲンアクチベータ阻害因子、テネイシンＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、胃癌細胞、ＨＧＣ−２７）；細胞（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌細胞（ＤＬＤ−１）、Ｈ２３肺腺癌細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（ＨＬ６０）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞、ＮＣＩＨ６９、ヒト膠芽腫細胞、Ｕ１１８−ＭＧ、ＰＣ−３細胞、ＨＥＲ−２過剰発現ヒト乳癌細胞、ＳＫ−ＢＲ−３、膵臓癌細胞株（Ｍｉａ−ＰａＣａ−２）を含むが、これらに限定されない）；および感染因子（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｏ８、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。
対象の方法およびデバイスを使用して必要とする患者または被験体から得られた試料中で測定され得るタンパク質またはペプチドアプタマーの例示的な標的としては、ＨＢＶコアカプシドタンパク質、ＣＤＫ２、Ｅ２Ｆ転写因子、チミジレートシンターゼ、Ｒａｓ、ＥＢ１、および高度糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。アプタマー、ならびにその使用および産生方法は、例えば、Ｓｈｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１３ ４：８７２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ ＭｅｄＣｈｅｍ．２０１１；１８：４１８５、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）．２０１２ ４８：１０４７２、Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．２００３ ２：７２、Ｒｅｖｅｒｄａｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ ８：ｅ６５１８０において検討されている。
ｃ）試料
本明細書で使用される場合、「試料」、「試験試料」、「生物学的試料」は、目的の検体を含有するかまたは含有することが疑われる流体試料を指す。試料は、任意の好適な供給源に由来し得る。いくつかの場合において、試料は、液体、流動性粒子状固体、または固体粒子の流体懸濁液を含み得る。いくつかの場合において、本明細書に記載の分析の前に試料を処理してもよい。例えば、試料は、分析前にその供給源から分離または精製することができるが、ある特定の実施形態では、検体を含有する未処理試料を直接アッセイすることができる。検体分子の供給源は、合成（例えば、実験室で産生された）、環境（例えば、空気、土壌、流体試料、例えば水道等）、動物、例えば哺乳動物、植物、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の例では、検体の供給源は、ヒト身体物質（例えば、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、痰、***、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄液、脳脊髄液、糞便、組織、臓器等）である。組織には、骨格筋組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、心筋組織、脳組織、骨髄、子宮頸部組織、皮膚等が含まれ得るが、これらに限定されない。試料は、液体試料または固体試料の液体抽出物であり得る。ある特定の場合において、試料の供給源は、組織崩壊／細胞溶解によって可溶化され得る、生検試料などの器官または組織であり得る。
広範囲の体積の流体試料を分析することができる。いくつかの例示的な実施形態では、試料体積は、約０．５ｎＬ、約１ｎＬ、約３ｎＬ、約０．０１μＬ、約０．１μＬ、約１μＬ、約５μＬ、約１０μＬ、約５０μＬ、約１００μＬ、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ等であり得る。いくつかの場合において、流体試料の体積は、約０．０１μＬ〜約１０ｍＬ、約０．０１μＬ〜約１ｍＬ、約０．０１μＬ〜約１００μＬ、約０．１μＬ〜約１０μＬ、約１μＬ〜約１００μＬ、約１０μＬ〜約１００μＬ、または約１０μＬ〜約７５μＬである。
いくつかの場合において、流体試料は、アッセイに使用する前に希釈することができる。例えば、検体分子の供給源がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、その流体を適切な溶媒（例えば、ＰＢＳ緩衝液などの緩衝液）で希釈することができる。流体試料は、使用前に約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、またはそれ以上に希釈することができる。
いくつかの場合において、試料は、分析前処理を受けてもよい。分析前処理は、非特異的タンパク質除去および／または効果的ではあるが安価に実施可能な混合機能などの追加の機能を提供し得る。前分析処理の一般的な方法としては、動電トラッピング、ＡＣ動電学、表面弾性波、等速電気泳動、誘電泳動、電気泳動、または当技術分野において知られている他の予備濃縮技法の使用を挙げることができる。いくつかの場合において、流体試料は、アッセイに使用する前に濃縮することができる。例えば、検体分子の供給源がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、その流体は、沈殿、蒸発、濾過、遠心分離、またはそれらの組み合わせによって濃縮することができる。流体試料は、使用前に約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、またはそれ以上に濃縮することができる。
ある特定の実施形態では、検体の測定前に、検体は増幅されない（すなわち、検体のコピー数は増加しない）。例えば、検体がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、検体は、検体のコピー数を増加させるために複製されない。ある特定の場合において、検体は、タンパク質または小分子である。
ｄ）特異的結合メンバー
当業者によって理解されるように、結合メンバーは、分析される検体によって決定されるであろう。多種多様な標的分子に対する結合メンバーが知られているか、または公知の技法を使用して容易に発見または開発することができる。例えば、標的検体がタンパク質である場合、結合メンバーは、タンパク質、特に抗体またはその断片（例えば、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ′）２断片、組み換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物に由来する可変重鎖ドメイン（「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ断片」としても知られる）（ＶＨＨおよびそれらを作製する方法は、Ｇｏｔｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１４：７７−８５（２００９）に記載されている）、組み換えＶＨＨ単一ドメイン抗体、およびＶＮＡＲ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、ならびに上記のうちのいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片、全長ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体様断片等）、受容体タンパク質、タンパク質Ａ、タンパク質Ｃ等の他のタンパク質を含み得る。検体が、ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質などの小分子である場合、第１および／または第２の結合メンバーは、足場タンパク質（例えば、リポカリン）または受容体であり得る。いくつかの場合において、タンパク質検体のための結合メンバーは、ペプチドであり得る。例えば、標的検体が酵素である場合、好適な結合メンバーは、酵素基質および／またはペプチド、小分子等であり得る酵素阻害剤を含み得る。いくつかの場合において、標的検体がリン酸化種である場合、結合メンバーは、リン酸結合剤を含み得る。例えば、リン酸結合剤は、米国特許第７，０７０，９２１号および米国特許出願第２００６／０１２１５４４号に記載されているものなどの金属イオン親和性媒体を含むことができる。
ある特定の場合において、結合メンバーのうちの少なくとも１つは、アプタマー、例えば米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，５６７，５８８号、第５，５９５，８７７号、第５，６３７，４５９号、第５，６８３，８６７号、第５，７０５，３３７号に記載されているものであり得る。核酸アプタマー（例えば、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子）は、事実上あらゆる標的分子を捕捉するために開発され得る。より低い結合親和性を有するアプタマーを選択することができるが、アプタマーは、典型的には非常に高い親和性で、非常に特異的な立体構造依存的様式で標的分子に結合する。アプタマーは、メチルまたはヒドロキシル基の存在または不在などの非常に小さい構造上の違いに基づいて標的検体分子を区別することができ、ある特定のアプタマーは、Ｄ−およびＬ−エナンチオマーとジアステレオマーとを区別することができる。アプタマーは、薬物、金属イオン、および有機染料、ペプチド、ビオチン、およびタンパク質を含む小分子標的に結合し得る。アプタマーは、ビオチン化、蛍光標識後、ならびにガラス表面および微小球に付着したときも機能的活性を保持することができる。
核酸アプタマーは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、または修飾オリゴデオキシヌクレオチドもしくはオリゴリボヌクレオチドであり得る、オリゴヌクレオチドである。「修飾された」は、共有結合的に修飾された塩基および／または糖を有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドには、３′位のヒドロキシル基以外および５′位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドが含まれる。したがって、修飾ヌクレオチドにはまた、２′置換糖、例えば２′−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２′−Ｓ−アルキル；２′−Ｓ−アリル；２′−フルオロ−；２′−ハロ、または２−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖；エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプツロースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、結合メンバーは、配列番号１〜１１のうちのいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
ペプチドアプタマーは、タンパク質相互作用を干渉するように設計され得る。ペプチドアプタマーは、可変ペプチドループが上に付着しているタンパク質足場に基づいてもよく、それによりアプタマーの立体配座を制限する。いくつかの場合において、ペプチドアプタマーの足場部分は、細菌チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）に由来する。
標的分子が炭水化物である場合、（本明細書で定義される）潜在的に好適な捕捉成分は、例えば、抗体、レクチン、およびセレクチンを含む。当業者によって理解されるように、目的の標的分子と特異的に会合し得る任意の分子が、結合メンバーとして潜在的に使用され得る。
ある特定の実施形態について、好適な標的検体／結合メンバーの複合体としては、抗体／抗原、抗原／抗体、受容体／リガンド、リガンド／受容体、タンパク質／核酸、酵素／基質および／または阻害剤、炭水化物（糖タンパク質および糖脂質を含む）／レクチンおよび／またはセレクチン、タンパク質／タンパク質、タンパク質／小分子等を挙げることができるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、第１の結合メンバーは、結合を介して固体支持体に付着することができ、これは結合メンバーの支持体への付着を促進する支持体および／または結合メンバーの任意の部分、官能化、または修飾を含み得る。結合メンバーと支持体との間の結合は、１つ以上の化学的または物理的（例えば、ファン・デル・ワールス力による非特異的付着、水素結合、静電相互作用、疎水性／親水性相互作用等）結合および／またはそのような結合（複数可）を提供する化学スペーサを含み得る。
ある特定の実施形態では、固体支持体はまた、アッセイ中に結合表面への非捕捉成分（例えば、検体分子、結合メンバー）の非特異的付着を排除するかまたは最小限に抑えることができる保護層、遮断層、または不動態化層を含み得、これは検出中の偽陽性シグナルまたはシグナルの喪失につながり得る。不動態化層を形成するためにある特定の実施形態において利用され得る材料の例としては、タンパク質の非特異的結合を拒絶するポリ（エチレングリコール）などのポリマー、血清アルブミンおよびカゼリンなどのこの特性を有する天然に存在するタンパク質、界面活性剤、例えばスルホベタインなどの双性イオン界面活性剤、天然に存在する長鎖脂質、ポリマーブラシ、ならびにサケ***ＤＮＡなどの核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態は、タンパク質またはポリペプチドである結合メンバーを利用する。当技術分野において知られているように、任意の数の技法を使用して、ポリペプチドを多種多様な固体支持体に付着させることができる。例えば、米国特許第５，６２０，８５０号に概説されている方法などの、タンパク質に反応性部分を付加するための多種多様な技法が知られている。さらに、タンパク質を表面に付着させる方法は公知であり、例えば、Ｈｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照されたい。
本明細書で説明されるように、結合メンバーと検体との間の結合は、例えば、結合メンバーおよび検体が結合対の相補的部分である場合のように特異的である。ある特定の実施形態では、結合メンバーは、検体に特異的に結合する。「特異的に結合する」または「結合特異性」とは、結合メンバーが、検体分子と試験試料の他の成分または汚染物質とを区別するのに十分な特異性で検体分子に結合することを意味する。例えば、一実施形態によれば、結合メンバーは、検体上のエピトープに特異的に結合する抗体であり得る。抗体は、一実施形態によれば、目的の検体に特異的に結合することができる任意の抗体であり得る。例えば、適切な抗体としては、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４−４９０に記載されるものなど、また天然に存在するか（例えば、軟骨魚類およびラクダ科と同様）または合成である（例えば、ナノボディ、ＶＨＨ、もしくは他のドメイン構造）単一ドメイン抗体ｓｄＡｂを含む）、合成抗体（抗体模倣体と称される場合がある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合（「抗体接合体」と称される場合がある）、ならびに各々の断片それぞれが挙げられるが、これらに限定されない。別の例として、検体分子は、抗体であり得、第１の結合メンバーは、抗原であり得、第２の結合メンバーは、標的抗体に特異的に結合する二次抗体であり得るか、または第１の結合メンバーは、標的抗体に特異的に結合する二次抗体であり、第２の結合メンバーは、抗原であり得る。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、化学的にプログラムされた抗体（ｃｐＡｂ）（Ｒａｄｅｒ（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１８６−１９７に記載される）、二重特異性ｃｐＡｂ、抗体動員分子（ＡＲＭ）（ＭｃＥｎａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：１１３９−１１５１に記載される）、トリリガンド捕捉剤などの分枝状捕捉剤（Ｍｉｌｌｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３：１８２８０−１８２８８に記載される）、非抗体足場に由来する操作された結合タンパク質、例えばモノボディ（ヒトフィブロネクチンの１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来する）、アフィボディ（免疫グロブリン結合タンパク質Ａに由来する）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリン繰り返しモジュールに基づく）、アンチカリン（リポカリンビリン結合タンパク質およびヒトリポカリン２に由来する）、ならびにシステインノットペプチド（ｋｎｏｔｔｉｎｓ）（Ｇｉｌｂｒｅｔｈ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，（２０１２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２：１−８、Ｂａｎｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１５：９３−１１３に記載される）、ＷＷドメイン（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２６（４）：３０７−３１４に記載される）、再利用受容体リガンド、アフィチン（Ｂｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）２６：２６７−２７５に記載される）、および／またはＡｄｈｉｒｏｎｓ（Ｔｉｅｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２７：１４５−１５５に記載される）であり得る。
検体が生物学的細胞（例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、他の脊椎動物、昆虫、酵母、細菌、細胞等）である一実施形態によれば、結合メンバーは、細胞表面抗原（例えば、細胞表面受容体）に対して特異的親和性を有するリガンドであり得る。一実施形態では、結合メンバーは、標的細胞型の表面に発現される細胞接着分子に対する結合特異性を有する、接着分子受容体またはその一部であり得る。使用中、接着分子受容体は、標的細胞の細胞外表面上の接着分子と結合し、それにより細胞を固定化または捕捉し、次いで、結合した細胞は、第１の結合と同じであり得るか、または細胞の表面に発現される異なる分子に結合し得る第２の結合メンバーを使用することによって検出され得る。
いくつかの実施形態では、検体分子と結合メンバーとの間の結合親和性は、アッセイの条件下で結合を維持するのに十分であるべきであり、非特異的に結合している分子または粒子を除去するための洗浄ステップを含む。いくつかの場合において、例えばある特定の生体分子の検出において、その相補的結合メンバーに対する検体分子の結合定数は、少なくとも約１０４〜約１０６Ｍ−１、少なくとも約１０５〜約１０９Ｍ−１、少なくとも約１０７〜約１０９Ｍ−１、約１０９Ｍ−１超、またはそれ以上であり得る。
ｅ）タグまたは標識
本明細書に記載の方法は、インピーダンスによって検体を分析するために、標識などのタグに結合した特異的結合メンバーを含み得る。組み込まれたタグまたは標識は、反応スキームの実施を実質的に干渉しない。例えば、組み込まれたタグまたは標識は、検体とその相補的結合メンバーとの結合定数またはそれらの間の相互作用を干渉しない。組み込まれたタグまたは標識のサイズおよび数は、捕捉速度および読み取り速度に関連し得る。取り込み速度および読み取り速度は、組み込まれたタグまたは標識のサイズおよび／または数を増やすことによって増加させることができる。例えば、組み込まれたタグまたは標識のサイズおよび数は、電荷を増加させ、ナノポアの捕捉ゾーンを増加させることができる。組み込まれたタグまたは標識は、結合メンバーの動態、例えば抗体動態、または反応スキームを改変しない。例示的なタグとしては、アニオン性ポリマーまたはカチオン性ポリマー（例えば、ポリヒスチジンまたはポリリジンなどの正味の正電荷を有するポリペプチド）などのポリマー（ポリマーの長さは約５〜１０００残基である）、結合メンバーと交差反応しない、および／またはアッセイを干渉しないタンパク質（例えば、球状タンパク質）、デンドリマー、例えばＤＮＡデンドリマー、および電荷ナノ粒子、例えばナノビーズが挙げられる。ポリマータグは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸などの核酸を含み得る。ポリマータグは、核酸塩基ポリマーを含み得る。ある特定の場合において、タグは、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーであり得、アプタマーは、検体に結合しない。タグがアプタマーである場合、それはナノポアを通る転位の前に任意選択で変性されてもよい。ポリマータグまたはナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、それがナノポアを通ってまたは横切って転位するときに、再現性のあるシグナルを発生させるのに十分に大きくてもよい。アプタマーは、２０〜２２０塩基長、例えば２０〜６０塩基長であり得る。ナノ粒子（例えば、ナノビーズまたはデンドリマー）のサイズは、直径が約１ｎｍ〜約９５０ｎｍ、例えば１０ｎｍ〜９００ｎｍ、２０ｎｍ〜８００ｎｍ、３０ｎｍ〜７００ｎｍ、５０ｎｍ〜６００ｎｍ、８０ｎｍ〜５００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、２００ｎｍ〜５００ｎｍ、３００ｎｍ〜５００ｎｍ、または４００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲、例えば１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、または９００ｎｍであり得る。タグとして使用されるとき、ナノ粒子のための好ましいサイズは、（本明細書にさらに記載されるように）ナノポアを通過し得るかまたは横切ることができるものである。ある特定の場合において、ナノビーズ／ナノ粒子は、正味の負電荷もしくは正電荷を有するか、または正味の負電荷もしくは正電荷を有するように処理することができる材料で作製することができる。例示的なナノビーズ／ナノ粒子は、有機または無機ポリマーから作製されたものを含む。有機ポリマーは、例えば、ポリスチレン、カーボン、ポリアクリルアミド等のポリマーを含む。無機ポリマーは、シリコンまたは金属ナノビーズ／ナノ粒子を含む。ある特定の場合において、ナノビーズ／ナノ粒子は、磁性でなくてもよい。
ある特定の場合において、タグは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、ナノポアを通るまたは横切る転位の前に、プローブ分子にハイブリダイズされ得る。ある特定の場合において、この方法は、単一試料中の複数の検体の分析を含み得る。試料中の異なる検体に結合する第２の結合メンバーは、タグとしてそれに付着した異なる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、異なる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、異なる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡがナノポアを通って移動するときにそれらをさらに区別する異なるプローブにハイブリダイズされ得る。他の実施形態では、異なる第２の結合メンバーに付着したタグは、そのタグがナノポアを通過するかまたは横切るときに区別可能な異なるヘアピン構造（例えば、ヘアピン構造の長さ）を有し得る。さらに別の実施形態では、異なる第２の結合メンバーに付着したタグは、タグがナノポアを通ってまたは横切って移動するときに区別可能な異なる長さを有し得る。例えば、タグは、異なる長さ（例えば、２５ｂｐ、５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、またはそれ以上）の二本鎖ＤＮＡであり得る。ある特定の場合において、異なる第２の結合メンバーに付着したタグは、異なる長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有し得るか、またはＰＥＧで異なって修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
タグまたはタグ分子への言及は、単一のタグまたは単一のタグ分子、ならびに複数のタグ（全てが同一であり得る）を包含することに留意されたい。ナノポアは、例えば基板、膜等の単一層に存在する単一のナノポアならびに複数のナノポアを包含することにさらに留意されたい。そのようなものとして、層／シート／膜内のナノポアを通ってまたは横切って転位するタグの数をカウントすることは、層／シート／膜内の１つ以上のナノポアを通ってまたは横切って転位する複数のタグのカウントを指す。ナノポアは、基板または膜などの単一層に存在してもよく、この層は、電気的に絶縁性であるか、または脂質二重層、誘電材料、例えば、窒化ケイ素およびシリカ、原子的に薄い膜、例えばグラフェン、ケイ素、シリセン、モリブデンジスルフィド（ＭｏＳ２）等、またはそれらの組み合わせなどの高い電気抵抗を有する任意の好適な材料で作製され得る。
タグは、任意のサイズまたは形状であり得る。いくつかの実施形態では、タグは、直径約１０〜９５０ｎｍ、例えば、直径２０〜９００ｎｍ、３０〜８００ｎｍ、４０〜７００ｎｍ、５０〜６００ｎｍ、６０〜５００ｎｍ、７０〜４００ｎｍ、８０〜３００ｎｍ、９０〜２００ｎｍ、１００〜１５０ｎｍ、２００〜６００ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、２〜１０ｎｍ、２〜４ｎｍ、または３〜４ｎｍのナノ粒子またはナノビーズであり得る。タグは、実質的に球形、例えば球形ビーズもしくはナノビーズ、または半球形であり得る。タグは、約０．５ｋＤａ〜約５０ｋＤａのサイズ、例えば約０．５ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約０．８ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１．０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約２．０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約０．５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約０．８ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１．０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２．０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約０．５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約０．８ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１．０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約２．０ｋＤａ〜約２５０ｋＤＡのサイズ、約５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約０．５ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約０．８ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１．０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約２．０ｋＤａ〜約２００ｋＤａのサイズ、約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約０．５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約０．８ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１．０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２．０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約０．５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約０．８ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１．０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約２．０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤＡ、約１０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、または約４０ｋＤａ〜約６０ｋＤａのタンパク質であり得る。
ある特定の実施形態では、タグは、ナノ粒子であり得る。本明細書に記載されるように、ナノ粒子は、第２の結合メンバーに可逆的に（例えば、切断可能に）付着してもよい。ある特定の態様では、ナノ粒子は、ナノポア層によって測定されたナノビーズの特性であり得る、定義された直径のナノビーズであり得る。ある特定の場合において、本開示の方法、システム、およびデバイスを使用して、試料中の複数の異なる検体を同時に分析することができる。そのような分析のために、各々が同族検体に特異的に結合する複数の第２の結合メンバーを使用することができる。異なる第２の結合メンバーの各々は、第２の結合メンバーを識別するために使用され得る異なるサイズのナノビーズに付着され得る。例えば、異なるナノビーズタグは、例えば１ｎｍ、２ｎｍ、４ｎｍ、６ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ、またはそれ以上、例えば最大２０ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、または９９０ｎｍの異なる直径を有し得る。
ある特定の実施形態では、異なる直径のナノビーズは全て、単一直径のナノポアを有するナノポア層を通って転位し得、異なるサイズのナノビーズは、ナノポア内の滞留期間、電流インピーダンスの大きさ、またはそれらの組み合わせに基づいて識別され得る。ある特定の場合において、第１の層が第１の直径のナノポアを有し、第２の層が第２の直径のナノポアを有することができる、複数のナノポア層を含む積層ナノポア層デバイスを使用して、ナノポアを通ってまたは横切って転位するナノビーズを検出し、カウントすることができる。複数のナノポア層は、より大きい直径のナノポアを有する層が、より小さい直径のナノポアを有する層の上流に置かれるように配置されてもよい。例示的な積層ナノポア層は、ＵＳ２０１２／００８０３６１に開示されている。
本方法においてタグとして使用され得る例示的なナノ粒子は、直径が５ｎｍ〜９５０ｎｍの範囲の金ナノ粒子またはポリスチレンナノ粒子を含む。
ある特定の場合において、タグは、核酸などのポリマーであり得る。タグの存在は、ポリマータグのサイズまたは長さに関連するシグナルなどの、タグに特徴的なシグナルを検出することによって決定され得る。ポリマータグのサイズまたは長さは、細孔またはチャネル内でのその滞留時間を測定することによって、例えば、電流の一時的な遮断の持続時間を測定することによって決定され得る。
タグまたは標識の一部であり得るか、全てであり得るか、それと関連し得るか、またはそれに付着され得る要素としては、ナノ粒子；金粒子；銀粒子；銀、銅、亜鉛、または他の金属コーティングもしくは堆積物；ポリマー；ドラッグ−タグ（本明細書に定義される）；磁性粒子；浮遊性粒子；金属粒子；電荷部分；誘電泳動タグ、二酸化ケイ素（不純物（例えば、石英、ガラス等）を含む／含まない）；ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）；ポリイミド；窒化ケイ素；金；銀；量子ドット（ＣｄＳ量子ドットを含む）；カーボンドット；蛍光体；消光剤；ポリマー；ポリスチレン；ヤヌス粒子；散乱粒子；蛍光粒子；燐光性粒子；球体；立方体；絶縁体；導体；バーコードもしくは標識粒子；多孔性粒子；固体粒子；ナノシェル；ナノロッド；微小球；ウイルス、細胞、寄生虫、および生物などの検体；核酸；タンパク質；分子認識要素；スペーサ；ＰＥＧ；デンドリマー；電荷調整因子；磁性材料；酵素；アプタマー配列を含むＤＮＡ；増幅可能ＤＮＡ；ＤＮＡの反復配列；検出可能な要素の、分子認識要素との融合もしくは接合（例えば、操作された結合メンバー）；抗抗体アプタマー；抗体結合タンパク質に向けられたアプタマー；吸収もしくは吸着された検出可能な化合物；ヘム；ルシフェリン；ホスホル；蛍光体；アジド、もしくはアルキレン（例えば、末端もしくは非末端アルキレン）、または他のクリック化学関与物が挙げられる。
ある特定の実施形態では、タグは、試料の迅速な分析を可能にするのに十分に高い捕捉速度を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、タグの捕捉速度は、１０秒当たり約１事象、５秒当たり１事象、１秒当たり１事象、またはそれ以上であり得る。ある特定の実施形態では、リボースポリマー、デオキシリボースポリマー、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの線状ポリマータグを使用することができる。典型的には、１ｎＭのＤＮＡ溶液について、塩勾配なし、２００〜８００ｍＶの電圧、および１Ｍの塩（ＫＣｌ）濃度で、固体ナノポア（Ｓｉ３Ｎ４）を使用すると、捕捉速度は、およそ１事象ｓｅｃ−１である。
ある特定の場合において、リボースポリマー、デオキシリボースポリマー、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの線状ポリマータグは、これらのタグの捕捉速度がある特定の用途には低すぎる場合があるため使用することができない。半球形、球形、または実質的に球形の形状のタグは、ナノポアを通って急速に転位し、したがってアッセイ期間が短縮され、より速いタグカウントを必要とする用途に使用することができる。ある特定の場合において、球形または半球形のタグのサイズは、アッセイに必要な捕捉速度に基づいて選択され得る。例えば、より高い捕捉速度のためには、より大きなサイズの球形または半球形のタグを選択することができる。ある特定の場合において、タグは、同じ測定条件下での、ＤＮＡタグなどの線状タグの捕捉速度よりも約１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、３００倍、５００倍、または１０００倍速い捕捉速度を有する、ナノ粒子／ナノビーズなどの球形タグであり得る。
いくつかの実施形態では、タグは、抗体、例えばＣＰＳＰ抗体接合体に接合することができる。いくつかの実施形態では、タグは、スペーサとともに抗体に接合されてもよく、例えば、スペーサとのＣＰＳＰ抗体接合体であり得る。いくつかの実施形態では、タグは、オリゴヌクレオチドおよび抗体に接合されてもよく、例えば、ＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体であり得る。いくつかの実施形態では、タグは、スペーサとともにオリゴヌクレオチドおよび抗体に接合されてもよく、例えば、スペーサとのＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体であり得る。いくつかの実施形態では、タグは、オリゴヌクレオチドに接合されてもよく、例えば、ＣＰＳＰオリゴヌクレオチド接合体であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、ニトロベンジル基、ジチオエチルアミノ、６炭素スペーサ、１２炭素スペーサ、または３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートを含む。いくつかの実施形態では、スペーサは、ニトロベンジル基を含み、タグは、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、スペーサは、ジチオエチルアミノであり、タグは、カルボキシル化ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、スペーサは、３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートであり、タグはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサは、６炭素スペーサまたは１２炭素スペーサを含み、タグは、ビオチンである。
ｆ）切断可能なリンカー
本明細書に記載の方法で使用されるタグは、一般的なリンカーによって特異的結合メンバーに付着させることができる。切断可能なリンカーは、タグを確実に除去できるようにする。一般的なリンカーは、切断可能なリンカーであり得る。例えば、タグは、切断可能なリンカーを介して第２の結合メンバーに付着されてもよい。第１の結合メンバー−検体−第２の結合メンバーの複合体は、切断可能なリンカーの切断を媒介する切断剤に曝露されてもよい。リンカーは、酸、塩基、求核剤、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素等への曝露を含む、任意の好適な方法によって切断され得る。好適なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．に開示されているように、標準化学遮断基から適合され得る。固相合成において使用されるさらなる好適な切断可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９２−２１５７，２０００）に開示されている。リンカーは、酸切断可能、塩基切断可能、または光切断可能であり得る。酸化還元反応は、切断スキームの一部であり得る。切断可能なリンカーは、電荷ポリマーであり得る。
リンカーは、光切断可能なリンカー、化学的に切断可能なリンカー、または熱的に切断可能なリンカーであり得る。実施形態では、リンカーは、感熱性の切断可能なリンカーであり得る。リンカーが光切断可能な基である場合、切断剤は、光切断可能な基を破壊または開裂する適切な波長の光であり得る。多くの実施形態では、光切断可能な結合基を切断するために使用される光の波長は、約１８０ｎｍ〜４００ｎｍ、例えば、約２５０ｎｍ〜４００ｎｍ、または約３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲である。切断を活性化するために必要とされる光は、検体の他の成分に影響を及ぼさないことが好ましい。好適なリンカーとしては、Ｏ−ニトロベンジル化合物およびニトロベラトリル化合物に基づくものが挙げられる。ベンゾイン化学に基づくリンカーを使用することもできる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：３４５４−３４６０，１９９９）。いくつかの実施形態では、光切断可能なリンカーは、以下の部分から誘導されてもよい。
あるいは、切断リンカーが化学的に切断可能な基である場合、切断剤は、その基を切断することができる化学剤であり得る。化学的に切断可能なリンカーは、酸化／還元に基づく切断、酸触媒による切断、塩基触媒による切断、または求核置換によって切断することができる。例えば、結合基がジスルフィドである場合、ジチオトレイトールまたはβメルカプトエタノールによるチオール媒介切断を使用して、タグを遊離させることができる。結合基が制限部位であるさらに他の実施形態では、薬剤は、加水分解酵素、制限酵素、または結合基を切断する他の酵素であり得る酵素などの触媒剤である。例えば、制限酵素は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＳ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型制限酵素であり得る。
いくつかの実施形態では、切断リンカーは、酵素的に切断可能な配列である。本明細書の実施形態のうちのいずれかの一態様では、酵素的に切断可能な配列は、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの核酸配列である。一実施形態では、酵素的に切断可能な配列は、少なくとも１０ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的に切断可能な配列は、２〜２０ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的に切断可能な配列は、２〜１５ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的に切断可能な配列は、４〜１０ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的に切断可能な配列は、４〜１５ヌクレオチドの配列を含む。
例えば、切断可能なリンカーは、アクリジニウム、置換ベンジルエーテルなどのエーテル、または酸性もしくは緩還元状態（例えば、アクリドンおよびスルホンアミドを産生する過酸化水素）によって切断され得るその誘導体（例えば、ベンジルヒドリルエーテル、インダニルエーテル等）、Ｐ−脱離を使用して生成された電荷ポリマーであり得、緩塩基は、産物であるアセタールを、そのチオ類似体を含めて遊離させるように機能することができ、脱離は、特に捕捉カルボニル化合物、感光性結合（例えば、Ｏ−ニトロベンゾイル、７−ニトロインダニル、２−ニトロベンズヒドリルエーテルもしくはエステル等）、または酵素的加水分解に供されるペプチドリンカー（例えば、酵素的に切断可能なリンカー）の存在下で緩酸によって達成され、特に酵素は、第Ｘａ因子もしくはエンテロキナーゼのペプチドなどの特異的配列を認識する。リンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸に不安定なリンカー（ジアルコキシベンジルリンカーを含む）、シーバーリンカー、インドールリンカー、ｔ−ブチルシーバーリンカー、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元条件、酸化条件下での切断、セーフティキャッチリンカーの使用による切断、および脱離機構による切断が挙げられるが、これらに限定されない。
求電子的に切断されたリンカーは、典型的にはプロトンによって切断され、酸に敏感な切断を含む。好適なリンカーとしては、トリチル、ｐ−アルコキシベンジルエステル、およびｐ−アルコキシベンジルアミドなどの修飾ベンジル系が挙げられる。他の好適なリンカーとしては、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基およびアセタール系が挙げられる。チオアセタールまたは他の硫黄含有保護基の切断における、ニッケル、銀または水銀などのチオフィリック金属の使用もまた、好適なリンカー分子の調製のために考慮され得る。
求核切断のために、水中で不安定である（すなわち、単純に塩基性ｐＨで切断され得る）エステルなどの基、および非水性求核剤に対して不安定である基を使用することができる。フッ化物イオンを使用して、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）またはｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）などの基中のケイ素−酸素結合を切断することができる。
ジスルフィド結合の還元の場合のように、還元的切断を受けやすいリンカーを使用することができる。ベンジルおよびベンジルオキシカルボニル基を切断するために、パラジウム系触媒を使用する接触水素化が使用されてきた。
酸化ベースの手法は、当技術分野において周知である。これらには、ｐ−アルコキシベンジル基の酸化ならびに硫黄およびセレンリンカーの酸化が含まれる。ジスルフィドおよび他の硫黄またはセレン系リンカーを切断するための水性ヨウ素もまた、使用することができる。
セーフティキャッチリンカーは、２つのステップで切断するものである。好ましい系では、第１のステップは、反応性求核中心の生成であり、続いて第２のステップは、切断をもたらす分子内環化を伴う。例えば、レブリン酸エステル結合は、ヒドラジンまたは光化学で処理して、活性アミンを遊離させることができ、次いでこれを環化して分子内の他の場所でエステルを切断することができる（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５１６５−５１６８，１９９７）。
脱離反応もまた使用され得る。例えば、Ｆｍｏｃおよびシアノエチルなどの基の塩基触媒脱離、ならびにアリル系のパラジウム触媒還元脱離を使用することができる。
リンカーが熱切断可能なリンカーまたは感熱性リンカーである場合、切断剤は、熱切断可能な基を破壊または切断するために閾値を超える局所的な温度上昇であり得る。いくつかの実施形態では、粒子温熱療法を誘導するためにマイクロ波照射を使用して局所領域で温度を上昇させることができる。ＤｕｔｚおよびＨｅｒｇｔ（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：４５２００１（２０１４））に概説され、米国特許第７，７１８，４４５号、米国特許公開第２００３／００８２６３３号、国際特許公開第２００２／０２９０７６号、国際特許公開第２００２／０２９０７６号、および米国特許公開第２００２／０１９７６４５号（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの粒子温熱療法を使用することができる。いくつかの実施形態では、温度上昇は、エネルギーを光から吸収性標的、例えば染料、顔料、または水に伝達することによって光熱的に達成することができる。一態様では、光源はレーザーである。いくつかの実施形態では、高温は、二本鎖ＤＮＡの熱分離を引き起こし得る。
ｇ）ナノポア層
本開示において、タグ（例えば、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子）の検出および／またはカウントは、ナノポアまたはナノチャネルを通してまたは横切ってタグを転位させることによって実行され得る。いくつかの実施形態では、タグ（例えば、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子）の検出および／またはカウントは、少なくとも１つ以上のナノポアまたはナノチャネルを通してまたは横切ってタグを転位させることによって実行され得る。いくつかの実施形態では、少なくともつ以上のナノポアまたはナノチャネルが並んでまたは連続して提示される。いくつかの実施形態では、ナノポアまたはナノチャネルは、一度に１つ以下のタグの転位のために寸法決めされる。したがって、いくつかの実施形態におけるナノポアの寸法は、典型的には検査されるタグの寸法に依存するであろう。二本鎖領域を有するタグは、完全に一本鎖であるタグの転位に十分なものよりも大きいナノポア寸法を必要とし得る。さらに、ナノビーズタグなどのナノ粒子タグは、オリゴマータグよりも大きい細孔またはチャネルを必要とし得る。典型的には、直径約１ｎｍの細孔は、一本鎖ポリマーの通過を許容し得るが、直径２ｎｍ以上の細孔寸法は、二本鎖核酸分子の通過を許容するであろう。いくつかの実施形態では、ナノポアまたはナノチャネルは、一本鎖タグ（例えば、直径約１ｎｍ〜２ｎｍ未満）に対して選択的であるが、他の実施形態では、ナノポアまたはナノチャネルは、二本鎖ポリヌクレオチドの通過を可能にするのに十分な直径（例えば、２ｎｍ以上）である。選択された孔径は、目的の検体について最適なシグナル対ノイズ比を提供する。
いくつかの実施形態では、細孔は、直径約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜１０００ｎｍ、約０．１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１００ｎｍ〜７００ｎｍ、約０．１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約１００ｎｍ〜５００ｎｍであり得る。例えば、細孔は、直径約０．１ｎｍ、約０．２ｎｍ、約０．３ｎｍ、約０．４ｎｍ、約０．５ｎｍ、約０．６ｎｍ、約０．７ｎｍ、約０．８ｎｍ、約０．９ｎｍ、約１．０ｎｍ、約１．５ｎｍ、約２．０ｎｍ、約２．５ｎｍ、約３．０ｎｍ、約３．５ｎｍ、約４．０ｎｍ、約４．５ｎｍ、約５．０ｎｍ、約７．５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５００ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約９５０ｎｍ、または約１０００ｎｍであり得る。
一般に、ナノポアは、ナノチャネルよりも長さが短い。ナノチャネルは、ナノポアよりも実質的に長く、分子がそれを通って転位するのにかかる時間を（同じ直径のナノポアを通ってまたは横切って転位するのにかかる時間と比較して）増加させることが望ましい用途において有用であり得る。ナノポアの長さは、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍ未満の範囲であり得る。ナノチャネルの長さは、約５００ｎｍ〜約１００μｍ、またはそれ以上の範囲であり得る。ナノポアおよびナノチャネルの直径は類似していてもよい。
タグ／アプタマーを分析するために様々な種類のナノポアを使用することができる。これらには、とりわけ、膜に埋め込まれた生物学的細孔またはチャネルを用いる生物学的ナノポアが含まれる。別の種類のナノポア層は、チャネルまたは細孔が、全体的にまたは部分的に、ケイ素などの製造または彫刻された固体成分から作製される固体ナノポアである。いくつかの実施形態では、ナノポアは、制御された絶縁破壊を使用して産生された固体ナノポアである。いくつかの実施形態では、ナノポアは、制御された絶縁破壊以外の方法によって産生された固体ナノポアである。
ある特定の実施形態では、ナノポアの長さは、最大約２００ｎｍ、例えば、約０．１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１〜約５０ｎｍ、約０．１ｎｍ〜約０．５ｎｍ、約０．３ｎｍ〜約１ｎｍ、約１ｎｍ〜約２ｎｍ、約０．３ｎｍ〜約１０ｎｍ、または約１０〜約３０ｎｍであり得る。ナノポア層内のナノポアの数は、約１、２、３、４、５、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００、３００００、１０００００、３０００００、またはそれ以上であり得る。中心間の層内のナノポア間の距離は、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍであり得る。
ある特定の実施形態では、各々がつ以上のナノポアを含有する複数のナノポア層は、タグ（例えば、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子）を検出および／またはカウントするために、互いに連続して配置することができる。この場合、タグの検出および／またはカウントは、各ナノポア層を通してまたは横切ってタグを転位させることによって実行することができる。そのようなものとして、層／シート／膜内のナノポアを通ってまたは横切って転位するタグの数をカウントすることは、層／シート／膜内の１つ以上のナノポアを通ってまたは横切って転位する複数のタグのカウントを指す。ある特定の実施形態では、２つ以上のナノポア層（例えば、技術的に可能な限り１、２、３、４、５、６、または他の数のナノポア層）が存在する場合、任意選択で、それらは少なくとも１つのナノポアが連続して存在し、ここで１つの層内の少なくとも１つのナノポアは、別の層内の別のナノポア等とは別個であるか、またはその上に（例えば、上または上部に）積層されている。ナノポア層が連続している場合、少なくとも２つの電極を使用して、細孔を通してタグを駆動するための電界を生じさせるために少なくとも２つの電極を使用することができ、任意選択的で、ナノポア層間に位置付けられた追加の電極が、駆動電流をさらに提供し得る。
ｉ）生物学的細孔
タグ／アプタマーを検出し、任意選択でカウントするために、タグの転位を許すチャネル寸法を有する任意の生物学的細孔を使用することができる。２つの広いカテゴリーの生物学的チャネルが、本明細書に開示されている方法に好適である。無電圧ゲートチャネルは、チャネルを活性化または開放するために膜電位の変化を必要とせずに、細孔を通る分子の通過を可能にする。一方で、電圧依存性チャネルは、チャネル開口部を活性化するために特定範囲の膜電位を必要とする。生物学的ナノポアを用いたほとんどの研究は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに見出される長さ約１０ｎｍのキノコ型ホモオリゴマー七量体チャネルであるα溶血素を使用した。各サブユニットは、２本のβ鎖が１４鎖の逆平行βバレルを形成するのに寄与する。βバレル構造によって形成された細孔は、リジン残基の環を含み、約３．６ｎｍの直径を有する内部空洞に開口するおよそ２．６ｎｍの直径を有する入口を有する。脂質二重層を貫通する溶血素孔の幹は、前庭と幹との間に１．５ｎｍの狭窄部を有する約２．０ｎｍの平均内径を有する。幹の寸法は、一本鎖核酸の通過に十分であるが、二本鎖核酸の通過には十分ではない。したがって、α溶血素孔は、一本鎖ポリヌクレオチドおよび同様の寸法の他のポリマーに対して選択的なナノポアとして使用され得る。
他の実施形態では、生物学的ナノポアは、一本鎖核酸よりも大きいポリマーの通過のために十分な寸法である。例示的な細孔は、ミトコンドリアポリンタンパク質、ミトコンドリア外膜に局在する電圧依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）である。ポリンタンパク質は、精製された形態で入手可能であり、人工脂質二重層に再構成されると、二本鎖核酸の通過を許すことができる機能的チャネルを生成する（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢＪ．１２：４９５−５０２）。構造研究は、ポリンもまた、１３本または１６本の鎖を有するβバレル型構造を有することを示唆している（Ｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２００：９０８−９１５）。ポリンは、α溶血素、マルトポリン（ＬａｍＢ）、およびグラミシジンによって形成される細孔のコンダクタンスと比較してより大きいコンダクタンスを示す。ポリン支持体研究のより大きいコンダクタンス特性は、ポリンチャネルが二本鎖核酸の通過に十分な寸法であることを示している。ポリン分子の孔径は、４ｎｍと推定される。非コイル状二本鎖核酸の直径は、約２ｎｍと推定される。
二本鎖ポリヌクレオチドをスキャンするのに好適であり得る別の生物学的チャネルは、枯草菌に見られるチャネルである（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５２７５−２５２８２）。枯草菌から作製され、人工膜に組み込まれた原形質膜小胞は、膜を横切る二本鎖ＤＮＡの通過を可能にする。枯草菌膜調製物によって形成されたチャネルのコンダクタンスは、ミトコンドリアポリンのものと同様である。これらのチャネルの不完全な特徴付け（例えば、精製形態）があるが、本明細書の目的のために精製形態を有する必要はない。適切な洗剤に可溶化すること、または十分な表面積の人工脂質膜に組み込むことのいずれかによって、原形質膜調製物を希釈することは、検出装置中の単一チャネルを単離することができる。適切に時限洗浄することによって膜調製物（またはタンパク質調製物）と人工膜との接触の持続時間を制限することは、人工脂質二重層に単一チャネルを組み込むための別の方法を提供する。コンダクタンス特性を使用して、二重層に組み込まれたチャネルを特徴付けることができる。
ある特定の場合において、ナノポアは、ハイブリッドナノポアであってもよく、ここで生物学的細孔は、固体ナノポア、例えば非生物学的材料で製造されたナノポアに導入される。例えば、α−溶血素孔は、固体ナノポアに挿入されてもよい。ある特定の場合において、ナノポアは、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１０，ｖｏｌ．５，ｐｇ．８７４−８７７に記載されているハイブリッドナノポアであり得る。
ｉｉ）固体細孔
他の実施形態では、タグの分析は、非生物学的材料から製造されたナノポアまたはナノチャネルを通してまたは横切ってタグを転位させることによって実行される。ナノポアまたはナノチャネルは、とりわけ化学堆積、電気化学体積、電気めっき、電子ビーム彫刻、イオンビーム彫刻、ナノリソグラフィー、化学エッチング、レーザーアブレーション、集束イオンビーム、原子層堆積、および当技術分野において周知の他の方法を含む、多くの異なる技法を使用して、様々な固体材料から作製され得る（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１２：１６６−１６９、およびＷＯ２００４／０８５６０９を参照）。
特定の実施形態では、ナノポアは、ＷＯ１３１６７９５２Ａ１またはＷＯ１３１６７９５５Ａ１に記載されているナノポアであり得る。ＷＯ１３１６７９５２Ａ１またはＷＯ１３１６７９５５Ａ１に記載されているように、正確かつ均一な孔径を有するナノポアは、膜中に形成されたナノポアを精密に拡大することによって形成することができる。この方法は、ナノポアにわたって高電位を印加することによってナノポアを拡大することと、ナノポアを流れる電流を測定することと、測定された電流に部分的に基づいてナノポアのサイズを決定することと、ナノポアのサイズが所望のサイズに対応するとき、ナノポアに印加された電位を除去することと、を含み得る。ある特定の場合において、印加電位は、高い値と低い値との間で振動するパルス波形を有することができ、電位が低い値でナノポアに印加されている間に、ナノポアを流れる電流を測定することができる。
固体材料としては、限定ではなく例として、任意の公知の半導体材料、絶縁材料、および絶縁材料でコーティングされた金属が挙げられる。したがって、ナノポア（複数可）の少なくとも一部は、限定されないが、ケイ素、シリカ、シリセン、酸化ケイ素、グラフェン、窒化ケイ素、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、または絶縁材料でコーティングされた金属、金属酸化物、および金属コロイドを含み得る。
ナノメートル寸法の細孔を作製するために、製造プロセスにおいて様々なフィードバック手順を用いることができる。イオンが穴を通過する実施形態では、固体材料を通るイオンの流れを検出することは、製造中に生成された孔径を測定する方法を提供する（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１２６９０５号を参照）。他の実施形態では、電極が孔径を定義する場合、電極間の電子トンネル電流は、電極間のギャップに関する情報を与える。トンネル電流の増加は、電極間のギャップ間隔の減少を示す。他のフィードバック技法は、当業者に明らかとなるであろう。
いくつかの実施形態では、ナノポアは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２：６１１−６１５に記載されているように、イオンビーム彫刻を使用して製造される。いくつかの実施形態では、ナノポアは、ＷＯ１３１６７９５２Ａ１またはＷＯ１３１６７９５５Ａ１に記載されるように、高電流を使用して製造される。他の実施形態では、ナノポアは、電子ビームリソグラフィと高エネルギー電子ビーム彫刻との組み合わせによって作製することができる（例えば、Ｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２：５３７−５４０を参照）。イオンビームスパッタリング技法によって好適なナノポアを生成するための同様の手法は、Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｐｈｙ Ｊ ８７：２９０５−２９１１に記載されている。ナノポアは、超薄膜を産生するための一般的な技法と組み合わせた金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）上に集束高エネルギー電子ビームを用いるリソグラフィを使用して形成される。他の実施形態では、ナノポアは、窒化ケイ素の彫刻によって、米国特許第６，６２７，０６７号、同第６，４６４，８４２号、同第６，７８３，６４３号、および米国公開第２００５／０００６２２４号に提供されるように構成される。
いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、金または銀ナノチューブとして構成され得る。これらのナノチャネルは、エッチング飛跡法を使用して調製されたポリカーボネートフィルタなどの多孔質材料のテンプレートを使用し、多孔質材料の表面に金または他の好適な金属を堆積させることによって形成される。エッチング飛跡ポリカーボネート膜は、典型的には、固体膜材料を高エネルギー核粒子に曝露することによって形成され、これが膜材料中に飛跡を形成する。次いで化学エッチングを用いて、エッチングされた飛跡を細孔に変換する。形成された細孔は、約１０ｎｍ以上の直径を有する。核粒子の強度を調整することは、膜に形成される細孔の密度を制御する。無電解めっき法を介して飛跡エッチングされた細孔に金属、典型的には金または銀を堆積させることによって、エッチングされた膜上にナノチューブを形成する（Ｍｅｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６７：１９２０−１９２８）。この金属堆積方法は、細孔材料の表面に堆積された触媒を使用し、これが次いでＡｕ（Ｉ）および還元剤を含有する溶液中に浸漬される。Ａｕ（Ｉ）から金属Ａｕへの還元は、触媒を含む表面上で起こる。堆積した金の量は、インキュベーション時間に依存し、それによりインキュベーション時間を増加させると、フィルタ材料中の細孔の内径が減少する。したがって、孔径は、細孔に堆積する金属の量を調整することによって制御することができる。得られる細孔寸法は、種々の技法、例えば、単純拡散を使用するガス輸送特性を使用して、またはパッチクランプ型システムを使用して細孔を通るイオン流を測定することによって測定される。支持体材料は、無傷のまま残されるか、または金ナノチューブを残すために除去される。無電解めっき技法は、直径が約１ｎｍ未満〜約５ｎｍ、または必要に応じてそれ以上の孔径を形成することができる。約０．６ｎｍの孔径を有する金ナノチューブは、Ｒｕ（ｂｐｙ）２＋２とメチルビオロゲンとを区別するように見え、金ナノポアの選択性を実証している（Ｊｉｒａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：６５５−６５８）。金ナノチューブ表面の修飾は、チオール含有化合物を金表面に付着させることによって、または金表面を他の官能基で誘導体化することによって容易に達成される。この特徴は、本明細書で論じられるように、細孔修飾化合物および感知標識の付着を許す。本明細書に記載の生物学的細孔に使用されるシス／トランス装置などのデバイスを金ナノポアと共に使用して、単一コード分子を分析することができる。
タグを検出するモードがタグを通る電流（例えば、電子トンネル電流）を含む場合、固体膜は、様々な技法によって金属化され得る。導電層は、鎖の長さに沿ってタグを調べるのに好適な電極、例えば、長手方向の電子トンネル電流を生成するために膜の両側に堆積されてもよい。他の実施形態では、導電層を膜の一方の表面に堆積させて、細孔を横切るタグ、例えば、横方向トンネル電流を調べるのに好適な電極を形成することができる。スパッタ堆積（すなわち、物理蒸着）、無電解堆積（例えば、コロイド懸濁液）、および電解堆積を含む、導電性材料を堆積するための様々な方法が知られている。他の金属堆積技法は、フィラメント蒸着、金属層蒸着、電子ビーム蒸着、フラッシュ蒸着、および誘導蒸着であり、当業者には明らかとなるであろう。
いくつかの実施形態では、検出電極は、スパッタ堆積によって形成され、ここでイオンビームは、金属ブロックに衝突して金属原子を蒸発させ、次いで薄膜の形態でウェハ材料上に堆積される。使用されるリソグラフィ方法に応じて、金属フィルムは、次いで反応性イオンエッチングによってエッチングされるか、または化学機械研磨を使用して研磨される。金属フィルムは、予め形成されたナノポア上に堆積され得るか、またはポアの製造前に堆積されてもよい。
いくつかの実施形態では、検出電極は、電着によって製造される（例えば、Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４：１２６５−１２６８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔ．７７（２４）：３９９５−３９９７、および米国出願公開第２００３／０１４１１８９号を参照）。この製造方法は、固体フィルムの一方の面上に位置付けられたナノポアおよび対応する検出電極を生成するため、例えば横方向電子トンネルを検出するために好適である。最初に、従来のリソグラフィプロセスを用いて、シリコンウェハ上に支持されている二酸化ケイ素層上に一対の対向電極を形成する。電解液が電極を覆い、電極対に電流を通すことによって、金属イオンが一方の電極に堆積する。経時的な電極上の金属を堆積は、電極間のギャップ距離を減少させ、検出電極だけでなくコード化分子の転位のためのナノメートル寸法のギャップも作り出す。電極間のギャップ距離は、多くのフィードバックプロセスによって制御することができる。
検出が電荷誘導電界効果の撮像に基づく場合、米国特許第６，４１３，７９２号および米国出願公開第２００３／０２１１５０２号に記載されているように、半導体を製造することができる。これらのナノポアデバイスを製造する方法は、他の固体ナノポアを製造するために用いられるものと同様の技法を使用することができる。
ポリヌクレオチドなどのタグの検出は、以下でさらに記載されるように実行される。タグの分析のために、ナノポアは様々なフォーマットで構成されてもよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、シスおよびトランスチャンバとも称される、２つのリザーバの間に保持されたナノポアを含む、生物学的または固体のいずれかの膜を含む（例えば、米国特許第６，６２７，０６７号を参照）。２つのチャンバ間の電子移動のための導管は、２つのチャンバの電気的接触を可能にし、２つのチャンバ間の電圧バイアスは、ナノポアを通るタグの転位を駆動する。この構成の変形は、米国特許第６，０１５，７１４号および第６，４２８，９５９号、ならびにＫａｓｉａｎｏｗｉｓｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：１３７７０−１３７７３（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれ）に記載されているように、ナノポアを通る電流の分析に使用される。
上記デバイスの変形は、米国出願公開第２００３／０１４１１８９号に開示されている。電着によって製造された一対のナノ電極が、基板表面上に位置付けられる。電極は互いに向き合っており、単一核酸の通過に十分なギャップ距離を有する。絶縁材料がナノ電極を保護し、核酸の検出のためにナノ電極の先端のみを露出させる。絶縁材料およびナノ電極は、試料リザーバとして働くチャンバと、ポリマーが転位によって送達されるチャンバとを分離する。カソード電極およびアノード電極は、タグを試料チャンバから送達チャンバへ駆動するための電気泳動電界を提供する。
ナノポアを通してタグを駆動するために使用される電流バイアスは、ナノポアを通して向けられた電界を印加することによって発生させることができる。いくつかの実施形態では、電界は、定電圧または定電流バイアスである。他の実施形態では、タグの移動は、電気泳動電界パラメータのパルス操作を通して制御される（例えば、米国特許出願第２００３／１４１１８９号および米国特許第６，６２７，０６７号を参照）。電流パルスは、規定の期間にわたってオリゴヌクレオチドタグの１つまたは少数の塩基を細孔を通して正確に転位させ、タグをその細孔内に短時間保持する方法を提供することができ、それによりタグの電気的特性のより優れた分解能を提供する。
ナノポアデバイスは、オリゴヌクレオチドタグがナノポアを通過するときに、オリゴヌクレオチドタグの配向を制限するための電界または電磁場をさらに含んでもよい。この保持場を使用して、細孔内のオリゴヌクレオチドタグの移動を減少させることができる。いくつかの実施形態では、転位の方向に直交する電界が、ナノポア内のタグ分子の移動を制限するために提供される。これは、米国特許出願公開第２００３／０１４１１８９号に、試料プレートの上下に２つの平行な導電プレートを使用することによって示されている。これらの電極は、タグ分子の転位方向と直交する電界を生成し、したがってタグ分子を試料プレートのうちの１つに保持する。ＤＮＡの負電荷骨格、または一方の鎖に負電荷を有するように修飾された核酸は、アノードプレートの上に配向され、それによってタグ分子の動きを制限する。
さらに他の実施形態では、タグの位置を制御することは、米国特許出願公開第２００４／０１４９５８０号に記載されている方法によって実行され、これはナノポアの近くまたはナノポア上の一連の電極位置を介してポア内に生じる電磁場を用いる。これらの実施形態では、一組の電極は、直流電圧と高周波電位を印加し、一方で第２の電極の組が反対の直流電圧と、第１の電極の組によって発生した高周波電位に関して１８０度位相がずれた高周波電位とを印加する。この高周波四重極は、電界の中心（すなわち、細孔の中心）に電荷粒子（例えば、核酸）を保持する。
例示的な実施形態では、ナノポア膜は、導電層および誘電体層の多層スタックであってもよく、埋め込まれた導電層または導電層ゲートは、タグが転位するナノポア内およびその周囲に、よく制御され測定可能な電界を提供する。態様では、導電層は、グラフェンであってもよい。積層されたナノポア膜の例は、例えば、ＵＳ２００８／０１８７９１５およびＵＳ２０１４／０１７４９２７に見られる。
ナノポアは、膜、層、または他の基板に位置してもよく、これらの用語は、ナノポアを含む二次元基板を説明するために互換的に使用されてきた。
ある特定の実施形態では、ナノポアは、そのナノポアを使用して検体の濃度を検出および／または決定するためのアッセイプロセスの一部として形成され得る。具体的には、ナノポアを使用して検体の濃度を検出および／または決定するためのデバイスは、膜または層にナノポアを形成することなく最初に提供されてもよい。デバイスは、膜の反対側で２つのチャンバ（シスチャンバおよびトランスチャンバ）を分離する膜を含み得る。シスチャンバおよびトランスチャンバは、塩溶液を含み得、電源に接続され得る。ナノポアが膜内に形成される場合、電圧がシスおよびトランスチャンバ内の塩溶液に印加され、膜を通るコンダクタンスが測定される。ナノポアの形成前に、膜を横切って測定される電流は全くないかまたは最小である。ナノポアの形成後、膜を横切って測定された電流は増加する。電圧は、所望の直径のナノポアを形成するのに十分な時間量にわたって印加することができる。ナノポアの形成に続いて、検体またはタグをナノポアを通して転位させ、転位事象を検出することができる。ある特定の実施形態では、同じ塩溶液を、ナノポアの形成、ならびにナノポアを通る検体またはタグの転位の検出に使用することができる。ナノポアの形成および／またはナノポアを通る検体もしくはタグの転位のために、任意の好適な塩溶液を利用することができる。カウント標識を損傷しない任意の塩溶液を使用することができる。例示的な塩溶液としては、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。塩溶液の濃度は、塩溶液の所望の導電率に基づいて選択することができる。ある特定の実施形態では、塩溶液は、１ｍＭ〜１０Ｍ、例えば１０ｍＭ〜１０Ｍ、３０ｍＭ〜１０Ｍ、１００ｍＭ〜１０Ｍ、１Ｍ〜１０Ｍ、１０ｍＭ〜５Ｍ、１０ｍＭ〜５Ｍ、１０ｍＭ〜３Ｍ、１０ｍＭ〜１Ｍ、３０ｍＭ〜５Ｍ、３０ｍＭ〜３Ｍ、３０ｍＭ〜１Ｍ、１００ｍＭ〜５Ｍ、１００ｍＭ〜３Ｍ、１００ｍＭ〜１Ｍ、５００ｍＭ〜５Ｍ、５００ｍＭ〜３Ｍ、または５００ｍＭ〜１Ｍの範囲、例えば、１０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ、または１０Ｍの濃度を有し得る。
いくつかの実施形態では、ナノポアは遮断されてもよく、遮断されたナノポアは、ナノポア層または膜を横切って電極によって印加される電圧のパターンを変調することによって除去される。いくつかの場合において、遮断されたナノポアは、ナノポア層または膜を横切る電圧の極性を反転させることによって除去される。場合によっては、遮断されたナノポアは、ナノポア層または膜を横切って印加される電圧の大きさを増加させることによって除去される。電圧の増加は、１０秒以下、例えば８秒以下、６秒以下、５秒以下、４秒以下、３秒以下、２秒以下、１秒以下、０．５秒以下、０．４秒以下、０．３秒以下、０．２秒以下、０．１秒以下を含めて継続する一時的な増加であり得る。
ｈ）シグナル検出
ナノポアを通るまたは横切る転位によってタグ／アプタマーを調べること、および検出可能な特性を検出することは、タグ／アプタマーをカウントする（すなわち、量もしくは濃度を決定する）および／または識別する（すなわち、存在を決定する）ために使用できるシグナルを発生させる。用いられる検出方法の種類は、タグについて検出されている特性に対応し得る。
いくつかの実施形態では、検出可能な特性は、タグが細孔を通って転位するときのナノポアの電気的特性に対するタグの効果である。ナノポアの電気的性質は、とりわけ、電流振幅、インピーダンス、持続時間、および周波数を含む。ある特定の場合において、タグは、ナノポア力分光法を使用することによって識別され得る（例えば、Ｔｒｏｐｉｎｉ Ｃ．ａｎｄ Ｍａｒｚｉａｌｉ Ａ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，Ｖｏｌ．９２，１６３２−１６３７を参照）。細孔の電気的特性を検出するためのデバイスは、薄膜または膜などの層に組み込まれたナノポアを含むことができ、このフィルムまたは膜は、導電性ブリッジによって接続されたシスチャンバとトランスチャンバとを分離する。分析されるタグは、ナノポアのシス側に、典型的には塩化カリウムなどの１つ以上の溶解塩を含む水溶液中に存在してもよい。ナノポアのシス側およびトランス側に位置付けられた電極を使用してポアを横切って電界を印加することは、ナノポアを通るタグの転位を引き起こし、これがポアを通るイオンの移動に影響を与え、それによってポアの電気的特性を変える。電流は、電流シグナルパターンを検出するのに十分なデータ点を得るために好適な時間周波数で測定され得る。次いで、生成されたシグナルパターンは、試料中の検体に公知の検体濃度で結合した公知のタグの単一の集団の検査から各参照パターンが得られる、参照パターンの組と比較することができる。前述のように、ナノポア（複数可）を通って転位する同種のタグの数は、単位時間当たり、例えば、１５分、１３分、１０分、８分、６分、４分、２分、１分、３０秒、２０秒当たり、１５秒当たり、１０秒当たり、５秒当たり、１秒当たり、１００ミリ秒当たり、１０ミリ秒当たり、または１ミリ秒当たりにナノポア（複数可）を通ってまたは横切って転位する同種のタグの数をカウントすることができる。いくつかの場合において、ナノポア（複数可）を通って転位する同種のタグの数を一定期間にわたってカウントして、閾値カウントに達するまでの時間量を決定することができる。電流振幅、電流持続時間、電流周波数、および電流の大きさのシフトは、タグのシグナルパターンを定義し、異なるタグを互いに区別するために使用され得る。パッチクランプ技法などによるナノポアの電流特性の測定は、上述の刊行物および様々な参照文献、例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ，２００１，Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓに記載されている。ある期間にわたって測定されたカウント数（カウント／時間）は、ナノポアを通ってまたは横切って転位する分子（例えば、タグ）の濃度に比例する。タグの濃度は、標準曲線を作成することによって決定することができる。例えば、一連の異なる濃度の標準分子を、ナノポアを通して転位させ、カウント／時間を測定して各濃度のカウント速度を計算することができる。測定されているタグのカウント速度を標準曲線と比較して、タグの濃度を計算する。
いくつかの実施形態では、タグの検出可能な特性は、電子の量子トンネルであり得る。量子トンネルは、粒子の量子波特性を介した古典的に禁制されたエネルギー状態を通る遷移の量子力学的効果である。電子トンネルは、ドナーとアクセプターとの間の電子の移動に対して電位障壁が存在するところで起こる。電子トンネルを検出するために、微細加工電極チップを標本から約２ナノメートルに位置付けることができる。適切な分離距離では、電子はチップと試料との間の領域をトンネルし、チップと試料との間に電圧が印加される場合、電子の正味の電流（すなわち、トンネル電流）は、ギャップを通って電圧バイアスの方向に流れる。ナノデバイスがトンネル電流を測定するために検出電極を使用する場合、電極は、検出電極とタグとの間に電子トンネルがあるように、転位タグに近接して位置付けられる。以下でさらに論じられるように、転位タグに対する電極の配置は、タグを通して生じる電子輸送の種類を決定し得る。
いくつかの実施形態では、タグの分析は、核酸鎖を通って（すなわち、核酸鎖に沿って長手方向に）生じる電流の流れを検出することを含み得る（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１（１２）：５３１５−９）。電子伝達の正確な機構は知られていないが、電子トンネルは、ＤＮＡの輸送特性に対する１つの説明として与えられている。しかしながら、二本鎖核酸を通る電子輸送の基礎をなす物理学は、本明細書の目的のために制限するものではなく、核酸を流れる電流の検出は、１つのポリマータグを別のポリマータグから区別するのに役立つ。タグ分子鎖を通って長手方向に生じる電子流を検出するために、検出電極は、タグ分子転位の方向に対して長手方向に位置付けられてもよく、それにより、拡張タグ分子の鎖に対して平行な電極間にギャップが存在する。様々な実施形態では、検出電極は、ナノポアの２つの側面を分離する層（複数可）（例えば、膜）の反対側に配置され得るが、他の実施形態では、検出電極は、ナノポアの２つの側面を分離する層（複数可）内に位置付けられ得る。
核酸中の電子の流れの別の形態は、核酸を横切って、例えば伸長した核酸鎖を横断する方向に（例えば、二本鎖核酸の直径を横切って）起こるものである。二本鎖核酸では、電子輸送は、対塩基を通して起こり得るが、一本鎖核酸では、電子輸送は、単一の非対塩基を通して起こり得る。さらに、化学組成、水和構造、電荷イオンとの相互作用、各塩基の空間的配向、および異なる塩基対の組み合わせにおける違いは、横方向電子輸送特性を変化させ、したがって配列および／またはポリマー骨格が異なるタグ分子を区別するための基礎を提供し得る。タグ分子を横切る（すなわち、伸長した核酸鎖を横断する）電子の流れを検出するために、検出電極は、ナノポアを通るのではなく横切るタグ分子を調べるためにナノポアの片側に位置付けられる。
長手方向または横方向の検出の実施形態では、電極の厚さは、電極によって調べられる塩基の総数を決定し得る。横方向検出のために、検出電極の先端は、（本明細書中で定義されるように）単一核酸塩基を調べるために寸法決めされ得、それにより単一塩基分解能を得る。他の実施形態では、検出電極の寸法は、複数の核酸塩基を調べるために配置されている。したがって、いくつかの実施形態では、一度に調べられる核酸塩基の数は、タグ分子の様々なポリマー配列の違いを検出するのに必要な分解能に応じて、約２以上、約５以上、約１０以上、または約２０以上であり得る。
他の実施形態では、タグの構造の違いは、静電容量の違いとして検出され得る。この種の測定は、ＵＳ２００３／０１４１１８９に示されている。静電容量は、定義された印加周波数およびインピーダンスで印加ＡＣ電圧に位相シフトを引き起こす。各核酸塩基についての位相シフト特性は、公知の配列および構造の核酸について決定され、個々の塩基特性を特定するための参照標準として使用される。最近傍分析は、静電容量測定値が複数の核酸塩基に及ぶことを許し得る。
他の実施形態では、検出技法は、米国特許第６，４１３，７９２号および米国公開出願第２００３／０２１１５０２号に記載されているように（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）、電荷誘導性電界を撮像することに基づいてもよい。電荷誘導性電界に基づいてタグを検出するために、上述の半導体デバイスが使用される。ソース領域とドレイン領域との間に電圧を印加すると、半導体中に電流が流れるためのチャネルが形成される場合には、ソースからドレインへの電流の流れが生じる。各核酸塩基は、関連する電荷を有するため、タグ分子が半導体細孔を通過すると、細孔を裏打ちする半導体材料の導電率が変化し、それによって特定の大きさおよび波形の電流が誘導される。電荷、電荷の分布、および塩基のサイズの違いに起因して、大きさや波形の異なる電流は、異なる塩基によって産生される。米国特許第６，４１３，７９２号に開示されている実施形態では、ポリマーは、ｐ型シリコン層で形成された細孔を通過する。タグ分子の転位は、上記のように、ポリマーを他の種類のチャネルを通して移動させるために使用されるものと同様の方法によって達成される。電流の大きさは、マイクロアンペアの範囲であると予想され、それは電子トンネルによって検出される予想されるピコアンペアの電流よりはるかに高い。タグ分子中のポリマーブロック領域は、単一の核酸塩基より多くを含むため、これらのブロックポリマー領域は、ブロックポリマー領域の電荷および電荷分布を反映した明確なシグナルを発生させるはずである。
上記の説明は、個々の検出技法に関するものであるが、いくつかの実施形態では、単一のタグ分子を調べるために複数の異なる技法を使用することができる（例えば、Ｋａｓｓｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｍｉｃｒｏｓｃ ２１７：１０９−１６を参照）。複数の検出モードの例としては、とりわけ、電子トンネル電流と組み合わせた電流遮断、および撮像電荷誘導電界と組み合わせた電流遮断が挙げられる。異なる検出モードによる同時検出を使用して、異なる検出モード間で結果として生じるシグナルの検出時間を相関させることによって、タグ分子を識別することができる。
いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグの数を測定すること、または層を通って転位するタグを検出することは、ナノポアに対するタグの電流遮断効果を観察することを含む。いくつかの実施形態では、電流遮断効果が閾値レベルを超えるとき、検体は試料中に存在する。
３．検体分析のためのデバイス
本開示は、ナノポアデバイスおよび集積マイクロ流体ナノポアデバイスと共に使用されるマイクロ流体デバイスを説明している。ナノポアデバイスおよび集積マイクロ流体ナノポアデバイスと共に使用される開示されたマイクロ流体デバイスは、上記のように、検体分析の方法において使用され得る。しかしながら、ある特定の場合において、本明細書に記載のデバイスは、他の用途に使用されてもよい。同様に、ある特定の場合において、本明細書に記載の方法を他のデバイスと共に使用することができる。
ナノポアデバイスと共に使用されるマイクロ流体デバイスは、図１Ａおよび図１Ｂに示されている。マイクロ流体デバイス１０は、ナノポアデバイス１５内で分析されることになる液滴１１を用いて示されている。液滴は、ナノポアデバイスを使用してカウントされることになるタグ（例えば、切断タグまたはアプタマー）を含み得る。ナノポアデバイス１５は、第１のチャンバ１６、ナノポア１８を有する層１７、および第２のチャンバ１９を含む。図１Ａおよび図１Ｂは、液滴１１がマイクロ流体デバイス１０から除去され、ナノポアデバイス１５内に配置される液体転送ステップ１を示す。図１Ａに示すように、液滴が層１７を横切って分割され、ナノポア１８に位置付けられるように、液滴１１が層１７上に堆積される。液滴は、入口（図示せず）を介してナノポアデバイス１５に導入することができる。入口ポートは、層１７の一部の上に位置付けられてもよい。例えば、入口ポートは、ナノポアを含む層が位置付けられているチャンバの壁の開口部に位置することができる。図１（Ｂ）では、液滴１１が第１のチャンバ１６内に堆積している。緩衝液添加ステップ２は、第２のチャンバ１９に緩衝液を導入する。他の実施形態では、液滴１１を第１のチャンバ１６に導入する前に、緩衝液を第２のチャンバ１９に添加することができる。さらに他の実施形態では、液滴１１は、緩衝液が第１のチャンバ１６に添加される前または後に、第２のチャンバ１９内に堆積されてもよい。図１Ａでは、いずれかのチャンバに緩衝液を添加するステップは不要である。
別の実施形態では、デバイスは、集積デバイスであり得る。集積デバイスは、別々に構築され、次いで組み合わされて集積デバイスを形成することができるマイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを含み得るか、またはマイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールは、単一デバイスに一緒に組み込まれ得る。
図２Ａおよび２Ｂは、ナノポアモジュールと組み合わされたマイクロ流体モジュールを有し、２つのモジュールがチャネルを使用してそれらを接続することによって集積されている、集積デバイスの概略図を示す。図２Ａおよび図２Ｂは、集積デバイスを生成するために組み合わされる個々のモジュールを含むデバイスを示しているが、図２Ａおよび図２Ｂのデバイスはまた、２つのモジュールが接続される単一デバイスとして製造することもできることが理解される。
図２Ａおよび図２Ｂの上部パネルにおいて、マイクロ流体モジュール２０は、ナノポアデバイス３０内で分析されることになる液滴２５と共に示されている。ナノポアモジュール３０は、第１のチャンバ３１、ナノポア３３を有する層３２、および第２のチャンバ３４を含む。マイクロ流体モジュール２０は、チャネル４０を介してナノポアモジュール３０と集積されている。チャネルは、２つのモジュールを流体的に接続し、マイクロ流体モジュール２０からナノポアモジュール３０への液滴２５の移動を容易にする。中央のパネルは、マイクロ流体モジュール２０からチャネル４０を介したナノポアモジュール３０への液滴２５の移動を示す。図２Ａに示すように、チャネルは、マイクロ流体モジュール２０をナノポアモジュール３０の入口ポートに接続することができる。入口ポート（図示せず）は、液滴２５が層３２を横切って分割され、ナノポア３３に位置付けられるように、液滴２５が層３２上に堆積されるように位置付けることができる。転送プロセスの最後に、液滴は、ナノポア３３を横切って位置付けられる（図２Ａ、下パネル）。他の実施形態では、チャネル４０は、マイクロ流体モジュール２０をナノポアモジュール３０の第１または第２のチャンバ内の入口ポートに接続することができる。そのような実施形態が図２Ｂに示されており、ここでチャネル４０は、マイクロ流体モジュール２０をナノポアモジュール３０の第１のチャンバ３１内の入口ポートに接続する。液滴２５を第１のチャンバ３１に転送した後、または転送前に、緩衝液を第２のチャンバに添加することができる。図２Ｂのステップ２では、液滴２５を第１のチャンバ３１に転送した後に、緩衝液を第２のチャンバ３４に添加する。任意選択で、転送が完了した後、チャネル４０を取り外して２つのモジュールを分離することができる。図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂにそれぞれ示すマイクロ流体およびナノポアデバイスおよびモジュールは、各々個々に機能的である。
図２Ｃ〜２Ｈは、デジタルマイクロ流体モジュール５０およびナノポアモジュール６０を含む、集積デバイスの実施形態を示す。デジタルマイクロ流体モジュールは、ナノポアモジュールに輸送される液滴の生成に使用される複数の試薬リザーバ５１に動作可能に接続された電極４９のアレイと共に示されている。リザーバ５１のうちの１つ以上は、試薬または試料を含み得る。異なる試薬は、異なるリザーバに存在してもよい。マイクロ流体モジュール５０には、電極４９のアレイを電源（図示せず）に接続する接触パッド５３も示されている。電極４９のアレイを接触パッドに接続するトレース線は描かれていない。電極４９のアレイは、１つ以上の液滴（緩衝液滴、または緩衝液および／もしくはタグ（例えば、切断されたタグもしくは解離したアプタマー）を含む液滴）を、デジタルマイクロ流体モジュール５０とナノポアモジュール６０との間の界面１００に位置する転送電極７１および７２の一方または両方に輸送する。デジタルマイクロ流体モジュール５０およびナノポアモジュール６０は、インターフェース１００において動作可能に接続されている。ナノポアモジュール６０は、ナノポア層７０が配設されている位置で互いに交差する、少なくとも２つのマイクロ流体毛細管チャネル６１および６２を含む。２つのマイクロ流体毛細管チャネル６１および６２は、ナノポアモジュール内の２つの異なる基板に位置している（図２Ｄに示される）。したがって、ナノポアモジュールは、第１の基板６３の上面にマイクロ流体毛細管チャネル６１を含む第１の基板６３（例えば、底部基板）を含み、第２の基板の第１の表面にマイクロ流体毛細管チャネル６２を有する、第２の基板６４（例えば、上部基板）をさらに含む。第２の基板６４は、マイクロ流体毛細管チャネル６１を覆い、第１の基板６３は、マイクロ流体毛細管チャネル６２の下にある。毛細管チャネル６２は、ナノポア層７０の位置で２つのチャネルの交差部で毛細管チャネル６１を覆っている（図２Ｄ、下パネルも参照）。２つの毛細管チャネルは、交差部に置かれたナノポア層７０によって交差部で物理的に分離されている。ナノポア層７０は、毛細管チャネルの交差部に位置付けられ、ナノポアを通して１つの毛細管チャネルから他のものへの分子の輸送を可能にする、少なくとも１つのナノポア（図示せず）を含む。毛細管チャネル６１および６２は、毛細管チャネルの第１の端部で界面１００で開口し、毛細管チャネルの第２の端部でリザーバ／通気口（図２Ｃに見られるように８４および８５）に開口している。また、図２Ｃに示されているのは、電極４９のアレイ上に位置付けられているカバー基板１０１である。カバー基板１０１は、マイクロ流体モジュール内に液滴が操作されるギャップを画定する。カバー基板１０１は、任意選択で、マイクロ流体モジュール５０内の液滴を操作するための二平面電極構成を提供する、カバー基板１０１の底面に配設された電極５５（例えば、参照電極）を含み得る。二平面電極構成がない場合、液滴は、例えば電極４９のアレイまたは別の共面電極構成を使用して、共面電極作動を使用することによってマイクロ流体モジュール５０内で操作することができる。例えば、ＵＳ６９１１１３２に記載されている共面電極は、マイクロ流体モジュール５０内の液滴を操作するために使用することができる。
図２Ｄの上パネルは、デジタルマイクロ流体モジュール５０とナノポアモジュール６０が動作可能に接続されている、インターフェース１００の断面の正面図の概略図を示す。転送電極７２におけるデバイスの断面の側面図の概略図が、図２Ｄの下パネルに描かれている。図２Ｄの上パネルは、マイクロ流体モジュール５０とナノポアモジュール６０との間の界面１００に位置する２つの転送電極７１および７２上に位置付けられた２つの液滴（６５ａおよび６５ｂ）を示す。図２Ｄの上パネルに示すように、電極７１に位置付けられた液滴６５ａは、毛細管チャネル６１の開口部と整列し、電極７２に位置付けられた液滴６５ｂは、毛細管チャネル６２の開口部と整列する。図２Ｄの下パネルは、転送電極７２上の液滴６５ｂの配置を示す集積デバイスの断面の側面図を示す。液滴６５ｂは、毛細管チャネル６２内に移動するように位置付けられている。毛細管チャネル６１も示されている。しかしながら、毛細管チャネルは、転送電極７２から一定の距離にあり、転送電極７１（図示せず）と整列している。カバー基板１０１の底面に電極５５が配設されたカバー基板１０１も描かれている。図２Ｄ〜２Ｈに示す集積デバイスの実施形態では、ナノポアモジュールは、マイクロ流体モジュールの電極アレイと同じ基板上に配設されている。
転送電極の上面と毛細管チャネルへの入口との間の垂直距離は、マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールの下部を形成する基板の厚さによって決定され得る。垂直距離は、ナノポアモジュールに移される液滴の体積に基づいて設定されてもよい。垂直距離は、基板の厚さを変えることによって調整することができる。例えば、ナノポアモジュールの基板（例えば、基板６３）を比較的薄く保つことができ、または（例えば、より厚い基板を使用することによって）転送電極が配設される基板の厚さを増加させて、液滴が毛細管チャネルの入口と整列することを保証する。より厚い底部基板を有するマイクロ流体モジュールを使用することによって、液滴を毛細管チャネルへの入口と整列させる例示的なデバイスを図２Ｅに示す。図２Ｅに示すデバイスは、図２Ｃ〜図２Ｄについて説明したのと同じ構成を有する。しかしながら、電極アレイが位置付けられている基板５９ａの厚さは、ナノポアモジュールが配設されている基板の部分の厚さに対して増加する。図２Ｅの上パネルは、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面１００における断面の正面図を示す。図２Ｅの下パネルは、転送電極７２および毛細管チャネル６２の位置における断面の側面図を示す。図２Ｅに示すように、電極アレイ４９と転送電極７１、７２が配設された基板５９ａは、ナノポアモジュールが配設された基板５９ｂよりも厚い。図２Ｅの下パネルに示すように、基板５９ａは、第１の高さＨ１を有し、基板５９ｂは、第２の高さＨ２を有し、ここでＨ１はＨ２より大きい。基板５９ａと５９ｂとの間の高さの差により、ナノポアモジュール内の毛細管チャネル６１および６２が、それぞれ電極７１および７２上に位置付けられた液滴と整列する。図２Ｅの下パネルにはまた、チャネル６１が描かれている。図２Ｃから明らかなように、毛細管チャネル６２は、ナノポア層７０の位置で毛細管チャネル６１に対して垂直である。チャネル６１は、転送電極７１と整列しており、転送電極７１上に位置付けられた液滴６５ａを受け取るように構成されている。２つの毛細管チャネルは交差部で互いに垂直であるように描かれているが、２つのチャネルが９０度以外の角度で交差する他の構成もまた想定される。
毛細管チャネルと接触すると、液滴は、毛細管作用などの任意の好適な手段を介して毛細管チャネル内に移動する。毛細管チャネルへの液滴の移動は、追加の方法／材料によって促進され得る。例えば、液滴は、拡散、ブラウン運動、対流、ポンピング、印加圧力、重力駆動流、密度勾配、温度勾配、化学勾配、圧力勾配（正または負）、空気圧、気体生成化学反応、遠心流、毛細管圧、ウィッキング、電界媒介、電極媒介、電気泳動、誘電泳動、磁気泳動、磁場、磁気駆動流れ、光学力、走化性、走光性、表面張力勾配駆動流れ、マランゴニ応力、熱−毛細管対流、表面エネルギー勾配、音響泳動、表面弾性波、電気浸透流、熱泳動、エレクトロウェッティング、オプトエレクトロウェッティング、またはそれらの組み合わせを介して毛細管チャネル内に移動し得る。追加としてまたは代替として、毛細管チャネル内への液滴の移動は、例えば、本明細書に開示されるものなどの作動力を使用すること、毛細管に親水性コーティングを使用すること、毛細管チャネルのサイズ（例えば、幅および／または高さおよび／または直径および／または長さ）を変えることによって容易にすることができる。
図２Ｃ〜図２Ｈに示す実施形態では、毛細管チャネル６１および６２を横切る流体の流れは、毛細管の断面を変化させることによって少なくとも部分的に制御され、流体は最初に、毛細管のより狭い部分に入るまで比較的速く動く。一方または両方の液滴は、ナノポアによる分析のために検出またはカウントされる検体（または切断されたタグもしくは解離したアプタマー）または導電性溶液（例えば、検体を含まない緩衝液）を含有する液滴であり得る。ある特定の場合において、一方の液滴６５ａは、検体／タグ／アプタマーを含有する液滴であり得、他方の液滴６５ｂは、緩衝液滴であり得る。単一の液滴が各チャネルについて描かれているが、実際には、複数の液滴がナノポアモジュールに輸送され得る。例えば、複数の液滴は、順次にナノポアモジュールに輸送されてもよい。いくつかの場合において、複数の液滴を一方または両方の転送電極に集めて、より大きな液滴を生成し、それをナノポアモジュールに輸送することができる。
図２Ｆは、集積デバイスに使用される様々な電極の例示的な構成を示す。上述のように、単一の連続電極５５（図２Ｆには示されていない）は、マイクロ流体モジュール６０内の電極４９のアレイから間隔を空けて位置付けられている。電極のアレイは、一連の個々に制御可能な電極を含む。電極５５は、カバー基板１０１の下面に配設されている。電極５５および電極のアレイは、液滴を転送電極上に移動させる。電極５５は、転送電極７１および７２を覆わないことが示されているが、ある特定の例示的なデバイスでは、カバー基板１０１および電極５５は、転送電極を覆って延在することができる。電極５５が転送電極を覆っていない実施形態では、共面電極を使用して、液滴を転送電極に移動させることができる（例えば、ＵＳ６９１１１３２に記載されているような共面作動）。本明細書に記載されるように、単一電極５５は、基準電極または接地電極として機能することができ、一方で電極４９のアレイは、個々に制御可能であり得る（例えば、電極のアレイは独立に作動できる作動電極であり得る）。電極対：８０ａと８０ｂの対および９０ａと９０ｂの対が、ナノポアモジュール内に位置付けられている。電極対８０ａ、８０ｂおよび９０ａ、９０ｂを使用して、ナノポア層７０内のナノポアを通して電荷分子を駆動するために、ナノポア層７０を横切って反対の極性を確立する。いくつかの実施形態では、電極対８０ａおよび８０ｂは正電極であり得、電極対９０ａおよび９０ｂは負電極であり得る。図２Ｇは、（４つではなく）２つの電極８０および９０が、ナノポア層７０を横切って極性差を確立するために使用される、ナノポアモジュールの代替電極構成を示す。これらの実施例は、ナノポアを通して電荷分子を転位させるために、ナノポア層を横切って電位勾配を生成する対称（４電極）または非対称（２電極）電極構成の使用を実証する。
図２Ｈは、１つのチャネル６１のみが界面１００でマイクロ流体モジュールに接続されている毛細管チャネルの代替構成を示す。他のチャネル６２は、ナノポアを横切る電荷分子の移動を容易にするために、導電性液体で満たされ得る２つのリザーバに接続される。
ある特定の場合において、本明細書で提供される集積デバイスは、第１の基板の上面の第１の領域上にデジタルマイクロ流体モジュール部分用のリザーバおよび電極のアレイを形成することによって製造され得る。第２の基板は、第２の基板の底面に単一電極（例えば、電極５５）を配設することによって調製され、個々に制御可能な電極のアレイ上に間隔を空けて位置付けられて、二平面液滴作動のために単一電極と電極のアレイとの間に対向配向を提供することができる。本明細書で使用される場合、「液滴作動」は、本明細書で開示されるようなマイクロ流体デバイスを使用するか、またはＵＳ６，９１１，１３２、ＵＳ６，７７３，５６６、もしくはＵＳ６，５６５，７２７（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される液滴アクチュエータを使用する液滴の操作を指す。したがって、本明細書に開示されるデバイスの二平面電極または電極のアレイの構成は、ＵＳ６，９１１，１３２、ＵＳ６，７７３，５６６、またはＵＳ６，５６５，７２７に開示されるものと同様であり得る。第２の基板上の電極５５はまた、参照電極とも称され得る。マイクロ流体モジュール内の電極は、任意選択で、誘電材料でコーティングされていてもよい。疎水性コーティングもまた、誘電体上に設けることができる。
ある特定の実施形態では、マイクロチャネルは、電極４９のアレイが配設されている第１の基板の第２の領域上に配設され得る、第３の基板上に形成され得る。例えば、第３の基板は、マイクロ流体電極アレイが第１の領域に配設されている第１の基板上の第２の領域の上に接着されてもよい。基板は、予め形成されたマイクロチャネルを有してもよく、またはマイクロチャネルは、接着ステップの後に形成されてもよい。第２のマイクロチャネルを有する第４の基板を、マイクロチャネルを含む基板の上に配設して、図２Ｃ〜図２Ｈに示される集積デバイスを提供することができる。ナノポア層は、２つのマイクロチャネルの交差位置でいずれかのマイクロチャネル上に配設されてもよい。したがって、ナノポアモジュールを形成する基板は、いずれかの端部および片側で開いているマイクロチャネルを含み得る。第３の基板上に第４の基板を配置することにより、マイクロチャネルが閉じられ、それによって毛細管チャネル（例えば、６１および６２）が形成される。
ある特定の実施形態では、マイクロチャネルは、電極のマイクロ流体アレイが配設されている第１の基板上に配設されてもよい別々の基板上に形成されてもよい。例えば、別の基板は、マイクロ流体電極アレイが第１の領域に配設されている第１の基板上の第２の領域の上に接着されてもよい。基板は、予め形成されたマイクロチャネルを有してもよく、またはマイクロチャネルは、接着ステップの後に形成されてもよい。第２のマイクロチャネルを有する別の基板を、マイクロチャネルを含む基板の上に配設して、図２Ｃ〜図２Ｈに示される集積デバイスを提供することができる。ナノポア層は、２つのマイクロチャネル６１および６２の交差位置でいずれかのマイクロチャネル上に配設され得る。
いくつかの実施形態では、マイクロチャネルは、電極のマイクロ流体アレイが配設されている第１の基板上の第１の領域に隣接する第２の領域に導入されてもよい。例えば、マイクロチャネルは、第２の領域の上面にエッチングされてもよい。ナノポア層は、マイクロチャネル上の位置に配置されてもよい。ナノポア層は、予め形成されたナノポア（複数可）を含み得る。代替実施形態では、ナノポア（複数可）は、マイクロチャネル上の位置に層を位置付けた後に形成することができる。第３の基板は、第３の基板の底面にマイクロチャネルを導入することによって調製され得る。第３の基板は、第１の基板の第２の領域の上面がその上面を横切って第３の基板の底面と接触し、それにより閉じた毛細管チャネル６１および６２を形成するように、第１の基板上の第２の領域の上に位置付けられてもよい。
図２Ｉ〜２Ｋは、デジタルマイクロ流体モジュール２５０およびナノポアモジュール２６０が、マイクロ流体モジュールの電極２４９のアレイ（一連の個々の制御可能な電極）が、第１の領域上に配設され、マイクロ流体チャネル２６１が第２の領域に形成される、共通の底部（第１の）基板２１０を共有するデバイスを示す。第１の基板内のマイクロ流体チャネル２６１は、転送電極２７１と整列している。単一の連続電極２５５（例えば、参照電極）を有する第２の基板２２０は、デジタルマイクロ流体モジュール２５０内の電極のアレイ２４９から間隔を空けて配設されている。第３の基板の下面に形成されたマイクロ流体チャネル２６２を含む第３の基板２３０は、第１の表面２１０の第２の領域上に置かれ、それによってマイクロ流体チャネル２６１が形成される第１の基板の上面を覆う。ナノポアモジュール内の第１の基板および第３の基板は、マイクロ流体チャネル２６１および２６２を包囲し、それによって毛細管チャネル２６１および２６２を提供する。「マイクロ流体チャネル（複数可）」および「マイクロチャネル（複数可）」は、本明細書では互換的に使用され、基板の表面の通路または切り欠き部を指すことが理解される。通路上に基板を配置すると、通路は包囲されて毛細管チャネルを形成する。図２Ｃと同様に、毛細管チャネルは、マイクロ流体モジュール２５０とナノポアモジュール２６０との間の界面１００で一端でマイクロ流体モジュールに流体的に接続されてもよく、他端にリザーバまたは通気口を有してもよい。他の実施形態では、第２の毛細管チャネル２６２は、図２Ｈの毛細管チャネル６２と同様に構成され得る。すなわち、第２の毛細管チャネル２６２は、いずれかの端部でマイクロ流体モジュールに接続されない場合があり、かつ両端でリザーバ／通気口に接続され得る。デバイスの上面図を図２Ｉに示し、モジュール間の界面におけるデバイスの断面の正面図を図２Ｉに示す（続き）。正面図から明らかなように、液滴２６５ａは、毛細管チャネル２６１への入口よりも高い平面上にある。液滴２６５ａを毛細管チャネル２６１内に流すことを可能にするために、ノッチ２８０が第３の基板２３０の側縁に形成され、液滴がマイクロチャネル２６１内に移動するための空間を提供する。したがって、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の流体接続は、界面１００における第１の毛細管チャネル２６１の一端で第１の毛細管チャネル２６１の上部に開口部を提供するノッチ２８０によって形成される垂直ポートによって提供される。ノッチ２８０は図２１は、一定の大きさに描かれておらず、界面１００において転送電極２７１と第１の毛細管チャネル２６１との間の流体通信を可能にする任意の好適なサイズであり得ることが理解される。さらに、ノッチは大きさが異なっていてもよい。例えば、ノッチは、界面１００で第３の基板２３０の側縁の長さに沿って延在する切り欠き部であり得、転送電極２７１の幅もしくは毛細管チャネル２６１の幅またはそれらの間の長さに一致するように比例し得る。切り欠き部は、毛細管チャネル２６１の比較的小さい領域が被覆されないように、名目上第３の基板２３０の幅に沿って延在することができる。他の実施形態では、切り欠き部は、毛細管チャネル２６１のかなりの長さにわたって延在してもよい。ナノポアを含む層２７０は、２つの毛細管チャネルが交差する位置で第１の毛細管チャネル２６１を横切って位置付けられる。層２７０は、支持基板２７５内に位置付けられている。ある特定の場合において、第１の基板２１０は、ガラス基板であり得、支持基板２７５は、ＰＤＭＳガスケットであり得る。
図２Ｉに示すデバイスの断面の側面図を図２Ｊに示す。断面は、第１の毛細管チャネル２６１が、第１の転送電極２７１と整列しているデバイスの領域にある。また、電極２４９のアレイを有するマイクロ流体モジュール２５０の一部、電極２４９のアレイから間隔を空けて位置付けられた単一電極２５５（例えば、参照電極）を有する第２の基板２２０も示されている。図２Ｊに示すように、単一電極２５５は、転送電極を被覆しない。これらの図には示されていないが、第２の基板２２０および単一電極２５５（これは参照電極であり得る）が、転送電極２７１および２７２を被覆して、二平面電極構成を提供することができる。この実施形態では、二平面電極を使用して、液滴を転送電極２７１および２７２に移動させることができる。第１の毛細管２６１は、第１の基板２１０内に位置し、液滴２６５ａが存在する平面よりも低い平面内に位置する。第２のマイクロチャネル（毛細管チャネル２６２を提供するために第１の基板２１０の上面によって包囲されている）を含む第３の基板２３０が、第１の基板上に配設されている。第３の基板２３０は、界面１００のマイクロ流体モジュールに隣接する側縁にノッチ２８０（または切り欠き部）を含む。ノッチ２８０は、毛細管チャネル２６１の端部の上部で毛細管２６１を開き、毛細管チャネル２６１に入るための垂直ポートを提供する。矢印の方向によって示されるように、液滴は、毛細管２６１まで下降し、次いで第１および第２の毛細管チャネルの交差部に向かって流れるように進む。第２の毛細管チャネル２６２は、ナノポア層２７０の位置で第１の毛細管２６１と交差する。第１の毛細管チャネル２６１の上（および第２の毛細管チャネル２６２の下）に位置付けられた支持基板２７５が描かれている。支持基板２７５は、ナノポア層２７０を含む。挿入図に示されているナノポア層の上面図に示されているように、支持基板２７５は、ナノポア層を取り囲んでいる。いくつかの実施形態では、支持基板は、中心に切り欠き部を有する第１の層および中心に切り欠き部を有する第２の層であり得る。ナノポア層は、第１層と第２層との間の切り欠き部に配設することができる。支持基板内のナノポア層は、底部基板２１０がガラスで作製されたデバイスに使用することができる。
図２Ｋは、図２Ｉに示されるデバイスの断面の追加の側面図を示す。図２Ｊでは、断面は、第１の転送電極２７１の位置にある。図２Ｋでは、断面は、第２の転送電極２７２の位置にある。図２Ｋに示すように、第２の毛細管チャネル２６２への入口は、第２の転送電極２７２上に存在する液滴２６５ｂの位置と整列している。図２Ｋにはまた、ナノポア層２７０の位置で第２の毛細管チャネル２６２と交差する第１の毛細管チャネル２６１が描かれている。
別の実施形態では、図２Ｌに示すように、第１の基板２１０は、電極２４９のアレイならびに転送電極２７１および２７２が配設されている第１の部分２１０ａと、毛細管チャネルを含む基板２９０が配設されている第２の部分２１０ｂと、を含み得る。図２Ｉ〜２Ｋに示されるデバイスと同様に、毛細管チャネル２６１ａは、転送電極が位置している平面の下にある。毛細管チャネル２６２は、毛細管チャネル２６２への入口がマイクロ流体モジュール２５０内の転送電極と同じ平面にある基板２３０内に位置している。さらに、図２Ｉ〜図２Ｋと同様に、毛細管チャネル２６２への入口は、転送電極２７２と整列している。したがって、電極２７２上に位置付けられた液滴は、毛細管チャネル２６２に対して実質的に水平に移動することができる。図２Ｉ〜図２Ｋに示すデバイスと同様に、基板２３０は、転送電極２７１上に位置付けられた液滴が、基板２９０内に位置する毛細管２６１ａまで下方に移動するための空間を提供するために、基板２３０の側縁にノッチ２８０を含む。また図２Ｌには、ナノポア層２７０が描かれている。この実施形態では、ナノポア層は、支持層２７５の不在下で基板２９０上に直接配設されている。例えば、チャネルを含む両方の基板がＰＤＭＳから形成される実施形態では、ナノポア層は、支持基板の不在下で基板間に直接配設されてもよい。図２Ｌの上パネルは、転送電極２７１および毛細管チャネル２６１ａが位置している位置におけるデバイスの断面の側面図を示す。図２Ｌの下パネルは、転送電極２７２および毛細管チャネル２６２が位置している位置におけるデバイスを通る断面の側面図を示す。上から見ると、このデバイスは、図２Ｉに示すデバイスと同じに見える。したがって、転送電極２７１および２７２は、図２Ｉに示すデバイスの転送電極７１および７２と同じ間隔で配置される。
ナノポア（複数可）を介してナノポア層を横切って分子を輸送するためのナノポアモジュール内の電極は、デバイス内にナノポア層を位置付けた後に製造することができる。例えば、電極は、基板に導入された開口部内に配設され、それらが毛細管チャネル内に曝露され、毛細管チャネル内に存在する流体と接触するように毛細管チャネル内に位置付けられてもよい。ナノポアからの電極の距離は、毛細管チャネル（複数可）の抵抗、幅、直径、および／または長さに基づいて経験的に決定され得る。
ナノポア層は、いずれかのチャネル上に配設することができる。ナノポア層は、プラズマ結合によって、またはガスケットなどの圧縮性要素を介して、マイクロチャネルを含む基板の表面に接着することができる。ある特定の場合において、第１のチャネルを含む基板は、ガラス基板であり得る。この実施形態では、ＰＤＭＳ層などの支持基板を、ナノポア層の位置付けに使用することができる。例えば、ナノポア層は、ＰＤＭＳガスケットを備えていてもよい。
基板上にチャネルを形成するために、任意の好適な方法を用いることができる。ある特定の場合において、リソグラフィまたはエンボス加工を使用して、ナノポアモジュール用のチャネルを形成することができる。他の実施形態では、チャネルは、基板にエッチングされてもよい。ある特定の実施形態では、好適な方法の組み合わせを使用して、基板にチャネルを形成することができる。例えば、エッチングプロセスを使用して、チャネルをガラス基板に形成することができ、ソフトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、レーザーアブレーション、またはエンボス加工（例えば、ソフトエンボス加工）などの適切な方法を使用して、別のチャネルをＰＤＭＳ基板に形成することができる。マイクロチャネルの高さ／幅／直径は、経験的に決定することができる。マイクロチャネルの高さ／幅／直径は、０．５μｍ〜約５０μｍの範囲、例えば、０．５μｍ〜４０μｍ、１μｍ〜３０μｍ、２μｍ〜２０μｍ、３μｍ〜１０μｍ、５μｍ〜１０μｍ、例えば、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、または５０μｍであり得る。本明細書に記載されるように、チャネルの高さ／幅／直径は、チャネルの長さに沿って変わり得る。
ある特定の実施形態では、ナノポア層（例えば、７０または２７０）は、ナノポア層の片側または両側に絶縁材料のコーティングを含み得る。絶縁材料は、接触容量を低減し、ナノポア層内のナノポア（複数可）を通る分子の転位の検出に関連するノイズを減少させることができる。別の実施形態では、ナノポア層と流体接触している毛細管チャネル（例えば、毛細管チャネル６１および６２または２６１および２６２）内の流体に曝露されるナノポア層の表面積を低減することができる。ナノポア（複数可）によって検出またはカウントされる分子を含む流体と接触しているナノポア層の表面積を低減することは、接触容量を最小化し、バックグラウンドノイズを低減することができる。毛細管チャネル内の流体と接触しているナノポア層の表面積は、ナノポア層の位置での毛細管チャネルのサイズを低減することによって低減することができる。例えば、ナノポア層の位置における毛細管チャネルの高さもしくは幅、またはそれらの両方（例えば、直径）を低減することができる。別の実施形態では、ナノポア層の表面積を低減することができる。ある特定のデバイスでは、接触容量を低減するためのこれらの実施形態の組み合わせを含めることができる。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるような集積デバイスは、ナノポア層の位置で減少した寸法を有する毛細管チャネルを含み得、かつ／またはナノポア層の片側もしくは両側に、絶縁材料（例えば、ＰＤＭＳ）でコーティングされるナノポア層を含み得、かつ／または最小表面積を有するナノポア層を含むことができる。
図３は、マイクロ流体モジュール３００およびナノポアモジュール３２５を含む、別の例示的な集積デバイスを示す。図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂのナノポアモジュールとは対照的に、ナノポアモジュール３２５は、独立型デバイスとして機能しないが、マイクロ流体モジュール３００と集積されるとナノポアとして機能する。マイクロ流体モジュール３００は、ナノポアモジュール３２５の挿入を可能にするサイズの開口部３０２を含む。図３に示すように、マイクロ流体モジュールは、ナノポアモジュール３２５を使用して分析される液滴３０１を含み、これはナノポア３０５を有する層３１１を含む。ナノポアモジュール３２５をマイクロ流体モジュール３００に挿入すると、層３１１によって分離された第１のチャンバ３０６および第２のチャンバ３０７が形成される。層３１１はまた、ナノポア３０５を横切って液滴３０１を分割する。
図４は、デジタルマイクロ流体モジュールが、内蔵ナノポアモジュールを含む、集積デバイス４００を提供する。図４では、ナノポアモジュールは、液滴４０１が生成されるマイクロ流体モジュール内の領域から下流に位置付けられている。マイクロ流体モジュールは、液滴４０１が層４０２を横切って分割され、ナノポア４０３に位置付けられるように、液滴４０１をナノポアモジュールに移動させる。図４は、デバイスの上面図を示す。明確にするために、上部基板は示されていない。ナノポア層４０２内のナノポア４０３が描かれているが、上面図からはナノポア４０３は見えないであろう。ナノポア層４０２は、底部基板または上部基板のいずれかに付着させることができる。
図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図３および図４では、単一のナノポアが示されているが、層は１つ以上のナノポアを含み得ることが理解される。さらに、ナノポアモジュールまたはデバイス内に複数の液滴を位置付けることができる。液滴（複数可）は、ナノポア（複数可）を横切って電圧を印加することによって分析され得る。電圧を印加することは、ナノポア（複数可）を横切って電荷分子の移動をもたらし得る。タグがナノポア（複数可）を通って転位するとき、ナノポアを横切る電流の減少は、転位の指標を提供する。ある特定の実施形態では、ナノポアモジュールのチャンバは、導電性溶液（例えば、緩衝液）で満たされなくてもよく、導電性溶液は、ナノポア層を横切って位置付けられると液滴によって提供されてもよい。ある特定の場合において、液滴中に存在するタグ／アプタマーの転位を測定するために電圧が印加される第１および第２のチャンバは、ナノポアデバイスおよびナノポア層の壁によって画定され得る（例えば、図１Ｂおよび２Ｂを参照）。第１および第２のチャンバは、液滴の導入前は空であってもよく、または導電性流体を含んでもよい。他の場合において、第１および第２のチャンバは、マイクロ流体モジュールおよびナノポア層の画定された壁であり得る（例えば、図３を参照）。他の場合において、第１および第２のチャンバは、ナノポア層を横切る液滴の分割によって画定され得る（例えば、図１Ａ、２Ａ、および４を参照）。ある特定の場合において、例えば、チャンバ内に導電性溶液が存在しない実施形態では、ナノポア（複数可）を横切って電荷分子を伝導するための電圧を液滴に印加することができる。液滴と直接または間接的に接触している電極を介して液滴に電圧を印加することができる。液滴が層を横切って分割され、ナノポア（複数可）を介してのみ接続されるように、ナノポア層の寸法は、液滴の寸法よりも大きいことが理解される。
図５Ａ、図５Ｂ、図６および図７は、デジタルマイクロ流体モジュールおよびナノポア層を有するデバイス内の液滴の動きを示す。図５Ａでは、集積デジタルマイクロ流体／ナノポアデバイス４５０の構成要素が描かれている。上面図は、ナノポア層４０２内のナノポア４０３を使用して分析される液滴４０１が、ナノポア層４０２を横切って位置付けられていることを示している。ナノポア４０３は、上面図からは見えないが、ここではナノポアは説明の目的で示されている。デバイス４５０は、基板４１１を含み、その上に電極４０５のアレイが配設される。電極のアレイを使用して、ナノポア層４０２を横切って液滴を分割することによって液滴４０１を位置付ける。矢印４５１および４５２は、液滴４０１が電極のアレイを横切ってナノポア層４０２に移動することができる方向を示す。ナノポア層４０２を横切って液滴４０１を位置付けると、液滴４０１の下に位置付けられた電極４０４および４０６を作動させてナノポア層４０２を横切って差動電圧を提供し、それによってナノポア４０３を横切る液滴４０１中の分子（例えば、切断タグまたはアプタマー）の移動を促進する。電極４０４および４０６は二重機能電極であり、それらは液滴をナノポア層に移動させ、タグ／アプタマーをナノポア４０３を横切って駆動するように働く。
図５Ｂは、デバイス４５０の側面図を示し、図５Ａに示される上面図で省略された上面基板４１２がここに描かれる。上部基板４１２は、電極４１４を含むように示されている。電極４１４は、単一電極であっても電極アレイであってもよい。ナノポア層は、上部基板から下部基板まで延在する。液滴４０１は、ナノポア層４０２を横切って分割される。二平面電極が図５Ｂに描かれているが、デバイスは両方の基板に電極を含まなくてもよく、むしろ、上部または底部基板は、共面電極を含み得る。液滴４０１の近傍の電極４０４および４０６は、反対の極性を有し、タグ／アプタマーをナノポア４０３を横切って駆動する。
図６は、ナノポア４０３を有するナノポア層４０２を横切る液滴４０１の分割を示す。１ａは、ナノポア層４０２に向かって矢印で示される方向に、電極４０５によって移動されている液滴を示す。２ａにおいて、液滴４０１は、ナノポア層４０２によって分割され、液滴がナノポア４０３を介して接続されるように位置付けられている。３ａにおいて、液滴４０１の下のナノポア層４０２を位置付けられた電極が活性化されて、アノード（−）およびカソード（＋）を提供する。活性化電極は、ナノポア４０３を介して液滴４０１中に存在する負電荷分子（カウントされるタグ／アプタマーを含む）を駆動する。タグ／アプタマーがナノポア４０３を通って転位するとき、タグ／アプタマーの数は、本明細書で説明されるようにカウントされ得る。ステップ３ａは、液滴が分割されたときに、液滴の片側でナノポア層を横切って分割された全てのタグ／アプタマーを収集するのに役立つ。
実質的に全てのタグ／アプタマーが、ナノポア膜の片側に転位すると、４ａに示すように、電極の極性を反転させ、タグ／アプタマーをナノポア層４０２の反対側に転位させてカウントすることができる。ステップ３ａでカウントされたタグの数は、ステップ４ａで得られたカウントのおよそ半分になるはずである。電極の極性を反転させ、タグ／アプタマーをカウントするステップは、液滴中のタグ／アプタマーの数の複数の読み取りを得るために任意の回数繰り返すことができる。
図７の１ｂおよび２ｂは、矢印で示す方向にナノポア層６０４に移動している２つの液滴６００ａおよび６００ｂを示す。ナノポア層６０４に達すると、液滴はナノポア層を濡らし、ナノポア６０５を介して流体的に接続される（３ｂ）。ステップ４ｂにおいて、液滴６００ａの下に位置付けられた電極は、カソードとして機能するように活性化され、液滴６００ｂの下に位置付けられた電極は、アノードとして機能するように活性化され、負電荷切断タグ／解離アプタマーは、液滴６００ａに駆動されカウントされる。ステップ５ｂにおいて、電極の極性が反転され、液滴６００ａ中に存在する負電荷切断タグ／解離アプタマーは、液滴６００ｂに駆動されてカウントされる。電極の極性を反転させ、切断タグ／解離アプタマーをカウントするステップは、液滴中の切断タグ／解離アプタマーの数の複数の読み取りを得るために任意の回数繰り返すことができる。２つの液滴６００ａおよび６００ｂは、試料液滴（例えば、カウントされる分子を含む液滴）または緩衝液滴（例えば、試料液滴（複数可）をナノポアに位置付ける前のナノ層を湿潤させるための液滴）であり得る。いくつかの実施形態では、一方の液滴は緩衝液滴であり得、他方の液滴は試料液滴であり得る。タグ／アプタマーは、１回または複数回カウントすることができる。
図８は、側面からの集積デジタルマイクロ流体およびナノポアデバイスを示す。基板９１および９２は、間隔を空けて位置付けられている。基板９２は、電極９７を含み、基板９１は、電極アレイ９５を含む。支持構造９８は、ナノポア層９４を基板９２に付着させる。他の実施形態では、支持構造９８を、底部基板９１に付着させることができる。電極アレイ９５は、液滴９９をナノポア層９４に移動させるために使用され、ナノポア層は、液滴を分割し、ナノポア９３を介して液滴の両側を流体的に接続する。電極９６および９７は、ナノポア９３を通して液滴９９中のタグ／アプタマーを駆動するのに役立つ。上記のように、電極９６および９７の極性を反転させて、タグ／アプタマーをナノポアを通して何度も転位させることができる。
図は単一のナノポアを描いているが、ナノポア層には１つより多くのナノポアが存在し得ることが理解される。ナノポア層に隣接し、ナノポア層を横切って電圧差を提供するために使用される電極は、ナノポア層に位置付けられた液滴と直接接触してもしなくてもよい。
マイクロ流体デバイスおよびナノポアデバイス、モジュール、ならびに集積デバイス内の液滴の移動は、任意の好適な手段を介して実行されてもよい。適用可能であれば、異なるデバイス／モジュールおよびチャネル内で液滴を移動させるための手段は、同じでも異なってもよい。例えば、エレクトロウェッティング、誘電泳動、オプトエレクトロウェッティング、電極媒介、電界媒介、静電作動等、またはそれらの組み合わせなどの流体操作力を使用して、液滴をマイクロ流体デバイスまたはモジュール内で移動させることができる。チャネルなどの流体接続を介したマイクロ流体モジュールからナノポアモジュールへの液滴の移動は、拡散、ブラウン運動、対流、ポンピング、印加圧力、重力駆動流、密度勾配、温度勾配、化学勾配、圧力勾配（正または負）、空気圧、ガス生成化学反応、遠心流、毛細管圧力、ウィッキング、電界媒介、電極媒介、電気泳動、誘電泳動、磁気泳動、磁場、磁気駆動流、光学力、走化性、走光性、表面張力勾配駆動流、マランゴニ応力、熱毛細管対流、表面エネルギー勾配、音響泳動、表面弾性波、電気浸透流、熱泳動、エレクトロウェッティング、オプトエレクトロウェッティング、またはそれらの組み合わせを介してもよい。液滴は、エレクトロウェッティング、誘電泳動、オプトエレクトロウェッティング、電極媒介、電界媒介、静電作動等の流体操作力、または組み合わせなどを介して、ナノポアモジュール内を移動し、ナノポア層を横切って位置付けられ得る。液滴中のタグ／アプタマーは、電位、静電電位、界面動電流、電気浸透流、圧力誘起流、電気泳動、電気泳動輸送、電気浸透輸送、拡散輸送、電気泳動、電界媒介流、タグ／アプタマーの誘電泳動媒介輸送、および当業者に公知の他の方法、またはそれらの組み合わせを使用して、ナノポア（複数可）を通して転位させることができる。
本開示の例示的な実施形態は、最初に実質的に全てのタグをナノポア層の同じ側に転位させて、シスまたはトランスチャンバ内の全てのタグを収集し、続いてナノポア層の反対側にタグを転位させることによって、ナノポア層を横切って位置付けられる液滴中に存在するタグの数をカウントすることと、ナノポア層内のナノポア（複数可）を横断するタグの数をカウントすることと、を含む。本明細書で使用される場合、ナノポア層の文脈における「シス」および「トランス」は、ナノポア層の反対側を指す。これらの用語は、ナノポア層の側面に関して、またナノポア層の側面上のチャンバに関しても使用される。デバイスの説明から理解されるように、シスおよびトランスチャンバは、壁、基板等によって画定される物理的構造によって画定され得る。いくつかの場合において、シスおよびトランスチャンバは、ナノポア層を横切って配置される液滴によって画定され得る。液滴は、液滴の１つ以上の側面上の壁または基板と接触していてもよい。ある特定の場合において、シスおよびトランスチャンバは、液滴によって画定されてもよく、シスチャンバは、ナノポア層のシス側からシス側の液滴の部分の周囲まで延在してもよく、トランスチャンバは、ナノポア層のトランス側からトランス側の液滴の一部の周囲まで延在し得る。シス側およびトランス側の各々の液滴の一部は、基材と接触していてもよい。したがって、シスおよびトランスチャンバは、液滴の周囲、基板の一部およびナノポア層の組み合わせによって画定され得る。
ある特定の場合において、マイクロ流体デバイスおよび／またはマイクロ流体モジュールは、試料液滴および試薬液滴と不混和性の不活性流体を含み得る。例えば、不活性流体は、マイクロ流体モジュール内で生成および処理されている液滴と不混和性の油など、水よりも密度の高い重質流体であり得る。不活性流体は、液滴の形成を容易にすると共に、液滴の形状の安定性を高めることができ、異なる液滴を互いに空間的に分離した状態に保つためにさらに有用であり得る。例示的な不活性流体としては、極性液体、シリコーン油、フルオロシリコーン油、炭化水素、アルカン、鉱油、およびパラフィン油が挙げられる。ある特定の場合において、マイクロ流体デバイスまたはモジュールおよび不活性流体は、ＵＳ２００７／０２４２１０５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているとおりであり得る。他の実施形態では、不混和性流体は、デバイスに含まれていない。これらの実施形態では、周囲空気がデバイス内の空間を満たす。
本明細書で使用される場合、「液滴（複数可）」および「液滴（複数可）」は、ほぼ球形であり、少なくとも２つの側面でマイクロ流体デバイス、ナノポアデバイス、マイクロ流体モジュール、またはナノポアモジュールの壁または基板によって境界が定められている、目立たない量の液体を指すために互換的に使用される。液滴の文脈における略球形とは、球形、部分的に平らな球形、例えば円板形、スラグ形、切頭球形、楕円形、半球形、または卵形などの形状を指す。本明細書に開示されるマイクロ流体およびナノポアモジュールおよびデバイス中の液滴の体積は、約１０μＬ〜約５μＬ、例えば１０μＬ〜１ｐＬ、７．５μＬ〜１０ｐＬ、５μＬ〜１ｎＬ、２．５μＬ〜１０ｎＬ、または１μＬ〜１００ｎＬ、例えば、１０μＬ、１μＬ、８００ｎＬ、４００ｎＬ、１００ｎＬ、１０ｎＬ、またはそれ以下の範囲であり得る。
ある特定の実施形態では、集積デバイスは、内蔵ナノポアモジュールを有するマイクロ流体モジュールを含み得る。集積デバイスは、第１の基板と第２の基板とを隔てるギャップを有する第１の基板と第２の基板とを含み、ギャップ（空気または不混和性液体で満たされ得る）は、試料液滴が第１の結合メンバーと接触する空間を提供し（磁気ビーズ上または２つの基板のうちの一方に固定化されている）、任意選択で、洗浄ステップが行われ、続いて、第１の結合メンバーに結合した検体を第２の結合メンバーと接触させ、任意選択で、混合および洗浄ステップを行ってもよく、第２の結合メンバーに付着したタグを切断して、切断されたタグを含む液滴を生成する。次いで、切断されたタグを含有する液滴を、第１の基板と第２の基板との間のギャップに位置するナノポア層を横切って位置付けることができる。
本明細書に記載されるように、液滴は、プログラム可能な流体操作力（例えば、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介力、電極媒介力、ＳＡＷ等）を使用するなど、多数の方法を介して集積デバイス内を移動し得る。ある特定の場合において、マイクロ流体デバイスおよびモジュールは、電極を使用することによって検体分析を実施するために試料および試薬の液滴を移動させることができる。電極は、共面であり得、すなわち同じ基板上に存在するか、または対面配向（二平面）にあり得、すなわち、第１および第２の基板中に存在することができる。ある特定の場合において、マイクロ流体デバイスまたはモジュールは、米国特許第６，９１１，１３２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような電極構成を有することができる。ある特定の場合において、デバイスは、ギャップによって第２の基板から分離された第１の基板を含んでもよい。第１の基板は、上面に位置付けられた一連の電極を含むことができる。誘電体層は、第１の基板の上面に配設され得、一連の電極を被覆して、液滴の移動のための実質的に平坦な表面を提供することができる。任意選択で、疎水性材料の層を、誘電体層の上面に配置して、実質的に平坦な表面を提供することができる。ある特定の場合において、第１の基板は、共面電極、例えば単一基板上に存在する駆動／制御および参照電極を含み得る。他の場合において、第１の基板上に位置付けられた第２の基板は、第２の基板の下面上に電極を含み得、第２の基板の下面は、第１の基板の上面に面している。第２の基板上の電極は、絶縁材料で被覆されていてもよい。一連の電極は、マイクロ流体モジュールの長さに沿って長手方向に、もしくはマイクロ流体モジュールの幅に沿って横方向に、またはその両方（例えば、二次元アレイもしくはグリッド）に配置されてもよい。ある特定の場合において、電極のアレイは、プログラム可能な様式で液滴を移動させるためにデバイスに動作可能に結合されたコンピュータのプロセッサによって活性化され得る（例えば、オンおよびオフにされ得る）。マイクロ流体デバイスにおいて液滴を作動させるためのデバイスおよび方法が知られている。例示的な場合において、マイクロ流体モジュールは、当分野で知られている液滴アクチュエータと同様であり得る。例えば、第１の（底部）基板は、個々に制御可能な電極のパターン化アレイを含み得、第２の（上部）基板は、連続接地電極を含むことができる。疎水性物質でコーティングされた誘電絶縁体を電極の上にコーティングして、表面の濡れ性を低下させ、液滴と制御電極（電極のパターン化アレイ）との間に静電容量を加えることができる。液滴を移動させるために、制御電圧を液滴に隣接する（電極のアレイ内の）電極に印加することができ、同時に、液滴の真下の電極を非活性化する。電極の線形アレイに沿って電位を変えることによって、エレクトロウェッティングを使用して、この電極の線に沿って液滴を移動させることができる。
第１および第２の基板は、任意の好適な材料から作製され得る。好適な材料としては、限定されないが、紙、薄膜ポリマー、シリカ、シリコン、加工シリコン、ガラス（硬質または軟質）、ポリマー（硬質、軟質、不透明、または透明）（例えばポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）および環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ））、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、プリント回路基板、ならびにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。ある特定の場合において、少なくとも第１の基板または第２の基板は、実質的に透明であり得る。実質的に透明な基板は、第２の結合メンバーに付着したタグの光切断が行われるデバイスにおいて使用され得る。共面電極が一方の基板に存在する実施形態では、電極は、透明であってもなくてもよい。例えば、電極が対向配向にある（両方の基板に存在する）他の実施形態では、基板の少なくとも一方の電極は、実質的に透明であり得、例えば、電極は酸化インジウムスズから作製され得る。電極は、任意の好適な材料から作製され得る。電極は、純粋な金属または合金などの任意の導電材料、または他の導電材料で作製することができる。例としては、アルミニウム、炭素（グラファイトなど）、クロム、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、イリジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀（アマルガムとして）、ニッケル、ニオブ、オスミウム、パラジウム、白金、レニウム、ロジウム、セレン、シリコン（高ドープ多結晶シリコンなど）、銀、タンタル、スズ、チタン、タングステン、バナジウム、亜鉛、ジルコニウム、それらの混合物、およびこれらの元素の合金または金属化合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、導電性材料は、炭素、金、白金、パラジウム、イリジウム、またはこれらの金属の合金を含む。なぜなら、そのような貴金属およびそれらの合金は、水性環境において非反応性である。
ある特定の場合において、第１または第２の基板は、ギャップ内に固定された第１の結合メンバーを有してもよい。例えば、第２の基板の表面と対面関係にある第１の基板の表面は、第１の結合メンバーが配設される領域を含み得る。本明細書中に記載されるように、第１の結合メンバー（例えば、ポリペプチド、例えば、受容体、抗体、またはそれらの機能的断片）は、任意の従来の方法を使用して固体基材の表面に固定化され得る。ある特定の場合において、ギャップ内の第１または第２の基板の表面上の第１の位置は、１種類の結合メンバー（例えば、単一種類の抗体）のみを含み得る。他の実施形態では、ギャップ内の第１または第２の基板の表面上の第１の位置は、複数の検体の分析のために、複数の異なる結合メンバーのみを含み得る。あるいは、デバイスは、第１または第２の基板の表面上に複数の位置を含み得、各位置は、その上に固定化された異なる第１の結合メンバーを含み得る。
ギャップ内の第１の基板または第２の基板の表面が、異なる第１の結合メンバーが固定化される複数の位置を有する実施形態では、これらの位置は、デバイスの長さに沿って直線的に配置されてもよい。試料液滴を直線的に移動させて、複数の位置の各々に順次接触させることができる。別の実施形態では、試料は、複数の液滴に分割されてもよく、各液滴は、複数の位置の各々に独立して接触してもよい。本明細書に記載されるように、第１の結合メンバーは、第１または第２の基板に付着させることができず、マイクロ流体デバイスに、例えば液滴として導入され得るビーズに付着させることができる。
本明細書に記載されるように、試料および試料をアッセイするための任意の試薬は、プログラム可能な流体操作力（例えば、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電駆動、電界媒介、電極媒介力等）を使用して、第１の基板と第２の基板との間を移動し得る離散体積の流体として操作され得る。例えば、第１および第２の基板の少なくとも一方は、離散体積の流体を操作するため、例えば、第１の基板と第２の基板との間で液滴をある位置から別の位置に移動させる、混合、合体分割、希釈などのための電極のアレイを含み得る。別の例では、検体分析方法のために表面音響波を使用して液滴を移動させることができる。
別の実施形態では、マイクロ流体モジュールは、表面音響波を使用することによって、検体分析を実行するために試料および試薬の液滴を移動させることができる。これらの実施形態では、第１の基板は、表面音響波の伝播を助長する薄い平面材料であり得る。第１の基板は、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ３）、石英、ＬｉＴａＯ３ウェハなどの圧電結晶層であってもよい。ある特定の場合において、圧電ウェハは、超基板に取り外し可能に結合されてもよく、トランスデューサから生成された表面音響波（ＳＡＷ）は、圧電結晶層と超基板との間に配設された接触媒質を介して超基板に伝達される。超基板の上面は、第２の基板によって重ね合わされてもよく、液滴は、圧電結晶層に接続された櫛形トランスデューサによって生成されたＳＡＷを介して、第２の基板と超基板の上面との間の空間内を移動してもよい。ある特定の場合において、マイクロ流体モジュールは、ＷＯ２０１１／０２３９４９（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＳＡＷマイクロ流体デバイスであってもよい。
代替実施形態では、マイクロ流体モジュールは、第１の表面と第２の表面との間に空間を有して第２の表面から分離された第１の表面を含み得、ここで試料および試薬の液滴は、本明細書に開示される試料分析を行うために操作される。マイクロ流体デバイスは、第１の表面に結合された表面音響波（ＳＡＷ）発生材料の層と、第１の表面上の液滴への伝達のための第１の表面に表面音響波（ＳＡＷ）を提供するために、ＳＡＷ発生材料層に配置されたトランスデューサ電極構造と、をさらに含み得、ここで第１の表面は、第１の表面におけるＳＡＷの伝達、分散、および／または動作に影響を及ぼすために、少なくとも１つのＳＡＷ散乱要素を有し、ＳＡＷ発生材料は、多結晶材料、配向多結晶材料、二軸配向多結晶材料、微結晶材料、ナノ結晶材料、非晶質材料、および複合材料からなる群から選択される。ある特定の場合において、ＳＡＷ発生材料は、強誘電材料、焦電材料、圧電材料、または磁歪材料であり得る。ＳＡＷ散乱要素の配置は、事実上、第１の表面における音場と相互作用するか、またはそれに影響を及ぼすフォノニック結晶構造を提供して、第１の表面上の液滴の移動に影響を及ぼすことができる。ある特定の場合において、マイクロ流体モジュールは、ＵＳ２０１３／０３３０２４７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＳＡＷマイクロ流体デバイスであってもよい。ＳＡＷマイクロ流体デバイスは、ナノポアデバイスと共に使用され得るか、またはそれと集積されたナノポアモジュールを有し得る。
本明細書に記載のデバイスは、電源、音波発生器等の別のデバイス（複数可）と共に使用することができる。
本明細書に記載の方法ステップを実行するために使用することができるデバイスはまた、試薬を供給し、廃棄物を収集するための手段を含むことができる。そのような手段は、チャンバ、吸収パッド、リザーバ等を含み得る。これらの手段は、デバイスに流体的に接続され得る。
マイクロ流体モジュールは、例えば、第１の結合メンバー、第２の結合メンバー、洗浄緩衝液、切断誘導試薬等の試料分析試薬を供給するためのリザーバに流体的に接続されてもよい。ナノポアモジュールは、廃棄物を収集するためのリザーバ、シスおよびトランスチャンバに導電性溶液を供給するためのリザーバ等に流体的に接続することができる。
集積デバイスは、自動または半自動であってよく、また電圧を供給するための電源および試料を第１の結合メンバーと接触させるための命令であって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、命令と、検体を第２の結合メンバーと接触させるための命令であって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含む、命令と、第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去するための命令と、第１の結合メンバーに結合した検体に結合した第２の結合メンバーに付着したタグを切断するための命令と、層内のナノポアを通してまたは横切ってタグを転位させるための命令と、層を通って転位するタグの数を決定するための命令と、層を通って転位するタグの数または一定の時間間隔で公知のタグ数を転位させる時間に基づいて、試料中の検体を測定するための命令と、を格納するためのランダムアクセスメモリを備える筐体に取り外し可能に結合されてもよい。本明細書に記載されるように、検体分析方法は、デバイスを制御するプロセッサを使用して実行することができる。例えば、デバイスは、本明細書に開示されるようないかなる任意選択の混合、インキュベート、および洗浄ステップも含む、本明細書に開示される検体分析を行うようにプログラムされてもよい。筐体は、メモリに格納された命令を実行するためのプロセッサをさらに含み得る。本明細書に記載のデバイスは、ナノポアデバイスまたはモジュールからの電気シグナルを処理するためのデータ取得モジュール（ＤＡＱ）を含み得る。ある特定の場合において、電気シグナルを処理し、最適なシグナル対ノイズ比を達成するためのパッチクランプ増幅器も含まれ得る。
ある特定の場合において、本明細書に記載のデバイスは、検体分析方法の少なくともいくつかのステップを自動的に行うためのシステムと関連付けることができる。そのようなシステムの例を図９に示す。例示的なシステムは、ディスプレイ６１に動作可能に結合されたプロセッサおよびメモリを有するデータ処理ユニット６３を含む処理コンポーネント６０と、本開示のデバイス６８の受信機／送信機ユニット６９と通信する送信機／受信機ユニット６２とを含む。デバイス６８は、本明細書に開示される検体分析方法の少なくともいくつかのステップを行うための命令（プログラムのステップ）を実行する処理構成要素６０によって制御される。ある特定の場合において、処理構成要素６０は、コンピュータ、集積デバイスを挿入するための開口部を有する計器（開口部は、デバイスを収容し、デバイスに動作可能に接続されるサイズおよび形状のスロットであり得る）、またはそれらの組み合わせであり得る。処理構成要素６０とデバイス６８との間の通信６４は、有線でも無線でもよい。デバイス６８は、マイクロ流体６６およびナノポア６７の機能性を有する本明細書に記載の任意のデバイスであり得る。ある特定の場合において、本明細書に開示されるデバイス内の液滴の移動は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２９４，０６３号に開示されているようにプログラムすることができる。
本明細書の実施形態に関連して記載される様々な例示的プロセスは、汎用プロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または本明細書に記載の機能を行うように設計された他のプログラム可能な論理デバイス、ディスクリートゲートまたはトランジスタロジック、ディスクリートハードウェアコンポーネント、またはそれらの任意の組み合わせで実装または実行できる。汎用プロセッサは、マイクロプロセッサであり得るが、代替として、プロセッサは、任意の従来のプロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、または状態機械であり得る。プロセッサは、ユーザインターフェースと通信し、ユーザによって入力されたコマンドを受信するユーザインターフェースポートも有し、プロセッサの制御下、ユーザインターフェースポートを介した通信により動作するプログラムを含む電子情報を記憶する少なくとも１つのメモリ（例えば、ハードドライブまたは他の同等の記憶装置、およびランダムアクセスメモリ）、ならびに任意の種類のビデオ出力フォーマット、例えば、ＶＧＡ、ＤＶＩ、ＨＤＭＩ、ＤｉｓｐｌａｙＰｏｒｔ、または任意の他の形態を介してその出力を生成するビデオ出力を有する、コンピューティングシステムの一部であり得る。
プロセッサはまた、コンピューティングデバイスの組み合わせ、例えば、ＤＳＰとマイクロプロセッサの組み合わせ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアと連携した１つ以上のマイクロプロセッサ、または任意の他のそのような構成として実装され得る。これらのデバイスを使用して、本明細書に記載されるデバイスのための値を選択することもできる。カメラは、フォトチューブ、フォトダイオード、アクティブピクセルセンサ（ＣＭＯＳ）、ＣＣＤ、フォトレジスタ、光電池または他のデジタル画像キャプチャ技術に基づくカメラであり得る。
本明細書に開示された実施形態に関連して記載される方法またはアルゴリズムのステップは、ハードウェアで直接、プロセッサによって実行されるソフトウェアモジュールで、またはその２つの組み合わせで実施することができる。ソフトウェアモジュールは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、フラッシュメモリ、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、電気的にプログラム可能なＲＯＭ（ＥＰＲＯＭ）、電気的に消去可能なプログラマブルＲＯＭ（ＥＥＰＲＯＭ）、レジスタ、ハードディスク、リムーバブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、クラウド、または当技術分野で知られている任意の他の形態の記憶媒体内に存在し得る。例示的な記憶媒体は、プロセッサが記憶媒体から情報を読み取り、記憶媒体に情報を書き込むことができるようにプロセッサに結合される。代替として、記憶媒体は、プロセッサと一体であり得る。プロセッサおよび記憶媒体は、ＡＳＩＣ内に存在し得る。ＡＳＩＣは、ユーザ端末内に存在してもよい。代替として、プロセッサおよび記憶媒体は、ユーザ端末内に個別のコンポーネントとして存在し得る。
１つ以上の例示的な実施形態では、説明された機能は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、またはそれらの任意の組合せで実装され得る。ソフトウェアで実施される場合、機能は、コンピュータ可読媒体上の１つ以上の命令、コードまたは他の情報として格納され、その上で送信され、または結果として得られる分析／計算データ出力であり得る。コンピュータ可読媒体は、ある場所から別の場所へのコンピュータプログラムの転送を容易にする任意の媒体を含む、コンピュータ記憶媒体と通信媒体の両方を含む。記憶媒体は、コンピュータによってアクセスされ得る任意の利用可能な非一時的媒体であり得る。例として、そのようなコンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、または他の光ディスク記憶装置、磁気ディスク記憶装置、または他の磁気記憶装置、または所望のプログラムコードを命令またはデータ構造の形で搬送または格納するために使用することができ、コンピュータによってアクセスできる任意の他の媒体を含むことができる。メモリ記憶装置はまた、回転磁気ハードディスクドライブ、光ディスクドライブ、またはフラッシュメモリベースの記憶ドライブ、または他のそのような固体、磁気、もしくは光記憶デバイスであり得る。本明細書で使用されるディスク（ｄｉｓｋ）およびディスク（ｄｉｓｃ）は、コンパクトディスク（ＣＤ）、レーザーディスク、光ディスク、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、フロッピーディスクおよびブルーレイディスクを含み、ディスク（ｄｉｓｋ）は、通常磁気的にデータを再生するが、ディスク（ｄｉｓｃ）は、光学的にレーザーでデータを再生する。上記の組み合わせもまた、コンピュータ可読媒体の範囲内に含まれるべきである。
本明細書に開示される実施形態が、メモリ、記憶装置、および／またはコンピュータ可読媒体を含むか、それらと関連して動作する限りにおいて、そのメモリ、記憶装置、および／またはコンピュータ可読媒体は、非一時的である。したがって、メモリ、記憶装置、および／またはコンピュータ可読媒体が１つ以上の特許請求の範囲によってカバーされる限りにおいて、そのメモリ、記憶装置、および／またはコンピュータ可読媒体は、非一時的なものにすぎない。
ある特定の場合において、デバイスは、ラボオンチップデバイス、連続流マイクロ流体デバイス、または液滴ベースのマイクロ流体デバイスなどのマイクロ流体デバイスであってもよく、検体分析は、検体を含むかまたは含んでいることが疑われる試料の液滴中で実行され得る。本方法において使用され得る例示的なマイクロ流体デバイスとしては、ＷＯ２００７／１３６３８６、ＵＳ８２８７８０８、ＷＯ２００９／１１１４３１、ＷＯ２０１０／０４０２２７、ＷＯ２０１１／１３７５３３、ＷＯ２０１３／０６６４４１、ＷＯ２０１４／０６２５５１、またはＷＯ２０１４／０６６７０４に記載されるものが挙げられる。ある特定の場合において、デバイスは、デジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）、表面音響波ベースのマイクロ流体デバイス（ＳＡＷ）、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＦ要素とナノポア要素は、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイスに動作可能に結合されるか、またはＳＡＷ要素およびナノポア要素は、完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスに動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、ＤＭＦデバイスまたはＳＡＷデバイスは、ロールツーロールベースの印刷エレクトロニクス方法によって製造される。いくつかの実施形態では、ＤＭＦ素子またはＳＡＷ素子は、ロールツーロールベースの印刷電子方法によって製造される。いくつかの実施形態では、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスは、マイクロ流体導管を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体導管は、ＤＭＦ要素をナノポア要素に結合し、マイクロ流体導管は、受動的な力または能動的な力によって誘導される流体の流れを含む。
例示的なエレクトロウェッティング技術は、ＵＳ８６３７２４２に見出すことができる。ＷＯ２０１１／０５７１９７に記載されているようなマイクロスケールでの電気泳動もまた利用され得る。例示的な誘電泳動技法は、ＵＳ６２９４０６３に記載されている。
本開示のデバイスは、一般に外部ポンプおよびバルブを含まず、したがって製造および使用するのに経済的である。本明細書に開示されているデバイスおよび関連システム、ならびに本明細書に開示されている全ての方法は、（例えば、診療所、病院、内科医院、中核研究所施設、自宅等での）ポイントオブケアなど、試料の供給源における試料の分析などの分野における用途に有用である。いくつかの場合において、本開示のデバイスまたはシステムは（例えば、本明細書に開示される方法でも使用されるように）、熱源または光源が活性化されると、本明細書に記載されるように、タグを検体に結合する熱的に切断可能なまたは光切断可能なリンカーの切断を誘導するように構成された熱源または光源を含む。
本開示はまた、ナノポア対応デバイスおよび集積マイクロ流体ナノポア対応デバイスと共に使用されるマイクロ流体デバイスについて記載する。ナノポア対応デバイスとは、ナノポアを形成することができる層または膜を含むデバイスを指す。本開示のナノポア対応デバイスは、層または膜によって分離された２つのチャンバを含み、２つのチャンバは、電流を伝導するためのイオン液体（例えば、目的の検体を含むまたは含まない、塩溶液）を含む。チャンバ内のイオン性液体（例えば、目的の検体を含むまたは含まない、塩溶液）を使用して、層全体に電圧を印加することによって、ナノポア対応デバイスの層にナノポアを形成することができる。理解されるように、本明細書に記載のナノポアデバイス（マイクロ流体デバイスと共に使用されるか、またはマイクロ流体モジュールと集積される）のうちのいずれもが、ナノポアが形成され得るが、ナノポアが欠けている層を含むナノポア対応デバイスとして最初に提供され得る。タグの転位を検出するためにナノポアを使用する前など、使用中にナノポア対応デバイスにナノポアを形成することができる。ある特定の実施形態では、ナノポアによって検出されるタグを含むイオン液体、例えば塩溶液は、ナノポアを形成するためおよび形成されたナノポアを横切ってタグを移動させるための両方に使用することができる。
いくつかの実施形態では、上述のように層を横切って電圧を印加することによって形成されるナノポアの品質は、ベースライン電圧がナノポア層または膜を横切って印加されたときに測定される電流におけるノイズのレベルによって評価される。
いくつかの場合において、上述のように、層を横切って電圧を印加することによって形成されたナノポアは、ナノポアを物理的に変化させ、所望の電気浸透特性を得る、例えば、ナノポア層または膜を横切って電圧が印加されると、孔径を増加させる、および／またはナノポアを横切る測定電流中のノイズを低減するように調整され得る。したがって、いくつかの実施形態では、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスにおいてナノポアを生成する方法は、ナノポアを調整することを含み得る。調整は、代替として、第１の極性を有する第１の電圧および第１の極性とは反対の第２の極性を有する第２の電圧を、ナノポア層または膜を横切って印加することであって、第１の電圧および第２の電圧が各々、少なくとも１回印加される、印加することと、ナノポアのサイズに関して電気浸透特性を測定することと、を含み得る。いくつかの場合において、ナノポアのサイズに関する電気浸透特性を、調整前に測定して、ナノポアのサイズの初期推定値を得る。
電気浸透特性は、ナノポアのサイズの推定値を提供する任意の好適な特性であり得る。いくつかの場合において、電気浸透特性は、ある範囲の電圧（−１Ｖ〜１Ｖの範囲、例えば、−５００ｍＶ〜５００ｍＶ、−２５０ｍＶ〜２５０ｍＶ、−２００〜２００ｍＶ、１０ｍＶ〜５００ｍＶ、１０ｍＶ〜２５０ｍＶ、１０ｍＶ〜２００ｍＶ、１５ｍＶ〜２００ｍＶを含む）にわたって得られる電流−電圧曲線によって表される。いくつかの場合において、電気浸透特性は、ナノポア層または膜を横切って測定されたコンダクタンスまたは抵抗である。
第１および第２の電圧は、ナノポアを修飾し、所望の電気浸透特性を得るために任意の好適な大きさを有し得る。いくつかの場合において、第１および第２の電圧は、１００ｍＶ以上の大きさ、例えば、２００ｍＶ以上、５００ｍＶ以上、７５０ｍＶ以上、１．０Ｖ以上、２．０Ｖ以上、３．０Ｖ以上（４．０Ｖ以上を含む）を有し、いくつかの場合において、１０Ｖ以下の大きさ、例えば９．０Ｖ以下、８．０Ｖ以下、６．０Ｖ以下、４．０Ｖ以下を有する。いくつかの実施形態では、第１および第２の電圧は、１００ｍＶ〜１０Ｖ、例えば２００ｍＶ〜９．０Ｖ、２５０ｍＶ〜９．０Ｖ、５００ｍＶ〜９．０Ｖ、１．０Ｖ〜８．０Ｖ（２．０Ｖ〜６．０Ｖを含む）の範囲の大きさを有する。
第１および第２の電圧は各々、ナノポアを修飾するため、および所望の電気浸透特性を得るために、任意の好適な長さの時間にわたって印加することができる。いくつかの場合において、第１および第２の電圧は各々、１０ミリ秒（ｍｓ）以上、例えば１００ｍｓ以上、２００ｍｓ以上、５００ｍｓ以上、１秒（ｓ）以上、２ｓ以上、３ｓ以上にわたって印加され、いくつかの場合において、１０ｓ以下、例えば５ｓ以下、４ｓ以下、３ｓ以下、２ｓ以下、１ｓ以下、５００ｍｓ以下、または２００ｍｓ以下、１００ｍｓ以下にわたって印加される。いくつかの場合において、第１および第２の電圧は各々、１０ｍｓ〜１００ｍｓ、１００ｍｓ〜２００ｍｓ、２００ｍｓ〜５００ｍｓ、５００ｍｓ〜１ｓ、１ｓ〜２ｓ、２ｓ〜３ｓ、３ｓ〜４ｓ、３ｓ〜５ｓ、または３ｓ〜１０ｓの範囲の期間にわたって印加される。
第１および第２の電圧は各々、ナノポアを修飾するため、および所望の電気浸透特性を得るために、任意の好適な回数印加することができる。いくつかの場合において、第１および第２の電圧は各々、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、７回以上、１０回以上、２０回以上、３０回以上、５０回以上、１００回以上、２００回以上、５００回以上印加され、いくつかの実施形態では、１０，０００回以下、例えば５，０００回以下、１，０００回以下、５００回以下、４００回以下、２００回以下、１００回以下、５０回以下印加される。いくつかの実施形態では、第１および第２の電圧は各々、２〜５０回、１０〜５０回、３０〜５０回、５０〜１００回、１００〜２００回、１００〜５００回、５００〜１，０００回、５００〜１，０００回、または５００〜１０，０００回印加される。
４．ＤＭＦモジュールの片側へのナノポアモジュールの統合
本開示の一態様は、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）モジュールと、ＤＭＦモジュールの一方の外側に位置付けられたナノポア層と、を含む集積デバイスを含む（図４０）。ナノポア層のナノポアは、ＤＭＦモジュールの第１の（例えば、上部）または第２の（例えば、底部）基板に存在する穴（「開口部」とも呼ばれる）を通して、または第１の基板と第２の基板との間のＤＭＦモジュールの側面を通して、ＤＭＦモジュールの内部空間内の液滴によってアクセスすることができる。上述のように、ナノポア層は、ナノポア膜または基板を含むことができ、いくつかの場合において、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）ウィンドウ内の市販の窒化ケイ素（ＳｉＮｘ）膜であり得る。ナノポア層は、ナノポアが存在しない場合（すなわち、本明細書に記載されるようにナノポアの製造前）に、ＤＭＦモジュール内のある量の液体が、ナノポア層の外側またはその周りの任意の量の液体から物理的に単離されるように、穴を覆うシールを形成する。いくつかの場合において、ナノポア層は、ナノポアモジュールの一部であり、ナノポア層は、ナノポアモジュール内の区画を、ＤＭＦモジュール内のある量の液体から分離する（例えば、上述のように基板の穴内の液滴）から分離する。ナノポア層またはモジュールは、ある量の液体（例えば、基板の穴の中の液滴）が外部環境から物理的に単離されるように、基板の外面に封止される。
ＤＭＦ中の液滴が、それを通ってナノポア層にアクセスする基板中の穴は、液滴が毛細管作用によって穴を通って移動するのに適切であるように寸法決定することができる。したがって、基板の穴は、毛細管チャネルであり得る。穴は、穴を通しての液滴の移動を、例えば毛細管作用によって受動的に支持するための任意の好適な断面形状および寸法を有することができる。いくつかの場合において、穴の直径は、外側（すなわちナノポア層に面する側）の穴の直径よりも、ＤＭＦの側で広い。いくつかの場合において、基板の底面と穴の壁との間の角度は、直角または鈍角（例えば、９０°以上、例えば、９５°以上、１００°以上を含む）である。
集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイスは、一対の電極を含んでよく、これらは、ナノポア層内にナノポアを製造する際、および／または本明細書の他の箇所に記載されるようにＤＭＦモジュールによって処理された目的の検体を検出するために使用できる。一対の電極は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）を含むがこれに限定されない、任意の好適な材料から作製されてもよい。対電極は、任意の好適な方法で構成することができる。いくつかの実施形態では、基板を物理的に貫通してナノポア層の反対側の液体の量にアクセスすることによって、１つの電極は、ナノポアモジュール内の区画に位置付けられ、第２の電極は、ＤＭＦモジュール内に位置付けられる（図４０）。
いくつかの実施形態では、第１の電極は、ＤＭＦモジュールで使用される単一の連続電極（例えば、参照電極）と同じ電極であり得、第２の電極は、第１の電極が位置付けられる底面の反対側の基板の上面（すなわち、外面）に配設され得る（図４３）。そのような場合において、上面は、底面と同様の方法で処理されてもよい（例えば、酸化インジウムスズなどの電極材料、およびポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）を含む）などのポリマーでのコーティング）。したがって、いくつかの場合において、第２の電極が、ナノポア層／モジュールが付着している基板の上面上の電極である場合、ＤＭＦモジュールに対するナノポア層の外面上の液体の量は、第２の電極と電気的に接触する。ナノポア製造のための電気経路は、第２の電極→液体（外部）→ナノポア膜（ナノポアなし）→液体（ＤＭＦモジュールの内部）→第１の電極（ＤＭＦの単一の連続電極と同じ）と表すことができる。第２の電極はまた、いくつかの場合において、ナノポアモジュール内に含まれ得るナノポア膜の外側の液体に電流を流すように、ナノポア層／モジュールが付着した領域に存在しなくてもよい。
いくつかの実施形態では、図４４に示すように、第１の電極は、第１のＤＭＦモジュール（例えば、図４４の「底部ＤＭＦチップ」）で使用される単一の連続電極（例えば、参照電極）と同じ電極であり、第２の電極は、第２のＤＭＦモジュールの単一の連続電極に関連する対応する上部基板に穴を有する第２のＤＭＦモジュール（例えば、図４４の「上部ＤＭＦチップ」）によって提供されてもよく、それぞれの基板の穴の間の２つのＤＭＦモジュールの間に挿入される。したがって、第１および第２のＤＭＦモジュールは、第１のＤＭＦモジュールの単一の連続電極に関連付けられた上部基板が、第２のＤＭＦモジュールの単一の連続電極に関連付けられた上部基板に近接し、対向するように互いに対して配向を反転させることができる。２つのＤＭＦモジュールは、ナノポア層にナノポアがあるときに、２つのＤＭＦモジュールがナノポア膜を介して流体的かつ電気的に一緒に結合されるように、互いに対して位置付けられてもよい。ナノポアを形成する前に、２つのＤＭＦモジュール内の２つの体積の流体を互いに単離されてもよい。いくつかの場合において、２つのＤＭＦモジュールの間に構造層を挿入させて、構造的支持を提供し、曲げを低減する。
本明細書ではまた、上述のように、集積ＤＭＦ−ナノポアモジュールデバイス内のナノポア対応層にナノポアを作製する方法も提供される。この方法の実施は、本明細書に記載されるように、イオン性液体、例えば塩溶液（例えば、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ等）を任意の好適な方法を使用してＤＭＦモジュールの穴に位置付けることと、穴を通して液体を移動させる毛細管作用を可能にすることと、を含む（例えば、図４０を参照）。イオン性液体、例えば塩溶液は、ナノポア対応層の反対側（すなわち、ナノポアを作製する前のナノポア膜）に位置付けることができる。ナノポアモジュールは、例えば、限定されないが、ＰＤＭＳ、圧力、ワックス、接着剤等の任意の好適な方法を使用して、ＤＭＦモジュールから封止され、それにより穴内の液体体積が、ナノポア膜の反対側の液体体積から単離される。ナノポア対応層を横切る電圧などの電界の印加は、最終的にナノポアの形成につながり、これは、例えば電流トレースにおける絶縁破壊として容易に検出することができる。
ナノポア層内にナノポアを形成した後、いくつかの場合において、ナノポアを物理的に修飾してシグナルをクリーンにするために調整プロセスを実行することができる。いくつかの場合において、調整は、ナノポアに印加される電圧を経時的に変化させることを含む。
ナノポア製造後、ＤＭＦモジュールを再活性化して、転位のための任意の液体前処理ステップ（例えば、ＫＣｌをＬｉＣｌで置き換えるなど、ＤＭＦ中の溶液を置き換える）を完了させることができる。前処理の後、ＤＭＦ液体体積、例えば目的の検体を含有する液体試料を穴の中に位置付けることができる。次いで、ＤＭＦシステムを非活性化し、ナノポアモジュールを、転位事象を可能にしそして検出するために使用可能にし得る。
５．方法およびデバイスの使用の変形
試料中に存在する目的の検体の存在または量を決定する開示された方法、およびマイクロ流体デバイスの使用は、上記のとおりであり得る。開示されたマイクロ流体デバイスの方法および使用はまた、検体を分析するための他の方法を考慮して適合させることができる。周知の変形の例としては、サンドイッチイムノアッセイなどのイムノアッセイ（例えば、モノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ、酵素検出を含む（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワードおよびリバース）、酵素増幅イムノアッセイ技法（ＥＭＩＴ）、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）、一段階抗体検出アッセイ、均一アッセイ、異種アッセイ、キャプチャオンザフライアッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、以下の説明は、上記の方法と重複することがあり、他の場合において、以下の説明は、代替例を提供し得る。
ａ）イムノアッセイ
目的の検体、および／またはペプチドもしくはその断片は、イムノアッセイを使用して分析することができる。目的の検体の存在または量は、本明細書に記載の抗体を使用し、目的の検体への特異的結合を検出することによって決定することができる。任意のイムノアッセイを利用することができる。イムノアッセイは、例えば酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フォワードまたはリバース競合阻害アッセイなどの競合阻害アッセイ、または競合結合アッセイであり得る。いくつかの実施形態では、１つのタグが捕捉抗体および検出抗体に付着している。代替として、捕捉のために用いられる微粒子またはナノ粒子はまた、検出のために機能し得る（例えば、それが何らかの手段によって切断可能なリンカーに付着または会合している場合）。
異種フォーマットが使用されてもよい。例えば、試験試料が対象から得られた後、第１の混合物が調製される。混合物は、目的の検体について評価される試験試料および第１の特異的結合パートナーを含み、第１の特異的結合パートナーおよび試験試料に含まれる任意の目的の検体は、第１の特異的結合パートナー−目的の検体の複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、目的の抗検体抗体またはその断片である。試験試料および第１の特異的結合パートナーを添加して、混合物を形成する順序は重要ではない。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、固相に固定化される。イムノアッセイに使用される固相（第１の特異的結合パートナー、および任意選択で、第２の特異的結合パートナー）は、磁性粒子、ビーズ、ナノビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子、マイクロ粒子、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスク、またはチップ（例えば、マイクロ流体チップ）などであるが、これらに限定されない当技術分野で公知の任意の固相であり得る。
第１の特異的結合パートナー−目的の検体の複合体を含有する混合物が形成された後、当技術分野で公知の任意の技法を使用して、任意の未結合の目的の検体が複合体から除去される。例えば、未結合の目的の検体は、洗浄によって除去することができる。しかしながら、望ましくは、第１の特異的結合パートナーは、試験試料中に存在する目的の全ての検体が第１の特異的結合パートナーによって結合されるように、試験試料中に存在するいかなる目的の検体も超えて存在する。
いかなる未結合の目的の検体も除去した後、第２の特異的結合パートナーを混合物に添加して、第１の特異的結合パートナー−目的の検体−第２の特異的結合パートナーの複合体を形成する。第２の特異的結合パートナーは、好ましくは、第１の特異的結合パートナーによって結合された目的の検体上のエピトープとは異なる目的の検体上のエピトープに結合する目的の抗検体抗体である。さらに、また好ましくは、第２の特異的結合パートナーは、検出可能な標識（例えば、上記のように切断可能なリンカーによって結合された標識）で標識されるか、またはそれを含む。
固定化抗体またはその断片の使用は、イムノアッセイに組み込まれてもよい。抗体は、磁性またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、ラテックス粒子または修飾表面ラテックス粒子、ポリマーまたはポリマーフィルム、プラスチックまたはプラスチックフィルム、平面基板、マイクロ流体表面、固体基材材料片等の様々な支持体に固定化することができる。
ｂ）サンドイッチイムノアッセイ
サンドイッチイムノアッセイは、抗体の２つの層（すなわち捕捉抗体（すなわち少なくとも１つの捕捉抗体））と検出抗体（すなわち少なくとも１つの検出抗体）との間の抗原の量を測定する。捕捉抗体および検出抗体は、抗原上の異なるエピトープ、例えば目的の検体に結合する。望ましくは、捕捉抗体のエピトープへの結合は、検出抗体のエピトープへの結合を干渉しない。サンドイッチイムノアッセイにおける捕捉抗体および検出抗体として、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを使用することができる。
一般に、試験試料中の目的の検体を分離し定量するために、少なくとも２つの抗体が用いられる。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する目的の検体または目的の検体断片の、ある特定のエピトープに結合する。試験試料中の目的の検体を捕捉するために１つ以上の抗体を使用することができ（これらの抗体は、しばしば「捕捉」抗体または「捕捉」抗体（複数）と呼ばれる）、目的の検体にも結合する検出可能な標識（例えば、切断可能なリンカーによって付着されたタグ）を有する１つ以上の抗体（これらの抗体は、しばしば「検出」抗体または「検出」抗体（複数）と呼ばれる）を使用して、サンドイッチを完成させることができる。いくつかの実施形態では、アプタマーは、第２の結合メンバーとして使用され得、検出可能なタグとして役立ち得る。サンドイッチアッセイでは、抗体のそのエピトープへの結合は、アッセイ中の任意の他の抗体の、それぞれのエピトープへの結合によって減少しないことが望ましい。言い換えれば、目的の検体を含むことが疑われる試験試料と接触した１つ以上の第１の抗体が、第２の抗体または後続の抗体によって認識されるエピトープの全部または一部に結合しないように選択され、それにより１つ以上の第２の検出抗体が目的の検体に結合する能力を干渉する。
好ましい実施形態では、目的の検体を含むことが疑われる試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体（単数または複数）および少なくとも１つの検出抗体と同時にまたは順次に接触させることができる。サンドイッチアッセイフォーマットでは、目的の検体（目的の膜関連検体、目的の可溶性検体、目的の膜関連検体の断片、目的の可溶性検体の断片、目的の検体の変異体（目的の膜会合型もしくは可溶性の検体）またはそれらの任意の組み合わせ））を含むことが疑われる試験試料を、最初に、抗体−目的の検体の複合体の形成を可能にする条件下で特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体と接触させる。複数の捕捉抗体を使用する場合、多重捕捉抗体−目的の検体の複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、抗体、好ましくは少なくとも１つの捕捉抗体は、試験試料中に予想される最大量の目的の検体または目的の検体断片のモル過剰量で使用される。
任意選択で、試験試料を少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができ、これは試験試料からの抗体−目的の検体の複合体の分離を促進する。平面基板またはビーズ等の形態でポリマー材料から作製された固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の固体支持体を使用することができる。抗体（単数または複数）は、吸着によって、化学カップリング剤を使用する共有結合によって、または当技術分野で公知の他の手段によって、固体支持体に結合することができるが、そのような結合が目的の検体または目的の検体断片に結合する抗体の能力を干渉しないことを条件とする。さらに、必要であれば、固体支持体を誘導体化して、抗体上の様々な官能基との反応性を可能にすることができる。そのような誘導体化は、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキニル、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの、ある特定のカップリング剤の使用を必要とする。
目的の検体を含むことが疑われる試験試料を少なくとも１つの捕捉抗体と接触させた後、捕捉抗体（または複数の捕捉抗体）−目的の検体の複合体の形成を可能にするために、試験試料をインキュベートする。インキュベーションは、約４．５〜約１０．０のｐＨ、約２℃〜約４５℃の温度、少なくとも約１分〜約１８時間、約２〜６分、または約３〜４分の期間にわたって実行することができる。
捕捉抗体（複数の抗体）−目的の検体の複合体の形成後、複合体は、少なくとも１つの検出抗体と（捕捉抗体（複数の抗体）−目的の検体−検出抗体（複数の抗体）の複合体の形成を可能にする条件下で）接触させられる。捕捉抗体−目的の検体の複合体が、１つより多い検出抗体と接触する場合、次いで捕捉抗体（複数の抗体）−目的の検体−検出抗体（複数の抗体）検出複合体が形成される。捕捉抗体と同様に、少なくとも１つの検出（およびその後の）抗体を捕捉抗体−目的の検体の複合体と接触させるとき、捕捉抗体（複数の抗体）−目的の検体−検出抗体（複数の抗体）の複合体の形成には、上記と同様の条件下でのインキュベーション期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識（例えば、切断可能なリンカーによって付着されたタグ）を含む。検出可能な標識は、捕捉抗体（複数の抗体）−目的の検体−検出抗体（複数の抗体）の複合体の形成の前に、それと同時に、またはその後に、少なくとも１つの検出抗体に結合することができる。当技術分野で公知の任意の検出可能な標識、例えば、本明細書で考察されるような切断可能なリンカー、および当技術分野で公知の他のものを使用することができる。
試験試料および特異的結合パートナー（複数可）を添加してアッセイ用の混合物を形成する順序は重要ではない。第１の特異的結合パートナーが、検出可能に標識されている場合（例えば、切断可能なリンカーで付着されたタグ）、次いで検出可能に標識された第１の特異的結合パートナー−目的の検体の複合体が形成される。代替として、第２の特異的結合パートナーが使用され、第２の特異的結合パートナーが検出可能に標識されている場合（例えば、切断可能なリンカーで付着されたタグ）、第１の特異的結合パートナー−目的の検体−第２の特異的結合パートナーの検出可能に標識された複合体が形成される。標識されていてもいなくても、任意の未結合の特異的結合パートナーは、洗浄などの当技術分野で公知の任意の技法を使用して混合物から除去することができる。
次に、目的の検体またはその断片の存在を示すシグナルが生成される。生成されたシグナルのパラメータに基づいて、試料中の目的の検体の量を定量することができる。任意選択で、標準曲線は、質量分析法、重量法、および当技術分野で知られている他の技法によって、既知濃度の目的の検体の段階希釈物または溶液を使用して生成することができる。
ｃ）フォワード競合阻害
フォワード競合フォーマットでは、既知の濃度の標識された目的の検体（例えば、切断可能なリンカーで付着されたタグを有する検体）のアリコートが、目的の検体抗体への結合について試験試料中の目的の検体と競合するために使用される。
フォワード競合アッセイでは、固定化された特異的結合パートナー（例えば、抗体）を、試験試料および標識された目的の検体、目的の検体の断片またはそれらの目的の検体の変異体と順次または同時に接触させることができる。目的の検体ペプチド、目的の検体断片、または目的の検体変異体は、切断可能なリンカーで付着されたタグを含む検出可能な標識を含む、任意の検出可能な標識で標識することができる。このアッセイでは、抗体を固体支持体上に固定化することができる。あるいは、抗体は、微粒子または平面基板などの固体支持体上に固定化されている抗種抗体などの抗体に結合することができる。
本明細書に提供されるのは、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法である。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを測定することが評価され、層を通って転位するタグの数が、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを検出することが評価され、層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
本明細書に提供されるのは、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法である。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含む、接触させることと、結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、結合メンバーに結合した標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを測定することが評価され、層を通って転位するアプタマーの数は、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを検出することが評価され、層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
目的の標識検体、試験試料および抗体を、サンドイッチアッセイフォーマットに関して上記したものと同様の条件下でインキュベートする。次いで、２つの異なる種の抗体−目的の検体の複合体が生成され得る。具体的には、生成された抗体−目的の検体の複合体のうちの１つは、検出可能な標識（例えば、タグ）を含むが、他の抗体−目的の検体の複合体は、検出可能な標識を含まない。抗体−目的の検体の複合体は、検出可能な標識の定量化の前に、試験試料の残りから分離することができるが、そうである必要はない。抗体−目的の検体の複合体が試験試料の残りの部分から分離されているかどうかにかかわらず、その後、抗体−目的の検体の複合体中の検出可能な標識の量を定量する。試験試料中の目的の検体（目的の膜関連検体、目的の可溶性検体、目的の可溶性検体の断片、目的の検体の変異体（対象の膜関連もしくは可溶性検体）、またはそれらの任意の組み合わせ）の濃度は、次いで、例えば上記のように決定することができる。有用ならば、抗体−目的の検体の複合体中の検出可能な標識の量を標準曲線と比較することによって、決定を行うことができる。標準曲線は、目的の検体の段階希釈（目的の膜関連検体、目的の可溶性検体、目的の可溶性検体の断片、目的の検体の変異体（膜関連または可溶性検体）など）を使用して生成することができ、濃度は、質量分析法、重量分析法、および当技術分野で公知の他の技法によって決定される。
任意選択で、抗体−目的の検体の複合体は、サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上述した固体支持体などの固体支持体に抗体を結合させ、次いで試験試料の残りを固体支持体との接触から分離することができる。
ｄ）リバース競合アッセイ
リバース競合アッセイでは、目的の固定化検体を、試験試料および少なくとも１つの標識抗体と順次または同時に接触させることができる。
本明細書に提供されるのは、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法である。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、固定化された検体と接触させることであって、固定化された検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、固定化された検体に結合していない結合メンバーを除去することと、固定化された検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを測定することが評価され、層を通って転位するタグの数が、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するタグを検出することが評価され、層を通って転位するタグを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
本明細書に提供されるのは、生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法である。この方法は、試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、固定化された検体と接触させることであって、固定化された検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、固定化された検体に結合していない結合メンバーを除去することと、固定化された検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを測定することが評価され、層を通って転位するアプタマーの数は、試料中に存在する検体の量を測定する。いくつかの実施形態では、層を通って転位するアプタマーを検出することが評価され、層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する。
目的の検体は、サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上述した固体支持体などの固体支持体に結合することができる。
目的の固定化検体、試験試料および少なくとも１つの標識抗体を、サンドイッチアッセイフォーマットに関して上記のものと同様の条件下でインキュベートする。次いで、２つの異なる種の目的の検体−抗体の複合体が生成される。具体的には、生成された目的の検体−抗体の複合体のうちの１つは、固定化され、検出可能な標識（例えば、切断可能なリンカーで付着されたタグ）を含み、一方で他の目的の検体−抗体の複合体は、固定化されず、検出可能な標識を含む。固定化されていない目的の検体−抗体の複合体および残りの試験試料は、洗浄などの当技術分野において公知の技法を介して、固定化された目的の検体−抗体の複合体の存在から除去される。一旦固定化されていない目的の検体−抗体の複合体が除去されると、固定化された目的の検体−抗体の複合体中の検出可能な標識の量がタグの切断後に定量される。次いで、試験試料中の目的の検体の濃度は、上記のように検出可能な標識の量を比較することによって決定され得る。有用ならば、これは標準曲線を使用して行うことができる。標準曲線は、質量分析法、重量分析法および当技術分野で公知の他の技法によって決定される、公知濃度の目的の検体または目的の検体の断片の段階希釈物を使用して生成することができる。
ｅ）ワンステップイムノアッセイまたはキャプチャオンザフライアッセイ
ワンステップイムノアッセイまたはキャプチャオンザフライアッセイでは、固体基材を固定化剤で予めコーティングする。捕捉剤、検体および検出剤を一緒に固体基材に添加し、続いて検出前に洗浄ステップを行う。捕捉剤は検体と結合することができ、固定化剤のためのリガンドを含む。捕捉剤および検出剤は、抗体、または本明細書に記載されているか、もしくは当技術分野において公知の捕捉または検出が可能な任意の他の部分であり得る。リガンドは、ペプチドタグを含み、固定化剤は、抗ペプチドタグ抗体を含み得る。代替として、リガンドおよび固定化剤は、キャプチャオンザフライアッセイに用いられるために一緒に結合することができる任意の対の作用物質（例えば、特異的結合対、および他の当技術分野で公知のものなど）であり得る。複数の検体を測定することができる。いくつかの実施形態では、固体基材を抗原でコーティングすることができ、分析される検体は抗体である。
いくつかの実施形態では、固定化剤（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン等）で予めコーティングされた固体支持体（微粒子など）、ならびに少なくとも第１の特異的結合メンバーおよび第２の特異的結合メンバー（それぞれ捕捉試薬および検出試薬として機能する）として機能する）が使用される。第１の特異的結合メンバーは、固定化剤に対するリガンド（例えば、固体支持体上の固定化剤がストレプトアビジンである場合、第１の特異的結合メンバー上のリガンドはビオチンであり得る）を含み、また目的の検体に結合する。第２の特異的結合メンバーは、検出可能な標識を含み、目的の検体に結合する。固体支持体ならびに第１および第２の特異的結合メンバーは、試験試料に（順次または同時に）添加され得る。第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、固体支持体上の固定化剤に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバーの複合体を形成する。試料中に存在する任意の目的の検体は、固体支持体／第１の特異的結合メンバーの複合体に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／検体の複合体を形成する。第２の特異的結合メンバーは、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／検体の複合体に結合し、検出可能な標識が検出される。検出の前に、任意の洗浄ステップを用いてもよい。ある特定の実施形態では、ワンステップアッセイにおいて、２つ以上の検体が測定され得る。ある特定の他の実施形態では、３つ以上の特異的結合メンバーを用いることができる。ある特定の他の実施形態では、複数の検出可能な標識を付加することができる。ある特定の他の実施形態では、目的の複数の検体を検出することができる。
ワンステップイムノアッセイまたはキャプチャオンザフライアッセイの使用は、本明細書中に記載され、当技術分野で公知の種々のフォーマットで行われ得る。例えば、フォーマットは上記のようなサンドイッチアッセイであり得るが、代替として競合アッセイであり得、単一の特異的結合メンバーを用い得るか、または公知のような他の変形を使用し得る。
ｆ）組み合わせアッセイ（Ａｇ／Ａｂによる微粒子の同時コーティング）
組み合わせアッセイでは、微粒子などの固体基材を抗原および抗体で同時コーティングして、それぞれ試料から抗体および抗原を捕捉する。固体支持体は、試料から２つ以上の異なる抗体を捕捉するために、２つ以上の異なる抗原で同時コーティングされてもよい。固体支持体は、試料から２つ以上の異なる抗原を捕捉するために、２つ以上の異なる抗体で同時コーティングされてもよい。
さらに、本明細書に記載の方法は、アッセイ化合物間の特異的または非特異的結合反応（例えば、ＨＡＭＡの懸念）を防ぐためにブロッキング剤を使用してもよい。作用物質（および任意選択で、任意の対照）が支持体上に固定化されると、作用物質の残りの結合部位は、支持体上でブロックされ得る。当業者に知られている任意の好適なブロッキング試薬を使用することができる。例えば、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、ＰＢＳ中のカゼインのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）溶液、Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、または他の好適な界面活性剤、ならびに他のブロッキング試薬を用いてもよい。
本開示から明らかなように、変形を含む、本明細書に開示される方法およびデバイスは、疾患、障害、または病態を有することが疑われる対象における疾患、障害、または病態を診断するために使用され得る。例えば、試料分析は、癌マーカー、心臓病態のマーカー、毒素、ウイルスなどの病原体、細菌、またはそれらの一部などの疾患マーカーを検出するのに有用であり得る。方法およびデバイスはまた、生物学的試料中に存在する検体を測定するために使用され得る。方法およびデバイスはまた、標的検体を検出するための血液スクリーニングアッセイにおいても使用され得る。血液スクリーニングアッセイを使用して、血液供給をスクリーニングすることができる。
６．カウントおよびデータ分析
転位事象の数は、当技術分野で公知の任意の日常的技法を使用して定性的または定量的に決定され得る。いくつかの実施形態では、転位事象の数は、実験的試験条件下、以下の等式を使用して、二本鎖ＤＮＡ転位事象において見出される予想される電流変化を最初に計算することによって決定することができ、
Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８およびＫｗｏｋ，Ｈ．；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｋ．；ａｎｄ Ｔａｂａｒｄ−Ｃｏｓｓａ，Ｖ．；″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″−ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３）：ｅ９２８８０（２０１４）において参照される。この予想される電流遮断値を使用して、実験的ナノポア出力のバイナリファイルデータを、許容可能な予想される現在の遮断事象について視覚的にまたは手動で走査することができる。これらの事象を使用して、ＣＵＳＵＭナノポアソフトウェアに必要な閾値およびヒステリシスパラメータを適用して実行することができる。このソフトウェアからの出力は、ｃｕｓｕｍｔｏｏｌｓ ｒｅａｄｅｖｅｎｔｓ．ｐｙソフトウェアを使用し、１０００ｐＡを超える（最初の計算から決定される）遮断事象をフィルタリングして、さらに分析することができる。流動事象、事象間の時間および他の計算は、ｒｅａｄｅｖｅｎｔｓ．ｐｙ分析ツールから決定することができる。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を使用して、ＣＵＳＵＭ生成データに対して追加の計算を行うことができる。当技術分野において公知のデータ分析のための閾値設定の他の方法が使用され得る。
７．定性的分析
定性的アッセイは、本明細書中に記載される方法およびステップのプロセスを使用して行われ得る。図２５に示されているチオールベースの切断ステップを用いて、実施例１７に記載されているように、切断可能なリンカー接合体を使用して直接アッセイを実施することができる。そのようなアッセイを実施するための他の切断可能なリンカー手法はまた、本明細書中に記載されるように、種々のタグのカウントを可能にするための、リンカーの切断の種々の他の方法を含み得るがこれらに限定されないことが理解される。さらに、アプタマーを用いることができる。例えば、実施例１７に記載の方法に加えて、そのような他の代替の切断方法および／または試薬は、本明細書に記載され、当業者に知られている他の切断方法に加えて、実施例１６、実施例１８、実施例１９、実施例２０および実施例２１に記載のものを含み得る。この実施例（実施例２４）において実証されたアッセイフォーマットは、直接アッセイを表すが、サンドイッチイムノアッセイフォーマットおよび／または様々な競合アッセイフォーマットなどの、当業者に知られているものなどのキャプチャオンザフライフォーマットを含む他のフォーマットが、記載された方法を使用してアッセイを実施するために同様に実施され得ることも理解される。
例えば、実施例９に記載されているように、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の検出のためのサンドイッチイムノアッセイフォーマットは、低コストＤＭＦチップ上でそのようなアッセイを実施する能力を実証した。さらに、他の方法で当業者に知られている他の切断可能なリンカーに加えて、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載されているものなどの様々なヘテロ二官能性の切断可能なリンカーを使用して、イムノ接合体の生成に有用な多数の様々なバイオ接合試薬または切断可能なリンカーを有する他の活性特異的結合メンバーが合成され得る。本発明の実施に有用な免疫接合体は、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載されるものなどの方法によって、ならびに当業者に公知の他の方法によって合成することができる。さらに、実施例８は、サンドイッチおよび競合アッセイフォーマットを含み、キャプチャオンザフライフォーマットむ様々なアッセイフォーマット、ならびに当業者に知られているそれらの他の変形を実行するために必要な様々なステップを容易にすることができる、低コストチップ上の様々な液滴操作の機能を示す。実施例１１は、アッセイにおいて切断可能な標識をカウントするために使用することができるナノポアの製造を示すが、当業者に知られているナノポア製造のための他の方法もまた、この目的のために使用することができることが理解される。実施例１６はまた、切断が行われるアッセイの実施に有用な別の構築物を表し、したがって、この実施例に記載されるように、ナノポアカウント法を使用してカウントできるように、カウント可能な標識が遊離される。この構築物および当業者に明らかである他のものは、本明細書に記載されるようなアッセイにおいて使用され得る。
実施例２２は、一般に、ナノポアを横断する様々な標識の存在に関する転位事象を測定することができるように、カウントをどのようにして行うことができるかを示す。図２９は、カウントアッセイにおいてデータの質を操作することができるようにするための、シグナルの閾値化の概念を示す。図２８は、この実施例に記載されるようなアッセイ方法を使用して、検体の存在を決定するために使用され得るデータの種類を表す定性的アッセイデータを示す。この特定の実施例では、ｄｓＤＮＡを標識として使用したが、ナノビーズ、デンドリマー等を含むがこれらに限定されない実施例５および／または実施例２２に記載の標識などの他の標識を利用することもできる。さらに、他の公知の標識もまた用いることができる。適切な試薬を生成するために必要とされるそのような構築物は、本出願において本明細書に記載される様々な実施例を通して、またはそうでなければ当業者に知られている方法を介して合成され得る。
８．定量的分析
定量的アッセイは、本明細書に記載されるような方法およびステップのプロセスを使用して実施され得る。図２５に示されているチオールベースの切断ステップを用いて、実施例１７に記載されているように、切断可能なリンカー接合体を使用して直接アッセイを実施することができる。そのようなアッセイを実施するための他の切断可能なリンカー手法はまた、本明細書中に記載されるように、ナノポアを使用する種々のタグのカウントを可能にするための、リンカーの切断の種々の他の方法を含み得るがこれらに限定されないことが理解される。さらに、アプタマーを用いることができる。例えば、実施例１７に記載の方法に加えて、そのような他の切断方法としては、本明細書に記載され、当業者に知られている方法に加えて、実施例１８、実施例１９、実施例２０および実施例２１に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。この実施例（実施例２５）において実証されたアッセイフォーマットは、直接アッセイを表すが、サンドイッチイムノアッセイフォーマットおよび／または様々な競合アッセイフォーマットなどの、当業者に知られているようなキャプチャオンザフライフォーマットを含む他のフォーマットが、アッセイを実施するために同様に実施され得ることも理解される。
例えば、実施例９に記載されているように、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の検出のためのサンドイッチイムノアッセイフォーマットは、低コストＤＭＦチップ上でそのようなアッセイを実施する能力を実証した。さらに、他の方法で当業者に知られている他の切断可能なリンカーに加えて、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載されているものなどの様々なヘテロ二官能性の切断可能なリンカーを使用して、イムノ接合体の生成に有用な多数の様々なバイオ接合試薬または切断可能なリンカーを有する他の活性特異的結合メンバーが、当業者により合成され得る。さらに、実施例８は、サンドイッチおよび競合アッセイフォーマットを含み、キャプチャオンザフライフォーマットを含む様々なアッセイフォーマット、ならびに当業者に知られているそれらの他の変形を実行するために必要な様々なステップを容易にすることができる、低コストチップ上の様々な液滴操作の機能を示す。実施例１６はまた、切断が行われるアッセイの実施に有用な別の構築物を表し、したがって、この実施例に記載されるように、ナノポアカウント法を使用してカウントできるように、カウント可能な標識が遊離される。この構築物ならびに当業者に明らかである他のものは、本明細書に記載されるようなアッセイにおいて使用され得る。
実施例２２は、一般に、ナノポアを横断する標識の存在に関する転位事象を測定することができるように、カウントをどのようにして行うことができるかを示す。図２９は、カウントアッセイにおいてデータの質を操作することができるようにするための、シグナルの閾値化の概念を示す。図３１、３２および３３は、この実施例に記載されるようなアッセイ方法を使用して、検体の量を決定するために使用され得るデータの種類を表す定性的アッセイデータ出力を示す。図３４は、化学的方法を使用して切断された構築物から生成された標準曲線を示す。この特定の実施例では、ｄｓＤＮＡを標識として使用したが、ナノビーズ、デンドリマー等を含むがこれらに限定されない実施例５に記載の標識などの他の標識を利用することもできる。さらに、他の公知の標識もまた用いることができる。適切な試薬を生成するために必要とされるそのような構築物は、本明細書に記載されるように、または当業者に知られている方法を介して合成され得る。
９．キットおよびカートリッジ
本明細書ではまた、開示されたデバイスを用いてまたは用いずに、上記の方法を実施する際に使用するためのキットも提供される。このキットは、開示されたデバイスを用いて検体を分析するための説明書を含み得る。キットに含まれる説明書は、包装材料に添付されてもよく、または添付文書として含まれてもよい。説明書は、書面または印刷物であってもよいが、それに限定されない。そのような説明書を保存し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「説明書」は、その説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
このキットは、上述のように、内蔵ナノポアモジュールと共にマイクロ流体モジュールを含むカートリッジを含んでもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールは、一緒に可逆的に集積するための別々のコンポーネントであり得るか、または完全にまたは不可逆的にカートリッジに集積され得る。カートリッジは使い捨てであり得る。カートリッジは、上に開示された方法を実施するのに有用な１つ以上の試薬を含み得る。カートリッジは、１つ以上の別々の組成物として、または任意選択で、試薬の適合性が許す場合の混和物として、試薬を保持する１つ以上の容器を含み得る。カートリッジはまた、緩衝液（複数可）、希釈剤（複数可）、標準物質（複数可）（例えば、較正物質および対照）、ならびに／または試料処理、洗浄、もしくはアッセイの任意の他のステップの実施において有用な任意の他の材料などの、ユーザの観点から望ましい可能性がある他の材料（複数可）を含み得る。カートリッジは、上記の特異的結合メンバーのうちの１つ以上を含み得る。
代替としてまたは追加として、キットは、較正物質または対照、例えば、精製された、および任意選択で凍結乾燥した目的の検体、またはカートリッジ上の液体、ゲル、もしくは他の形態の、または別個の目的の検体、ならびに／あるいは上記のデバイスおよび方法と共に使用するための少なくとも１つの容器（例えば、チューブ、マイクロタイタープレート、もしくはストリップ）、および／またはアッセイ緩衝液もしくは洗浄緩衝液などの緩衝液（それらのうちのいずれか１つは、濃縮溶液として提供され得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイを行うのに必要な全ての構成要素、すなわち試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤等を含む。説明書はまた、標準曲線を生成するための説明書を含み得る。
キットは、目的の検体を定量するための参照標準をさらに含み得る。参照標準は、目的の検体濃度の内挿および／または外挿のための標準曲線を確立するために用いられ得る。キットは、濃度レベルに関して異なる参照標準を含み得る。例えば、キットは、高濃度レベル、中濃度レベル、または低濃度レベルのいずれかを有する１つ以上の参照標準を含み得る。参照標準の濃度範囲に関しては、これはアッセイごとに最適化することができる。参照標準の例示的な濃度範囲としては、例えば、約１０ｆｇ／ｍＬ、約２０ｆｇ／ｍＬ、約５０ｆｇ／ｍＬ、約７５ｆｇ／ｍＬ、約１００ｆｇ／ｍＬ、約１５０ｆｇ、約２００ｆｇ／ｍＬ、約２５０ｆｇ／ｍＬ、約５００ｆｇ／ｍＬ、約７５０ｆｇ／ｍＬ、約１０００ｆｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約７５０ｐｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２．５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２２５ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２７５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約４２５ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４６５ｎｇ／ｍＬ、約４７５ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約５２５ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５７５ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ、約７２５ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７６５ｎｇ／ｍＬ、約７７５ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ、約８２５ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８７５ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ、約９２５ｎｇ／ｍＬ、約９５０ｎｇ／ｍＬ、約９７５ｎｇ／ｍＬ、約１０００ｎｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約１０００μｇ／ｍＬ、約２０００μｇ／ｍＬ、約３０００μｇ／ｍＬ、約４０００μｇ／ｍＬ、約５０００μｇ／ｍＬ、約６０００μｇ／ｍＬ、約７０００μｇ／ｍＬ、約８０００μｇ／ｍＬ、約９０００μｇ／ｍＬ、または約１００００μｇ／ｍＬが挙げられるが、これらに限定されない。
キットで提供される任意の特異的結合メンバーは、例えば蛍光体、酵素、アプタマー、ビーズ、ナノ粒子、微粒子、ポリマー、タンパク質、ビオチン／アビジン標識等のタグもしくは標識を組み込み得るか、あるいはキットは、特異的結合メンバーを標識するための試薬、または特異的結合メンバーを検出するためおよび／もしくは検体を標識するための試薬、または検体を検出するための試薬を含み得る。必要に応じて、キットは、１つ以上の異なるタグまたは標識を含み得る。キットはまた、切断媒介試薬などの、切断を誘発するための成分を含み得る。例えば、切断媒介試薬は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）ＴＣＥＰなどの還元剤を含み得る。特異的結合メンバー、較正物質、および／もしくは対照は、別々の容器に入れて提供するか、または適切なアッセイフォーマットもしくはカートリッジに予め分注することができる。タグは、開示されたデバイスを使用して検出されてもよい。
キットは、例えば、多重化アッセイにおいて試料中の１つ以上の標的検体を検出するための１つ以上の特異的結合メンバーを含み得る。キット中の異なる種類の特異的結合メンバーの数は、キットの意図する用途に応じて広範囲におよび得る。キット中の特異的結合メンバーの数は、１〜約１０、またはそれ以上の範囲であり得る。例えば、キットは、１〜１０個の特異的結合メンバー、１〜９個の特異的結合メンバー、１〜８個の特異的結合メンバー、１〜７個の特異的結合メンバー、１〜６個の特異的結合メンバー、１〜５個の特異的結合メンバー、１〜４個の特異的結合メンバー、１〜３個の特異的結合メンバー、１〜２個の特異的結合メンバー、２〜１０個の特異的結合メンバー、２〜９個の特異的結合メンバー、２〜８個の特異的結合メンバー、２〜７個の特異的結合メンバー、２〜６個の特異的結合メンバー、２〜５個の特異的結合メンバー、２〜４個の特異的結合メンバー、３〜１０個の特異的結合メンバー、３〜９個の特異的結合メンバー、３〜８個の特異的結合メンバー、３〜７個の特異的結合メンバー、３〜６個特異的結合メンバー、３〜５個の特異的結合メンバー、３〜４個の特異的結合メンバー、４〜１０個の特異的結合メンバー、４〜９個の特異的結合メンバー、４〜８個の特異的結合メンバー、４〜７個の特異的結合メンバー、４〜６個の特異的結合メンバー、５〜１０個の特異的結合メンバー、５〜９個の特異的結合メンバー、５〜８個の特異的結合メンバー、５〜７個の特異的結合メンバー、５〜６個の特異的結合メンバー、６〜１０個の特異的結合メンバー、６〜９個の特異的結合メンバー、６〜８個の特異的結合メンバー、６〜７個の特異的結合メンバー、７〜１０個の特異的結合メンバー、７〜９個の特異的結合メンバー、７〜８個の特異的結合メンバー、８〜１０個の特異的結合メンバー、８〜９個の特異的結合メンバー、または９〜１０個の特異的結合メンバーを含み得る。１つ以上の特異的結合メンバーの各々は、異なる標的検体に結合し得、各特異的結合メンバーは、異なるタグおよび／またはアプタマーで標識され得る。例えば、キットは、第１の標的検体に結合する第１の特異的結合メンバー、第２の標的検体に結合する第２の特異的結合メンバー、および第３の標的検体に結合する第３の特異的結合メンバー等を含み得、第１の特異的結合メンバーは、第１のタグおよび／またはアプタマーで標識され、第２の特異的結合メンバーは、第２のタグおよび／またはアプタマーで標識され、第３の特異的結合メンバーは、第３のタグおよび／またはアプタマーで標識される等である。１つ以上の特異的結合メンバーに加えて、キットは、１つ以上の追加のアッセイ成分、例えば好適な緩衝媒体等をさらに含み得る。キットはまた、上記のものなどの、タグおよび／またはアプタマーを検出および測定するためのデバイスを含み得る。最後に、キットは、本発明による検体検出の方法において特異的結合メンバーを使用するための説明書を含んでもよく、使用のためのこれらの説明書は、キット包装および／または添付文書に存在してもよい。
任意選択で、キットには、品質管理構成要素（例えば、感度パネル、較正物質、および正の対照）が含まれる。品質管理試薬の調製は、当技術分野において周知であり、種々の免疫診断製品のための挿入シートに記載されている。感度パネルメンバーを任意選択で使用して、アッセイ性能特性を確立し、さらに任意選択で、キット試薬の完全性およびアッセイの標準化の有用な指標である。
キットはまた、任意選択で、診断アッセイを行うか、または例えば緩衝液、塩、酵素、酵素共因子、基質、検出試薬等の品質管理評価を容易にするために必要な他の試薬を含むことができる。試験試料の単離および／または処理のための緩衝液および溶液（例えば、前処理試薬）などの他の成分もまた、キットに含めることができる。キットは、追加として１つ以上の他の対照を含み得る。キットの構成要素のうちの１つ以上は、凍結乾燥することができ、その場合キットは、凍結乾燥された構成要素の再構成に適した試薬をさらに含むことができる。構成要素のうちの１つ以上は、液体形態であり得る。
キットの様々な構成要素は、任意選択で、必要に応じて好適な容器で提供される。キットは、試料を保持または保存するための容器（例えば、尿、唾液、血漿、脳脊髄液、または血清試料用の容器またはカートリッジ、あるいは組織吸引をもたらすために組織を保存、輸送または処理するための適切な容器）をさらに含み得る。適切な場合、キットは、任意選択で、反応容器、混合容器、および試薬または試験試料の調製を容易にする他の成分も含み得る。キットはまた、マイクロサンプリングデバイス、マイクロニードル、または他の低侵襲性の無痛性の採血方法などの様々な採血／転送デバイスなどの、試験試料の取得を支援するための１つ以上の試料収集／取得器具；採血管（複数可）；ランセット；毛細管採血管；他の単一の指先刺し採血方法；頬スワブ、鼻／咽頭スワブ；組織試料を入手、保存、もしくは吸引するための１６ゲージまたは他のサイズの針、パンチ生検用の円形ブレード（例えば、１〜８ｍｍ、もしくは他の適切なサイズ）、外科用ナイフもしくはレーザー（例えば、特に手持ち式）、注射器、滅菌容器、またはカニューレ等を含み得る。キットは、関節吸引、円錐生検、穿孔生検、細針吸引生検、画像誘導経皮針吸引生検、気管支肺胞洗浄、内視鏡生検、および腹腔鏡生検を補助するための１つ以上の器具を含み得る。
タグまたは検出可能な標識が、少なくとも１つのアクリジニウム化合物であるか、またはそれを含む場合、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシアミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステル、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。タグまたは検出可能な標識が、少なくとも１つのアクリジニウム化合物であるか、またはそれを含む場合、キットはまた、緩衝液、溶液、および／または少なくとも１つの塩基性溶液などの過酸化水素源を含み得る。必要に応じて、キットは、磁性粒子、ビーズ、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスク、またはチップなどの固相を含むことができる。
所望される場合、キットは、試験試料を別の検体についてアッセイするための、１つ以上の成分を、単独でまたは使用説明書と組み合わせてさらに含むことができ、これらは感染症、心臓病、代謝性疾患、甲状腺疾患等の疾患状態または障害のバイオマーカーなどのバイオマーカーであり得る。
本発明は、本明細書に提供される非限定的な実施例によって例示される複数の態様を有する。
集積ＤＭＦ−電気化学的／電気的／光学的検出チップ、デバイス、およびシステム
前述のセクションで述べたように、検体検出チップを操作して試料を調製し、検体検出チップ内の調製された試料から検体関連シグナルを検出するように構成された検体検出デバイスが開示されている。検体検出チップは、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）領域と、ＤＭＦ領域と重なり得るか、または空間的に分離されていてもよい検体検出領域と、を含んでもよい。前のセクションに記載されるように、ＤＭＦ領域およびナノポア領域は、動作可能に接続されているか、または単一のカートリッジに集積されていることがある個々のデバイスに分離することができる。部分的にまたは完全に集積されたデバイスのＤＭＦ領域およびナノポア領域に作用して、液滴の移動に影響を及ぼし、ナノポアからの電気シグナルを検出するための器具もまた、本明細書に提供される。この器具については、前のセクションで詳細に説明されている。この器具は、異なるタイプの検体検出デバイスを操作するための構成要素をさらに含み得、このデバイスは、臨床化学を実施するためのカートリッジであり得る。
ある特定の場合において、臨床化学は、基質に対する酵素の作用によって生成される電気化学種または発色反応産物の検出を含み得る。例えば、基質は、試料中に存在する検体であり得、酵素は、検体に特異的であり得、検体と触媒的に反応して電気化学種または着色反応産物を生成し得る。他の場合において、臨床化学は、第１の結合メンバーを使用して検体を捕捉して、検体および第１の結合メンバーを含む第１の複合体を生成することと、その複合体を、検体に結合する第２の結合メンバーと接触させて、検体、第１の結合メンバー、および第２の結合メンバーを含む第２の複合体を生成することと、を含み得る。第２の結合メンバーは、好適な基質への曝露時に電気化学種または発色反応産物を生成する酵素に接合している。
ある特定の実施形態では、臨床化学を実施するためのカートリッジの検体検出領域は、検体が試料中に存在するときに生成される電気化学種を検出するための電極を含み得る。そのようなカートリッジはまた、本明細書ではＤＭＦ電気化学チップとも呼ばれる。他の実施形態では、臨床化学を実施するためのカートリッジの検体検出領域は、検体が試料中に存在するときに生成される光学シグナルの検出のために構成されてもよい。そのようなカートリッジは、本明細書ではＤＭＦ光学チップとも呼ばれる。臨床化学を実施するためのカートリッジは、ＤＭＦ電気化学チップと呼ばれることがあることに留意されたい。
さらに他の実施形態では、カートリッジは、電気化学的検出およびナノポア層を使用する検出のために構成された多機能であり得る。そのようなものとして、本明細書に開示されている器具は、複数の単一機能カートリッジ上ならびに多機能カートリッジ（複数可）上で動作することができる。
ＤＭＦ領域を使用して、分析のための液滴を、検出領域に転送することができ、ここで液滴が、電気的に（例えば、ナノポアを使用して）、電気化学的に（例えば、臨床化学を使用して）、および／または光学的に（例えば、臨床化学を使用して）分析される。光学的検出は、比色検出、濁度検出、蛍光検出、および／または画像分析であり得る。画像分析は、検体検出カートリッジからの光学シグナルの検出を含み得る。光学シグナルは、比色、濁度、または蛍光シグナルなどの光シグナルであり得る。電気化学的検出は、電流測定、クーロメトリー、電位差測定、電圧測定、インピーダンス、またはそれらの組み合わせを含み得る。
「検体検出チップ」、「検体検出カートリッジ」という語句、ならびに「チップ」および「カートリッジ」という語句は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に開示される検体検出器具と適合する使い捨てまたは再使用可能な試料処理デバイスを指す。本明細書に開示される検体検出器具はまた、本明細書に提供されるチップ内の試料を処理するために使用される検体検出デバイスとも呼ばれる。ある特定の実施形態では、検体検出チップは、第１の基板と第２の基板とを含み得、第２の基板は、第１の基板上に位置付けられ、ギャップによって第１の基板から分離されている。第１または第２の基板は、複数のＤＭＦ電極を含み得る。複数のＤＭＦ電極は、活性化および非活性化のために個々に制御可能な電極のアレイまたは一連の電極であり得る。複数のＤＭＦ電極は、ＤＭＦ電極を電気的に絶縁するために絶縁材料で覆われてもよい。ある特定の実施形態では、第１の基板と第２の基板との間の空間／ギャップは、空気またはオイルなどの不活性流体で充填されてもよい。ある特定の実施形態では、ＤＭＦ電極は、本明細書の前のセクションに記載されているように配置することができる。例示的な実施形態では、一連のＤＭＦ電極を第１の基板上に配設することができ、単一の電極を第１の基板上の一連の電極と対面構成で第２の基板上に配設することができる。一連の電極および単一電極は、絶縁層で被覆されていてもよい。他の場合において、第１の基板上の一連のまたは複数の電極は、共面電極として構成され、第２の基板は、電極を含まなくてもよい。ＤＭＦ電極の様々な構成は、集積マイクロ流体デバイスおよびナノポアデバイスについて説明している前のセクションに記載されている。ＤＭＦ電極のこれらの構成のいずれも、本明細書に開示されている追加のカートリッジに存在することができる。
前のセクションで説明したように、第１層および／または第２層に存在する電極は、例えばインジウム錫酸化物、フッ素ドープ酸化錫（ＦＴＯ）、ドープ酸化亜鉛等の実質的に透明な材料から製造することができる。さらに、一方または両方の基板は、光学的インタロゲーションを容易にするために実質的に透明であり得る。
検体検出デバイスは、そのデバイスに挿入された検体検出チップ内の光学シグナル、電気化学的、電気的シグナルを検出するための光学的、電気化学的、および／または電気的手段を含み得る。さらに、検体検出デバイスは、検体検出チップに存在するＤＭＦ電極を操作するための手段を含む。本明細書に開示される検体検出デバイスは、カートリッジと相互作用するための１つまたは複数のインターフェースを含み得る。ある特定の場合において、カートリッジインターフェースは、スロットなどの挿入領域であり得る。他の場合において、インターフェースは、カートリッジを受け入れるための凹部であり得、ドアまたは蓋によって包囲され得る。検体検出デバイスは、複数の検体検出チップと適合し得る単一のインターフェースを含み得る。例えば、挿入スロットは、電気化学シグナルを検出する検体検出チップ、光学シグナルを検出する検体検出チップ、および／または電気シグナルを検出する検体検出チップと適合し得る。ある特定の実施形態では、検体検出デバイスは、例えば、複数のチップを使用して異なる試料中の同じ検体を検出するため、または複数の異なるチップを使用して同じ試料中の複数の異なる検体を同時に検出するために、複数の検体検出チップを同時に動作させるように構成され得る。そのような実施形態では、デバイスは、挿入領域などの複数のインターフェースを含むことができる。
本開示の検体検出チップは、任意選択で、血漿分離構成要素を含み得る。ある特定の実施形態では、血漿分離構成要素は、全血試料中に存在する細胞を捕捉し、血漿を濾過して分析のために試料液滴（複数可）に加工することを可能にするフィルタを含み得る。他の実施形態では、血漿分離構成要素は、流体分離要素であり得る。検体検出チップの実施形態を以下に開示する。以下に記載される検体検出チップのうちのいずれも、任意選択で、血漿分離構成要素を含み得る。ある特定の場合において、血漿分離構成要素は、市販の膜であり得る。ある特定の実施形態では、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ．から入手可能なもの（例えば、Ｐｒｉｍｅｃａｒｅ（商標）親水性非対称膜）またはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（例えば、Ｖｉｖｉｄ（商標）血漿分離膜）から入手可能なものなどの市販の膜を、血漿の分離に使用することができる。ある特定の場合において、膜は、本開示のカートリッジに集積されてもよい。他の実施形態では、本開示のチップ、器具、およびシステムは、全血試料中の検体を検出するように構成され得る。
ｉ．ＤＭＦ電気化学検出カートリッジ
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるカートリッジは、重なり合うかまたは空間的に分離されていてもよいＤＭＦ領域および検体検出領域を含む。ＤＭＦ領域を使用して、分析のための液滴を検出領域に転送することができ、ここで液滴は、（臨床化学アッセイで生成された電気化学種の検出のために）電気化学的に分析される。電気化学分析は、試料中の検体の存在によって生成される電気活性種によって発生する電気シグナルを検出する作用電極を利用することによって行われる。電気シグナルは、試料中に存在する検体の量に比例するため、検出された電気シグナルを定量して、試料中の検体の存在または濃度を決定することができる。電気化学的検出は、本開示において提供される器具によって行われる電流測定、クーロメトリー、電位差測定、電圧測定、インピーダンス、またはそれらの組み合わせを含み得る。
ある特定の実施形態では、電気化学種は、検体に対する検体特異的酵素の作用によって生成され得る。他の実施形態では、電気化学種は、基質に対する酵素の作用によって生成されてもよい。そのような実施形態では、酵素は、検体に特異的ではない。むしろ、酵素は、検体に特異的に結合する結合メンバーに接合されている。ある特定の実施形態では、電気化学種によって生成された電気シグナルを増幅するために、酸化還元媒介物質が含まれてもよい。検体特異的酵素および酸化還元媒介物質は周知であり、所望の感受性および／または特異性に基づいて選択され得る。
電気化学種を検出するための電極は、数多くの構成で提供することができる。そのような電極は、ＤＭＦ電極とは別個であり得るか、または電気化学的感知のために電極に修飾されたＤＭＦ電極であり得る。本明細書で提供される器具は、電極のアレイならびに電気化学的感知のための電極に印加される電力を制御する電気回路を含む。ＤＭＦ電極および電気化学的感知用の電極を含む、検体検出チップの例示的な構成は、以下でさらに説明される。
図４８Ａ〜４８Ｆは、本開示のチップ内に存在する電極の概略図を提供する。図４８Ａは、液滴をチップのセンサ領域５１１に転送するために使用されるＤＭＦ電極５１０を示す。センサ領域５１１は、作用電極５１２および参照電極５１３を含む。図４８Ｂは、センサ領域５１１上に位置付けられた液滴５１４を示す。図４８Ｃは、センサ領域５１１、作用電極５１２、および参照電極５１３を示し、ここで電極は半円形であり、共面構成で配設されている。ここには示されていないが、一方の電極を、他方の電極と対面構成に配置することができる。そのような実施形態では、電気化学的検出用のセンサ領域は、作用電極と参照電極とを隔てるギャップを含むことができ、電極は液滴がセンサ領域内に移動すると電気的に接続される。作用電極および参照電極は、リード線５１５を介して接触パッド５１６および５１７に接続されている。接触パッドは、チップを動作させるデバイスに動作可能に接続されている。目的の検体の電気化学的検出のための電極の追加の構成は、図４８Ｄ〜図４８Ｅに示されている。図４８Ｄにおいて、作用電極５１２は円形であり、一方参照電極５１３は弧状であり、作用電極と同心であり、作用電極を取り囲んでいる。図４８Ｅにおいて、センサ領域は、３つの電極、すなわち作用電極５１２、参照電極５１３、および対電極５１８を含む。液滴および電極は、液滴が作用電極および参照電極（および存在する場合には対電極）の両方と接触するようなサイズである。図４８Ｆは、相対サイズの液滴および作用電極を示し、電極（複数可）のサイズおよび形状は、液滴サイズに一致するように構成される。この実施形態では、参照電極が作用電極に面する構成で存在することに留意されたい。作用電極５１３は、第２の直径Ｂを有する液滴５１４よりも小さい第１の直径（Ａ）を有する。第１の直径Ａは、約５０μｍ〜１．９ｍｍであり得る。第２の直径Ｂは、約１００μｍ〜２ｍｍであり得る。液滴直径に対する電極直径の他の比率もまた、本開示のチップにおいて使用され得る。作用電極および参照電極（および存在する場合は対電極）が共面構成にある実施形態では、電極の総面積（電極間の任意のギャップを含む）は、液滴の直径に一致するようなサイズである（図４８Ｂを参照）。
ある特定の実施形態では、図４８Ａ〜図４８Ｆに示すものなどの電気化学センサは、単一の上部電極などのＤＭＦ表面とは反対側の表面上にあってもよい。このようにして、ＤＭＦ電極は、試料液滴を移動させて電気化学センサと接触させることができ、ここで試料液滴は、ＤＭＦ電極とも接触させながら調べることができる。
図４９Ａ〜４９Ｃは、ＤＭＦ電極が電気化学的検出に適した感知電極（５１０Ａ、５１０Ｂ、または５１０Ｃ）に修飾されているＤＭＦ電極（５１０）を含む検体検出チップを示す。図４９Ａにおいて、ＤＭＦ電極５１０Ａは、ＤＭＦ電極上に配設された絶縁層に開口部を形成することによって修飾され、この開口部は、電気化学的感知のための、液滴と修飾ＤＭＦ電極５１０Ａとの間に接触領域を提供する。図４９Ｂにおいて、修飾ＤＭＦ電極５１０Ｂは、液滴と修飾ＤＭＦ電極との間の接触のためにＤＭＦ電極を被覆する絶縁層に複数のピンホール開口部を含む。図４９Ｃにおいて、ＤＭＦ電極は、露光によって除去可能な絶縁層で被覆されている。１つ以上のＤＭＦ電極を光５１１に曝して絶縁層を除去することができ、それによって絶縁層によって被覆されず、したがって液滴に接触することができる修飾ＤＭＦ電極を作成することができる。図４９Ｃにおいて、電極５１０Ｃｈは、露光されて感光性絶縁層を除去し、電極を露出する。ＤＭＦ電極５１０と対面構成で配設されたＤＭＦ電極もまた露出させて、参照電極を提供することができる。例えば、ＤＭＦ電極は、電極５１０Ａ、５１０Ｂ、または５１０Ｃを有する対面構成の領域に１つまたは複数の開口部を含むように修飾することができる。
別の実施形態では、ＤＭＦ電極を第１の基板上に配設し、電気化学的感知用の電極のうちの少なくとも１つを第２の基板上に配設することができる。いくつかの実施形態では、ＤＭＦ電極は、第１の基板上に配設することができ、電気化学的感知用の作用電極および参照電極は、第２の基板上に配設することができる。
ある特定の実施形態では、ＤＭＦ電気化学チップは、毛細管領域を含むことができ、電気化学的感知用の電極は、毛細管領域に配設することができる。毛細管領域は、電気化学的感知の毛細管領域への液滴の移動を容易にすることができる。
ある特定の実施形態では、本開示の検体検出チップは、米国特許第５，２００，０５１号に開示されているような感知領域を含み得る。米国特許第５，２００，０５１号に記載されているように、目的の検体の存在および／または濃度を決定するために有用な感知電極が提供された。感知電極は、検体に対する酵素の作用によって検体に応答して生成された電気化学種を検出する。感知電極は、作用電極とも呼ばれる。文献で知られているように、電気化学種の生成は、酸化還元媒介物質の使用を含み得る。さらに、酵素および／または酸化還元媒介物質は、感知電極に局在する試薬混合物中に存在してもよい。他の場合では、酵素および／または酸化還元媒介物質は、チップに接続されたデポーから酵素および／または酸化還元媒介物質を含む液滴を輸送するためにＤＭＦ電極を用いてチップに導入されてもよい。
他の実施形態では、イムノアッセイを利用することができる。手短に言えば、例示的なイムノアッセイにおいて、検体は、検体に結合する第１の結合メンバー（例えば、受容体、アプタマー、または抗体）によって捕捉されてもよい。任意選択の洗浄ステップの後、検体に結合する二次抗体を使用して複合体を形成することができる。第２の結合メンバー（例えば、抗体またはアプタマー）を酵素に接合してもよく、その酵素は、基質に作用して作用電極によって検出される電気化学種を生成してもよい。ある特定の場合において、酵素は、基質を加水分解し得る。次いで、この加水分解基質は、本開示の検体検出チップを用いて電気化学的に検出される、電気活性種（例えば、二酸素および過酸化水素）の濃度の変化を生じる反応を受けることがある。そのようなイムノアッセイはまた、第２の結合メンバーに接合しているアルカリホスファターゼによって例示される。アルカリホスファターゼは、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート）と反応して、ＤＭＦ電気化学検出チップで電気化学的に検出される電気活性種（二酸素および過酸化水素）の濃度変化を生じる。サンドイッチアッセイおよび競合アッセイの両方が、米国特許第５，２００，０５１号に記載されている手順を使用して達成され得る。これらのアッセイにおいて、ＤＭＦ電極に加えて、作用（または感知）電極および任意選択の参照電極が含まれてもよい。生物活性層を作用電極上に固定化することができ、この生物活性層は、目的の検体に結合する第１の特異的結合メンバー（例えば、受容体または抗体）を含む。他の実施形態では、試料は、ＤＭＦ電極を使用して処理され、電気化学種の検出のために作用／参照電極に輸送されてもよい。
本開示の一実施形態では、検体検出チップを使用して、電気化学種を含む液滴を調製することができる。例えば、試料液滴を、検体に作用する酵素を含む液滴と混合して電気化学種を形成するステップは、チップのＤＭＦ電極と、電気化学種の検出および任意選択で測定のための作用電極および参照電極に移動した電気化学種を含む液滴（またはその一部）と、によって行われ得る。
他の実施形態では、ＤＭＦ電極は、試料液滴を、磁性ビーズに接合した第１の結合メンバー（例えば、受容体または抗体）を含む液滴と混合するステップを行うことができる。得られた液滴は、酵素に接合した二次抗体を含む別の液滴と混合することができる。次いで、得られた液滴を緩衝液滴と混合して、未結合の第２の抗体を洗い流し、液滴を酵素の基質を含む液滴と混合し、基質に対する酵素の作用によって生成された電気化学種を検出するために、得られた液滴を作用／参照電極に移動させることができる。そのような実施形態では、作用電極は、結合メンバー（例えば、検体に結合する受容体、アプタマー、または抗体）の付着によって官能化される必要がないため、同じ検体検出チップを、検出／測定されている検体に特異的な結合メンバーを含有する液滴を単に装填することによって、異なる種類の検体を検出するために使用できる。前のセクションに記載されているものなどの任意のイムノアッセイフォーマットを使用することができる。ＤＭＦ電極は、例えば、前のセクションに記載された方法で、イムノアッセイのための試料調製を行うために利用され得る。
検体が酵素の作用によって直接検出される、開示された検体検出チップによって同様の利点が実現される。例えば、酵素（および酸化還元媒介物質などの追加の試薬）を作用／感知電極上に局在化させる代わりに、試薬を含有する液滴を試料液滴と混合し、検体が試料中に存在するときに酵素によって生成された電気化学種の検出のために、得られた液滴を作用／感知電極に移動させてもよい。そのようなものとして、検出／測定される検体に作用する酵素を含有する液滴を単に装填することによって、同じチップを使用して異なる検体を検出することができる。例えば、グルコースオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼなどの酵素を、グルコースの検出、乳酸の検出には乳酸デヒドロゲナーゼ、クレアチンの検出にはクレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチナーゼ、またはクレアチンキナーゼ等を使用することができる。いくつかの例では、グルコースデヒドロゲナーゼは、ニコチンアミドジヌクレオチドグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＧＤＨ）、ピロールキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）またはフラビン−アデニンジヌクレオチドグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）であり得る。他の実施例では、検体は、β−ヒドロキシブチレート（ケトン）であり得、酵素は、ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼであり得る。
電気化学種の検出に必要な電極（例えば、作用電極および参照電極）のサイズおよび形状は、経験的に決定することができ、または文献に基づくことができる。例えば、電極は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，２００，０５１号に開示されているものと同様であり得る。電極の材料は、電気化学的感知を助長する任意の材料であり得る。例示的な電極材料としては、炭素、白金、金、銀、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、水銀、パラジウム、およびオスミウムが挙げられる。ある特定の場合において、作用電極は、銀から作製され、参照電極は、銀／ハロゲン化銀（例えば、塩化銀）であり得る。
ある特定の実施形態では、作用電極（および任意選択の参照電極）は、選択的透過性層で被覆されてもよい。選択的透過性層は、約１２０ｋＤａ以上の分子量を有する分子を実質的に排除しながら、約５０ｋＤａ以下の分子量を有する分子の自由浸透を可能にし得る。
ある特定の実施形態では、米国特許第５，２００，０５１号に記載されている選択的透過性シラン層を用いることによって、所望の閾値を超える（例えば、約１２０ｋＤａ）を超える分子量を有する干渉電気活性種を、作用電極表面との相互作用から効果的に除外することができる。しかしながら、そのような選択透過層は、二酸素および過酸化水素のような低分子量の電気活性種を低下させて、基礎となる電極表面と酸化還元反応を起こすことを可能にする。そのような選択透過層は、電流測定において特に有用であり得る。
電位差測定において、ある特定のイオノホア化合物のさらなる組み込みに導電性の官能基および化学的特性を有するポリマー材料は、検体検出チップの作用電極上に確立される半透性イオン感受性フィルムとして使用され得る。電極−フィルム界面における電位の発生は、平衡状態で確立された、いくつかの予め選択されたイオン種の電荷密度に依存する。そのようなイオン種の同一性は、半透膜に組み込まれたイオノフォアの選択によって決定される。次に、本明細書に記載のバイオレイヤー中に固定化されている酵素は、試料中に存在する特定の検体の、予め選択されたイオン種への変換を触媒する。本明細書に記載されるように、酵素は、バイオレイヤーに固定化されず、むしろ酵素を含む液滴を試料液滴に輸送するＤＭＦ電極および２つの液滴の融合によって検体に近接させられてもよい。
別の態様では、本開示の検体検出チップは、試料液滴の輸送および任意選択の処理に使用されるＤＭＦ電極、およびイオン、例えばＮａ２＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等の検体の検出に使用される修飾ＤＭＦ電極を含み得る。試料中のイオンを検出するために、修飾ＤＭＦ電極は、ＤＭＦ電極を被覆するイオン不透過性絶縁層の代わりにイオン選択性膜で被覆されてもよい。
酸化還元媒介物質
本開示のチップ中に存在し得るか、または液滴を介して本開示のチップ中に導入され得る酸化還元媒介物質の代表例としては、フェロセンを含むメタロセンなどの有機金属酸化還元種、またはヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）、ルテニウムヘキサミン等の無機酸化還元種が挙げられる。本発明のセンサにおける酸化還元媒介物質として使用可能な追加の好適な電子移動剤は、１つ以上のリガンドを有するオスミウム遷移金属複合体であり、各リガンドは、２，２′−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、１−メチル、２−ピリジルビイミダゾール、またはそれらの誘導体などの窒素含有複素環を有する。電子移動剤はまた、ポリマー中に共有結合した１つ以上のリガンドを有してもよく、各リガンドは、ピリジン、イミダゾール、またはそれらの誘導体などの少なくとも１つの窒素含有複素環を有する。電子移動剤の一例としては、（ａ）ピリジンまたはイミダゾール官能基を有するポリマーまたはコポリマー、および（ｂ）２つのリガンドと複合したオスミウムカチオンが挙げられ、各リガンドが、２，２′−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、または誘導体を含有し、２つのリガンドは必ずしも同じではない。オスミウムカチオンとの複合体形成のための２，２′−ビピリジンのいくつかの誘導体としては、４，４′−ジメチル−２，２′−ビピリジンならびにモノ−、ジ−、およびポリアルコキシ−２，２′−ビピリジン、４，４′−ジメトキシ−２，２′−ビピリジンが挙げられるが、これらに限定されない。オスミウムカチオンとの複合体形成のための１，１０−フェナントロリンの誘導体としては、４，７−ジメチル−１，１０−フェナントロリン、ならびにモノ、ジ、およびポリアルコキシ−１，１０−フェナントロリン、例えば４，７−ジメトキシ−１，１０−フェナントロリンが挙げられるが、これらに限定されない。オスミウムカチオンとの複合体化のためのポリマーとしては、ポリ（１−ビニルイミダゾール）（「ＰＶＩ」と呼ばれる）およびポリ（４−ビニルピリジン）（「ＰＶＰ」と呼ばれる）のポリマーおよびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリ（１−ビニルイミダゾール）の好適なコポリマー置換基には、アクリロニトリル、アクリルアミド、および置換または四級化Ｎ−ビニルイミダゾール、例えば、ポリ（１−ビニルイミダゾール）のポリマーまたはコポリマーに複合体化したオスミウムを有する電子移動剤が含まれる。実施形態は、標準カロメル電極（ＳＣＥ）に対して約−２００ｍＶ〜約＋２００ｍＶの範囲の酸化還元電位を有する電子移動剤を用い得る。
酵素
本開示の検体検出チップと共に使用される酵素は、検出される検体または利用される基質に基づいて（例えば、イムノアッセイにおいて）選択され得る。検体特異的酵素の非限定的な例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレアチニナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチナーゼ、クレアチンキナーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ジアホラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、およびそれらの混合物のうちの１つ以上が挙げられる。
ｉｉ．ＤＭＦ光学チップ
ある特定の実施形態では、検体検出チップを使用して、チップによって分析されている試料中の検体の存在を示す、光学シグナルを発生させることができる。光学シグナルは、例えば、比色シグナル、濁度シグナル、および／または蛍光シグナルであり得る。光学シグナルの大きさは、検体の量に比例してもよく、試料中の検体の存在または濃度を決定するために使用されてもよい。
ある特定の実施形態では、検体検出チップの基板のうちの少なくとも１つは、光学シグナルの検出を容易にするために透明であり得る。さらに、ＤＭＦ電極は透明であり得る。
ＤＭＦ電極を使用して、試料中の検体の存在を示す光学シグナルを発生させるために試料液滴を処理することができる。光学シグナルは、基質に対する酵素の作用によって発生させることができる。比色アッセイ（例えば、臨床化学アッセイにおいて生じる発色反応を検出する）、イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、酵素検出を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害免疫測定法（例えば、フォワードおよびリバース）、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、粒子増強比濁法阻害免疫測定法（ＰＥＴＩＮＩＡ）、均一酵素免疫測定法（ＨＥＩＡ）、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、ワンステップ抗体検出アッセイ、均一アッセイ、不均一アッセイ、キャプチャオンザフライアッセイ等の任意のアッセイフォーマットを用いて、光学シグナルを発生することができる。例示的なアッセイフォーマットが、本明細書に記載される。
測定され得る光学シグナルとしては、蛍光、化学発光、比色、比濁等が挙げられる。ある特定の実施形態では、光学シグナルは、分光光度計を使用して検出され得る。例えば、光学シグナルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２０１５）４０７：７４６７−７４７５に記載されているように検出され得る。この技法では、カスタムマニホールドが、光ファイバーをデジタルマイクロ流体チップと整列させ、デバイスの面内で光学測定を行うことを可能する。デバイス上の液滴の幅対厚さが大きいため、この技法の面内位置合わせは、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）デバイス上の垂直吸光度測定の感度を上回ることを可能にする。他の実施形態では、光学シグナルは、チップに垂直な平面で測定されてもよい。
ある特定の実施形態では、ＤＭＦ光学カートリッジは、カートリッジ内の液滴を照らすための内蔵または別個の構成要素を含み得る。照明された液滴からの光を検出するために、内蔵または別個の構成要素を使用することもできる。例えば、導波路を使用してカートリッジ内の液滴を照らすことができる。液滴からの光学シグナルを検出するために、導波路を使用することもできる。ある特定の場合において、ＤＭＦ光学カートリッジの領域は、導波路材料から製造されてもよい。ある特定の場合において、ＤＭＦ光学カートリッジの一方または両方の基板は、導波路であり得る。最小限の損失で光を伝播することができる任意の好適な導波路を、そのようなカートリッジに使用することができる。
光学シグナル生成は、光源を用いて液滴を照射し、分光計またはＣＭＯＳ検出器などの検出器を使用して液滴からの光を測定することを含み得る。
酵素の作用によって発生したシグナルの光学的検出のための例示的なチップは、Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２０１５）４０７：７４６７−７４７５の図７に示されている。図７は、本明細書では図５０として再現される。図５０に示すように、ＤＭＦチップは、検体が吸収されるＰＰＭディスクを含む。ＤＭＦチップを使用して、反応区域においてＰＰＭディスクから検体フルオレセインを抽出し、検出区域に移動させ、光ファイバーに隣接して位置付けられた。レーザーを使用してフルオレセインを励起し、その発光を光ファイバーを使用して測定した。
ある特定の実施形態では、ＤＭＦ光学チップは、光ファイバーを用いて構成されなくてもよい。これらの実施形態では、液滴を垂直方向から調べて、液滴からの反射光、放射光、または吸光度のいずれかを測定することができる。
ｉｉｉ．ＤＭＦ電気検出チップ
また本明細書で提供されるのは、前のセクションに記載したようにナノポア層を使用して、検体分析用に構成されたＤＭＦチップである。そのようなチップは、試料を処理するためのおよびナノポア層でシグナルを測定するための電極の活性化および非活性化を操作するために構成された回路を含む器具を使用して処理することができ、このシグナルは、タグまたは検体特異的結合メンバー（例えば、アプタマー）がナノポアを横断するときに発生し、このシグナルは、試料中の検体の存在を示し、試料中の検体の濃度に比例し得る。
ｉｖ．ＤＭＦ撮像チップ
画像分析用に構成されたＤＭＦチップもまた本明細書で提供される。ＤＭＦチップは、第１の基板上に（個々にまたは集合的にエネルギー供給可能な）電極のアレイを含み、その電極は絶縁層で被覆されている。第１の基板は、第２の基板から離間していてもよい。ある特定の場合において、第２の基板は、電極のアレイに面する構成の接地電極を含むことができる。
２つの基板は、ギャップによって分離されている。ある特定の場合において、基板は、１μｍなど、約５μｍ以下の狭いギャップによって分離されている。ある特定の場合において、ＤＭＦチップの一部は、１μｍなど、約５μｍ以下の狭いギャップによって基板が分離されている領域を含み得る。例えば、試料が導入される領域における基板間のギャップは比較的広くてもよく（約１００μｍ）、試料液滴（または処理された試料液滴）が撮像されるギャップはより狭くてもよい。より小さなギャップ高さは、画像化および分析することができる単層の粒子の形成をもたらし、したがって単一粒子の分析をより直接的にする。
図５１Ａは、赤血球（ＲＢＣ）が楕円によって表される可能な表現を示す。ギャップ高さは、ＲＢＣがギャップ内に複数の層を形成するのを制限する。ＤＭＦチップの上に位置する画像センサは、分析用の光学データを収集するために使用される。この実施形態では、照明は、画像センサと同じ位置にある。上部基板は、照明および撮像のために光学的に透明でなければならない。ＤＭＦチップから面外には、分析のために光学データを収集するために使用される撮像検出器がある。撮像素子技術としては、ＣＭＯＳおよびＣＣＤ技術を挙げることができるが、それらに限定されない。
図５１Ｂは、粒子を単一層に分散させるような寸法のギャップを有する毛細管流動領域に接続されたより大きなギャップによって分離された基板をチップの一部が含む、ＤＭＦ撮像チップを示す。チップのＤＭＦ部分は、流体の流れを能動的に制御し、流体を混合し、チップ上の異なる活性試薬領域に粒子を移動または分離するか、または分析操作（希釈等）に有用な他の作用に有用であるが、毛細管流動領域は、チップのＤＭＦ部分上に存在する液滴から毛細管力による狭い毛細管ギャップへの流動ギャップ遷移によって粒子単層を形成するチャネルである。これにより、液滴中に存在する物質を、毛細管流動領域上に位置決めされ集束される撮像検出器を介して分析することが可能になる。チップのＤＭＦ部分は流体を制御し、毛細管流動領域は比色、吸光度、透過率、蛍光粒子カウント、および撮像（細胞など）のための分析領域を形成する。毛細管チャネル内のカウントおよび撮像は、粒子の静止位置を用いて、または粒子がチャネルを通って流れるときに行うことができる。
図５１Ｂのチップ内のＤＭＦ領域内のギャップは、粒子状物質の単層についてのギャップ高さに制約される必要はなく、むしろ、撮像検出器は、毛細管流動領域に焦点を合わせているため、毛細管流動領域のギャップは、複数の層が形成されるのを防ぐ値に保持される。撮像検出器アセンブリは、毛細管チャネル内の内容物に焦点を合わせるか、または異なる毛細管高さに適応するために、複数の被写界深度およびレンズの移動を有することができる。
図５２Ａおよび５２Ｂは、一体型試料調製および試料分析カートリッジの実施形態を示す。ＤＭＦ素子と撮像チャンバとを有するカートリッジ１０００の概略図が、図５２Ａに提供されている。ＤＭＦ電極１００３を含む第１の基板１００１は、第２の基板１００２から離間して配設されている。第１基板と第２基板との間の空間は、カートリッジの第１領域が高さｈ１を有する第１のチャンバを含み、第２領域が高さｈ２を有する第２のチャンバを含むように変化する。図５２Ａに示すように、ｈ１は、ｈ２より大きい。ある特定の実施形態では、ｈ１は、２０〜２００μｍ（ミクロン）、例えば、５０〜２００ミクロン、７５〜２００ミクロン、１００〜２００ミクロン、１２５〜２００ミクロン、１００〜１７５ミクロンの範囲、例えば、１５０ミクロンであり得、ｈ２は、２〜１０μｍ（ミクロン）、例えば、２〜８ミクロン、２〜６ミクロン、３〜６ミクロンの範囲、例えば、４ミクロンであり得る。開示されたカートリッジ１０００の態様は、第１のチャンバが、第１のチャンバ内で血液液滴を移動させるように、試料液滴、例えば血液液滴を作動させるために構成される実施形態を含み、それにより液滴は、第１のチャンバ内に配設された試薬に接触し、それにより第２のチャンバにおける後次分析のための試料の処理および調製を容易にする。例えば、第１のチャンバは、血液試料中に存在する細胞を染色して、細胞の検出／カウント、全血球カウントおよび／または他の血液学的測定、例えば細菌、ＲＢＣ、ＷＢＣ、および／または血小板等の染色、カウント、および／または形態分析を容易にするための試薬を含み得る。本明細書に開示されるように、ＤＭＦ電極は、乾燥形態または液滴の形態で配設された試薬（例えば、染色試薬、例えば、核酸に結合する染料、例えばアクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、またはＳＹＴＯＸ）を有する第１のチャンバ内の領域に試料液滴を移動させるように動作させることができる。試料液滴は、試料液滴中の試薬の均一な分布を提供するために試薬と混合されてもよい。染色試薬の少なくとも８０％が試料液滴内に均一に分布するまで、試料液滴を分割して合体させることによって混合を行うことができる。第２のチャンバは、第１のチャンバから第２のチャンバに移された試料の光学分析を容易にするために、少なくとも撮像領域１００４において透明であり得る。示されるように、第２のチャンバは、単層として試料中に存在する細胞の分布を容易にするように構成され得、細胞の光学分析においてエラーを導入する傾向がある重複する細胞を回避する。第２の基板１００２は、第１の平面領域と、第２の平面領域を基準にして第１の平面領域の平面の高さを変えるための肩部または段差要素１００６を導入する傾斜領域によって分離された第２の平面領域と、を含み得る。２段の第２の基板は、高さの異なる２つのチャンバを含むカートリッジを提供するために実質的に平坦な第１の基板の上に配設される。本明細書で論じるように、試料は、毛細管作用、ＤＭＦ電極、ＳＡＷ、または他の方法によって第１のチャンバから第２のチャンバへ移動させることができる。
図５２Ｂは、高さｈ３を有するスペーサによって離間した第１の基板２００２および第２の基板２００３によって画定された第１のチャンバ２００１を含む、カートリッジ２０００の実施形態の概略図を提供する。カートリッジ２０００はまた、高さｈ４を有するビーズ２００７によって離間した第３の基板２００６および第４の基板２００５によって画定された第２のチャンバ２００４を含む。本明細書に記載されるように、ＤＭＦ電極は、第２の基板上または両方の基板上に存在してもよいが、第１の基板は、ＤＭＦ電極２００８と共に示される。図５２Ａのカートリッジと同様に、第１のチャンバは第２のチャンバよりも高い高さを有する。ある特定の実施形態では、ｈ３は、２０〜２００μｍ（ミクロン）、例えば、５０〜２００ミクロン、７５〜２００ミクロン、１００〜２００ミクロン、１２５〜２００ミクロン、１００〜１７５ミクロンの範囲、例えば、１５０ミクロンであり得、ｈ４は、２〜１０μｍ（ミクロン）、例えば、２〜８ミクロン、２〜６ミクロン、３〜６ミクロンの範囲、例えば、４ミクロンであり得る。図５２Ｂに示すカートリッジは、単層としての細胞の分布を容易にするために第２のチャンバ内で均一な高さを画定するために、第３の基板と第４の基板との間に分散したポリスチレンビーズを含む。第２のチャンバの少なくとも一部は、光学デバイス２０１０によってインタロゲーションを容易にするために透明であり得る。図５２Ａのカートリッジと同様に、第１のチャンバは、第２のチャンバ内で（例えば、染色試薬と混合することによって）分析の準備のために試料２０１２を作動させる。第２のチャンバ内の単層内に分散した細胞２０１５もまた示されている。光学デバイスは、第３または第４の基板を介して試料を調べるように位置付けられてもよい。ある特定の実施形態では、カートリッジが共通の底部基板を有するように、第１の基板２００２および第３の基板２００６を単一の基板から形成することができる。第１および第２のチャンバは、毛細管作用、ＤＭＦ電極、ＳＡＷ、または他の方法を利用して、試料が第１のチャンバから第２のチャンバへ移動することを可能にするように構成され得る。
ＤＭＦチャンバおよび撮像チャンバのための追加の構成は、図５２Ｃ〜５２Ｅに示される実施形態を含む。カートリッジは、撮像チャンバに動作可能に接続された試料調製（例えば、試料液滴を染色試薬と混合する）のためのＤＭＦ電極を含むＤＭＦチャンバを含み得る。図５２Ａおよび図５２Ｂの説明で述べたように、ＤＭＦチャンバの高さ（ｈ１）は、２０〜２００μｍ（ミクロン）、例えば、５０〜２００ミクロン、７５〜２００ミクロン、１００〜２００ミクロン、１２５〜２００ミクロン、１００〜１７５ミクロンの範囲、例えば１５０ミクロンであり得、撮像チャンバの高さ（ｈ２）は、２〜１０μｍ（ミクロン）、例えば２〜８ミクロン、２〜６ミクロン、３〜６ミクロンの範囲、例えば４ミクロンであり得る。図５２Ｃは、第２の基板１１０２上に配設された第１の基板１１０１によって画定されたＤＭＦチャンバを含むカートリッジ１１００ａを示す。ＤＭＦ電極は図示されておらず、第１および／または第２の基板上に存在してもよい。第２の基板１１０２は、第２の基板１１０２および第３の基板１１０４によって画定されている撮像チャンバまで延在する。スペーサ１１０３は、ＤＭＦチャンバの遠位端を画定する。スペーサ１１０３は、第１の基板１１０１の下面と基板１１０４の上面とに接触してもよい。図５２Ｄは、２つの部分からなるスペーサ１１０３ａ〜１１０３ｂを介して撮像チャンバがＤＭＦチャンバに動作可能に接続されているカートリッジ１１００ｂを示し、スペーサの第１の部分（１１０３ａ）は、第１の基板１１０１と第３の基板１１０４との間に配設され、スペーサの第２の部分（１１０３ｂ）は、第２の基板１１０２と第４の基板１１０５との間に配設されている。図５２Ｅは、撮像チャンバがＤＭＦチャンバの遠位領域に配設されているカートリッジ１１００ｃを示す。ＤＭＦチャンバは、基板１１０１および１１０２によって画定されている。撮像チャンバは、基板１１０１と基板１１０４によって画定されている。スペーサ１１０３は、基板１１０４を支持する。
本明細書に記載されるように、ＤＭＦチャンバは、検体検出領域（電気化学的検出、電気的検出、光学的検出等）に可逆的に結合されて、一体型または半一体型カートリッジを形成することができる。ＤＭＦチャンバと検体検出領域との結合は、本明細書に記載のように行うことができる。
ある特定の実施形態では、カートリッジは、血液試料の分析用の試薬を含み得、米国特許第６，００４，８２１号または米国特許第８，３６７，０１２号（参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように構成され得る。ある特定の実施形態では、ＤＭＦ電極および試料調製用チャンバは、ＷＯ２０１６／１６１４００、ＷＯ２０１６／１６１４０２、またはＵＳ２０１５／０２９８１２４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているように構成されてもよい。ＤＭＦ電極の代わりにまたはそれに加えて、カートリッジは、ＳＡＷによって試料液滴を作動させるように構成されてもよいことが理解される。
ｖ．複数の検出領域を有するＤＭＦチップ
本明細書ではまた、単一のＤＭＦチップで複数の分析および技法を利用することを可能にするＤＭＦチップも提供される。図５３は、特定の検出ゾーンが形成されたＤＭＦチップのレイアウトを示し、特異な検出技術を用いるのではなく、むしろ検出技術自体に対して構成されたゾーンを形成する。例えば、ゾーン５５０ａは、電気化学的検出を可能にするように形成および構成されてもよく、ゾーン５５０ｂは、画像分析に特異的であり、ゾーン５５０ｃは、吸光度に基づく測定用である。
図５３に示されるチップは、異なる検出技術を利用する複数の典型的な診断テストが実行され得る、コンパクトなＤＭＦチップを提供する。例えば、血液学的測定は、典型的には画像分析に依存し、一方臨床化学的またはイムノアッセイ測定は、典型的には電気化学的または光学的検出に依存する。このチップを使用して、ユーザは、複数の診断分析デバイスにわたって単一の血液採取を利用することができ、したがって診断プロセスおよびユーザに結果をもたらすまでの時間を非常に単純化する。
図５４は、撮像、光子、および電気化学的感知からなるＤＭＦチップレイアウトを示す。ＤＭＦ構成は、診断要件に応じて、任意の組み合わせおよび／または数の感知ゾーンであり得る。ＣＭＯＳ技術などの撮像センサを利用することができる。より高い感度が必要とされる場合には、ＣＣＤまたは強化ＣＣＤ（ｅＣＣＤ）を使用することができる。ＣＭＯＳ検出器は、それらが適切なコーティングを有する電気化学センサとして使用され得るように用途が広い。高感度のフォトンセンシングが必要な場合（最高から最低まで）、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはアバランシェフォトダイオード検出器（ＡＰＤ）またはフォトダイオードを使用することができる。照明は、発光ダイオード（ＬＥＤ）または固体型レーザーを使用することによって達成され得る。示されている照明構成は、明視野および蛍光励起の両方に対処している。二色性またはビームスプリッタは、蛍光励起波長を反射し、発光波長を透過させる。二色性の帯域通過波長は、透過明視野波長がセンサに伝達されることを可能にする。二色性光学部品は、透過光分析には必要ではなく、蛍光のみが必要である。異なるアッセイのために追加の励起および発光フィルタが必要とされ得、それぞれの光路に含まれ得る。そのようなチップに適合する検体検出器具は、光学シグナルおよび電気シグナルを検出するための手段を含むように構成され得る。例えば、検体検出器具は、ＣＭＯＳ、ＣＣＤ、または強化ＣＣＤ（ｅＣＣＤ）カメラ、ＰＭＴ、ＡＰＤなどの撮像センサを含み得る。さらに、検体検出器具は、ＬＥＤ、レーザー等のような試料照明用の手段を含んでもよい。
複数の検出領域を有するＤＭＦチップの実施形態を図５５に示す。図５５のチップは、２０〜８０μＬの全血試料がチップ上に装填され、試料が１／２時間以上まで存在し得る再懸濁領域に直ちに転送される試料採取ポートを含む。再懸濁領域を使用して、血液が０．５〜１μＬの体積の５つのアリコートに分配される前に、血液を再懸濁する。再懸濁は、流体経路が血液の完全な反転を可能にするように血液試料を往復運動させることによって達成され、流体経路は、血液スラグの長さの２倍超である。
再懸濁された血液は転送され、いくつかのアリコートに分けられる。個々に、各アリコートを試薬区画を通過する感知／撮像領域に転送して、細胞を染色、球状化、または溶解する。この領域内でアリコートを往復運動させることによって、混合が達成される。この図は、血液学測定用の異なる試薬と撮像領域を示している。消耗品中の全ての試薬は乾燥されている。流体経路内の他のコーティングは、液体を操作するための疎水性表面および親水性表面を提供する。電気化学的感知および光学的感知を行うための代替構成が含まれてもよい。血小板（ＰＬＴ）、網状赤血球（ＲＥＴＣ）、および有核赤血球（ＮＲＢＣ）は、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）と同じ撮像領域で撮像することができる。ＤＭＦは、取得ポートに試料を収集し、試料を再懸濁し、任意選択でアリコート分割を含め、試料全体を染色するために使用することができる。そのようなチップは、例えば、血液型を決定することなど、血液凝集をアッセイするために使用され得る。
図５６および図５７は、電気化学的および光学的検出が可能なＤＭＦチップを示す。２０〜８０μＬの全血試料を充填口で患者から採取し、直ちに試料が１／２時間以上まで存在できる再懸濁領域に転送する。再懸濁領域を使用して、血液が分配される前に血液を再懸濁する。再懸濁は、流体経路が血液の完全な反転を可能にするように血液試料を往復運動させることによって達成され、流体経路は、血液スラグの長さの２倍超である。試料を転送し、１つは血漿分離用、もう１つは全血分析用の２つのアリコートに分ける。血漿分離は、分離媒体を用いて達成することができる。すなわち、濾過、またはＤＭＦの能力を利用する流体的方法による。消耗品は、図５５の血液学的構築物と同じ撮像センサレイアウトを利用する。各撮像領域は、試薬混合のための対応する領域を有する。「染色および混合領域」の全ての試薬は乾燥している。試料を洗浄するために、洗浄用の試薬パックを流体設計に追加することができる（図５６）。
ｖｉ．検体検出デバイス
本明細書で述べたように、検体検出チップと相互作用するためのカートリッジインターフェースを含む検体検出デバイスが提供される。ある特定の実施形態では、検体検出デバイスは、１種類の検体検出チップのみと適合し得る。そのような検体検出デバイスは、単一のカートリッジインターフェース、例えば単一の挿入スロットを含み得、スロットに挿入された単一のチップ上で動作し得る。他の実施形態では、検体検出デバイスは、複数のカートリッジインターフェース、例えば複数のチップ（例えば、異なる種類の試料を装填した同じ種類の）を操作するために使用できる挿入スロットを含むことができる。さらに他の実施形態では、検体検出器具は、単一の検体検出チップを挿入することができる単一のカートリッジインターフェースを含むことができる。いくつかの実施形態では、検体検出デバイスは、複数の異なる種類の検体検出チップ、例えば２つ以上のＤＭＦ電気化学検出チップ（例えば、臨床化学用）、ＤＭＦ光学検出チップ（例えば、臨床化学用）、ＤＭＦ電気チップ（例えば、ナノポア層を含む）、および多重検出領域を有するＤＭＦチップ上で動作することができる多機能器具または汎用器具であり得る。いくつかの実施形態では、汎用器具は、異なる検体検出チップごとに別々の挿入スロットを含み得る。他の実施形態では、汎用器具は、異なる種類の検体検出チップと適合する単一の挿入スロットを有することができる。多機能または汎用の検体検出器具は、光学的検出ユニットおよび電気的検出ユニットを含み得る。
検体検出デバイスは、電源と、ＤＭＦ電極を作動させるための回路と、を含むことができる。デバイスが動作する検体検出チップに応じて、検体検出デバイスは、（電気化学的検出のために）作用電極からの電気シグナルを検出するための回路、ナノポアからの電気シグナルを検出するための回路、光シグナルを検出するためのセンサおよび／または撮像用カメラ（複数可）を含むことができる光学的検出、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。検体検出デバイスは、メモリを含み得るか、または検体検出チップの動作のための命令を記憶するメモリに動作可能に接続され得る。ある特定の場合において、デバイスは、検体関連シグナルを発生させ、シグナルを検出するために必要なステップを実行するためのプログラムを実行するプロセッサによって動作させることができる。検体検出デバイスはまた、検出された電気シグナルまたは光学シグナルに基づいて検体の濃度を計算するためのアルゴリズム（複数可）を含み得る。
本明細書に開示されている検体検出デバイスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２５７８７に開示されているものなどのＤＭＦナノポアデバイス上で動作するように構成することもできる。ある特定の実施形態では、ＤＭＦ電気化学検出チップ、ＤＭＦ光学検出チップ等のＤＭＦ部分は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２５７８５またはＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２５７８７に開示されているように構成および形成することができる。
図５８Ａおよび図５８Ｂは、検体検出デバイスを示す。図５８Ａの検体検出デバイス４１０ａは、単一種類の検体検出チップと適合する。図５８Ａのデバイス４１０ａは、単一種類の検体検出チップ用の単一スロット４１１ａなどの単一インターフェースを含むことができる。ある特定の場合において、図５８Ａのデバイス４１０ａは、各々が同じ種類の検体検出チップを受け入れるスロット（４１１ａ、４１１ｂ、４１１１ｃ、４１１ｄ）などの複数のインターフェースを含むことができる。図５８Ａのデバイス４１０ａは、検体の存在について複数の試料を同時に分析するために使用されてもよい。ある特定の実施形態では、図５８Ａのデバイスは、検出チップを使用するためのプログラミングを含むメモリに動作可能に接続されたプロセッサ４１３を含むハウジングを含み得る。スロット４１１ａおよび追加のスロット（存在する場合）は、全てハウジング内に収容することができる。他の実施形態では、ハウジングはプロセッサのみを含んでもよく、任意選択でスクリーンまたはモニタ、ならびにスロット４１１ａ〜４１１ｄなどの１つ以上のスロットを含む別個のデバイスに接続して動作するのに十分なハードウェアおよびソフトウェアを含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、デバイスのオペレーティングシステムは、カートリッジが配置されるスロットから物理的に分離可能であり得る。
図５８Ｂのデバイス４１０ｂは、複数のスロット４１２ａ、４１２ｂ、４１２ｃ、および４１２ｄを含む。スロット４１２ａは、ＤＭＦ電気化学検出チップと適合する。スロット４１２ｂは、ＤＭＦ光学検出チップと適合する。スロット４１２ｃおよび４１２ｄは、それぞれＤＭＦナノポアおよびＤＭＦ臨床化学チップと適合する。ＤＭＦ臨床化学チップは、電気化学的検出領域または光学的検出領域を有し得る。デバイス４１０ａおよび４１０ｂはまた、検出チップを使用するためのプログラミングを含むメモリに動作可能に接続されているプロセッサ４１３を含む。デバイス４１０ａと同様に、デバイス４１０ｂは、プロセッサ４１３を収容する筐体、任意のスクリーン、またはモニタを含み、スロット４１２ａ〜４１２ｄまたは筐体は、デバイス４１０ｂに接続された別々のデバイス（複数可）に存在し得るスロット４１２ａ〜４１２ｄを含まない。
図５８Ｃは、図５８Ａおよび図５８Ｂに示す検体検出デバイスと適合する検体検出チップを示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスおよびシステムは、単一のスロットを異なる種類のカートリッジに適合させるために利用することができるカートリッジアダプタ（複数可）を含むことができる。例えば、カートリッジアダプタ１は、スロット１に接続するための第１のインターフェースと、カートリッジ１に接続するための第２のインターフェースとを含み得、カートリッジアダプタ２は、スロット１に接続するための第１のインターフェースと、カートリッジ２に接続するための第２のインターフェースとを含み得る。カートリッジアダプタおよびカートリッジアダプタと適合するカートリッジを、図５８Ｄおよび図５８Ｅに示す。図５８Ｄは、プロセッサを含むか、またはカートリッジのＤＭＦ領域内で試料を調製するためおよび／または調製された試料を分析する（例えば、検体関連シグナルを検出する）ために必要なステップを行うための命令により、プロセッサに（物理的または無線的に）接続可能なデバイスに存在するスロットと適合するピン５８１０ａおよび５８１０ｂを含む第１のインターフェースを含むカートリッジアダプタ５８１２ａを示す。カートリッジアダプタ５８１２ａの第２のインターフェースは、カートリッジ５８１４（例えば、イムノアッセイカートリッジ）に存在するピン５８１３と嵌合するポート５８１１を含む。図５８Ｅは、ピン５８１０ａおよび５８１０ｂの存在によりカートリッジアダプタ５８１２ａと適合するものと同じスロットと適合するカートリッジアダプタ５８１２ｂを示す。しかしながら、カートリッジアダプタ５８１２ｂの第２のインターフェースは、カートリッジ５８１５（例えば、血液学カートリッジ）を収容し、それに接続可能であるが、カートリッジ５８１４には接続できない空洞を含む。したがって、カートリッジアダプタを使用して、スロットを適応させて複数の異なる種類のカートリッジと接続することができる。
図５９Ａは、本明細書に記載の方法に従って試料の分析を行うために使用することができる検体検出チップを示す。検体検出チップは、遠位領域に開口部を含み、この開口部は、試料を検体検出チップに導入するための入口（図５９Ａにおいて矢印で印を付けた）を提供する。本明細書に記載のように、ある特定の場合において、試料は全血試料であり得る。ある特定の実施形態では、試料は、検体検出チップの開口部にピペットで入れることができる。他の実施形態では、試料液滴は、指先などの皮膚の切開領域から検体検出チップに直接装填することができる。検体検出チップの遠位領域は、試料中に存在する１つ以上の検体を検出するために、試料を処理するおよび／または試料を検体検出チップ内の適切な領域に転送するための要素を含み得る。検体検出チップの近位領域は、試料分析用の検体検出デバイスに挿入可能である。ある特定の場合において、検体検出チップは、カバーを含み、チップの近位領域のカバーの一部は、近位領域の内部を露出するように移動可能である。カバーの可動部分は、チップのカバーにヒンジで取り付けられてもよく、チップの内部を露出させるように枢動されてもよい。他の場合において、カバーの可動部分は、近位領域でチップの内部を露出させるために遠位領域に向かってスライド可能であり得る。ある特定の場合において、検体検出チップは、図５９Ｂに示される検体検出デバイスと適合性があり得る。本明細書で述べたように、チップは、ナノポアおよび／またはナノウェルを含み得る。さらに、チップは、電極、例えば、デジタルマイクロ流体用の電極のアレイを含み得る。
図５９Ｂは、本明細書に記載の検体検出チップと適合する検体検出デバイスを示す。例えば、検体検出デバイスは、図５９Ａに示す検体検出チップと適合する。図５９Ｂの検体検出デバイスは、検体検出チップの少なくとも近位領域が挿入される単一の挿入スロット（矢印で示す）を含む。ある特定の場合において、チップ全体または実質的に全体が挿入スロットに挿入される。いくつかの場合において、この検体検出デバイスは、複数の挿入スロットなどの複数のインターフェースを含むように構成することもできる。図５９Ｂに示されるように、検体検出デバイスは、約１２インチの範囲の高さを有するベンチトップデバイスに理想的なサイズを有する。
本明細書に開示されているチップ、デバイス、およびシステムは、試料分析の分野において多くの利点を提供する。これらのチップおよびデバイスは、少量の試料でも信頼性が高く、他の試料分析デバイスに代わる低コストのものである。デバイスの設置面積が小さいことに加えて、これらのデバイスは使い易く、イムノアッセイおよび／または臨床化学を含む複数のコアラボ試験を行うために使用することができる。本明細書で説明されるように、開示されたチップ、デバイス、およびシステムは、少量の試料量の分析を可能にする高感度を提供する。さらに、チップおよびデバイスの構成は、最小限のユーザ入力を必要とし、最小限の訓練を受けたユーザが試料を分析するためにデバイスおよびチップを操作することを可能にする。本開示のチップおよびデバイスは、製造コストおよび／またはメンテナンスコストもまた低減しながら、またデバイスの寿命を延ばす可動部品を全く有しないか、または最小限の可動部品を有している。
検体検出器具は、ＣＭＯＳ、ＣＣＤ、または強化ＣＣＤ（ｅＣＣＤ）カメラ、ＰＭＴ、ＡＰＤなどの撮像センサを含み得る。さらに、検体検出器具は、ＬＥＤ、レーザー等のような試料照明用の手段を含んでもよい。検体検出器具はまた、ＤＭＦチップを操作するための、およびＤＭＦ電気化学／電気チップを操作するための電気回路を含み得る。
いくつかの実施形態では、検体検出は、一定レベルの感度を必要とし得る。所望の感度に応じて、ＤＭＦ−光学チップ（例えば、ＤＭＦ−臨床化学チップ）またはＤＭＦ−電気化学（例えば、ＤＭＦ−臨床化学チップ）またはＤＭＦ−電気（例えば、ＤＭＦ−ナノポアチップ）チップ利用することができる。検体検出のためのさらに他のアッセイでは、例えば、ＤＭＦ電極上に存在する液滴が（例えば、分光光度計を使用して）光学的にインタロゲーションされるＤＭＦ撮像チップを使用することができる。
ｖｉｉ．検体検出システム
また、本明細書に開示されているのは、検体検出チップおよびそのチップと適合する検体検出器具を含むシステムである。本開示に記載されるように、器具は、単一の多機能チップを使用して、または異なるチップを使用して、複数のアッセイを行うことができる。例えば、器具は、電気シグナル（ＤＭＦ−臨床化学チップの作用電極および参照電極と接触している電気化学種からのもの、またはＤＭＦ−ナノポアチップ内のナノポアを横断するタグ／検体特異的結合メンバーからのものなど）、およびＤＭＦ光学チップを撮像すること、ＤＭＦ光学チップから検体関連シグナルを検出すること、および／またはＤＭＦ撮像チップ上に液滴を撮像することを含む、光学シグナルを検出することができる。本明細書に記載されるように、ＤＭＦ電気化学チップにおいて、ＤＭＦ電極は、単一基板上の作用電極および参照電極に隣接してもよく、または作用電極および参照電極は、チップのＤＭＦ電極含有領域に流体接続された毛細管に浸されてもよい。いくつかの場合において、ナノポア層の位置を基準としたＤＭＦ電気チップ上のＤＭＦ電極のアレイの位置は、前述のセクションで説明したとおりであり得る。
本開示のシステムは、試料中の検体（複数可）の分析のための試験のメニューを行うためににプログラムされてもよい。例えば、器具は、器具内に配置されたチップの種類を検出してもよく、チップ上で行われるアッセイを選択してもよい。器具は、ＤＭＦ電極を活性化および非活性化して、試料液滴（複数可）を処理し、電気的または光学的に調べることができる液滴を生成することができる。例えば、器具は、液滴中の電気化学種および／または液滴中の光学活性分子（例えば、発色分子、蛍光分子等）を検出することができる。さらに、器具は、ナノポア層に液滴を位置付け、ナノポア層を通るタグまたは検体特異的結合メンバー（例えば、アプタマー）の転位を測定することができる。
システムは、ＤＭＦ電極を制御するため、および電気化学的検出に使用される電極を制御するため、または光学検出ユニットを制御する等のために、システムに含まれる（例えば、器具に含まれる）プロセッサで実行される命令を有するメモリをさらに含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示の検体検出システムは、試料液滴／緩衝液滴／試薬液滴等の移動のために、ＤＭＦ電極を最初に活性化させるための命令でプログラムを実行するためのプロセッサを含む、検体検出デバイスを含み得る。命令は、ＤＭＦ電極を非活性化すること、および試料中の検体の存在に応答して生成された電気化学種を検出するための作用電極からの電気シグナルを測定することをさらに含み得る。システムは、例えば、検体の濃度を決定する前にノイズを除去するために、チップから記録されたシグナルを正規化するためのアルゴリズムをさらに含み得る。アルゴリズムは、検体濃度を決定するのを助けるための較正曲線を含み得る。
本明細書に開示されるシステムを使用して、（例えば、作用電極および参照電極を使用して測定された電気化学種から、またはナノポアを通るタグまたは検体特異的結合メンバーの転位から）電気シグナル、および／または試料中の検体の存在を示す光学シグナルを発生させるために試料液滴を処理することができる。電気シグナルおよび／または光学的シグナルは、臨床化学アッセイにおいて基質上の酵素の作用によって発生させることができる。電気シグナルは、ナノポアを通るタグまたは検体特異的結合メンバーの転位によって発生させることができる。試料は、本開示に記載されている１つ以上のアッセイフォーマットを利用して処理され得る。
本開示のシステムは、試料中の検体の電気化学的検出方法に使用することができる。この方法は、（ａ）試料をカートリッジに導入することであって、カートリッジが、第１の基板と、第２の基板と、第１の基板を第２の基板から分離するギャップと、液滴に対する電気作用力を生成する複数の電極と、を備える、導入することと、（ｂ）複数の電極を作動させて、検体を含む第１の液滴を提供することと、（ｃ）複数の電極を作動させて、検体に特異的な酵素を含む第２の液滴を提供することと、（ｄ）複数の電極を作動させて、第１および第２の液滴を合体させて混合物を形成することと、（ｅ）複数の電極を作動させて、混合物の全部または一部を電気化学的感知領域に移動させることと、（ｆ）作用電極および参照電極を介して、検体に対する酵素の作用によって発生した電気化学種の電気シグナルを検出することと、を含み得る。
いくつかの場合において、第２の液滴は、酸化還元媒介物質も含み得る。いくつかの場合において、システムは、電気シグナルに基づいて検体の濃度を決定してもよい。いくつかの場合において、電気化学的感知領域は、カートリッジ内の毛細管領域に位置する。
ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）試料をカートリッジに導入することであって、カートリッジが、第１の基板と、第２の基板と、第２の基板を第１の基板から分離するギャップと、液滴に対する電気作動力を発生させる複数の電極と、作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域とを含む、導入することと、（ｂ）複数の電極を作動させて、検体を含む第１の液滴を提供することと、（ｃ）複数の電極を作動させて、検体に特異的に結合する第１の結合メンバーを含む固体基質を含む第２の液滴を提供することと、（ｄ）複数の電極を作動させて、第１の液滴および第２の液滴を合体させて混合物を形成することと、（ｅ）複数の電極を作動させて、混合物の全部または一部を、検体に特異的に結合する第２の結合メンバーを含む第３の液滴と合体させることと、（ｆ）固体基材を所定の位置に保持しながら、複数の電極を作動させて、任意の未結合の検体および／または第２の結合メンバーを除去することと、（ｇ）複数の電極を作動させて、固体基材を、第２の結合メンバーに接合した酵素の基質分子と接触させることと、（ｈ）作用電極および参照電極を介して、基質分子に対する酵素の作用によって発生した電気化学種の電気シグナルを検出することと、を含み得る。
いくつかの場合において、方法は、ステップ（ｇ）および（ｈ）の前に、ステップ（ｆ）から固体の第２の基板を含む液滴を、電気化学的感知領域に移動させることを含み得る。他の場合において、方法は、ステップ（ｇ）からの固体の第２の基質および酵素基質を含む液滴を、電気化学的感知領域に移動させることを含み得る。
いくつかの場合において、第２の液滴は、酸化還元媒介物質も含み得る。いくつかの場合において、システムは、電気シグナルに基づいて検体の濃度を決定してもよい。いくつかの場合において、電気化学的感知領域は、カートリッジ内の毛細管領域に位置する。本明細書に記載されるように、システムおよび器具は、多機能カートリッジ（複数可）を使用して、または複数の別々の単一アッセイカートリッジを使用して、２つ以上の別々のアッセイを行うことができる。
ある特定の実施形態では、器具を使用して検体検出を行うための方法が開示されている。この方法は、１つ以上の検体検出カートリッジに動作可能な接続のためのカートリッジインターフェースを備える検体検出器具を提供することと、液滴に対する電気作動力を発生させるために、複数の電極を有する複数のカートリッジを提供することと、第１のカートリッジを器具とインターフェース接続し、カートリッジ中の液滴からの検体関連シグナルを検出することと、第２のカートリッジを器具とインターフェース接続し、カートリッジ内のナノポア層の細孔を通って転位するタグ／検体特異的結合メンバーからの検体関連シグナルを検出することと、を含み得る。
ある特定の場合において、システムは、複数の器具の各々が複数のアッセイを実施する複数の器具と相互作用することを可能にするプログラミングを含み得、ここで複数の器具は、異なるかまたは同一である。例えば、図６０Ａに示されるようなシステムは、複数のデバイス４１１に動作可能に接続されたプロセッサ４１３を含む制御ユニットを含み得、複数のデバイスは、各々少なくとも１つのスロット（４１１ａ〜４１１ｄ）を含むことができ、そこでカートリッジは、プロセッサによって挿入および操作され得る。デバイス４１１は、同一でもよく、同時に処理することができる試料の数を増やすための手段を提供してもよい。ある特定の実施形態では、システムは、プログラミングを含んでもよく、またはそれらが利用可能になったときに追加のまたは代替の器具と相互作用することを可能にするプログラミングを含むようにアップグレードされてもよい。図６０Ｂに示すようなシステムは、複数の異なるデバイス４１４ａ〜４１４ｄに動作可能に接続されたプロセッサ４１３を含むことができ、複数のデバイスは各々、少なくとも１つのスロット（４１２ａ〜４１１ｄ）を含んでもよく、そこで異なる種類のカートリッジがプロセッサによって挿入および操作され得る。例えば、第１のデバイスは、イムノアッセイを実施するように構成することができ、第２のデバイスは、電気化学的アッセイを実施するように構成することができ、第３のデバイスは、血液学的アッセイを実施するように構成することができる等である。そのような実施形態では、デバイスおよびそのデバイスと適合するカートリッジは、（試料分析のための）試料調製および検体関連シグナルの検出のための手段を含み得る。プロセッサ４１３によって実行されるプログラミングは、アッセイを実行するために必要なステップを行う、例えばＤＭＦ電極を作動させるか、または試料調製のためのＳＡＷを生成するため、および調製された試料からシグナルを検出するための、例えばカメラ、顕微鏡、電気化学センサ等の検出モジュールを制御するために、デバイスに通信される命令を含み得る。システムは、アッセイ結果を提供する前に収集されたデータを分析するためのアルゴリズムをさらに含み得る。システムは、システムに無線で接続された遠隔デバイス上でアッセイ結果を提供するために、無線通信用に装備されてもよい。ある特定の場合において、遠隔デバイスは、リアルタイムで結果を受信することができる。ある特定の場合において、アッセイ結果のプリントアウトを提供するために、プリンターをシステムに接続することもできる。
図６０Ａおよび図６０Ｂに示されているシステムのモジュール方式は、例えばポイントオブケア施設で消費者に柔軟性を提供するためにシステムの機能に追加すること、またはそこから機能を削除することを可能にする。
検体
本明細書に提示される方法、チップ、器具および方法によって分析され得る検体の非限定的なリストは、血液試料（またはその一部、例えば血清もしくは血漿）などの生物学的試料中に存在する分子を含む。目的の例示的な検体としては、核酸、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、コレステロール、トリグリセリド、グルコース、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン、ミクロアルブミン、全タンパク質、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、塩化物（Ｃｌ−）、二酸化炭素、酸素、クレアチニン、カルシウム（Ｃａ２＋）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ｐＨ、乳酸、ケトン体、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ビリルビン、フェリチン、アルコール（血中アルコール）、アンフェタミン、メタンフェタミン、***、アヘン剤、バルビツル酸、ベンゾジアザピン、三環酸、コカイン、およびフェンシクリジン（ＰＣＰ）のうちの１つ以上が挙げられる。本明細書に開示されているＤＭＦ−電気化学的／電気的／光学的検出チップを使用して検出され、任意選択で測定され得るさらなる検体は、前述のセクションにおいて検出される検体の１つ以上を含む。本開示の方法、デバイス、およびシステムを使用して検出および測定され得る検体のさらなる例としては、血球、インフルエンザウイルス、連鎖球菌、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、単核球症、結核、Ｂ−ＨＣＧ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、梅毒、ヘルペス、トロポニン、ＢＮＰ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、Ｄ−ダイマー、ＰＳＡ、ＴＳＨ、Ｔ３、Ｔ４、ＦＳＨ、ＬＨ、エストラジオール、テストステロン、ビタミンＤ、Ｂ１２、およびＨが挙げられる。ピロリ
検体が検出されている試料は、血液、固体組織、別の体液（例えば、尿、痰、唾液、脳脊髄液）の試料、ならびに環境試料（例えば、水、土壌、食品サンプル等）などの、本明細書に開示される任意の試料であり得る。
１０．実施例
実施例１
光切断可能な２−ニトロベンジルスクシンイミジル／マレイミジル二官能性リンカーの合成
＊上記合成において、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
化合物２の合成：光切断可能なスルホスクシンイミジル／マレイミジルリンカーの合成は、Ａｇａｓｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４（４５），１８４９９−１８５０２，２０１２に由来する。簡潔には、出発物質４−［４−（１−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ］酪酸（０．３３４ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解する。フラスコを、氷浴中に置くことによって０℃に冷却する。化合物２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．３６８ｍｍｏｌ）、およびトリメチルアミン（ＴＥＡ）（０．８３５ｍｍｏｌ）を溶液に添加する。反応混合物を０℃で５分間撹拌し、続いてＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（０．３６８ｍｍｏｌ）を添加する。０℃で１５分間撹拌した後、反応混合物を、室温（ＲＴ）に上昇させ、さらに１８時間撹拌する。反応混合物をＤＣＭ（４５ｍＬ）で希釈した後、有機相を水（２×）、飽和ＮａＣｌ溶液（１×）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。有機層を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２カラム（溶出液：１００％ＤＣＭに対してＤＣＭ中３％メタノール、ｖ／ｖ）を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。化合物１（０．０２４ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ′−ジスルホスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）（０．０７１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．０９６ｍｍｏｌ）を連続的に溶液に添加する。反応混合物を室温で１８時間撹拌する。反応混合物を、Ｃ１８逆相カラム（溶出液：水中５％アセトニトリル対水中９５％アセトニトリル、ｖ／ｖ）に直接装填することにより精製する。合成に使用される出発物質および他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。
実施例２
光切断可能なスルホスクシンイミジル／ＤＢＣＯ ２−ニトロベンジル二官能性リンカーの合成
＊上記合成において、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
化合物４の合成：光切断可能なスルホスクシンイミジル／ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）アルキニルリンカーの合成は、Ａｇａｓｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４（４５），１８４９９−１８５０２，２０１２に記載されているのと同様の手順から誘導される。簡潔には、出発物質４−［４−（１−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ］酪酸（０．３３４ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解する。フラスコを、氷浴中に置くことによって０℃に冷却する。化合物２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．３６８ｍｍｏｌ）、およびトリメチルアミン（ＴＥＡ）（０．８３５ｍｍｏｌ）を溶液に添加する。反応混合物を０℃で５分間撹拌し、続いてＤＢＣＯ−アミン（０．３６８ｍｍｏｌ）を添加する。０℃で１５分間撹拌した後、反応混合物を、室温に上昇させ、さらに１８時間撹拌する。反応混合物をＤＣＭ（４５ｍＬ）で希釈した後、有機相を水（２×）、飽和ＮａＣｌ溶液（１×）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。有機層を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２カラム（溶出液：１００％ＤＣＭに対してＤＣＭ中３％メタノール、ｖ／ｖ）を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。化合物３（０．０２４ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ′−ジスルホスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）（０．０７１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．０９６ｍｍｏｌ）を連続的に溶液に添加する。反応混合物を室温で１８時間撹拌する。反応混合物を、Ｃ１８逆相カラム（溶出液：水中５％アセトニトリル対水中９５％アセトニトリル、ｖ／ｖ）に直接装填することにより精製する。合成に使用される出発物質および他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。
実施例３
スルホスクシンイミジル／マレイミジル２−ニトロベンジル二官能性リンカーを使用する抗体−ＤＮＡ接合体のカップリングおよび光化学的切断
抗体およびＤＮＡの生体共役反応および切断：以下のスキームを使用して、ＤＮＡ分子を抗体に接合することができる。一方または両方のプライマーが、５′−チオール基で標識されている２つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ反応において、ＤＮＡ配列を複製することによって、ＤＮＡを５′末端でチオール化することができる。標識ＤＮＡ（最終濃度１００μＭ）を、撹拌しながら５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）に溶解する。化合物２（２ｍＭ）を添加し、反応を室温で２時間進行させる。カップリング後、過剰の未反応マレイミド基を、過剰のジチオトレイトール（ＤＴＴ）でクエンチする。接合体を、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）上で、または適切な接合体貯蔵緩衝液中４℃で十分に透析することにより精製する。精製したＤＮＡ−スクシンイミジルリンカー（最終濃度５０μＭ）を、撹拌しながら１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）に溶解する。天然抗体（最終濃度５０μＭ）を添加し、反応を室温で２時間進行させる。Ａｂ−ＤＮＡ接合体を、１００ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．５、またはＢｉｏＧｅｌ Ｐ−３０ゲル濾過媒体で操作されるＳｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）を使用して精製する。
ナノポア検出の前に、３６５ｎｍのＵＶランプで照射することによって、接合体を切断することができる。この例は、同じ生体共役化学を使用してＤＮＡデンドリマーに使用することもできる。
実施例４
スルホスクシンイミジル／ＤＢＣＯ２−ニトロベンジル二官能性リンカーを使用する抗体−ＤＮＡ接合体のカップリングおよび光化学的切断
抗体およびＤＮＡの生体共役反応および切断：以下のスキームを使用して、ＤＮＡ分子を抗体に接合することができる。一方または両方のプライマーが、５′−チオール基で標識されている２つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ反応において、ＤＮＡ配列を複製することによって、ＤＮＡを５′末端でアミン化することができる。標識ＤＮＡ（最終濃度１００μＭ）を、撹拌しながら１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）に溶解する。化合物４（最終濃度２ｍＭ）を添加し、反応を室温で２時間進行させる。ＤＮＡ−ＤＢＣＯリンカーをゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）上でまたは適切な接合体貯蔵緩衝液中４℃で十分に透析することにより精製する。精製したＤＮＡ−ＤＢＣＯリンカー（最終濃度５０μＭ）を、撹拌しながら５０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．０）に溶解する。銅を含まないクリックケミストリーを使用して、ＤＮＡ−ＤＢＣＯリンカーを抗体に結合させる。アジド標識抗体（Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９（１０）， ３７３１−３７３６，２０１２）（最終濃度２５μＭ）を添加し、反応を室温で６〜１２時間進行させる。Ａｂ−ＤＮＡ接合体を、１００ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．５、またはＢｉｏＧｅｌ Ｐ−３０ゲル濾過媒体で操作されるＳｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）を使用して精製する。
ナノポア検出の前に、３６５ｎｍのＵＶランプで照射することによって、接合体を切断することができる。この例は、同じ生体共役化学を使用してＤＮＡデンドリマーに使用することもできる。
実施例５
デジタルイムノアッセイのためのナノ粒子−抗体接合体（ナノポアカウント）
この実施例は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｓ（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から得ることができるものなどの、２６ｎｍのカルボキシル化ポリスチレンナノ粒子（ＮＰ、ＰＣ０２Ｎ）への抗体の共有結合を記載する。２６ｎｍＮＰは、５２８．７μｅｑ／ｇの表面電荷、６８．４ｓｑ．Å／群のパーキング面積を有する（製造元情報）。
カルボキシル−ポリスチレンナノ粒子の活性化：１．０ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬ）の２６ｎｍのカルボキシル化−ＮＰを、１０ｍＬの０．１Ｍ ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、ｐＨ４．５〜５．０）で洗浄する。洗浄後、ペレットを１００ｍｇの０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ４．５〜５．０）に１．０ｍｇ／ｍＬのＮＰ濃度（固形分０．１％）で再懸濁する。１０．０ｍＬのナノ粒子懸濁液（１０ｍｇ ＮＰ、５．２８μｅｑカルボキシル）をバイアルに移し、１０μＬ（５．２８μモル、１．０ｅｑｕｉｖ／ＣＯ２Ｈ ｅｑ）の新たに調製された水中の１０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ溶液（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）および１７μＬ（７．９３μモル、１．５ｅｑｕｉｖ／１ｅｑｕｉｖ ＥＤＣ）のスルホ−ＮＨＳ水溶液の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃５６４８５）と、室温で１５分間、連続混合しながら反応させる。反応した懸濁液を、６，５００ｇで遠心分離し、溶液を廃棄する。ペレットを２０ｍＬの２０ｍＭ ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で洗浄し、６，５００ｇでの遠心分離により沈降させる。上清を除去する。スクシンイミド活性化カルボキシル−ＮＰペレットを、５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、９．８μＬ（５２．８ｎｍｏｌ、０．０１ｅｑｕｉｖ／１ＣＯ２Ｈｅｑ）の１．０ｍｇ／ｍＬピリジンジチオエチルアミン水溶液を直ちに添加して、室温で２〜４時間連続的に撹拌しながら反応させる。ピリジル誘導体化カルボキシル−ＮＰを、１０ｍＬの２０ｍＭ ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で洗浄し、１０．０ｍＬの同じ緩衝液に再懸濁する。ナノ粒子濃度は、カルボキシル−ＮＰ較正曲線を使用するＵＶ−Ｖｉｓ分光法（６００ｎｍ、散乱）を使用して決定される。ＮＰへのピリジルリガンド負荷は、規定量のＮＰを１０ｍＭ ＴＣＥＰまたはＤＴＴで還元し、遠心分離により還元剤を除去し、ピリジル活性化ＮＰペレットをＰＢＳ／ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、エルマン試薬と反応させることにより決定される（上清のＡ４１２を測定する）。活性化されたＮＰは、抗体接合のために同じ日に使用されない場合、４℃で貯蔵される。
別個の抗体−ナノ粒子接合体を調製するための所望の化学量論を決定するために、ある範囲のＥＤＣ／ＮＨＳおよびピリジンジチオエチルアミンモル入力が評価される。所望のＮＰ活性化結果を達成するために、反応パラメータ（ｐＨ、温度、時間）を評価する。
抗体の還元：１．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液（１０ｍｇ）を、３８μＬの新たに調製した３０ｍｇ／ｍＬ ２−ＭＥＡ溶液（反応濃度１０ｍＭ）（２−メルカプトエチルアミン塩酸塩）とよく混合し、次いで蓋をして、３７℃で９０分間置く。この溶液を室温にし、過剰の２−ＭＥＡを脱塩カラムで除去し、２０ｍＭ ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で予め平衡化した。還元抗体の濃度は、Ａ２８０でのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度（タンパク質吸光度）およびＡ３２０（散乱補正）を使用して決定される。遊離チオールの数は、エルマン検定を使用して決定される。条件は、２または４個の遊離チオール（抗体ヒンジ領域のＣｙｓ）を生成するために、必要に応じて最適化される。還元抗体は、ピリジル誘導体化カルボキシル−ＮＰへのカップリングに直ちに使用される。
活性化ナノ粒子への還元抗体の結合：（１）抗体パーキングエリアは、４５ｎｍ２であり、（２）２６ｎｍのナノ粒子表面積は、２，１２０ｎｍ２であり、（３）４７個の抗体分子が理論的には２６ｎｍのＮＰの表面に適合すると仮定する。
手順：２０ｍＭ ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中のピリジル活性化カルボキシナノ粒子の０．１％溶液１０ｍＬ（１０ｍｇ）に、０．１０ｍｇ（０．６６ｎｍｏｌ、０．１０ｍＬ）の還元抗体を、１．０ｍｇ／ｍＬで同じＥＤＴＡ含有緩衝液中に添加する。混合物を、室温で２時間混合しながら反応させ、遠心分離して未結合分子を除去し、そして吸引する。ペレットを、１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、遠心分離し、そして吸引する。抗体−ＮＰ接合体を、１０．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に懸濁する。接合体ＮＰ濃度（固形分％）は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（６００ｎｍ）を使用して決定される。粒子接合体を、ＳＥＭによって調べ、サイズ／電荷分布をＺｅｔａＳｉｚｅｒを使用して決定する。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、接合体集団の潜在的分布から別個の接合体を単離することができる。抗体対ＮＰ取り込み比は、蛍光標識抗原接合体を使用するか、またはマイクロＢＣＡ（ｕＢＣＡ）アッセイを使用するフローサイトメトリーによって決定することができる。抗体からＮＰへのモル入力の範囲を、接合温度およびｐＨと共に評価して、別個の接合体の均一な集団を生成することができる（すなわち、２または４のＮＰ取り込み比）。
ナノポアカウントイムノアッセイ
上記のスキームは、調製が上述されている還元抗体活性化ナノ粒子接合体を利用するナノポアカウントアッセイを例示する。イムノアッセイの過程で形成された免疫複合体は、ジスルフィド結合リンカーの還元によって切断されて、遊離抗体−検体−抗体複合体および遊離ナノ粒子タグを形成することができ、これによりナノポアを通過するときにナノ粒子タグをカウントするのを可能にする。
実施例６
ＣＰＳＰ接合体の合成
Ａ．ＣＰＳＰ抗体接合体。
＊上記合成において、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
３−（９−（（４−オキソ−４−（ペルフルオロフェノキシ）ブチル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネート（２）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネート（ＣＰＳＰ）（１）（１ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍｍｏｌ）、およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を充填した。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。氷浴を外し、反応物を室温で３時間撹拌した。揮発性成分を真空で反応物から除去し、残渣をメタノールに取り込み、逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
ＣＰＳＰ抗体接合体（３）：２の溶液（１μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭ溶液）を抗体溶液（１００μＬの１０μＭ水溶液）および水性重炭酸ナトリウム（１０μＬの１Ｍ溶液）に添加した。得られた混合物を、室温で４時間撹拌した。産物の精製を、スピンカラム上で行い、ＣＰＳＰ抗体接合体３を得た。「ｎ」の値は、抗体依存的に変化する。活性エステル濃度（すなわち、化合物２、５、９および１３）を上昇または低下させることによって、および／または反応中にｐＨを上昇または低下させることによって、取り込みをある程度制御することができるが、常に取り込み値の分布が生じる。平均取り込み比（「ＩＲ」）は、反応後に実験的に決定される。通常、「ｎ」は、１から１０の間の任意の値である。
Ｂ．スペーサを有するＣＰＳＰ抗体接合体。
＊上記合成において、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
３−（９−（（４−（（５−カルボキシペンチル）アミノ）−４−オキソブチル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネート（４）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネート（ＣＰＳＰ）（１）（１ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍｍｏｌ）、およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を充填した。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。氷浴を外し、反応物を室温で３時間撹拌した。次いで、６−アミノカプロン酸（１．３ｍｍｏｌ）を少量ずつ反応物に添加し、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。この後、揮発性成分を、真空で反応物から除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
３−（９−（（４−オキソ−４−（（６−オキソ−６−（ペルフルオロフェノキシ）ヘキシル）アミノ）ブチル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネート（５）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、４（１ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍｍｏｌ）、およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を充填した。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。氷浴を外し、反応物を室温で３時間撹拌した。この後、揮発性成分を、窒素流下で反応物から除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
スペーサを有するＣＰＳＰ抗体接合体（６）：５の溶液（１μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭ溶液）を、抗体溶液（１００μＬの１０μＭ水溶液）および水性重炭酸ナトリウム（１０μＬの１Ｍ溶液）に添加した。得られた混合物を、室温で４時間撹拌した。産物の精製を、スピンカラム上で行い、スペーサを有するＣＰＳＰ抗体接合体６を得た。通常、「ｎ」は、１〜１０の間の任意の値である。
Ｃ．ＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体。
＊上記合成において、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）−１０−（プロプ−２−イン−１−イル）アクリジン−１０−イウム（８）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、プロパルギルアルコール（１０ｍｍｏｌ）、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルピリジン（１０ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（５０ｍＬ）を充填し、−２０℃に冷却した。次いで、トリフリン酸無水物を溶液に滴下添加し、反応物を−２０℃で２時間撹拌した。ペンタン（２５ｍＬ）を反応物に添加し、結果として生じる沈殿した塩をろ過により分離した。揮発性成分を真空中で蒸発させ、残渣を１００ｍＬの丸底フラスコ中の塩化メチレン（２５ｍＬ）に再溶解した。４−（Ｎ−トシルアクリジン−９−カルボキサミド）ブタン酸（ＣＰ−アクリジン）（７）（１ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加し、反応物を室温で１８時間撹拌した。揮発性成分を真空で蒸発させ、残留物をメタノール（５ｍＬ）中に取り込み、逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
９−（（４−オキソ−４−（ペルフルオロフェノキシ）ブチル）（トシル）カルバモイル）−１０−（プロプ−２−イン−１−イル）アクリジン−１０−イウム（９）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、８（１ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を充填した。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。氷浴を外し、反応物を室温で３時間撹拌した。揮発性成分を真空で反応物から除去し、残渣をメタノールに取り込み、逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
ＣＰＳＰ抗体接合体（１０）：９の溶液（１μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭ溶液）を、抗体溶液（１００μＬの１０μＭ水溶液）および水性重炭酸ナトリウム（１０μＬの１Ｍ溶液）に添加した。得られた混合物を、室温で４時間撹拌した。産物の精製を、スピンカラム上で行い、ＣＰＳＰ抗体接合体１０を得た。通常、「ｎ」は、１〜１０の間の任意の値である。
ＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体（１１）：オリゴアジド（５μＬの水中１０ｎｍｏｌ）、ＣＰＳＰ抗体接合体１０（１０μＬの水中１０ｎｍｏｌ）および新たに調製した０．１Ｍ「クリック溶液」（３μＬ、下記参照）の混合物を、室温で４時間振とうした。反応物を０．３Ｍ酢酸ナトリウム（１００μＬ）で希釈し、ＤＮＡ接合体を、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）を添加することによって沈殿させた。上清を除去し、残渣を冷たいＥｔＯＨ（２×１ｍＬ）で２回洗浄した。残渣を水（２０μＬ）に取り込み、ＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体１１の溶液を、さらに精製することなく使用した。通常、「ｎ」は、１〜１０の間の任意の値である。
「クリック溶液」：ＣｕＢｒ（１ｍｇ）を、７０μＬのＤＭＳＯ／ｔ−ＢｕＯＨ ３：１に溶解して０．１Ｍ溶液を形成した。（この溶液は、新たに調製しなければならず、貯蔵することはできない。）トリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）（５４ｍｇ）を、１ｍＬのＤＭＳＯ／ｔ−ＢｕＯＨ ３：１に溶解して０．１Ｍ溶液を形成した。（この溶液は、−２０℃で貯蔵できる。）１体積の０．１Ｍ ＣｕＢｒ溶液を、２体積の０．１Ｍ ＴＢＴＡ溶液に添加して、「クリック」溶液を得た。
Ｄ．スペーサを有するＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体
＊上記合成において、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。
９−（（４−（（５−カルボキシペンチル）アミノ−４−オキソブチル）（トシル）カルバモイル）−１０−（プロプ−２−イン−１−イル）アクリジン−１０−イウム（１２）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、８（１ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を充填した。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。氷浴を外し、反応物を室温で３時間撹拌した。次いで、６−アミノカプロン酸（１．３ｍｍｏｌ）を少量ずつ反応物に添加し、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。この後、揮発性成分を、真空で反応物から除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
９−（（４−オキソ−４−（（６−オキソ−６−（ペルフルオロフェノキシ）ヘキシル）アミノ）ブチル）（トシル）カルバモイル）−１０−（プロプ−２−イン−１−イル）アクリジン−１０−イウム（１３）：磁気撹拌棒および窒素導入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、１２（１ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍｍｏｌ）、およびジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を充填した。溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。氷浴を外し、反応物を室温で３時間撹拌した。この後、揮発性成分を、窒素流下で反応物から除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製して表題化合物を得た。
スペーサを有するＣＰＳＰ抗体接合体（１４）：１３の溶液（１μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭ溶液）を、抗体溶液（１００μＬの１０μＭ水溶液）および水性重炭酸ナトリウム（１０μＬの１Ｍ溶液）に添加した。これを室温で４時間撹拌した。産物の精製を、スピンカラム上で行い、スペーサを有するＣＰＳＰ抗体接合体１４を得た。通常、「ｎ」は、１〜１０の間の任意の値である。
ＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体（１５）：オリゴアジド（例えば、市販のものなど）（５μＬの水中１０ｎｍｏｌ）、スペーサを有するＣＰＳＰ抗体接合体１４（１０μＬの水中１０ｎｍｏｌ）および新たに調製された０．１Ｍの「クリック溶液」（３μＬ、実施例６．Ｃを参照）の混合物を、室温で４時間振とうした。通常、「ｎ」は、１〜１０の間の任意の値である。反応物を０．３Ｍ酢酸ナトリウム（１００μＬ）で希釈し、ＤＮＡ接合体を、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）を添加することによって沈殿させた。上清を除去し、残渣を冷たいＥｔＯＨ（２×１ｍＬ）で２回洗浄した。残渣を水（２０μＬ）に取り込み、スペーサを有するＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体１５の溶液を、さらに精製することなく使用した。
スペーサを有するかまたは有しないＣＰＳＰ抗体接合体およびスペーサを有するかまたは有しないＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体の切断。スペーサを有するかまたは有しないＣＰＳＰ抗体接合体およびスペーサを有するかまたは有しないＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体を、記載されているように、塩基性過酸化水素溶液を使用して切断または「誘発」される。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムでは、励起状態のアクリドン中間体が、光子を産生し、それを測定する。さらに、切断産物は、アクリドンおよびスルホンアミドである。実施例６．Ａ〜Ｄの接合体は、アクリドンおよび／またはスルホンアミド分子をカウントすることによって、開示されたデバイスと共に使用される。
Ｅ．抗体を含まないＣＰＳＰオリゴヌクレオチド接合体。
抗体を含まないＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体（１６）：オリゴアジド（例えば、市販のものなど）（５μＬの水中１０ｎｍｏｌ）、プロパルギル−ＣＰＳＰ８（１０μＬの水中１０ｎｍｏｌ）および新たに調製された０．１Ｍの「クリック溶液」（３μＬ、実施例６．Ｃを参照）の混合物を、室温で４時間振とうすることができる。反応物を、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（１００μＬ）で希釈し、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）を添加することによってＤＮＡ接合体を沈殿させることができる。上清を除去し、残渣を冷たいＥｔＯＨ（２×１ｍＬ）で２回洗浄することができる。残渣を水（２０μＬ）に取り込み、スペーサを有するＣＰＳＰオリゴヌクレオチド−抗体接合体１６の溶液を、さらに精製することなく使用することができる。
実施例７
低コストＤＭＦボトムチップの製造
低コスト可撓性ＤＭＦチップを、Ｌｏ Ｃ−Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６（２００９）９７９−９８３に記載されるプロセスを、いくつかの修正を加えて使用することによって、電極パターン化のためのリフトオフプロセスと組み合わせたロールツーロール（Ｒ２Ｒ）フレキソ印刷を使用して製造した。製造プロセスの概略を図１０に示す。ＤＭＥ電極印刷用の出発材料として、ＭＥＬＩＮＥＸ（登録商標）ＳＴ５０６ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）５．０ミル基板（１）のロールを使用した。黄色のインク（Ｓｕｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の層を、厚さ１．１４ｍｍの印刷プレート（Ｆｌｉｎｔ ＭＣＯ３）を使用して、アニロックスローラーアセンブリ上で３．８ｍＬ／ｍ２のインク転写量を使用して、１０ｍ／分の速度でＰＥＴ基板上にフレキソ印刷した（２）。ＤＭＦ電極パターンのネガ像は、フレキソ印刷ステップ（３）から生じる。金属堆積の前に、インクを熱風オーブン（２×１００℃）で２回乾燥させた。ＥＶＡ Ｒ２Ｒメタルエバポレータを使用して、印刷されたＰＥＴ基板上に銀金属層を堆積させ、厚さ８０ｎｍの厚さで銀の均一なコーティングを形成した（４）。１ｍ／分の速度で超音波浴のアセトン＋超音波の組み合わせを使用して、金属化インキ−フィルム支持体（５）を湿式リフトオフプロセスに供した（６）。この化学的／物理的処理により、銀のみの層を無傷に保ちながら、銀インク層を溶解させることができる。インク−銀層を除去すると、５０または１４０μｍの電極ギャップ間隔を有する８０個の作動電極（２．２５×２．２５ｍｍ）からなるＤＭＦ印刷電極パターンが得られた（７）。ＱＣチェックとして、単一ロールからの合計８０〜９０個のランダムチップを、電極ギャップ間隔およびコネクタリード幅変動について目視検査した。許容できるギャップ仕様を有すると決定されたチップの典型的な歩留まりは、１００％に近かった。単一の製造された可撓性チップを、図１１に示す。製造されたフレキシブルチップは、３″×２″の寸法であり、電極、リザーバ、コンタクトパッドおよびリードを含む。
ロータリースクリーン印刷またはグラビア印刷のいずれかを使用することによって、誘電体コーティングを電極およびリザーバに適用した。ロータリースクリーン印刷については、Ｈｅｎｋｅｌ ＥＤＡＣ ＰＦ−４５５Ｂを、２ｍ／分の印刷速度および５０％のＵＶ硬化速度で、Ｇａｌｌｕｓ ＮＦ（４００Ｌ）スクリーンを用いて印刷することによって誘電体コーティングとして使用した。典型的な誘電体の厚さは、１０〜１５μｍであった。グラビア印刷では、シリンダは、ＩＰＤ−３５０（Ｉｎｋｒｏｎ）などの高粘度誘電体インクを、５０ｍＬ／ｍ２インク体積を使用して、２ｍ／分の速度で印刷するように設計された。グラビア印刷の典型的な誘電体の厚さは、７〜８μｍであった。Ｍｉｌｌｉｄｙｎｅ Ａｖａｌｏｎ ８７またはＣｙｔｏｎｉｘ Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ ＰＦＣ８０４ＵＣコーティングのいずれかを、グラビアシリンダ（１４０〜１８０Ｌ）および８ｍ／分の印刷速度で、続いて４つの連続オーブン乾燥ステップ（４×１４０℃）で使用して、最終疎水性層を印刷した。典型的な疎水性厚さは、４０〜１００ｎｍであった。
あるいは、個々のチップの小バッチに対して、誘電性コーティングおよび疎水性コーティングは、それぞれ化学気相堆積（ＣＶＤ）およびスピンコーティングを使用して適用され得る。
実施例８
低コストＤＭＦチップの機能試験
上記の実施例７に概説したように製造した３″×２″のＰＥＴ系ＤＭＦボトムチップを作動能力について試験した。図１２は、厚さ０．７ｍｍのガラス基板（３）がその上に位置した３″×２″のＰＥＴベースのＤＭＦチップ（１）を示す。ガラス基板（３）は、ガラス基板の下面に透明な酸化インジウム錫（ＩＴＯ）電極と、ＩＴＯ電極を覆うＴｅｆｌｏｎコーティングとを含む。ＤＭＦチップは、８個の緩衝液リザーバと共に、ストレートエッジ電極設計および電極間に５０μｍのギャップを有する、８０個の銀作動電極を含む（上記実施例７を参照）。
底部電極を、ＣＶＤおよびスピンコーティングによって、それぞれ誘電体Ｐａｒｙｌｅｎｅ−Ｃ（６〜７μｍ厚）およびＴｅｆｌｏｎの最終コーティング（５０ｎｍ厚）でコーティングした。０．１％の界面活性剤を含むおよそ５０μＬのＰＢＳ緩衝液（２）を、底部ＤＭＦチップ上の４つの隣接するリザーバにピペットで入れた。液滴サイズは７００〜１，５００ｎＬ（１滴または２滴）の範囲であり、混合に必要な円形掃引パターンに加えて、垂直方向および水平方向の両方の横方向の動きについて調べた（４）。液滴作動は、９０Ｖｒｍｓの電圧を使用して達成された。チップ上の作動電極のおよそ９０％が試験され、完全に機能的であることがわかった。
実施例９
低コストＤＭＦチップ上のＴＳＨイムノアッセイ
上記の実施例８に記載されているようにガラス基板で覆われた３′×２″ＰＥＴベースのＤＭＦチップを、化学発光検出を使用して、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）イムノアッセイを実行するその能力について試験した。模擬試料は、遮断剤および界面活性剤を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）緩衝液にスパイクしたＴＳＨ較正材料を含んでいた。０、４、４０μＩＵ／ｍＬの３つの試料を試験した。５μｍの磁性微粒子（３×１０８粒子／ｍＬ）上にコーティングされた２μＬの抗βＴＳＨ捕捉抗体を、微粒子リザーバからＤＭＦ電極アレイの中央に分注した。磁性微粒子を、ＤＭＦチップ下で、ネオジミウム磁石棒（３インチ×１／２インチ×１／４インチ厚、相対透過性μｒ＝１．０５、残留フィールド強度Ｂｒ＝１．３２Ｔ）を係合することによって、緩衝液から分離した（図１３Ａ）。５μＬの試料を、微小粒子スラグに移し、続いて微粒子懸濁液（図１３Ｂ）を四電極正方形構成上で５分間混合した。微粒子を、磁石によって試料から分離し、上清を廃棄物リザーバに移した（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合した２μＬの１μｇ／ｍＬ抗ＴＳＨ検出抗体を、微粒子スラグに移し、２分間混合した。微粒子を磁石によって分離し、上清を廃棄物リザーバに移した。イムノアッセイサンドイッチ複合体を含有する微粒子を、０．１％界面活性剤を含有する４×２μＬのＰＢＳ洗浄緩衝液で合計４回洗浄した。各洗浄ステップからの洗浄緩衝液は、ステップが完了した後に廃棄物に移動させた。化学発光基質は、１μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｈ２Ｏ２および１μＬのルミノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなり、これを微粒子スラグに移し、続いて６分間混合した。化学発光シグナルは、５ＶのＤＣ源を備えた一体型Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｈ１０６８２−１１０ＰＭＴを使用して４２７ｎｍ発光（３４７ｎｍ励起）で測定した。用量反応曲線を、相対発光に対してプロットした（図１３Ｅを参照）。
実施例１０
ナノポアモジュール製造
ナノポアモジュールは、ＴＥＭウィンドウ（Ｎｏｒｃａｄａ）に埋め込まれた市販の窒化ケイ素（ＳｉＮｘ）膜の統合と組み合わせた標準的なソフトリソグラフィ製造方法を使用して製造された。このモジュールは、４つの別々のＰＤＭＳ層、すなわち転送マイクロチャネルを含む上部および底部ＰＤＭＳ基板、ならびにＴＥＭウィンドウを封止するための２つの任意選択の中間ＰＤＭＳ層からなっていた。
ＳＵ８マスターモールド製造：清浄な乾燥ガラス基板を、フォトレジスト（ＳＵ８−５０）で所望の厚さにスピンコートした。次いで、フォトマスクを使用して、コーティングされた基板の領域を近紫外線に選択的に露光した。マスクは、転送マイクロチャネルおよびリザーバの形状が残ることになる領域においてのみフォトレジストをＵＶ光に露光する。露光後、露光されたフォトレジストの架橋領域へのベーキングが続いた。次いで、ＳＵ８現像液を使用して、基板から残りの未露光のフォトレジストを除去した。最終製品は、マスターモールド、すなわちパターン化された転送マイクロチャネルと硬いフォトレジストのリザーバを有するガラス基板である。
中間ＰＤＭＳ層製造：中間ＰＤＭＳ層を製造するために、ＰＤＭＳモノマーとその硬化剤（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４シリコーンエラストマー）を、７：１のＰＤＭＳモノマー：硬化剤の比で含む溶液を、ガラススライド上にスピンコートし、続いて７０℃で３０分間ホットプレート上で加熱した。ＰＤＭＳ層をガラス基板から剥がし、１．２５ｍｍの切り欠き部をＰＤＭＳ層に打ち抜いて、ＴＥＭウィンドウへのアクセスを可能にする開口部を設けた。ＰＤＭＳ層の表面は、コロナ処理機を使用して８ｍｍの距離で３０秒間プラズマ処理することによって親水性にした。第２のプラズマ処理（５秒）を使用して、２つの中間ＰＤＭＳ層の間にＳｉＮｘＴＥＭウィンドウを接合する前に、ＰＤＭＳ層およびＴＥＭウィンドウの表面を処理した。
上部および下部ＰＤＭＳの製造：マイクロチャネルを含む上部および下部ＰＤＭＳ基板を、図１４Ｂに示すように、ＰＤＭＳモノマーおよび硬化剤を７：１のＰＤＭＳモノマー：硬化剤の比で混合することと、転送マイクロチャネルおよびリザーバでパターン化したＳＵ８パターン化型（６）を含有するガラス上に注ぐことによって製造した（上記のＳＵ８種型製造を参照）。マイクロチャネルは、幅がおよそ１１０〜１３５μｍ、深さが５０μｍと測定された。１５分間脱気した後、ＳＵ８型をホットプレート上で７０℃で６０分間加熱した（７）。硬化後、ＰＤＭＳ基板をＳＵ８型（８）から剥がし、切断して、長さ３０ｍｍ×幅２０ｍｍ×深さ３ｍｍのおよその寸法を有する長方形のＰＤＭＳ基板を得た。その後の電極のマイクロチャネルへの挿入を可能にするために、アクセス穴（直径１．２５ｍｍ）をＰＤＭＳ基板に穿孔した。最終アセンブリは、図１４Ａに示され、下から上へ、１つのマイクロチャネルを含む下部ＰＤＭＳ基板（１）と、マイクロチャネル上に位置付けられた切り欠き部を含む第１の中間ＰＤＭＳ層（２）と、ＴＥＭウィンドウ内のＳｉＮｘ膜（３）と、同様に切り欠き部を含む第２の中間ＰＤＭＳ層（４）と、第２のマイクロチャネルを含む上部ＰＤＭＳ基板と、を含む。
上部および下部ＰＤＭＳ基板の整列：ＰＤＭＳ下部基板（上記の「上部および下部ＰＤＭＳの製造」で概説したように調製した）を３０秒間プラズマ処理し、続いて第１の中間ＰＤＭＳ層（上記「中間体ＰＤＭＳ層の製造」に概説したように調製した）をＰＤＭＳ下部基板の上に接合した。同様に、ＰＤＭＳ上部基板を、３０秒間プラズマ処理し、続いて第２の中間ＰＤＭＳ層をＰＤＭＳ上部基板上に接合した。中間層の切り欠き部は、マイクロチャネルと整列していた。上部および下部ＰＤＭＳ片の両方を、３０秒間酸素プラズマ処理し、続いて上部片と下部片との間にＳｉＮｘ膜ウィンドウを配置し、中間ＰＤＭＳ層の切り欠き部と整列させた。底部片と整列したＳｉＮｘ膜と整列した上部片を、全ての気泡が放出されるまで一緒に押圧した。最終ナノポアＰＤＭＳアセンブリを、ホットプレート上で１００℃で３０分間加熱し、５分間プラズマ処理した。図１４Ｃに示す最終モジュールアセンブリ（９ａ）は、２つのチャネル（１つの直線および１つの「Ｌ字型」チャネル）を含み、各々が溶液用のリザーバ（例えば緩衝液）で終了する。ＳｉＮｘ膜を含むＴＥＭウィンドウは、２つの垂直マイクロチャネルの交差部に位置付けられる（図１４Ｃ、９ｂ）。
実施例１１
ナノポアの製造
ナノポアの製造は、２つのＰＤＭＳ層の間に収容されたＳｉＮｘＴＥＭウィンドウを、絶縁破壊が起こるまで電位バイアスにかけることによって達成され、それにより膜に小さな直径の穴を開けた。これにより、検体の検出前に、マイクロ流体デバイス内に細孔を原位置形成することが可能になる。絶縁破壊によるナノポア形成は、固体誘電体膜における小径細孔の迅速な製造に有用であることが以前に示されている（Ｈ．Ｋｗｏｋ，Ｋ．Ｂｒｉｇｇｓ，Ｖ．Ｔａｂａｒｄ−Ｃｏｓｓａ，ＰＬｏＳ−Ｏｎｅ，９（３），２０１４）。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）ウィンドウ（Ｎｏｒｃａｄａ）として市販されているＳｉＮｘ膜を上記の実施例１０）に概説したように組み立てられたＰＤＭＳモジュールに埋め込んで、ナノポアを生成するために使用した。垂直マイクロチャネル接合部を、ＳｉＮｘ ＴＥＭウィンドウの断面積（５０μｍ×５０μｍ）を膜の対向側（シスおよびトランス）に配設された塩溶液（１Ｍ ＫＣｌ）に曝露した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、ＳｉＮｘ ＴＥＭウィンドウの中心からＰＤＭＳ基板を通して穿孔された穴の中へ、およそ３ｍｍの各マイクロチャネル内に配置した。鈍針を含むシリンジを使用して、液体がモジュール端部のチャネル開口部から出ることが観察されるまで、エタノールを２つのリザーバに添加することによってシスおよびトランスマイクロチャネルの両方を充填した。抵抗を測定して、適切な封止を確認し、ＴＥＭ−ＳｉＮｘ膜が無傷であることを確実にした。ＭΩ程度の抵抗は、良好な封止性および無傷で損傷していない膜を示した。エタノールを脱イオン水でマイクロチャネルから洗い流し、２つのリザーバに注入することによって１ＭのＫＣｌ溶液と交換した。適切な封止性をチェックするために抵抗を再度測定した。
４．４Ｖの定電圧を膜アセンブリに印加し、漏れ電流をリアルタイムで監視した。リアルタイムで測定された漏れ電流が、図１５Ａにプロットされている。図１５Ａは、ナノポア形成前の漏れ電流（１）を示す。５ｎＡ超の閾値をカットオフ値として使用した、すなわち、細孔形成を意味する。およそ１０分後、リーク電流の増加が見られた（２）。漏れ電流の増加を検出した直後に電圧を切った。形成された細孔の直径は、以下の関係式により決定されるように、６．９ｎｍであった。
ここで、Ｇ＝コンダクタンス、σ＝バルク導電率（ＫＣｌについて測定して１２．３５Ｓ／ｍ）、Ｌ＝膜の厚さ（１０ｎｍ）、ｄ＝孔径（Ｓ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ，Ａ．Ｇｒｏｓｂｅｒｇ，Ｙ．Ｒａｂｉｎ，Ｃ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，２２，２０１１）。
細孔形成後、電流−電圧（Ｉ−Ｖ）曲線（図１５Ｂを参照）を使用して、ナノポアがオーム挙動を示すことを検証し、ナノポアの形状が対称であり、抵抗が印加電圧または電流と無関係であることを示した。細孔製造およびＩ−Ｖ曲線の両方に同じ１Ｍ ＫＣｌ溶液を使用した。
実施例１２
乾燥マイクロチャネル充填
組み立てられたＰＤＭＳモジュール（すなわち、ＤＭＦモジュールおよびナノポアモジュールを含む集積デバイス）に含まれる毛細管は、ＤＭＦ電極アセンブリからの高塩溶液を自然に満たす能力について試験された（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。充填は、自発的毛細管流動（ＳＣＦ）を介して達成された。マイクロチャネルのより良い視覚化を可能にするために、ナノポア膜は含まれていなかった。図１６Ａを参照すると、８０個の作動電極（１）（２．２５ｍｍ×２．２５ｍｍ、Ｃｒ−２００ｎｍ厚）を含むガラスＤＭＦチップ（３″×２″×０．０２７６″）を使用して、３．６Ｍ ＬｉＣｌ、０．０５％ Ｂｒｉｊ３５および青色染料（可視化を補助するため）の液滴（２）を移動させた。ＰＤＭＳモジュール（３）は、ＤＭＦ電極アレイ（４）に面する２つの開口部、２つのリザーバ（５）および２つのマイクロチャネル、すなわち１つの直線チャネル（６）および１つのＬ字型チャネル（７）を含んでいた。２つのチャネル開口部が、ＤＭＦ電極アレイの内部に面するように、モジュールアセンブリをＤＭＦガラス表面上に置いた。上部接地電極チップが使用されなかったため、液滴の移動は、駆動電位を生成するために共面底部電極を使用することによって達成された。
１０μＬの青色のＬｉＣｌ塩溶液の液滴を、ＤＭＦ電極アレイの中央の電極上に置いた。１００Ｖｒｍｓ（１０ｋＨｚ）の電圧を使用して、液滴を直線状マイクロチャネル開口部に隣接した転送電極に移動させた。図１６Ｂに示すように、液滴がＰＤＭＳ表面（８）に接触した後、直径１３０μｍの直線状チャネル（９）を満たしてリザーバに到達するのに必要な時間を測定した。図１６Ｃに示すように、およそ３０秒後、液滴の体積は目に見えて小さくなり（１０）、チャネルは半分満たされていた（１１）。乾燥マイクロチャネル全体（直径１３０μｍ）を満たすのに５３秒の合計時間が必要であった。
湿潤マイクロチャネル充填：１０μＬの青色のＬｉＣｌ塩溶液の液滴を、ＤＭＦ電極アレイの中央の電極上に置いた。１００Ｖｒｍｓ（１０ｋＨｚ）の電圧を使用して、液滴を直線状マイクロチャネル開口部に隣接した転送電極に移動させた。予め湿らせたチャネルを模倣するために、チャネルをエタノールで予め満たした。液滴がＰＤＭＳ表面に接触した後、リザーバまでチャネルを満たすのに１秒未満の時間が必要であった。これは、乾燥チャネルよりも有意に速く、親水性溶液による事前湿潤が、マイクロチャネル充填速度を高めることを示唆している。
実施例１３
集積シリコンＮＰデバイスにおけるＤＭＦ液滴転送
ＰＤＭＳなどの可撓性基板に加えて、剛性基板（例えば、シリコン）を使用して、ナノポアモジュールを製造することができる。図１７は、作動電極（４）を含むデジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）チップ（１）を示し、そこから液滴が、ナノポアセンサ（２）を含むシリコンマイクロ流体チップに転送される。液滴は、ナノポアセンサを含むマイクロ流体チップの上面のアクセスポート（３）によって、２つの構成要素チップ間で転送さる。アクセスポートは、マイクロ流体チャネル（６）によってナノポアセンサ（５）に接続されている。液滴は、毛細管力によってアクセスポートからマイクロ流体チャネルを通って移動し、移動は、マイクロピラーのアレイ（７）から製造された受動型紙ポンプによって補助されてもよい（図１８）。受動ポンプはまた、マイクロチャネルから流体を除去し、汚染することなく（例えば、ナノポア形成およびナノポア感知のための溶液間で）異なる流体溶液を連続して使用することを可能にし得る。
シリコンナノポアモジュールの製造は、標準的なＣＭＯＳフォトリソグラフィおよびエッチングプロセスを使用することを含み得る。図１８は、ナノポア緩衝液（複数可）を充填するための前面チャネル（シス）および背面チャネル（トランス）を有する、およそのダイサイズが１０ｍｍ×１０ｍｍである、シリコンナノポアモジュール設計の例を示す。前面チャネルは、３０μｍの幅および深さを有し、長さ１１ｍｍである。背面チャネルは、幅５０μｍ、深さ２００μｍを有し、長さ１１ｍｍである。マイクロピラーの寸法は、３０μｍのピラー直径、３０μｍの間隔および２００μｍの深さである。
ＤＭＦとナノポアモジュールは、成形プラスチックから製造された界面を使用して、または直接結合によって接合することができる（図１９および２０）。アクセスポートと整列したＤＭＦチップ内の電極（４）上に位置付けられた液滴は、インターポーザ（７）によって促進された毛細管力によって転送される。代替として、ＤＭＦチップの上部電極（８）は、作動電極（４）をインターポーザ（８）と接続する穴を導入することによって、このプロセスをさらに容易にするように修正されてもよい（図２０）。
実施例１４
毛細管力によるＤＭＦとナノポアモジュールとの間の液滴転送
高塩転位緩衝液をＤＭＦチップから好適なナノポア膜を含むモジュールへ移動させる能力を、シリコンマイクロ流体チップで試験した。蛇行マイクロチャネルを、自発的毛細管流動（ＳＣＦ）を唯一の推進力として使用して、１Ｍ ＫＣｌの液滴（ｐＨ＝８）を受動的に移動させる能力について試験した。マイクロチャネル全体はシリコンで製造され、ＣＭＯＳベースのシリコン環境における流体転送のモデルとして機能した。蛇行マイクロチャネルは、２つのアクセスポート（流体装填用）を有するように設計された。チャネル寸法は、直径１６０μｍ、長さおよそ２．５ｃｍであった。絶縁破壊によるナノポアの形成に適した溶液の液滴は、受動的毛細管力を使用してシリコンマイクロ流体構造を満たすことが実証された。
図２１を参照すると、１Ｍ ＫＣｌ溶液（ｐＨ＝８．０）の個々の液滴が、輸送用マイクロ流体チャネル（２）に接続する入口ポート（１）のうちの１つに配置され、長さ２．５ｃｍの蛇行チャネル（３）をもたらした。チャネルは、大気圧に曝されたポート（図示せず）で終端した（４）。蛇行チャネルの拡大図を図２２に示す。光学顕微鏡に取り付けられたｓＣＭＯＳカメラを使用して、毛細管充填をモニターした。塩溶液を入口ポートに堆積させると、数ｍｍ／秒の速度で受動的毛細管力によってマイクロチャネルが自然に充填され、それによりマイクロチャネル内の流体をナノポア膜に転送する能力を実証する。
転送速度のさらなる試験として、チャネルからＫＣｌ溶液を取り除き、窒素流下で乾燥させた。１Ｍ ＫＣｌ溶液（ｐＨ＝８．０）のさらなる液滴を、乾燥マイクロチャネルの入口ポートに入れ、毛細管充填を光学顕微鏡を使用してモニターした。「乾燥」チャネルと比較して（すなわち、ＫＣｌ溶液がチャネルに最初に導入されたときと比較して）、より速い充填速度が観察され、それにより親水性溶液によるシリコンマイクロチャネルの予備充填は、その後の流体充填を増強したことを示した。
実施例１５
流体マイクロチャネルを有する集積ナノポアセンサの製造
流体マイクロチャネル内の集積ナノポアセンサは、フォトリソグラフィおよびエッチングプロセスを使用して、酸化シリコン（ＳＯＩ）ウェハを修正するように製造される（図２３Ａ〜図２３Ｂ）。
ＳＯＩウェハ（１）をフォトリソグラフィおよびエッチング（２）にかけて、幅３０μｍおよびチャネル深さ１０〜３０μｍの寸法を有する小さな流体体積（３）の移動に適した構造を生成する。
窒化ケイ素（ＳｉＮ）材料（５）が、蒸発（４）によってパターン化されたＳＯＩウェハ上に堆積される。
酸化物材料の層（７）は、蒸発（６）によって窒化ケイ素（５）の上に堆積される。下層のシリコン（１）は、フォトリソグラフィおよびエッチングの組み合わせを使用して、微細構造のうちの１つを被覆する上層の酸化物および窒化物材料を選択的に除去することによって露出される（６）。この構造は、少量の流体を作動させるためのマイクロチャネルを形成するであろう。
第２の微細構造内の下層の窒化ケイ素は、フォトリソグラフィとエッチングの組み合わせを使用してのみ、上層の酸化物層を除去することによって選択的に露出される（８）。
露出した微細構造は、キャリアウェハ（９）に恒久的に接合され、構造は、さらなる処理のために反転される（１０）。ＳＯＩウェハの裏面上の酸化物材料は、フォトリソグラフィとエッチングの組み合わせを使用して選択的にパターン化され、各微細構造の背面を露出させる（１１）。
実施例１６
切断可能なＤＮＡ−ビオチン構築物の合成
非ビオチン化二本鎖ＤＮＡ（ＮＰ１）の合成：標準的なホスホルアミダイト化学（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２つの一本鎖５０ｍｅｒを合成した。オリゴＮＰ１−１Ｓは、Ｃ−１２炭素スペーサ（配列番号１）によってＤＮＡから分離された、５′末端にアミノ基を含有する５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列からなる（１、ＭＷ＝１５，５２２．３ｇ／モル、ε＝５０２，１００Ｍ−１ｃｍ−１）。オリゴＮＰ１−２ＡＳは、ＮＰ１−１Ｓに相補的な５０ヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号２）からなっていた（２、ＭＷ＝１５，５０７．１ｇ／モル、ε＝４８７，９００Ｍ−１ｃｍ−１）。その後の操作の前に、両方のオリゴヌクレオチドを定量し、凍結乾燥した。
非ビオチン化二本鎖５０ｂｐ ＤＮＡ構築物の合成：ＮＰ１−２ＡＳ（１．４４ｍｇ、９３．４ナノモル）を、０．５ｍＬの蒸留水中で再構成して１８７μＭの溶液を得た。ＮＰ１−１Ｓ（１．３２ｍｇ、８５．３ナノモル）を、０．５ｍＬの５０ｍＭリン酸、７５ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に再構成して、１７１μＭ溶液を得た。二本鎖構築物（３）（配列番号１−フォワード鎖（上）；配列番号２−リバース鎖（下））を、６０μＬのＮＰ１−１Ｓ溶液（１０．２μモル）を４０μＬのＮＰ１−２ＡＳ溶液（７．４７μモル）でアニーリングすることにより作製した。混合物を８５℃の加熱ブロックに３０分間入れ、続いて２時間かけてゆっくりと室温に冷却した。１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＴｏｓｏＨ Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）に総アニーリング量（１００μＬ）を注入することによって、二本鎖材料を精製した。カラム溶出液を、２６０および２８０ｎｍでモニターした。二本鎖物質（３）は、７．９分（およそ２０分）で溶出した。０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎフィルタ濃縮器（ＭＷカットオフ１０，０００Ｄａ）を使用して、ＤＮＡを１５０μＬに濃縮した。Ａ２６０吸光度により決定したとき、最終ＤＮＡ濃度は、４０．５μＭであると計算された。
一本鎖５′−アミノオリゴのビオチン化：スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１００ｍＭ溶液は、６ｍｇの粉末を０．０９９ｍＬの無水ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解することによって作製した。溶液をボルテックスし、直ちに５′−アミノ−ＤＮＡをビオチン化するために使用した。５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中のおよそ１００μＬのｓｓＤＮＡ（１、１７１μＭ、１７．１μモル、０．２６５ｍｇ）（配列番号１）溶液を、ＤＭＳＯ中の３．４μＬの０．１ｍＭビオチン化試薬（３４．１μモル、ｓｓＤＮＡ上の２０倍モル過剰）と混合した。混合物を混合し、室温で２時間反応させた。２つの０．５ｍＬ Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷカットオフ７，０００Ｄａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で平衡化した。粗ビオチン化ｓｓＤＮＡ溶液を、１つのＺｅｂａカラムに添加し、４，６００ｒｐｍで１．３分間溶出した。溶出液を、第２のＺｅｂａカラムに転送し、記載のように溶出した。精製ＮＰ１−１Ｓ−ＳＳ−ビオチン（５）（配列番号１）の濃度は、Ａ２６０吸光度（２．０３ｍｇ／ｍＬ、１３１μＭ）を測定することによって決定した。
ビオチン化二本鎖ＤＮＡの形成：およそ６０μＬのＮＰ１−１Ｓ−ＳＳ−ビオチン溶液（５、７．８５μモル、１３１μＭ、２．０３ｍｇ／ｍＬ）を、４２μＬのＮＰ１−２ＡＳ溶液（２、７．８５μモル、１８７μｍｏｌ／Ｌ）と混合した（配列番号２）。溶液を８５℃の加熱ブロックに３０分間入れ、続いて２時間かけてゆっくりと室温に冷却した。全アニーリング量（およそ１００μＬ）を注入することにより、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を使用して、ＴｏｓｏＨ Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）で二本鎖産物を精製した。二本鎖ビオチン化物質は、Ａ２６０吸光度でモニターしたとき、７．９分（２０分の実行時間）で溶出した。０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎフィルタ濃縮器（ＭＷカットオフ１０，０００Ｄａ）を使用して、溶出液量を４８０μＬに低減した。最終ＮＰ１−ジチオ−ビオチン（６）（配列番号１−フォワード鎖（上）；配列番号２−リバース鎖（下））の濃度は、Ａ２６０吸光度によって決定されるように、１６．３μＭであると計算された。
実施例１７
切断可能なＤＮＡ−ビオチン構築物の代替合成
相補的ＤＮＡ配列（ＮＰ−３１ａおよびＮＰ−３１ｂ）：標準的なホスホルアミダイト化学（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２つの一本鎖６０ｍｅｒを合成した。オリゴＮＰ−３１ａは、Ｃ−６炭素スペーサ（配列番号１）によってＤＮＡから分離された、５′末端にアミノ基を含有する６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列からなる（１、ＭＷ＝１８，８４１．２ｇ／モル、１．７μＭ／ＯＤ）。オリゴＮＰ−３１ｂは、ＮＰ−３１ａに相補的な６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列（配列番号４）から構成されていた（２、ＭＷ＝１８２９２．８ｇ／モル、１．８μＭ／ＯＤ）。その後の操作の前に、両方のオリゴヌクレオチドを定量し、凍結乾燥した。
一本鎖５′−アミノオリゴＮＰ−３１ａのビオチン化：ＮＨＳ−ＳＳ−ｄＰＥＧ４−ビオチン（４、ＭＷ＝７５１．９４ｇ／モル、Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ）の１０ｍＭ溶液は、１５．０４ｍｇの粉末を２．０ｍＬのジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解することによって調製した。溶液をボルテックスし、直ちに５′−アミノ−ＤＮＡをビオチン化するために使用した。１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中のおよそ１００μＬのｓｓＤＮＡ（１、１００μＭ、０．０１μモル、０．１８８ｍｇ）（配列番号３）溶液を、ＤＭＦ中の１０μＬの１０ｍＭビオチン化試薬（０．１μモル、ｓｓＤＮＡに対して１０倍モル過剰）と混合した。混合物を混合し、室温で２時間反応させた。２つの０．５ｍＬ Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷカットオフ７，０００Ｄａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で平衡化した。粗ビオチン化ｓｓＤＮＡ溶液を、１つのＺｅｂａカラムに添加し、４，６００ｒｐｍで２分間溶出した。溶出液を、第２のＺｅｂａカラムに転送し、記載のように溶出した。精製ＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチン（５）（配列番号３）の濃度は、Ａ２６０吸光度（１．４５ｍｇ／ｍＬ、７７μＭ）を測定することによって決定した。
ビオチン化二本鎖ＤＮＡの形成：およそ６０μＬのＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチン溶液（５、７７μＭ）（配列番号３）を、５０μＬのＮＰ−３１ｂ溶液（２、１００μＭ）と混合した。溶液を８５℃の加熱ブロックに３０分間入れ、続いて２時間かけてゆっくりと室温に冷却した。二本鎖産物（配列番号３−フォワード鎖（上）；配列番号４−リバース鎖（下））を、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を使用して、全アニーリング容量（およそ１００μＬ）を注入することによって、ＴｏｓｏＨ Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）で精製した。二本鎖ビオチン化物質は、Ａ２６０吸光度でモニターしたとき、７．５７分で溶出した。０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎフィルタ濃縮器（ＭＷカットオフ１０，０００Ｄａ）を使用して、溶出液量を低減した。最終ｄｓＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチン（６）（配列番号３−フォワード鎖（上）；配列番号４−リバース鎖（下））の濃度は、Ａ２６０吸光度によって決定されるように、１１μＭであると計算された。
実施例１８
切断可能なＤＮＡ−ビオチン−チオール媒介切断構築物の合成
ｓｓＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチンのストレプトアビジンコーティング磁性微粒子（ＳＡ−ＭＰ）への結合および化学的切断（ＴＣＥＰまたはＤＴＴ）：化学的切断実験を、以下の方法により磁性微粒子上で行った（図２５を参照）。１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中７７μＭの修飾オリゴヌクレオチドｓｓＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチン溶液を、室温で３０分間、１μＬの０．１％ストレプトアビジン常磁性微粒子と共にインキュベートした。粒子を磁石に引きつけ、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０回洗浄することによって、過剰のオリゴを除去した。オリゴ結合粒子を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の様々な濃度のＤＴＴまたはＴＣＥＰのいずれかと共に１５分間インキュベートした。微粒子をＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０回洗浄して、切断されたオリゴヌクレオチドを除去した。発蛍光団を含有する相補配列ＮＰ−３１ｃ（配列番号５）（７、ＭＷ＝７４９４．６ｇ／モル、５．２μＭ／ＯＤ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３０分間微粒子と共にインキュベートして、粒子上にそのまま残っている任意の未切断ｓｓＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチンと結合させた。微粒子を磁石に引きつけ、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０回洗浄して、過剰のＮＰ−３１ｃセグメントを除去した。洗浄したが化学的切断を受けなかった、上記のように調製したコーティング微粒子を対照として用いた。粒子上の蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡によって測定した。最大切断効率は、表１に示すように、ＤＴＴおよびＴＣＥＰについてそれぞれ７９％および９３％と測定された。
実施例１９
切断可能なＤＮＡ−ビオチン−光切断構築物の合成
光切断可能なＤＮＡ配列および微粒子上での切断効率の評価：一本鎖ＤＮＡの光切断可能な配列を、標準的なホスホルアミダイト化学（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して合成した。オリゴヌクレオチドは、２つの光切断可能な部分によって分離された２つのオリゴセグメント（オリゴ８−１（配列番号６）およびオリゴ８−２（配列番号７））を構成する４８ヌクレオチドからなる（８、ＭＷ＝１５，４３０．１ｇ／モル、４４１８００Ｌ ｍｏｌ−１ｃｍ−１）。５′末端は、Ｃ−６炭素スペーサによってＤＮＡから分離されたアミノ基を含んでいた。蛍光タグを含むオリゴ８−２に対する相補鎖を合成した（９、ＭＷ＝７７３８．８ｇ／モル、２１２７００Ｌ ｍｏｌ−１ｃｍ−１）（配列番号８）。その後の操作の前に、両方のオリゴヌクレオチドを定量し、凍結乾燥した。
オリゴ８−１（配列番号６）：５′ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＧＴ ＣＣＧ ＣＡＴ ＣＧＡ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＣＡ３′
オリゴ８−２（配列番号７）：５′ＣＣＣ ＴＣＧ ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＣＴ ＡＣＧ ＣＣＴ３′
ＮＰ−８（８）（２つの光切断可能な部分（「ＰＣ」）によって接合されたオリゴ８−１（配列番号６）およびオリゴ８−２（配列番号７））：
Ｈ２Ｎ−５′ＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＴＣＡ−ＰＣ−ＰＣ−ＣＣＣＴＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴ３′
ＮＰ−９（９）（配列番号８）：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６−５′ＡＧＧ ＣＧＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ＧＧＧ３′
光切断実験は、以下の方法により磁性微粒子に対して行われた（図２６Ａおよび２６Ｂを参照）。ＮＰ−８を抗体に共有結合させて、Ａｂ−オリゴ複合体（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．により調製）を生成した。１００μＬの３３ｎＭ抗体−オリゴ複合体を、１μＬの０．１％固形分のヤギ抗マウス微粒子と共に室温で３０分間インキュベートした。粒子を磁石に引きつけ、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０回洗浄することによって、過剰の抗体−オリゴ複合体を除去した。微粒子複合体溶液を、ＵＶ光（３００〜３５０ｎｍの波長）下で５分間照射した。微粒子を磁石に引きつけ、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０回洗浄して、任意の切断されたオリゴセグメントを除去した。ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４）に粒子を再懸濁した後、蛍光標識オリゴ９（配列番号８）を、照射した微粒子に添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄されたがＵＶ照射を受けなかった上記のように調製されたコーティング微粒子（切断されていないオリゴ８−２）を対照として用いた。粒子上の蛍光シグナル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６）を、蛍光顕微鏡によって撮像した。表２に示すように、常磁性微粒子に結合したときの切断効率は７４％であった。
実施例２０
熱切断可能なリンカー
この実施例は、熱切断可能なリンカーおよびそれらの切断について記載する。そのような熱切断可能なリンカーは、本明細書に記載されるように、例えば、ＤＭＦチップ、液滴ベースのマイクロ流体チップ、ＳＡＷチップ等において用いられ得る。
熱切断可能なリンカーは、二本鎖ＤＮＡの熱分離の場合のように、温度を閾値以上に上昇させることによって切断される。ＤＭＦチップ内の温度上昇は、光から吸収標的にエネルギーを転送することによって光熱的に達成することができる。一方法では、約９８０ｎｍ（約９３０ｎｍ〜約１０４０ｎｍの範囲）の波長を有するレーザーなどの光源を、流体試料の領域のＤＭＦチップに適用することができる。光は流体中の水分子によって吸収され得、結果として温度上昇およびリンカーの切断をもたらす。加熱のレベルおよび期間は、パルス長、パルスエネルギー、パルス数、およびパルス繰り返し率によって制御することができる。例えば、水の吸収帯を使用する光熱加熱は、例えば、米国特許第６，０２７，４９６号に記載されている。
光熱加熱はまた、光源を染料または顔料含有標的と結合することによって達成することもできる。この場合、ＤＭＦチップの目標領域は、吸収染料または顔料、例えばカーボンブラックで印刷される。流体が標的と接触すると、光源、例えば市販のレーザーダイオードが、光吸収標的に向けられ、結果として局所的な温度上昇およびリンカーの切断をもたらす。加熱のレベルおよび持続時間は、標的の吸光特性、光波長、パルス長、パルスエネルギー、パルス数、およびパルス繰り返し率によって制御することができる。例えば、光吸収標的と組み合わせて光源を使用する光熱加熱は、米国特許第６，６７９，８４１号に記載されている。
光熱加熱の第３の方法では、吸収染料または顔料を、ＤＭＦチップ内の流体に導入することができる。次いで、光はＤＭＦチップを透過し、エネルギーは溶解または懸濁した吸収材料に転送され、結果として局所的な温度上昇およびリンカーの切断をもたらす。加熱のレベルおよび持続期間は、標的材料の吸光特性、光波長、パルス長、パルスエネルギー、パルス数、およびパルス繰り返し率によって制御る。この方法の一実施形態では、光吸収標的は、デバイスに使用される磁性微粒子懸濁液である。例えば、液滴中の懸濁ナノ粒子を使用する光熱加熱は、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ，１４０（５），１５３５−４２（２０１５）に記載されている。Ｗａｌｓｈらの参考文献もまた、光熱用途において達成することができる制御のうちのいくつかを実証している。
実施例２１
マイクロ波誘導粒子温熱療法により達成された熱的切断
この実施例は、イムノアッセイ検出が低電力マイクロ波放射の使用により加速され得るため、感熱性の切断可能なリンカーを介してカウント可能な部分を遊離する熱変性（ｄｓＤＮＡ変性、逆マイケル反応、逆デールスアルダー、および他の排除）を促進するためのマイクロ波誘導粒子温熱療法の使用について説明している。そのような感熱性の切断可能なリンカーは、本明細書に記載されるように、例えばＤＭＦチップにおいて用いられ得る。
この実施例では、４０〜５５℃の範囲の二本鎖Ｔｍを有する１５ｂｐ配列などの直交性官能化短ｄｓＤＮＡセグメントの形成が、熱遊離剤として役立つ。ｄｓＤＮＡセグメントを、スルフヒドリル−マレイミド相互作用および２６ｎｍカルボキシル化ポリスチレンナノ粒子（ＮＰ）、例えばアミン活性化カルボン酸化学などの付着化学を介してＢａｎｇｓ Ｌａｂｓ（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から得られるものなどの、抗体と付着化学を介して反応させることができる。２６ｎｍ ＮＰは、５２８．７μｅｑ／ｇの表面電荷および６８．４ｓｑ．Å／群のパーキング面積を有する（製造元情報）。抗体およびナノ粒子は、熱的に誘発された遊離可能なリンカーを形成するｄｓＤＮＡセグメントを介して会合している。熱リンカーは、粒子温熱療法および局所的温度勾配を引き起こすためのマイクロ波照射などの技法を使用して切断することができる。
ＤＮＡ配列１（１０）（配列番号９）：Ｈ２Ｎ−５′ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＡＡ３′
ＤＮＡ配列１ｂ（１１）（配列番号１０）：マレイミド−５′ＴＴＡ ＣＧＡ ＣＣＧ ＧＧＣ ＴＴＧ３′
ｄｓＤＮＡ配列（１２）（配列番号９−フォワード鎖（上）；配列番号１０−リバース鎖（下））：
Ｈ２Ｎ−５′ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＡＡ３′
３′ＧＴＴ ＣＧＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＴＴ５′−マレイミド。
直行性官能化相補ＤＮＡ配列複合体のアニーリング：ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中のおよそ１００μＭ ＤＮＡ配列１（配列番号９）の溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中１．０モル等量のＤＮＡ配列１ｂ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓオリゴアナライザツールに従う理論上のＴｍ ５１．６℃）（配列番号１０）と混合し、６０℃で３０分間加熱ブロックに配置した後、室温で２時間ゆっくり冷却することができる。得られたｄｓＤＮＡ産物を、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を使用して、ＴｏｓｏＨ Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）で全アニーリング量を注入することにより精製する。溶出液量は、０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎフィルタ濃縮器を使用して低減する。最終ｄｓＤＮＡ濃度は、Ａ２６０吸光度によって決定される。反応スキームを以下に示す（「Ｍａｌ」はマレイミドである）。
カルボキシル−ポリスチレンナノ粒子の活性化および二本鎖ＤＮＡの付加：カルボキシルナノ粒子は、実施例５の「カルボキシル−ポリスチレンナノ粒子の活性化」のセクションに記載されるように予備活性化される。ＮＰへのＤＮＡ負荷は、結合したＤＮＡ鎖の熱変性、粒子洗浄、蛍光標識された相補ＤＮＡ配列（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６−５′−ＴＴＡ ＣＧＡ ＣＣＧ ＧＧＣ ＴＴＧ３′（配列番号１１）など）のアニーリングによって決定され、蛍光顕微鏡を使用して定量した。
抗体の低減およびＮＰ−ｄｓＤＮＡ複合体への接合：実施例５の「抗体の低減」のセクションに記載されているように、抗体を低減させる。還元抗体は、ＮＰ−ｄｓＤＮＡ複合体へのカップリングに直ちに使用することができる。得られた接合体を６，５００ｇで遠心分離し、上澄みをデカントによって除去する。洗浄手順をＰＢＳ（ｐＨ７．５）で５回繰り返して、ナノ粒子から遊離抗体を除去する。ナノ粒子の取り込みに対する活性抗体の比率は、所定の抗体に対する蛍光標識抗原を用いて定量することができる。接合体ＮＰ濃度（固形分％）は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（６００ｎｍ）を使用して決定される。粒子接合体を、ＳＥＭによって調べ、サイズ／電荷分布をＺｅｔａＳｉｚｅｒを使用して決定する。
マイクロ波誘導粒子温熱療法およびナノポアカウントイムノアッセイ：上記のスキームは、調製が上述されている熱変性抗体−ナノ粒子接合体を利用するナノポアカウントアッセイを例示する。サンドイッチ型イムノアッセイは、検体捕捉剤でコーティングされた磁性微粒子を使用して調製することができ、ここで血液検体は、磁性微粒子でインキュベートされ、洗浄され、記載の抗体−ナノ粒子接合体でインキュベートされる。粒子温熱療法は、マイクロ波照射を使用して粒子表面近くに局所的な温度勾配を生じさせることによって誘導され得る。Ｄｕｔｚ ａｎｄ Ｈｅｒｇｔ（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：４５２００１（２０１４））において検討されているものなどの粒子温熱療法を使用することができる。イムノアッセイ設定における局所熱変性へのこれらの技法の適応は、（ナノ粒子などの）カウント部分を遊離する方法を提供することができる。磁性微粒子を除去した後、カウント部分（ナノ粒子）は、ナノポアを通過する際にカウントされる。
実施例２２
ナノポアカウントデータ
この実施例は、種々のタグ、例えばポリエチレングリコールを有するｓｓＤＮＡハイブリッド分子（ＤＮＡ−ＳＴＡＲ）、ｄｓＤＮＡ、ＤＢＣＯで標識されたｄｓＤＮＡ、およびＰＡＭＡＭコハク酸デンドリマーについてのナノポアカウントデータを記載する。ナノポア最適化を提供するために、異なるサイズのナノポアと共にこれらの異なるタグを使用した。異なる分子ポリマー標識を、適切な塩緩衝液に懸濁し、標準的な流体セルカセットを使用して検出した。
社内器具を使用して、電流−電圧（ｉ−Ｖ）記録（ボルタンメトリーデータ）および電流−時間（ｉ−ｔ）記録を記録した。ＣＵＳＵＭと呼ばれるコンピュータソフトウェアプログラムを用いて、取得したデータを調べ、ユーザによって入力された閾値に基づいて事象を検出した。評価における主観性の影響は、できるだけ多くの事象を検出し、後で特定の目的のためにフィルタリングすることによって最小限に抑えられた。
膜のシス側にタグを付加して、初期実験を行った。標識溶液に２００ｍＶの電気バイアスを印加し、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器およびＣＵＳＵＭソフトウェアを使用して電流遮断をモニターした。
細孔サイズがそれらの通過を制限しない限り、小分子はナノポアを非常に速く通過し得ることが知られている。高速事象の電流遮断は、システムの制限された帯域幅のために変形し得る。より速い分子は、特定のシステムによって完全に検出されないことさえあり得る。
我々の研究では、より大きなポリマーおよび大きな基修飾剤で標識された分子のみが検出された。実験条件および検出可能な事象の数を表３に示す。
これらのデータは、ＤＮＡデンドリマー、ポリマー、およびＰＡＭＡＭデンドリマーが、固体ナノポアセンサ用の検出標識として使用できることを確認している。
実施例２３
生体分子のナノポア分化
この実施例では、ナノポアを使用して、生体分子（例えば、ｄｓＤＮＡスター、ＤＢＣＯ修飾ｄｓＤＮＡおよび通常のｄｓＤＮＡ）を区別した。この方法は、異なる標識型を使用した多重化に使用することができる。
この実施例は、一本鎖オリゴヌクレオチドが共有結合した（ＤＮＡ−Ｓｔａｒ）、中央に分岐点を含む５０ｂｐオリゴヌクレオチド（ｂｐ＃２５）、中央にジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）修飾を含む二本鎖５０ｂｐオリゴヌクレオチド（塩基＃２５）、５′−チオール修飾二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。
これらの様々な修飾ＤＮＡ分子を、３．６Ｍ ＬｉＣｌ緩衝液中の３つの異なるＳｉＮｘナノポアを使用して分析した。ＤＮＡスター分子は、直径４．０ｎｍの細孔で分析し、ＤＢＣＯ修飾ＤＮＡは、直径３．７ｎｍの細孔で分析し、チオール修飾ＤＮＡは、直径４．２ｎｍの細孔で分析した。ナノポアが３つの異なる生体分子を区別する能力を示すために、現在の遮断レベル（ｐＡ）をナノポア持続時間（μｓｅｃ）に対してプロットした。集団レベルでは、散布図における明確なパターンの違いによって実証されるように、３つの異なる標識は区別可能であるように思われる（図２４Ａ〜図２４Ｃ）。個々の事象をリアルタイムで識別するには、シグナルとノイズを区別する方法として、追加レベルの遮断レベルおよび時間情報が必要である。異なるナノポア標識を区別する能力は、ナノポアを様々なアッセイにおける多重化に用いることができることを実証している。
実施例２４
定性的分析
以下の実施例は、定性的アッセイを実施するための方法を記載する。基本的に、この実施例では、構築物を使用して、ＤＭＦチップ上でアッセイの原理を実証し、構築物を切断し、標識を解放し、次いでナノポアを転位させたときにシグナルを発生させるようにナノポアを使用してカウントし、ｄｓＤＮＡ標識のこの切断およびその後のカウントが、アッセイ中に生じた特異的結合と相関している、２つの特異的結合メンバー対（ストレプトアビジンおよびビオチン）の結合を示す。さらに、適切な対照実験を行って、ナノポア転位測定中にカウントされた標識から発生したシグナルが、アッセイプロセス流に導入されるチオール切断試薬の存在と相関するのではなく、アッセイプロセス中に生じた特異的結合事象によることを確認した。実施した実験の詳細は、以下のとおりである。
ＤＭＦを使用したチオール媒介切断：切断可能なジスルフィド結合を含むビオチン標識二本鎖ＤＮＡ（実施例１７の（６））を、ナノポア検出／カウントのための標的として使用した。結合アッセイは、ＤＭＦチップ上のストレプトアビジン磁性微粒子にビオチンＤＮＡを結合させ、続いてチオール媒介化学的切断ステップからなる（図２５を参照）。ＤＭＦチップ上の試薬の配置を図２７に示す。ストレプトアビジン磁石粒子に結合した種から分離された切断されたＤＮＡ標的を、制御された絶縁破壊によって形成されたプレドリルナノポアを有する固体窒化ケイ素（ＳｉＮｘ）膜を含むナノポア流体セルに転送した（Ｈ．Ｋｗｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ，９（３），２０１４）。ＤＮＡ標的物質をカウントし、オープンソースＣＵＳＵＭソフトウェア分析パッケージ（ＮＩＳＴ）を使用して分析した。
適切な試薬を、８個の試薬リザーバを含むガラス製ＤＭＦチップ（３″×２″×０．０２７６″）に負荷した。廃棄物リザーバを除いて、各リザーバは、およそ５μＬの各試薬を含んでいた。試薬の濃度は以下のとおりであった。ＰＢＳ中１１μＭのビオチン−ＳＳ−ＤＮＡ（ｐＨ＝７．２）、１０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）Ｍ−２７０ ２．７μｍのストレプトアビジンでコーティングされた磁性微粒子（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＢＳ洗浄緩衝液（ｐＨ＝７．２）＋０．０５％ ＥＴＫＴ（エチレンテトラ−ＫＩＳ（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロ）、５０ｍＭトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）。分注されたＤＭＦ液滴のおよそのサイズは、１．５μＬであった。
１滴のＭ−２７０ストレプトアビジンでコーティングされた微粒子を分注し、１滴のｄｓＮＰ−３１−ＳＳ−ビオチンとおよそ４０分間混合した。２滴を複合し、ＤＭＦチップ上で１２個の電極（３×４）上を円形パターンで動かすことによって混合を達成した。底部磁石を係合させて微粒子を収集し、上清を廃棄物リザーバに移した。次に、２滴のＰＢＳ／ＥＴＫＴ緩衝液を分注して、微粒子スラグに移し、次いでこれを溶液に再懸濁した。懸濁液を５分間混合した後、磁石を再び係合させ、上澄み液を廃棄物リザーバに移した。混合時間を４５分まで徐々に増やしながら、粒子洗浄ステップを合計１１回繰り返した。最後の洗浄上清を空のリザーバに移した。追加の５滴のＰＢＳ／ＥＴＫＴを同じリザーバに移した。ナノポア分析の準備として、３４−ＡＷＧ非金属シリンジ（Ｍｉｃｒｏｆｉｌ ３４−ＡＷＧ）を使用して、リザーバ内の洗浄液およびＰＢＳ／ＥＴＫＴを除去し、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に転送した。２滴のＴＣＥＰ試薬を微粒子スラグに移し、４５分間混合することによって、切断を開始した。底部磁石を係合させ、上清（切断されたＤＮＡを含む）を空のリザーバに移した。さらに５滴のＰＢＳ／ＥＴＫＴ洗浄緩衝液を、同じリザーバに移した。ナノポア分析の準備として、３４ゲージの非金属製シリンジを使用して、最終抽出物をＤＭＦチップから取り出し、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に転送した。切断溶出液を３０秒間微量遠心分離し、１分間磁気ラックに入れて微量の微粒子を除去した。
ナノポア分析：ＴＥＭウィンドウ（０．０５μｍ×０．０５μｍ）に埋め込まれた１０ｎｍ厚のＳｉＮｘ膜（Ｎｏｒｃａｄａ ＮＴ００５２、低応力ＳｉＮｘ）の制御された絶縁破壊（ＣＢＤ）を使用して、ナノポア製造を達成した。この方法は、高精度かつ最小のコストで小径の固体細孔を形成することができる。ＴＥＭ−ＳｉＮｘ膜を、２つの緩衝液チャンバを含むポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）流体セルに入れ、２つのシリコーンエラストマーガスケットを使用して封止した。流体セルは、セルの底部に１６μＬの体積チャネルを含み、これは上部チャンバの塩溶液をナノポア膜に接続した。ナノポア製造のために、流体セルを最初に脱気エタノールで満たし、脱気脱イオン水で交換し、次いで１８ＭΩ脱イオン水中で重炭酸ナトリウムでｐＨ１０に緩衝した脱気０．５Ｍ ＫＣｌで満たした。８Ｖのバイアス電圧を使用する増幅器を用いて製造を行った。流体セルの両側を、銀／塩化銀ワイヤを使用して接続した。Ｋｗｏｋらに記載されているように、８Ｖの固定電圧を設定している間、電流はリアルタイムで静電容量（電流の低減）を呈する。電流が増加すると、電力がセルから除去される。製造のためのサンプリングレートは２５ＫＨｚである。漏れ電流の増加は、細孔の形成を示し、それによって電圧が切られた。孔径は、以下のコンダクタンスに基づく式から求めた。
ここで、Ｇ＝コンダクタンス、σ＝バルク導電率（ＫＣｌについて測定して１２．３５Ｓ／ｍ）、Ｌ＝膜の厚さ（１０ｎｍ）、ｄ＝孔径（Ｓ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ，Ａ．Ｇｒｏｓｂｅｒｇ，Ｙ．Ｒａｂｉｎ，Ｃ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，２２，２０１１）。Ｉ−Ｖ曲線を生成することによって、ナノポアのオーム挙動を調べた。測定されたナノポアの直径は、４．４ｎｍであると決定され、続いて切断されたｄｓ−ＳＳ−ＤＮＡ標的の検出に使用された。
製造塩緩衝液を、３．６Ｍ ＬｉＣｌと交換し、これを転位事象を検出するための感知緩衝液として使用した。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器と、ナノポア膜を収容する流体セルへの銀／塩化銀接続との間にヘッドステージを配置した。
およそ０．２μＬのＴＣＥＰ切断ｄｓ−ＤＮＡ標的を、１．８μＬのＰＢＳ緩衝液（これは、ＴＣＥＰ切断溶出液の１０倍希釈液に相当する）で希釈し、およそ３０μＬの３．６Ｍ ＬｉＣｌ塩溶液を含んでいたナノポア細胞チャンバに全量を装填し混合した。最後のＤＭＦ洗浄溶出液を、陰性切断対照として使用した（これは希釈しなかった）。ＴＣＥＰ溶出液および陰性対照について、ＤＮＡ転位の数をそれぞれ２３分および６５分間測定し、流動速度（ｓｅｃ−１）に変換した。図２８に示す結果は、ｄｓ−ＳＳ−ＤＮＡ標的がＤＭＦを使用してＭ−２７０ストレプトアビジン粒子から首尾よく切断され、検出器として固体ナノポアを使用して検出されたことを実証する。ナノポア流動速度から測定して、ＳＮＲは２１．９であると決定された。
データ分析：転位事象の数は、実験的試験条件下、以下の等式を使用して、二本鎖ＤＮＡ転位事象において見出される予想電流変化を最初に計算することによって決定することができ、
Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８およびＫｗｏｋ，Ｈ．；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｋ．；ａｎｄ Ｔａｂａｒｄ−Ｃｏｓｓａ，Ｖ．；″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″−ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３）：ｅ９２８８０（２０１４）において参照される。この予想される電流遮断値を使用して、実験的ナノポア出力のバイナリファイルデータを、許容可能な予想される電流遮断事象について視覚的に手動で走査した。これらの事象を使用して、ＣＵＳＵＭナノポアソフトウェアに必要な閾値およびヒステリシスパラメータを適用して実行した。このソフトウェアからの出力は、ｃｕｓｕｍｔｏｏｌｓ ｒｅａｄｅｖｅｎｔｓ．ｐｙソフトウェアを使用し、１０００ｐＡを超える（最初の計算から決定される）遮断事象をフィルタリングして、さらに分析した。流動事象、事象間の時間および他の計算は、ｒｅａｄｅｖｅｎｔｓ．ｐｙ分析ツールから決定した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を使用して、ＣＵＳＵＭ生成データに対して追加の計算を行った。この閾値設定方法は、データ分析および閾値設定に対する１つの手法であり、本発明はこの方法に限定されず、当業者に知られているような他のそのような方法も使用できることが理解される。
要約：この実施例は、本明細書中に記載されるようなステップのプロセスを実施することによる定性的アッセイを記載する。図２５に示されているチオールベースの切断ステップを用いて、実施例１７に記載されるように、切断可能なリンカー接合体を使用して直接アッセイを実施した。そのようなアッセイを実施するための他の切断可能なリンカー手法はまた、本明細書中に記載されるように、種々のタグのカウントを可能にするための、リンカーの切断の種々の他の方法を含み得るがこれらに限定されないことが理解される。例えば、実施例１７に記載の方法に加えて、そのような他の代替の切断方法および／または試薬は、本明細書に記載され、当業者に知られている他の切断方法に加えて、実施例１６、実施例１８、実施例１９、実施例２０および実施例２１に記載のものを含み得る。この実施例（実施例２４）において実証されたアッセイフォーマットは、直接アッセイを表すが、サンドイッチイムノアッセイフォーマットおよび／または様々な競合アッセイフォーマットなど、当業者に知られているものなどの他のフォーマットが、記載された方法を使用してアッセイを実施するために同様に実装され得ることも理解される。
例えば、実施例９に記載されているように、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の検出のためのサンドイッチイムノアッセイフォーマットは、低コストＤＭＦチップ上でそのようなアッセイを実施する能力を実証した。さらに、他の方法で当業者に知られている他の切断可能なリンカーに加えて、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載されているものなどの様々なヘテロ二官能性の切断可能なリンカーを使用して、イムノ接合体の生成に有用な多数の様々なバイオ接合試薬または切断可能なリンカーを有する他の活性特異的結合メンバーが合成され得る。本発明の実施に有用な免疫接合体は、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載されるものなどの方法によって、ならびに当業者に公知の他の方法によって合成することができる。さらに、実施例８は、サンドイッチおよび競合アッセイフォーマットを含む様々なアッセイフォーマット、ならびに当業者に知られているそれらの他の変形を実行するために必要な様々なステップを容易にすることができる、低コストチップ上の様々な液滴操作の機能を示す。実施例１１は、アッセイにおいて切断可能な標識をカウントするために使用することができるナノポアの製造を示すが、当業者に知られているナノポア製造のための他の方法もまた、この目的のために使用することができることが理解される。実施例１６はまた、切断が行われるアッセイの実施に有用な別の構築物を表し、したがって、この実施例に記載されるように、ナノポアカウント法を使用してカウントできるように、カウント可能な標識が遊離される。
実施例２２は、一般に、ナノポアを横断する様々な標識の存在に関する転位事象を測定することができるように、カウントをどのようにして行うことができるかを示す。図２９は、カウントアッセイにおいてデータの質を操作することができるようにするための、シグナルの閾値化の概念を示す。図２８は、この実施例に記載されるようなアッセイ方法を使用して、検体の存在を決定するために使用され得るデータの種類を表す定性的アッセイデータを示す。この特定の実施例では、ｄｓＤＮＡを標識として使用したが、ナノビーズ、デンドリマー等を含むがこれらに限定されない実施例５および／または実施例２２に記載の標識などの他の標識も利用され得ることも理解される。適切な試薬を生成するために必要とされるそのような構築物は、本出願において本明細書における様々な実施例を通して、またはそうでなければ当業者に知られている方法を介して合成され得る。
実施例２５
定量的分析
以下の実施例は、定量的アッセイを実施するための方法を記載する。基本的に、この実施例では、実施例２４の延長として、増加した量のカウント標識が（この場合はカウント可能な標識がｄｓＤＮＡ分子である）、標準曲線上で、アッセイ（結合）ステップにおいて結合された（順に元の試料中に存在する検体の量と相関する）特定の結合剤の量に相関することを実証するように標準曲線を生成した。この特定の実験の標準曲線は、データ分析の様々な異なる方法に基づく図３１、図３２、図３４、または標準曲線を生成するために流動に依存する図３４に見出すことができる。後者の場合、図３４に示す測定方法は、事象／時間（カウント事象の流動）に基づいているが、所与の試料中で測定される検体濃度の量に相関する標準曲線を生成するために他の測定方法も使用できることが理解される。実施した実験の詳細は、以下のとおりである。
ナノポア製造：ＴＥＭウィンドウ（０．０５μｍ×０．０５μｍ）に埋め込まれた１０ｎｍ厚のＳｉＮｘ膜（Ｎｏｒｃａｄａ ＮＴ００５２、低応力ＳｉＮｘ）の制御された絶縁破壊（ＣＢＤ）を使用して、ナノポア製造を達成し、この方法は、高精度かつ最小のコストで小径の固体細孔を形成することができる。ＴＥＭ−ＳｉＮｘ膜を、２つの緩衝液チャンバを含むポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）流体セルに入れ、２つのシリコーンエラストマーガスケットを使用して封止した。流体セルは、セルの底部に１６μＬの体積チャネルを含み、これは上部チャンバの塩溶液をナノポア膜に接続した。ナノポア製造のために、流体セルを最初に脱気エタノールで満たし、脱気脱イオン水で交換し、次いで１８ＭΩ脱イオン水中で重炭酸ナトリウムでｐＨ１０に緩衝した脱気０．５Ｍ ＫＣｌで満たした。８Ｖのバイアス電圧を使用する増幅器を用いて製造を行った。流体セルの両側を、銀／塩化銀ワイヤを使用して接続した。Ｋｗｏｋらに記載されているように、８Ｖの固定電圧を設定している間、電流はリアルタイムで静電容量（電流の低減）を呈する。電流が増加すると、電力がセルから除去される。製造のためのサンプリングレートは２５ＫＨｚであった。漏れ電流の急な増加は、細孔の形成を示し、それによって電圧が切られた。０．５Ｍ ＫＣｌ緩衝液を、３．６Ｍ ＬｉＣｌ（ｐＨ＝８．３）で置き換えた。
孔径は、以下のコンダクタンスに基づく等式から求めた。
ここで、Ｇ＝コンダクタンス、σ＝バルク導電率（ＬｉＣｌについて測定して１６．０６Ｓ／ｍ）、Ｌ＝膜の厚さ（１０ｎｍ）、およびｄ＝孔径（Ｓ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ，Ａ．Ｇｒｏｓｂｅｒｇ，Ｙ．Ｒａｂｉｎ，Ｃ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，２２，２０１１）。Ｉ−Ｖ曲線を生成することによって、ナノポアのオーム挙動を調べた。測定されたナノポアの直径は、４．８ｎｍであると決定され、続いてＤＮＡ較正標準の検出に使用された。
ＤＮＡ用量反応：ＤＮＡ標準を較正物質として使用して、漸増濃度のＤＮＡに伴うナノポア流動速度の変化を決定することによって用量反応曲線を観察した。これにより標準曲線が生成され、これをイムノアッセイにおける切断ＤＮＡ標識の定量に使用することができる。２μＬの１．５μＭ １００ｂｐ ＤＮＡ標準（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、３０μＬの３．６Ｍ ＬｉＣｌ塩溶液を含有するＰＴＦＥ流体セルにピペットで入れ、９４ｎＭ ＤＮＡの最終濃度を得た。ナノポア分析の前に、溶液を数回上下にピペット操作することによって試薬を混合した。セルを＋２００ｍＶのＤＣバイアスにかけ、６０分にわたって電流遮断についてモニターした。ＣＵＳＵＭ分析ソフトウェアを使用して、電気シグナルおよびカウント率を特徴付けた。この手順を２回繰り返して、標準曲線上に１８２ｎＭおよび２６６ｎＭの２つの追加の点を得た。３つの標準全てについて、異なる期間にわたる電流遮断を示している。すなわち９４ｎＭで４１秒（図３０Ａ）、１８２ｎＭで２４秒（図３０Ｂ）、２６６ｎＭで８秒間（図３０Ｃ）。ベースラインノイズは、経験的に、図３０Ａ、図３０Ｂおよび図３０Ｃについてそれぞれおよそ９００ｐＡ、９００ｐＡおよび１０００ｐＡであると推定された。
実行から得られたデータを使用して、３種類の用量反応曲線を生成した。一定の時間量（５分）にわたる事象数（図３１）、一定数の事象（２００事象）に必要な時間（図３２）、および単位時間当たりの事象数（図３３）。これらの曲線のそれぞれは、標識としてＤＮＡを使用する、定量的なナノポアベースのイムノアッセイのための標準曲線として使用され得る。同様に、デンドリマー、ポリマー、ナノ粒子等のような他の標識を使用して、様々な検体を定量することができる。
Ｓｅｑ３１−ＳＳ−ビオチンＤＮＡ用量反応：合成ＤＮＡ構築物、Ｓｅｑ３１−ＳＳ−ビオチンを原料物質として使用して、用量反応曲線を生成した（図４７）。この標的を使用して、定性的アッセイにおいてストレプトアビジンビーズから切断された切断標識ＮＰ−Ｓｅｑ３１−ＳＳ−ビオチンを定量することができる。この物質は、切断標識Ｓｅｑ３１−ＳＳ−ビオチンとほぼ同じＭＷおよび電荷密度を有するため、ＴＣＥＰおよび／またはＤＴＴを使用してストレプトアビジン微粒子から切断標的を定量するために較正曲線に使用することができる。
データ分析：転位事象の数は、実験的試験条件下、以下の等式を使用して、二本鎖ＤＮＡ転位事象において見出される予想される電流変化を最初に計算することによって決定することができ、
Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８およびＫｗｏｋ，Ｈ．；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｋ．；ａｎｄ Ｔａｂａｒｄ−Ｃｏｓｓａ，Ｖ．；″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″−ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３）：ｅ９２８８０（２０１４）において参照される。この予想される電流遮断値を使用して、実験的ナノポア出力のバイナリファイルデータを、許容可能な予想される電流遮断事象について視覚的に手動で走査した。これらの事象を使用して、ＣＵＳＵＭナノポアソフトウェアに必要な閾値およびヒステリシスパラメータを適用して実行した。このソフトウェアからの出力は、ｃｕｓｕｍｔｏｏｌｓ ｒｅａｄｅｖｅｎｔｓ．ｐｙソフトウェアを使用し、１０００ｐＡを超える（最初の計算から決定される）遮断事象をフィルタリングして、さらに分析した。流動事象、事象間の時間および他の計算は、ｒｅａｄｅｖｅｎｔｓ．ｐｙ分析ツールから決定した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を使用して、ＣＵＳＵＭ生成データに対して追加の計算を行った。この閾値設定方法は、データ分析に対する１つの手法であり、本発明はこの方法に限定されないが、当業者に知られているような他のそのような方法も使用できることが理解される。
要約：この実施例は、本明細書中に記載されるようなステップのプロセスを実施することによる定量的アッセイを記載する。図２５に示されているチオールベースの切断ステップを用いて、実施例１７に記載されているように、切断可能なリンカー接合体を使用して直接アッセイを実施した。そのようなアッセイを実施するための他の切断可能なリンカー手法はまた、本明細書中に記載されるように、ナノポアを使用する種々のタグのカウントを可能にするための、リンカーの切断の種々の他の方法を含み得るがこれらに限定されないことが理解される。例えば、実施例１７に記載された方法に加えて、そのような他の切断方法としては、本明細書に記載され、当業者に知られている方法に加えて、実施例１８、実施例１９、実施例２０および実施例２１に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。この実施例（実施例２５）において実証されたアッセイフォーマットは、直接アッセイを表すが、サンドイッチイムノアッセイフォーマットおよび／または様々な競合アッセイフォーマットなど、当業者に知られているものなどの他のフォーマットが、アッセイを実施するために同様に実施され得ることも理解される。
例えば、実施例９に記載されているように、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の検出のためのサンドイッチイムノアッセイフォーマットは、低コストＤＭＦチップ上でそのようなアッセイを実施する能力を実証した。さらに、他の方法で当業者に知られている他の切断可能なリンカーに加えて、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載されているものなどの様々なヘテロ二官能性の切断可能なリンカーを使用して、イムノ接合体の生成に有用な多数の様々なバイオ接合試薬または切断可能なリンカーを有する他の活性特異的結合メンバーが、当業者により合成され得る。さらに、実施例８は、サンドイッチおよび競合アッセイフォーマットを含む様々なアッセイフォーマット、ならびに当業者に知られているそれらの他の変形を実行するために必要な様々なステップを容易にすることができる、低コストチップ上の様々な液滴操作の機能を示す。実施例１６はまた、切断が行われるアッセイの実施に有用な別の構築物を表し、したがって、この実施例に記載されるように、ナノポアカウント法を使用してカウントできるように、カウント可能な標識が遊離される。
実施例２２は、一般に、ナノポアを横断する標識の存在に関する転位事象を測定することができるように、カウントをどのようにして行うことができるかを示す。図２９は、カウントアッセイにおいてデータの質を操作することができるようにするための、シグナルの閾値化の概念を示す。図３１、３２および３３は、この実施例に記載されるようなアッセイ方法を使用して、検体の量を決定するために使用され得るデータの種類を表す定性的アッセイデータ出力を示す。図３４は、化学的方法を使用して切断された構築物から生成された標準曲線を示す。この特定の実施例では、ｄｓＤＮＡを標識として使用したが、ナノビーズ、デンドリマー等を含むがこれらに限定されない実施例５に記載の標識などの他の標識を利用することもできる。そのような構築物は、当業者に公知の方法によって合成することができる。
実施例２６
ナノポア電界シミュレーション
理論的な直径１０ｎｍのナノポアを通る対イオン濃度および電気浸透流速に対するＳｉＯ２ビアのサイズの影響を研究するために、シリコンモジュールで使用される提案されたナノポア膜設計について一連のＣＯＭＳＯＬシミュレーション実験を行った。ＳｉＯ２の最上層は、複数の目的を果たした。１）ＳｉＮｘ膜に絶縁層を提供し、それによりナノポアの容量性ノイズを低減する。２）シリコン基板内のＳｉＮｘ膜の堅牢性および強度を高める。３）溶液に曝露されるＳｉＮｘ領域のサイズを小さくし、それにより制御された絶縁破壊（ＣＢＤ）プロセスから膜上の細孔の位置付けを改善する。電界シミュレーションを使用して、局所対イオン濃度および細孔を通る電気浸透流に対するＳｉＯ２層の干渉を決定した。
図３５を参照すると、シリコン基板（１）をエッチングして、ＳｉＮｘ膜の上下に位置するシスおよびトランスチャンバを得た。ＳｉＮｘ膜（５０μｍ×５０μｍ）（２）を、厚さ３００μｍのＳｉＯ２の最下層と、厚さ３００μｍのＳｉＯ２の最上層（３）との間に積層した。最上層を製造して（４）を介してＳｉＯ２を形成し、これによりＣＢＤ中にナノポアの形成が可能となった。ＳｉＯ２ビアの最適直径は、シミュレーションによって決定された。
ＣＯＭＳＯＬシミュレーション結果：ＣＯＭＳＯＬ電界シミュレーションは、材料、静電気学、分子輸送および層流特性に基づく物理モデルを使用した。電位は、ポアソン方程式に基づいた。イオン流動は、ネルンスト−プランク方程式に基づいた。流速は、ストークス方程式に基づいた。シミュレーションに使用した物理的パラメータは、図３６に示す表１に定義されている。
細孔付近の対イオン濃度勾配についてのＣＯＭＳＯＬの結果は、図３７に示されており、ＳｉＯ２ビア直径が、直径５０ｎｍを超えたときにイオン濃度の影響をほとんどまたは全く示さない。５０ｎｍ未満では、細孔の口の近くに正味電荷の蓄積が生じた。最も深刻な影響は、２５ｎｍの直径で観察され、大きなイオン勾配が細孔の近くに形成された。結果は、ナノポアがＳｉＯ２壁から２５〜５０ｎｍ未満離れているとき、ＳｉＯ２表面のかなり大きな影響を示した。
細孔を通る対イオンの電気浸透流速は、ＳｉＯ２層がナノポアセンシングに及ぼし得る影響を決定する方法としてシミュレートされた（図３８）。電気浸透流の最高速度は、より大きいビア直径（１００〜４，５００ｎｍ）で生じた。細孔を通る流速の低減が、５０ｎｍのＳｉＯ２ビアについて観察され、続いて２５ｎｍのビアについて有意な低減が観察された。
図３９に示されるように、細孔対ビア直径を通るコンダクタンスの測定は、１００ｎｍを超える飽和曲線を示し、ビア直径が１００ｎｍ〜２５ｎｍのサイズに低減するにつれてコンダクタンスが減少した。
実施例２７
ナノポアモジュールをデジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）モジュールに統合する
ナノポアモジュールは、ＤＭＦモジュールの片側に位置していた。細孔の形成および検体の検出のためにＤＭＦモジュールからナノポアモジュールへの液体輸送を可能にするために、ＤＭＦモジュールに穴が存在した（例えば、図４０を参照）。
ナノポアモジュールからの１つの電極は、ナノポアモジュール内の流体体積内で終端した。もう一方の電極は、ＤＭＦモジュール内の流体体積内で終端した。この電極は、ＤＭＦモジュールの第２の穴を経由した。液体がＤＭＦモジュール内の穴を通って移動することができたことを実証するために、液体が適所に移動された後に平らな紙をチップの外面上で押した。この紙の濡れは、液体が毛細管力を介してＤＭＦモジュールからこの穴の上に位置する別のモジュールに移動できることを示した（図４１）。
図４２を参照すると、ＤＭＦモジュールは、ナノポア製造を制御するためにＡｇ／ＡｇＣｌ電極を備えていた。この設定では、ナノポアモジュール上の液体体積は、ＬｉＣｌの外液滴であった。この液体をナノポアモジュール上に直接分注し、電極端子をこの液滴内に吊り下げた。
ＤＭＦ技術を使用して、試料をＤＭＦモジュールの穴に移動させた。試料は、受動的に穴を通って移動し、ナノポア形成のためにナノポアモジュールに曝露された。ナノポアモジュールは、ＤＭＦモジュールに封止され（例えば、ＰＤＭＳ、圧力、ワックス等を使用して）、各モジュール内に保持されている液体体積を隔離する。図４５は、ナノポアの製造中の時間の関数としての電流を示す。
ナノポアが形成されたら、調整プロセス（経時的に電圧を変化させる）を使用して、ナノポアを物理的に修飾してシグナルをクリーンにした。このプロセスは、Ｉ−Ｖ曲線の対称性を改善した。前後のＩ−Ｖ曲線を、それぞれ図４６Ａおよび４６Ｂに示す。
実施例２８
カウント標識および孔径分析
一連の実験は、孔径およびカウント標識サイズに対してある特定の属性を分析し、実証するために、様々な一連の条件下で二本鎖ＤＮＡを使用して行われた。これらの実験では、検出電圧、ＤＮＡ長、ＤＮＡ濃度、塩濃度および塩組成、膜材料、膜厚、ナノポア直径および他の要因を含む様々なパラメータを調べた。
次いで、データセットをシグナル対ノイズ比に関して分析し、その因子をカウント標識サイズ（推定分子直径）に対して種々の孔径と比較した。例えば、膜材料および厚さなどの、ある特定の因子は、この一連の実験において一定に保たれたが、他の因子は変動した。
集計データセット分析から、実験で決定されたＳＮＲ（シグナル対ノイズ比）に対するカウント標識平均直径とナノポアサイズとの間の比の平均をプロットした（図４７）。図４７は、一般に、有用なカウントデータが、この特定のデータセットでは約約０．４〜０．８のような比率の範囲から得られることを実証し、そのような比率は、およそ約２．０ｎｍのｄｓＤＮＡの分子直径を仮定する。線状ｄｓＤＮＡは、その分子直径についてであることが文献から知られており、分析は、ＤＮＡがその線状立体配座で細孔を通って進むと仮定する。表４は、計算データを示す。
この実施例で前述したように、条件は変化したが、このデータセットの一般的な範囲は、この範囲内で合理的なシグナル／ノイズ比のデータをカウントできることを示している。さらに、当業者であれば、合理的なＳＮＲを達成するために、他のカウント標識分子直径とナノポア直径との比を利用できることを認識するであろうことに留意すべきである。加えて、一般に標識は、細孔を通過することができるように、ナノポアのサイズより小さいその分子直径の少なくとも１つの寸法を有するべきであること、または言い換えれば、標識分子直径とナノポア直径とのこの比は、恐らくナノポア力分光法と呼ばれる技術において説明されるような条件が使用される場合を除いて、一般に標識が細孔を通過できるものよりも小さいはずであり、ここでエネルギーをシステムに付加して、標識に立体配座の変化を起こしやすくし、それによってそのような転位事象が起こることを可能にするレベルまで変形した後に細孔を通過させることができるようにする。
この実施例に記載されるように、ｄｓＤＮＡ以外の他の標識をカウントするために利用することができ、それらはこのグラフに示されるものとは異なる挙動を有し得ることもまた当業者に理解されるべきである。さらに、そのような標識の分子カウントを可能にするために、他の分子直径とナノポアとの比から許容できるＳＮＲを得ることもまた可能であり、現在の遮断は、以下の等式に記載されるように、そのようなカウント標識の分子直径に関連し得ることが理解されるべきであり、
これはＫｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８および／またはＫｗｏｋ，Ｈ．；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｋ．；ａｎｄ Ｔａｂａｒｄ−Ｃｏｓｓａ，Ｖ．；″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″−ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３）：ｅ９２８８０（２０１４）において見出すことができる。この等式を使用して、この文書の実施例２４および２５に記載されているように、シグナルをゲートまたは閾値処理することができる。
この一連のナノポアカウント実験の集合内で変動したある特定の特定条件は以下を含んでいた。
●イオン強度−３または３．６Ｍ
●ＤＮＡの長さ−１０ｋｂｐ、５０ｂｐまたは１ｋｂｐ
●使用されるイオン塩−ＬｉＣｌまたはＫＣｌ
●膜材料−ＳｉＮｘ（データセット全体で一定）
●膜厚−１０ｎｍ（データセット全体で一定）
●ＤＮＡ濃度−３ｎＭ〜約３０６ｎＭの間で変動
●電圧−５０〜６００ｍＶの増分を含む変動
●ナノポア直径−８．０、１．１、３．６、４．２、２．８、２．５、７．７、３．１、２．７、２．６、２．９および４．２（全てナノメートル単位）を含む様々な孔径。
これらを含むが限定されない様々な条件は、計算可能であるが、この実施例で参照されるようなＫｗｏｋらのこの等式の量に従って電圧が印加されるとき、細孔の直径より小さいカウント可能な標識が、細孔を横切るイオン電流の流動の遮断を引き起こし得る状況において得られることを示すことが結論され得る［Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８ ａｎｄ／ｏｒ Ｋｗｏｋ，Ｈ．；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｋ．；ａｎｄ Ｔａｂａｒｄ−Ｃｏｓｓａ，Ｖ．；″Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ″−ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（３）：ｅ９２８８０（２０１４）］。
これらの条件は、デンドリマー、ヘミデンドリマー、ナノビーズ、アニオン性またはカチオン性ポリマー、変性線状化アプタマー、負電荷もしくは正電荷ポリペプチド、または他の電荷ポリマーもしくはカウント可能な分子実体等を含むが、これらに限定されないｄｓＤＮＡ以外の他の標識についてノイズに対する合理的なシグナルで機能する、孔径に対するカウント標識分子直径を示すように適用され得ることも理解されるであろう。
最後に、本発明の様々な態様および特徴を本明細書の様々な実施形態および具体例に関して説明してきたが、それらは全て従来どおりに作製または実行することができるが、本発明は特許請求の全範囲内で保護する権利があることを理解する。
前述の詳細な説明および添付の実施例は、単なる例示であり、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義される、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことが理解される。
開示された実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者に明らかであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合物、または使用方法に関するものを含むがこれらに限定されないそのような変更および修正は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得る。
完全を期すために、本発明の様々な態様を以下の番号を付けた項に記載する。
項１．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出する方法であって、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含む、接触させることと、（ｃ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、（ｄ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合した第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを移動させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項２．層を通って転位する各タグが、転位事象であり、転位事象の数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量が、ｉ）一定期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）一定数の転位事象が発生するまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が発生する間の平均時間を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照が、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準である、項１に記載の方法。
項３．サブセクションｉ）における標準曲線が、一定期間の間の検体の対照濃度について転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について設定数の転位事象が起こるまでの時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について転位事象間の平均時間を測定することによって決定される、項２に記載の方法。
項４．方法が、単一分子カウントを含む、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
項５．タグが、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、デンドリマー、およびナノ粒子からなる群から選択される、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
項６．タグが、実質的に球形または半球形である、項１または５に記載の方法。
項７．タグが、実質的に球形であり、ナノ粒子を含む、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
項８．タグが、実質的に球形または半球形であり、デンドリマーを含む、項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
項９．デンドリマーが、正電荷または負電荷である、項８に記載の方法。
項１０．ナノ粒子が、正電荷ナノ粒子を含む、項５または７に記載の方法。
項１１．ナノ粒子が、負電荷ナノ粒子を含む、項１０に記載の方法。
項１２．第１および第２の結合メンバーが、抗体または受容体である、項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
項１３．第１の結合メンバーが受容体であり、第２の結合メンバーが抗体であるか、または第１の結合メンバーが抗体であり、第２の結合メンバーが受容体である、項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
項１４．第１の結合メンバーが第１の抗体であり、第２の結合メンバーが第２の抗体である、項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
項１５．タグが負電荷であり、転位することが、層を横切って正の電位を印加し、それにより層を通してタグを転位させることを含む、項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６．タグが正電荷であり、転位することが、層を横切って負の電位を印加し、それにより層を通してタグを転位させることを含む、項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
項１７．少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、マイクロ流体デバイス、液滴ベースのマイクロ流体デバイス、デジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）、表面音響波ベースのマイクロ流体デバイス（ＳＡＷ）、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスにおいて実行される、項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
項１８．ＤＭＦ要素およびナノポア要素が、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイスに動作可能に結合されるか、またはＳＡＷ要素およびナノポア要素が、完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスに動作可能に結合される、項１７に記載の方法。
項１９．ＤＭＦデバイスまたはＳＡＷデバイスが、ロールツーロールベースの印刷エレクトロニクス方法によって製造される、項１７に記載の方法。
項２０．ＤＭＦ素子またはＳＡＷ素子が、ロールツーロールベースの印刷電子方法によって製造される、項１８に記載の方法。
項２１．完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスが、マイクロ流体導管を含む、項１７に記載の方法。
項２２．マイクロ流体導管が、ＤＭＦ要素をナノポア要素に結合し、マイクロ流体導管は、受動的な力または能動的な力によって誘導される流体の流れを含む、項２１に記載の方法。
項２３．ナノポアが、固体ナノポアまたは生物学的ナノポアである、項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
項２４．層を通って転位するタグの数を測定することが、タグとナノポアとの相互作用によって誘導される電流の変化を観察することを含む、項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
項２５．電流変化が、閾値レベルを超える大きさを有するときに、検体が試料中に存在する、項２４に記載の方法。
項２６．ステップ（ｄ）で得られたタグを含む液滴をナノポアデバイスに輸送することと、ナノポアデバイスに存在するナノポア層を横切って液滴を配置することをさらに含み、それにより液滴が、ナノポア層によって分割され、ナノポア層に存在するナノポア（複数可）によって接続され、タグが、ナノポア層の両側の液滴に存在する、項２３に記載の方法。
項２７．方法が、ナノポアを横切ってナノポア層の第１の側に存在するタグを、ナノポア層の第２の側に転位させ、それによりナノポア層の第２の側上の分割液滴注のタグを収集することを含む、項２６に記載の方法。
項２８．タグをナノポア層の第１の側に転位させることと、液滴中に存在するタグの数を決定することと、をさらに含む、項２６に記載の方法。
項２９．タグが、切断可能なリンカーを含む、項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
項３０．生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を固体支持体、第１の特異的結合メンバー、および第２の特異的結合メンバーと接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、第１の特異的結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、第１の特異的結合メンバーが、目的の検体に特異的に結合し、第２の特異的結合メンバーが、切断可能なタグを含み、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／目的の検体／第２の特異的結合メンバーの複合体が形成される、接触させることと、（ｂ）固体支持体／第１の特異的結合メンバー／検体／第２の特異的結合メンバーの複合体に結合していない第２の特異的結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／第１の特異的結合メンバー／目的の検体／第２の特異的結合メンバーの複合体に結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項３１．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｃ）固体基材に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、（ｄ）検体に結合したアプタマーを解離させることと、（ｅ）解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｆ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項３２．層を通って転位する各アプタマーが、転位事象であり、転位事象の数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量が、ｉ）一定期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）一定数の転位事象が発生するまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が発生する間の平均時間を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照が、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準である、項３１に記載の方法。
項３３．サブセクションｉ）における標準曲線が、一定期間の間の検体の対照濃度について転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について設定数の転位事象が起こるまでの時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について転位事象間の平均時間を測定することによって決定される、項３２に記載の方法。
項３４．方法が、単一分子カウントを含む、項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
項３５．アプタマーが、ＤＮＡアプタマーである、項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
項３６．アプタマーが、ＲＮＡアプタマーである、項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
項３７．第１の結合メンバーが抗体である、項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
項３８．検体がリガンドであり、第１の結合メンバーが受容体である、項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
項３９．少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、マイクロ流体デバイス、液滴ベースのマイクロ流体デバイス、デジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）、表面音響波ベースのマイクロ流体デバイス（ＳＡＷ）、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスにおいて実行される、項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
項４０．ＤＭＦ要素およびナノポア要素が、完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイスに動作可能に結合されるか、またはＳＡＷ要素およびナノポア要素が、完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスに動作可能に結合される、項３９に記載の方法。
項４１．ＤＭＦデバイスまたはＳＡＷデバイスが、ロールツーロールベースの印刷エレクトロニクス方法によって製造される、項３９に記載の方法。
項４２．ＤＭＦ素子またはＳＡＷ素子が、ロールツーロールベースの印刷電子方法によって製造される、項４０に記載の方法。
項４３．完全集積ＤＭＦおよびナノポアデバイス、または完全集積ＳＡＷおよびナノポアデバイスが、マイクロ流体導管を含む、項３９に記載の方法。
項４４．マイクロ流体導管が、ＤＭＦ要素をナノポア要素に結合し、マイクロ流体導管は、受動的な力または能動的な力によって誘導される流体の流れを含む、項４３に記載の方法。
項４５．ナノポアが、固体ナノポアまたは生物学的ナノポアである、項３１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
項４６．集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、電極のアレイを含む第１の基板と、該第１の基板から離間した第２の基板と、第１の基板と第２の基板との間に配設されたナノポア層と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスに関し、電極のアレイは、液滴がナノポア層によって第１の部分と第２の部分とに分割されるように、ナノポア層を横切って液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも２つの電極が、ナノポア層を横切って位置付けられ、２つの電極が、アノードおよびカソードを形成し、液滴がナノポア層を横切って位置付けられると、ナノポア層内のナノポアを通して電流を流すように動作する、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項４７．ナノポア層が、第１および第２の基板に付着している、項４６に記載のデバイス。
項４８．ナノポア層が、第１または第２の基板に付着している、項４６に記載のデバイス。
項４９．電極が透明である、項４６〜４８のいずれか一項に記載のデバイス。
項５０．電極が、格子パターンに配設されている、項４６〜４９のいずれか一項に記載のデバイス。
項５１．ナノポア層を横切って位置付けられた電極のアレイの少なくとも２つの電極が、ナノポア層に隣接し、ナノポア層を横切って位置付けられていない、項４６〜５０のいずれか一項に記載のデバイス。
項５２．電極が互いに組み合わされる、項４６〜５１のいずれか一項に記載のデバイス。
項５３．電極のアレイが、電源による活性化のために構成されており、電源が、順次電極を活性化する、項４６〜５１のいずれか一項に記載のデバイス。
項５４．順次方法が、１つ以上の電極をオンまたはオフにすることを含む、項５３に記載のデバイス。
項５５．電源による電極のアレイの活性化が、電源を制御するプロセッサによって実行される一組の命令によって制御される、項５２〜５４のいずれか一項に記載のデバイス。
項５６．集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、電極のアレイを含む第１の基板と、第１の基板から離間している第２の基板と、第１の基板と第２の基板との間に配設されたナノポア層と、を備え、電極のアレイが、ナノポア層が液滴を第１の部分と第２の部分とに分割するように、ナノポア層を横切って液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも１つの電極が、ナノポア層を横切って位置付けられた液滴の第１の部分と接触し、第２の基板内の電極が、ナノポア層を横切って位置付けられた液滴の第２の部分と接触するように位置付けられ、液滴がナノポア層を横切って位置付けられているとき、２つの電極がアノードおよびカソードを形成し、ナノポア層内のナノポアを通して電流を流すように動作する、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項５７．ナノポア層が、第１の基板に付着している、項５６に記載のデバイス。
項５８．ナノポア層が、第２の基板に付着している、項５６または５７に記載のデバイス。
項５９．第１および／または第２の基板が透明である、項５６〜５８のいずれか一項に記載のデバイス。
項６０．電極のアレイが透明である、項５６〜５９のいずれか一項に記載のデバイス。
項６１．項４６〜６０のいずれか一項に記載のデバイスを含む、または項１〜４５のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
項６２．追加の試薬をさらに含み、少なくとも１つの試薬が、デバイスのナノポア層を介した転位によって検出され得るタグを含む、項６１に記載のキット。
項６３．生物学的試料中に存在する検体を測定もしくは検出するため、または患者を診断するため、または血液供給をスクリーニングするために、項４６〜６０のいずれか一項に記載のデバイスを使用する方法、または項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
項６４．少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、項４６〜６０のいずれか一項に記載のデバイスを使用して実行される、項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
項６５．患者を診断するか、もしくは血液供給をスクリーニングする方法における、または生物学的試料中に存在する検体を測定もしくは検出するための、項４６〜６０のいずれか一項に記載のデバイスの使用、または項１〜４５のいずれか一項に記載の方法の使用。
項６６．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出する方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）結合メンバーに結合された標識検体に付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項６７．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含む、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出することと、を含む、方法。
項６８．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上に固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項６９．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、層内の１つ以上のナノポアを通して解離したアプタマーを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項７０．層を通って転位する各アプタマーが、転位事象であり、転位事象の数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量が、ｉ）一定期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）一定数の転位事象が発生するまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が発生する間の平均時間を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照が、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準である、項６６または６８に記載の方法。
項７１．層を通って転位する各アプタマーが、転位事象であり、転位事象の数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量が、ｉ）一定期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）一定数の転位事象が発生するまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が発生する間の平均時間を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照が、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準である、項６７または６９に記載の方法。
項７２．サブセクションｉ）における標準曲線が、一定期間の間の検体の対照濃度について転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について設定数の転位事象が起こるまでの時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について転位事象間の平均時間を測定することによって決定される、項７０または７１に記載の方法。
項７３．方法が、単一分子カウントを含む、項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
項７４．少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、項４６〜６０のいずれか一項に記載のデバイスを使用して実行される、項６６、６８、７０、７２、または７３のいずれか一項に記載の方法。
項７５．少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、項４６〜６０のいずれか一項に記載のデバイスを使用して実行される、項６７、６９、７１、７２、または７３のいずれか一項に記載の方法。
項７６．タグが、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、デンドリマー、およびナノ粒子からなる群から選択される、項６６、６８、７０、７２、７３、または７４のいずれか一項に記載の方法。
項７７．タグが、実質的に球形または半球形である、項６６、６８、７０、７２、７３、または７４のいずれか一項に記載の方法。
項７８．タグが、実質的に球形であり、ナノ粒子を含む、項６６、６８、７０、７２、７３、または７４のいずれか一項に記載の方法。
項７９．タグが、実質的に球形または半球形である、項６６、６８、７０、７２、７３、または７４のいずれか一項に記載の方法。
項８０．デンドリマーが、正電荷または負電荷である、項７９に記載の方法。
項８１．ナノ粒子が、正電荷ナノ粒子を含む、項７９に記載の方法。
項８２．ナノ粒子が、負電荷ナノ粒子を含む、項７６または７８に記載の方法。
項８３．結合メンバーが、抗体または受容体である、項６６、６８、７０、７２、７３、７４、または７６〜８２のいずれか一項に記載の方法。
項８４．タグが負電荷であり、転位することが、層を横切って正の電位を印加し、それにより層を通してタグを転位させることを含む、項６６、６８、７０、７２、７３、７４、または７６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
項８５．タグが正電荷であり、転位することが、層を横切って負の電位を印加し、それにより層を通してタグを転位させることを含む、項６６、６８、７０、７２、７３、７４、または７６〜８４のいずれか一項に記載の方法。
項８６．層を通って転位するタグの数を測定することが、ナノポアに対するタグの電流遮断効果を観察することを含む、項６６、６８、７０、７２、７３、７４、または７６〜８５のいずれか一項に記載の方法。
項８７．電流遮断効果が、閾値レベルを超えるときに、検体が試料中に存在する、項８６に記載の方法。
項８８．アプタマーが、ＤＮＡアプタマーである、項６７、６９、７１、７２、７３、または７５のいずれか一項に記載の方法。
項８９．アプタマーが、ＲＮＡアプタマーである、項６７、６９、７１、７２、７３、または７５のいずれか一項に記載の方法。
項９０．結合メンバーが、抗体である、項６７、６９、７１、７２、７３、７５、８８、または８９のいずれか一項に記載の方法。
項９１．検体がリガンドであり、結合メンバーが受容体である、項６７、６９、７１、７２、７３、７５、８８、または８９のいずれか一項に記載の方法。
項９２．方法が、タグを含む液滴をナノポアデバイスに輸送することと、ナノポアデバイスに存在するナノポア層を横切って液滴を配置することをさらに含み、それにより液滴が、ナノポア層によって分割され、ナノポア層に存在するナノポア（複数可）によって接続され、タグが、ナノポア層の両側の液滴に存在する、項６７、６９、７１、７２、７３、７５、または８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
項９３．方法が、ナノポアを横切ってナノポア層の第１の側に存在するタグを、ナノポア層の第２の側に転位させ、それによりナノポア層の第２の側上の分割液滴注のタグを収集することを含む、項９２に記載の方法。
項９４．タグをナノポア層の第１の側に転位させることと、液滴中に存在するタグの数を決定することと、をさらに含む、項９２に記載の方法。
項９５．方法が、アプタマーを含む液滴をナノポアデバイスに輸送することと、ナノポアデバイスに存在するナノポア層を横切って液滴を配置することをさらに含み、それにより液滴が、ナノポア層によって分割され、ナノポア層に存在するナノポア（複数可）によって接続され、アプタマーが、ナノポア層の両側の液滴に存在する、項６７、６９、７１、７２、７３、７５、または８８〜９４のいずれか一項に記載の方法。
項９６．方法が、ナノポアを横切ってナノポア層の第１の側に存在するアプタマーを、ナノポア層の第２の側に転位させ、それによりナノポア層の第２の側上の分割液滴注のアプタマーを収集することを含む、項９５に記載の方法。
項９７．アプタマーをナノポア層の第１の側に転位させることと、液滴中に存在するアプタマーの数を決定することと、をさらに含む、項９５に記載の方法。
項９８．ナノポアが、固体ナノポアまたは生物学的ナノポアである、項６６〜９７のいずれか一項に記載の方法。
項９９．第２の結合メンバーが、スペーサをさらに含む、項１〜４５または６３〜９８のいずれか一項に記載の方法。
項１００．スペーサが、ニトロベンジル基、ジチオエチルアミノ、６炭素スペーサ、１２炭素スペーサ、または３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートを含む、項９９に記載の方法。
項１０１．スペーサが、ニトロベンジル基を含み、タグが、ＤＮＡ分子である、項１００に記載の方法。
項１０２．スペーサが、ジチオエチルアミノであり、タグが、カルボキシル化ナノ粒子である、項１００に記載の方法。
項１０３．スペーサが、３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートであり、タグが、オリゴヌクレオチドである、項１００に記載の方法。
項１０４．スペーサが、６炭素スペーサまたは１２炭素スペーサを含み、タグが、ビオチンである、項１０３に記載の方法。
項１０５．第２の結合メンバーが、配列番号１〜１１のうちのいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む核酸を含む、項１０４に記載の方法。
項１０６．マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、マイクロ流体モジュールが、電極のアレイを含み、該電極のアレイが、少なくとも１つの液滴を、電極のアレイにおける第１の転送位置に輸送し、第１の転送位置が、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面にあり、ナノポアモジュールが、第１の毛細管チャネルと、第２の毛細管チャネルとを備え、少なくとも第１の毛細管チャネルが、界面まで延在し、第１の転送位置に隣接し、該第１の転送位置に位置付けられた液滴を受け取るように位置付けられ、第１の毛細管チャネルが、第２の毛細管チャネルと交差し、ナノポア層が、第１の毛細管チャネルと第２の毛細管チャネルとが交差する位置で、第１の毛細管チャネルと第２の毛細管チャネルとの間に位置付けられる、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項１０７．電極のアレイが、少なくとも１つの液滴を、電極のアレイにおける第２の転送位置に輸送し、第２の転送位置が、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面にあり、第２の毛細管チャネルが、界面まで延在し、第２の転送位置に隣接し、第２の転送位置に位置付けられた液滴を受容するように位置付けられる、項１０６に記載のデバイス。
項１０８．第２の毛細管チャネルが、第２の毛細管チャネルの一方または両方の端部の通気口またはリザーバの間に延在する、項１０６に記載のデバイス。
項１０９．第２の毛細管チャネルが、一端で第１のリザーバに、他端で第２のリザーバに接続されている、項１０８に記載のデバイス。
項１１０．第１のリザーバおよび／または第２のリザーバは、交差部で第２の毛細管チャネル内に位置付けられる流体を含み、この流体は、ナノポア層の動作を促進してナノポア層のナノポアを通して電流を流す、項１０９に記載のデバイス。
項１１１．第１の毛細管チャネルおよび／または第２の毛細管チャネルは、交差部のいずれかの側の幅と比較して、交差部で幅が減少するように、毛細管の長さを横切って断面幅が変化する、項１０９に記載のデバイス。
項１１２．第１の毛細管チャネルが、第１の電極対を含み、第２の毛細管チャネルが、第２の電極対を含み、第１の電極対が、第１の毛細管チャネル内に位置付けられ、ナノポア層内のナノポアに隣接し、第２の電極対が、第２の毛細管チャネル内に位置付けられ、ナノポア層内のナノポアに隣接する、項１０６に記載のデバイス。
項１１３．液滴が、ナノポア層内のナノポアを通って輸送することによってカウントされる分子を含む液滴である、条項１０７〜１１２のいずれか一項に記載のデバイス。
項１１４．液滴が、異なる組成を有し、第１の液滴および第２の液滴であり、第１の液滴が、ナノポアを通してナノポア層を横切って輸送することによりカウントされる分子を含み、第２の液滴が、その分子を欠く導電性流体を含み、導電性流体が、ナノポアを介してナノポア層を横切る分子の輸送を容易にする、項１０７に記載のデバイス。
項１１５．第１の毛細管チャネルが、ナノポア層に近接して位置付けられた第１の電極を含み、第２の毛細管チャネルが、ナノポア層に近接して位置付けられた第２の電極を含み、第１および第２の電極の各々が、それらが毛細管チャネル内に存在する流体と接触するように毛細管チャネル内で露出され、第１および第２の電極が、液体が第１および第２の毛細管チャネル内のナノポア層を横切って位置付けられると、ナノポア層内のナノポアを通して電流を流すように動作する、項１０６〜１１４のいずれか一項に記載のデバイス。
項１１６．第１の転送位置および第１の毛細管チャネルが、実質的に同じ平面上にあり、液滴が、第１の毛細管チャネルの開口部と整列している、項１０６〜１１５のいずれか一項に記載のデバイス。
項１１７．第１の転送位置が、第１の毛細管チャネルよりも高い平面にあり、デバイスが、液滴を第１の毛細管チャネルの開口部まで転送するための垂直ポートを備えて構成されている、項１０６〜１１５のいずれか一項に記載のデバイス。
項１１８．第１の基板の第１の表面が、電極のアレイが配設される第１の領域と、第１のマイクロチャネルが形成される第２の領域とを含み、電極のアレイが、第１のマイクロチャネルが形成される平面よりも高い平面上にある、項１１７に記載のデバイス。
項１１９．第２の基板が、界面に位置する側縁部にノッチを含み、ノッチが、第１の毛細管チャネル上に整列され、転送電極に位置する液滴を第１の毛細管チャネルの開口部に輸送するための垂直ポートを提供する、項１１７に記載のデバイス。
項１２０．電極のアレイから離間した単一電極をさらに含み、単一電極が、第１の転写位置において電極のアレイの少なくとも一部の上に延在し、かつ第１の転送位置に電極のアレイの少なくとも一部を有する、二平面構成である、項１０６〜１１９のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
項１２１．電極のアレイから離間した単一電極をさらに含む、項１０７〜１１９のいずれか一項に記載のデバイス。
項１２２．電極のアレイから離間した単一電極をさらに含み、単一電極が、第１の転送位置を超えて延在せず、電極のアレイと二平面構成ではなく、液滴が共面電極を使用することによって第１の転送位置に移動される、項１０６〜１１９のいずれか一項に記載のデバイス。
項１２３．電極のアレイから離間した単一電極をさらに含み、単一電極が、第１の転送位置を超えて延在せず、電極のアレイと二平面構成ではなく、液滴が共面電極を使用することによって転送位置に移動される、項１０６〜１１９のいずれか一項に記載のデバイス。
項１２４．生物学的試料中に存在する検体を測定もしくは検出するため、または患者を診断するため、または血液供給をスクリーニングするために、項１０６〜１２３のいずれか一項に記載のデバイスを使用する方法、または項６６〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
項１２５．少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、項１０６〜１２３のいずれか一項に記載のデバイスを使用して実行される、項１〜４５または６６〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
項１２６．患者を診断するか、もしくは血液供給をスクリーニングする方法における、または生物学的試料中に存在する検体を測定もしくは検出するための、項１０６〜１２３のいずれか一項に記載のデバイスの使用、または項１〜４５のいずれか一項に記載の方法の使用。
項１２７．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含み、（ｃ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合していない第２の結合メンバーを除去することと、（ｄ）第１の結合メンバーに結合した検体に結合した第２の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１２８．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含み、（ｃ）固体基材に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、（ｄ）検体に結合したアプタマーを解離させることと、（ｅ）解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｆ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位する各アプタマーは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１２９．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１３０．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含み、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位する各アプタマーは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１３１．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上に固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１３２．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｂ）試料を固定化検体と接触させることであって、固定化検体が、固体支持体上に固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを、層内の１つ以上のナノポアを通して転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位する各アプタマーは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１３３．生物学的試料中に存在する検体を測定するための方法であって、（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、それに付着した切断可能なタグを含み、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位する各タグは、転位事象であり、転位事象の数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定し、試料中に存在する検体の量は、ｉ）設定された期間中の転位事象の数をカウントし、転位事象の数を対照と相関させること、ｉｉ）設定された数の転位事象が起こるまでの時間量を測定し、対照と相関させること、またはｉｉｉ）転位事象が起こる平均時間間隔を測定し、対照と相関させることによって決定され、対照は、較正曲線、標準付加、またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む参照標準であり、サブセクションｉ）内の標準曲線は、設定された期間中の検体の対照濃度について、転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、設定された数の転位事象が起こるまでにかかる時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）内の標準曲線は、検体の対照濃度について、転位事象が起こる平均時間間隔を測定することによって決定される、方法。
項１３４．サブセクションｉ）における標準曲線が、一定期間の間の検体の対照濃度について転位事象の数を測定することによって決定され、サブセクションｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について設定数の転位事象が起こるまでの時間を測定することによって決定され、サブセクションｉｉｉ）における標準曲線が、検体の対照濃度について転位事象間の平均時間を測定することによって決定される、項１３３に記載の方法。
項１３５．マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを備える集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスであって、マイクロ流体モジュールは、電極のアレイの少なくとも一部と重なる大きさの単一電極から離間している電極のアレイを含み、電極のアレイおよび単一電極は、少なくとも１滴の流体を電極のアレイ内の転送電極に輸送し、転送電極は、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面に位置付けられ、ナノポア対応モジュールは、第１の基板の第１の表面上に位置付けられた第１のマイクロチャネルを含み、第２のマイクロチャネルは、第２の基板の第１の表面上に位置付けられ、第１の基板の第１の表面は、第２の基板の第１の表面と接触し、それによって第１のマイクロチャネルおよび第２のマイクロチャネルを取り囲み、第１の毛細管チャネルおよび第２の毛細管チャネルをそれぞれ提供し、少なくとも第１の毛細管チャネルは、マイクロ流体モジュールとナノポア対応モジュールとの間の界面まで延在し、転送電極に隣接し、転送電極上に位置付けられた液滴を受け取るように位置付けられ、第１の毛細管チャネルは、第２の毛細管チャネルと交差し、ナノポア層は、第１および第２の毛細管チャネルが交差する位置で、第１の基板と第２の基板との間に位置付けられる、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイス。
項１３６．イオン性液体が水溶液である、項１３５に記載のデバイス。
項１３７．水溶液が塩溶液である、項１３６に記載のデバイス。
項１３８．イオン性液体が、目的の検体を含み、イオン性液体中の検体の有無を検出するように構成されている、項１３５〜１３７のいずれか一項に記載のデバイス。
項１３９．集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスにおいてナノポアを生成するための方法であって、項１３５〜１３８のいずれか一項に記載の集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスを提供することと、第１および第２の毛細管チャネル内に電圧を印加して、層を通して電流を流すことと、層を横切るコンダクタンスを測定することと、層内のナノポアの生成を示すコンダクタンスの検出時に電圧の印加を終了することと、を含む、方法。
項１４０．電極のアレイを含む第１の基板と、第１の基板から離間した第２の基板と、ナノポアを含むナノポア層と流体連通している第１または第２の基板における開口部と、ナノポアを通して電界を印加するように構成されている電極対と、を備え、電極のアレイが、少なくとも１滴の流体を開口部に輸送するように構成されている、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイス。
項１４１．開口部が、毛細管チャネルである、項１４０に記載のデバイス。
項１４２．毛細管チャネルが、第１または第２の基板の第２の面上の開口よりも広い第１または第２の基板の第１の面上の開口を有する、項１４１に記載のデバイス。
項１４３．一対の検出電極が、単一電極である第１の検出電極を含む、項１４２に記載のデバイス。
項１４４．一対の検出電極が、第２の側に配設された第２の検出電極を含む、項１４２または１４３に記載のデバイス。
項１４５．一対の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、
項１４２による第１の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、単一電極が、第１の単一電極であり、毛細管チャネルが、第１の毛細管チャネルである、第１の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスと、第５の側面および該第５の側面に対向する第６の側面を含み、第５の側面が、電極のアレイを含む、第３の基板、ならびに該第３の基板から離間した第４の基板を備える、第２の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスと、を含む、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスの対に関し、第４の基板は、第３の基板の第５の側面に面する第７の側面と、該第７の側面に対向する第８の側面とを含み、第７の側面は、第２の単一電極を含み、ナノポア層は、第８の側面上に配設され、第４の基板は、該第４の基板の第７の側面から第８の側面まで延在する第２の毛細管チャネルを含み、ナノポア層は、毛細管チャネルの開口部上に位置付けられ、ナノポア層は、ナノポアが、第１の毛細管チャネルと第２の毛細管チャネルとの間の電気浸透導管を提供するように、第２の基板と第４の基板との間に挿入され、検出電極の対が、第２の単一電極である第２の検出電極を含む、一対の集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項１４６．集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスであって、第１の側面および該第１の側面に対向する第２の側面を含み、第１の側面が、電極のアレイを含む、第１の基板と、第１の基板から離間した第２の基板であって、第１の基板の第１の側面に面する第３の側面および該第３の側面に対向する第４の側面を含む第２の基板と、ナノポアを欠き、デバイスの外部側面に配設されたナノポア対応層であって、外部側面が、第２の側面または第４の側面から選択され、外側側面を含む第１の基板または第２の基板の一方が、第１の基板の第１の側面から第２の側面まで、または第２の基板の第３の側面から第４の側面まで延在する毛細管チャネルを含み、ナノポア対応層が、毛細管チャネルの開口部上に位置付けられる、ナノポア対応層と、該ナノポア対応層を横切って電界を印加するように構成された電極対であって、少なくとも一滴の流体を毛細管チャネルに輸送するように構成されている、電極対と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイス。
項１４７．集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスにおいてナノポアを生成するための方法であって、項１４３に記載の集積デジタルマイクロ流体ナノポア対応デバイスを提供することと、層の各側面上のイオン液体が、一対の検出電極のいずれか一方と電気的に接触するように、ナノポア対応層の両側をイオン液体に浸すことと、一対の検出電極間に電圧を印加して層を通して電流を流すことと、層を横切るコンダクタンスを測定することと、層内にナノポアが生成されたことを示すコンダクタンスの検出時に、電圧の印加を終了することと、を含む、方法。
項１４８．イオン性液体が塩溶液である、項１４７に記載の方法。
項１４９．イオン性液体が、目的の検体を含み、イオン性液体中の検体の有無を検出するように構成されている、項１４７または１４８に記載のデバイス。
項１５０．生成されたナノポアを調整することをさらに含む、項１３９または１４７〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
項１５１．調整が、代替として、第１の極性を有する第１の電圧および第１の極性とは反対の第２の極性を有する第２の電圧を、ナノポア膜を横切って印加することであって、第１の電圧および第２の電圧が各々、少なくとも１回印加される、印加することと、ナノポアのサイズに関連する電気浸透特性を測定することと、を含む、項１５０に記載の方法。
項１５２．調整前に、ナノポアのサイズに関連する電気浸透特性を測定することをさらに含む、項１５０または１５１に記載の方法。
項１５３．結合メンバー、タグおよびスペーサを含む、組成物。
項１５４．スペーサが、ニトロベンジル基、ジチオエチルアミノ、６炭素スペーサ、１２炭素スペーサ、または３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートを含む、項１５３に記載の組成物。
項１５５．スペーサが、ニトロベンジル基を含み、タグが、ＤＮＡ分子である、１５４に記載の組成物。
項１５６．スペーサが、ジチオエチルアミノであり、タグが、カルボキシル化ナノ粒子である、１５４に記載の組成物。
項１５７．スペーサが、３−（９−（（３−カルボキシプロピル）（トシル）カルバモイル）アクリジン−１０−イウム−１０−イル）プロパン−１−スルホネートであり、タグが、オリゴヌクレオチドである、項１５４に記載の組成物。
項１５８．スペーサが、６炭素スペーサまたは１２炭素スペーサを含み、タグが、ビオチンである、項１５４に記載の組成物。
項１５９．第２の結合メンバーが、配列番号１〜１１のうちのいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む核酸を含む、項１５８に記載の組成物。
項１６０．タグが、切断可能なリンカーを含む、項１５３〜１５９のいずれか一項に記載の組成物。
項１６１．切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカー、化学的に切断可能なリンカー、熱的に切断可能なリンカー、感熱性の切断可能なリンカー、および酵素的に切断可能なリンカーからなる群から選択される、項１６０に記載の組成物。
項１６２．切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカーであり、光切断可能なリンカーが、以下に由来する光切断可能な部分を含む、項１６１に記載の組成物。
項１６３．切断可能なリンカーが、熱的に切断可能なリンカーであり、局所的な温度上昇を用いて切断される、項１６１に記載の組成物。
項１６４．局所的な温度上昇が、光熱的またはマイクロ波照射によって発生する、項１６３に記載の組成物。
項１６５．光からのエネルギーが、吸収性標的に転送される、項１６４に記載の組成物。
項１６６．吸収性標的が、染料、顔料、または水を含む、項１６５に記載の組成物。
項１６７．切断可能なリンカーが、二本鎖ＤＮＡを含む、項１６３〜１６６のいずれか一項に記載の組成物。
項１６８．切断可能なリンカーが、化学的に切断可能なリンカーであり、切断が、チオールによって媒介される、項１６１に記載の組成物。
項１６９．タグが、切断可能なリンカーを含む、項２９、６６、６８、７０、７２〜８６、９２〜９４、９８〜１０５、１２７、１２９、１３１、１３３、および１３４のいずれか１項に記載の方法。
項１７０．切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカー、化学的に切断可能なリンカー、熱的に切断可能なリンカー、感熱性の切断可能なリンカー、および酵素的に切断可能なリンカーからなる群から選択される、項１６９に記載の方法。
項１７１．切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカーであり、光切断可能なリンカーが、以下に由来する光切断可能な部分を含む、項１７０に記載の方法。
項１７２．切断可能なリンカーが、熱的に切断可能なリンカーであり、局所的な温度上昇を用いて切断される、項１７０に記載の方法。
項１７３．局所的な温度上昇が、光熱的またはマイクロ波照射によって発生する、項１７２に記載の方法。
項１７４．光からのエネルギーが、吸収性標的に転送される、項１７３に記載の方法。
項１７５．吸収性標的が、染料、顔料、または水を含む、項１７４に記載の方法。
項１７６．切断可能なリンカーが、二本鎖ＤＮＡを含む、項１７２〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
項１７７．切断可能なリンカーが、化学的に切断可能なリンカーであり、チオールによって切断される、項３０および１７０に記載の方法。
項１７８．１つ以上の転位事象が、結合メンバーの検体への結合事象に対応する、項２〜３０、３１〜４５、６４、７０〜１０５、１２５、１２７〜１３４、および１６９〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
項１７９．１つの転位事象が、結合メンバーの検体への結合事象に対応する、項１７８に記載の方法。
項１８０．２つ以上の転位事象が、結合メンバーの検体への結合事象に対応する、項１７８に記載の方法。
項１８１．結合メンバー当たり２つ以上のタグが組み込まれており、２つ以上の転位事象が、検体への結合メンバーの結合を表す、項１８０に記載の方法。
項１８２．少なくとも２つ以上のナノポアが層内にある、項１〜４５、６３〜１０５、１２４、１２５、１２７〜１３４、および１６９〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
項１８３．少なくとも２つ以上のナノポアが、並んでまたは連続して存在する、項１８２に記載の方法。
項１８４．電極のアレイを含む第１の基板と、第１の基板から離間した第２の基板と、第１の基板と第２の基板との間に配設された第１の表面および第２の表面を有するナノポア層と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、電極のアレイは、ナノポア層の第１の表面に第１の液滴を位置付けるように構成され、電極のアレイの少なくとも２つの電極が、ナノポア層を横切って位置付けられ、２つの電極が、アノードおよびカソードを形成し、液滴がナノポア層の第１の表面にあるとき、ナノポア層内のナノポアを通して電流を流すように動作する、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項１８５．項１７３に記載の電極のアレイは、ナノポア層の第２の表面に第２の液滴を位置付けるようにさらに構成される。
項１８６．マイクロ流体モジュールおよびナノポアモジュールを備える集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、マイクロ流体モジュールは、電極のアレイを含み、該電極のアレイは、少なくとも１滴の流体を電極のアレイ内の転送位置に輸送し、転送位置は、マイクロ流体モジュールとナノポアモジュールとの間の界面にあり、ナノポアモジュールは、転送位置からナノポア層まで延在する第１の毛細管チャネルを含む、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項１８７．電極のアレイを含む第１の基板と、該第１の基板から離間した第２の基板と、その中に１つ以上のナノポアを有する第１のナノポア層と、その中に１つ以上のナノポアを有する第２のナノポア層と、第１および第２のナノポア層内のナノポアを通してタグを駆動する電界を生成するための少なくとも２つの電極と、を備える、集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイス。
項１８８．固定化剤が、ビオチンまたはストレプトアビジンを含む、項３０に記載の方法。
項１８９．固定化剤が、ビオチンを含み、リガンドが、ストレプトアビジンを含む、項１８８に記載の方法。
項１９０．固定化剤が、ストレプトアビジンを含み、リガンドが、ビオチンを含む、項１８８に記載の方法。
項１９１．固体支持体、第１の結合メンバー、および第２の結合メンバーが、連続的または同時に試料に添加される、項３０および１８８〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
項１９２．タグに対する細孔のサイズの比が１．０以下である、項１〜４５、６３〜１０５、１２４、１２５、１２７〜１３４、１６９〜１８１、１８３、および１８８〜１９１のいずれか一項に記載の方法。
項１９３．生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を固体支持体、結合メンバー、および切断可能なタグで標識された標識検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、結合メンバーが、固体支持体／結合メンバー／目的の検体の複合体または固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合し、（ｂ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｃ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合した標識検体に付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項１９４．固定化剤が、ビオチンまたはストレプトアビジンを含む、項１９３に記載の方法。
項１９５．固定化剤が、ビオチンを含み、リガンドが、ストレプトアビジンを含む、項１９４に記載の方法。
項１９６．固定化剤が、ストレプトアビジンを含み、リガンドが、ビオチンを含む、項１９４に記載の方法。
項１９７．固体支持体、結合メンバー、および標識検体が、連続的または同時に試料に添加される、項１９３〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
項１９８．生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法であって、該方法は、（ａ）試料を固体支持体、結合メンバー、および外因性検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、外因性検体が、固定化剤に対するリガンドを含み、固体支持体／固定化検体の複合体を形成するように、固体支持体に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグを含み、固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体のいずれかにおいて結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体中の結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項１９９．固定化剤が、ビオチンまたはストレプトアビジンを含む、項１９８に記載の方法。
項２００．固定化剤が、ビオチンを含み、リガンドが、ストレプトアビジンを含む、項１９９に記載の方法。
項２０１．固定化剤が、ストレプトアビジンを含み、リガンドが、ビオチンを含む、項１９９に記載の方法。
項２０２．固体支持体、結合メンバー、および外因性検体が、連続的または同時に試料に添加される、項１９８〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
項２０３．ステップ（ｃ）でタグを切断する前に、固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体が単離される、条項１９８〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
項２０４．単離が、磁界を使用して行うことができる、項２０３に記載の方法。
項２０５．生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法であって、（ａ）試料を固体支持体、結合メンバー、およびアプタマーで標識された標識検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、結合メンバーが、固定化剤に対するリガンドを含み、結合メンバーが、固体支持体／結合メンバー／目的の検体の複合体または固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合し、（ｂ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｃ）固体支持体／結合メンバー／標識検体の複合体中の結合メンバーに結合した標識検体に付着したアプタマーを解離することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することは、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することは、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項２０６．固定化剤が、ビオチンまたはストレプトアビジンを含む、項２０５に記載の方法。
項２０７．固定化剤が、ビオチンを含み、リガンドが、ストレプトアビジンを含む、項２０６に記載の方法。
項２０８．固定化剤が、ストレプトアビジンを含み、リガンドが、ビオチンを含む、項２０６に記載の方法。
項２０９．固体支持体、結合メンバー、および標識検体が、連続的または同時に試料に添加される、項２０５〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
項２１０．生物学的試料中に存在する目的の検体を測定または検出するための方法であって、該方法は、（ａ）試料を固体支持体、結合メンバー、および外因性検体と接触させることであって、固体支持体が、固定化剤を含み、外因性検体が、固定化剤に対するリガンドを含み、固体支持体／固定化検体の複合体を形成するように、固体支持体に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含み、固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体のいずれかを形成するように、目的の検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体または固体支持体／目的の検体／結合メンバーの複合体のいずれかにおいて結合していない結合メンバーを除去することと、（ｃ）固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体中の結合メンバーに結合したアプタマーを解離することと、（ｄ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｅ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項２１１．固定化剤が、ビオチンまたはストレプトアビジンを含む、項２１０に記載の方法。
項２１２．固定化剤が、ビオチンを含み、リガンドが、ストレプトアビジンを含む、項２１１に記載の方法。
項２１３．固定化剤が、ストレプトアビジンを含み、リガンドが、ビオチンを含む、項２１１に記載の方法。
項２１４．固体支持体、結合メンバー、および外因性検体が、連続的または同時に試料に添加される、項２１０〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
項２１５．ステップ（ｃ）でアプタマーを解離する前に、固体支持体／固定化検体／結合メンバーの複合体が単離される、項２１０〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
項２１６．磁界を使用して単離を行うことができる、項２１５に記載の方法。
項２１７．生物学的試料中に存在する検体を測定または検出するための方法であって、
Ｉ．（ａ）試料を第１の結合メンバーと接触させることであって、第１の結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）検体を第２の結合メンバーと接触させることであって、第２の結合メンバーが、検体に特異的に結合し、第２の結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｃ）固体基質に結合した検体に結合していないアプタマーを除去することと、（ｄ）検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、
ＩＩ．（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を標識検体と接触させることであって、標識検体が、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）結合メンバーに結合された標識検体に付着したタグを切断することと、（ｅ）層内の１つ以上のナノポアを通してタグを転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、
ＩＩＩ．（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、結合メンバーが、検体に特異的に結合する、接触させることと、（ｂ）試料を、標識検体と接触させることであって、標識検体が、アプタマーを含む、接触させることと、（ｃ）結合メンバーに結合していない標識検体を除去することと、（ｄ）結合メンバーに結合した標識検体に結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、
ＩＶ．（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、切断可能なタグで標識される、接触させることと、（ｂ）試料を、固定化された検体と接触させることであって、固定化された検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化された検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化された検体に結合した結合メンバーに付着したタグを切断することと、（ｅ）切断されたタグを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、（ｆ）層を通って転位するタグを評価することと、を含み、層を通って転位するタグの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するタグを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、
Ｖ．（ａ）試料を結合メンバーと接触させることであって、結合メンバーが、検体に特異的に結合し、結合メンバーが、アプタマーを含む、接触させることと、（ｂ）結合メンバーに結合される検体を含有し得る試料を、固定化された検体と接触させることであって、固定化された検体が、固体支持体上で固定化される、接触させることと、（ｃ）固定化された検体に結合していない結合メンバーを除去することと、（ｄ）固定化された検体に結合した結合メンバーに結合したアプタマーを解離させ、解離したアプタマーを層内の１つ以上のナノポアを通してまたはそれを横切って転位させることと、（ｅ）層を通って転位するアプタマーを評価することと、を含み、層を通って転位するアプタマーの数を測定することが、試料中に存在する検体の量を測定するか、または層を通って転位するアプタマーを検出することが、検体が試料中に存在することを検出する、方法。
項２１８．細孔のサイズとタグとの比が、１．０以下である、項１９３〜２１７のいずれか一項に記載の方法。

Claims (84)

  1. 試料中の検体の検出のための器具であって、前記器具が、
    制御ユニットと、
    検出ユニットと、
    前記試料を含む１つ以上のカートリッジへの動作可能な接続のためのカートリッジインターフェースと、を備え、
    前記制御ユニットが、前記カートリッジ内に存在する試料液滴を移動させるための前記カートリッジ内の電極のアレイの活性化を制御するために構成され、
    前記検出ユニットが、
    ｉ）カートリッジ内の液滴からの第１の検体関連シグナルと、
    ｉｉ）
    （ａ）カートリッジ内のナノポア層の細孔を通って転位するタグ、または
    （ｂ）カートリッジ内のナノポア層の細孔を通って転位する検体特異的結合メンバーからの第２の検体関連シグナルと、を検出するように構成されている、器具。
  2. 前記第１の検体関連シグナルが、電気シグナルを含み、前記第２の検体関連シグナルが、前記電気シグナルを含む、請求項１に記載の器具。
  3. 前記第１の検体関連シグナルが、光学シグナルを含み、前記第２の検体関連シグナルが、前記電気シグナルを含む、請求項１に記載の器具。
  4. 前記器具が、同じカートリッジからの前記第１および第２の検体関連シグナルを検出するように構成されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の器具。
  5. 前記器具が、異なるカートリッジからの前記第１および第２の検体関連シグナルを検出するように構成されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の器具。
  6. 前記タグが、第１の結合メンバーおよび前記検体を含む複合体に対し特異的に結合する第２の結合メンバーから切断され、前記検体特異的結合メンバーが、アプタマーである、請求項１に記載の器具。
  7. 前記制御ユニットが、前記電極のアレイの活性化の持続期間および前記電極のアレイに印加される電力を制御する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の器具。
  8. 前記制御ユニットが、前記カートリッジ内の液滴の移動を容易にするために電極のアレイの活性化および非活性化の順序を制御する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の器具。
  9. 前記移動が、合体液滴を生成するために試料液滴を試薬液滴と合体させることを含む、請求項８に記載の器具。
  10. 前記移動が、前記検出ユニットによるインタロゲーションのために、前記合体液滴またはその一部をカートリッジの検出領域に移動させることを含む、請求項９に記載の器具。
  11. 前記検出ユニットが、前記カートリッジからの電気シグナルの検出のための電気検出ユニットを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の器具。
  12. 前記電気検出ユニットが、前記カートリッジインターフェースに接続された電気回路を含む、請求項１１に記載の器具。
  13. 前記電気回路が、前記電気シグナルを記録するための記録装置に動作可能に接続され、前記電気シグナルが、
    前記検体における検体特異的酵素の作用から産生された電気化学種、または
    基質分子における酵素の作用から産生された電気化学種によって発生され、前記酵素が、前記検体に特異的に結合する抗体に接合される、請求項１２に記載の器具。
  14. 前記検出ユニットが、光学検出ユニットを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の器具。
  15. 前記光学検出ユニットが、比色シグナル、濁度シグナル、または蛍光シグナルのうちの１つ以上のための検出器を含む、請求項１４に記載の器具。
  16. 前記光学検出ユニットが、前記液滴を撮像するための撮像システムを含む、請求項１４または１５に記載の器具。
  17. 前記器具が、前記電極のアレイを活性化および非活性化し、前記検出ユニットを動作させるために、前記制御ユニットへの命令を含むプログラムを実行するプロセッサを備える、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の器具。
  18. 前記器具が、臨床化学、イムノアッセイ、ナノポア層を通る転位のためのタグの開裂、前記検体からの検体特異的結合メンバーの解離、ナノポア層の細孔を通るタグ／検体特異的結合メンバーの転位、撮像、凝集アッセイ、および血液学のうちの２つ以上を行うように構成されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の器具。
  19. 電気化学的検出領域を含むカートリッジの作用電極からの電気シグナルを検出するために構成された電気回路と、電気的検出領域を含むカートリッジ内に存在するナノポア層内のナノポアにおける電気シグナルの変化を検出するための電気回路と、を含む電気的検出ユニットを備える、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の器具。
  20. カメラ、顕微鏡、電荷結合素子（ＣＣＤ）、分光計、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出器、蛍光光度計、比色計、および濁度計のうちの１つ以上を含む光学検出ユニットを備える、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の器具。
  21. カートリッジであって、
    第１の基板と、
    第２の基板と、
    前記第１の基板から前記第１の基板を分離するギャップと、
    液滴への電気作動力を発生させるための電極のアレイと、
    作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域と、を含む、カートリッジ。
  22. 前記作用電極および前記参照電極の両方が、前記第１の基板または前記第２の基板の表面上に配設され、前記作用電極および前記参照電極の少なくとも一部が、前記カートリッジ内の前記ギャップに配設された液滴と電気的に接触している、請求項２１に記載のカートリッジ。
  23. 前記作用電極または前記参照電極の一方が、前記第１の基板の表面上に配設され、他方の電極が、前記第２の基板の表面上に対向構成で配設され、かつ前記作用電極および前記参照電極の少なくとも一部が、前記カートリッジ内の前記ギャップに配設された液滴と電気的に接触している、請求項２２に記載のカートリッジ。
  24. 液滴への電気作動力を発生させるための前記複数の電極が、前記第１の基板または前記第２の基板の表面上に位置付けられる、請求項２１または２２に記載のカートリッジ。
  25. 前記複数の電極を被覆する第１の層をさらに備える、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のカートリッジ。
  26. 前記第１の層が、誘電体層および／または疎水性層を含む、請求項２５に記載のカートリッジ。
  27. 前記作用電極および前記参照電極の少なくとも一部が、前記第１の層によって被覆されていない、請求項２５または２６に記載のカートリッジ。
  28. 前記第１の層が、光分解性材料を含み、光への曝露による前記作用電極および前記参照電極の一部からの前記第１の層の除去に起因して、前記第１の層が、前記作用電極および前記参照電極の一部を被覆しない、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のカートリッジ。
  29. 前記作用電極および参照電極が、液滴に毛細管力を及ぼすように構成された毛細管チャネル内に配設され、それによって前記液滴を前記毛細管チャネルに移動させる、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載のカートリッジ。
  30. 多機能カートリッジであって、
    第１の基板と、
    第２の基板と、
    前記第１の基板から前記第１の基板を分離するギャップと、
    液滴への電気作動力を発生させるための複数の電極と、
    作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域、
    ナノポアを含むナノポア層を含む電気的検出領域、および
    光学的に透明であり、液滴を作動させるための電極を含み、かつ前記液滴の光学的インタロゲーションのために構成されている、光学的検出領域、のうちの２つ以上と、を含む、多機能カートリッジ。
  31. 前記カートリッジが、
    作用電極および参照電極を含む、電気化学種感知領域と、
    ナノポアを含むナノポア層を含む、電気的検出領域と、を含む、請求項３０に記載の多機能カートリッジ。
  32. 前記カートリッジが、
    作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域を含む、請求項３０に記載の多機能カートリッジ。
  33. 前記カートリッジが、
    作用電極および参照電極を含む、電気化学種感知領域と、
    光学的に透明であり、液滴を作動させるための電極を含み、かつ前記液滴の光学的インタロゲーションのために構成されている、光学的検出領域と、を含む、請求項３０に記載の多機能カートリッジ。
  34. 前記カートリッジが、
    ナノポアを含むナノポア層を含む、電気的検出領域を含む、請求項３０に記載の多機能カートリッジ。
  35. 前記カートリッジが、
    光学的に透明であり、液滴を作動させるための電極を含み、かつ前記液滴の光学的インタロゲーションのために構成されている、光学的検出領域を含む、請求項３０に記載の多機能カートリッジ。
  36. 前記複数の電極を被覆する第１の層をさらに備える、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載のカートリッジ。
  37. 前記第１の層が、誘電体層および／または疎水性層を含む、請求項３６に記載のカートリッジ。
  38. 試料中の検体を検出するためのシステムであって、前記システムが、
    検体検出器具と、
    １つ以上の検体検出カートリッジと、を備え、
    前記検体検出器具が、
    制御ユニットと、
    検出ユニットと、
    前記１つ以上の検体検出カートリッジへの動作可能な接続のためのカートリッジインターフェースと、を備え、
    前記制御ユニットが、前記カートリッジ内に存在する液滴を移動させるためのカートリッジ内の複数の電極の活性化を制御するために構成され、
    前記検出ユニットが、
    ｉ）カートリッジ内の液滴からの第１の検体関連シグナル、および
    ｉｉ）カートリッジ内のナノポア層の細孔を通って転位するタグまたは検体特異的結合メンバーからの第２の検体関連シグナルを検出するように構成され、
    各前記１つ以上の検体検出カートリッジが、
    前記制御ユニットに応答して液滴への電気作動力を発生させるための複数の電極、
    前記カートリッジ内の液滴から検体関連シグナルを発生させるための検出領域、および／または
    前記カートリッジ内のナノポア層の細孔を通して転位するタグもしくは検体特異的結合メンバーから検体関連シグナルを発生させるための検出領域を備える、システム。
  39. 試薬リザーバをさらに備え、前記試薬リザーバが、前記カートリッジインターフェースに隣接するか、または前記カートリッジ上に位置する、請求項３８に記載のシステム。
  40. 前記器具が、前記試薬リザーバから液滴を形成するため、かつ前記複数の電極を選択的に活性化および非活性化することによって前記液滴を移動させるためにプログラムされている、請求項３９に記載のシステム。
  41. 前記器具が、前記カートリッジに導入された試料から少なくとも試料液滴を形成するため、かつ前記複数の電極を選択的に活性化および非活性化することによって前記試料液滴（複数可）を移動させるためにプログラムされている、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のシステム。
  42. 前記試薬リザーバが、前記試料中の前記検体に対して特異的な酵素を含む試薬を含み、前記酵素が、前記検体に作用して電気シグナルまたは光学シグナルを発生させる反応産物を生成する、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載のシステム。
  43. 前記試薬が、酸化還元媒体をさらに含む、請求項３８に記載のシステム。
  44. 前記試薬リザーバが、前記検体に選択的に結合する第１の結合メンバーを含み、前記第１の結合メンバーが、ビーズに付着している、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
  45. 前記第１の結合メンバーが、抗体である、請求項４４記載のシステム。
  46. 前記試薬リザーバが、前記検体に選択的に結合する第２の結合メンバーを含み、前記第２の結合メンバーが、酵素に付着している、請求項４４または４５に記載のシステム。
  47. 前記第２の結合メンバーが、抗体である、請求項４６に記載のシステム。
  48. 前記酵素が、電気シグナルまたは光学シグナルに関連する反応産物を産生するように基質に作用する、請求項４６または４７に記載のシステム。
  49. 前記カートリッジインターフェースが、前記カートリッジを収容するための挿入スロットを含み、前記カートリッジが、
    電気的検出領域を含み、前記電気的検出領域が、
    検体が前記試料中に存在するときに発生される電気化学種からの電気シグナルを検出するための作用電極および参照電極、または
    前記第１の基板と第２の基板との間に配置されたナノポア層を含み、前記複数の電極が、前記ナノポア層を横切ってタグまたは検体特異的結合メンバーを転位させるために構成され、前記電気的検出ユニットが、前記転位を検出する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載のシステム。
  50. 前記器具が、複数の挿入スロットを含む、請求項４９に記載のシステム。
  51. 前記複数の挿入スロットが、カルーセル上に位置付けられている、請求項５０に記載のシステム。
  52. 前記システムが、前記器具の機能を選択するためのプログラミングを含み、前記機能が、前記器具の前記カートリッジインターフェースに動作可能に接続されたカートリッジの種類に基づいて選択され、前記機能が、前記試料を処理するための複数のアッセイから選択される、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載のシステム。
  53. 前記カートリッジが、電気的検出領域を含む場合、前記器具が、前記試料中の検体の存在に応答して電気シグナルを発生させるために前記試料を処理し、前記電気的検出ユニットを介して前記電気シグナルを検出するように命令される、請求項５２に記載のシステム。
  54. 器具が、検出される検体の表示を受け取り、検出される検体の種類に基づいて前記試料を処理する、請求項５３に記載のシステム。
  55. 前記表示が、前記器具のユーザインターフェースを介してユーザによって提供されるか、または前記表示が、前記カートリッジ上に存在する機械可読インジケータを介して提供される、請求項５４に記載のシステム。
  56. 前記カートリッジが、光学的検出領域を含む場合、前記器具が、前記試料中の検体の存在に応答して光学シグナルを発生させるために前記試料を処理し、前記光学検出ユニットを介して前記光学シグナルを検出するように命令される、請求項３８〜５４のいずれか一項に記載のシステム。
  57. 前記システムが、全血試料中の検体および／または全血試料の血漿画分の検出のために構成されている、請求項３８〜５６のいずれか一項に記載のシステム。
  58. 前記システムが、全血試料の血漿画分中の検体の検出のために構成され、前記全血試料の前記血漿画分が、前記血漿画分を前記全血試料から分離するためのフィルタを備えるカートリッジを使用して生成される、請求項３８〜５６のいずれか一項記載のシステム。
  59. 試料中の検体の電気化学的検出のための方法であって、
    （ａ）前記試料をカートリッジに導入することであって、前記カートリッジが、
    第１の基板、第２の基板、前記第１の基板から前記第１の基板を分離するギャップ、液滴への電気作動力を発生させるための複数の電極、ならびに作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域を含む、導入することと、
    （ｂ）前記検体を含む第１の液滴を提供するために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｃ）前記検体に対して選択的な酵素を含む第２の液滴を提供するために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｄ）混合物を生成するように前記第１および第２の液滴を合体させるために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｅ）前記混合物の全部または一部を前記電気化学的感知領域に移動させるために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｆ）前記作用電極および参照電極を介して、前記検体に対する前記酵素の作用によって発生した電気化学種の電気シグナルを検出することと、を含む、方法。
  60. 前記第２の液滴が、酸化還元媒体を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記電気シグナルに基づいて、前記検体の濃度を決定することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記電気化学的感知領域が、毛細管領域内に位置している、請求項５９に記載の方法。
  63. 試料中の検体の電気化学的検出のための方法であって、
    （ａ）前記試料をカートリッジに導入することであって、前記カートリッジが、
    第１の基板、第２の基板、前記第１の基板から前記第１の基板を分離するギャップ、液滴への電気作動力を発生させるための複数の電極、ならびに作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域を含む、導入することと、
    （ｂ）前記検体を含む第１の液滴を提供するために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｃ）前記検体に対して特異的に結合するように第１の結合メンバーを含む固体基材を含む第２の液滴を提供するために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｄ）混合物を生成するように前記第１および第２の液滴を合体させるために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｅ）前記混合物の全部または一部を前記検体に特異的に結合する第２の結合メンバーを含む第３の液滴と合体させるために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｆ）前記複数の電極を作動させながら、いかなる未結合の検体および／または第２の結合メンバーを、除去するために、前記固体基材を所定の位置に保持することと、
    （g）前記固体基材、前記第２の結合メンバーに接合された前記酵素の基質分子と接触させるために、前記複数の電極を作動させることと、
    （ｈ）前記作用電極および参照電極を介して、前記基質分子に対する前記酵素の作用によって発生した電気化学種の電気シグナルを検出することと、を含む、方法。
  64. 前記方法が、ステップ（ｇ）および（ｈ）の前に、第２の固体基質を含む液滴を、ステップ（ｆ）から前記電気化学的感知領域に移動させることを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記方法が、第２の固体基質および酵素基質を含む液滴を、ステップ（ｇ）から前記電気化学的感知領域に移動させることを含む、請求項６３記載の方法。
  66. 前記電気シグナルに基づいて、前記検体の濃度を決定することをさらに含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 単一のカートリッジまたは異なるカートリッジを使用して、試料におけるイムノアッセイを実施することをさらに含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記方法が、前記試料中の検体の存在を示すタグまたは検体特異的結合メンバーを含む液滴を生成するために、前記複数の電極を使用することと、前記ナノポア層のナノポアを通したタグまたは検体特異的結合メンバーの転位によって発生した電気シグナルをアッセイするために、前記液滴を前記ナノポア層に位置付けることをさらに含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 器具を使用して検体検出を実行するための方法であって、
    前記１つ以上の検体検出カートリッジへの動作可能な接続のためのカートリッジインターフェースを備える、検体検出器具を提供することと、
    液滴への電気作動力を発生させるために複数の電極を有する、複数のカートリッジを提供することと、
    第１のカートリッジを前記器具とインターフェース接続し、カートリッジ内の液滴から検体関連シグナルを検出することと、
    第２のカートリッジを前記器具とインターフェース接続し、前記カートリッジ内のナノポア層の細孔を通って転位するタグ／検体特異的結合メンバーからの検体関連シグナルを検出することと、を含む、方法。
  70. 単一のシステムを使用して少なくとも２つのアッセイを同時にまたは連続して実施するための方法。
  71. 前記少なくとも２つのアッセイが、
    （ａ）臨床化学アッセイおよびイムノアッセイ、
    （ｂ）２つの臨床化学アッセイ、
    （ｃ）２つのイムノアッセイ、
    （ｄ）臨床化学アッセイおよび血液学アッセイ、
    （ｅ）イムノアッセイおよび血液学アッセイ、
    （ｆ）２つの血液学アッセイ、
    （ｇ）臨床化学アッセイ、イムノアッセイ、および血液学アッセイ、
    （ｈ）３つの臨床化学アッセイ、
    （ｉ）３つのイムノアッセイ、
    （ｊ）２つの臨床化学アッセイおよび血液学アッセイ、
    （ｋ）２つのイムノアッセイおよび血液学アッセイ、
    （ｌ）２つの血液学アッセイおよび臨床化学アッセイ、
    （ｍ）２つの血液学アッセイおよびイムノアッセイ、ならびに
    （ｎ）３つの血液学アッセイからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記単一のシステムが、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の器具である、請求項７０または７１に記載の方法。
  73. 試料中の検体を検出するための器具であって、前記器具が、
    制御ユニットと、
    検出ユニットと、
    前記試料を含む１つ以上のカートリッジへの動作可能な接続のためのカートリッジインターフェースと、を備え、
    前記制御ユニットが、前記カートリッジ内に存在する試料液滴を移動させるための前記カートリッジ内の電極のアレイの活性化を制御するために構成され、
    前記検出ユニットが、
    ｉ）カートリッジ内の液滴からの第１の検体関連シグナル、および
    ｉｉ）カートリッジ内の単一分子からの第２の検体関連シグナルを検出するように構成されている、器具。
  74. 前記第１の検体関連シグナルが、光学シグナルまたは電気シグナルを含み、前記第２の検体関連シグナルが、光学シグナルを含む、請求項７３に記載の器具。
  75. 前記第１の検体関連シグナルが、光学シグナルまたは電気シグナルを含み、前記第２の検体関連シグナルが、電気シグナルを含む、請求項７３に記載の器具。
  76. 前記検出ユニットが、同じカートリッジからの前記第１および第２の検体関連シグナルを検出するように構成されている、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の器具。
  77. 前記検出ユニットが、異なるカートリッジからの前記第１および第２の検体関連シグナルを検出するように構成されている、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の器具。
  78. 器具が、電源をさらに含み、前記制御ユニットが、前記１つ以上の電極に印加される電力を制御する、請求項７３に記載の器具。
  79. 前記制御ユニットが、前記１つ以上の電極の活性化の持続期間を制御する、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の器具。
  80. 前記制御ユニットが、前記カートリッジ内の液滴の移動を容易にするために１つ以上の電極の活性化および非活性化の順序を制御する、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の器具。
  81. 合体液滴を生成するために、前記移動が試料液滴を試薬液滴と合体させることを含む、請求項８０に記載の器具。
  82. 前記移動が、前記合体液滴またはその一部を前記検出ユニットに移動させることを含む、請求項８１に記載の器具。
  83. 前記検出ユニットが、前記カートリッジからの電気シグナルを検出するための電気的検出ユニットを含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の器具。
  84. 前記検出ユニットが、前記カートリッジからの光学シグナルの検出のための光学検出ユニットを含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の器具。
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