JP2020171288A - インフルエンザヘマグルチニンに対する結合分子及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスに対して広域の活性を有し、且つインフルエンザ感染の予防又は治療用医薬として用いることのできる有効な新規阻害薬を提供する。【解決手段】系統発生学的グループ２の２つの異なるヘマグルチニン（ＨＡ）亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの特異的結合能を有するか；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの特異的結合能を有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの特異的結合能を有する単量体及び多量体結合分子。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬の分野に関する。本発明は、結合分子、詳細には、Ａ型及び／又はＢ型
インフルエンザウイルスのインフルエンザヘマグルチニンに結合するシングルドメイン抗
体及びマルチドメイン抗体を提供する。好ましくは、本結合分子はまた、Ａ型及び／又は
Ｂ型インフルエンザウイルスの中和能も有する。本発明は、シングルドメイン抗体及びマ
ルチドメイン抗体をコードする核酸分子、並びにそれを含む組成物を更に提供する。本発
明は、Ａ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされ
る感染症の診断、予防及び／又は治療に更に関する。

季節性Ａ型インフルエンザは公衆衛生上重要な問題であり、毎年世界で２５０，０００
人以上が死亡していると共に、何百万人もの人々に経済的負担をもたらしている。汎流行
インフルエンザは、新種のウイルスが出現して、免疫がほとんど又は全くない人々に全世
界的に感染すると起こるものであり、ヒトの健康にとって一層大きい脅威となっている。
例えば、１９１８年の「スペイン風邪」の世界的流行では、推定５千万人が死亡した。高
病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）は感染したヒトにおいて５０％を超える死亡率を示
しており、継続的に問題化している。Ｈ５及びＨ７インフルエンザウイルスは、世界の特
定の場所の家禽に地域的に流行する。これらのウイルスは、現在のところ、ヒト間で易感
染する能力はないように思われるが、トリＨ５型に関する最近のデータでは、哺乳類イン
ビボモデル系において、このウイルスの空気感染による伝播が可能となるのに僅か数個の
アミノ酸変化で十分であることが示されている。

これまで、Ｂ型インフルエンザウイルスはあまり注目されてこなかった。これは、Ｂ型
インフルエンザウイルス − そもそも宿主がヒトに限られている − が、汎流行Ａ型
インフルエンザ株の出現の鍵である病原体保有動物の大規模なリザーバーを有していない
ことが理由であり得る。しかしながら、毎年の流行の累積的な影響は世界的流行の影響を
上回り、Ｂ型インフルエンザに起因する罹患率及び死亡率は、例えばＨ３Ｎ２ウイルスよ
りも低いが、概してＨ１Ｎ１ウイルスよりも高い。

インフルエンザウイルス感染の管理の中心はワクチンであるが、時宜を得た実施には幾
つかの技術的課題を伴う。そうした課題としては、（ｉ）いずれのウイルス株が出現して
ヒト集団に感染するかの予測、（ｉｉ）新型ウイルス株が出現してから臨床認可済みのワ
クチンが利用可能となるまでの時間の遅れ、（ｉｉｉ）特定の患者集団、例えば高齢者、
超若年者又は免疫不全者における低い免疫原性、及び（ｉｖ）世界的に見た製造能力の限
界が挙げられる。

ノイラミニダーゼ阻害薬オセルタミビル及びザナミビル並びにＭ２阻害薬アマンタジン
及びリマンタジンなどの抗ウイルス薬は、季節性及び汎流行性の両方のインフルエンザに
対する治療選択肢群の重要な補強となる。しかしながら、これらの薬物は、感染後期に投
与した場合には有効性が限られており、広範囲に及ぶ使用は耐性ウイルス株の出現をもた
らす可能性がある。更に成人におけるオセルタミビルの使用は、悪心、嘔吐、精神医学的
作用及び腎臓イベントなどの有害作用と関連付けられている。

抗体は、最も初期の防御剤クラスの１つに相当し、これまでのインフルエンザの世界的
流行では回復期患者血清の受身伝達の使用が成功した。しかしながら、この手法は、（ｉ
）適切な血清の供給が限られている、（ｉｉ）毒性リスクが高い、（ｉｉｉ）ロット間の
ばらつきが大きい、（ｉｖ）用量決定が不確か、及び（ｖ）投与が難しいため、世界規模
での実施可能性は限られている。

組換えモノクローナル抗体技術の進歩により、この戦略は更に研究する価値があるもの
となっているが、それは、分量に制限なく防御抗体を作製して備蓄し、世界的流行の緊急
時に直ちに防御を提供し得ることが理由であるわけでは全くない。これが有効な戦略とな
るには、かかる抗体が異なるウイルス亜型にわたって中和活性を有することが必要となり
得る。インフルエンザウイルスのウイルスコートタンパク質、詳細にはヘマグルチニン（
ＨＡ）は絶えず変化しているため、これは大きい課題を提起する。

ヘマグルチニン又はＨＡは、インフルエンザウイルス外被にアンカリングした、以下の
二重の機能を有する三量体糖タンパク質である。ＨＡは宿主細胞表面受容体シアル酸との
結合に関与し、取り込み後にウイルス膜とエンドソーム膜との融合を媒介して、細胞のサ
イトゾルにおけるウイルスＲＮＡの放出をもたらす。ＨＡは、大きい可変の頭部ドメイン
と、小さいより高度に保存された茎部ドメインとを含む。ＨＡに対する多くの中和抗体は
頭部領域の超可変領域にあるエピトープを認識し、従って宿主細胞との結合を妨げる。し
かしながら、最近になって、ＨＡ茎部領域に結合して膜融合を妨げる新規モノクローナル
抗体が同定されている（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ
ａｌ．，２０１２；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ
．，２０１１及びＥｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋａｓｈｙａｐ ｅｔ ａｌ
．，２０１０；Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１
２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｔｈｒｏｓｂ
ｙ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔｓｉｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，２０１０；Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

これらの広域中和抗体の少なくとも一部は前例のない交差反応範囲を示しており、イン
フルエンザウイルスのある亜型、系統発生学的グループの範囲内の、又は更には異なるグ
ループの及び亜型間の多くの異なる株の中和が可能となっている。これらの抗体の潜在的
治療及び予防能力はマウス及びフェレットの両モデルで実証されており、幾つかは現在ヒ
ト臨床試験で評価中である。しかしながら、これらのモノクローナル抗体にも、ある固有
の制限があり、インフルエンザの予防及び／又は治療にそれらを広範に利用する上で大き
い課題となり得る。これらの制限としては、（ｉ）非経口投与の必要性；（ｉｉ）高い商
品原価；（ｉｉｉ）蔓延しているインフルエンザ株を完全には網羅できないこと；（ｉｖ
）感染部位における低いバイオアベイラビリティ；及び（ｖ）薬剤耐性の出現リスクを挙
げることができる。

シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の抗原結合可変ドメインからなる抗体断片
である。こうした断片には、従来のモノクローナル抗体と比べて、（ｉ）小さいサイズ（
１５ｋＤａ）、（ｉｉ）低い微生物学的生産コスト、（ｉｉｉ）単純な操作で多重特異性
フォーマットになる、（ｉｖ）安定性が高く、注射以外の投与経路に対応できる可能性が
ある、及び／又は（ｉｖ）埋もれた又は隠れたエピトープに到達できる可能性があること
を含め、幾つかの利点がある。これらの有利な特性により、ｓｄＡｂは、特に感染症の分
野でモノクローナル抗体に代わる魅力的な選択肢となっている。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイル
ス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ＦＭＤＶ、ポリオウイルス及びロタウイル
スを含め、幾つかの異なるウイルスに対するｓｄＡｂが文献に記載されている（Ｖａｎｌ
ａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

インフルエンザの中和能を有するＨＡ結合ｓｄＡｂも文献に記載されている。このよう
に、Ｈｕｌｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）は、複数のＨ５Ｎ１ウイルスに対して
中和活性を有するｓｄＡｂ（Ｉｎｆｌ−Ｃ８）を同定した。Ｉｎｆｌ−Ｃ８二量体及び三
量体は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する活性の向上及び広域化を示した。しかしながら、ＰＲ
８（Ｈ１Ｎ１）又はＸ４７（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスの交差中和は観察されな
かった。

国際公開第２００９／１４７２４８号パンフレットは、ＥＬＩＳＡでヘテロ亜型結合活
性を示す幾つかのｓｄＡｂを開示している。しかしながら、これらのｓｄＡｂのいずれも
、１つを除いてウイルス中和アッセイで活性を示さなかった。ＩＶ１４６と呼ばれるこの
１つの中和ｓｄＡｂは、ＥＬＩＳＡで系統発生学的グループ１に限定された結合を示し、
２つの異なるＨ５ウイルスの中和能を有した。

Ｔｉｌｌｉｂ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、Ｈ５Ｎ２株Ａ／マガモ／ペンシルベニア
／１０２１８／８４に対してインビトロ及びインビボ中和活性を有する複数のｓｄＡｂを
記載している。

Ｈｕｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５及び／又はＨ９ウイル
スに対する亜型間交差中和活性を有する幾つかのｓｄＡｂを同定した。しかしながら、こ
れらのｓｄＡｂのいずれもＨ７Ｎ２を中和することはできなかった。ｓｄＡｂのうちの１
つを二量化すると、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９に対するその活性が改善したが、Ｈ７Ｎ２
又はＨ３Ｎ２ウイルスの群間交差中和は得られなかった。

このように、これまで同定された単量体又は多量体ｓｄＡｂの中に、関連する全ての季
節性（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢ）及び汎流行性（例えばＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９）インフ
ルエンザ株を中和可能なものは１つもない。Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ
ウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患が重症であること、及び季節的流行の経済的
影響が大きく、且つ世界的流行のリスクが継続的に存在することを踏まえると、Ａ型及び
Ｂ型インフルエンザウイルスに対して広域の活性を有し、且つインフルエンザ感染の予防
又は治療用医薬として用いることのできる有効な新規阻害薬が常に必要とされている。

本発明は、系統発生学的グループ２の２つの異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２つの
Ａ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；
又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザ株及び系統発生学的
グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株との特異的結合能を有する
か；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との
特異的結合能を有する新規シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提供する。特定の実施形
態において、本ｓｄＡｂはまた、系統発生学的グループ２の２つのＨＡ異なる亜型を含む
少なくとも２つの異なるＡ型インフルエンザウイルス株；又は系統発生学的グループ１の
少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループの少なくとも
１つのＡ型インフルエンザウイルス株；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイル
ス株の中和能も有する。

本発明は、いわゆるマルチドメイン抗体、即ち、少なくとも２つ、好ましくは少なくと
も３つ、より好ましくは少なくとも４つ、又は更により好ましくは少なくとも５つの本明
細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体を含む結合分子を更に提供する。特定の
実施形態において、マルチドメイン抗体は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つの
Ａ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型イン
フルエンザウイルス株の中和能を有する。特定の実施形態において、マルチドメイン抗体
は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統
発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１
つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型イ
ンフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイ
ルス株の中和能を有する。特定の実施形態において、マルチドメイン抗体は、Ｈ１亜型の
ＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、Ｈ３亜
型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株など）、Ｈ
５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株など）
、及びＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルス
株など）、及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス、好ましくはＢ／山形系統
の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも
１つのインフルエンザウイルス株の中和能を有する。

本発明は、ｓｄＡｂ又はマルチドメイン抗体をコードする核酸分子、並びに前記核酸分
子を含むベクター及び宿主細胞を更に提供する。

本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの１つ以上のｓｄＡｂ、マルチドメイン抗
体、核酸分子及び／又はベクターを含む（医薬）組成物も提供する。

本発明によれば、新規インフルエンザヘマグルチニン結合分子が提供される。本結合分
子はシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗体であってもよい。本発明の結合分子の
少なくとも一部は、系統発生学的グループ間での交差中和性を有し、即ち、系統発生学的
グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ
２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株に結合してそれらを中和することが
可能である点でユニークである。特定の実施形態において、本結合分子は、少なくとも１
つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型イ
ンフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイ
ルス株との特異的結合能及びその中和能を有する。本発明の結合分子及び核酸配列は、更
に原因となるインフルエンザ亜型と無関係に、インフルエンザ感染の診断用、予防用、及
び／又は治療用薬剤としての使用に好適である。

ＥＬＩＳＡによるラマ＃３及び＃４の免疫応答の分析を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０１６、ＳＤ１０３８及びＳＤ１０４５のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｄＡｂで治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３６、ＳＤ１０４６及びＳＤ１０４８のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５又は０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｄＡｂで治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０８３及びＳＤ１０８４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５又は０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｄＡｂで治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３８、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又はＳＤ１０３８とＳＤ１０３６との１：１混合物のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３６、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又はＳＤ１０３６とＳＤ１０３８との１：１混合物のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３８及びＭＤ１２１２のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５、１．７、０．６又は０．２ｍｇ／ｋｇシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＳＤ１０３８及びＭＤ１２１２のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５、１．７、０．６又は０．２ｍｇ／ｋｇシングル又はマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１２２１、ＭＤ１２２２及びＭＤ１２２４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に５又は０．５ｍｇ／ｋｇマルチドメイン抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に３ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にＭＤ２６１７で鼻腔内治療（上）又は静脈内治療（下）したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）にＭＤ２６１７で鼻腔内治療（上）又は静脈内治療（下）したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６（上）又はＡ／香港／１／１９６８−ＭＡ（下）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に（マルチドメイン）抗体で鼻腔内治療又は静脈内治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６（上）又はＡ／香港／１／１９６８−ＭＡ（下）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２６１７及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に（マルチドメイン）抗体で鼻腔内治療又は静脈内治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、１又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．２、１又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ｂ／フロリダ／４／２００６ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０２、０．１又は０．５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０１、０．０５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０１、０．０５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．０１、０．０５又は０．２５ｍｇ／ｋｇ（マルチドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（シングルドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。 Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスによる致死的攻撃誘発に対するＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４のインビボ有効性を示す。攻撃誘発前日（０日目）に０．６、１．７又は５ｍｇ／ｋｇ（シングルドメイン）抗体で治療したマウスの生存曲線（左）及び体重減少（右）を示す。

定義
本発明において用いられるとおりの用語の一部の定義を以下に示す。

用語「結合分子」は、本明細書で使用されるとき、本発明に係るシングルドメイン抗体
（単量体結合分子）及びマルチドメイン抗体（多量体結合分子）の両方を指す。

本明細書で使用されるとき、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、他のＶ領域又はＶ
ドメインとは独立に抗原又はエピトープと特異的に結合する単一の単量体可変抗体ドメイ
ンからなる結合分子である。シングルドメイン抗体は当該技術分野において公知であり、
通常、天然に存在する「重鎖単独」抗体、即ち軽鎖を欠く重鎖抗体に由来する。かかる重
鎖単独抗体は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラ
クダ、又はアルパカから得ることができる（ラクダ科動物抗体とも称される）。前記重鎖
単独抗体に由来する可変領域は、概してＶＨＨドメイン又はシングルドメイン抗体（ｓｄ
Ａｂ）として知られている。シングルドメイン抗体は、本明細書で使用されるとき、２本
の重鎖と２本の軽鎖とを含む従来の免疫グロブリンから単離された単一の可変ドメイン（
ＶＬ又はＶＨ）も指す。この免疫グロブリンは、好ましくはヒトであるが、げっ歯類を含
めた他の哺乳類種の免疫グロブリンも含み得る。

本明細書で使用されるとき、用語「マルチドメイン抗体」は、互いに直接、或いは連結
配列によって連結した少なくとも２つのシングルドメイン抗体を含む結合分子を指す。

Ａ型インフルエンザウイルスに関して用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグ
ルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の様々な組み合わせ
によって特徴付けられるＡ型インフルエンザウイルス株を指す。Ａ型インフルエンザウイ
ルス亜型は、例えば「Ｈ１又はＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、又は「
Ｈ１インフルエンザウイルス」「Ｈ３インフルエンザウイルス」など、そのＨ番号による
か、又は例えば「インフルエンザウイルス亜型「Ｈ３Ｎ２」又は「Ｈ５Ｎ１」など、Ｈ番
号とＮ番号との組み合わせによって参照され得る。用語インフルエンザウイルス「亜型」
は、具体的には、通常突然変異に起因する、異なる病原プロファイルを示すかかる亜型の
範囲内にある個々のインフルエンザウイルス「株」を全て含み、自然分離株並びに人工の
突然変異体又はリアソータントなどを含む。かかる株はまた、ウイルス亜型の様々な「分
離株」とも称され得る。従って、本明細書で使用されるとき、用語「株」と「分離株」と
は同義的に用いられ得る。

Ａ型インフルエンザウイルス亜型は、その系統発生学的グループを参照して更に分類す
ることができる。系統発生解析から、インフルエンザヘマグルチニンは２つの主要なグル
ープ、特に系統発生学的グループ１（「グループ１」インフルエンザウイルス）のＨ１、
Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型と、特に系統発生学的グループ２（「グループ２」インフルエン
ザウイルス）のＨ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０亜型とに細分化されることが示されている。

インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡの抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものより
小さい。ヒトでは、Ｂ／山形／１６／８８系統（Ｂ／山形系統とも称される）及びＢ／ビ
クトリア／２／８７（Ｂ／ビクトリア）系統によって表されるとおりの、２つの遺伝的及
び抗原的に異なる亜型、即ち「系統」のＢ型インフルエンザウイルスが出回っている。本
明細書で使用されるとき、Ｂ型インフルエンザウイルス株は、「Ｂ／山形系統」又は「Ｂ
／ビクトリア系統」に由来するインフルエンザウイルス株を参照する。

用語「中和する」は、本発明の結合分子に関連して本明細書で使用されるとき、中和が
達成される機構に関わらず、インビトロで、及び／又は対象体内のインビボでインフルエ
ンザウイルスの複製を阻害する結合分子を指す。従って、中和は、例えば、細胞表面への
ウイルスの付着又は接着の阻害によるか、又はウイルスが標的細胞に付着した後のウイル
ス膜と細胞膜との融合の阻害によるか、又は感染細胞からのウイルスの放出の阻害による
などして達成され得る。用語「交差中和する」又は「交差中和」は、本発明の結合分子に
関連して本明細書で使用されるとき、本発明の結合分子が異なる亜型のＡ型及び／又はＢ
型インフルエンザウイルスを中和する能力を指す。

本発明の結合分子に関して、用語「（免疫）特異的に結合する」は、目的のタンパク質
のエピトープに結合するが、抗原性生体分子の混合物を含有する試料中の他の分子は実質
的に認識及び結合しない結合分子を指す。結合は、共有結合性又は非共有結合性の相互作
用又は両方の組み合わせによって媒介され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「インフルエンザ」、又は「インフルエンザウイルス
疾患」は、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスによる細胞又は対象の感染によって起こ
る病的状態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、Ａ型又はＢ型インフルエン
ザウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患を指す。本明細書で使用されるとき、用語
「インフルエンザウイルス感染」は、細胞又は対象におけるインフルエンザウイルスの侵
入、増殖及び／又は存在を意味する。

図の詳細な説明
本発明の第１の態様において、系統発生学的グループ２の２つの異なる亜型のＨＡを含
む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的
結合能を有する新規シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、即ち、少なくとも２つの異なる
Ａ型インフルエンザウイルス株であって、系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜
型のＨＡを含む株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するｓｄＡｂが提供さ
れる。加えて、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス
株のＨＡとの結合能及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザ
ウイルス株のＨＡとの結合能を有するｓｄＡｂが提供される。更には、少なくとも１つの
Ｂ型インフルエンザウイルス株のＨＡとの特異的結合能を有するｓｄＡｂが提供される。
系統発生学的グループ２のＡ型インフルエンザウイルス株の２つの異なる亜型のＨＡとの
特異的結合能を有するか、又は系統発生学的グループ１（Ｈ１、Ｈ２、及び／又はＨ５亜
型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）と系統発生学的グループ２（Ｈ３、Ｈ７及
び／又はＨ１０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）との両方のＡ型インフル
エンザウイルス株のＨＡとの結合能を有するシングルドメイン抗体については、これまで
記載されたことがない。加えて、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡとの特異的結合能を
有するｓｄＡｂについても依然として記載されたことがない。

本発明のｓｄＡｂは、ＨＡの保存された中和エピトープに結合する。特定の実施形態に
おいて、本ｓｄＡｂは、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の茎部領
域にあるエピトープに結合する。他の実施形態において、本ｓｄＡｂは、ＨＡタンパク質
の頭部領域にあるエピトープに結合する。特定の実施形態において、本ｓｄＡｂは、Ｂ型
インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の頭部領域にあるエピトープに結合する。

特定の好ましい実施形態において、本ｓｄＡｂはまた、系統発生学的グループ２の２つ
の異なる亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株の中和能も有
する。特定の実施形態において、本ｓｄＡｂは、系統発生学的グループ１の好ましくは少
なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ１又はＨ５亜型のＨＡを含むイ
ンフルエンザウイルスなど）及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフ
ルエンザウイルス株（例えばＨ３又はＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど
）；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少
なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つ
のインフルエンザウイルス株の中和能を有する。

特定の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体は、ラクダ科動物ＶＨＨ
ドメイン、即ち、いわゆるラクダ科動物（重鎖単独）抗体の可変ドメインである。更なる
実施形態において、本シングルドメイン抗体はヒト化ラクダ科動物ＶＨＨドメインである
。ラクダ科動物シングルドメイン抗体のヒト化には、単一のポリペプチド鎖における限ら
れた量のアミノ酸の導入及び突然変異誘発が必要である。これは、２本の鎖、軽鎖及び重
鎖におけるアミノ酸変化の導入並びに両鎖のアセンブリの維持が必要なｓｃＦｖ、Ｆａｂ
、（Ｆａｂ）２及びＩｇＧのヒト化と対照的である。ラクダ科動物ＶＨＨドメインのヒト
化方法については、例えば、国際公開第２００８／０２００７９号パンフレット、国際公
開第２００８／１４２１６４号パンフレット、国際公開第２０１０／１３９８０８号パン
フレットに記載されているように、当該技術分野において公知である。本発明に係るｓｄ
Ａｂのヒト化は実施例１１に記載する。

特定の実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、
配列番号２２７、２２８及び２２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３０、２３１及び２３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３３、２３４及び２３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３６、２３７及び２３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３９、２４０及び２４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４２、２４３及び２４４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４５、２４６及び２４７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４８、２４９、及び２５０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５１、２５２及び２５３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５４、２５５及び２５６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５７、２５８及び２５９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６０、２６１及び２６２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６３、２６４及び２６５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６６、２６７及び２６８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６９、２７０及び２７１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７２、２７３及び２７４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７５、２７６及び２７７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７８、２７９及び２８０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８１、２８２及び２８３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８４、２８５及び２８６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８７、２８８及び２８９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２９０、２９１及び２９２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２９３、１２２及び１２３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１２４、１２５及び１２６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１２７、１２８及び１２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３０、１３１及び１３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３３、１３４及び１３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３６、１３７及び１３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；又は
配列番号１３９、１４０及び１４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上
を含む。

用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、本明細書で使用されるとき、結合分子の可変領
域内の配列であって、抗原上の認識されるエピトープと形状及び電荷分布が相補的な抗原
結合部位に通常大きく寄与する配列を意味する。ＣＤＲ領域は、タンパク質上にその天然
の立体構造で存在するとおりの、或いは場合によってはタンパク質上に例えばＳＤＳ中で
の可溶化によって変性したものとして存在するとおりの、タンパク質又はタンパク質断片
の線状エピトープ、不連続エピトープ、又は立体エピトープに特異的であり得る。

特定の実施形態において、本シングルドメイン抗体は、
ａ）配列番号２２７のＣＤＲ１領域、配列番号２２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２
９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂ）配列番号２３０のＣＤＲ１領域、配列番号２３１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２３
２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｃ）配列番号２３３のＣＤＲ１領域、配列番号２３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２３
５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｄ）配列番号２３６のＣＤＲ１領域、配列番号２３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号２３
８のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｅ）配列番号２３９のＣＤＲ１領域、配列番号２４０のＣＤＲ２領域、及び配列番号２４
１のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｆ）配列番号２４２のＣＤＲ１領域、配列番号２４３のＣＤＲ２領域及び配列番号２４４
のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｇ）配列番号２４５のＣＤＲ１領域、配列番号２４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２４
７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｈ）配列番号２４８のＣＤＲ１領域、配列番号２４９のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５
０のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｉ）配列番号２５１のＣＤＲ１領域、配列番号２５２のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５
３のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｊ）配列番号２５４のＣＤＲ１領域、配列番号２５５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５
６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｋ）配列番号２５７のＣＤＲ１領域、配列番号２５８のＣＤＲ２領域、及び配列番号２５
９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｌ）配列番号２６０のＣＤＲ１領域、配列番号２６１のＣＤＲ２領域及び配列番号２６２
のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｍ）配列番号２６３のＣＤＲ１領域、配列番号２６４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６
５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｎ）配列番号２６６のＣＤＲ１領域、配列番号２６７のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６
８のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｏ）配列番号２６９のＣＤＲ１領域、配列番号２７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７
１のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｐ）配列番号２７２のＣＤＲ１領域、配列番号２７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７
４のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｑ）配列番号２７５のＣＤＲ１領域、配列番号２７６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７
７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｒ）配列番号２７８のＣＤＲ１領域、配列番号２７９のＣＤＲ２領域及び配列番号２８０
のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｓ）配列番号２８１のＣＤＲ１領域、配列番号２８２のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８
３のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｔ）配列番号２８４のＣＤＲ１領域、配列番号２８５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８
６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｕ）配列番号２８７のＣＤＲ１領域、配列番号２８８のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８
９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｖ）配列番号２９０のＣＤＲ１領域、配列番号２９１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２９
２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｗ）配列番号２９３のＣＤＲ１領域、配列番号１２２のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２
３のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｘ）配列番号１２４のＣＤＲ１領域、配列番号１２５のＣＤＲ２領域及び配列番号１２６
のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｙ）配列番号１２７のＣＤＲ１領域、配列番号１２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２
９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｚ）配列番号１３０のＣＤＲ１領域、配列番号１３１のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３
２のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ａａ）配列番号１３３のＣＤＲ１領域、配列番号１３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号１
３５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂｂ）配列番号１３６のＣＤＲ１領域、配列番号１３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号１
３８のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；及び
ｃｃ）配列番号１３９のＣＤＲ１領域、配列番号１４０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１
４１のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される。

特定の好ましい実施形態において、シングルドメイン抗体は、
ａ）配列番号２７５のＣＤＲ１領域、配列番号２７６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７
７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂ）配列番号２８４のＣＤＲ１領域、配列番号２８５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８
６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｃ）配列番号１２４のＣＤＲ１領域、配列番号１２５のＣＤＲ２領域及び配列番号１２６
のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｄ）配列番号１２７のＣＤＲ１領域、配列番号１２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２
９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｅ）配列番号２６３のＣＤＲ１領域、配列番号２６４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６
５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；及び
ｆ）配列番号１３３のＣＤＲ１領域、配列番号１３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３
５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される。

更なる実施形態によれば、本発明に係るシングルドメイン抗体は、配列番号１〜２９か
らなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含む。本明細書で使用さ
れるとき、本発明の相同アミノ酸配列は、本発明の結合分子の機能的特性を実質的に変化
させることのない、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含み得る。相同配列が配
列同一性を指示する場合、それは、親配列と高い配列同一性（７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９５％又は９８％超の配列同一性）を呈する配列を意味する。

特定の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸
は突然変異していてもよく、即ち別のアミノ酸に置換されていてもよい。かかる突然変異
が導入されることにより、翻訳後修飾の発生を防止し得る。最も一般的な修飾としては、
タンパク質分解、グリコシル化、メチオニンの酸化、並びにアスパラギン及びグルタミン
残基のアミド分解が挙げられる。他の修飾としては、ピログルタミン酸形成、アスパラギ
ン酸異性化及びトリプトファン酸化が挙げられる。以下のアミノ酸残基及び配列モチーフ
が翻訳後修飾を受け易く、従って部位特異的突然変異誘発によって変化させてもよい：Ｎ
末端グルタミン酸又はグルタミン、Ｎ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／
Ｔｈｒ、溶媒に露出しているメチオニン又はトリプトファン残基、タンパク質分解切断部
位Ａｓｐ−Ｐｒｏ、アミド分解モチーフＡｓｎ−Ｇｌｙ及びＧｌｎ−Ｇｌｙ及び／又はＡ
ｓｐ異性化モチーフＡｓｐ−Ｇｌｙ。

特定の実施形態において、本発明のｓｄＡｂはヒト化されている。従って、特定の実施
形態において、本ｓｄＡｂは、配列番号１４６〜２２６及び３４０からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体は、配列番号１３（又は
配列番号１７７〜１８７及び配列番号３４０からなる群から選択されるそのヒト化変異体
）；配列番号１７（又は配列番号１４６〜１５６からなる群から選択されるそのヒト化変
異体）；配列番号２０（又は配列番号１５７〜１７６からなる群から選択されるそのヒト
化変異体）；配列番号２４（又は配列番号１８８〜１９７からなる群から選択されるその
ヒト化変異体）；配列番号２５（又は配列番号１９８〜２０３からなる群から選択される
そのヒト化変異体）；及び配列番号２７（又は配列番号２０４〜２２６からなる群から選
択されるそのヒト化変異体）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本シングルドメイン抗体は、配列番号１８７、配列番号３４
０、配列番号１５５、配列番号１７６、配列番号１９７、配列番号２０３及び配列番号２
２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の第２の態様によれば、いわゆるマルチドメイン抗体、即ち上記に記載したとお
りのシングルドメイン抗体を少なくとも２つ含む結合分子が提供される。例えば、第１の
シングルドメイン抗体のＣ端側末端が次のシングルドメイン抗体のＮ端側末端に連結され
て、二量体結合分子を形成し得る。特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、
上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体を少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は
少なくとも５つ含んで、三量体、四量体、五量体などの多量体を形成する。連結されるｓ
ｄＡｂは同じであってもよく、又は異なるｓｄＡｂ、即ち、異なるアミノ酸配列及びエピ
トープ特異性を有するｓｄＡｂであってもよい。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は単鎖分子である。特定の実施形態に
おいて、本マルチドメイン抗体は２本鎖分子であり、即ち、各々が少なくとも１つのシン
グルドメイン抗体を含む少なくとも２本の鎖を含む。これらの２本の鎖は同一であっても
よく、又は異なってもよい。

シングルドメイン抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて連結され、
本明細書に開示される任意のマルチドメイン抗体を形成し得る。従って、シングルドメイ
ン抗体は化学的連結によって連結されてもよく、又は互いに直接連結されても、或いはシ
ョートポリペプチドリンカーによって連結されてもよい。かかるリンカー配列は、天然に
存在する配列又は天然に存在しない配列であってもよい。リンカー配列は好ましくは、マ
ルチドメイン抗体に十分な可動性をもたらすと同時に、タンパク質分解に耐性を示す。

特定の実施形態において、少なくとも２つのシングルドメイン抗体がペプチドリンカー
を介して遺伝的に融合される。従って、シングルドメイン抗体は、完全なポリペプチドコ
ンストラクト、即ち２つ以上のシングルドメイン抗体を含む結合分子をコードするポリヌ
クレオチドコンストラクト（又は核酸配列）を形成することにより、ＤＮＡレベルで遺伝
的に融合される。

特定の実施形態において、少なくとも２つのシングルドメイン抗体が、１〜１００アミ
ノ酸、好ましくは１〜８０アミノ酸、又は１〜６０アミノ酸、又は１０〜６０アミノ酸を
含む連結配列によって連結される。リンカーの例としては、限定はされないが、表１５の
連結配列が挙げられる。従って、特定の実施形態において連結配列は、配列番号１４２〜
１４５から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、少なくとも２つの本発明に係るｓ
ｄＡｂを含む。少なくとも２つのｓｄＡｂは、表１４及び／又は表４０から選択され得る
。特定の実施形態において、少なくとも２つのｓｄＡｂは、配列番号１〜２９及び配列番
号１４６〜２２６からなる群から選択される。これらの少なくとも２つのｓｄＡｂは同じ
であってもよく（ホモ多量体）、又は異なってもよい（ヘテロ多量体）。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、
ａ）配列番号２７５のＣＤＲ１領域、配列番号２７６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７
７のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｂ）配列番号２８４のＣＤＲ１領域、配列番号２８５のＣＤＲ２領域、及び配列番号２８
６のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｃ）配列番号１２４のＣＤＲ１領域、配列番号１２５のＣＤＲ２領域及び配列番号１２６
のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｄ）配列番号１２７のＣＤＲ１領域、配列番号１２８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１２
９のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；
ｅ）配列番号２６３のＣＤＲ１領域、配列番号２６４のＣＤＲ２領域、及び配列番号２６
５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体；及び
ｆ）配列番号１３３のＣＤＲ１領域、配列番号１３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号１３
５のＣＤＲ３領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは
少なくとも４つのｓｄＡｂを含む。

特定の実施形態において、本発明に係るマルチドメイン抗体は、配列番号１３（又は配
列番号１７７〜１８７及び配列番号３４０からなる群から選択されるそのヒト化変異体）
；配列番号１７（又は配列番号１４６〜１５６からなる群から選択されるそのヒト化変異
体）；配列番号２０（又は配列番号１５７〜１７６からなる群から選択されるそのヒト化
変異体）；配列番号２４（又は配列番号１８８〜１７７からなる群から選択されるそのヒ
ト化変異体）；配列番号２５（又は配列番号１９８〜２０３からなる群から選択されるそ
のヒト化変異体）；及び配列番号２７（又は配列番号２０４〜２２６からなる群から選択
されるそのヒト化変異体）からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なく
とも３つ、より好ましくは少なくとも４つのｓｄＡｂを含む。

特定の実施形態において、本発明に係るマルチドメイン抗体は、配列番号３０〜７３か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本発明のマルチドメイン抗体は、系統発生学的グループ１の
少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ１及び／又はＨ５亜型のＨＡ
を含むインフルエンザウイルスなど）及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ
型インフルエンザウイルス株（例えばＨ３及び／又はＨ７亜型のＨＡを含むインフルエン
ザウイルスなど）の中和能を有する。特定の実施形態において、本発明のマルチドメイン
抗体は、系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例
えばＨ１及び／又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）及び系統発生学
的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株（例えばＨ３及び／又は
Ｈ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスなど）及び少なくとも１つのＢ型インフル
エンザウイルス株、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイ
ルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイルス株の中和能を
有する。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエ
ンザウイルス（Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフ
ルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株など）、Ｈ５亜型のＨＡを含むイ
ンフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株など）、Ｈ７亜型のＨＡを含
むインフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルス株など）、及び少なくとも
１つのＢ型インフルエンザウイルス、好ましくはＢ／山形系統の少なくとも１つのＢ型イ
ンフルエンザウイルス株及びＢ／ビクトリア系統の少なくとも１つのインフルエンザウイ
ルス株の中和能を有する。従って、本発明のマルチドメイン抗体は、好適には、更に原因
となるインフルエンザ亜型と無関係に、インフルエンザ感染の予防及び／又は治療に使用
することができる。

本発明によれば、本発明の交差中和マルチドメイン抗体は、他の小型及び大型抗インフ
ルエンザ分子と比べて幾つかの利点を提供することが示されている。従って、本マルチド
メイン抗体の親和性及び効力、並びに中和範囲は、例えばＣＲ９１１４（国際公開第２０
１３／００７７７０号パンフレット）及びＦＩ６ｖ３（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０
１１）など、インフルエンザＨＡを標的化する既発表の広域中和Ａｂ（ｂｎＡｂ）の親和
性、効力及び中和範囲より優れている。加えて、複数の独立した中和エピトープを標的化
することによる本マルチドメイン抗体は、ＣＲ９１１４及びＦＩ６ｖ３と比べて薬物耐性
インフルエンザ株が生じにくい。

従って、本明細書に記載されるとおり、本発明は、新規インフルエンザ結合及び交差中
和結合分子を提供する。本結合分子は、単量体、即ちシングルドメイン抗体であってもよ
く、又は多量体、即ちマルチドメイン抗体であってもよい。本発明の結合分子はその標的
に高い親和性及び特異性で結合する。これは、高頻度でオフターゲット結合を示して望ま
しくない副作用を生じる抗ウイルス薬などの小分子薬物と対照的である。加えて、本発明
の結合分子は多様なＨＡエピトープに結合し、その一部は従来の抗体が到達できないもの
である。インフルエンザＨＡは頭部領域及び茎部領域の両方に複数のグリコシル化部位を
含有する。これらの部位に結合した炭水化物により、ＨＡ分子上の一部が従来の抗体には
到達不可能となっている。本発明の結合分子はより小さく、これらの機能上重要である可
能性のあるエピトープをなおも標的化することが可能である。加えて、本発明の結合分子
は広範囲にわたる極限条件下で安定している。本結合分子は典型的には高温（最高１００
℃）、極端なｐＨ、変性剤及びタンパク質分解に耐性がある。本結合分子の有利な安定性
は、コールドチェーン外に保管し得ると共に、モノクローナル抗体などの他のタンパク質
薬物と比べて貯蔵寿命がより長い製品をもたらし得る。更には、本発明の結合分子は、全
て１つの単一工程に従い作製及び精製することのできる単一のタンパク質である。

典型的には、本発明に係る結合分子は、グループ１のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ
１Ｎ１など）及び／又はグループ２のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２など）、及
び／又はＢ型インフルエンザウイルスのＨＡ、及び／又はそれらの断片に、１．０×１０
^−６Ｍ、１．０×１０^−７Ｍ未満、好ましくは１．０×１０^−８Ｍ未満、より好ましくは
１．０×１０^−９Ｍ未満の親和性定数（Ｋｄ値）で結合する。親和性定数は、例えば、表
面プラズモン共鳴を用いて、例えばＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、又は実施例８に記載
されるとおり計測することができる。

特定の実施形態において、本結合分子はＡ型及び／又はＢ型インフルエンザウイルスに
対する中和活性を呈する。特定の実施形態において、本発明の結合分子は、宿主細胞のＡ
型又はＢ型インフルエンザウイルス感染を、前記結合分子の非存在下での宿主細胞の前記
インフルエンザウイルス感染と比べて少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも
９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、
少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくと
も４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％
、又は少なくとも１０％妨げる。中和活性は、例えば、本明細書に記載されるとおり計測
することができる。中和活性を計測する代替的なアッセイが、例えば、ＷＨＯ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｓｕｒ
ｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉ
ｏｎ，２００５，ｖｅｒｓｉｏｎ ２００２．５に記載されている。典型的には、本発明
に係る結合分子は、例えば実施例に記載されるとおりのインビトロウイルス中和アッセイ
（ＶＮＡ）で決定するとき、１０００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下の中和活性、
より好ましくは１０ｎＭ以下、更により好ましくは１ｎＭ以下の中和活性を有する。

特定の実施形態において、本結合分子（即ちシングルドメイン抗体又はマルチドメイン
抗体）はＦｃテールを更に含む。従って、特定の実施形態において、上記に記載されると
おりの結合分子は、抗体、好ましくはヒト抗体のＦｃ断片、例えば、ヒトＩｇＧ抗体のＦ
ｃ断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＧ４に連結されて
いる。本発明によれば、本明細書に記載されるとおりの単量体又は多量体結合分子は、直
接、或いはリンカーを用いてＦｃ断片と遺伝的に融合させてもよい。特定の実施形態にお
いて、本結合分子は、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜８０アミノ酸、又は１〜６０
アミノ酸、又は１０〜６０アミノ酸を含む連結配列によってＦｃ断片に連結している。リ
ンカーの例としては、限定はされないが、表１５の連結配列が挙げられる。従って、特定
の実施形態において、連結配列は、配列番号１４２〜１４５から選択されるアミノ酸配列
を含む。特定の実施形態において、ｓｄＡｂ又はマルチドメイン抗体はＦｃ断片のＣ末端
に遺伝的に融合している。更なる実施形態において、シングルドメイン抗体又はマルチド
メイン抗体はＦｃ断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合している。

特定の実施形態において、Ｆｃ断片は、最小限のエフェクター機能を有するように改変
される。最小限のエフェクター機能及び保存された半減期を有するＦｃ断片については当
該技術分野において記載されており、例えば、ＩｇＧ２、脱グリコシル化ＩｇＧ１（Ｉｇ
Ｇ１ ａｇｌｙ）、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４（ＩｇＧ
４ ＰｒｏＡｌａＡｌａ）、Ｈ２６８Ｑ／３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変化を有す
るＩｇＧ２（ＩｇＧ２ｍ４）及びＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ
３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を含有するＩｇＧ２σと呼ばれるＩｇＧ２のＦｃ
変異体が挙げられる。突然変異型のＩｇＧ４に関しては、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２４５Ａ置換に
よってＦｃγＲに対する特異的親和性が除かれている。

特定の実施形態において、Ｆｃ断片は、増強されたエフェクター機能を有するように改
変される。従って本発明の結合分子は、Ｆｃ媒介エフェクター機能が増強されるように改
変することができ、これは、インフルエンザ感染症の前臨床モデルにおいて、薬物の有効
性に寄与することが示されている。エフェクター機能の増強に関連するヒトＩｇＧ１のＣ
Ｈ２ドメインにおける幾つかの突然変異が、当該技術分野において記載されている。これ
らの突然変異としては、限定はされないが、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増加させる３３
３位のアラニン突然変異体、ＦｃγＲＩＩＩａに対する高い親和性及びＦｃγＲＩＩｂに
対する低い親和性によりＡＤＣＣの増強をもたらす三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３
２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）、及び向上したＦｃγＲＩＩＩａ親和性及び食作用の増強を媒介する
ＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を有する別の三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２
Ｅ／Ｇ２３６Ａ）が挙げられる。エフェクター機能に影響を及ぼす他のＦｃ突然変異が、
文献、例えばＳｔｒｏｈｌ，２００９に記載されている。特定の実施形態において、Ｆｃ
断片は、長い血清中半減期を有するように改変される。血清中半減期の増加を伴う幾つか
の改変Ｆｃ骨格が当該技術分野において公知である。これらのＦｃ変異体としては、限定
はされないが、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異を有するｈＩｇ
Ｇ１ Ｆｃ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ突然変異（ＱＬ）を有するｈＩｇＧ１又はｈＩｇＧ
２ Ｆｃ、Ｎ４３４Ａ突然変異を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ
４３４Ａ突然変異（ＡＡＡ）を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ又はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（Ｌ
Ｓ）置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃが挙げられる（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。
更なる実施形態において、本結合分子（即ち本発明に係るシングルドメイン抗体又はマル
チドメイン抗体）は、ヒト血清アルブミン又は血清アルブミンに結合するシングルドメイ
ン抗体に遺伝的に融合している。他の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン
抗体又はマルチドメイン抗体はＰＥＧに化学的にコンジュゲートしている。従って本発明
の結合分子は、例えば僅か数時間〜数週間又は更には数ヵ月の範囲の血清中半減期を有す
るように改変することができる。これは、現在オセルタミビル及びザナミビルなどのノイ
ラミニダーゼ阻害薬で用いられているとおりの１日２回レジメンに代わる、インフルエン
ザ感染の単回投与治療の可能性を開く。

更なる実施形態において、上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体又はマルチド
メイン抗体は、Ｆｃテール、好ましくはヘテロ二量体Ｆｃ分子の形成を促進するように改
変されたＦｃテールに融合されてもよい。Ｆｃヘテロ二量体化を促進する突然変異につい
ては、当該技術分野において記載されている（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
特定の実施形態において、ＦＣヘテロ二量体化を促進する突然変異は、欧州特許第０８１
２３５７Ｂ１号明細書及び欧州特許第０９７９２８１Ｂ１号明細書に記載されるとおりの
ノブ・イントゥ・ホール突然変異である。

特定の実施形態において、本発明に係るマルチドメイン抗体は、配列番号７４〜１０７
、配列番号１１０〜１２１及び配列番号２９３〜３３９からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含む少なくとも１本の鎖を含む。

特定の実施形態において、本マルチドメイン抗体は２本の鎖を含み、これらの２本の鎖
のアミノ酸配列は同一である。特定の実施形態において、これらの２本の鎖は、配列番号
７４〜１０５及び配列番号２９３〜２９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
。特定の実施形態において、これらの２本のアミノ酸鎖は配列番号２９３〜２９８のアミ
ノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、マルチドメイン抗体は２本の異なるアミノ酸鎖を含む。特定
の実施形態において、これらの２本の異なるアミノ酸鎖は、
配列番号２９９のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３００のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３０１のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０２のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３０３のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０５のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３０６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０７のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３０８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３１０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１１のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３１２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１３のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３１５のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１５のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３１６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１７のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３１８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１９のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号１０６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１７のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３２０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２１のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３２２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３２４のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２５のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３２６のアミノ酸配列を含む１本の鎖、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む
１本の鎖；
配列番号３２８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２９のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３３０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３１のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３３２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３３のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３３４のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３５のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３３６のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３７のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；及び
配列番号３３８のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３９のアミノ酸配列を含
む１本の鎖
からなる群から選択される。

特定の実施形態において、これらの２本の異なるアミノ酸鎖は、
配列番号３０１のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３０２のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３１０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３１１のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；
配列番号３２２のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含
む１本の鎖；及び
配列番号３３０のアミノ酸配列を含む１本の鎖及び配列番号３３１のアミノ酸配列を含
む１本の鎖
からなる群から選択される。

更に別の態様において、本発明は、上記に記載したとおりのシングルドメイン抗体又は
マルチドメイン抗体をコードする核酸分子（核酸配列とも称される）を更に提供する。好
ましくは、本核酸配列は、上記に記載したとおりのＣＤＲ領域の１つ以上を含む結合分子
をコードする。

特定の実施形態において、本核酸配列は、配列番号１〜２９からなる群から選択される
アミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含むシングルドメイン抗体をコードする。

特定の実施形態において、本核酸配列は、配列番号１４６〜２２６及び配列番号３４０
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミノ酸配列を含むシングルドメイン
抗体をコードする。

特定の実施形態において、本核酸配列は、配列番号３０〜１０７、配列番号１１０〜１
２１及び配列番号２９３〜３３９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は相同アミ
ノ酸配列を含むマルチドメイン抗体をコードする。

本発明に係る核酸配列はポリマー形態のヌクレオチドを指し、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーが含まれる。ヌクレオチド
は、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はいずれか一方のタイプのヌクレオチド
の修飾形態を指す。この用語にはまた、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡも含まれる。当業
者は、これらの核酸分子の機能変異体も本発明の一部であると意図されることを理解する
であろう。機能変異体は、標準的な遺伝子コードを用いて直接翻訳されて、親核酸分子か
ら翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供し得る核酸配列である。

好ましい実施形態において、本発明に係る結合分子をコードする核酸分子は、酵母細胞
又はヒト細胞などの哺乳類細胞における発現にコドンが最適化される。コドンの最適化方
法は公知であり、これまでに記載がなされている（例えば国際公開第９６／０９３７８号
パンフレット）。配列は、野生型配列と比較したとき、少なくとも１つの好ましくないコ
ドンがより好ましいコドンに置き換えられている場合にコドンが最適化されていると見な
される。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において同じアミノ酸をコードす
る別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生
物において好ましくないコドンと比べてより高頻度に使用されるコドンである。特定の生
物のコドン使用頻度については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃ
ｏｄｏｎにあるものなどのコドン頻度表を参照することができる。好ましくは２つ以上の
好ましくないコドン、好ましくはほとんど又は全ての好ましくないコドンが、より好まし
いコドンに置き換えられる。好ましくは、コドン最適化配列には、生物で最も高頻度に使
用されるコドンが使用される。好ましいコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。

また、当業者は、遺伝子コードの縮重の結果として、多数の異なる核酸分子が同じポリ
ペプチドをコードし得ることも理解するであろう。また、当業者が、ルーチンの技術を用
いて、ポリペプチドを発現させる任意の詳細な宿主生物のコドン使用を反映するため、核
酸分子によってコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製し
得ることも理解される。従って、特記されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配
列」には、互いの縮重型であり且つ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配
列が含まれる。核酸配列はルーチンの分子生物学技術を用いてクローニングするか、又は
ＤＮＡ合成によってデノボ生成することができ、これらは、ＤＮＡ合成及び／又は分子ク
ローニングの分野で業務を行っているサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳ
ｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によってルーチ
ンの手順を用いて実施されてもよい。

本発明はまた、上記に記載したとおりの少なくとも１つの核酸配列を含むベクターも提
供する。用語「ベクター」は、その複製場所、及び場合によっては発現場所となる宿主細
胞に導入するため第２の核酸分子を挿入し得る核酸分子を指す。換言すれば、ベクターは
、それに連結されている核酸分子の輸送能を有する。本明細書で使用されるとき、用語「
ベクター」には、クローニングベクターも発現ベクターも企図される。ある種のベクター
は、それが導入される宿主において自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有す
るベクターは細菌で複製することができる）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿
主のゲノムに組み込まれることができ、従って宿主ゲノムと共に複製される。本発明に係
るベクターは、当業者に周知の方法によって容易に作製することができる。

特定の実施形態において、１つ以上の発現調節核酸配列に作動可能に連結された本発明
に係る核酸分子を１つ以上含むベクターが提供される。用語「発現調節核酸配列」は、本
明細書で使用されるとき、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発
現に必要である、及び／又はその発現に影響を及ぼす核酸配列を指す。発現調節核酸配列
、例えば、特に適切な転写開始、終結、プロモーター、エンハンサー配列など；リプレッ
サー又はアクチベーター配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的
なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強す
る配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；及び必要に
応じて、タンパク質分泌を増強する配列は、選択の宿主生物において活性を示す任意の核
酸配列であってよく、宿主生物と同種或いは異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来
し得る。発現調節配列の同定及び使用は当業者にとってルーチンである。本発明に係る好
適なベクターは、例えば、アデノベクター（例えばＡｄ２６又はＡｄ３５など）、アデノ
随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワ
クシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクター等である。

特定の実施形態において、ベクターは、例えば、Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４）
、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）及びＳｕｓｃｏｖｉｃｈ ａｎｄ Ａｌｔ
ｅｒ（２０１５）によって記載されるとおり、遺伝子療法の目的で使用される。

本発明は、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体又はマルチドメイン抗
体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を更に提供する。「宿主細胞」は、本明細書で使
用されるとき、クローニングベクター又は発現ベクターなどのベクターが導入されている
細胞を指す。宿主細胞は原核生物細胞又は真核生物細胞であってもよい。

本発明は、上記に記載したとおりの１つ以上のシングルドメイン抗体、マルチドメイン
抗体、核酸分子及び／又はベクターを含む医薬組成物を更に提供する。本発明の医薬組成
物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を更に含み得る。「薬学的に許容可能
な賦形剤」とは、好適な組成物を調製するため本発明に係る結合分子などの活性分子と組
み合わされる任意の不活性な物質が意味される。薬学的に許容可能な賦形剤は、使用され
る投薬量及び濃度でレシピエントにとって非毒性である、製剤中の他の成分と適合する賦
形剤である。薬学的に許容可能な賦形剤は当該技術分野において広く利用されており、公
知である。本発明に係る医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療用、予防用及び／又は
診断用薬剤を更に含み得る。前記更なる治療用及び／又は予防用薬剤は、例えばＭ２阻害
薬（例えば、アマンタジン、リマンタジン）及び／又はノイラミニダーゼ阻害薬（例えば
、ザナミビル、オセルタミビル）など、例えば、インフルエンザウイルス感染を予防し及
び／又は治療する能力も有する薬剤であってもよい。これらは、本発明の結合分子と組み
合わせて使用され得る。本明細書における「組み合わせて」は、同時に、別個の製剤とし
て、又は１つの単一の組み合わされた製剤として、又は別個の製剤として逐次的な投与レ
ジメンに従い、任意の順序におけるものであることを意味する。

更なる態様において、本発明は、インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療に使
用される、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体、マルチドメイン抗体、
核酸分子、及び／又はベクターを提供する。本発明は、インフルエンザ感染の診断、予防
及び／又は治療用医薬の製造における、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン
抗体、マルチドメイン抗体、核酸分子、及び／又はベクターの使用を更に提供する。かか
る感染は小さい集団に起こることもあるが、また季節的流行で、又は悪ければ何百万人も
の人がリスクに曝される世界的規模の流行で全世界に広がることもある。本発明は、かか
る季節的流行、並びに可能性として世界的流行を引き起こすインフルエンザ株の感染を中
和することのできる結合分子を提供する。重要なことには、ここで、例えばＨ１、Ｈ２、
Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９及びＨ１１亜型を包含する系統発生学的グループ１、及び例えば
Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０亜型を包含する系統発生学的グループ２の両方の様々なイン
フルエンザ亜型、並びにＢ型インフルエンザ亜型の交差中和能が本発明の結合分子にある
ことが開示されているとおり、原因となるインフルエンザウイルスとは無関係に、本発明
の結合分子による防御及び治療を想定することができる。

本発明は、対象においてインフルエンザを予防及び／又は治療する方法を更に提供し、
この方法は、本明細書に記載されるとおりのシングルドメイン抗体、マルチドメイン抗体
、核酸分子、及び／又はベクターの治療有効量を、それを必要としている対象に投与する
ステップを含む。用語「治療有効量」は、インフルエンザウイルスに感染した結果起こる
状態を予防し、改善し及び／又は治療するのに有効な本明細書に定義するとおりの結合分
子又は核酸分子の量を指す。本明細書において使用するとおりの改善とは、目に見える又
は知覚できる疾患症状、ウイルス血症、又はインフルエンザ感染の任意の他の計測可能な
徴候の低減を指し得る。予防には、インフルエンザウイルスの伝播を阻害し若しくは低減
すること、又は症状の１つ以上の発生、発症又は進行を阻害し若しくは低減することが含
まれる。

予防及び／又は治療は、インフルエンザ感染に罹患し易い患者集団が対象となり得る。
かかる患者集団としては、限定はされないが、例えば、高齢者（例えば５０歳以上、６０
歳以上、及び好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下、１歳以下）、入院中の
患者及び抗ウイルス化合物による治療を受けたが不十分な抗ウイルス応答を示した既感染
患者が挙げられる。

投薬量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）が得られるように調整する
ことができる。好適な投薬量範囲は、例えば、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好まし
くは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る
。更に、例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、数回の用量が時間をかけて投与され
てもよく、又は必要と認められた場合に用量を比例的に減少又は増加させてもよい。

本発明に係る結合分子、核酸分子及び／又はベクターは対象に対し、例えば、静脈内に
、鼻腔内に、経口吸入により、肺内に、皮下に、皮内に、硝子体内に、経口的に、筋肉内
に等で投与されてもよい。最適な投与経路は、活性分子の物理化学的特性、臨床的状況の
緊急性及び活性分子の血漿濃度と所望の治療効果との関係を含め、幾つかの要因に左右さ
れることになる。

本発明の結合分子の高い安定性は、点鼻薬又は鼻腔内スプレーを使用した鼻腔内投与に
よるか、或いはネブライザー又は乾燥粉末吸入器を使用した吸入によるなど、代替的な無
針送達の可能性を開く。特定の実施形態において、本発明に係る少なくとも１つのシング
ル又はマルチドメイン抗体をコードする核酸分子又はベクターは、従って、例えばＬｉｍ
ｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されるとおり、鼻腔内投与される。

従来の抗体及び他の多くのバイオ医薬品と異なり、本発明の結合分子は、微生物系で極
めて効率的に作製することができる。大規模製造で使用される微生物宿主細胞の例は、例
えば酵母（Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であ
る。これらの微生物系は、生物医薬製造に最も費用効果の高い選択肢であると考えられる
。低いＣＯＧは、インフルエンザ予防及び治療における抗インフルエンザ薬の広範な利用
に必須である。特定の実施形態において、このように本発明は、結合分子の発現を誘導し
得る条件下で本明細書に記載されるとおりの宿主細胞を培養するステップと、任意選択で
、発現した結合分子を回収するステップとを含む、本発明に係る結合分子（即ちシングル
ドメイン抗体又はマルチドメイン抗体）の作製方法を提供する。培養培地からの結合分子
の回収方法は、当業者に周知である。

特定の実施形態において、宿主細胞は微生物細胞、例えば、限定はされないが、酵母細
胞又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

更なる実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞、例えば、限定はされないが、ＣＨＯ
細胞、ＨＥＫ細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。

本発明は、試料中のインフルエンザウイルスを検出する方法に更に関し、この方法は、
ａ）本発明に係る結合分子の診断上有効な量を前記試料に接触させるステップと、ｂ）結
合分子が試料中の分子に特異的に結合するかどうかを決定するステップとを含む。試料は
、限定はされないが、感染した（可能性のある）対象からの血液、血清、組織又は他の生
物学的材料を含め、生体試料であり得る。感染した（可能性のある）対象はヒト対象であ
り得るが、またインフルエンザウイルスのキャリアであることが疑われる動物も、インフ
ルエンザウイルスの存在に関して本発明の結合分子を使用して検査される可能性がある。
好ましくは、本発明の結合分子は、結合分子と試料中に存在し得るインフルエンザウイル
ス又はその抗原成分との間で免疫複合体の形成が可能な条件下で試料に接触させる。次に
、それがある場合には試料中にインフルエンザウイルスが存在することの指標となる免疫
複合体の形成を好適な手段によって検出及び計測し得る。かかる方法としては、特に、同
種及び異種結合イムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ
、免疫蛍光法、免疫組織化学、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥ及びウエスタンブロット分析が
挙げられる。以下の非限定的な実施例において本発明を更に説明する。

実施例１：免疫化
重鎖抗体依存性免疫応答の誘導を目的として、表１に記載するスキームに従い４匹のラ
マ（ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ））をフロイントアジュバントの存在下でイン
フルエンザウイルス抗原（市販のワクチンＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）及び組換えタン
パク質）によって免疫した。

２回目、３回目、４回目、及び５回目の免疫化後の指示される時点で（表１）、ラマか
ら静脈穿刺によって末梢血をクエン酸塩抗凝固試料チューブに採取した。

免疫化前（０日目）に採取した試料及び抗原投与後（２８日目及び１１２日目）に採取
した血清試料の抗原特異的血清力価をＨＡ ＥＬＩＳＡで比較することにより、各動物の
同種及び異種免疫応答を分析した。そのため、組換えＨＡタンパク質をＭａｘｉｓｏｒｐ
９６ウェルマイクロタイタープレートに捕捉した。ブロック後、血清試料の段階希釈物
を加え、ヤギ抗ラマＩｇＧ−ＨＲＰを添加することにより、結合したラマＩｇＧを検出し
た。結果は図１に示す。これらのデータは、免疫した動物が全てＨＡに対して良好な同種
及び異種免疫応答を生じたことを示している。

実施例２：ファージライブラリ構築
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示
に従い使用して新鮮血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＲＴ−ＰＣＲの出
発物質としてＰＢＭＣから抽出した全ＲＮＡを用い、ＶＨＨコード遺伝子断片を増幅した
。これらの断片をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位を用いてＭ１３ファージミドベクターｐ
ＤＶ−ＬｕｃＳｔｕｆｆｅｒ（ｐＤＶ−Ｃ０６由来；国際公開第０２／１０３０１２号パ
ンフレットに記載されるとおり）にクローニングして、ＶＨＨドメインとＭ１３ファージ
のｐＩＩＩタンパク質との融合物（これらの２つのタンパク質間にはアンバー終止コドン
が含まれる）を作成した。ライゲートしたベクターをＴＧ−１菌（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形
質転換し、１００〜１５０個の単一コロニーをＰＣＲで分析して各ライブラリの品質を決
定した。挿入頻度及び完全性は典型的には９５％超であった。構築したライブラリの特性
を表２に示す。ＣＴヘルパーファージを本質的に記載（国際公開第０２／１０３０１２号
パンフレット）のとおり使用して個々の動物からのファージライブラリを調製し、滅菌ろ
過し、選択に使用した。本明細書に示されるとおり、全ての免疫ラマから複合ファージラ
イブラリを作成することができた。

実施例３：インフルエンザＨＡに対するシングルドメイン抗体の選択
上記に記載したＶＨＨファージディスプレイライブラリ、並びに本質的に米国特許第６
，２６５，１５０号明細書、国際公開第９８／１５８３３号パンフレット、及び「Ｐｈａ
ｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｔ．Ｋｕｈｌｍａ
ｎ，２００１（これらは参照によって本明細書に援用される）に記載されるとおりの一般
的なファージディスプレイ技術及びＭＡＢＳＴＲＡＣＴ（登録商標）技術を使用して、抗
体断片を選択した。更に、本発明では、国際公開第０２／１０３０１２号パンフレット（
参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの方法及びヘルパーファージを使
用した。

Ａ型インフルエンザ（Ｈ１ Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ｈ１ Ａ／ニュー
カレドニア／２０／１９９９、Ｈ２ Ａ／日本／３０５／１９５７、Ｈ３ Ａ／ブリスベ
ン／１０／２００７、Ｈ７ Ａ／オランダ／２１９／２００３）及び／又はＢ型インフル
エンザ（ビクトリアクレードＢ／ブリスベン／６０／２００８、山形クレードＢ／フロリ
ダ／０４／２００６）のヘマグルチニン（ＨＡ）を標的タンパク質として、特異的結合剤
の選択を実施した。標的タンパク質源は、昆虫細胞が産生した組換えタンパク質（Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）又はインフルエンザに
感染させて固定（３％パラホルムアルデヒド）したＭＤＣＫ細胞の表面上に発現したＨＡ
のいずれかであった。様々な選択条件を用いており、表３に要約する。「ＳＤ」はシング
ルドメイン抗体を指す。特に言及がない場合、選択はｐＨ７．４及び５μｇ／ｍｌ ＨＡ
タンパク質で実施した。ＣＲ８０３３及びＣＲ８０７１は、Ｂ型インフルエンザＨＡの頭
部及び首部に結合するモノクローナル抗体（ＩｇＧ）である（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａ
ｌ．２０１２）。

第１ラウンド選択のため、イムノチューブをＨＡ（５．０μｇ／ｍＬ、ＰＢＳに希釈）
で一晩被覆し、ブロック緩衝液（ＰＢＳ中２％脱脂粉乳（ＥＬＫ））で洗浄した。ファー
ジディスプレイライブラリのアリコート（５〜１０μＬ）を２ｍＬブロッキング緩衝液（
ＰＢＳ中５％非熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％マウス血清、及び２％ＥＬＫ）にブ
ロックし、イムノチューブに加えた。室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした後、チュ
ーブを洗浄した（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５〜１５回及びＰＢＳで３〜５
回）。結合したファージをトリエチルアミン（１００ｍＭ）で１０分間溶出させて、ｐＨ
を７．５に調整した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅを溶出したファージに感
染させて播き、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーをカウントし（１Ｅ＋０４〜
１Ｅ＋０６ＣＦＵ）、プレートから剥がし取って、エンリッチされたファージライブラリ
を調製した（国際公開第０２／１０３０１２号パンフレットに記載されるとおり）。

第２ラウンド選択は、第１ラウンドからレスキューされたファージを使用して実施し、
本質的に同じプロトコルに従ったが、但し、抗原、ｐＨを変更し、及び／又はエピトープ
遮断モノクローナル抗体を加えた。ＨＡの保存された茎部領域を特異的に標的化する強力
な結合剤を選択するため、変異体パニング戦略を適用した。交差反応性のシングルドメイ
ンクローンを選択するため、第１ラウンド選択と比較してより低量の種々のＨＡ抗原も使
用した。プロトコルに低ｐＨ洗浄ステップを導入して、茎部に結合することのできるファ
ージが選択される可能性を高め、ｐＨ５．０で起こるＨＡの立体構造変化（Ｂｒａｎｄｅ
ｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）をブロックした。ここでＨＡ被覆イムノチューブを
５倍希釈のＴｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ（組換えトリプシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と
共に１０分間インキュベートして被覆ＨＡ_０を（ＨＡ_１〜ＨＡ_２に）切断し、続いて洗浄
及びブロックステップを行った。ファージと共にインキュベートした後、先述のとおりチ
ューブを洗浄し、続いてｐＨ５．１のクエン酸リン酸ナトリウム緩衝液で２０分間インキ
ュベートした。３回のＰＢＳ洗浄ステップ後、上記に記載したとおりファージ溶出を継続
した。選択中にＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加すると、ＨＡの頭部又は首部で免
疫優位エピトープが遮断され、また、ＨＡの茎部に結合するシングルドメインファージが
選択される可能性も増加させることができる。ＨＡ被覆イムノチューブのブロック中及び
ファージライブラリとのインキュベーション中に、抗体ＣＲ８０３３及びＣＲ８０７１（
Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）を加えた。

２回又は３回連続の選択ラウンドを実施した後、個々のｓｄＡｂを単離した。各選択の
アウトプットをエンリッチメント因子に関して配列解析し、更なる分析に最良のセレクシ
ョンを選択した。個々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーをピッキングして、粗モノクロ
ーナルｓｄＡｂを含有するペリプラズム抽出物を調製した。端的には、溶出したファージ
を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＦ１１０培養物（２ＹＴ培地、１０μｇ／ｍＬテ
トラサイクリン、４％グルコース）を感染させ、個々のコロニーをピッキングし、９６デ
ィープウェルプレート（１ｍＬ ２ＹＴ−ＡＴＧ培地）で成長させた。ＩＰＴＧ（１ｍＭ
）を添加することによりＶＨＨドメイン発現を誘導した。細菌ペレットを氷上で１５０μ
Ｌ ＴＥＳ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭスクロー
ス、ｐＨ８．０）に３０分間溶解させることによりペリプラズム抽出物を調製した。浸透
圧ショックによってペリプラズム画分を遊離させ、クリアリング及び滅菌ろ過したｓｄＡ
ｂ含有上清を機能スクリーニングに使用した（実施例４を参照）。

Ｎｉ−ＮＴＡ ９６ウェルスピンプレートを製造者の指示に従い使用することにより、
小規模製造のｓｄＡｂ（９６ディープウェルプレートで１ｍＬ）を精製及び濃縮した。

ペリプラズム抽出物生成と並行して、個々のクローンの残りの培養物を使用してグリセ
ロールストックを作成し、ＶＨＨ遺伝子のシーケンシング用にプラスミドＤＮＡを単離し
た。ユニーク配列を更に調べた。

インフルエンザグループ１、グループ２又はＢ型由来のＨＡタンパク質を使用した交差
選択、並びに低ｐＨでのストリンジェントな洗浄ステップにより、広域ＨＡ結合ファージ
を単離することが可能であった。小規模大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生のペリプラズム抽出
物が、機能スクリーニングに好適な再現性のあるタンパク質レベルをもたらした。

実施例４：インフルエンザウイルス中和シングルドメイン抗体の機能スクリーニング
ＳｄＡｂ含有ペリプラズム抽出物を、哺乳類細胞のインフルエンザウイルス感染を防ぐ
それらの能力に関してウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）で分析した。そのため、ＭＤＣＫ
細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−３４）を９６ウェルプレートに播種し（４Ｅ＋０
４細胞／ウェル）、４時間後にインフルエンザウイルス（１００ＴＣＩＤ５０／ウェル）
の混合物と共にインキュベートし、ペリプラズム抽出物（１５μＬ／ウェル又はその希釈
物）を滅菌ろ過した。３７℃及び１０％ＣＯ_２で３日間インキュベートした後、細胞培養
上清中の新しく産生されたウイルスの量をＶ底プレートにおいて１％シチメンチョウ赤血
球（ＴＲＢＣ）の血球凝集によって評価した（中和ｓｄＡｂは上清中のウイルス負荷を低
下させてＴＲＢＣの血球凝集の防止をもたらす）。ペリプラズム抽出物に対するｓｄＡｂ
入力濃度は未知であるため、試料はウイルス中和に関して陽性又は陰性のスコア化のみ行
った。複数のインフルエンザ株を並行して試験して、好ましくは広域中和性のｓｄＡｂを
選択した（表３ａを参照のこと）。

結論として、機能スクリーニングにより、中和Ａ型グループ１、Ａ型グループ２、Ａ型
グループ１及び２、又はＢ型インフルエンザウイルスに分類することのできるｓｄＡｂが
得られた。

実施例５：シングルドメイン抗体の発現及び精製
関連性のあるｓｄＡｂ配列を、Ｅｘｐｉ２９３懸濁細胞における使用に好適な標準的な
真核細胞発現ベクターにクローニングした。産生ランは５〜６日間実施した。発現したｓ
ｄＡｂを細胞培養培地に分泌させる。培地からグルコースを完全に枯渇させる前に、培養
上清を回収し、遠心し、滅菌ろ過した。ニッケルイオンを含有する抗Ｈｉｓ樹脂（ｃＯｍ
ｐｌｅｔｅ ＨＩＳ−Ｔａｇカラム；Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０６７８１５４３００１
）を使用してｓｄＡｂを精製し、高濃度イミダゾール（３００ｍＭ）を使用して溶出させ
た。溶出物を脱塩カラム（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム、ＧＥＨＣ カタログ番
号１７−５０８７）を使用してその最終製剤化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＡｃ、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、５％スクロースｐＨ５．５）と緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３
Ｋスピンフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９００３２４）を使用して
濃縮した。濃度を決定した後、純ｓｄＡｂアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＳＥＣ、
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ及びエンドトキシン測定によって更に特徴付けた。全てのコンストラク
トについて、６００ｍＬのトランスフェクション容積から５ｍｇの精製ｓｄＡｂの最小収
量が得られた。９５％を超える単量体含有量及び正しい分子質量を有するｓｄＡｂバッチ
のみを更なる特徴付けに使用した。

選択された適用には、タグ（例えばＨＩＳタグ）を有しないｓｄＡｂが望ましかった。
非タグ付加ｓｄＡｂを多段階イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によって精製した
。クリアリング及びろ過した上清をｄＨ_２Ｏで２倍希釈して伝導性を低下させ、ｐＨを８
．０に設定し、試料を正電荷Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂（ＧＥＨＣ、カタログ
番号１７−５４７０−０２）にロードした。非荷電ｓｄＡｂはフロースルー中に残り、次
にこれをｐＨ３．５に調整した。ここで正電荷のｓｄＡｂを負電荷ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐ
ｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓカラム（ＧＥＨＣ、カタログ番号１７−５４６８−５５）で捕
捉し、高濃度塩化ナトリウムを使用して溶出させた。ｓｄＡｂのｐＩは大きく異なり得る
が、ｐＨ８でマイナス〜＋１．０の電荷及びｐＨ３〜５の範囲で少なくとも＋１０超の電
荷を有する分子にこの方法を用いた。溶出したｓｄＡｂを上記に記載したとおり更に処理
した。

本明細書に示されるとおり、Ｅｘｐｉ２９３細胞発現並びにＨＩＳタグに基づく、及び
タグ無しコンストラクトについてはイオン交換に基づく精製戦略により、高度な量及び質
の単量体ｓｄＡｂコンストラクトが得られた。

実施例６：シングルドメイン抗体の特徴付け
インフルエンザウイルス中和範囲
実施例４に記載したとおりのウイルス中和アッセイを用いてインフルエンザウイルス株
の大規模パネルで様々な濃度を調べることにより、精製ｓｄＡｂの中和力価を評価した。
力価は表４〜表７に報告する。ｓｄＡｂは、その活性に基づき、Ａ型インフルエンザグル
ープ１（Ｈ１、Ｈ５、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ１１、Ｈ９、Ｈ８、及びＨ１２ウイルスが含まれる
）中和分子、Ａ型インフルエンザグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１４、Ｈ７、及びＨ１０ウ
イルスが含まれる）中和分子、及びＢ型インフルエンザ（山形、ビクトリア、及び先行（
Ｐｒｅｄｅｃｅｓｓｏｒ）／旧型（Ｏｌｄ）ウイルスを含む）中和分子に分けることがで
きる。興味深いことに、ｓｄＡｂの一部は、グループ１及びグループ２の両方のＡ型イン
フルエンザウイルスの中和能を有した（表６）。

ＨＡに対する結合範囲
バイオレイヤー干渉法プラットフォームＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉ
ｏ，Ｐａｌｌ）を使用して、特殊なセンサーの表面上における高速のディップ・アンド・
リード法でタンパク質間相互作用の無標識リアルタイム結合解析を行った。機能化された
センサーの先端で検出された質量のシフトから、組換えＨＡに対するｓｄＡｂの結合を調
べることが可能であった。所定の濃度範囲にわたって実施することにより、全般的な結合
のみならず、ｓｄＡｂのＫ_Ｄも決定することができた。

Ｃ末端ＨＩＳタグを有する精製ｓｄＡｂを抗Ｈｉｓセンサー（ローディング相、抗Ｐｅ
ｎｔａ−Ｈｉｓセンサー、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、カタログ番号１８−００２０）上に捕捉
した。続いてｓｄＡｂをロードしたセンサーを種々のＨＡ亜型（２０μｇ／ｍＬ）と共に
インキュベートして結合を調べた（会合相）。このアッセイの最後のステップは、キネテ
ィック緩衝液中でセンサーをインキュベートしてＨＡ−ｓｄＡｂ複合体の解離速度を決定
することである。試験したｓｄＡｂの結合能を表８に掲載する。多くの場合、ｓｄＡｂは
、それらが中和可能なよりも多くの株のＨＡに結合する。より広い結合スペクトルは、Ｈ
Ａに対するそれらの個々の親和性に関係している（Ｋ_Ｄ値を含む表９も参照のこと）。

無標識バイオレイヤー干渉法を用いて、ｓｄＡｂと種々のインフルエンザ株の組換えＨ
Ａ分子との間の結合効力の尺度としての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）も決定した。Ｋ_Ｄ値は、
定常状態におけるｓｄＡｂ濃度範囲の結合反応（会合相のプラトーで計測した最後の１０
秒の平均結合反応）をフィッティングして飽和の５０％の濃度を求めることにより決定し
た（これはＫ_Ｄ値（Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ＊［ｓｄＡｂ］／（Ｋ_Ｄ＋［ｓｄＡｂ］））を反映する
）。段階希釈物はデュプリケートで計測しており、幾何平均Ｋ_Ｄ値を表９に報告する。

シングルドメイン抗体と他のＨＡ結合剤との競合
ＨＡ上の既知のエピトープを用いたｓｄＡｂ自体の間での競合及び十分に特徴付けられ
ているモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を含めた他のＨＡ結合タンパク質との競合に関して
ｓｄＡｂをスクリーニングする結合競合試験を設計した。競合が観察された場合、両方の
分子がＨＡの表面にある同様の又は少なくとも重複するエピトープに結合すると考えられ
る。

ここではＡｌｐｈａＬＩＳＡ競合アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を確立し、こ
れは、ビオチン化ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０μＬ、５０μＬ中０．
５ｎＭ最終濃度）へのＩｇＧ又はＨｉｓタグ付加ｓｄＡｂ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、
１０μＬ、５０μＬ中０．３ｎＭ最終濃度）の結合に依存するものであった。室温で２つ
のビーズ、ＨＡを認識するストレプトアビジンドナービーズ（１０μｇ／ｍＬの１０μＬ
）及びＩｇＧ又は使用したｓｄＡｂのいずれかを認識する抗Ｆｃ又は抗Ｈｉｓアクセプタ
ービーズ（１０μｇ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートした後、ＨＡと結合剤との間の
相互作用を検出した。更に１時間インキュベートした後に励起されたドナービーズ（６８
０ｎｍ）及びアクセプタービーズがごく近接した場合、アクセプタービーズのルミネセン
スシグナルとしてエネルギー移動（一重項酸素）を計測することができる。この均一系ア
ッセイフォーマットのシグナル強度は、両結合パートナー間の結合強度（親和性／アビデ
ィティ）に正比例する。その親和性及び濃度（通常は１００ｎＭ〜０．５ｐＭの範囲で試
験される）に依存して、競合相手がＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを妨害するとシグモイド
阻害曲線を得ることができ、これをＳＰＳＳで標準４パラメータロジスティック非線形回
帰モデルを用いてフィッティングする。ｐＩＣ５０計算値の平均を表１０及び表１１に示
す。

表１０及び表１１は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐＩＣ５０値の平均を示す（最大半量阻害
濃度の負の対数、値が高いほど、指数関数的により大きい効力を示す）。「Ｈ１＿Ｃａｌ
＿ＨＡ」はＨ１Ｎ１ Ａ／カリフォルニア／０７／２００９を指し、「Ｈ１＿ＮＣａ＿Ｈ
Ａ」はＨ１Ｎ１ Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９のＨＡを指し、「Ｈ５＿Ｖｉｅ
＿ＨＡ」はＨ５Ｎ１ Ａ／ベトナム／１２０３／２００４のＨＡを指し、「Ｈ３＿Ｂｒｉ
＿ＨＡ」はＨ３Ｎ２ Ａ／ブリスベン／１０／２００７のＨＡを指し、「Ｈ３＿Ｗｉｓ＿
ＨＡ」はＡ／ウィスコンシン／６７／２００５のＨＡを指し、「Ｈ７＿Ｎｅｔ＿ＨＡ」は
Ｈ７Ｎ７ Ａ／オランダ／２１９／２００３のＨＡを指し；Ｂ＿Ｂｒｉ＿ＨＡ」はＢ／ブ
リスベン／６０／２００８のＨＡを指し；「Ｂ＿Ｆｌｏ＿ＨＡ」はＢ／フロリダ／０４／
２００６のＨＡを指し、「ＣＲ８０３３」、「ＣＲ８０７１」及び「ＣＲ９１１４」は、
Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１２によって特徴付けられるＨＡ結合ＩｇＧである。
「２Ｄ１」は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって特徴付けられるＨＡの受容体結
合部位に結合するＩｇＧを指す。「ＣＲ８０２０」は、Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２
０１１）によって特徴付けられるＨＡの茎部に結合するＩｇＧである。「３９．２９」は
、国際公開第２０１４０７８２６８号パンフレットに特徴付けられるＨＡの茎部に結合す
るＩｇＧである。「タグ無し」型と指示されているものを除き、全てのＳＤｘｘｘｘが、
検出に用いられるＨｉｓタグを有する。空白セルは「未試験」を意味する。

受容体結合の遮断 − 血球凝集抑制
一般的な種類のＨＡアッセイである血球凝集抑制アッセイを用いることにより、ｓｄＡ
ｂがＨＡ頭部領域の上部近傍に結合して標的細胞、ここでは赤血球上のシアル酸受容体と
の相互作用を物理的に遮断する能力を試験した。十分な濃度のｓｄＡｂがシアル酸との相
互作用を遮断する場合、「凝集反応」（赤血球が一体に集塊化する）が抑制される。ｓｄ
Ａｂの段階希釈物をＰＢＳ（２５μＬ／ウェル）に調製し、２５μＬの８ＨＡＵ／５０μ
Ｌウイルス希釈物を添加して混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、５０μＬ
の１％シチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）を添加して混合した。室温で３０〜６０分間イ
ンキュベートした後、凝集パターンを目視で（涙滴形の形成）スコア化する。４レプリケ
ートの試料及び陽性対照抗体に加えて、入力ウイルスの逆滴定を取る。血球凝集抑制価、
ＴＲＢＣ上のシアル酸受容体とのウイルスの相互作用が全て遮断されるときの最小濃度を
、スピアマン−カーバーの式を用いて計算した。結果は表１２に示す。全てのＡ型インフ
ルエンザ結合ｓｄＡｂが陰性であった（即ちＨＩ価＞５０μｇ／ｍＬを有する）。

その結合及び中和プロファイルと併せて、ＳＤ１０８４は強力なＨＡ頭部結合剤である
ことが示されたと共に、シアル酸受容体との結合を防ぐ。

茎部結合ｓｄＡｂによるＨＡの立体構造変化の抑制
茎部結合ｓｄＡｂが、それらの競合抗体と同様に、ＨＡの立体構造変化を防止し、それ
によりウイルス融合及び続く感染を阻止することを立証するため、低ｐＨ処理後のＨＡ頭
部（ＨＡ１）の存在及びＨＡ１とＨＡ２との間を結び付けているジスルフィド架橋の還元
を計測するアッセイが開発されている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３
）。

立体構造変化アッセイは、無標識検出に基づき、バイオレイヤー干渉法プラットフォー
ムＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ，Ｐａｌｌ）を用いて実施される。初
めにＣ末端ビオチン化組換えＨＡのバッチを切断する（２５０μｇのＨＡを１０μＬ ０
．０５％トリプシン−ＥＤＴＡと共に３７℃で２０分間インキュベートし、次に３０μＬ
ＤＴＩを添加してトリプシン活性を停止させる）。次にＯｃｔｅｔのストレプトアビジ
ンセンサー（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、カタログ番号１８−５０２０）上にＨＡ（２μｇ／ｍ
Ｌ）を捕捉し、続いて結合パートナー（最大５０ｎＭのｓｄＡｂ、陽性及び陰性対照抗体
）と共にインキュベートする。このインキュベーションステップ後、センサーをｐＨ範囲
（０．２ｐＨ刻みでｐＨ６．５〜５．０）に曝す。結合パートナーがＨＡを安定化させず
抑止しない場合、ＨＡは立体構造変化を起こす。ＨＡ１頭部ドメインが離れる一方で、融
合機構を包含するＨＡ２ドメインが融合ペプチドをリフォールディングして外側に突出さ
せる。ここでＨＡ１はジスルフィド架橋を介してＨＡ２に結び付いているに過ぎず、この
架橋は最終アッセイステップでＤＴＴへの曝露（ＰＢＳ中５０ｍＭ ＤＴＴ）によって還
元され得る。次にＨＡ１がビオチン化ＨＡ２ドメインから解離すると、検出器上で大幅な
質量低下が検出されることになる。結果は表１３に要約する。

これらの結果は、ＨＡ茎部結合ｓｄＡｂがそれらの中和プロファイルに従いＨＡの立体
構造変化を防ぐ能力を有することを示している。この能力には、後期エンドソームにおけ
る条件と同様の低ｐＨでｓｄＡｂが結合したまま留まることが必要である。立体構造変化
の阻止レベルは、それぞれのインフルエンザ株に対するそれらの中和力価と正の相関を有
する。

シングルドメイン抗体配列
選択され且つ特徴付けられた本発明に係るｓｄＡｂの配列を表１４に掲載する。ＣＤＲ
領域の配列を表１４ａに掲載する。

結論として、精製単量体ｓｄＡｂコンストラクトで実施したウイルス中和アッセイによ
り、４つの異なるクラスのｓｄＡｂが確認された：Ａ型インフルエンザグループ１、Ａ型
インフルエンザグループ２、Ａ型インフルエンザグループ１及びグループ２、又はＢ型イ
ンフルエンザ中和ｓｄＡｂ。それにも関わらず、結合試験は、多くのＡ型グループ１又は
Ａ型グループ２中和ｓｄＡｂが、それらが中和できないグループに属するＨＡにも結合し
得ることを示している。これにより、極めて多数のＡ型グループ１及びＡ型グループ２結
合ｓｄＡｂがもたらされる。Ａ型及びＢ型インフルエンザを中和し、又は少なくとも結合
することのできるｓｄＡｂは見出されなかった。更なる特徴付けのため、広域の結合及び
中和能を有するｓｄＡｂを選択した（ＳＤ１０３８、ＳＤ１０３６、ＳＤ１０８３、及び
ＳＤ１０８４を含む）。ＨＡに対する親和性を決定すると、選択のｓｄＡｂの結合強度と
中和力価との間に正の相関が示される。既知のＨＡ結合分子を用いた競合アッセイによる
エピトープマッピングから、ＳＤ１０８４を除く全てが、ＨＡの保存された茎部に結合す
ることが明らかになった。競合が起こった濃度は中和力価と正の相関を有し、即ち、結合
及び競合が強力であるほど中和力価が低くなることを意味する。他方でＳＤ１０８４は、
血球凝集抑制アッセイで実証されたとおり、ＨＡ頭部のシアル酸結合部位の近傍又はその
部位に結合し、受容体結合を遮断することによってインフルエンザウイルスの細胞侵入を
防ぐことができる。選択された他の全てのｓｄＡｂは、立体構造変化アッセイで実証され
るとおり、ＨＡの茎部のＨＡ１及びＨＡ２に結合し、融合過程でのＨＡの立体構造変化を
防ぐことができる。

実施例７：ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体の生成及び特徴付け
ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体の生成
ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体を作成するため、それらのｓｄＡｂコード配列を共にク
ローニングするか、或いは完全長遺伝子を直接合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、真核細胞
発現ベクターにライゲートした。ｓｄＡｂ二量体コンストラクトでは、第１のｓｄＡｂ（
前）のＣ末端を第２のｓｄＡｂ（後ろ）のＮ末端に連結した。異なる長さ（１０、１５、
３５、及び５７アミノ酸）のリンカー配列はアミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）か
らなる。共にクローニングすると、第１のｓｄＡｂに直接続く制限部位（ＮｏｔＩ）が３
つの更なるアラニン（Ａ）残基をもたらす。リンカー配列を表１５に示し、ｓｄＡｂ二量
体の完全なアミノ酸配列を表１６（Ａ型インフルエンザ標的化コンストラクト）及び表１
７（Ｂ型インフルエンザ標的化コンストラクト）に示す。ｓｄＡｂの位置（前又は後ろ）
は、コンストラクトにおいて、最適な組み合わせが実現するように変えた。発現及び精製
は実施例５に記載されるとおり実施した。

ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体によるインフルエンザ中和
精製ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体を実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウ
イルス中和アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が
示された。結果は、Ａ型インフルエンザ中和二量体について表１８に示し、Ｂ型インフル
エンザ中和二量体について表１９に示す。

ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体のＨＡ結合
精製ｓｄＡｂホモ及びヘテロ二量体を実施例６に記載されるとおりの結合アッセイで試
験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに結合強度（アビディティ）の向上が示された。
結果は、Ａ型インフルエンザ中和二量体について表２０に示す。

実施例８：マルチドメイン抗体コンストラクトの生成及び特徴付け
ｓｄＡｂ多量体の生成
ｓｄＡｂ多量体（三量体、四量体及び五量体）を作成するため、ｓｄＡｂコード配列を
共にクローニングするか、或いは完全長遺伝子を直接合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、真
核細胞発現ベクターにライゲートした。異なる長さ（１０又は３５アミノ酸）のリンカー
配列はアミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる。共にクローニングすると、第
１のｓｄＡｂに直接続く制限部位（ＮｏｔＩ）が３つの更なるアラニン（Ａ）アミノ酸を
もたらし、第２のｓｄＡｂに直接続く２つの連続する制限部位（ＰａｃＩ及びＸｈｏＩ）
が５つの更なるアミノ酸（ＬＩＮＬＥ）をもたらす。リンカー配列を表１５に示し、ｓｄ
Ａｂ三量体の完全なアミノ酸配列を表２３に示し、ｓｄＡｂ四量体及び五量体の完全なア
ミノ酸配列を表２４に示す。コンストラクト内におけるｓｄＡｂの位置は、最適な組み合
わせが実現するように変えた。発現及び精製は実施例５に記載されるとおり実施した。

マルチドメイン抗体によるインフルエンザ中和
精製マルチドメイン抗体を実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和
アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。
結果は、インフルエンザ中和三量体について表２５に示し、四量体及び五量体について表
２６に示す。

ＨＡに対するマルチドメイン抗体結合
無標識バイオレイヤー干渉法を用いることにより、ｐＨ７．４におけるマルチドメイン
抗体と種々のインフルエンザ株の組換えＨＡ分子との間の結合効力の尺度としての平衡解
離定数（Ｋ_Ｄ値）を決定した。Ｋ_Ｄ値は、定常状態におけるＭＤ濃度範囲の結合反応（会
合相のプラトーで計測した最後の１０秒の平均結合反応）をフィッティングして飽和の５
０％の濃度を求めることにより決定した（これはＫ_Ｄ値（Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ＊［ｓｄＡｂ］／
（Ｋ_Ｄ＋［ｓｄＡｂ］））を反映する）。段階希釈物はデュプリケートで計測しており、
幾何平均Ｋ_Ｄ値を表２７に報告する。

茎部結合ｓｄＡｂによるＨＡの立体構造変化の阻害
ＨＡ茎部結合ｓｄＡｂ構成単位を含有するマルチドメイン抗体が、それらの競合抗体と
同様に、ＨＡの立体構造変化を防ぎ、それによりウイルス融合、続いて感染を阻止するこ
とを立証するため、実施例６に記載されるとおりアッセイを実施した。結果は表２９に要
約する。

３つ以上のｓｄＡｂを共に連結すると、個々の構成単位と比較して効力及び中和範囲が
大幅に向上し得る。従って、ｓｄＡｂのいずれか個々によっては中和できなかったであろ
うインフルエンザ株を、同じｓｄＡｂの多量体コンストラクトによって確実に中和するこ
とができる。Ａ型インフルエンザグループ１、Ａ型インフルエンザグループ２、又はＢ型
インフルエンザを中和するｓｄＡｂの組み合わせは、事実上試験した全ての株の中和能を
有するマルチドメインをもたらした。中和範囲の増加は、使用されるｓｄＡｂの基礎的な
結合範囲に関係する。コンストラクトの二価の性質に関係する可能性のある他の中和機構
に加えて、ＨＡに対するアビディティの増加が、この記載される向上に関与するものと考
えられる。試験した二量体及びマルチドメインについて、ウイルス中和機構としてのウイ
ルス融合の遮断が確認された。

実施例９：Ｆｃ融合コンストラクトの生成及び特徴付け
Ｆｃ融合コンストラクトの生成
ｓｄＡｂ及びｓｄＡｂ多量体は、抗体のＦｃ領域に融合させることができる。Ｆｃ領域
は、ヒンジ領域と、続くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する抗体、例えばヒトＩｇＧ１
分子の一部として定義される。種々のＦｃ融合コンストラクトが生成され、ＨＡ結合、イ
ンビトロ中和及びインビボ有効性に関してｓｄＡｂ多量体及びモノクローナル抗体と比較
されている。

Ｆｃ断片のＣ末端及び／又はＮ末端に表１５に示すとおりの更なるリンカーを伴い又は
伴わず、ｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ多量体を融合した。Ｆｃ融合コンストラクトを哺乳類細胞
で発現させて、二量体Ｆｃ分子として培地中に分泌させた。これらのＦｃ融合コンストラ
クトの完全なアミノ酸配列を表３０に示す。コンストラクト内でのｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ
多量体の位置は、最適な組み合わせが実現するように変えた。ホモ二量体並びにヘテロ二
量体Ｆｃ融合分子を生成した。ヘテロ二量体Ｆｃ融合物は、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ
．（２０１３）によって記載されるとおり、ＣＨ３ドメインに単一点突然変異を導入する
ことにより生成した。これらの突然変異はＫ４０９Ｒ及びＦ４０５Ｌであり、これらの突
然変異を含有するＦｃ鎖は、それぞれ、ＦｃＧａ及びＦｃＧｂと称される。

Ｆｃ融合コンストラクトを懸濁Ｅｘｐｉ２９３細胞で発現させた。Ｋ４０９Ｒ又はＦ４
０５Ｌ突然変異を有するヘテロ二量体Ｆｃコンストラクトの配列を含有するＤＮＡコンス
トラクトを、２つの連続オープンリーディングフレームを含有する単一のベクターとして
トランスフェクトした。一過性トランスフェクション及び発現を供給業者の指示に従い実
施し、これはヒトＩｇＧコンストラクトの作製に関する既報告の条件と同様であった（Ｄ
ｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。可能性のある凝集物及び不純物を調製用ゲル
ろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム、ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって除去した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、予想される
分子量に対応する画分をプールして、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ遠心フィルタを
使用して濃縮した。全ての製造ランにおいて、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって安
定に連結した二量体Ｆｃ融合分子が得られた。ＦｃＧａ及びＦｃＧｂの両方を同じ細胞に
トランスフェクトした場合、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載さ
れるとおり、精製Ｆｃ融合タンパク質をインビトロでの制御された還元条件に供してＦｃ
融合物を半分の分子に分け、再アセンブル及び再酸化させて純粋なヘテロ二量体Ｆｃ融合
分子を形成した。

Ｆｃ含有マルチドメイン抗体によるインフルエンザ中和
精製Ｆｃ含有シングル及びマルチドメイン抗体コンストラクトを実施例６に記載される
とおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、ｓｄＡｂ構成単位と比較したと
きに効力及び範囲の向上が示された。結果は、インフルエンザ中和Ｆｃ融合コンストラク
トについて表３１〜表３７に示す。

機能性Ｆｃ受容体結合（抗体依存性細胞傷害）
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）レポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
て、細胞が発現するヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に対する機能的結合を計測した
。標的Ａ５４９細胞をＢ／ブリスベン／６０／２００８又はＢ／フロリダ／０４／２００
６に感染させるか、又はＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍ
ｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨ３Ｎ２ Ａ／ウィスコンシン／
６７／２００５ ＨＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、Ｈ
Ａを発現する標的細胞を白色９６ウェルプレートに播種し、Ｆｃ融合コンストラクトの段
階希釈物又はＩｇＧ対照抗体と共に３０分間インキュベートした。更なる陰性対照として
、Ｆｃ断片にＬＡＬＡ点突然変異を担持するコンストラクトを使用した。ＬＡＬＡ点突然
変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．２００７により記載される
とおり）は、ヒトＦｃγ受容体に対する結合の大幅な低下及びＡＤＣＣの誘導を示す。最
後に、標的細胞にジャーカットエフェクターＴ細胞（ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８及びＮ
ＦＡＴ−ＲＥルシフェラーゼを安定に発現する）を加えて６時間インキュベートした。ウ
ェルにＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ル
ミネセンスプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でルミネセンス（ＲＬＵ単位
）を計測した。ＳＰＳＳで標準４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用して
ＲＬＵデータをフィッティングした。

全てのＳＤ／ＭＤ Ｆｃ融合コンストラクト（ＬＡＬＡ型を除く）がロバストなＡＤＣ
Ｃ誘導を示すことから、細胞の表面にあるインフルエンザＨＡ上の茎部エピトープとの結
合によってＦｃγＲＩＩＩａ受容体発現細胞との生産的な相互作用が可能となることが示
唆される。結果は表３８に要約する。

ｓｄＡｂ又はｓｄＡｂ多量体をヒトＩｇＧ１のＦｃ断片と融合すると、使用される個々
のｓｄＡｂ又はマルチドメイン構成単位の効力及び中和範囲を維持するＨＡ結合分子がも
たらされる。ｓｄＡｂ構成単位は、Ｆｃ断片のＮ末端にもＣ末端にも融合させることがで
きる。発現時、２つのＦｃ鎖が二価抗体様分子を形成する。従って、ｓｄＡｂ又はマルチ
ドメイン部分が異なる２つの別々のＦｃ鎖コンストラクトを同じ細胞で発現させること、
及び二重特異性抗体様分子を作成することも可能である。ｓｄＡｂ及び／又はマルチドメ
インがＦｃ断片のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたホモ二量体及びヘテロ二量体Ｆｃ
融合コンストラクトの作成は成功しており、Ａ型及びＢ型インフルエンザにわたるそれら
の中和範囲が実証されている。ｓｄＡｂ又はマルチドメイン部分による中和を指図するこ
とに加え、融合コンストラクトのＦｃ部分は、感染細胞又はトランスフェクト細胞の表面
のＨＡに結合したとき、エフェクター細胞の表面にあるＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）
受容体との生産的な相互作用を促進することができる。これは、インビボでは、ＮＫ細胞
の活性化と、続くＡＤＣＣの誘導につながり得る。エフェクター機能の誘導の次に、Ｆｃ
部分はまた新生児Ｆｃ受容体とも相互作用して、長い生体内半減期をもたらすことができ
る。

実施例１０：シングルドメイン及びマルチドメイン抗体のインビボ有効性
Ａ型インフルエンザグループ１シングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型インフルエンザグループ１シングルドメイン抗体ＳＤ１０１６、ＳＤ１０３
８及びＳＤ１０４５を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験
に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）にＳＤ１０１６
、ＳＤ１０３８又はＳＤ１０４５を０．５ｍｇ／ｋｇの単一用量で鼻腔内投与した。緩衝
溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウ
スを２５×ＬＤ_５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ
１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。
ＳＤ１０３８及びＳＤ１０１６の両方の投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に
有意な改善をもたらした一方、ＳＤ１０４５の投与は生存期間の改善をもたらすのみであ
った（図２を参照のこと）。

Ａ型インフルエンザグループ２シングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ａ型インフルエンザグループ２シングルドメイン抗体ＳＤ１０３６、ＳＤ１０４
６及びＳＤ１０４８を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験
に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇ
の用量のＳＤ１０４６又はＳＤ１０４８又は２つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／
ｋｇ）のＳＤ１０３６を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス
群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ
／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間に
わたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３６、ＳＤ１０４６又はＳＤ
１０４８の鼻腔内投与がＡ／香港／１／１９６８−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対す
る完全防御を提供することを示している（図３を参照のこと）。

Ｂ型インフルエンザシングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ｂ型インフルエンザシングルドメイン抗体ＳＤ１０８３及びＳＤ１０８４を、Ｂ
ａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば
、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの単一用量のＳＤ１０８４
又は２つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）のＳＤ１０８３を鼻腔内投与した
。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日
、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から
攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ｓｄ
Ａｂ ＳＤ１０８４がＢ／フロリダ／４／２００６による致死的攻撃誘発に対する１００
％の防御を提供する一方、ＳＤ１０８３は最も高い５ｍｇ／ｋｇの用量で部分的防御を提
供するのみであることを示している。それより低い用量のＳＤ１０８３は生存期間の改善
をもたらすのみであった（図４）。

Ｈ１Ｎ１モデルにおけるＡ型インフルエンザシングル及びマルチドメイン抗体のインビボ
有効性
例示的Ａ型インフルエンザｓｄＡｂ ＳＤ１０３８及び例示的Ａ型インフルエンザマル
チドメイン抗体ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビ
ボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス
（ｎ＝８）に１ｍｇ／ｋｇの用量のＭＤ１２１１又はＭＤ１２１２又は単独（０．５ｍｇ
／ｋｇ）若しくはＳＤ１０３６との１：１混合物（総用量＝１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの
ＳＤ１０３８を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体
対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエル
トリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間に
わたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３８、ＭＤ１２１１、ＭＤ１
２１２又はＳＤ１０３８とＳＤ１０３６との１：１混合物の鼻腔内投与がＡ／プエルトリ
コ／８／１９３４−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示
している。体重曲線は、ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２の有効性がｓｄＡｂ（混合物）よ
り優れていることを示している（図５）。

Ｈ３Ｎ２モデルにおけるＡ型インフルエンザシングル及びマルチドメイン抗体のインビボ
有効性
例示的Ａ型インフルエンザｓｄＡｂ ＳＤ１０３６及び例示的Ａ型インフルエンザマル
チドメイン抗体ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビ
ボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス
（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＤ１２１１又はＭＤ１２１２又は単独（２．５ｍｇ
／ｋｇ）若しくはＳＤ１０３８との１：１混合物（総用量＝５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの
ＳＤ１０３６を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体
対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／
１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって
生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３６、ＭＤ１２１１、ＭＤ１２１２又
はＳＤ１０３６とＳＤ１０３８との１：１混合物の鼻腔内投与がＡ／香港／１／１９６８
−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している。体重曲
線は、ＭＤ１２１１及びＭＤ１２１２の有効性がｓｄＡｂ（混合物）より優れていること
を示している（図６）。

Ｈ３Ｎ２モデルにおけるＳＤ１０３８単量体及び二量体のインビボ有効性の比較
例示的Ａ型インフルエンザシングルドメイン抗体ＳＤ１０３８及び例示的Ａ型インフル
エンザマルチドメイン抗体ＭＤ１２１２を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボイン
フルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝
８）に４つの用量（５ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ又は０．２ｍｇ
／ｋｇ）のＳＤ１０３８又はＭＤ１２１２を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受け
た別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０の
インフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した
。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＳＤ１０３８がＡ
／香港／１／１９６８−ＭＡウイルスの致死的攻撃誘発に対して部分的防御を提供するの
みであること、及び防御レベルが用量依存的であることを示している。対照的に、二量体
ＳＤ１０３８（ＭＤ１２１２）は４つ全ての用量群で１００％の防御を提供する（図７）
。

Ｂ型インフルエンザマルチドメイン抗体のインビボ有効性
例示的Ｂ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１２２１、ＭＤ１２２２及びＭＤ１
２２４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。
簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に５ｍｇ／ｋｇの単一用量の
ＭＤ１２２１又はＭＤ１２２４又は２つの用量（０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ）の
ＭＤ１２２２を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体
対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリ
ダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重を
モニタした。この試験は、３つ全てのマルチドメイン抗体がＢ／フロリダ／４／２００６
による致死的攻撃誘発に対する１００％の防御を提供することを示している（図８）。

静脈内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体のイン
ビボ有効性
例示的Ａ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１３０１及びＭＤ２６０１
を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に
言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３ｍｇ／ｋｇの単一用量のＭＤ１
３０１又はＭＤ２６０１を静脈内投与した。ＣＲ９１１４を陽性対照としてとった。緩衝
溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウ
スを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ
１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。
この試験は、Ｆｃ含有マルチドメイン抗体ＭＤ２６０１が静脈内投与後に完全防御を提供
する一方、Ｆｃ不含ＭＤ１３０１が生存に効果を及ぼさないことを示している。対照抗体
ＣＲ９１１４はＡ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）による致死的攻撃誘
発に対して部分的防御を提供するのみである（図９）。

鼻腔内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体のイン
ビボ有効性
例示的Ａ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ１３０１及びＭＤ２６０１
及び基準抗体ＣＲ９１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和
試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用
量（０．２、０．０５又は０．０１ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ１３０１、ＭＤ２６０１又は基準
抗体ＣＲ９１１４を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を
媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プ
エルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日
間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、最小有効用量（１００％防御を提
供する最も低い用量として定義される）がＦｃ含有抗体ＭＤ２６０１及びＣＲ９１１４に
ついて０．０５ｍｇ／ｋｇであり、Ｆｃ不含ＭＤ１３０１について０．２ｍｇ／ｋｇであ
ることを示している。０．０５ｍｇ／ｋｇ ＣＲ９１１４を投与されたマウスは、同じ用
量のＭＤ２６０１を投与されたマウスよりも大きい体重減少を示した（図１０）。

Ｈ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２６１７のインビ
ボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２６１７を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボイ
ンフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ
＝８）にＭＤ２６１７を鼻腔内に０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍ
ｇ／ｋｇで、或いは静脈内に３、１又は０．３ｍｇ／ｋｇで投与した。緩衝溶液のみの投
与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×Ｌ
Ｄ５０のＡ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した
。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。ＭＤ２６１７の用量０．２ｍｇ
／ｋｇの鼻腔内投与又は３ｍｇ／ｋｇの静脈内投与は、媒体対照群と比較して生存率の統
計学的に有意な改善をもたらした（図１１）。

Ｈ３Ｎ２及びＢ型フロリダに対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ
２６１７のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２６１７を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボイ
ンフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ
＝８）にＭＤ２６１７を鼻腔内に０．５ｍｇ／ｋｇで、或いは静脈内に２ｍｇ／ｋｇで投
与した。２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与したＣＲ９１１４を陽性対照としてとった。緩衝溶液
のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを
２５×ＬＤ５０のＡ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）又はＢ／フロリダ／４／２
００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした
。ＭＤ２６１７の鼻腔内投与並びに静脈内投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的
に有意な改善をもたらした。

鼻腔内投与後のＢ型フロリダに対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体Ｍ
Ｄ２４０７及びＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を
、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言
えば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、
０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６又はＣＲ９１１
４を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群とし
て供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２
００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした
。０．０２、０．１及び０．５ｍｇ／ｋｇ ＭＤ２４０７及びＭＤ３６０６の投与は媒体
対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、ＣＲ９１１４の投与
は０．１及び０．５ｍｇ／ｋｇで生存率の改善をもたらすのみであった（図１３）。

静脈内投与後のＢ型フロリダに対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体Ｍ
Ｄ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は５
ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を
受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５
０のインフルエンザ株Ｂ／フロリダ／４／２００６で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２
１日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、ＭＤ３６０６が１ｍｇ／ｋｇ
もの低い用量に至るまでＢ／フロリダ／４／２００６に対する完全防御を提供することを
示している。対照的に基準抗体ＣＲ９１１４は、最も高い５ｍｇ／ｋｇの用量で部分的防
御を提供するのみである（図１４）。

鼻腔内投与後のＨ３Ｎ２に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２
４０７及びＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言え
ば、６〜８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０
．１ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４
を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として
供した。投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８
−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重
をモニタした。この試験は、ＭＤ２４０７及びＣＲ９１１４が、それぞれ０．１及び０．
５ｍｇ／ｋｇの低い用量に至るまでＡ／香港／１／１９６８−ＭＡに対する完全防御を提
供することを示している。ＭＤ３６０６は、最も低い０．０２ｍｇ／ｋｇの用量であって
も完全防御を提供する（図１５）。

静脈内投与後のＨ３Ｎ２に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ３
６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ又
は５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投
与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×Ｌ
Ｄ５０のインフルエンザ株Ａ／香港／１／１９６８−ＭＡ（Ｈ３Ｎ２）で鼻腔内から攻撃
誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。用量１．７ｍｇ／ｋｇ
もの低さに至るまでのＭＤ３６０６及びＣＲ９１１４の投与が、媒体対照群と比較して生
存率の統計学的に有意な改善をもたらした。５又は１．７ｍｇ／ｋｇ ＭＤ３６０６で治
療したマウスは、同じ用量のＣＲ９１１４で治療したマウスよりも小幅な体重減少を示し
た（図１６）。

鼻腔内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ２
４０７及びＭＤ３６０６のインビボ有効性
例示的マルチ抗体ＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ
／Ｃマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜
８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ
／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ２４０７、ＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を鼻腔内
投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。
投与翌日、マウスを２５×ＬＤ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４
−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重
をモニタした。０．２５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ ＭＤ２４０７又はＣＲ９１１４の投与
は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、ＭＤ３６０
６については、この改善は最も低い０．０１ｍｇ／ｋｇの用量に至るまで有意であった（
図１７）。

静脈内投与後のＨ１Ｎ１に対するＡ型及びＢ型インフルエンザマルチドメイン抗体ＭＤ３
６０６のインビボ有効性
例示的マルチドメイン抗体ＭＤ３６０６及び基準抗体ＣＲ９１１４を、Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、６〜８週齢
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝８）に３つの用量（０．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ又
は５ｍｇ／ｋｇ）のＭＤ３６０６又はＣＲ９１１４を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投
与を受けた別の８匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを２５×Ｌ
Ｄ５０のインフルエンザ株Ａ／プエルトリコ／８／１９３４−ＭＡ（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内
から攻撃誘発した。感染後２１日間にわたって生存及び体重をモニタした。１．７及び５
ｍｇ／ｋｇ ＭＤ３６０６及び５ｍｇ／ｋｇ ＣＲ９１１４の投与は、媒体対照群と比較
して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした（図１８）。

実施例１１：ｓｄＡｂヒト化
ｓｄＡｂ ＳＤ１０３６、ＳＤ１０３８、ＳＤ１０４６、ＳＤ１０８３、ＳＤ１０８４
及びＳＤ１０８７のタンパク質配列をＩＭＧＴヒトＶ遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に対してＢＬＡＳＴにかけた。続いて各ｓｄＡｂを最も相
同なヒトＶ遺伝子配列とアラインメントした。各ｓｄＡｂのＦＲ４配列をヒトＪコンセン
サス配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳとアラインメントした。アラインメントしたヒトＶ及び
Ｊ配列と比べたｓｄＡｂフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸の違いを表３９に
示す。

続いて、異なる組み合わせの非ヒトＦＲ残基をそれらのヒト均等物に置き換えた、複数
の一連のｓｄＡｂ変異体を作製した。全ての変異体で、ＦＲ２の残基３７、４４、４５及
び４７並びにＦＲ４の１０３は維持した。可能性のあるＭｅｔ酸化部位を取り除くため、
２つのＭｅｔ残基（一方はＳＤ１０８７のＣＤＲ２に位置し、他方はＳＤ１０３８のＣＤ
Ｒ３に位置する）も突然変異させた。ｓｄＡｂ ＳＤ１０３６、ＳＤ１０３８、ＳＤ１０
４６、ＳＤ１０８３、ＳＤ１０８４及びＳＤ１０８７の全ての変異体のアミノ酸配列を表
４０に掲載する。ヒト化ｓｄＡｂ変異体は、温度安定性、（ＨＥＫ２９３細胞における）
発現レベル及びインビトロ中和活性について分析した。温度安定性は、選択したｓｄＡｂ
に関して、ＤＳＣを用いてそれらの融解温度を計測することにより評価した。インビトロ
中和活性は、ＭＤＣＫ細胞及び約１００ ＴＣＩＤ_５０のインフルエンザウイルスを使用
した標準３日間ＶＮＡで決定した。ＩＣ_５０値、融解温度及び発現レベルを表４１〜表４
３に掲載する。アラインメントしたヒトＶ及びＪ配列と比べたｓｄＡｂフレームワーク領
域（ＦＲ）における異なるアミノ酸の数並びに％ＦＲ同一性計算値も掲載する。

ＳＤ１０３６のヒト化：
ＳＤ１０３６については、１１個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの
幾つかは、親ｓｄＡｂと等しい、又は場合によってはむしろ良好な中和活性を示した。発
現レベルに大きい差は観察されなかった一方、ＳＤ１０３６変異体の大多数について、融
解開始温度が増加した。変異体ＳＤ３０９７は、試験した全てのグループ２インフルエン
ザ株のなかでヒト生殖細胞系列に対するＦＲ突然変異数が最も少なく、Ｔ_ｍ開始値が高く
、加えて強力な中和を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。

ＳＤ１０３８のヒト化：
ＳＤ１０３８については、２１個のヒト化変異体を作製した。ＳＤ３０３１〜３３を除
く全ての変異体が、親ｓｄＡｂとしての４つのグループ１株と同程度の中和活性を示した
。ＳＤ１０３８変異体のほとんどについて、Ｈ３株Ａ／ブリスベン／１０／０７及びＡ／
香港／１／６８に対するＩＣ_５０値がやや高かった。変異体ＳＤ３１１９は、試験した全
てのインフルエンザ株のなかでヒト生殖細胞系列に対するＦＲ突然変異数が最も少なく、
Ｔ_ｍ開始値が高く、且つ強力な中和を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択
した。この変異体では、ＣＤＲ３のＭｅｔがＩｌｅに置き換えられている。

ＳＤ１０４６のヒト化：
ＳＤ１０４６については、１１個のヒト化変異体を作製した。第１の一連の変異体は、
親ｓｄＡｂと比較して中和活性の強い低下を示した。第２の一連の変異体を作製し、これ
らはＶＮＡにおいてＳＤ１０４６と極めて類似した活性を示した。これらの変異体のうち
、ＳＤ３０９９は、ヒト生殖細胞系列に対するＦＲ突然変異数が最も少なく、且つ高い温
度安定性を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。

ＳＤ１０８３のヒト化：
ＳＤ１０８３については、１０個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの
幾つかはＨＥＫ２９３細胞で低い発現レベルを示し、２つは全く発現しなかった。十分に
発現した３つの変異体のうち、ＳＤ３０８７を最終的なヒト化変異体として選択した。こ
のｓｄＡｂは、ＶＮＡにおいて親ＳＤ１０８３よりも強力で、且つＴ_ｍ開始値が実質的に
高い。

ＳＤ１０８４のヒト化：
ＳＤ１０８４については、６個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの４
つが、ＶＮＡにおいて親ｓｄＡｂと同程度の中和活性を示した。これらの変異体のうち、
ＳＤ３０８５は、Ｔ_ｍ開始値が最も高く、且つヒト生殖細胞系列と比べてＦＲ突然変異が
僅か２つであるため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。

ＳＤ１０８７のヒト化：
ＳＤ１０８７については、２３個のヒト化変異体を作製した。第１の一連の８個の変異
体は、ＶＮＡにおいて２つのＢ型インフルエンザ株と比べて計測可能な活性を示さなかっ
た。第２の一連のＳＤＡｂを作製し、これには、ＳＤ１０８７と同程度のＩＣ_５０値を示
す幾つもの変異体が含まれた。これらの変異体の温度安定性は親分子より低かった。ＣＤ
Ｒ２にＭｅｔの置換を含むこれらの変異体のいずれも、ＶＮＡにおいて活性を示さなかっ
た。ＳＤ３０９３は、Ｔ_ｍ開始値の低下が少なく、ＶＮＡにおけるその活性がＳＤ１０８
７と同等であったためこれを最終的なヒト化変異体として選択した。

実施例１２：ヒト化ｓｄＡｂ多量体Ｆｃ融合コンストラクトの生成及び特徴付け
Ｆｃ融合コンストラクトの生成
実施例１１に記載するヒト化ｓｄＡｂ変異体を使用して多量体Ｆｃ融合コンストラクト
を生成した。ヒト化多量体結合分子、即ち少なくとも２つのヒト化ｓｄＡｂを含む多量体
結合分子を、Ｆｃ領域のＮ末端に直接融合した。Ｆｃ融合コンストラクトを哺乳類細胞で
発現させて、二量体Ｆｃ分子として培地中に分泌させた。これらのＦｃ融合コンストラク
トの完全なアミノ酸配列を表４４に示す。ホモ二量体並びにヘテロ二量体Ｆｃ融合分子を
生成した。ヘテロ二量体Ｆｃ融合物は、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によ
って記載されるとおり２つのＦｃ鎖のＣＨ３ドメインに単一点突然変異（Ｋ４０９Ｒ及び
Ｆ４０５Ｌ）を導入することによるか、又は欧州特許第０８１２３５７Ｂ１号明細書及び
欧州特許第０９７９２８１Ｂ１号明細書に記載されるとおりノブ・イントゥ・ホール突然
変異を導入することにより生成した。

ヒト化ｓｄＡｂ多量体Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子コンストラクトを哺乳類
細胞発現にコドン最適化し、Ｌｏｎｚａ ｐＥＥ１２．４ベクターに導入した。これらの
発現ベクター（ＣＤ４ ＨＣシグナルペプチドを利用する）を増幅し、精製し、滅菌水中
＞５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に濃縮して、電気穿孔を用いてＣＨＯ細胞株にトランスフェク
トした。２つの個々の鎖をコードする等量のベクターのコトランスフェクションにより、
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を作製した。上述のとおり単一のベクターコンストラク
トを使用してホモ二量体Ｆｃ融合物を作製した。標準的な懸濁相振盪フラスコ手順を用い
て細胞培養物を成長させた。ろ過した培養上清をＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓ
ｕＲｅカラムに適用し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ３．５で溶出し
、２．５Ｍトリス ｐＨ７．２を用いて中和して、ｄＰＢＳに透析した。

ヒト化ｓｄＡｂ多量体Ｆｃ融合タンパク質によるインフルエンザ中和
精製Ｆｃ融合タンパク質を実施例６に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和
アッセイで試験し、対応する野生型バージョンと比較したときに同程度の効力及び範囲が
示された。種々のインフルエンザ株に対する平均中和力価を表４５に要約する。

参考文献
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Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，２００９；５：ｅ１０００
３５０．

以下の態様を包含し得る。
［１］ 系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するシングルドメイン抗体。
［２］ ＨＡの茎部領域のエピトープに結合する、上記［１］に記載のシングルドメイン抗体。
［３］ Ｂ型インフルエンザＨＡの頭部領域のエピトープに結合する、上記［１］に記載のシングルドメイン抗体。
［４］ ラクダ科動物ＶＨＨである、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
［５］ 系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型インフルエンザウイルス株；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
［６］ 配列番号２２７、２２８及び２２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３０、２３１及び２３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３３、２３４及び２３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３６、２３７及び２３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２３９、２４０及び２４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４２、２４３及び２４４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４５、２４６及び２４７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２４８、２４９、及び２５０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５１、２５２及び２５３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５４、２５５及び２５６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２５７、２５８及び２５９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６０、２６１及び２６２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６３、２６４及び２６５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６６、２６７及び２６８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２６９、２７０及び２７１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７２、２７３及び２７４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７５、２７６及び２７７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２７８、２７９及び２８０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８１、２８２及び２８３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８４、２８５及び２８６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２８７、２８８及び２８９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２９０、２９１及び２９２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号２９３、１２２及び１２３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１２４、１２５及び１２６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１２７、１２８及び１２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３０、１３１及び１３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３３、１３４及び１３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
配列番号１３６、１３７及び１３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；又は
配列番号１３９、１４０及び１４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上
を含む、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
［７］ 配列番号１〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
［８］ ヒト化ラクダ科動物ＶＨＨである、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
［９］ 前記ヒト化シングルドメイン抗体が、配列番号１４６〜２２６及び配列番号３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［８］に記載のシングルドメイン抗体。
［１０］ Ｆｃテールを更に含む、上記［１］〜［９］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
［１１］ 前記ＦｃテールがヒトＩｇＧ Ｆｃテールである、上記［１０］に記載のシングルドメイン抗体。
［１２］ 少なくとも２つの、上記［１］〜［９］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体を含むマルチドメイン抗体。
［１３］ 系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株、系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有する、上記［１２］に記載のマルチドメイン抗体。
［１４］ 系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、上記［１２］又は［１３］に記載のマルチドメイン抗体。
［１５］ Ｆｃテールを更に含む、上記［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体。
［１６］ 前記ＦｃテールがヒトＩｇＧ Ｆｃテールである、上記［１５］に記載のマルチドメイン抗体。
［１７］ 配列番号３０〜１０７、配列番号１１０〜１２１及び配列番号２９３〜３３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１２］〜［１６］のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体。
［１８］ 上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体又は上記［１２］〜［１７］のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体をコードする核酸分子。
［１９］ 上記［１８］に記載の核酸分子を含むベクター。
［２０］ 上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、上記［１２］〜［１７］のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、上記［１８］に記載の核酸分子、及び／又は上記［１９］に記載のベクターを含む医薬組成物。
［２１］ インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療において使用される、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、上記［１２］〜［１７］のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、上記［１８］に記載の核酸分子、又は上記［１９］に記載のベクター。
［２２］ インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療用医薬の製造における、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、上記［１２］〜［１７］のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、上記［１８］に記載の核酸分子、又は上記［１９］に記載のベクターの使用。

Claims (22)

1. 系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型イ
   ンフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するか；又は系
   統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発生学
   的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ
   ）との特異的結合能を有するか；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の
   ヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有するシングルドメイン抗体。
2. ＨＡの茎部領域のエピトープに結合する、請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
3. Ｂ型インフルエンザＨＡの頭部領域のエピトープに結合する、請求項１に記載のシング
   ルドメイン抗体。
4. ラクダ科動物ＶＨＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗
   体。
5. 系統発生学的グループ２の２つの異なるＨＡ亜型のＨＡを含む少なくとも２つのＡ型イ
   ンフルエンザウイルス株；又は系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフル
   エンザウイルス株及び系統発生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウ
   イルス株；又は少なくとも１つのＢ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、請求
   項１〜４のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
6. 配列番号２２７、２２８及び２２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３０、２３１及び２３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３３、２３４及び２３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３６、２３７及び２３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２３９、２４０及び２４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２４２、２４３及び２４４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２４５、２４６及び２４７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２４８、２４９、及び２５０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２５１、２５２及び２５３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２５４、２５５及び２５６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２５７、２５８及び２５９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６０、２６１及び２６２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６３、２６４及び２６５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６６、２６７及び２６８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２６９、２７０及び２７１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２７２、２７３及び２７４から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２７５、２７６及び２７７から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２７８、２７９及び２８０から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２８１、２８２及び２８３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２８４、２８５及び２８６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２８７、２８８及び２８９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２９０、２９１及び２９２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号２９３、１２２及び１２３から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１２４、１２５及び１２６から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１２７、１２８及び１２９から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１３０、１３１及び１３２から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１３３、１３４及び１３５から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；
   配列番号１３６、１３７及び１３８から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上；又は
   配列番号１３９、１４０及び１４１から選択されるＣＤＲ配列の１つ以上
   を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
7. 配列番号１〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいず
   れか一項に記載のシングルドメイン抗体。
8. ヒト化ラクダ科動物ＶＨＨである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシングルドメ
   イン抗体。
9. 前記ヒト化シングルドメイン抗体が、配列番号１４６〜２２６及び配列番号３４０から
   なる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のシングルドメイン抗体。
10. Ｆｃテールを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
11. 前記ＦｃテールがヒトＩｇＧ Ｆｃテールである、請求項１０に記載のシングルドメイ
    ン抗体。
12. 少なくとも２つの、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体を含む
    マルチドメイン抗体。
13. 系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株、系統発生
    学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つの
    Ｂ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）との特異的結合能を有する、請
    求項１２に記載のマルチドメイン抗体。
14. 系統発生学的グループ１の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び系統発
    生学的グループ２の少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルス株及び少なくとも１つ
    のＢ型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、請求項１２又は１３に記載のマルチ
    ドメイン抗体。
15. Ｆｃテールを更に含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体
    。
16. 前記ＦｃテールがヒトＩｇＧ Ｆｃテールである、請求項１５に記載のマルチドメイン
    抗体。
17. 配列番号３０〜１０７、配列番号１１０〜１２１及び配列番号２９３〜３３９からなる
    群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のマルチ
    ドメイン抗体。
18. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体又は請求項１２〜１７の
    いずれか一項に記載のマルチドメイン抗体をコードする核酸分子。
19. 請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。
20. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項１２〜１７のい
    ずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項１８に記載の核酸分子、及び／又は請求
    項１９に記載のベクターを含む医薬組成物。
21. インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療において使用される、請求項１〜１１
    のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載
    のマルチドメイン抗体、請求項１８に記載の核酸分子、又は請求項１９に記載のベクター
    。
22. インフルエンザ感染の診断、予防及び／又は治療用医薬の製造における、請求項１〜１
    １のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項１２〜１７のいずれか一項に記
    載のマルチドメイン抗体、請求項１８に記載の核酸分子、又は請求項１９に記載のベクタ
    ーの使用。