JP2020159958A - Biosensor probe and method of manufacturing the same - Google Patents

Abstract

To provide a probe of an in vivo biosensor which prevents an enzyme and a redox mediator from flowing to an outside and realizes better durability.SOLUTION: A portion of a surface of an insulating substrate to be a base forming a sensing part of a biosensor probe is provided with a recessed region in a prescribed shape, and a detection layer is formed inside the recessed region.SELECTED DRAWING: Figure 15

Description

本開示は、例えば、液体試料の被検体に含まれる特定物質の濃度を計測するバイオセンサを構成するプローブおよびその製造方法に関する。より詳しくは、本開示により、体内に挿入されるバイオセンサプローブに形成された検知層に含まれる酵素やメディエータの漏出または変質を防止することによって、バイオセンサの耐久性を向上したバイオセンサプローブおよびその製造方法が提供される。 The present disclosure relates to, for example, a probe constituting a biosensor for measuring the concentration of a specific substance contained in a subject of a liquid sample, and a method for producing the same. More specifically, the present disclosure improves the durability of biosensor probes by preventing leakage or alteration of enzymes and mediators contained in the detection layer formed on the biosensor probe inserted into the body. The manufacturing method is provided.

バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用あるいは模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。 A biosensor is a system that measures substances by utilizing or imitating the molecular recognition ability of a living body. For example, one of a combination of enzyme-substrate, antigen-antibody, hormone-receptor, etc. is used as a sample (substance to be measured). ), And the other is a receptor, and the chemical change generated by the molecular recognition reaction between the sample and its receptor is converted into an electrical signal by a transducer, and the sample's strength depends on the strength of the obtained electrical signal. It is a measuring device that measures a quantity.

バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは盛んに開発が行われており、その代表例が、自己血糖測定に用いられるグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などを用いた電気化学式グルコースセンサである。 In addition to the above, biomolecules used in biosensors also include genes, sugar chains, lipids, peptides, cells, tissues and the like. Among them, biosensors using enzymes are being actively developed, and typical examples are glucose oxidase (GOx) and glucose dehydrogenase (GDH) used for self-glycemic measurement. It is an electrochemical glucose sensor using the above.

自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁性基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。 The electrochemical glucose sensor used for self-blood glucose measurement is generally configured such that a cover is arranged via a spacer on an insulating substrate having electrodes formed on its surface. A reagent containing a sample-responsive enzyme, a redox mediator (electron carrier), and the like is arranged on the electrode, and this portion serves as an analysis unit. One end of a flow path for introducing blood communicates with this analysis unit, and the other end of the flow path is open to the outside, and this is a blood supply port. The blood glucose level is measured using such a sensor, for example, as follows. That is, first, the sensor is set in a dedicated measuring device (meter). Then, the fingertip or the like is injured with a lancet to cause bleeding, and the blood supply port of the sensor is brought into contact with the bleeding. Blood is sucked into the flow path of the sensor by capillarity and introduced into the analyzer through which it comes into contact with the reagent. Then, the sample-responsive enzyme E (for example, GOx, GDH) oxidizes glucose by reacting specifically with glucose in blood. Redox Mediator M accepts electrons generated by oxidation. The redox mediator M, which has received and reduced electrons, is electrochemically oxidized at the electrode. The glucose concentration in blood, that is, the blood glucose level is easily detected from the magnitudes such as the current value and the amount of electric charge obtained by the oxidation of the redox mediator M.

このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。 Such an electrochemical blood glucose sensor plays an important role in blood glucose control in the treatment of diabetes, and a diabetic patient can perform appropriate insulin administration and dietary restriction based on the blood glucose level. However, the quality of life (QOL) should be maintained because the blood glucose level must be measured many times a day and blood sampling each time causes pain to the patient. Was difficult.

すでに埋め込み型電気化学式グルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。 Implantable electrochemical glucose sensors have already been developed. The main body 10 of such an implantable electrochemical glucose sensor 1 is attached to the living body 2 and the probe 11 is inserted into the living body to continuously measure the blood glucose level (FIGS. 1 and 2). As a result, the blood glucose level can be measured for a long period of time without collecting blood each time.

厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサ1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図３）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサの需要はますます高まることが期待される。 The Ministry of Health, Labor and Welfare issued the "Notice of Remote Medical Care in 1997 (Notice of Director of Health Policy Bureau, Ministry of Health, Labor and Welfare No. 1075 issued on December 24, 1997)" with the basic concept of remote medical care and Article 20 of the Medical Practitioners Act. The matters to be noted from the relationship of. After that, based on the development and popularization of information and telecommunications equipment, on August 10, 2015, administrative communication was made to each prefectural governor regarding medical treatment using information and communication equipment (so-called "remote medical treatment"). With the 2015 notification, the ban on remote medical care was virtually lifted, and in 2016, remote medical care tools that wirelessly communicate with biosensor 1 using information communication device 3 (smartphone) and a dedicated application began to appear in the world (Fig.) 3). Furthermore, on July 14, 2017, a notification was issued (Medical Administration No. 0714 No. 4) to remind and clarify the handling of remote medical care. According to the 2015 notification, remote medical care will also be direct for remote medical care that combines information and communication devices such as videophones, e-mail, and social networking services, as long as it can be confirmed that the parties are the doctor and the patient. If useful information on the physical and mental condition of the patient can be obtained that can be replaced with face-to-face medical care, it does not immediately violate Article 20 of the Medical Practitioners Act. With this 2017 notification, remote medical care using information and communication equipment will be further developed. Therefore, the demand for embedded sensors is expected to increase more and more.

従来のイン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサの構成として、主面を有するベース基板と、前記ベース基板の主面上に形成され、作用極と対極とを有する電極層と、被検体と反応する試薬層と、前記試薬層を含む、被検体と試薬が反応する空間を覆う生体性適合膜と、を備えたものであった（特許文献１）。また、イン・ビトロ型のバイオセンサでは、絶縁性の基板の表面に、少なくとも測定電極と対電極を形成し、その上に少なくとも一部を覆うように試薬層を形成し、試薬層の厚さを調整するための絶縁部を設け、試薬層を形成するための絶縁部が、凹部を形成したバイオセンサもある（特許文献２）。 As a configuration of a conventional in-biosensor (embedded type) biosensor, a base substrate having a main surface, an electrode layer formed on the main surface of the base substrate and having an working electrode and a counter electrode, and a subject. It was provided with a reagent layer that reacts and a biocompatible membrane that covers the space in which the subject and the reagent react, including the reagent layer (Patent Document 1). Further, in an in-vitro type biosensor, at least a measurement electrode and a counter electrode are formed on the surface of an insulating substrate, and a reagent layer is formed on the measurement electrode so as to cover at least a part thereof, and the thickness of the reagent layer is formed. There is also a biosensor in which an insulating portion for adjusting the temperature is provided and a recess is formed in the insulating portion for forming a reagent layer (Patent Document 2).

米国特許第８３２６３９３号明細書U.S. Pat. No. 8326393 特開２０００−２２１１５６号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-22156

上記従来のイン・ビボの埋め込み型センサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、センサ感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。 Since the conventional in vivo implantable sensor inserts the probe into the body for a long time, the chances of the component sample-responsive enzyme and redox mediator leaking out increase. If the sample-responsive enzyme or redox mediator leaks out of the sensor, not only the sensor sensitivity deteriorates, but also the living body is harmed. In addition, if the sample-responsive enzyme or redox mediator leaks to the outside, the durability of the sensor also decreases. Therefore, it is very important to take measures to prevent the outflow of sample-responsive enzymes and redox mediators.

従来のイン・ビボの埋め込み型のバイオセンサでは、ベースとなる絶縁性基板上に電極層を形成し、その上に検知層を形成し、その試薬層を生体性適合の保護膜で覆って、検体応答性酵素やレドックスメディエータなどの試薬が外部に流出することを防止しているが、絶縁性基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が生じ、試薬が膜の外部に漏れ出す場合があり、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が低下してしまうのであった。 In a conventional in-biosensor embedded biosensor, an electrode layer is formed on a base insulating substrate, a detection layer is formed on the electrode layer, and the reagent layer is covered with a biocompatible protective film. Although it prevents reagents such as sample-responsive enzymes and redox mediators from flowing out to the outside, the protective film becomes thinner than the detection layer formed on the insulating substrate, causing the reagents to become thinner. It may leak out of the membrane, resulting in reduced durability of biosensor measurements.

したがって、本開示では、バイオセンサの測定の耐久性を向上するために、ベース基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が存在しないバイオセンサプローブおよびその製造方法を提供することを課題とする。 Therefore, in the present disclosure, in order to improve the measurement durability of the biosensor, the biosensor probe and the manufacturing method thereof do not have a portion where the film thickness of the protective film becomes thin with respect to the detection layer formed on the base substrate. The challenge is to provide.

この課題を解決するために、本開示では、イン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサにおいて、バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板の表面の一部に凹部領域を設け、その凹部領域内に検知層を形成する。 In order to solve this problem, in the present disclosure, in an in vivo type (embedded type) biosensor, a recessed region is provided in a part of the surface of an insulating substrate which is a base constituting a sensing portion of the biosensor probe. , A detection layer is formed in the recessed region.

より具体的には、本開示は、バイオセンサ用のプローブであって、
主面を有する絶縁性基板と、
前記絶縁性基板の主面上の少なくとも一部に形成された導電性薄膜と、
導電性薄膜上の一部に規定された作用電極と、
前記作用電極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に規定された対極と、
前記作用電極または対極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に形成された参照電極と、
前記作用電極上に形成された検知層と、
前記作用電極、前記検知層、前記参照電極、および前記対極を被覆する生体性適合保護膜と、を備え、
前記作用電極が規定された絶縁性基板の主面の少なくとも一部に***した少なくとも２本の突堤部および、前記少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面として備える凹部領域が形成され、前記凹部領域の内底面上に前記導電性薄膜と検知層が形成されているプローブを提供する。 More specifically, the present disclosure is a probe for a biosensor.
Insulating substrate with main surface and
A conductive thin film formed on at least a part of the main surface of the insulating substrate,
The working electrode specified on a part of the conductive thin film and
The counter electrode specified on a part of the conductive thin film other than the specified conductive thin film, and the working electrode
With a reference electrode formed on a part of the conductive thin film other than the conductive thin film in which the working electrode or the counter electrode is defined,
The detection layer formed on the working electrode and
The working electrode, the detection layer, the reference electrode, and a biocompatible protective film covering the counter electrode are provided.
A recessed region including at least two jetty portions raised on at least a part of the main surface of the insulating substrate in which the working electrode is defined and a region of the main surface sandwiched between the at least two jetty portions as an inner bottom surface. To provide a probe in which the conductive thin film and the detection layer are formed on the inner bottom surface of the recessed region.

本開示の態様は、前記凹部領域が少なくとも２本の突堤部で構成されていることを特徴とする。前記少なくとも２本の突堤部をつなぐように横行する１または複数の突堤部をさらに形成して、凹部領域をコの字型やロの字型その他の形状に構成することもできる。
絶縁性基板の表面から突堤部の上端までの高さは５〜９０μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍであり、より好ましくは１５〜３０μｍである。 Aspects of the present disclosure are characterized in that the recessed region is composed of at least two jetty portions. It is also possible to further form one or more jetty portions traversing so as to connect the at least two jetty portions, and form the recessed region in a U-shape, a square-shape or other shape.
The height from the surface of the insulating substrate to the upper end of the jetty is 5 to 90 μm, preferably 10 to 50 μm, and more preferably 15 to 30 μm.

凹部領域の寸法や角度は、上面図において長手方向および横手方向のそれぞれを略４等分する３つの線分を接触式表面形状測定装置（Dektak XT）で走査して得られたプロファイルから算出した平均値である。 The dimensions and angles of the recessed region were calculated from the profile obtained by scanning three line segments that divide each of the longitudinal direction and the lateral direction into approximately four equal parts in the top view with a contact type surface shape measuring device (Dektak XT). It is an average value.

本開示によるイン・ビボ型バイオセンサ用のプローブの製造方法は、
プローブのベースとなる絶縁性基板の表側の一部に凹部領域を形成する工程、
前記絶縁性基板の表側および凹部領域の全面、ならびに裏面に導電性薄膜を形成する工程、
前記凹部領域の内底面上の導電性薄膜上に検知層を形成する工程；ならびに、
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む。 The method for manufacturing a probe for an in vivo biosensor according to the present disclosure is described.
The process of forming a recessed area on a part of the front side of the insulating substrate that is the base of the probe.
A step of forming a conductive thin film on the entire front side and the concave portion region of the insulating substrate and on the back surface.
A step of forming a detection layer on a conductive thin film on the inner bottom surface of the recessed region;
The step of coating the working electrode, the reference electrode, the counter electrode and the detection layer with a biocompatible protective film is included.

絶縁性基板の表側の一部に凹部領域を形成する工程において、絶縁性基板に凹部領域を形成できる方法であれば、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工などのいずれの方法も用いることができる。本開示によるプローブにおいて、所望する形状の凹部領域を形成する方法としては、レーザー加工が好ましい。 In the step of forming the concave region on a part of the front side of the insulating substrate, any method such as press working, etching processing, laser processing, and grinding processing should be used as long as the concave region can be formed on the insulating substrate. Can be done. In the probe according to the present disclosure, laser processing is preferable as a method for forming a concave region having a desired shape.

本開示によれば、絶縁性基板の表側の一部に形成した凹部領域内に検知層を形成したので、検知層上の保護膜の膜厚を十分に厚く形成することが可能となり、その結果、試薬の外部への漏出や保護膜内の試薬の変質を防ぐことができる。これにより、バイオセンサの測定の耐久性を向上することができた。 According to the present disclosure, since the detection layer is formed in the recessed region formed on a part of the front side of the insulating substrate, it is possible to form a sufficiently thick protective film on the detection layer, and as a result, , It is possible to prevent leakage of the reagent to the outside and deterioration of the reagent in the protective film. This made it possible to improve the measurement durability of the biosensor.

埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。The schematic diagram which shows the state which the embedded biosensor is attached to the living body (human body). 生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。A cross-sectional view showing an implantable biosensor attached to a living body (human body). スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサの概略図。Schematic diagram of an embedded biosensor that wirelessly communicates measurement data with a smartphone. 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。The manufacturing process of the probe of the implantable biosensor of one specific example of the present disclosure. 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。The manufacturing process of the probe of the implantable biosensor of one specific example of the present disclosure. 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。The manufacturing process of the probe of the implantable biosensor of one specific example of the present disclosure. 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。The manufacturing process of the probe of the implantable biosensor of one specific example of the present disclosure. 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。Top view of the probe front side of the implantable biosensor of one specific example of the present disclosure. 図８におけるA-A’切断線での断面図。FIG. 8 is a cross-sectional view taken along the line AA'in FIG. 図９におけるB-B’切断線での断面図。FIG. 9 is a cross-sectional view taken along the line B-B'in FIG. 図９におけるC-C’切断線での断面図。FIG. 9 is a cross-sectional view taken along the line C-C'in FIG. 本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、レーザー加工による絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上への凹部領域の形成過程を示す図。The figure which shows the formation process of the recess region on an insulating substrate (PET substrate) by laser processing in the manufacturing process of one Embodiment by this disclosure. 本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、レーザー加工による絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上への凹部領域の形成過程を示す図。The figure which shows the formation process of the recess region on an insulating substrate (PET substrate) by laser processing in the manufacturing process of one Embodiment by this disclosure. 本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、レーザー加工による絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上への凹部領域の形成過程を示す図。The figure which shows the formation process of the recess region on an insulating substrate (PET substrate) by laser processing in the manufacturing process of one Embodiment by this disclosure. 本開示によるひとつの実施形態のプローブ先端の絶縁性基板（ＰＥＴ基板）の縦断面図。FIG. 3 is a vertical sectional view of an insulating substrate (PET substrate) at the tip of a probe according to the present disclosure. 本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、プローブ先端に保護膜を形成する過程を示す図。The figure which shows the process of forming a protective film at the tip of a probe in the manufacturing process of one Embodiment by this disclosure. 本開示による一つの実施形態の保護膜が形成されたプローブ先端の縦断面図。FIG. 3 is a vertical sectional view of a probe tip on which a protective film of one embodiment according to the present disclosure is formed. 本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上に、レーザー加工により形成した凹部領域を示す図：（ａ）上面図および（ｂ）凹部領域のプロファイル。The figure which shows the recess region formed by laser processing on the insulating substrate (PET substrate) in the manufacturing process of one Embodiment by this disclosure: (a) top view and (b) profile of the recess region. 本開示による別の実施形態の製造工程において、絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上に、レーザー加工により形成した凹部領域を示す図：（ａ）上面図および（ｂ）凹部領域のプロファイル。The figure which shows the recess region formed by laser processing on the insulating substrate (PET substrate) in the manufacturing process of another embodiment by this disclosure: (a) top view and (b) profile of the recess region.

１．埋め込み型バイオセンサのプローブの製造方法
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、本開示の特徴を有する所望の凹部領域が形成されていれば、下記した構成に限定されるものではない。 1. 1. Method for Manufacturing Probe for Implantable Biosensor The method for manufacturing probe 11 for implantable biosensor 1 according to one embodiment of the present disclosure will be described. The structure and manufacturing method shown below are one specific example of the present disclosure, and are not limited to the following configurations as long as a desired recessed region having the characteristics of the present disclosure is formed.

（１）絶縁性基板の準備
埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図４ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
鍵形状の絶縁性基板111は、材料を裁断することによって準備するが、裁断する方法は、特に限定されず、レーザーカット、ピナクルダイを用いたダイカットなどの分野公知の方法で裁断することができる。 (1) Preparation of Insulating Substrate The embedded biosensor 1 includes the main body 10 and the probe 11, and the probe 11 is generally used for electrically connecting the sensing portion to be inserted into the living body and the internal circuit of the biosensor main body 10. It is a key shape consisting of terminal parts. The sensing portion is formed thin so that it can be inserted into the body, and the terminal portion has a certain size so as to be inserted into the biosensor main body 10 to form an electrical connection. Therefore, first, the key-shaped insulating substrate 111 is prepared (FIG. 4a). The upper row shows the top view seen from the front side, and the lower row shows the top view seen from the back side (hereinafter, the same applies). The insulating substrate 111 is not particularly limited as long as it has a material and a thickness that can be used as a probe to be inserted into a living body, and for example, polyethylene terephthalate (PET) having a thickness of about 200 μm can be used.
The key-shaped insulating substrate 111 is prepared by cutting the material, but the cutting method is not particularly limited, and the key-shaped insulating substrate 111 can be cut by a method known in the field such as laser cutting and die cutting using a pinnacle die. ..

（２）凹部領域の形成
次に、絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面に、長手方向に沿って凹部領域112を形成する（図４ｂ）。
凹部領域の形成方法として、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工などのいずれの方法を用いることができるが、本発明の実施形態においては、レーザー加工による方法を用いている。この方法の特徴は、絶縁性基板を掘り下げて凹部領域を形成するのではなく、絶縁性基板111をレーザー照射して熱で溶かしながらその部分を***させて突堤部を形成することで、凹部領域112を形成している。すなわち、本実施形態の凹部領域112は、絶縁性基板111の表面に***した２本の突堤部1121および、２本の突堤部1121に挟まれた領域である内底面1122から構成され、内底面1122は絶縁性基板111の表面に相当する。
本開示による凹部領域は少なくとも２本の突堤部で構成される溝状の開放形態であるが、前記少なくとも２本の突堤部をつなぐように横行する１または複数のさらなる突堤部によってコの字型の突堤部で構成される半閉鎖形態またはロの字型の突堤部で構成される閉鎖形態とすることもできる。 (2) Formation of Recessed Region Next, a recessed region 112 is formed along the longitudinal direction on the front surface of the tip of the sensing portion of the insulating substrate 111 (FIG. 4b).
As a method for forming the recessed region, any method such as press working, etching processing, laser processing, and grinding processing can be used, but in the embodiment of the present invention, the method by laser processing is used. The feature of this method is that instead of digging down the insulating substrate to form a concave region, the insulating substrate 111 is irradiated with a laser and melted by heat, and the portion is raised to form a jetty region. Forming 112. That is, the recessed region 112 of the present embodiment is composed of two jetty portions 1121 raised on the surface of the insulating substrate 111 and an inner bottom surface 1122 which is a region sandwiched between the two jetty portions 1121. 1122 corresponds to the surface of the insulating substrate 111.
The recessed region according to the present disclosure is a groove-shaped open form composed of at least two jetty portions, but is U-shaped by one or more additional jetty portions traversing so as to connect the at least two jetty portions. It can also be a semi-closed form composed of the jetty portion of the above or a closed form composed of a square-shaped jetty portion.

（３）導電性薄膜の形成
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜113を形成する（図５ｃ）。これにより、絶縁性基板111の表側の表面において、凹部領域の突堤部および内底面から凹部領域が形成されていない領域にわたって連続的に導電性薄膜が形成され、同様に、絶縁性基板111の裏側の表面の全面にも連続的に導電性薄膜が形成される。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm〜数百nmである。 (3) Formation of Conductive Thin Film Conductive metal materials selected from the group consisting of carbon or metal such as gold, silver, platinum or palladium are sputtered, vapor-deposited, ion-plated, etc. on both sides of the insulating substrate 111. The conductive thin film 113 is formed by depositing with (Fig. 5c). As a result, on the front surface of the insulating substrate 111, a conductive thin film is continuously formed from the jetty portion of the recessed region and the inner bottom surface to the region where the recessed region is not formed, and similarly, the back side of the insulating substrate 111 is formed. A conductive thin film is continuously formed on the entire surface of the surface. The preferred thickness of the conductive thin film is 10 nm to several hundred nm.

（４）電極リードの形成
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜113にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝114を形成して、作用電極リード113aと参照電極リード113bに分離して電気的絶縁する（図５ｄ）。 (4) Formation of Electrode Lead A groove 114 having a depth reaching the surface of the insulating substrate 111 is formed by drawing a laser on the conductive thin film 113 formed on the front side of the insulating substrate 111, and is referred to as an working electrode lead 113a. Separated into electrode leads 113b and electrically insulated (Fig. 5d).

（５）絶縁膜の形成
絶縁性基板111の表側に、作用電極115および参照電極116ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子115aおよび参照電極用端子116aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁膜117aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極118および本体10と電気接続するための対極用端子118aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁膜117bを形成する（図６ｅ）。絶縁膜の好ましい厚さは、5〜40 μmである。 (5) Formation of Insulating Film On the front side of the insulating substrate 111, the working electrode 115, the reference electrode 116, and the working electrode terminal 115a for electrical connection to the main body 10 and the region used as the reference electrode terminal 116a are excluded. An insulating film 117a having an opening is formed by a sputtering method, a screen printing method, or the like, and a portion excluding a region used as a counter electrode terminal 118a for electrical connection with the counter electrode 118 and the main body 10 on the back side of the insulating substrate 111. In addition, an insulating film 117b having an opening is formed by a sputtering method, a screen printing method, or the like (FIG. 6e). The preferred thickness of the insulating film is 5-40 μm.

（６）参照電極の形成
絶縁性基板111の表側に形成した絶縁膜117aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法、ディスペンサ法およびインクジェット法などにより堆積させて、参照電極116を形成する（図６ｆ）。参照電極の好ましい厚さは、5〜40 μmである。 (6) Formation of Reference Electrode Ag / AgCl is deposited in the opening for the reference electrode of the insulating film 117a formed on the front side of the insulating substrate 111 by a screen printing method, a dispenser method, an inkjet method, or the like to form the reference electrode 116. (Fig. 6f). The preferred thickness of the reference electrode is 5-40 μm.

（７）検知層の形成
凹部領域112の作用電極115の上に、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を混合させ、その混合水溶液を塗布乾燥して、少なくとも、レドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む検知層119を形成する（図７ｇ）。また、検知層の導電性を向上させるために、レドックスメディエータおよび検体応答性酵素の混合水溶液の前に、炭素粒子懸濁液などの導電性粒子を先に塗布乾燥してもよい。本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。 (7) Formation of Detection Layer An aqueous solution of a redox mediator and an aqueous solution of a sample-responsive enzyme are mixed on the working electrode 115 of the recessed region 112, and the mixed aqueous solution is applied and dried to at least the redox mediator and the sample-responsiveness. A detection layer 119 containing the enzyme is formed (Fig. 7 g). Further, in order to improve the conductivity of the detection layer, conductive particles such as a carbon particle suspension may be applied and dried first before the mixed aqueous solution of the redox mediator and the sample-responsive enzyme. In the present disclosure, the "specimen-responsive enzyme" means a biochemical substance capable of specifically catalyzing the oxidation or reduction of a sample. Any biochemical substance may be used as long as it can be used for the purpose of detecting a biosensor. For example, when glucose is used as a sample, suitable sample-responsive enzymes include glucose oxidase (GOx) and glucose dehydrogenase (GDH). The “redox mediator” means a redox substance that mediates electron transfer, and is responsible for the transfer of electrons generated by the redox reaction of a sample (analyte) in a biosensor. For example, a phenazine derivative and the like are included, but the present invention is not limited to this, and any redox substance may be used as long as it can be used for the detection purpose of a biosensor.

また、以下にレドックスメディエータの合成の一例を示す。
［合成例：カルボキシル基を有するフェナジン誘導体の合成］
1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、例えば、5-(4-カルボキシブチル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。さらに、末端カルボキシル基にN-ヒドロキシスクシンイミドを付加してカルボキシル基の反応性が向上した、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。対応するN-アルキル化剤を選択して、所望のN-アルキルカルボキシフェナジニウム塩を合成することができる。 In addition, an example of synthesis of redox mediator is shown below.
[Synthesis example: Synthesis of phenazine derivative having carboxyl group]
An N-alkylating agent is allowed to act on 1-methoxyphenazine to synthesize, for example, 5- (4-carboxybutyl) -1-methoxyphenazine nitrate. Furthermore, N-hydroxysuccinimide was added to the terminal carboxyl group to improve the reactivity of the carboxyl group, 5-{[(2,5-dioxopyridin-1-yl) oxy] -5-oxopentyl} -1. -Synthesize methoxyphenadinium nitrate. The corresponding N-alkylating agent can be selected to synthesize the desired N-alkylcarboxyphenazineium salt.

合成例で得られた、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C5-Su）： 5-{[(2,5-dioxopyridin-1-yl) oxy] -5-oxopentyl} -1-methoxyphenazinenium nitrate (Ph-C5-Su) obtained in the synthetic example:

を0.6 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）120 μLに溶解した。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を5 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-C5-Ph_1）を得た。
得られたPLL-C5-Ph_1の溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
Was weighed in 0.6 mg and dissolved in 120 μL of 100 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer (pH 6.0). Separately, 5 mg of poly (L-lysine) hydrochloride (Peptide Institute, Ltd. Code 3075; MW> 12000, cutoff by dialysis) was weighed and dissolved in 1 mL of 100 mM MES buffer (pH 6.0). The above two solutions were mixed and reacted at room temperature for 4 hours with stirring.
The reaction solution was subjected to gel filtration chromatography using a PD-10 column (GE Healthcare) using PBS as an elution buffer. The solution after gel filtration was subjected to ultrafiltration using a centrifugal ultrafiltration filter (Amicon Ultra-4 30k; Merck Millipore).
By the above procedure, a high molecular weight polymer (PLL-C5-Ph_1) in which phenazine was covalently bonded to poly (L-lysine) hydrochloride was obtained.
The obtained solution of PLL-C5-Ph_1 was measured by a microplate (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN) and a plate reader (TECAN infinite M200 PRO), and the absorbance at 386 nm was about 386 nm on PBS. Adjusted to 11. As the absorbance, the value obtained by subtracting the measured absorbance of PBS as a blank value was used.

本開示において、検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含み、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を順次塗布乾燥して、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜であってもよい。また、検知層の好ましい厚さは、1〜80 μmである。 In the present disclosure, the detection layer contains at least a redox mediator and a sample-responsive enzyme, and an aqueous solution of the redox mediator and an aqueous solution of the sample-responsive enzyme are sequentially applied and dried to contain the mediator layer containing the redox mediator and the sample-responsive enzyme. It may be a multilayer film composed of an enzyme layer. The preferred thickness of the detection layer is 1 to 80 μm.

（８）保護膜の形成
センシング部分を、センサ保護用の生体適合性樹脂を含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜120を形成する（図７ｈ）。保護膜120は、作用電極用端子115a、参照電極用端子116aおよび対極用端子118aを被覆することなく、少なくとも、作用電極115、参照電極116、対極118および検知層119を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5〜200 μmである。 (8) Formation of Protective Film The sensing portion is immersed in a solution containing a biocompatible resin for protecting the sensor to form a protective film 120 on both sides, side surfaces and end faces of the sensing portion (FIG. 7h). The protective film 120 covers at least the working electrode 115, the reference electrode 116, the counter electrode 118 and the detection layer 119 without covering the working electrode terminal 115a, the reference electrode terminal 116a and the counter electrode terminal 118a, and in vivo. Form longer than the length to be inserted. The preferred thickness of the protective film is 5 to 200 μm.

センサ保護用の生体適合性樹脂として、限定されないが、ポリ（4-ビニルピリジン）を用いることができ、ポリ（4-ビニルピリジン）はポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよく、例えば、ポリ(tert-ブチルメタクリレート)-b-ポリ(4-ビニルピリジン)、ポリスチレン-co-4-ビニルピリジン-co-オリゴ[プロピレングリコールメチルエーテル]メタクリレートなどが挙げられる。 Poly (4-vinylpyridine) can be used as the biocompatible resin for sensor protection, and poly (4-vinylpyridine) is crosslinked with a cross-linking agent such as polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE). For example, poly (tert-butyl methacrylate) -b-poly (4-vinylpyridine), polystyrene-co-4-vinylpyridine-co-oligo [propylene glycol methyl ether] methacrylate and the like can be mentioned.

図１６を参照して、保護膜の形成手順を詳説する。鍵型プローブのセンシング部分の軸を下方に向けて、容器に収容された生体適合保護膜形成用の樹脂溶液に浸漬する。プローブの製造条件に依存するが、１または複数回浸漬を繰り返す。適当回数の浸漬が終了したら、前記プローブの裏側の面（すなわち、縦断面における台形の下底）を下にして静置する。この状態で、室温（１８〜２５℃）にて３〜６０時間乾燥させる。 The procedure for forming the protective film will be described in detail with reference to FIG. The key-type probe is immersed in a resin solution for forming a biocompatible protective film contained in a container with the axis of the sensing portion facing downward. The immersion is repeated one or more times, depending on the manufacturing conditions of the probe. After a suitable number of dips, the probe is allowed to stand with the back surface (ie, the trapezoidal bottom in the longitudinal section) facing down. In this state, it is dried at room temperature (18 to 25 ° C.) for 3 to 60 hours.

２．埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11のプローブの内部構造をさらに説明する。 2. 2. Internal Structure of Probe of Implantable Biosensor The internal structure of the probe of probe 11 of implantable biosensor 1 according to one embodiment of the present disclosure will be further described.

図８に、センシング部分に保護膜まで形成された状態のプローブ11の表側から見た上面図を示す。図８のA-A’切断線での断面図を図９に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜113が形成されている。表側の導電性薄膜113では、溝114によって作用電極リード113aと参照電極リード113bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード113aの一部が作用電極115として機能する。センシング部分の先端または先端付近には、凹部領域112が形成され、その側面および内底面まで連続的に導電性薄膜113が形成され、したがって、凹部領域112の内底面に形成された導電性薄膜113が作用電極115として機能することとなる。 FIG. 8 shows a top view of the probe 11 in a state where a protective film is formed on the sensing portion as seen from the front side. A cross-sectional view taken along the AA'cutting line of FIG. 8 is shown in FIG. Conductive thin films 113 are formed on both sides of the insulating substrate 111. In the conductive thin film 113 on the front side, the groove 114 separates the working electrode lead 113a and the reference electrode lead 113b into two leads, which are electrically insulated. A part of the working electrode lead 113a functions as the working electrode 115. A recessed region 112 is formed at or near the tip of the sensing portion, and a conductive thin film 113 is continuously formed up to the side surface and the inner bottom surface thereof, and therefore, the conductive thin film 113 formed on the inner bottom surface of the recessed region 112. Will function as the working electrode 115.

ここで、本実施形態において、凹部領域112は、絶縁性基板の主面から***する突堤部1121を設けることにより形成されている。すなわち、凹部領域112は、元の絶縁性基板111の主面を加工しないで、そのままの形状で構成するので、凹部領域の内底面1112は、絶縁性基板111の他の主面と同じ水準にある。
本実施形態において、凹部領域は、プローブ先端の長手方向に並列する２本の突堤部で構成されているため、短手方向に横行する突堤部が存在しないが（図９ａ）、閉鎖形態の突堤部により凹部領域が構成された場合の断面図を図９ｂに図示する。 Here, in the present embodiment, the recessed region 112 is formed by providing a jetty portion 1121 that rises from the main surface of the insulating substrate. That is, since the recessed region 112 is configured as it is without processing the main surface of the original insulating substrate 111, the inner bottom surface 1112 of the recessed region is at the same level as the other main surfaces of the insulating substrate 111. is there.
In the present embodiment, since the recessed region is composed of two jetty portions parallel to each other in the longitudinal direction of the probe tip, there is no jetty portion traversing in the lateral direction (FIG. 9a), but the jetty in the closed form. A cross-sectional view of a recessed region formed by the portions is shown in FIG. 9b.

この作用電極115上に検知層119が形成されている。検知層119は図９では、一層で示されているが、作用電極上にメディエータ層119aを形成し、その上にレドックスメディエータ層119bを形成して二層構造とすることができ、実施形態に依存して、その他の構成も許容される。 A detection layer 119 is formed on the working electrode 115. Although the detection layer 119 is shown as a single layer in FIG. 9, the mediator layer 119a can be formed on the working electrode, and the redox mediator layer 119b can be formed on the mediator layer 119a to form a two-layer structure. Depending on this, other configurations are also acceptable.

また、絶縁膜117aの開口部分に参照電極116が形成されて、参照電極リード113bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜113は対極リード113cとなり、その一部が対極118として機能する。
なお、図９において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、凹部領域の形状は簡便に描写している。 Further, the reference electrode 116 is formed in the opening portion of the insulating film 117a and is electrically connected to the reference electrode lead 113b. The conductive thin film 113 on the back side serves as a counter electrode lead 113c, and a part of the conductive thin film 113 functions as a counter electrode 118.
In FIG. 9, the shape of the recessed region is simply depicted for the purpose of explaining the basic structure inside the probe.

図９のB-B’切断線での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側の主面上に凹部領域112が形成され、この凹部領域112の表面上に作用電極115が形成され、その上に検知層119が形成され、裏側に対極118が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜120で被覆されていることが分かる。
なお、図１０において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、凹部領域の形状は簡便に描写している。 A cross-sectional view taken along the B-B'cutting line of FIG. 9 is shown in FIG. A concave region 112 is formed on the main surface of the front side of the insulating substrate 111, a working electrode 115 is formed on the surface of the concave region 112, a detection layer 119 is formed on the working electrode 115, and a counter electrode 118 is formed on the back side. ing. Further, it can be seen that the entire periphery of the sensing portion is covered with the protective film 120 of the present disclosure.
In FIG. 10, the shape of the recessed region is simply depicted for the purpose of explaining the basic structure inside the probe.

図９のC-C’切断面での断面図を図１１に示す。絶縁性基板111の表側に、溝114で電気的に分離された作用電極リード113aと参照電極リード113bとが形成され、その上に絶縁膜117aが形成されている。絶縁膜117aの開口部に参照電極116が形成されている。基板111の裏側に対極リード113cが形成され、その上に絶縁膜117bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜120で被覆されていることが分かる。また、参照電極116は、ここでは表側に配置したが、裏側に配置してもよい。 A cross-sectional view of the C—C'cut surface of FIG. 9 is shown in FIG. A working electrode lead 113a and a reference electrode lead 113b electrically separated by a groove 114 are formed on the front side of the insulating substrate 111, and an insulating film 117a is formed on the working electrode lead 113a. A reference electrode 116 is formed in the opening of the insulating film 117a. A counter electrode lead 113c is formed on the back side of the substrate 111, and an insulating film 117b is formed on the counter electrode lead 113c. Further, it can be seen that the entire periphery of the sensing portion is covered with the protective film 120 of the present disclosure. Further, although the reference electrode 116 is arranged on the front side here, it may be arranged on the back side.

図１５は、プローブ先端部分の短手方向での絶縁性基板111の縦断面図を示し、凹部領域の突堤部の形状をより詳細に描写している。絶縁性基板111の主面（図の上側）には、凹部領域112が形成されている。この凹部領域112は、絶縁性基板111を掘って形成したのではなく、絶縁性基板111の表面上に***する突堤部1121を形成し、突堤部に挟まれた主面の領域を内底面1122として凹部領域112を形成している。すなわち、凹部領域112は、絶縁性基板111の主面の一部である内底面1122と、この内底面1122を挟むように***した突堤部1121により構成されている。このように、凹部領域112の内底面1122は、絶縁性基板111の本来の主面上の平面部分を加工しないでそのまま用いているので、凹部領域112の内底面1122の表面は平滑であり、導電体等が塗布しやすい形状になっている。 FIG. 15 shows a vertical cross-sectional view of the insulating substrate 111 in the lateral direction of the probe tip portion, and depicts the shape of the jetty portion in the recessed region in more detail. A recessed region 112 is formed on the main surface (upper side of the drawing) of the insulating substrate 111. The recessed region 112 is not formed by digging the insulating substrate 111, but forms a jetty portion 1121 that rises on the surface of the insulating substrate 111, and the region of the main surface sandwiched between the jetty portions is the inner bottom surface 1122. The recessed region 112 is formed as. That is, the recessed region 112 is composed of an inner bottom surface 1122 which is a part of the main surface of the insulating substrate 111 and a jetty portion 1121 which is raised so as to sandwich the inner bottom surface 1122. As described above, since the inner bottom surface 1122 of the recessed region 112 is used as it is without processing the flat portion on the original main surface of the insulating substrate 111, the surface of the inner bottom surface 1122 of the recessed region 112 is smooth. It has a shape that makes it easy to apply a conductor or the like.

凹部領域112の突堤部1121は、頂点1121aと、頂点から内底面に向かって傾斜した第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bと、頂点から内底面とは反対の外側に向かって傾斜した第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cとを備えている。第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_１）は、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_２）よりも大きい。また、突堤部1121は、山状に***した形状になっているので、第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_１）および第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_２）は、ともに９０度未満となっている。 The jetty portion 1121 of the recessed region 112 has a vertex 1121a, a first inclined portion (inwardly inclined portion) 1121b inclined from the apex toward the inner bottom surface, and a first inclined portion (inwardly inclined portion) 1121b inclined from the apex toward the outer side opposite to the inner bottom surface. It is provided with 2 inclined portions (outward inclined portions) 1121c. The inclination angle of the first inclined portion (inward inclined portion) 1121b (180 degrees −θ _{1 in} FIG. 15) is the inclination angle of the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c (180 degrees −θ _{2 in} FIG. 15). Greater than. Further, since the jetty portion 1121 has a mountain-like raised shape, the inclination angle of the first inclined portion (inwardly inclined portion) 1121b (180 degrees −θ _{1 in} FIG. 15) and the second inclined portion (inwardly inclined portion) 1121b. The inclination angle of the outwardly inclined portion) 1121c (180 degrees −θ _{2 in} FIG. 15) is less than 90 degrees.

プローブ先端を保護膜用の樹脂溶液に浸漬したときに、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cに沿って樹脂溶液が付着し、第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bに沿って、樹脂溶液が内底面1122に流れ込み、乾燥することによって保護膜120が形成される。凹部領域112の突堤部1121を形成する場所に限定はないが、図１５においては、絶縁性基板111の両縁に突堤部1121が形成され、縦断面形状において、上底の長さが下底の長さより短い略等脚台形となる。このような構成とすることで、凹部領域112の上方に多くの樹脂溶液が滞留し、凹部領域112内に形成された検知層119上方の保護膜120の膜厚が厚くなる。 When the tip of the probe is immersed in the resin solution for the protective film, the resin solution adheres along the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c, and the resin solution adheres along the first inclined portion (inward inclined portion) 1121b. The protective film 120 is formed by the resin solution flowing into the inner bottom surface 1122 and drying. The place where the jetty portion 1121 of the recessed region 112 is formed is not limited, but in FIG. 15, the jetty portions 1121 are formed on both edges of the insulating substrate 111, and the length of the upper base is the lower base in the vertical cross-sectional shape. It becomes an approximately isosceles trapezoid shorter than the length of. With such a configuration, a large amount of resin solution stays above the recessed region 112, and the film thickness of the protective film 120 above the detection layer 119 formed in the recessed region 112 becomes thick.

以下、保護膜120の膜厚が厚くなる理由について、詳細に説明する。第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度が９０度未満となる場合、プローブのセンシング部分の縦断面における形状は、台形の両脚が上方に向かうに従い、内側に閉じた形状になっている。
本発明者らが、プローブのセンシング部分の縦断面における形状が略長方形の場合と比較して、縦断面における形状が上底の長さが下底の長さより短い略台形の場合、検知層側上部の保護膜の厚さが増大することを初めて確認した。
これは、保護膜120をプローブに塗布する際に、プローブに付着した保護膜を形成する樹脂溶液は、表面張力により球形になろうとするが、重力および内部のプローブ形状に依存して、保護膜の形状が定まる。縦断面形状が略長方形の場合には、上辺と縦辺とが形成する角（センシング部分を立体的にみたとき、辺）が、樹脂溶液の流動を妨害するため、球状になりにくく、センシング部分の表側の表面上に存在する樹脂溶液量が少なくなる。
一方、本実施形態での保護膜の形状では、上方に存在する樹脂溶液に対して、両脚横に存在する樹脂溶液が、第２の傾斜部1121cに沿って流れ込み、一体となり、球状になりやすくなる。結果として、センシング部分の表側の表面上に存在する樹脂溶液量が多くなると想定される。
そのような構成により、検知層表面上方の保護膜120の膜厚を十分に確保することができるので、検知層119に含まれる試薬がプローブ外部に漏出することが防止される。さらに、凹部領域112の開口部周囲に沿って上方に***する突堤部1121が形成されているので、絶縁性基板111の凹部領域112内で検知層119に含まれた試薬が、水平方向に拡散することが防止されるのである。 Hereinafter, the reason why the protective film 120 becomes thicker will be described in detail. When the inclination angle of the second inclined portion (extroverted inclined portion) 1121c is less than 90 degrees, the shape of the sensing portion of the probe in the vertical cross section becomes a shape that is closed inward as both trapezoidal legs are directed upward. There is.
When the shape of the sensing portion of the probe in the vertical cross section is substantially trapezoidal, the shape in the vertical cross section is shorter than the length of the lower base, the present inventors have a detection layer side. It was confirmed for the first time that the thickness of the upper protective film increased.
This is because when the protective film 120 is applied to the probe, the resin solution that forms the protective film attached to the probe tends to become spherical due to surface tension, but depending on gravity and the shape of the probe inside, the protective film The shape of is determined. When the vertical cross-sectional shape is substantially rectangular, the angle formed by the upper side and the vertical side (the side when the sensing part is viewed three-dimensionally) obstructs the flow of the resin solution, so that it does not easily become spherical and the sensing part. The amount of resin solution present on the front surface of the surface is reduced.
On the other hand, in the shape of the protective film in the present embodiment, the resin solution existing on the sides of both legs flows along the second inclined portion 1121c with respect to the resin solution existing above, and tends to be integrated and become spherical. Become. As a result, it is assumed that the amount of resin solution existing on the front surface of the sensing portion increases.
With such a configuration, the film thickness of the protective film 120 above the surface of the detection layer can be sufficiently secured, so that the reagent contained in the detection layer 119 is prevented from leaking to the outside of the probe. Further, since the jetty portion 1121 that rises upward along the periphery of the opening of the concave portion region 112 is formed, the reagent contained in the detection layer 119 diffuses horizontally in the concave portion region 112 of the insulating substrate 111. It is prevented from doing.

また、プローブのセンシング部分の縦断面において、突堤部の頂点1121aから第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cを経て、絶縁性基板111の端面である第３の傾斜部111aが連続している。この第３の傾斜部111aの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_３）は、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度よりも大きい。
言い換えれば凹部領域112の突堤部の頂点1121aから絶縁性基板111の裏側の表面までの外側斜面は、傾斜角度が段階的に大きくなる形状となっている。このような形状とすることで、両脚横に存在する樹脂溶液が、まず、傾斜角度のきつい第３の傾斜部111aに沿って流れ、そして傾斜角度が第３の傾斜部111aより緩やかな第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cに沿って減速した状態で流れ込むことになる。そして、検知層119の上方に存在する樹脂溶液と一体となるので、球状になりやすくなる。結果として、センシング部分の表側の主面上に存在する樹脂溶液量が多くなると想定される。 Further, in the vertical cross section of the sensing portion of the probe, the third inclined portion 111a, which is the end surface of the insulating substrate 111, is continuous from the apex 1121a of the jetty portion through the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c. .. The inclination angle of the third inclined portion 111a (180 degrees −θ _{3 in} FIG. 15) is larger than the inclination angle of the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c.
In other words, the outer slope from the apex 1121a of the jetty portion of the recessed region 112 to the surface on the back side of the insulating substrate 111 has a shape in which the inclination angle gradually increases. With such a shape, the resin solution existing on the sides of both legs first flows along the third inclined portion 111a having a steep inclination angle, and then the second inclined portion having a gentler inclination angle than the third inclined portion 111a. It will flow in a decelerated state along the inclined part (outward inclined part) 1121c. Then, since it is integrated with the resin solution existing above the detection layer 119, it tends to be spherical. As a result, it is assumed that the amount of resin solution existing on the main surface on the front side of the sensing portion increases.

突堤部の頂点1121aから外側面にかけて形成される第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cは、レーザー加工によるものである。レーザーの熱によって、絶縁性基板111の表面が溶解し、谷部が形成される。そして、溶解した部分は、山状に***して突堤部を形成する。この突堤部の頂点から谷部にかけて形成される斜面が第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cとなる。
そして、絶縁性基板から個別のプローブを裁断する際には、この谷部の谷底に沿ってほぼ鉛直方向に裁断するので、この裁断面によって形成される第３の傾斜部111aの傾斜角度は、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度に対して大きくなる。 The second inclined portion (outward inclined portion) 1121c formed from the apex 1121a of the jetty portion to the outer surface is laser-processed. The heat of the laser melts the surface of the insulating substrate 111 to form valleys. Then, the melted portion rises in a mountain shape to form a jetty portion. The slope formed from the apex to the valley of the jetty is the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c.
Then, when cutting individual probes from the insulating substrate, they are cut in a substantially vertical direction along the valley bottom of this valley, so that the inclination angle of the third inclined portion 111a formed by this cut section is determined. It becomes larger with respect to the inclination angle of the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c.

［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
ポリエチレンテレフタレート (PET)シート（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を使用した。 [Example 1]
<Making a probe>
(1) Preparation of Insulating Substrate A polyethylene terephthalate (PET) sheet (Toray Industries, Inc. Lumirror R E20 # 188; 189 μm thickness) was used.

（２）凹部領域の形成
図４ｂに示す絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面にあたる部分の長手方向に沿って、上面図において略長方形の凹部領域112を形成した。
この実施例においては、レーザー加工により、凹部領域を形成した。波長９．３μｍ、出力１０Ｗ、連続波として発振するCO₂レーザーを用いた。
１２（ａ）に示すように、絶縁性基板111の上方よりレーザーを走査しながらレーザー照射する。レーザーは、絶縁性基板111の主面上の凹部領域を形成しようとする領域の外側の短手方向に所定の距離を離した２点それぞれに照射する。
１２（ｂ）に示すように、レーザーを照射すると、照射した部分は熱によって掘り下げられ、その両側には***した部分が形成される。
図１２（ｃ）に示すように、レーザーを更に照射すると、照射した部分はさらに掘り下げられ、その両側に形成された***部はさらに高く形成される。その結果、絶縁性基板111の主面には、４本の***部が形成される。このとき、形成された複数の***部のうち、前記凹部領域を形成しようとする領域を構成する少なくとも２本の***部を１組の突堤部とし、これら少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面とする。そして、この実施形態では並列する２本の突堤部1121と、それらに挟まれた領域である内底面1122とにより凹部領域112が形成される。
このようにして形成した凹部領域を上面から観察した顕微鏡像を図１８（ａ）に示す。併せて、凹部領域112の短手方向に走査して計測したプロファイルを図１８（ｂ）に示す。横軸はμｍ単位、縦軸はｎｍ単位で表示されている。 (2) Formation of Recessed Region A substantially rectangular recessed region 112 is formed in the top view along the longitudinal direction of the portion corresponding to the front surface of the tip of the sensing portion of the insulating substrate 111 shown in FIG. 4b.
In this example, a recessed region was formed by laser processing. A CO ₂ laser oscillating as a continuous wave with a wavelength of 9.3 μm and an output of 10 W was used.
As shown in 12 (a), the laser is irradiated while scanning the laser from above the insulating substrate 111. The laser irradiates each of two points separated by a predetermined distance in the lateral direction outside the region where the concave region on the main surface of the insulating substrate 111 is to be formed.
As shown in 12 (b), when the laser is irradiated, the irradiated portion is dug down by heat, and raised portions are formed on both sides thereof.
As shown in FIG. 12 (c), when the laser is further irradiated, the irradiated portion is further dug down, and the ridges formed on both sides thereof are formed higher. As a result, four raised portions are formed on the main surface of the insulating substrate 111. At this time, of the plurality of formed ridges, at least two ridges constituting the region for forming the recessed region were set as a set of jetties, and were sandwiched between the at least two jetties. The area of the main surface is the inner bottom surface. Then, in this embodiment, the recessed region 112 is formed by the two jetty portions 1121 that are parallel to each other and the inner bottom surface 1122 that is the region sandwiched between them.
A microscope image of the recessed region thus formed observed from above is shown in FIG. 18 (a). At the same time, FIG. 18B shows a profile measured by scanning the recessed region 112 in the lateral direction. The horizontal axis is displayed in μm units, and the vertical axis is displayed in nm units.

上記の観察から、凹部領域の長手方向の長さが約２５００μｍ、幅が２４０μｍの開口を有する凹部領域が形成されていることが確認された。
より詳細には、図１８（ｂ）のプロファイルから理解されるように、縦断面図において山状に***した突堤部の高さは約２０μｍである。
そして、凹部領域112は、頂点1121aと、頂点から内底面に向かって傾斜した第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bと、頂点から内底面とは反対の外側に向かって傾斜した第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cとを備えている。また、凹部領域112の第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cに連続して、第３の傾斜角度を有する第３の傾斜部111aを備えている。
第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_１）は約４０度であり、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_２）は約３０度であることが確認できる。第３の傾斜部111aの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_３）は、約８０度であることが確認できる。
したがって、本開示の製造方法により、縦断面において、第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度は第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度より大きく、第３の傾斜部111aの傾斜角度（図１５では１８０度−θ_３）は第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度よりも大きいプローブ先端を形成することができた。
このように、凹部領域112の突堤部の頂点1121aから突堤部の外側面を通って絶縁性基板の裏側の表面にかけて、傾斜角度が段階的に大きくなる形状となっている。 From the above observation, it was confirmed that a concave region having an opening having a length of about 2500 μm in the longitudinal direction and a width of 240 μm was formed.
More specifically, as can be seen from the profile of FIG. 18 (b), the height of the mountain-shaped raised jetty in the vertical cross section is about 20 μm.
The recessed region 112 includes a vertex 1121a, a first inclined portion (inwardly inclined portion) 1121b inclined from the apex toward the inner bottom surface, and a second inclined portion (inwardly inclined portion) 1121b inclined from the apex toward the outer side opposite to the inner bottom surface. It is equipped with an inclined portion (outward inclined portion) 1121c. Further, a third inclined portion 111a having a third inclined angle is provided continuously with the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c of the recessed region 112.
The inclination angle of the first inclined portion (inward inclined portion) 1121b (180 degrees −θ _{1 in} FIG. 15) is about 40 degrees, and the inclined angle of the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c (180 in FIG. 15). It can be confirmed that the degree −θ ₂ ) is about 30 degrees. It can be confirmed that the inclination angle of the third inclined portion 111a (180 degrees −θ _{3 in} FIG. 15) is about 80 degrees.
Therefore, according to the manufacturing method of the present disclosure, the inclination angle of the first inclined portion (inward inclined portion) 1121b is larger than the inclined angle of the second inclined portion (outward inclined portion) 1121c in the vertical cross section, and the third inclined portion is formed. The inclination angle of 111a (180 degrees −θ _{3 in} FIG. 15) was able to form a probe tip larger than the inclination angle of the second inclination (outward inclination) 1121c.
In this way, the inclination angle is gradually increased from the apex 1121a of the jetty portion of the recessed region 112 to the surface on the back side of the insulating substrate through the outer surface of the jetty portion.

比較のため、絶縁性基板111の表側の表面をレーザーにより掘り下げて形成した凹部領域を上面から観察した顕微鏡像を図１９（ａ）に示す。併せて、凹部領域112の短手方向に走査して計測したプロファイルを図１９（ｂ）に示す。横軸はμｍ単位、縦軸はｎｍ単位で表示されている。 For comparison, FIG. 19 (a) shows a microscope image of the concave region formed by digging the front surface of the insulating substrate 111 with a laser and observing from the upper surface. At the same time, FIG. 19B shows a profile measured by scanning the recessed region 112 in the lateral direction. The horizontal axis is displayed in μm units, and the vertical axis is displayed in nm units.

本実施形態の方法により形成した凹部領域の内底面の表面は、図１８（ｂ）に示すように平滑であり、一方、比較の実施形態の方法により形成した凹部領域の内底面の表面は、図１９（ｂ）に示すように非常に粗かった。 The surface of the inner bottom surface of the concave region formed by the method of the present embodiment is smooth as shown in FIG. 18 (b), while the surface of the inner bottom surface of the concave region formed by the method of the comparative embodiment is smooth. It was very coarse as shown in FIG. 19 (b).

（３）導電性薄膜の形成
図５ｃおよび図１３（ｄ）に示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。その結果、図１８（ａ）に示すように、前記凹部領域を上面から観察した顕微鏡象から、絶縁性基板111の上表面、形成された凹部領域の内壁および内底面を含めて全体に導電性薄膜が形成されたことが確認された。 (3) Formation of Conductive Thin Film As shown in FIGS. 5c and 13 (d), a conductive thin film (thickness 30 nm) is formed by depositing gold on both surfaces of the insulating substrate by a sputtering method. did. As a result, as shown in FIG. 18A, from the microscopic image of the recessed region observed from above, the entire surface including the upper surface of the insulating substrate 111, the inner wall and inner bottom surface of the formed recessed region is conductive as a whole. It was confirmed that a thin film was formed.

（４）電極リードの形成
図５ｄおよび図１３（ｅ）に示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。 (4) Formation of Electrode Lead As shown in FIGS. 5d and 13 (e), a groove having a depth reaching the surface of the insulating substrate is formed by drawing a laser on the conductive thin film formed on the front side of the insulating substrate. Then, the working electrode lead and the reference electrode lead were separated and electrically separated.

（５）絶縁膜の形成
図６ｅに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁膜（厚さ１０から２０ μm）をスクリーン印刷法により形成した。 (5) Formation of Insulating Film As shown in FIG. 6e, the working electrode and the reference electrode, and the working electrode terminal and the reference electrode terminal for electrical connection with the main body of the embedded biosensor are provided on the front side of the insulating substrate. An insulating film having an opening is formed by a screen printing method in a portion excluding the area to be used, and an opening is provided on the back side of the insulating substrate except for the counter electrode and the region excluding the counter electrode terminal for electrical connection with the main body. An insulating film (thickness 10 to 20 μm) was formed by a screen printing method.

（６）参照電極の形成
図６ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ１０から１５ μm）を形成した。 (6) Formation of Reference Electrode As shown in FIG. 6f, Ag / AgCl is deposited in the opening for the reference electrode of the insulating film formed on the front side of the insulating substrate by the screen printing method, and the reference electrode (from the thickness of 10). 15 μm) was formed.

（７）検知層の形成
図７ｇに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、その上に、炭素粒子懸濁液として、ケッチェンブラックEC600JD（ライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社）をテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（和光純薬株式会社）0.2%水溶液で2mg/mlになるように懸濁させた溶液を0.18μlをインクジェット装置（Labojet3000:マイクロジェット社製）塗布し乾燥させた。その後、レドックスメディエータである合成したPLL-Phと、検体応答性酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）（BBI international GDH GLD1）と、グルタルアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）の混合水溶液を0.12μlを同様にインクジェット装置により塗布し乾燥して二層構造の検知層119を形成した。 (7) Formation of detection layer As shown in FIG. 7g, a conductive thin film exposed from an opening of an insulating film formed on the front side of an insulating substrate is used as a working electrode, and a carbon particle suspension is formed on the conductive thin film. A 0.18 μl solution of Chen Black EC600JD (Lion Specialty Chemicals Co., Ltd.) suspended in a 0.2% aqueous solution of tetradecyltrimethylammonium bromide (Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) at a concentration of 2 mg / ml was added to an inkjet device (Labojet3000: (Made by Microjet) It was applied and dried. After that, a mixed aqueous solution of synthesized PLL-Ph, which is a redox mediator, glucose dehydrogenase (FAD-dependent) (BBI international GDH GLD1), which is a sample-responsive enzyme, and glutaraldehyde solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Similarly, 0.12 μl was applied by an inkjet device and dried to form a detection layer 119 having a two-layer structure.

（８）絶縁性基板用PETシートの裁断
図４〜７では、基板上での各構成要素の位置関係が明確になるように、鍵形状に裁断した基板に対して種々の構成要素を形成するように図示しているが、実際のプローブ作製に際しては、裁断前の絶縁性基板用PETシートに対して、複数のプローブパターンを形成した後、保護膜形成工程前に、加工された基板を鍵形状に裁断した。
この実施例において、レーザー加工によりPETシートの裁断を行った。 (8) Cutting of PET Sheet for Insulating Substrate In FIGS. 4 to 7, various constituent elements are formed on a substrate cut into a key shape so that the positional relationship of each component on the substrate is clarified. However, in the actual probe fabrication, the processed substrate is the key after forming a plurality of probe patterns on the PET sheet for the insulating substrate before cutting and before the protective film forming step. It was cut into a shape.
In this example, the PET sheet was cut by laser processing.

図１４（ｆ）および（ｇ）に示すように、複数のプローブパターンに対して各構成要素を形成した後、凹部領域の形成の際のレーザーの熱によって突堤部が形成された外周の谷部の谷底にレーザーを照射して、個々のプローブに裁断した。 As shown in FIGS. 14 (f) and 14 (g), after each component is formed for a plurality of probe patterns, the valley portion of the outer periphery where the jetty portion is formed by the heat of the laser during the formation of the concave region region. The bottom of the valley was irradiated with a laser and cut into individual probes.

図９におけるB-B’切断線での断面図に相当する、より具体的な絶縁性基板の縦断面図を図１５に示す。 FIG. 15 shows a more specific vertical cross-sectional view of the insulating substrate corresponding to the cross-sectional view taken along the B-B'cutting line in FIG.

（９）保護膜の形成
図７ｈおよび図１６に示すように、センシング部分を、架橋剤および保護膜用ポリマーを含むエタノール溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
より具体的には、Poly(tert-butyl methacrylate)-b-poly(4-vinyl pyridine)（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、Poly(styrene-co-4-vinylpyridine-co-oligo[propylene glycol methylether]methacrylate),random（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、Poly(ethylene glycol) diglycidyl ether（Sigma-Aldrich）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、緩衝液として、4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidを２００ｍMとエタノールを調製し、保護膜溶液に上記で作製したプローブを浸漬し、10分乾燥後に再度浸漬を15回繰返し、２４時間分以上乾燥をすることによって、架橋した保護膜を形成し、プローブAを得た。
保護膜が形成されたプローブ先端の短手方向の縦断面を図１７に示す。 (9) Formation of Protective Film As shown in FIGS. 7h and 16, the sensing portion is immersed in an ethanol solution containing a cross-linking agent and a polymer for a protective film, and protective films (thickness) are applied to both sides, side surfaces and end faces of the sensing portion. 5-40 μm) was formed.
More specifically, a solution prepared by dissolving Poly (tert-butylryl) -b-poly (4-vinyl pyridine) (General Science Corporation) in ethanol so as to be 10% (weight / volume), and Poly (styrene-co-4-vinylpyridine-co-oligo [propylene glycol methylether] methacrylate), random (General Science Corporation) dissolved in ethanol to 10% (weight / volume) and Poly A solution of (ethylene glycol) diglycidyl ether (Sigma-Aldrich) dissolved in ethanol to a concentration of 10% (weight / volume) and 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid as a buffer solution at 200 mM. Ethanol is prepared, the probe prepared above is immersed in a protective film solution, dried for 10 minutes, then immersed again 15 times, and dried for 24 hours or more to form a crosslinked protective film, and probe A is used. Obtained.
FIG. 17 shows a vertical cross section of the probe tip on which the protective film is formed in the lateral direction.

＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブAを３極式のポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）に取り付け、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、150、300、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。 <Measurement of probe characteristics>
[Glucose response characteristics]
Probe A was attached to a 3-pole potentiostat (BAS Co., Ltd.), and the probe was placed in phosphate buffered saline (PBS, pH 7) at 37 ° C. Glucose was added to this PBS solution at intervals of 50, 150, 300, and 500 mg / dL every 500 seconds, and the current response value (nA) was continuously measured.
At a glucose concentration of 0 to 500 mg / dL, high linearity was shown and glucose responsiveness was good.

［耐久性］
プローブAを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で保管した。保管１日目、３日目、８日目および１１日目に、プローブAを３極式のポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）に取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、150、300、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。１日目のグルコース濃度500 mg/dLでの電流応答値を100%として、各濃度での応答率 (%)を算出した。結果を表１にまとめた。 [durability]
Probe A was stored in phosphate buffered saline (PBS, pH 7) at 37 ° C. On the 1st, 3rd, 8th and 11th days of storage, probe A was attached to a 3-pole potentiostat (BAS Co., Ltd.) and placed in a phosphate buffered saline solution at 37 ° C. The probe was placed in PBS, pH 7). Glucose was added to this PBS solution at intervals of 50, 150, 300, and 500 mg / dL every 500 seconds, and the current response value (nA) was continuously measured. The response rate (%) at each concentration was calculated, assuming that the current response value at a glucose concentration of 500 mg / dL on the first day was 100%. The results are summarized in Table 1.

［比較例１］
実施例１において、絶縁性基板に凹部領域を形成しない以外は、実施例１と同様にして、プローブBを得た。
実施例１と同様にして、プローブBの耐久性を測定し、算出した結果を表１にまとめた。 [Comparative Example 1]
In Example 1, probe B was obtained in the same manner as in Example 1 except that a recessed region was not formed on the insulating substrate.
The durability of probe B was measured in the same manner as in Example 1, and the calculated results are summarized in Table 1.

プローブ先端付近に凹部領域を形成し、その中に作用電極を形成したプローブＡは、凹部領域を形成しない従来のプローブＢと比較して、応答性の低下が抑えられている。
したがって、本開示のように所定の形状の凹部領域内に検知層を形成するので、検知層に含まれる成分が保護膜内で移動して、プローブ外部に漏出することが抑制され、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が向上されたことが実証できた。 The probe A in which the concave region is formed near the tip of the probe and the working electrode is formed in the concave region is suppressed in the decrease in responsiveness as compared with the conventional probe B in which the concave region is not formed.
Therefore, since the detection layer is formed in the recessed region having a predetermined shape as in the present disclosure, it is suppressed that the components contained in the detection layer move in the protective film and leak to the outside of the probe, and as a result, It was demonstrated that the measurement durability of the biosensor was improved.

凹部領域内に検知層が、ほぼ平坦の厚みで設けられ、検知層表面からの保護膜の膜厚は十分に確保することができるので、検知層に含まれる試薬がプローブ外部に漏出することが防止される。さらに、凹部領域の開口部周囲に沿って上方に***する突堤部が形成されているので、検知層に含まれた試薬が絶縁性基板の上表面の高さまで達したとしても、水平方向に拡散することが防止される。 Since the detection layer is provided in the recessed region with a substantially flat thickness and the film thickness of the protective film from the surface of the detection layer can be sufficiently secured, the reagent contained in the detection layer may leak to the outside of the probe. Be prevented. Further, since a jetty portion that rises upward is formed along the periphery of the opening of the recessed region, even if the reagent contained in the detection layer reaches the height of the upper surface of the insulating substrate, it diffuses in the horizontal direction. Is prevented.

本開示の少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備えた膜構造体は、埋め込み型バイオセンサのプローブに有用である。 A membrane structure comprising a detection layer containing at least a sample-responsive enzyme and a redox mediator of the present disclosure and a protective film formed on the detection layer is useful as a probe for an implantable biosensor.

1 埋め込み型バイオセンサ
10 本体
11 プローブ
111 絶縁性基板
111a 傾斜部
112 凹部領域
1121 突堤部
1121a 頂点
1121b 内向傾斜部
1121c 外向傾斜部
1122 内底部
113 導電性薄膜
113a 作用電極リード
113b 参照電極リード
113c 対極リード
114 溝
115 作用電極
116 参照電極
117 絶縁膜
118 対極
119 検知層
120 保護膜
2 生体
3 情報通信機器 1 Implantable biosensor
10 body
11 probe
111 Insulating board
111a Inclined part
112 Recess area
1121 Jetty
1121a vertices
1121b Introverted slope
1121c Outward slope
1122 Inner bottom
113 Conductive thin film
113a Working electrode lead
113b Reference electrode lead
113c opposite pole lead
114 groove
115 Working electrode
116 Reference electrode
117 Insulation film
118 Opposite pole
119 Detection layer
120 protective film
2 Living body
3 Information and communication equipment

Claims (9)

バイオセンサ用のプローブであって、
主面を有する絶縁性基板と、
前記絶縁性基板の主面上の少なくとも一部に形成された導電性薄膜と、
導電性薄膜上の一部に規定された作用電極と、
前記作用電極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に規定された対極と、
前記作用電極または対極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に形成された参照電極と、
前記作用電極上に形成された検知層と、
前記作用電極、前記検知層、前記参照電極、および前記対極を被覆する生体性適合保護膜と、を備え、
前記作用電極が規定された絶縁性基板の主面の少なくとも一部に***した少なくとも２本の突堤部および、前記少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面として備える凹部領域が形成され、前記凹部領域の内底面上に前記導電性薄膜と検知層が形成されているプローブ。 A probe for biosensors
Insulating substrate with main surface and
A conductive thin film formed on at least a part of the main surface of the insulating substrate,
The working electrode specified on a part of the conductive thin film and
The counter electrode specified on a part of the conductive thin film other than the specified conductive thin film, and the working electrode
With a reference electrode formed on a part of the conductive thin film other than the conductive thin film in which the working electrode or the counter electrode is defined,
The detection layer formed on the working electrode and
The working electrode, the detection layer, the reference electrode, and a biocompatible protective film covering the counter electrode are provided.
A recessed region including at least two jetty portions raised on at least a part of the main surface of the insulating substrate in which the working electrode is defined and a region of the main surface sandwiched between the at least two jetty portions as an inner bottom surface. Is formed, and the conductive thin film and the detection layer are formed on the inner bottom surface of the recessed region. 前記２本の突堤部は、それぞれ、頂点と、頂点から内底面に向かって傾斜した第１の傾斜部（内向傾斜部）と、頂点から内底面とは反対の外側に向かって傾斜した第２の傾斜部（外向傾斜部）とを備え、第１の傾斜部の傾斜角度は、第２の傾斜部の傾斜角度よりも大きい、請求項１に記載のプローブ。 The two jetty portions are the apex, the first inclined portion (inwardly inclined portion) inclined from the apex toward the inner bottom surface, and the second inclined portion inclined from the apex toward the outer side opposite to the inner bottom surface, respectively. The probe according to claim 1, further comprising an inclined portion (outward inclined portion) of the above, wherein the inclination angle of the first inclined portion is larger than the inclined angle of the second inclined portion. 前記頂点から第２の傾斜部を経て、絶縁性基板の端面である第３の傾斜部が連続し、第３の傾斜部の傾斜角度は、第２の傾斜部の傾斜角度よりも大きい、請求項１または２に記載のプローブ。 The third inclined portion, which is the end face of the insulating substrate, is continuous from the apex through the second inclined portion, and the inclination angle of the third inclined portion is larger than the inclined angle of the second inclined portion. Item 2. The probe according to Item 1 or 2. 前記凹部領域のそれぞれの***部の第２の傾斜部は、***部の頂点から外側面にかけて、傾斜角度が段階的に大きくなる形状とした請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。 The probe according to any one of claims 1 to 3, wherein the second inclined portion of each raised portion of the recessed region has a shape in which the inclination angle gradually increases from the apex of the raised portion to the outer surface. .. 前記検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。 The probe according to any one of claims 1 to 4, wherein the detection layer contains at least a redox mediator and a sample-responsive enzyme. 前記検知層は、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。 The probe according to any one of claims 1 to 5, wherein the detection layer is a multilayer film composed of a mediator layer containing a redox mediator and an enzyme layer containing a sample-responsive enzyme. バイオセンサ用のプローブの製造方法であって、
プローブのベースとなる絶縁性基板の主表面の少なくとも一部に凹部領域を形成する工程；
前記絶縁性基板の少なくとも一部に導電性薄膜を形成する工程；
前記凹部領域の内底面に形成された導電性薄膜上に検知層を形成する工程；
前記絶縁性基板に形成された、異なる導電性薄膜上に、参照電極および対極を、それぞれ、形成する工程；ならびに、
前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む、プローブの製造方法。 A method for manufacturing a probe for a biosensor.
The step of forming a recessed region on at least a portion of the main surface of the insulating substrate that is the base of the probe;
A step of forming a conductive thin film on at least a part of the insulating substrate;
A step of forming a detection layer on a conductive thin film formed on the inner bottom surface of the recessed region;
A step of forming a reference electrode and a counter electrode on different conductive thin films formed on the insulating substrate, respectively;
A method for manufacturing a probe, which comprises a step of coating the reference electrode, the counter electrode and the detection layer with a biocompatible protective film. 前記凹部領域を形成する工程は、絶縁性基板の主面上の凹部領域を形成しようとする領域の外側の２点それぞれからレーザーを走査することによって、それぞれ***部を形成し、形成された複数の***部のうち、前記凹部領域を形成しようとする領域を構成する少なくとも２本の***部を１組の突堤部とし、これら少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面とする、請求項７に記載のプローブの製造方法。 In the step of forming the recessed region, a plurality of raised portions are formed by scanning a laser from each of two points outside the region where the recessed region is to be formed on the main surface of the insulating substrate. Of the raised portions of the above, at least two raised portions constituting the region for forming the concave region are defined as a set of jetty portions, and the region of the main surface sandwiched between these at least two jetty portions is the inner bottom surface. The method for manufacturing a probe according to claim 7. 前記レーザーはCO₂レーザーである請求項７または８に記載のプローブの製造方法。 The method for manufacturing a probe according to claim 7 or 8, wherein the laser is a CO ₂ laser.