JP2020156481A

JP2020156481A - Gene defects and mutant alk kinase in human solid tumors

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Publication number: JP2020156481A
Application number: JP2020068047A
Authority: JP
Inventors: リコヴァクラリーシャ; Rikova Klarisa; ハークハーバート; Haack Herbert; サリヴァンローラ; Sullivan Laura; グティンレイ; Gu Ting-Lei; ポッセマートアンソニー; Possemato Anthony; グオアイラン; Guo Ailan; マクニールジョーン; Macneil Joan; ユジャン; Yu Jan
Original assignee: Cell Signaling Technology Inc
Current assignee: Cell Signaling Technology Inc
Priority date: 2020-04-06
Filing date: 2020-04-06
Publication date: 2020-10-01
Also published as: JP2022184916A

Abstract

To provide a method of detecting the presence of a mutant anaplastic lymphoma kinase (ALK) polynucleotide in a biological sample obtained from a human non-small cell lung carcinoma (NSCLC) patient.SOLUTION: A method comprises detecting the presence, in a sample, of an ALK fusion polynucleotide encoding an ALK fusion polypeptide having ALK kinase activity and having a specific amino acid sequence, where the detection includes performing the polymerase chain reaction (PCR) using a pair of oligonucleotides hybridizing to the ALK portion of the ALK fusion polynucleotide.SELECTED DRAWING: Figure 1A

Description

（関連出願）
本出願は、現在審査中の、２００６年４月１４に出願された米国特許出願番号（ＵＳＳＮ）第６０／７９２，３６４号の優先権を主張し、その開示の全てを参照して本明細書に組み入れる。 (Related application)
This application claims the priority of U.S. Patent Application No. (USSN) No. 60 / 792,364, which is currently under review and filed on April 14, 2006, with reference to all of its disclosures herein. Incorporate into.

本発明は一般に、癌に含まれているタンパク質及び遺伝子、及び癌の検出、診断及び治療に関する。 The present invention generally relates to proteins and genes contained in cancer, and the detection, diagnosis and treatment of cancer.

多くの癌は、細胞過程の異常な制御、又は細胞の無制御の生育及び増殖をもたらす細胞シグナル伝達経路の障害によって特徴付けられる。これらの障害はしばしば、キナーゼのような、特定のシグナル伝達タンパク質の活性の変化に起因している。これらの癌の代表的なものは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような固形腫瘍である。ＮＳＣＬＣは米国における癌による死亡の主要な原因であって、全肺癌の約８７％を占めている。米国において年間約１５１，０００のＮＳＣＬＣの新症例があり、そして米国だけでもこの疾患によって年間１２０，０００人を超える患者が死亡すると予測されている。米国癌協会の「Cancer Facts and Figures 2005」を参照されたい。ＮＳＣＬＣは３つの異なったサブタイプを含んでいて、しばしば転移してからしか検出されないので、診断から２年以内の死亡率は７５％である。 Many cancers are characterized by abnormal regulation of cellular processes or impaired cell signaling pathways that lead to uncontrolled growth and proliferation of cells. These disorders are often due to altered activity of certain signaling proteins, such as kinases. Typical of these cancers are solid tumors such as non-small cell lung cancer (NSCLC). NSCLC is the leading cause of cancer death in the United States and accounts for about 87% of all lung cancers. There are about 151,000 new cases of NSCLC annually in the United States, and it is estimated that the disease alone will kill more than 120,000 patients annually in the United States alone. See "Cancer Facts and Figures 2005" by the American Association for Cancer Research. Mortality within 2 years of diagnosis is 75% because NSCLC contains three different subtypes and is often detected only after metastasis.

キナーゼ融合タンパク質に異常なシグナル伝達活性をもたらす遺伝子の欠失及び転座が幾つかの癌に直接つながり得るということはよく知られている。例えば、チロシンキナーゼ融合タンパク質である、ＢＣＲ−ＡＢＬ癌タンパク質はヒトの慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の原因物質であると言うことが直接立証されている。ＣＭＬ症例の少なくとも９０〜９５％に見出されているＢＣＲ−ＡＢＬ癌タンパク質は、いわゆるフィラデルフィア染色体を生成する、染色体９上のｃ−ＡＢＬタンパクチロシンキナーゼから染色体２２上のＢＣＲ配列への遺伝子配列の転座によって生成される。例えば、Kurzock et al., N. Engl. J. Med. 319:990-998（1988）を参照されたい。この転座は急性リンパ性白血病及びＮＳＣＬＣの症例においても観察される。 It is well known that deletions and translocations of genes that cause aberrant signaling activity in kinase fusion proteins can directly lead to some cancers. For example, the tyrosine kinase fusion protein, BCR-ABL cancer protein, has been directly demonstrated to be the causative agent of human chronic myelogenous leukemia (CML). The BCR-ABL cancer protein found in at least 90-95% of CML cases is the gene sequence from the c-ABL protein tyrosine kinase on chromosome 9 to the BCR sequence on chromosome 22 that produces the so-called Philadelphia chromosome. Produced by the translocation of. See, for example, Kurzock et al., N. Engl. J. Med. 319: 990-998 (1988). This translocation is also observed in cases of acute lymphocytic leukemia and NSCLC.

他の様々の癌に関連している突然変異体及び融合タンパク質をもたらす遺伝子の転座及び欠失が記述されている。例えば、Falini et al,. Blood 99(2):409-426 (2002) は、ＡＬＣＬ（未分化大細胞型リンパ腫 Anaplastic Large Cell Lymphoma ）に見られるＮＰＭ−ＡＬＫ融合を包含して、血液癌をもたらすことが知られている転座について概説している。今日まで、ノッチ３に関連するｔ（１５；１９）転座を含めて、限られた数の肺癌をもたらす遺伝子転座、欠失及び突然変異タンパク質のみが記述されている。Dang et al., J. Natl. Can. Instit. 92(16):1355-1357 (2000) を参照されたい。ＲＮＡ結合性タンパク質−６（ＥＭＬ−４）の発現及び／又は活性の欠失が、小細胞及び非小細胞の肺癌に見出されている。Drabkin et al., Oncogene 8(16):2589-97 (1999) を参照されたい。しかしながら今日まで、ヒトＮＳＣＬＣ癌におけるプロテインキナーゼに関する転座又は欠失については記述されていない。 Translocations and deletions of genes that result in mutants and fusion proteins associated with various other cancers have been described. For example, Falini et al ,. Blood 99 (2): 409-426 (2002) results in hematologic cancer, including the NPM-ALK fusion found in ALCL (Anaplastic Large Cell Lymphoma). It outlines the known translocations. To date, only gene translocations, deletions and mutated proteins that result in a limited number of lung cancers have been described, including the t (15; 19) translocation associated with Notch 3. See Dang et al., J. Natl. Can. Instit. 92 (16): 1355-1357 (2000). Deletions of expression and / or activity of RNA-binding protein-6 (EML-4) have been found in small and non-small cell lung cancer. See Drabkin et al., Oncogene 8 (16): 2589-97 (1999). However, to date, no translocation or deletion of protein kinases in human NSCLC cancer has been described.

大細胞未分化リンパ腫におけるＮＰＭのＡＬＫへの融合に起因するＡＬＫキナーゼ発現の欠失については記述されている。Morris et al., 1994; Shiota et al., 1994 を参照されたい。モエシン、非筋ミオシン重鎖９（Tort et al., 2001）、クラスリン重鎖（Touriol et al., 2000; Bridge et al., 2001）、トロポミオシン３（ＴＰＭ３）（Lamant et al., 2000; Bridge et al., 2001）、ＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＧＦ）（Hernandez et al., Am. J. Path. 160(4):1487-1493 (2002)）及び他の遺伝子へのＡＬＫの融合について述べられている。特に、ＴＧＦ−ＡＬＫ融合は非固形リンパ腫について報告されているが、今日まで固形腫瘍におけるこの融合については述べられていない。癌におけるＡＬＫの一般的な役割については述べられている。Pulford et al., J. Cell Physiol. 199(3):330-358 (2004) を参照されたい。しかしながら今日まで、ＥＭＬ−４の発現及び／又は活性化の欠失については記述されていない。 Deletions in ALK kinase expression due to fusion of NPM to ALK in anaplastic large cell lymphoma have been described. See Morris et al., 1994; Shiota et al., 1994. Moesin, non-muscle myosin heavy chain 9 (Tort et al., 2001), clathrin heavy chain (Touriol et al., 2000; Bridge et al., 2001), tropomyosin 3 (TPM3) (Lamant et al., 2000; Bridge et al., 2001), TRK-fusion gene (TGF) (Hernandez et al., Am. J. Path. 160 (4): 1487-1493 (2002)) and description of fusion of ALK to other genes Has been done. In particular, the TGF-ALK fusion has been reported for non-solid lymphoma, but to date this fusion in solid tumors has not been described. The general role of ALK in cancer has been described. See Pulford et al., J. Cell Physiol. 199 (3): 330-358 (2004). However, to date, no description has been made of deletions in EML-4 expression and / or activation.

ヒトの癌における突然変異を同定することは、それがそのような融合又は突然変異タンパク質を標的とする新規な治療法の開発、及びそのような遺伝子突然変異を有する患者を同定する新規な診断法をもたらすことができるので非常に望ましい。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬは、白血病を治療するための治療標的になってきている。最近、ＡＢＬキナーゼの低分子阻害剤である、グリーベック（登録商標）（Ｇｌｅｅｖｅｃ；メシル酸イマチニブ；Imatinib mesylate；ＳＴＩ−５７１）がＣＭＬの治療薬として承認された。この薬剤は、ガン細胞の生育を促進するシグナル伝達経路を妨害するようにデザインされた新しい分類の抗増殖剤の第１号である。この薬剤の開発は、ＣＭＬ及びＡＬＬの従来の治療法である、化学療法及び照射療法（これらはよく知られている副作用によって悩まされ、そして悪性腫瘍の根本原因を特異的に標的とすることができないためしばしば限られた効果のみを有している）を越える有意義な進歩を示している。同様に、グリーベック（登録商標）のような標的の阻害剤に対して最も応答可能性がある患者を同定するために、患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質を特異的に検出する試薬及び方法が記述されている。 Identifying mutations in human cancer is the development of novel therapies that target such fusion or mutated proteins, and novel diagnostic methods to identify patients with such gene mutations. Is highly desirable as it can bring about. For example, BCR-ABL has become a therapeutic target for treating leukemia. Recently, a small molecule inhibitor of ABL kinase, Gleevec® (Imatinib mesylate; STI-571), has been approved for the treatment of CML. This drug is the first in a new class of antiproliferative agents designed to interfere with signaling pathways that promote the growth of cancer cells. The development of this drug is the traditional treatment of CML and ALL, chemotherapy and irradiation therapy, which are plagued by well-known side effects and can specifically target the root cause of malignancies. It shows significant progress beyond (often having only limited effects because it cannot). Similarly, reagents and methods for specifically detecting BCR-ABL fusion proteins in patients are described to identify patients who are most likely to respond to targeted inhibitors such as Gleevec®. Has been done.

従って、ヒトの癌、特にＮＳＣＬＣのような肺癌を包含する固形腫瘍の進展に関わる融合又は突然変異のタンパク質をもたらす転座若しくは欠失ような、新規な遺伝子突然変異体の同定、及びそのような融合タンパク質の検討及び検出のための試薬及び方法が必要とされている。とりわけ、そのような融合タンパク質の同定は、標的治療のために患者を選択するための、更にそのような突然変異／融合タンパク質を阻害する新規な薬剤をスクリーニングするための新規な方法を望ましく可能とするであろう。 Thus, identification of novel gene mutants, such as translocations or deletions that result in fusion or mutation proteins involved in the development of solid tumors, including human cancers, especially lung cancers such as NSCLC, and such. There is a need for reagents and methods for the study and detection of fusion proteins. Among other things, the identification of such fusion proteins makes it desirable to enable new methods for selecting patients for targeted therapy and for screening new agents that further inhibit such mutations / fusion proteins. Will do.

（発明の要約）
本発明に従い、ヒト染色体２で生ずる、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の部分が二次タンパク質と結合している融合タンパク質をもたらす新規の遺伝子の欠失変異が、ヒト固形腫瘍である非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）中で同定された。ＡＬＫ融合に関わる二次タンパク質は微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ−４）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）を包含している。突然変異／融合ＡＬＫキナーゼは現在、非小細胞肺癌患者の試料中で観察されている。 (Summary of invention)
According to the present invention, a novel gene deletion mutation that results in a fusion protein in which the anaplastic lymphoma kinase (ALK) portion is bound to a secondary protein that occurs on human chromosome 2 is a human solid tumor, non-small cell lung cancer. Identified in (NSCLC). Secondary proteins involved in ALK fusion include microtubule-associated protein-like 4 (EML-4) and TRK-fusion gene (TFG). Mutant / fused ALK kinase is currently being observed in samples from patients with non-small cell lung cancer.

従って本発明は、１つには、開示した突然変異／融合ＡＬＫポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド及びベクター、これらを検出するプローブ及びアッセイ、単離された突然変異／融合ＡＬＫポリペプチド、組み換え突然変異ポリペプチド、及び突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド及びポリペプチドを検出する試薬を提供する。開示する、これらの新規な変異ＡＬＫキナーゼ及び転座／欠失の同定は、生体試料における変異ＡＬＫポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を判定する新規な方法、突然変異キナーゼタンパク質を阻害する化合物をスクリーニングする方法、及び突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現によって特徴付けられる癌の進展を阻害する方法を可能として、これらもまた本発明により提供される。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（４３）に関する。
（１）（ａ）配列番号１又は配列番号１８のアミノ酸配列を含有している微小管結合タンパク質様４／未分化リンパ腫キナーゼ（Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4/Anaplastic Lymphoma Kinase; ＥＭＬ４−ＡＬＫ）融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、そのヌクレオチド配列は配列番号２又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含有している；
（ｃ）ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−２３３又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ＥＭＬ−４のＮ−末端ヌクレオチド配列（配列番号４の１−７００ヌクレオチド又は配列番号４の１−１４８６ヌクレオチド）及びＡＬＫのキナーゼドメインヌクレオチド配列（配列番号６の３３４８−４１４９ヌクレオチド）を含有しているヌクレオチド配列；
（ｅ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの融合接合部（配列番号２の７００−７０１ヌクレオチド又は配列番号１９の１４８６−１４８７ヌクレオチド）を包含するする少なくとも６つの隣接ヌクレオチドを含有しているヌクレオチド配列；
（ｆ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のヌクレオチド配列の何れかと相同性があるヌクレオチド配列：
よりなる群から選ばれる配列と少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含有している、単離されたポリヌクレオチド。
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記（１）に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、当該ハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＡ残基のみ又はＴ残基のみを含有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、単離されたポリヌクレオチド。
（３）当該ポリヌクレオチドが更に検出可能な標識を含有している、前記（２）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（４）前記（１）に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入することを含有してなる、組み換えベクターを形成する方法。
（５）前記（４）に記載の方法で作成された組み換えベクター。
（６）前記（５）に記載の組み換えベクターを宿主細胞に導入することを含有してなる、組み換え宿主細胞を作成する方法。
（７）前記（６）に記載の方法で形成された組み換え宿主細胞。
（８）当該方法がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現に適している条件下で、前記（７）に記載の組み換え宿主細胞を培養し、そして当該ポリペプチドを回収することを含有してなる、組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫポリペプチドを作成する方法。
（９）（ａ）配列番号１又は配列番号１８のアミノ酸配列を含有している、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−２３３又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有している、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列；及び
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするアミノ酸配列：
よりなる群から選ばれる配列に少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含有している、単離されたポリペプチド。
（１０）前記（５）に記載の組み換えベクター又は前記（７）に記載の組み換え宿主細胞を用いて作成された組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫポリペプチド。
（１１）前記（９）に記載のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的に結合するか又はこれを検出するが、野生型のＥＭＬ−４又は野生型のＡＬＫの何れとも結合しないか又はこれを検出しない、単離された試薬。
（１２）当該試薬が抗体又は重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドである、前記（１１）に記載の単離された試薬。
（１３）当該試薬がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブ又は蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブである、前記（１１）に記載の単離された試薬。
（１４）当該ペプチドがＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部又は野生型ＡＬＫの切断点のアミノ酸配列を含有している、前記（１２）に記載の重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチド。
（１５）当該方法が工程：
（ａ）哺乳類の癌から生体試料を得ること；及び
（ｂ）融合ポリヌクレオチド、又はＡＬＫの部分と二次タンパク質の部分を含有している、そのコードされた融合ポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて、ＡＬＫ突然変異ポリヌクレオチド及び／又はそのコードされた突然変異ＡＬＫポリペプチドが当該生体試料中に存在するか否かを判定すること：
を含有してなる、哺乳類の癌から得られる生体試料における、突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド又はそれがコードする突然変異ＡＬＫポリペプチドの存在を検出する方法。
（１６）当該癌が固形腫瘍、肉腫又は癌腫である、前記（１５）に記載の方法。
（１７）当該癌腫が肺癌である、前記（１６）に記載の方法。
（１８）当該肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、前記（１７）に記載の方法。
（１９）当該突然変異ＡＬＫポリペプチドが、ＡＬＫ（配列番号５）の残基１１１６−１３８３と当該二次タンパク質の部分を含有している融合ポリペプチドである、前記（１５）に記載の方法。
（２０）当該二次タンパク質が、ＥＭＬ−４（配列番号３）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）タンパク質（配列番号２２）よりなる群から選ばれる、前記（１５）又は（１６）に記載の方法。
（２１）当該融合ポリペプチドがＥＭＬ−４（配列番号３）の残基１−２３３又は残基１−４９５、又はＴＦＧ（配列番号２２）の残基１−１３８を含有している、前記（２０）に記載の方法。
（２２）当該融合ポリヌクレオチドが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２又は１９）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２１）を含有している、前記（１５）に記載の方法。
（２３）当該融合ポリペプチドが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号１又は１８）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号２０）を含有している、前記（１５）に記載の方法。
（２４）当該融合ポリヌクレオチドが、前記（１）に記載の融合ポリヌクレオチドである、前記（１５）に記載の方法。
（２５）当該融合ポリペプドが、前記（９）に記載の融合ポリペプドである、前記（１５）に記載の方法。
（２６）当該試薬が、前記（１）に記載のポリヌクレオチド及び／又は前記（１１）に記載の少なくとも１つの試薬を含有している、前記（１５）に記載の方法。
（２７）当該試薬が、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号２０）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２１）と特異的に結合するか又はこれを検出するが、野生型のＴＦＧ又は野生型のＡＬＫの何れとも結合しないか又は検出しない単離された試薬を含有している、前記（１５）に記載の方法。
（２８）当該試薬が抗体又は重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドである、前記（２７）に記載の方法。
（２９）当該試薬がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブ又は蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブである、前記（２７）に記載の方法。
（３０）当該重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドがＴＧＦ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部又は野生型ＡＬＫの切断点のアミノ酸配列を含有している、前記（２８）に記載の方法。
（３１）当該方法が、フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、又は免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイ形式で実施される、前記（１５）に記載の方法。
（３２）当該方法が、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のアッセイ形式で実施される、前記（１５）に記載の方法。
（３３）当該ＡＬＫ融合ポリペプチドの活性を検出する、前記（１５）に記載の方法。
（３４）当該方法が、当該癌におけるＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を当該化合物が阻害するか否かを判定する工程を含有してなる、化合物がＡＬＫ融合ポリペプチドの発現を特徴としている哺乳類の固形腫瘍の進展を阻害するか否かを判定する方法。
（３５）当該ＡＬＫ融合ポリペプチドが、ＡＬＫ（配列番号５）の残基１１１６−１３８３と当該二次タンパク質の部分を含有している、前記（３４）に記載の方法。
（３６）当該二次タンパク質が、ＥＭＬ−４（配列番号３）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）タンパク質（配列番号２２）よりなる群から選ばれる、前記（３４）に記載の方法。
（３７）当該融合ポリペプチドがＥＭＬ−４（配列番号３）の残基１−２３３又は残基１−４９５、又はＴＦＧ（配列番号２２）の残基１−１３８を含有している、前記（３６）に記載の方法。
（３８）当該ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性の阻害が、前記（１）に記載のポリヌクレオチドを検出する少なくとも１つの試薬及び／又は前記（１１）に記載の少なくとも１つの試薬及び／又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて判定される、前記（３４）に記載の方法。
（３９）当該方法が、当該癌における当該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する工程を含有してなる、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する癌の進展を阻害する方法。
（４０）当該方法が、当該癌における当該ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する工程を含有してなる、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する固形腫瘍の進展を阻害する方法。
（４１）当該癌又は当該固形腫瘍が肺癌である、前記（３９）又は（４０）に記載の方法。
（４２）当該肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、前記（４１）に記載の方法。
（４３）当該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は当該ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性が、ＷＨＩ−１３１及び／又はＷＨＩ−１５４、又はその類縁体を含有している組成物で阻害される、前記（３９）又は（４０）に記載の方法。
本発明の態様及び実施態様を以下により詳細に記載する。 Thus, the invention is, in part, isolated polynucleotides and vectors encoding the disclosed mutant / fused ALK polypeptides, probes and assays to detect them, isolated mutant / fused ALK polypeptides. , Recombinant mutant polypeptide, and mutant ALK polynucleotides and reagents for detecting the polypeptide. The disclosure of these novel mutant ALK kinases and translocations / deletions is a novel method for determining the presence of mutant ALK polynucleotides or polypeptides in biological samples, screening for compounds that inhibit the mutant kinase protein. These are also provided by the present invention, enabling methods and methods of inhibiting the development of cancer characterized by the expression of mutant ALK polynucleotides or polypeptides.
That is, the present invention relates to the following (1) to (43).
(1) (a) Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4 / Anaplastic Lymphoma Kinase (EML4-ALK) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 18. A nucleotide sequence encoding a fusion polypeptide;
(B) A nucleotide sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide, the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 19;
(C) The N-terminal amino acid sequence of EML-4 (residue 1-233 of SEQ ID NO: 3 or residue 1-495 of SEQ ID NO: 3) and the kinase domain of ALK (residue 1116-1383 of SEQ ID NO: 5). Nucleotide sequence encoding the EML4-ALK fusion polypeptide contained;
(D) Contains the N-terminal nucleotide sequence of EML-4 (1-700 nucleotides of SEQ ID NO: 4 or 1-1486 nucleotides of SEQ ID NO: 4) and the kinase domain nucleotide sequence of ALK (3348-4149 nucleotides of SEQ ID NO: 6). Nucleotide sequence;
(E) A nucleotide sequence containing at least 6 adjacent nucleotides comprising a fusion junction of an EML4-ALK fusion polynucleotide (700-701 nucleotides of SEQ ID NO: 2 or 1486-1487 nucleotides of SEQ ID NO: 19);
(F) A polypeptide containing at least 6 adjacent amino acids comprising a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide (residue 233-234 of SEQ ID NO: 1 or residue 495-996 of SEQ ID NO: 18). Encoding nucleotide sequence; and nucleotide sequence homologous to any of the nucleotide sequences of (g) (a) to (f):
An isolated polynucleotide containing a nucleotide sequence having at least 95% homology to a sequence selected from the group consisting of.
(2) An isolated polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide according to (1) above under stringent hybridization conditions, and the hybridizing isolated polynucleotide is stringent hybridization. An isolated polynucleotide that does not hybridize to a nucleotide having a nucleotide sequence containing only A or T residues under conditions.
(3) The isolated polynucleotide according to (2) above, wherein the polynucleotide further contains a detectable label.
(4) A method for forming a recombinant vector, which comprises inserting the isolated nucleic acid molecule according to (1) above into a vector.
(5) A recombinant vector prepared by the method according to (4) above.
(6) A method for producing a recombinant host cell, which comprises introducing the recombinant vector according to (5) above into a host cell.
(7) A recombinant host cell formed by the method according to (6) above.
(8) The method comprises culturing the recombinant host cell according to (7) above and recovering the polypeptide under conditions suitable for expression of the EML4-ALK fusion polypeptide. A method for making a recombinant EML4-ALK fusion polypeptide or a cleaved active ALK polypeptide.
(9) (a) Amino acid sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 18;
(B) The N-terminal amino acid sequence of EML-4 (residue 1-233 of SEQ ID NO: 3 or residue 1-495 of SEQ ID NO: 3) and the kinase domain of ALK (residue 1116-1383 of SEQ ID NO: 5). The amino acid sequence encoding the EML4-ALK fusion polypeptide contained; and (c) the fusion junction of the EML4-ALK fusion polypeptide (residue 233-234 of SEQ ID NO: 1 or residue 495 of SEQ ID NO: 18). Amino acid sequence encoding a polypeptide containing at least 6 adjacent amino acids, including 496):
An isolated polypeptide containing an amino acid sequence having at least 95% homology to a sequence selected from the group consisting of.
(10) A recombinant EML4-ALK fusion polypeptide or a cleaved active ALK polypeptide prepared using the recombinant vector according to (5) above or the recombinant host cell according to (7) above.
(11) It specifically binds to or detects the EML4-ALK fusion polypeptide according to (9) above, but does not bind to or binds to either wild-type EML-4 or wild-type ALK. An isolated reagent that is not detected.
(12) The isolated reagent according to (11) above, wherein the reagent is an antibody or a heavy isotope-labeled (AQUA) peptide.
(13) The isolated reagent according to (11) above, wherein the reagent is a polymerase chain reaction (PCR) probe or a fluorescence in situ hybridization (FISH) probe.
(14) The heavy isotope-labeled (AQUA) peptide according to (12) above, wherein the peptide contains an amino acid sequence at a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide or a cut point of a wild-type ALK.
(15) The method is a process:
(A) Obtaining a biological sample from mammalian cancer; and (b) at least one detecting a fused polynucleotide or its encoded fusion polypeptide containing a portion of ALK and a portion of secondary protein. Using a reagent to determine if an ALK mutant polynucleotide and / or its encoded mutant ALK polypeptide is present in the biological sample:
A method for detecting the presence of a mutated ALK polynucleotide or a mutated ALK polypeptide encoded by the mutant ALK polynucleotide in a biological sample obtained from a mammalian cancer.
(16) The method according to (15) above, wherein the cancer is a solid tumor, sarcoma or carcinoma.
(17) The method according to (16) above, wherein the carcinoma is lung cancer.
(18) The method according to (17) above, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).
(19) The method according to (15) above, wherein the mutant ALK polypeptide is a fusion polypeptide containing residues 11116-1383 of ALK (SEQ ID NO: 5) and a portion of the secondary protein.
(20) The method according to (15) or (16) above, wherein the secondary protein is selected from the group consisting of EML-4 (SEQ ID NO: 3) and TRK-fusion gene (TFG) protein (SEQ ID NO: 22). ..
(21) The fusion polypeptide contains residue 1-233 or residue 1-495 of EML-4 (SEQ ID NO: 3), or residue 1-138 of TFG (SEQ ID NO: 22). 20) The method according to.
(22) The method according to (15) above, wherein the fusion polynucleotide contains an EML4-ALK fusion polynucleotide (SEQ ID NO: 2 or 19) or a TFG-ALK fusion polynucleotide (SEQ ID NO: 21).
(23) The method according to (15) above, wherein the fusion polypeptide contains an EML4-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 1 or 18) or a TFG-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 20).
(24) The method according to (15) above, wherein the fusion polynucleotide is the fusion polynucleotide according to (1) above.
(25) The method according to (15) above, wherein the fusion polypept is the fusion polypept according to (9) above.
(26) The method according to (15) above, wherein the reagent contains the polynucleotide according to (1) above and / or at least one reagent according to (11) above.
(27) The reagent specifically binds to or detects a TFG-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 20) or TFG-ALK fusion polynucleotide (SEQ ID NO: 21), but wild-type TFG or wild. The method according to (15) above, which contains an isolated reagent that does not bind to or detect any of the types of ALK.
(28) The method according to (27) above, wherein the reagent is an antibody or a heavy isotope labeled (AQUA) peptide.
(29) The method according to (27) above, wherein the reagent is a polymerase chain reaction (PCR) probe or a fluorescence in situ hybridization (FISH) probe.
(30) The method according to (28) above, wherein the heavy isotope-labeled (AQUA) peptide contains an amino acid sequence at a fusion junction of a TGF-ALK fusion polypeptide or a cut point of a wild-type ALK.
(31) The method according to (15) above, wherein the method is performed in an assay format of flow cytometry (FC), immunohistochemical examination (IHC), or immunofluorescence (IF).
(32) The method according to (15) above, wherein the method is carried out in the assay format of fluorescence in situ hybridization (FISH) or polymerase chain reaction (PCR).
(33) The method according to (15) above, which detects the activity of the ALK fusion polypeptide.
(34) The method comprises the step of determining whether the compound inhibits the expression and / or activity of the ALK fusion polypeptide in the cancer, wherein the compound is characterized by the expression of the ALK fusion polypeptide. A method of determining whether or not to inhibit the development of solid tumors in mammals.
(35) The method according to (34) above, wherein the ALK fusion polypeptide contains residues 11116-1383 of ALK (SEQ ID NO: 5) and a portion of the secondary protein.
(36) The method according to (34) above, wherein the secondary protein is selected from the group consisting of EML-4 (SEQ ID NO: 3) and TRK-fusion gene (TFG) protein (SEQ ID NO: 22).
(37) The fusion polypeptide contains residues 1-233 or 1-495 of EML-4 (SEQ ID NO: 3), or residues 1-138 of TFG (SEQ ID NO: 22). 36).
(38) Inhibition of expression and / or activity of the ALK fusion polypeptide is at least one reagent and / or at least one reagent according to (11) above that detects the polynucleotide according to (1) above. Or the method according to (34) above, which is determined using at least one reagent for detecting a TFG-ALK fusion polynucleotide or polypeptide.
(39) A method for inhibiting the progression of a cancer expressing an EML4-ALK fusion polypeptide, wherein the method comprises a step of inhibiting the expression and / or activity of the EML4-ALK fusion polypeptide in the cancer.
(40) A method for inhibiting the development of a solid tumor expressing a TFG-ALK fusion polypeptide, wherein the method comprises a step of inhibiting the expression and / or activity of the TFG-ALK fusion polypeptide in the cancer. ..
(41) The method according to (39) or (40) above, wherein the cancer or the solid tumor is lung cancer.
(42) The method according to (41) above, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).
(43) The expression and / or activity of the EML4-ALK fusion polypeptide or the TFG-ALK fusion polypeptide is inhibited by a composition containing WHI-131 and / or WHI-154 or an analog thereof. The method according to (39) or (40) above.
Aspects and embodiments of the present invention will be described in more detail below.

図１Ａは、染色体２上のＥＭＬ−４遺伝子及びＡＬＫ遺伝子の位置（上の図）、及び全長ＥＭＬ−４及びＡＬＫタンパク質のドメイン位置、更にはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い変異体）のドメイン位置（下の図）を示し；融合接合部がアミノ酸２３３−２３４に生じ、そして融合タンパク質がＡＬＫのキナーゼドメイン（膜貫通及び細胞外ではないドメイン）を含んでいる。ＥＭＬ４エクソン６／イントロン６／ＡＬＫエクソン２０融合接合部領域のＤＮＡ（及びタンパク質）配列（それぞれ、配列番号７及び配列番号８）も示している（下の図）。FIG. 1A shows the positions of the EML-4 and ALK genes on chromosome 2 (above), the full-length EML-4 and ALK protein domain positions, and the EML4-ALK fusion protein (short variant) domain position. (Figure below); a fusion junction occurs at amino acids 233-234, and the fusion protein contains the kinase domain of ALK (transmembrane and non-cellular domains). The DNA (and protein) sequences of the EML4 exon 6 / intron 6 / ALK exon 20 fusion junction region (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively) are also shown (figure below). 図１Ｂは、染色体２上のＥＭＬ−４遺伝子及びＡＬＫ遺伝子の位置（上の図）、及び全長ＥＭＬ−４及びＡＬＫタンパク質のドメイン位置、更にはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（長い変異体）のドメイン位置（下の図）を示し；融合接合部がアミノ酸４９５−４９６に生じ、そして融合タンパク質がＡＬＫのキナーゼドメイン（膜貫通及び細胞外ではないドメイン）を含んでいる。ＥＭＬ４エクソン１３／ＡＬＫエクソン２０融合接合部領域のＤＮＡ（及びタンパク質）配列（それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５）も示している（下の図）。FIG. 1B shows the positions of the EML-4 and ALK genes on chromosome 2 (above), the full-length EML-4 and ALK protein domain positions, and the EML4-ALK fusion protein (long variant) domain position. (Figure below); fusion junctions occur at amino acids 495-496, and fusion proteins contain the kinase domain of ALK (transmembrane and non-cellular domains). The DNA (and protein) sequences of the EML4 exon 13 / ALK exon 20 fusion junction region (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25, respectively) are also shown (figure below). 図１Ｃは、染色体６上のＴＦＧ遺伝子及び染色体２上のＡＬＫ遺伝子の位置（上の図）、及び全長ＴＦＧ及びＡＬＫタンパク質のドメイン位置、更にはＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質のドメイン位置（下の図）を示し；融合接合部がアミノ酸１３８−１３９に生じ、そして融合タンパク質がＡＬＫのキナーゼドメイン（膜貫通及び細胞外ではないドメイン）を含んでいる。ＴＦＧエクソン３／ＡＬＫエクソン２０融合接合部領域のＤＮＡ（及びタンパク質）配列（それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７）も示している（下の図）。FIG. 1C shows the positions of the TFG gene on chromosome 6 and the ALK gene on chromosome 2 (upper figure), the domain positions of the full-length TFG and ALK proteins, and the domain positions of the TFG-ALK fusion protein (lower figure). The fusion junction occurs at amino acids 138-139, and the fusion protein contains the kinase domain of ALK (transmembrane and non-cellular domains). The DNA (and protein) sequences of the TFG exon 3 / ALK exon 20 fusion junction region (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, respectively) are also shown (figure below). 図２Ａは、ヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い変異体）のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号１）（上の図）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号２）（下の図）も示している。ＥＭＬ−４部分の残基はイタリック体であり、一方、ＡＬＫのキナーゼドメインはボールド体である。FIG. 2A is an amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 1) (upper figure) of a human EML4-ALK fusion protein (short mutant), which encodes a DNA sequence (SEQ ID NO: 2) (lower figure). ) Is also shown. The residue of the EML-4 moiety is italic, while the kinase domain of ALK is bold. 図２Ｂは、ヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（長い変異体）のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号１８）（上の図）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号１９）（下の図）も示している。ＥＭＬ−４部分の残基はイタリック体であり、一方、ＡＬＫのキナーゼドメインはボールド体である。FIG. 2B shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 18) (upper figure) of the human EML4-ALK fusion protein (long mutant), and the encoding DNA sequence (SEQ ID NO: 19) (lower figure). ) Is also shown. The residue of the EML-4 moiety is italic, while the kinase domain of ALK is bold. 図２Ｂは、ヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（長い変異体）のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号１８）（上の図）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号１９）（下の図）も示している。ＥＭＬ−４部分の残基はイタリック体であり、一方、ＡＬＫのキナーゼドメインはボールド体である。FIG. 2B is an amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 18) (upper figure) of a human EML4-ALK fusion protein (long mutant), which encodes a DNA sequence (SEQ ID NO: 19) (lower figure). ) Is also shown. The residue of the EML-4 moiety is italic, while the kinase domain of ALK is bold. 図２Ｃは、ヒトＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号２０）（上の図）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号２１）（下の図）も示している。ＴＦＧ部分の残基はイタリック体であり、一方、ＡＬＫのキナーゼドメインはボールド体である。FIG. 2C shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 20) (upper figure) of the human TFG-ALK fusion protein, and also shows the encoding DNA sequence (SEQ ID NO: 21) (lower figure). .. The residue of the TFG moiety is italic, while the kinase domain of ALK is bold. 図３Ａ−３Ｂは、ヒトＥＭＬ−４タンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号３）（SwissProt Accession No.061936）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号４）（GeneBank Accession No.NM019063）も示している。欠失変異体の短い変異体に保持されている残基は下線付きで、一方、長い変異体に保存されている残基はイタリック体である。FIG. 3A-3B is an amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 3) (SwissProt Accession No.061936) of the human EML-4 protein, which encodes a DNA sequence (SEQ ID NO: 4) (GeneBank Accession No. NM019063). ) Is also shown. The residues retained in the short mutant of the deleted mutant are underlined, while the residues conserved in the long mutant are italic. 図３Ａ−３Ｂは、ヒトＥＭＬ−４タンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号３）（SwissProt Accession No.061936）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号４）（GeneBank Accession No.NM019063）も示している。欠失変異体の短い変異体に保持されている残基は下線付きで、一方、長い変異体に保存されている残基はイタリック体である。3A-3B is the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 3) (SwissProt Accession No.061936) of the human EML-4 protein, which encodes the DNA sequence (SEQ ID NO: 4) (GeneBank Accession No. NM019063). ) Is also shown. The residues retained in the short mutant of the deleted mutant are underlined, while the residues conserved in the long mutant are italic. 図３Ａ−３Ｂは、ヒトＥＭＬ−４タンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号３）（SwissProt Accession No.061936）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号４）（GeneBank Accession No.NM019063）も示している。欠失変異体の短い変異体に保持されている残基は下線付きで、一方、長い変異体に保存されている残基はイタリック体である。3A-3B is the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 3) (SwissProt Accession No.061936) of the human EML-4 protein, which encodes the DNA sequence (SEQ ID NO: 4) (GeneBank Accession No. NM019063). ) Is also shown. The residues retained in the short mutant of the deleted mutant are underlined, while the residues conserved in the long mutant are italic. 図４Ａ−４Ｂは、ヒトＡＬＫキナーゼのアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号５）（SwissProt Accession No.Q9UM73）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号６）（GeneBank Accession No.HSU66559）も示している。欠失変異体に保持されている残基は下線付きで、一方、キナーゼドメインの残基はボールド体である。FIG. 4A-4B shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 5) (SwissProt Accession No. Q9UM73) of human ALK kinase, which also encodes the DNA sequence (SEQ ID NO: 6) (GeneBank Accession No. HSU66559). Shown. The residues retained in the deletion mutant are underlined, while the residues in the kinase domain are bold. 図４Ａ−４Ｂは、ヒトＡＬＫキナーゼのアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号５）（SwissProt Accession No.Q9UM73）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号６）（GeneBank Accession No.HSU66559）も示している。欠失変異体に保持されている残基は下線付きで、一方、キナーゼドメインの残基はボールド体である。FIG. 4A-4B shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 5) (SwissProt Accession No. Q9UM73) of human ALK kinase, which also encodes the DNA sequence (SEQ ID NO: 6) (GeneBank Accession No. HSU66559). Shown. The residues retained in the deletion mutant are underlined, while the residues in the kinase domain are bold. 図４Ａ−４Ｂは、ヒトＡＬＫキナーゼのアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号５）（SwissProt Accession No.Q9UM73）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号６）（GeneBank Accession No.HSU66559）も示している。欠失変異体に保持されている残基は下線付きで、一方、キナーゼドメインの残基はボールド体である。FIG. 4A-4B shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 5) (SwissProt Accession No. Q9UM73) of human ALK kinase, which also encodes the DNA sequence (SEQ ID NO: 6) (GeneBank Accession No. HSU66559). Shown. The residues retained in the deletion mutant are underlined, while the residues in the kinase domain are bold. 図４Ｃ−４Ｄは、ヒトＴＦＧタンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号２２）（SwissProt Accession No.Q92734）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号２３）（GeneBank Accession No.NM006070）も示している。欠失変異体に保持されている残基は下線付きである。FIG. 4C-4D shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 22) (SwissProt Accession No. Q92734) of the human TFG protein, and also the encoding DNA sequence (SEQ ID NO: 23) (GeneBank Accession No. NM006070). Shown. The residues retained in the deletion mutant are underlined. 図４Ｃ−４Ｄは、ヒトＴＦＧタンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号２２）（SwissProt Accession No.Q92734）であって、コードするＤＮＡ配列（配列番号２３）（GeneBank Accession No.NM006070）も示している。欠失変異体に保持されている残基は下線付きである。FIG. 4C-4D shows the amino acid sequence (1 character code) (SEQ ID NO: 22) (SwissProt Accession No. Q92734) of the human TFG protein, and also the encoding DNA sequence (SEQ ID NO: 23) (GeneBank Accession No. NM006070). Shown. The residues retained in the deletion mutant are underlined. 図５は、（Ａ）ＰＣＲの第２ラウンド後のＡＬＫプライマーでの５’ＲＡＣＥ生成によるＡＬＫの検出；ＵＡＰは、ユニバーサル増幅プライマー（Universal Amplification Primer）を示し、ＧＳＰは遺伝子特異的プライマー（Gene Specific Primer）を示す、（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲによるＥＭＬ−４及びＡＬＫ欠失変異体によって形成された融合遺伝子の検出、を表しているゲルである。FIG. 5 shows (A) detection of ALK by 5'RACE generation with ALK primers after the second round of PCR; UAP shows Universal Amplification Primer and GSP is Gene Specific. Primer), which represents (B) detection of fusion genes formed by EML-4 and ALK-deficient variants by RT-PCR. 図５は、（Ｃ）５’ＲＡＣＥによるヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子（短い変異体及び長い変異体）の検出、そして（Ｄ）５’ＲＡＣＥによるヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料中のＴＦＧ−ＡＬＫ融合遺伝子の検出、を表しているゲルである。FIG. 5 shows (C) detection of the EML4-ALK fusion gene (short and long mutants) in a human NSCLC tumor sample by 5'RACE, and (D) TFG- in a human NSCLC tumor sample by 5'RACE. A gel representing the detection of an ALK fusion gene. 図６は、ＡＬＫ遺伝子の切断点２ｐ２３の両側にプローブを含有している、２色（橙色／緑色）分解プローブを用いるＦＩＳＨアッセイによるＨ２２２８細胞中のＥＭＬ−４及びＡＬＫの転座によって形成された融合遺伝子の検出を表している画像であって；プローブの大きさ及び位置が上の図に示されている。FIG. 6 was formed by translocation of EML-4 and ALK in H2228 cells by FISH assay using bicolor (orange / green) degradation probes containing probes on both sides of the ALK gene cleavage point 2p23. An image showing the detection of a fusion gene; the size and position of the probe is shown in the figure above.

（発明の詳細な説明）
本発明により、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の部分が二次タンパク質の部分と結合している突然変異融合タンパク質をもたらす従来知られていない遺伝子の欠失及び転座が、ヒト固形腫瘍である非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）中で同定された。発見されたＡＬＫ融合に関わる二次タンパク質は微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ−４）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）を包含している。 (Detailed description of the invention)
According to the present invention, deletions and translocations of previously unknown genes that result in mutated fusion proteins in which the anaplastic lymphoma kinase (ALK) portion is bound to the secondary protein portion are non-human solid tumors. It was identified in small cell lung cancer (NSCLC). The discovered secondary proteins involved in ALK fusion include microtubule-associated protein-like 4 (EML-4) and TRK-fusion gene (TFG).

ＥＭＬ４と染色体２上のＡＬＫ遺伝子の間に生じる本開示の二つの欠失は、４０１のアミノ酸の微小管結合タンパク質であるＥＭＬ−４のＮ−末端が、１６２０のアミノ酸の膜チロシンキナーゼであるキナーゼドメイン及びＡＬＫのＣ−末端と結合する融合タンパク質を産生する。それぞれ７９６のアミノ酸（短い変異体）及び１０５９のアミノ酸（長い変異体）であって、ＡＬＫキナーゼ活性を保持している、生じたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質が、ＮＳＣＬＣを包含するヒト固形腫瘍サブセットの増殖及び生存を促進すると考えられる。 The two deletions of the present disclosure that occur between EML4 and the ALK gene on chromosome 2 are those in which the N-terminus of EML-4, a microtubule binding protein of 401 amino acids, is a membrane tyrosine kinase of 1620 amino acids. It produces a fusion protein that binds to the domain and the C-terminus of ALK. The resulting EML4-ALK fusion protein, which is 796 amino acids (short mutants) and 1059 amino acids (long mutants), respectively and retains ALK kinase activity, proliferates a human solid tumor subset, including NSCLC. And is thought to promote survival.

染色体６上のＴＦＧ遺伝子と染色体２上のＡＬＫ遺伝子の間に生じる本開示の転座は、４００のアミノ酸タンパク質であるＴＦＧのＮ−末端が、１６２０のアミノ酸の膜チロシンキナーゼであるキナーゼドメイン及びＡＬＫのＣ−末端と結合する融合タンパク質を産生する。得られるＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質は、７０１のアミノ酸であり、非固形ヒトリンパ腫で以前に観察されている（Hernadez et al. (2002)、supra.）が、固形腫瘍については未だ記述されていない。ＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質はＡＬＫキナーゼ活性を保持しており、そしてＮＳＣＬＣを包含するヒト固形腫瘍のサブセットの増殖及び生存を促進することが考えられる。 The translocations of the present disclosure that occur between the TFG gene on chromosome 6 and the ALK gene on chromosome 2 are the kinase domain and ALK in which the N-terminus of TFG, a 400 amino acid protein, is a membrane tyrosine kinase of 1620 amino acids. Produces a fusion protein that binds to the C-terminus of. The resulting TFG-ALK fusion protein is an amino acid of 701 and has been previously observed in non-solid human lymphoma (Hernadez et al. (2002), supra.), But has not yet been described for solid tumors. The TFG-ALK fusion protein retains ALK kinase activity and is thought to promote the growth and survival of a subset of human solid tumors, including NSCLC.

ノッチ３に関するｔ（１５；１９）転座（Dang et al., supra.）を含む、異常な融合タンパク質をもたらす幾つかの遺伝子転座又は欠失が、ＮＳＣＬＣにおいて述べられているが、本開示のＥＭＬ４−ＡＬＫの欠失変異体及び融合タンパク質は新規である。同様に、ＴＦＧ−ＡＬＫの転座変異体及び融合タンパク質は、リンパ腫のような非固形腫瘍においては知られているが、固形腫瘍であるＮＳＣＬにおいては新規である。ＥＭＬ−４は、殆どのヒト組織中で発現される微小管関連タンパク質である。現在まで、ＥＭＬ−４の発現及び／又は活性の欠陥については報告されていない。ＡＬＫは膜チロシンキナーゼであって、ヒトにおいては、脳及びＣＮＳ組織、さらに小腸及び睾丸においても発現されるが、正常なリンパ細胞では発現されない。これは神経系の正常な発達及び機能において重要な役割を果たしている（Iwahara et al., 1997）。 Several gene translocations or deletions that result in aberrant fusion proteins, including the t (15; 19) translocation for Notch 3 (Dang et al., Supra.), Have been described in NSCLC, but are disclosed herein. EML4-ALK deletion mutants and fusion proteins are novel. Similarly, translocation variants and fusion proteins of TFG-ALK are known in non-solid tumors such as lymphoma, but novel in the solid tumor NSCL. EML-4 is a microtubule-related protein expressed in most human tissues. To date, no defects in EML-4 expression and / or activity have been reported. ALK is a membrane tyrosine kinase that is expressed in humans in the brain and CNS tissues, as well as in the small intestine and testis, but not in normal lymphocytes. It plays an important role in the normal development and function of the nervous system (Iwahara et al., 1997).

ＡＬＫの発現及び／又は活性の異常は大細胞型未分化リンパ腫及び神経芽細胞腫において見出されている（Morris et al., 1994, Osajima-Hakomori et al., 2005 を参照されたい）。モエシン、非筋ミオシン重鎖９、クラスリン重鎖、トロポミシン３（ＴＰＭ３）、ＴＲＫ融合遺伝子（ＴＦＧ）、及び他の遺伝子へのＡＬＫの融合が記述されている。Tort et al.; Tourio et al., Hernadez et al., supra.を参照されたい。興味深いことに、開示されているＥＭＬ−４のＡＬＫ（短い変異体）への融合は、他のＡＬＫ融合突然変異体について既に記載されているように、野生型ＡＬＫ（アミノ酸１０５８個）と正確に同じ位置で生じる。 Abnormal ALK expression and / or activity have been found in large cell anaplastic lymphomas and neuroblastomas (see Morris et al., 1994, Osajima-Hakomori et al., 2005). Fusion of ALK to moesin, non-muscle myosin heavy chain 9, clathrin heavy chain, tropomicin 3 (TPM3), TRK fusion gene (TFG), and other genes has been described. See Tort et al .; Tourio et al., Hernadez et al., Supra. Interestingly, the disclosed fusion of EML-4 to ALK (short variant) is exactly as wild-type ALK (1058 amino acids), as already described for other ALK fusion mutants. Occurs in the same position.

以下に更に詳細に述べるように、ＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失変異体及び発現された融合タンパク質が単離され、配列決定され、融合タンパク質を発現するｃＤＮＡが産生される。従って、本発明は、一つには、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドへハイブリダイズする核酸プローブ、及び組み換えの突然変異ＡＬＫポリペプチドを産生するためのそのようなポリヌクレオチドを利用するための方法、ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明は、一つには、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含んでいる単離されたポリペプチド、組み換えの突然変異ポリペプチド、及びＥＭＬ４−ＡＬＫの融合ポリペプチドと特異的に結合及び／又はこれを検出するが、野生型のＥＭＬ−４又は野生型のＡＬＫの何れとも結合又はこれを検出しない単離された試薬も提供する。以下に更に詳細に述べている、本発明のこれらの態様は、とりわけ、突然変異ＡＬＫキナーゼの発現／活性によって促進される癌のメカニズムの更なる研究、固形腫瘍（例えば、肺癌を包含する癌腫及び肉腫）及び開示のＡＬＫ欠失及び転座変異及び／又は融合タンパク質によって特徴付けられる他の癌の同定、及び以下に更に記載するような本発明の方法の実施において有用であろう。 As described in more detail below, the EML4-ALK-deficient mutant and the expressed fusion protein are isolated, sequenced, and a cDNA expressing the fusion protein is produced. Thus, the invention, in part, produces isolated polynucleotides encoding EML4-ALK fusion polypeptides, nucleic acid probes that hybridize to such polynucleotides, and recombinant mutant ALK polypeptides. Methods, vectors and host cells for utilizing such polynucleotides for use are provided. The present invention is, in part, specific to an isolated polypeptide comprising an amino acid sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide, a recombinant mutant polypeptide, and an EML4-ALK fusion polypeptide. Also provided is an isolated reagent that binds to and / or detects it, but does not bind to or detect either wild-type EML-4 or wild-type ALK. These aspects of the invention, described in more detail below, are among other things, further studies of cancer mechanisms promoted by the expression / activity of mutant ALK kinase, solid tumors (eg, carcinomas including lung cancers and cancers and cancers). Sarcoma) and other cancers characterized by ALK deletions and translocation mutations and / or fusion proteins in the disclosure, and in the practice of the methods of the invention as further described below.

新規なＡＬＫキナーゼの突然変異体及び遺伝子の欠失及び転座変異は、これらの融合タンパク質の１つ又はそれ以上により特徴付けられる、ＮＳＣＬＣのような、固形腫瘍の潜在的診断及び治療において重要な意味を有している。例えば、ＮＳＣＬＣは多くの場合に、それが転移した後にしか検出されないので、診断２年以内の死亡率は７５％である。従って、ＮＳＣＬＣを引き起こす遺伝子突然変異を有している患者をできるだけ早く同定することが非常に望ましい。 Deletions and gene deletions and translocation mutations of novel ALK kinase are important in the potential diagnosis and treatment of solid tumors, such as NSCLC, characterized by one or more of these fusion proteins. It has meaning. For example, NSCLC is often detected only after it has metastasized, so the mortality rate within 2 years of diagnosis is 75%. Therefore, it is highly desirable to identify patients with gene mutations that cause NSCLC as soon as possible.

従って、固形腫瘍（ＮＳＣＬＣ）の増殖及び生存を促進すると考えられる、遺伝子欠失によってもたらされるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い又は長い変異体）及び遺伝子転座によってもたらされるＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質の発見は、肺癌（ＮＳＣＬＣのような）を含む哺乳類の固形腫瘍を、更にはＡＬＫ融合タンパク質（ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫのような）が発現される他の癌を的確に同定する重要な新規な方法を可能にする。これらの癌は、ＷＨＩ−１３１又はＷＨＩ−１５４のような、突然変異ＡＬＫタンパク質のキナーゼ活性の阻害剤に応答する可能性が最も高い。突然変異ＡＬＫタンパク質キナーゼによって促進される癌をできるだけ早く同定することは、どの療法又は併用療法が特定の患者に対して最も適しているかを臨床的に判断するのに大いに役立ち、実際には癌を促進する主要なシグナル伝達分子ではない、他のキナーゼを標的とする阻害剤の処方を避けることに役立つであろう。 Therefore, the discovery of EML4-ALK fusion proteins (short or long variants) resulting from gene deletion and TFG-ALK fusion proteins resulting from gene translocations, which are thought to promote the growth and survival of solid tumors (NSCLC), is An important novel method for accurately identifying solid mammalian solid tumors, including lung cancer (such as NSCLC), and other cancers in which ALK fusion proteins (such as EML4-ALK or TFG-ALK) are expressed. To enable. These cancers are most likely to respond to inhibitors of the kinase activity of the mutant ALK protein, such as WHI-131 or WHI-154. Identifying cancers promoted by mutant ALK protein kinases as soon as possible can be very helpful in clinically determining which therapy or combination therapy is best suited for a particular patient, and in fact cancers. It will help avoid the formulation of inhibitors that target other kinases that are not the major signaling molecules that promote.

従って、本発明は、一つには、癌におけるＡＬＫ突然変異ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドの存在を、本発明の融合特異的及び突然変異体特異的な試薬を用いて検出する方法を提供する。そのような方法は、例えば、タンパク質のＡＬＫキナーゼ活性の阻害剤に応答すると思われる、ＮＳＣＬＣのような、固形腫瘍を同定するために実施することができる。本発明は、一つには、ある化合物がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドによって特徴付けられる癌の進展を阻害するか否かを判定する方法も提供する。更に、突然変異ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害することによって、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する固形腫瘍の進展を阻害する方法が本発明によって提供される。そのような方法を以下に詳細に記述する。 Accordingly, the invention provides, in part, a method of detecting the presence of ALK mutant polynucleotides and / or fusion polypeptides in cancer using the fusion-specific and mutant-specific reagents of the invention. To do. Such methods can be performed to identify solid tumors, such as NSCLC, which appear to respond, for example, to inhibitors of the protein's ALK kinase activity. The invention also provides, in part, a method of determining whether a compound inhibits the progression of cancer characterized by an EML4-ALK fusion polypeptide. Furthermore, the present invention provides a method of inhibiting the development of a solid tumor expressing an EML4-ALK fusion polypeptide or a TFG-ALK fusion polypeptide by inhibiting the expression and / or activity of the mutant polypeptide. Such a method is described in detail below.

本発明の更なる態様、利益及び具体的態様は以下により詳細に記述されている。本明細書で引用する全ての文献はその全てを参照して本明細書に取り込まれる。 Further aspects, benefits and specific embodiments of the present invention are described in more detail below. All references cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

（定義）
本明細書では、以下の用語は表記の意味を有している。
「抗体」（複数を含む）は、Ｆ_ａｂ又はその抗原認識断片を包含し、キメラ、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を包含する、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含んでいる全てのタイプの免疫グロブリンを示す。本明細書では、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力を保持しながら、ヒト抗体により酷似するように、非抗原結合領域のアミノ酸を置き換えた抗体を示す。 (Definition)
In the present specification, the following terms have the meaning of notation.
"Antibodies" (s) include all types of immunoglobulins, including IgG, IgM, IgA, and IgE, including _Fabs or antigen recognition fragments thereof, including chimeric, polyclonal and monoclonal antibodies. Shown. As used herein, the term "humanized antibody" refers to an antibody in which the amino acids in the non-antigen binding region have been replaced so as to closely resemble a human antibody while retaining its original binding capacity.

用語「生物学的に活性な」は、天然に存在する分子の構造的、調節的、又は生化学的機能を有しているタンパク質を示す。同様に、「免疫学的に活性な」は、天然、組み換え、又は合成のＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド、又はそれらのオリゴペプチドの、しかるべき動物又は細胞に特異的な免疫応答を誘発して特異抗体と結合する能力を示す。 The term "biologically active" refers to a protein that has a structural, regulatory, or biochemical function of a naturally occurring molecule. Similarly, "immunologically active" provides an appropriate animal or cell-specific immune response of a natural, recombinant, or synthetic EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide, or oligopeptides thereof. Shows the ability to induce and bind to specific antibodies.

用語「生体試料」は、その広い意味で用いられて、ＡＬＫ融合のポリヌクレオチド又はポリペプチド又はその断片（ＥＭＬ４−ＡＬＫ及びＴＦＧ−ＡＬＫの融合ポリヌクレオチド及びポリペプチドを包含する）を含有していることが推測される何れかの生体試料を意味し、そして細胞、細胞から単離された染色体（例えば、***中期染色体の核酸）、ゲノムＤＮＡ（溶液中又はサウザン分析用のように固体支持体に結合して）、ＲＮＡ（溶液中又はノーザン分析用のように固体支持体に結合して）、ｃＤＮＡ（溶液中又は固体支持体に結合して）、細胞からの抽出物、血液、尿、骨髄、又は組織などを含有していてよい。 The term "biological sample" is used in its broad sense and contains ALK fusion polynucleotides or polypeptides or fragments thereof (including fusion polynucleotides and polypeptides of EML4-ALK and TFG-ALK). Means any biological sample that is presumed to be, and in cells, chromosomes isolated from cells (eg, nucleic acids of mid-mitotic chromosomes), genomic DNA (in solution or on solid supports for Southern analysis, etc.) (Binding), RNA (binding to solid support in solution or for Northern analysis), cDNA (binding to solid support in solution or), extract from cells, blood, urine, bone marrow , Or tissue or the like may be contained.

癌及び突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する「によって特徴付けられる」は、遺伝子の欠失又は転座及び／又は発現されたＡＬＫに関するポリペプチドが、そのような遺伝子欠失及び／又は融合ポリペプチドが存在していない癌と比べて、存在している癌を示す。突然変異ポリペプチドの存在が、全部又は一部において、そのような癌の生育又は生存を促進する可能性がある。 "Characterized by" for cancer and mutant ALK polynucleotides and polypeptides is a gene deletion or translocation and / or a polypeptide for expressed ALK such a gene deletion and / or fusion polypeptide. Indicates a cancer that is present as compared to a cancer that is not present. The presence of mutant polypeptides, in whole or in part, may promote the growth or survival of such cancers.

「コンセンサス配列」は、不要な塩基を削除するめに再配列されている、又はＸＬ−ＰＣＲ（登録商標、Perkin Elmer, Norwalk, Conn.)を用いて５’及び／又は３’方向に延伸されて再配列されている、又はＧＥＬＶＩＥＷ（登録商標）のフラグメントアセンブリーシステム（GCG, Madison, Wis.）を用いて２つ以上のインサイトクローンの重複配列で構築されている、又は延伸され構築されている、核酸配列を示す。 The "consensus sequence" has been rearranged to remove unwanted bases or stretched in the 5'and / or 3'directions using XL-PCR (registered trademark, Perkin Elmer, Norwalk, Conn.). Rearranged or constructed with duplicate sequences of two or more Insight clones using the GELVIEW® fragment assembly system (GCG, Madison, Wis.), Or stretched and constructed. The nucleic acid sequence is shown.

「ＡＬＫキナーゼ阻害療法剤」は、野生型又は切断型のＡＬＫキナーゼの発現又は活性を、単独で及び／又は融合タンパク質（ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質のような）の一部として、直接的又は間接的の何れかで阻害する、１つ又はそれ以上の化学的又は生物学的な化合物を含有している何れかの組成物を意味する。 An "ALK kinase inhibitor" is an expression or activity of wild or truncated ALK kinase alone and / or as part of a fusion protein (such as an EML4-ALK fusion protein or a TFG-ALK fusion protein). , A composition that contains one or more chemical or biological compounds that inhibit either directly or indirectly.

「誘導体化」は、開示した融合ポリヌクレオチドをコードする核酸配列又はコードされたポリペプチド自体の化学修飾を示す。そのような修飾の例はアルキル基、アシル基、又はアミノ基による水素の置換であるだろう。核酸誘導体は天然の分子の必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードするであろう。 "Derivatization" refers to a nucleic acid sequence encoding a disclosed fusion polynucleotide or a chemical modification of the encoded polypeptide itself. An example of such a modification would be the substitution of hydrogen with an alkyl group, an acyl group, or an amino group. Nucleic acid derivatives will encode polypeptides that retain the essential biological properties of the natural molecule.

本明細書に開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は試薬に関する「検出可能な標識」は、これに限定されないが、蛍光、質量、残基、染色、放射性同位体、標識、又はタグ修飾等を包含し、これによって目的の分子の存在を検出できる、化学的、生物学的又は他の修飾を意味する。 "Detectable labels" for a polypeptide, polynucleotide, or reagent disclosed herein include, but are not limited to, fluorescence, mass, residues, stains, radioisotopes, labels, or tag modifications. It means a chemical, biological or other modification that can include and thereby detect the presence of the molecule of interest.

生体試料中のＡＬＫ融合ポリペプチドに関する「発現」又は「発現された」は、この融合ポリペプチドが有意に発現されない対照試料と比べて、有意に発現されることを意味する。 "Expression" or "expressed" for an ALK fusion polypeptide in a biological sample means that the fusion polypeptide is significantly expressed as compared to a control sample in which it is not significantly expressed.

「重同位体標識化ペプチド」（ＡＱＵＡペプチドと同義語で用いられる）は、少なくとも１つの重同位体標識を含んでいるペプチドを意味し、これは、更に以下で検討する、国際公開ＷＯ第０３／０１６８６１号公報、「多段階質量分析よるタンパク質及びその修飾形態の絶対的定量化」（Gygi et al.) に記載されているような、タンパク質の絶対的定量化又は検出に適している。そのようなＡＱＵＡペプチドに関する、用語「特異的に検出する」は、ペプチドが、ＡＱＵＡペプチド配列を含有しているポリペプチド及びタンパク質のみを検出及び定量化して、ＡＱＵＡペプチド配列を含有していないポリペプチド及びタンパク質を実質的に検出しないであろうことを意味する。 "High isotope-labeled peptide" (used synonymously with AQUA peptide) means a peptide containing at least one heavy isotope label, which will be discussed further below, WO 03. / 016661, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms by Multi-Step Mass Spectrometry" (Gygi et al.), Suitable for absolute quantification or detection of proteins. With respect to such AQUA peptides, the term "specifically detected" is a polypeptide that does not contain an AQUA peptide sequence by detecting and quantifying only polypeptides and proteins in which the peptide contains an AQUA peptide sequence. And means that the protein will not be detected substantially.

「単離された」（又は「実質的に精製された」）は、それらの天然環境から取り出され、単離又は分離された核酸又はアミノ酸配列を示す。これらは好ましくは、これらが天然で結合していた他の成分を、少なくとも６０％、より好ましくは７５％、そして最も好ましくは９０％又はそれ以上含んでいない。 "Isolated" (or "substantially purified") refers to a nucleic acid or amino acid sequence taken from their natural environment and isolated or isolated. They preferably do not contain at least 60%, more preferably 75%, and most preferably 90% or more of the other components they were naturally bound to.

「模倣物質」は、その構造がＡＬＫ融合ポリペプチド又はそのタンパク質の構造的認識から生じていて、タンパク質様分子に関する転座の作用の幾つか又は全てに影響を与え得るような、分子を示す。 "Mimicking" refers to a molecule whose structure results from the structural recognition of the ALK fusion polypeptide or protein thereof and can affect some or all of the translocation effects on the protein-like molecule.

「突然変異ＡＬＫ］又は「融合」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書に記載されているような、ＡＬＫ及び二次タンパク質（例えば、ＥＭＬ−４又はＴＦＧ）を含有している融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。 A "mutated ALK" or "fusion" polynucleotide or polypeptide is a fusion polynucleotide or polypeptide containing an ALK and a secondary protein (eg, EML-4 or TFG), as described herein. Means a polypeptide.

「ポリヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド配列」）は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びそれらの断片又は部分、及び一本鎖又は二本鎖で、センス又はアンチセンス鎖を表してもよい、ゲノム又は合成由来のＤＮＡ又はＲＮＡを示す。 A "polynucleotide" (or "nucleotide sequence") is an oligonucleotide, a nucleotide or a polynucleotide, and a fragment or portion thereof, and a single or double strand, which may represent a sense or antisense strand, a genome. Alternatively, it indicates synthetically derived DNA or RNA.

「ポリペプチド」（又は「アミノ酸配列」）は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列、及びそれらの断片又は部分を示し、そして天然の又は合成の分子を示す。ここで、「アミノ酸配列」が本明細書で天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を示すように述べられているときは、「アミノ酸配列」及び、「ポリペプチド」又は「タンパク質」のような同様な用語は、アミノ酸配列を、述べられているタンパク質分子に関連する完全な、元のアミノ酸配列に限定することを意味していない。 A "polypeptide" (or "amino acid sequence") refers to an oligopeptide, peptide, polypeptide, or protein sequence, and a fragment or portion thereof, and indicates a natural or synthetic molecule. Here, when "amino acid sequence" is described herein to indicate the amino acid sequence of a natural protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms such as "polypeptide" or "protein". Does not mean limiting the amino acid sequence to the complete, original amino acid sequence associated with the protein molecule described.

「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド」は、何れかの種、特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好ましくはヒトを包含する哺乳類から、天然、合成、半合成、又は組み換えか何れかの起源から得られる、本明細書に記載のような、実質的に精製されているＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失変異遺伝子の産物又は融合ポリヌクレオチド（短い又は長い変異体）の核酸配列を示す。 The "EML4-ALK fusion polynucleotide" is of either natural, synthetic, semi-synthetic, or recombinant origin from any species, particularly mammals including cows, sheep, pigs, rats, horses and preferably humans. The nucleic acid sequences of substantially purified EML4-ALK deletion mutant genes or fusion polynucleotides (short or long variants), as described herein, are shown.

「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド」は、何れかの種、特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好ましくはヒトを包含する哺乳類から、天然、合成、半合成、又は組み換えの何れかの起源から得られる、本明細書に記載の、実質的に精製されているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド（短い又は長い変異体）のアミノ酸配列を示す。 The "EML4-ALK fusion polypeptide" is of either natural, synthetic, semi-synthetic, or recombinant origin from any species, particularly mammals, including bovine, sheep, pig, rat, horse and preferably human. The amino acid sequence of the substantially purified EML4-ALK fusion polypeptide (short or long variant) described herein, obtained from.

「ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド」は、何れかの種、特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好ましくはヒトを包含する哺乳類から、天然、合成、半合成、又は組み換えの何れかの起源から得られる、本明細書に記載のような、実質的に精製されているＴＦＧ−ＡＬＫの転座変異遺伝子の産物又は融合ポリヌクレオチドの核酸配列を示す。 A "TFG-ALK fusion polynucleotide" is of either natural, synthetic, semi-synthetic, or recombinant origin from any species, particularly mammals, including bovines, sheep, pigs, rats, horses and preferably humans. The nucleic acid sequence of the product or fusion polynucleotide of the translocation mutant gene of TFG-ALK that is substantially purified, as described herein, is shown.

「ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド」は、何れかの種、特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好ましくはヒトを包含する哺乳類から、天然、合成、半合成、又は組み換えの何れかの起源から得られる、本明細書に記載の、実質的に精製されているＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 The "TFG-ALK fusion polypeptide" is of either natural, synthetic, semi-synthetic, or recombinant origin from any species, particularly mammals including bovine, sheep, pig, rat, horse and preferably human. The amino acid sequence of the substantially purified TFG-ALK fusion polypeptide described herein, obtained from.

抗体とタンパク質又はペプチドとの相互作用に関する用語「に特異的に結合する」（又は「特異的な結合」又は「特異結合」）は、相互作用がタンパク質上の特定な構造（すなわち、抗原決定基又はエピトープ）によって決まること；言い換えると、抗体は一般のタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合するということを意味している。特異的であるもの以外の配列又は抗原決定基への抗体の結合に関する用語「結合しない」は、抗体が特異的な抗原決定基又は配列への抗体の結合と比べて、実質的に反応しないことを意味する。 The term "specifically binds" (or "specific binding" or "specific binding") to the interaction of an antibody with a protein or peptide means that the interaction has a specific structure on the protein (ie, an antigenic determinant). Or an epitope); in other words, it means that an antibody recognizes and binds to a specific protein structure rather than a general protein. The term "non-binding" with respect to the binding of an antibody to a sequence or antigenic determinant other than the specific one means that the antibody does not react substantially as compared to the binding of the antibody to a specific antigenic determinant or sequence. Means.

配列又はプローブのハイブリダイゼーション条件に関する用語「ストリンジェントな条件」は、約Ｔ_ｍマイナス５℃（プローブ又は配列の融解温度（Ｔ_ｍ）より５℃低い）からＴ_ｍより約２０℃〜２５℃低いまでの範囲以内を生ずる「厳しさ」である。典型的なストリンジェント条件は次の通りである；５０％のホルムアミド、５倍のＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍のデンハーズ溶液（Denhardt's solution）、１０％のデキストラン硫酸、及び２０マイクログラム／ｍｌの変性、せん断サケ***ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃にて１晩培養してから、約６５℃で濾液を０．１倍のＳＳＣ中で洗浄する。当業者によって理解されるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件を、相同な又は関連するポリヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために改変できる。 The term "stringent condition" for sequence or probe hybridization conditions is about T _m minus 5 ° C (5 ° C lower than the melting temperature (T _m ) of the probe or sequence) to about 20 ° C to 25 ° C lower than T _m. It is the "severity" that occurs within the range of. Typical stringent conditions are: 50% formamide, 5-fold SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5-fold denaturation. After culturing overnight at 42 ° C. in a solution containing Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 micrograms / ml of denatured, sheared salmon sperm DNA, the filtrate was 0. Wash in 1x SSC. As will be appreciated by those skilled in the art, stringent conditions of hybridization can be modified to identify or detect homologous or related polynucleotide sequences.

突然変異ＡＬＫポリペプチドの「変異体」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を示す。変異体は「保存的な」変化を有していて、置換されたアミノ酸は同様な構造又は化学的な性質を有している（例えば、イソロイシンでロイシンを置換）。より希には、変異体は「非保存的な」変化、例えば、トリプトファンによるグリシンの置換、を有している。同様な軽微な変異は、アミノ酸の欠失又は挿入、又はその両方も包含している。生物学的又は免疫学的な活性を無くさずに、どのアミノ酸を置換、挿入又は欠失させるかを判定する指針は、当該技術分野で公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見い出すことができるだろう。 A "mutant" of a mutant ALK polypeptide indicates an amino acid sequence in which one or more amino acids have been modified. The variants have "conservative" changes and the substituted amino acids have similar structural or chemical properties (eg, replace leucine with isoleucine). More rarely, the mutant has "non-conservative" changes, such as the replacement of glycine with tryptophan. Similar minor mutations include amino acid deletions and / or insertions. Guidance on which amino acid to replace, insert or delete without losing biological or immunological activity can be found using computer programs known in the art, such as DNASTAR software. right.

Ａ．ヒト固形腫瘍における突然変異ＡＬＫキナーゼの同定
染色体２上で生じて、ＥＭＬ−４のＮ末端をキナーゼドメイン及びＡＬＫのＣ末端と結合する２つの融合タンパク質変異体の発現をもたらす、本明細書に開示されている新規なヒト遺伝子欠失が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株（Ｈ２２２８を含む）及び患者の固形腫瘍の抽出物における、広範囲のホスホペプチドプロファイルの実験中に、意外にも同定された。固形腫瘍である、ＮＳＣＬＣは肺癌の亜類型である。これら欠失融合に含まれるタンパク質は図１Ａ−１Ｂの上の図に示されている。 A. Identification of Mutant ALK Kinases in Human Solid Tumors Disclosed herein, which results in the expression of two fusion protein variants that occur on chromosome 2 and bind the N-terminus of EML-4 to the kinase domain and the C-terminus of ALK. A novel human gene deletion has been surprisingly identified during extensive phosphopeptide profile experiments in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines (including H2228) and solid tumor extracts of patients. It was. A solid tumor, NSCLC is a subtype of lung cancer. The proteins contained in these deletion fusions are shown in the figure above Figure 1A-1B.

Ｈ２２２８細胞株のリン酸化プロファイルを、最近記述された、複合混合物由来の修飾ペプチドの単離技術及び質量分析による特徴付け（Rush et al., の米国特許出願公開第２００３００４４８４８号、「複合混合物由来の修飾ペプチドの免疫親和性単離（「ＩＡＰ」技術）を参照されたい）を用いて、以下の実施例１に更に記載されるように、初めて明らかにした。ホスホチロシン特異抗体（CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411) を用いるＩＡＰ技術の適用は、Ｈ２２２８細胞株はＡＬＫキナーゼを発現するが、このタンパク質は明らかに切断されないことを明確にした。このスクリーニングでは細胞株中の、肺癌中で活性化されることが知られている幾つかを含む、多くの他の活性化キナーゼを同定した。５'ＲＡＣＥによるＡＬＫへの配列５’の分析は、次いでこのキナーゼがＥＭＬ−４のＮ−末端に融合していることを明確にした（図６を参照されたい）。 Phosphorylation profiles of H2228 cell lines are characterized by a recently described technique for isolating modified peptides from complex mixtures and mass spectrometric analysis (Rush et al., US Patent Application Publication No. 20030044848, "From Complex Mixtures". Using immunoaffinity isolation of modified peptides (see "IAP" technique)), it was revealed for the first time as further described in Example 1 below. The application of IAP technology using a phosphotyrosine-specific antibody (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. # 9411) is that the H2228 cell line expresses ALK kinase, but this protein is clearly not cleaved. Was clarified. This screen identified many other activated kinases in cell lines, including some known to be activated in lung cancer. Analysis of sequence 5'to ALK by 5'RACE then revealed that this kinase was fused to the N-terminus of EML-4 (see Figure 6).

同様の広範なホスホプロファイリング手段を用いる、ＮＳＣＬＣ患者由来の１５４癌試料のその後の実験は、これらの患者集団中にＥＭＬ４−ＡＬＫ（短い変異体の）突然変異の存在を確認したばかりでなく、その他の患者集団中に第２のＥＭＬ４−ＡＬＫ（長い変異体）の存在及びＴＦＧ−ＡＬＫ突然変異の存在も明らかにした（実施例１Ｂ及び１Ｃを参照されたい）。 Subsequent experiments with 154 cancer samples from NSCLC patients using similar extensive phosphoprofiling means not only confirmed the presence of EML4-ALK (short mutant) mutations in these patient populations, but also others. The presence of a second EML4-ALK (long mutant) and TFG-ALK mutation in the patient population was also revealed (see Examples 1B and 1C).

突然変異ＡＬＫタンパク質がこれらのＮＳＣＬＣ癌において細胞の増殖及び生存を促進していることを、ｓｉＲＮＡサイレンシングを用いて細胞を阻害することによって確認することができる（実施例３参照されたい）。 It can be confirmed that the mutant ALK protein promotes cell proliferation and survival in these NSCLC cancers by inhibiting the cells using siRNA silencing (see Example 3).

ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子（短い及び長い変異体）及びＴＦＧ−ＡＬＫ融合遺伝子をＰＣＲで増幅し、単離して、配列を決定した（実施例３を参照されたい）。図１Ａ−１Ｂの下の図から明らかなように、このＥＭＬ４−ＡＬＫの欠失は、野生型ＥＭＬ−４のＮ−末端（短い変異体のアミノ酸１−１２３、又は長い変異体のアミノ酸１−４９５のどちらか）を、野生型ＡＬＫのキナーゼドメイン及びＣ−末端（アミノ酸１０５７−１６２０）と結合する（配列番号３及び５も参照されたい）。融合接合部はまさに野生型ＡＬＫのＣ−末端から膜貫通ドメインまでに生じる（図１Ａ−１Ｂを参照されたい）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドは、このタンパク質のコイルドコイルドメインを含む、ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸２３３又は４９５をそれぞれ保持している。７９６のアミノ酸（短い変異体）又は１０５９のアミノ酸（長い変異体）からなる、得られたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質は、ＡＬＫのキナーゼ活性を保持している。関連するエクソン及び融合接合部を図１Ａ−１Ｂ下の図に示す。融合接合部は、エクソン６に続くＥＭＬ−４のイントロン６（短い変異体）、又はＥＭＬ−４のエクソン１３（長い変異体）を包含している。 The EML4-ALK fusion gene (short and long variants) and the TFG-ALK fusion gene were amplified by PCR, isolated and sequenced (see Example 3). As is apparent from the figure below FIG. 1A-1B, this deletion of EML4-ALK is due to the N-terminus of wild-type EML-4 (short mutant amino acids 1-123, or long mutant amino acids 1-. Either 495) is bound to the wild-type ALK kinase domain and C-terminus (amino acids 1057-1620) (see also SEQ ID NOs: 3 and 5). The fusion junction occurs exactly from the C-terminus of the wild-type ALK to the transmembrane domain (see Figure 1A-1B). The EML4-ALK fusion polypeptide carries the N-terminal amino acid 233 or 495 of EML-4, respectively, which contains the coiled coil domain of this protein. The resulting EML4-ALK fusion protein consisting of 796 amino acids (short variants) or 1059 amino acids (long variants) retains the kinase activity of ALK. The relevant exons and fusion joints are shown in the figure below Figure 1A-1B. The fusion junction comprises an exon 6 followed by an EML-4 intron 6 (short variant) or an EML-4 exon 13 (long variant).

図１Ｃの下の図に示すように、ＴＦＧ−ＡＬＫ転座は、野生型ＴＦＧのＮ−末端（アミノ酸１−１３８）を、野生型ＡＬＫのキナーゼドメイン及びＣ−末端（アミノ酸１０５７−１６２０）と結合する（配列番号２２及び５；及び図１Ｃの下の図及び図４Ｃ（配列番号２０及び１）も参照されたい）。融合接合部はまさに野生型ＡＬＫのＣ−末端から膜貫通ドメインまでに生じ（図１Ｃを参照されたい）、そしてＡＬＫのキナーゼ活性を保持している。関連するエクソン及び融合接合部を図１Ｃ（下の図）に示す。融合接合部は、ＴＦＧのエクソン３及びＡＬＫのエクソン２０を包含している。 As shown in the figure below FIG. 1C, the TFG-ALK translocation mate the N-terminus of wild-type TFG (amino acids 1-138) with the kinase domain and C-terminus of wild-type ALK (amino acids 1057-1620). Combine (see also SEQ ID NOs: 22 and 5; and the figures below FIG. 1C and FIG. 4C (SEQ ID NOs: 20 and 1)). The fusion junction occurs exactly from the C-terminus of the wild-type ALK to the transmembrane domain (see Figure 1C) and retains the kinase activity of ALK. The relevant exons and fusion joints are shown in Figure 1C (below). The fusion junction comprises exon 3 of TFG and exon 20 of ALK.

ＦＩＳＨプローブを、パラフィン包埋ヒトＮＳＣＬＣ試料４００個の群におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ（短い変異体）融合タンパク質の存在を検出するために用いた（実施例６及び７；図６を参照されたい）。この試料サイズにおけるこの短い変異体の突然変異の出現率は非常に低かった。しかしながら、患者由来の凍結ヒトＮＳＣＬＣ癌試料１５４個の別の群においては、広範なリン酸化プロファイルを試験するＩＡＰ技術を用いて、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質をより高い発現率で検出した（実施例１Ｂを参照されたい）。 A FISH probe was used to detect the presence of an EML4-ALK (short variant) fusion protein in a group of 400 paraffin-embedded human NSCLC samples (Examples 6 and 7; see FIG. 6). The incidence of mutations in this short variant at this sample size was very low. However, in another group of 154 patient-derived frozen human NSCLC cancer samples, TFG-ALK fusion proteins were detected at higher expression rates using IAP techniques that test a broader phosphorylation profile (Example 1B). Please refer to).

Ｂ．単離されたポリヌクレオチド。
本発明は、一つには、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ、及び組み換えの融合ポリペプチドを産生するためにそのようなポリヌクレオチドを用いるための方法、ベクター、及び宿主細胞を提供する。 B. An isolated polynucleotide.
The present invention, in part, to produce an isolated polynucleotide encoding an EML4-ALK fusion polypeptide, a nucleotide probe that hybridizes to such a polynucleotide, and a recombinant fusion polypeptide. Methods, vectors, and host cells for using the same polynucleotide are provided.

他に指示がない限り、本明細書におけるＤＮＡ分子の配列決定によって決定された全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems Inc. のモデル３７３のような）を用いて決定され、本明細書において決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、自動ペプチドシークエンサーを用いて決定された（実施例２を参照されたい）。この自動化手段によって決定されたＤＮＡ配列について当該技術分野で知られているように、本明細書で決定された何れかのヌクレオチド配列も幾つかの誤差を含んでいてもよい。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は一般に、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％の相同性を有していて、より典型的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％の相同性を有する。実際の配列は、当該技術分野で公知のＤＮＡ配列決定方法のマニュアルを含む、他の手段によってより正確に決定することができる。当該技術分野でも知られているように、実際の配列に比べ、決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入又は欠失は、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予測アミノ酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なるように、ヌクレオチド配列の翻訳において、そのような挿入又は欠失位置から始まる、読み枠移動をもたらすであろう。 Unless otherwise indicated, all nucleotide sequences determined by sequencing of DNA molecules herein are determined using an automated DNA sequencer (such as Applied Biosystems Inc.'s model 373) and are herein determined. All amino acid sequences of the polypeptide encoded by the DNA molecule determined in are determined using an automated peptide sequencer (see Example 2). As is known in the art for DNA sequences determined by this automated means, any nucleotide sequence determined herein may also contain some error. Nucleotide sequences determined by automation generally have at least about 90% homology to the actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule, and more typically at least about 95% to at least about. It has 99.9% homology. The actual sequence can be more accurately determined by other means, including a manual of DNA sequencing methods known in the art. As is also known in the art, a single insertion or deletion in a determined nucleotide sequence compared to the actual sequence was sequenced as a predicted amino acid sequence encoded by the determined nucleotide sequence. In the translation of the nucleotide sequence, it will result in a frame shift starting from such an insertion or deletion position, as is completely different from the amino acid sequence actually encoded by the DNA molecule.

他に指示がない限り、本明細書に示されているそれぞれのヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔと省略）の配列として表されている。しかしながら、特定のデオキシリボヌクレオチド配列におけるそれぞれのチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）に置換されている場合には、ＤＮＡ分子又はポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの配列、及びＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対する、核酸分子、又はポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」は、リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）の対応する配列を意図している。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略号を用いて示されている配列番号２の配列を有するＲＮＡ分子への参照は、配列番号２のそれぞれのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣで置換されていて、それぞれのデオキシリボヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵによって置換されている配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図している。 Unless otherwise indicated, each nucleotide sequence shown herein is represented as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, T). However, if each thymidine deoxyribonucleotide (T) in a particular deoxyribonucleotide sequence is replaced with ribonucleotide uridine (U), then for the DNA molecule or polynucleotide, the deoxyribonucleotide sequence, and the RNA molecule or polynucleotide. , Nucleotide molecule, or "nucleotide sequence" of a polynucleotide is intended the corresponding sequence of ribonucleotides (A, G, C and U). For example, a reference to an RNA molecule having the sequence of SEQ ID NO: 2 shown using the abbreviation of deoxyribonucleotide is such that each deoxyribonucleotide A, G or C of SEQ ID NO: 2 has a corresponding ribonucleotide A, G or It is intended to indicate an RNA molecule that is substituted with C and has a sequence in which each deoxyribonucleotide T is substituted with ribonucleotide U.

一態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１又は配列番号１８のアミノ酸配列を含有している微小管結合タンパク質様４／未分化リンパ腫キナーゼ（Echnoderm Micrutubule-Associated Protein-LIke 4/Anaplastic Lymphoma Kinase; ＥＭＬ４−ＡＬＫ）融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、そのヌクレオチド配列は配列番号２又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含有している；
（ｃ）ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−２３３又は配列番号１９の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ＥＭＬ−４のＮ−末端ヌクレオチド配列（配列番号４の１−７００ヌクレオチド又は配列番号４の１−１４８６ヌクレオチド）及びＡＬＫのキナーゼドメインヌクレオチド配列（配列番号６の３３４８−４１４９ヌクレオチド）を含有しているヌクレオチド配列；
（ｅ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの融合接合部（配列番号２の７００−７０１ヌクレオチド又は配列番号１９の１４８６−１４８７ヌクレオチド）を包含するする少なくとも６つの隣接ヌクレオチドを含有しているヌクレオチド配列；
（ｆ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のヌクレオチド配列の何れかと相同性を有するヌクレオチド配列：
よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含有している単離されたポリヌクレオチドを提供する。 In one aspect, the invention
(A) Microtubule-associated protein-Associated Protein-LIke 4 / Anaplastic Lymphoma Kinase (EML4-ALK) fusion polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 18. The nucleotide sequence encoding
(B) A nucleotide sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide, the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 19;
(C) The N-terminal amino acid sequence of EML-4 (residue 1-233 of SEQ ID NO: 3 or residue 1-495 of SEQ ID NO: 19) and the kinase domain of ALK (residue 1116-1383 of SEQ ID NO: 5). Nucleotide sequence encoding the EML4-ALK fusion polypeptide contained;
(D) Contains the N-terminal nucleotide sequence of EML-4 (1-700 nucleotides of SEQ ID NO: 4 or 1-1486 nucleotides of SEQ ID NO: 4) and the kinase domain nucleotide sequence of ALK (3348-4149 nucleotides of SEQ ID NO: 6). Nucleotide sequence;
(E) A nucleotide sequence containing at least 6 adjacent nucleotides comprising a fusion junction of an EML4-ALK fusion polynucleotide (700-701 nucleotides of SEQ ID NO: 2 or 1486-1487 nucleotides of SEQ ID NO: 19);
(F) A polypeptide containing at least 6 adjacent amino acids comprising a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide (residue 233-234 of SEQ ID NO: 1 or residue 495-996 of SEQ ID NO: 18). Encoding nucleotide sequence; and nucleotide sequence having homology with any of the nucleotide sequences of (g) (a) to (f):
Provided are isolated polynucleotides containing a nucleotide sequence having at least 95% homology to a sequence selected from the group consisting of.

図２（配列番号２）のヌクレオチド配列のような、本明細書で提供されている情報を用いて、本発明の突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、出発物質としてｍＲＮＡを用いるｃＤＮＡのクローニングのような、標準的なクローニング及びスクリーニング方法を用いて得ることができる。本発明の実例としては、図２（配列番号２）に記載されているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（短い変異体）は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株由来のゲノムＤＮＡから単離した（以下の実施例２に更に記載されている）。融合遺伝子は、開示されるＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子欠失（染色体２）が生ずる、固形腫瘍を包含する他の癌におけるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー中でも同定することができる。 Using the information provided herein, such as the nucleotide sequence of FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), the nucleic acid molecule of the invention encoding the mutant ALK polypeptide of the invention uses mRNA as a starting material. It can be obtained using standard cloning and screening methods, such as cloning of the cDNA used. As an example of the present invention, the EML4-ALK fusion polynucleotide (short mutant) shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) was isolated from genomic DNA derived from a human NSCLC cell line (Example 2 below). Further described in). The fusion gene can also be identified in genomic DNA or cDNA libraries in other cancers, including solid tumors, where the disclosed EML4-ALK gene deletion (chromosome 2) occurs.

決定されたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のヌクレオチド配列は７９６のアミノ酸（短い変異体）及び１０５９のアミノ酸（長い変異体）のそれぞれのキナーゼ融合タンパク質をコードする（図２Ａ−Ｂ（配列番号１及び１８）及び図１Ａ−Ｂを参照されたい）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドは、そのタンパク質のＮ−末端（アミノ酸１−２３３（短い変異体）又はアミノ酸１−４９５（長い変異体）をコードする野生型ＥＭＬ−４のヌクレオチド配列（図３（配列番号４）を参照されたい）の部分を、そのタンパク質のキナーゼドメイン及びＣ−末端をコードする野生型ＡＬＫのヌクレオチド配列（図４（配列番号６）を参照されたい）の部分とともに含有している。図１Ａ−Ｂを参照されたい。キナーゼドメインは短い変異融合タンパク質（短い変異融合ポリヌクレオチドのヌクレオチド８７４−５６８によってコードされる）の残基２９２−５６８、又は長い変異融合タンパク質（長い変異融合ポリヌクレオチドのヌクレオチド１６６３−２４９４によってコードされる）の残基５５８−８３１から成っている。図２Ａ−２Ｂを参照されたい。 The nucleotide sequence of the determined EML4-ALK fusion gene encodes a kinase fusion protein of 796 amino acids (short variants) and 1059 amino acids (long variants), respectively (FIGS. 2AB (SEQ ID NOs: 1 and 18)). And see Figures 1A-B). The EML4-ALK fusion polynucleotide is a nucleotide sequence of wild EML-4 encoding the N-terminus of the protein (amino acid 1-233 (short variant) or amino acid 1-495 (long variant) (FIG. 3 (sequence)). The portion of (see number 4)) is included along with the portion of the nucleotide sequence of the wild-type ALK encoding the kinase domain and C-terminus of the protein (see Figure 4 (reference number 6)). See Figures 1A-B. The kinase domain is the residue 292-568 of a short mutagenesis protein (encoded by nucleotides 874-568 of a short mutagen polynucleotide), or a long mutagenesis protein (long mutagenoid poly). Consists of residues 558-831 (encoded by nucleotides nucleotides 1663-2494), see Figure 2A-2B.

示されるように、本発明は一つには、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の成熟形態を提供する。シグナル仮説によれば、哺乳類の細胞によって分泌されるタンパク質は、増大するタンパク質鎖の粗面小胞体を越える移行が開始すると、成熟タンパク質から開裂されるシグナル又は分泌リーダー配列を有している。大部分の哺乳類の細胞及び昆虫の細胞でさえも、同様の特異性で、分泌タンパク質を開裂する。しかしながら、ある場合には、分泌タンパク質の開列は完全に均一ではなく、タンパク質に２つ又はそれ以上の成熟種をもたらす。更に、分泌タンパク質の開裂特異性は完全タンパク質の一次構造よって最終的に決定することが以前から知られている。すなわちそれはポリペプチドのアミノ酸配列に固有なものである。 As shown, the invention provides, in part, a mature form of the EML4-ALK fusion protein. According to the signal hypothesis, proteins secreted by mammalian cells have a signal or secretory leader sequence that is cleaved from the mature protein upon initiation of translocation of the growing protein chain across the rough vesicles. Most mammalian and even insect cells cleave secretory proteins with similar specificity. However, in some cases, the opening of secreted proteins is not perfectly uniform, resulting in two or more mature species of protein. Furthermore, it has long been known that the cleavage specificity of secreted proteins is ultimately determined by the primary structure of the complete protein. That is, it is unique to the amino acid sequence of the polypeptide.

例えば、寄託されているｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有している、成熟したＥＭＬ４−ＡＬＫポリペプチドとは、哺乳類の細胞（例えば、以下に記載のような、３Ｔ３細胞）中で、寄託されているクローン又は成熟融合ポリペプチドをコードする他のクローンのヒトＤＮＡ配列によってコードされる完全読み込み枠の発現によって産生された融合タンパク質の成熟形態を意味する。 For example, a mature EML4-ALK polypeptide having an amino acid sequence encoded by a deposited cDNA clone is a deposit in mammalian cells (eg, 3T3 cells as described below). It means the mature form of the fusion protein produced by the expression of the complete loading frame encoded by the human DNA sequence of the clone being cloned or another clone encoding the mature fusion polypeptide.

示されるように、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態で、又は例えばクローニングよって得られるか又は合成で産生されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを包含するＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖であってもよい。一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡは、センス鎖としても知られている、コード鎖であってよく、又はアンチセンス鎖としても知られている、非コード鎖であってもよい。 As shown, the polynucleotides of the invention may be in the form of RNA, such as mRNA, or in the form of DNA, including cDNA and genomic DNA obtained, for example, by cloning or synthetically. The DNA may be double-stranded or single-stranded. The single-stranded DNA or RNA may be a coding strand, also known as the sense strand, or may be a non-coding strand, also known as the antisense strand.

本発明の単離されたポリヌクレオチドは、それらの天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクター中に含まれている組み換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたものと考えられる。単離されたＤＮＡ分子の更なる例は、異種の宿主細胞中の組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中の精製（部分的に又は実質的に）されたＤＮＡ分子を包含する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボ又はインビトロでのＲＮＡ転写物を包含する。本発明による単離された核酸分子は、合成によって産生されるような分子を更に包含する。 The isolated polynucleotides of the present invention are nucleic acid molecules, DNA or RNA extracted from their natural environment. For example, the recombinant DNA molecule contained in the vector is believed to have been isolated for the purposes of the present invention. Further examples of isolated DNA molecules include recombinant DNA molecules in heterologous host cells, or purified (partially or substantially) DNA molecules in solution. The isolated RNA molecules include RNA transcripts of the DNA molecules of the invention in vivo or in vitro. The isolated nucleic acid molecules according to the invention further include molecules such as those produced by synthesis.

本発明の単離されたポリヌクレオチドは、図２Ａ−Ｂ（配列番号２及び１９）で示されるＤＮＡ分子、図１Ａ−Ｂ（配列番号１及び１８）で示される成熟ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質をコードする配列を含有しているＤＮＡ分子、及び上記のようなものとは実質的に異なる配列を含有しているが、遺伝子コードの縮重によって、本発明のＡＬＫ突然変異ポリペプチドを未だにコードするＤＮＡ分子を包含する。この遺伝子コードは当該技術分野で公知であり、従って、当業者にとってそのような縮重変異体を作成することは通常のことであろう。 The isolated polynucleotide of the present invention encodes the DNA molecule shown in FIGS. 2AB (SEQ ID NOs: 2 and 19) and the mature EML4-ALK fusion protein shown in FIGS. 1AB (SEQ ID NOs: 1 and 18). A DNA molecule containing a sequence to be used, and a DNA that contains a sequence substantially different from that described above, but still encodes the ALK mutant polypeptide of the present invention due to the degeneracy of the genetic code. Includes molecules. This genetic code is known in the art and therefore it would be normal for one of ordinary skill in the art to make such a degenerate variant.

別の態様では、本発明は上記の寄託されているｃＤＮＡクローンに含まれているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ヌクレオチド配列を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、そのような核酸分子は、上記の寄託されているｃＤＮＡクローン、又は本明細書に記載されるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の全長を発現する別のクローンによって、コードされる成熟融合ポリペプチドをコードするであろう。
別の態様では、本発明は、ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−２３３、又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１１８３）を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、ＡＬＫのキナーゼドメインを含有しているポリペプチドは配列番号５の残基１０５７−１６２０を含んでいる（図１Ｃの下の図を参照されたい）。
その他の態様では、上記ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列及びＡＬＫのキナーゼドメインは配列番号４のヌクレオチド１−７００を含有しているヌクレオチド配列又は配列番号４の１−１４８６のヌクレオチド及び配列番号６の３１７１−４８６０のヌクレオチドによってそれぞれコードされる。 In another aspect, the invention provides an isolated polynucleotide encoding an EML4-ALK fusion polypeptide containing the EML4-ALK fusion nucleotide sequence contained in the deposited cDNA clone described above. .. Preferably, such a nucleic acid molecule is a mature fusion polypeptide encoded by the deposited cDNA clone described above, or another clone expressing the full length of the EML4-ALK fusion protein described herein. Will code.
In another aspect, the invention presents the N-terminal amino acid sequence of EML-4 (residue 1-233 of SEQ ID NO: 3 or residue 1-495 of SEQ ID NO: 3) and the kinase domain of ALK (of SEQ ID NO: 5). Provided is an isolated nucleotide sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide containing residues 1116-1183).
In one aspect, the polypeptide containing the kinase domain of ALK comprises residues 1057-1620 of SEQ ID NO: 5 (see figure below FIG. 1C).
In other embodiments, the N-terminal amino acid sequence of EML-4 and the kinase domain of ALK are nucleotide sequences containing nucleotide 1-700 of SEQ ID NO: 4 or nucleotides of SEQ ID NO: 4 1-1486 and SEQ ID NO: 6 It is encoded by the nucleotides of 3171-4860, respectively.

本発明は更に、本発明の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドの一つと相補的な配列を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体での in situ ハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピング用のプローブとして、そして例えば更に以下のＦ欄に記載されるているようなノーザンブロット分析による、ヒト組織におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の発現を検出するために有用である。 The present invention further provides an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence having a sequence complementary to one of the mutant ALK polynucleotides of the invention. Such isolated molecules, especially DNA molecules, are humans as probes for gene mapping by in situ hybridization on chromosomes and, for example, by Northern blot analysis as further described in column F below. It is useful for detecting the expression of the EML4-ALK fusion protein in tissues.

本発明は更に、本明細書に記載される単離された核酸分子の断片に関する。本発明の単離されたＥＭＬ４−ＡＬＫポリヌクレオチドの断片とは、本明細書で検討される診断用のプローブ及びプライマーとして有用である、長さが少なくとも約１５のヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約２０のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約３０のヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約４０のヌクレオチドの断片を意図している。もちろん、長さが約５０〜１５００のヌクレオチドのより大きい断片も、寄託されているｃＤＮＡか、又は図２（配列番号２）で示されるようなものか、又は図２Ａ−Ｂ（配列番号２又は１９）で示されるような融合ポリヌクレオチドを発現する他のクローンの全部ではないが、殆どの突然変異ＡＬＫヌクレオチド配列に対応する断片として、本発明により有用である。長さが少なくとも２０のヌクレオチドである断片とは、例えば、断片が派生するそれぞれのヌクレオチド配列由来の、２０又はそれ以上の連続した塩基を含有している断片を意図している。そのようなＤＮＡ断片の生成は当業者にとって通常のことであって、例を挙げると、制限エンドヌクレアーゼ切断、又は寄託されているｃＤＮＡクローンから入手可能な又は本明細書に開示される配列に従って合成されたＤＮＡの超音波処理によるせん断によって、実施することができる。また、そのような断片を直接合成によって作り出すことができる。 The present invention further relates to fragments of isolated nucleic acid molecules described herein. Fragments of the isolated EML4-ALK polynucleotides of the invention are nucleotides of at least about 15 length, and more preferably at least about, which are useful as diagnostic probes and primers considered herein. A fragment of 20 nucleotides, more preferably at least about 30 nucleotides, even more preferably at least about 40 nucleotides is intended. Of course, larger fragments of nucleotides about 50-1500 in length are also deposited cDNA, as shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), or FIG. 2AB (SEQ ID NO: 2 or It is useful by the present invention as a fragment corresponding to most mutant ALK nucleotide sequences, but not all of the other clones expressing the fusion polynucleotide as shown in 19). A fragment having a length of at least 20 nucleotides is intended, for example, a fragment containing 20 or more contiguous bases from each nucleotide sequence from which the fragment is derived. Generation of such DNA fragments is common to those of skill in the art, for example, restriction endonuclease cleavage, or synthesis according to a sequence available from a deposited cDNA clone or disclosed herein. It can be carried out by shearing the DNA by sonication. Also, such fragments can be produced by direct synthesis.

本発明の好ましい核酸断片又はプローブは、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合遺伝子産物の融合接合部（図１Ａ−Ｂ、下の図を参照されたい）をコードする核酸分子を包含する。例えば、ある好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの融合接合部（配列番号２のヌクレオチド７００−７０１、又は配列番号１９のヌクレオチド１４８６−１４８７）を包含する少なくとも６つの隣接ヌクレオチドよりなるヌクレオチド配列／断片を含んでいる（図１Ａ−Ｂ、下の図（配列番号８及び２５）を参照されたい）。
その他の好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列／断片を含んでいる（図１Ａ−Ｂ、最下図（配列番号７及び２４）を参照されたい）。 Preferred nucleic acid fragments or probes of the invention include nucleic acid molecules encoding fusion junctions of the fusion gene product of EML4-ALK (FIGS. 1AB, see figure below). For example, in one preferred embodiment, the isolated polynucleotide of the invention comprises a fusion junction of EML4-ALK fusion polynucleotides (nucleotides 700-701 of SEQ ID NO: 2, or nucleotides 1486-1487 of SEQ ID NO: 19). Contains a nucleotide sequence / fragment consisting of at least 6 adjacent nucleotides (see Figures 1AB, below (SEQ ID NOs: 8 and 25)).
In another preferred embodiment, the isolated polynucleotide of the invention comprises a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide (residue 233-234 of SEQ ID NO: 1 or residue 495-996 of SEQ ID NO: 18). Contains a nucleotide sequence / fragment encoding a polypeptide containing at least 6 adjacent amino acids (see FIGS. 1AB, bottom view (SEQ ID NOs: 7 and 24)).

別の態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されるような本発明の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％のホルムアミド、５倍のＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍のデンハーズ溶液（Denhardt's solution）、１０％のデキストラン硫酸、及び２０マイクログラム／ｍｌの変性、せん断サケ***ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で１晩培養してから、約６５℃で濾液を０．１倍のＳＳＣ中で洗浄することを意図している。 In another aspect, the invention comprises isolated polynucleotides that hybridize to some of the mutant ALK polynucleotides of the invention as described herein under stringent hybridization conditions. provide. "Stringent hybridization conditions" are 50% formamide, 5 times SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 times denatured solution (5 times Denhaz solution). Denhardt's solution), cultivated overnight at 42 ° C. in a solution containing 10% dextran sulfate and 20 micrograms / ml denatured, sheared salmon sperm DNA, and then 0.1-fold the filtrate at about 65 ° C. Intended to be washed in SSC.

ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５のヌクレオチド（ｎｔ）に、そしてより好ましくは少なくとも約２０のｎｔ、更により好ましくは少なくとも約３０のｎｔ、そしてより一層好ましくは約３０〜７０のｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡの何れか）を意図している。これらは上記そして以下で更に詳細に検討されるような診断用のプローブ又はプライマーとして有用である。 A polynucleotide that hybridizes to a "part" of a polynucleotide is at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt. And even more preferably, a polynucleotide (either DNA or RNA) that hybridizes to about 30-70 nt is intended. These are useful as diagnostic probes or primers as discussed in more detail above and below.

もちろん、参照ポリヌクレオチド（例えば、図２（配列番号２）に記載されている成熟ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド）のより大きい部分（例えば、長さが５０〜７５０のｎｔ、又は参照ポリヌクレオチドの全長に至るまで）にハイブリダイズするポリヌクレオチドも、寄託されているｃＤＮＡのヌクレオチド配列又は図２Ａ−Ｂ（配列番号２又は１９）又は図１Ａ−Ｂ（下の図）（配列番号７及び２４）に示されるヌクレオチド配列の全てでなくても、殆どに対応するポリヌクレオチドであるので、本発明によるプローブとして有用である。 Of course, a larger portion of the reference polynucleotide (eg, the mature EML4-ALK fusion polynucleotide set forth in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2)) (eg, nt in length 50-750, or the total length of the reference polynucleotide). The polynucleotides that hybridize to (up to) are also shown in the nucleotide sequence of the deposited cDNA or in FIGS. 2AB (SEQ ID NO: 2 or 19) or FIG. 1AB (below) (SEQ ID NOs: 7 and 24). It is useful as a probe according to the present invention because it is a polynucleotide corresponding to most, if not all, of the nucleotide sequences shown.

「長さが少なくとも２０」のポリヌクレオチドの一部とは、例えば、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列由来の２０又はそれ以上の隣接ヌクレオチドを意図している。示されるように、そのような部分は、例えば、 MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)（その開示の全てを参照して本明細書に取り込む）に記述のように、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技術によるプローブか又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列を増幅するプライマーかのどちらかとして診断的に有用である。もちろん、ポリＡ配列（図２（配列番号２）に示されるＥＭＬ−４−ＡＬＫ配列の３'末端ポリ（Ａ）トラクトのような）のみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドがポリ（Ａ）延伸体又はそれらに相補的なもの（例えば、実質的に二本鎖のｃＤＮＡクローンの何れか）を含有している核酸分子のいずれかにハイブリダイズするであろうために、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために用いる本発明のポリヌクレオチドに含まれないであろう。 A portion of a "at least 20" length polynucleotide is intended, for example, 20 or more adjacent nucleotides from the nucleotide sequence of the reference polynucleotide. As shown, such parts are, for example, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. , NY (1989) (incorporated herein by reference in its entirety), either a probe by conventional DNA hybridization techniques or a primer that amplifies the target sequence by polymerase chain reaction (PCR). It is diagnostically useful as either. Of course, a polynucleotide that hybridizes only to a poly A sequence (such as the 3'terminal poly (A) tract of the EML-4-ALK sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2)) is such a polynucleotide. This is because it will hybridize to any of the nucleic acid molecules that contain poly (A) stretches or their complements (eg, substantially any of the double-stranded cDNA clones). It will not be included in the polynucleotides of the invention used to hybridize to some of the nucleic acids of the invention.

示されるように、本発明の突然変異ポリペプチドをコードする、本発明の核酸分子は、これに限定されないが、単独で成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするようなもの；成熟ポリペプチドをコードする配列、及びプレ−、又はプロ−、プレ−プロ−タンパク質配列のようなリーダー又は分泌配列をコードするもののような、付加配列；成熟ポリペプチドのコード配列であって、例えばこれに限定されないが、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、例えばリボソーム結合及びｍＲＮＡの安定化を含む、転写、ｍＲＮＡプロセッシングとしての役割を果たす、転写、非翻訳配列のような、イントロン及び非コード５’及び３’配列を包含する、付加、非コード配列と共に、前記の付加コード配列を有しているか又は有していないないもの；付加機能を提供するような、付加アミノ酸をコードする付加コード配列を包含してもよい。 As shown, the nucleic acid molecule of the invention encoding the mutant polypeptide of the invention is such as, but not limited to, encoding the amino acid sequence of a mature polypeptide alone; encoding a mature polypeptide. Sequences and additional sequences, such as those encoding leader or secretory sequences such as pre- or pro-, pre-pro-protein sequences; coding sequences of mature polypeptides, such as, but not limited to. Includes intron and non-coding 5'and 3'sequences, such as transcriptional, untranslated sequences, that serve as transcriptional, mRNA processing, including splicing and polyadenylation signals, including ribosome binding and mRNA stabilization. Along with the additional and non-encoding sequences, those having or not having the above additional coding sequence; may include additional coding sequences encoding additional amino acids that provide additional function.

従って、ポリペプチドをコードする配列は、融合タンパク質の精製を容易にするペプチドをコードする配列ような、マーカー配列に融合していてもよい。
本発明のこの態様のある好ましい実施態様では、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）に備わっている標識のような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、とりわけこれらの多くは市販されている。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989) に記載されているように、例えばヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」標識は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来の抗原決定基に対応する、精製に有用な別のペプチドであり、Wilson et al., Cell 37:767 (1984) によって記載されている。以下で検討するように、他のそのような融合タンパク質は、自体がＮ−又はＣ−末端のＦｃと融合しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを包含する。 Thus, the sequence encoding the polypeptide may be fused to a marker sequence, such as the sequence encoding the peptide that facilitates purification of the fusion protein.
In one preferred embodiment of this aspect of the invention, the marker amino acid sequence is a hexa-histidine peptide, such as the label provided on the pQE vector (Qiagen, Inc.), many of which are commercially available. .. As described in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), for example hexa-histidine provides convenient purification of fusion proteins. The "HA" label is another peptide useful for purification that corresponds to an antigenic determinant from an influenza hemagglutinin protein and has been described by Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Other such fusion proteins, as discussed below, include EML4-ALK fusion polypeptides that themselves are fused to N- or C-terminal Fc.

本発明は更に、本明細書に開示されているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの一部、類縁体又は誘導体をコードする、本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、自然の対立遺伝子変異体のように、自然に発生してもよい。「対立遺伝子変異体」とは、有機体の染色体上に所定の遺伝子配座を占有している遺伝子の幾つかの代替的形態の一つを意図している。例えば、GEENS II,Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985) を参照されたい。非天然の変異体を公知の突然変異生成技術を用いて産生することができる。 The present invention further relates to variants of the nucleic acid molecules of the invention that encode parts, analogs or derivatives of the EML4-ALK fusion polypeptides disclosed herein. Mutants may occur spontaneously, such as natural allelic variants. An "allelic variant" is intended as one of several alternative forms of a gene that occupies a given gene conformation on the chromosome of an organism. See, for example, GEENS II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Non-natural variants can be produced using known mutagenesis techniques.

そのような変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失又は付加によって産生されたものを包含する。この置換、欠失又は付加は、一つ又はそれ以上のヌクレオチドを含む。変異体はコード領域、非コード領域又はその両方を改変することができる。コード領域の改変は、保存的な又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は付加を産生することができる。これらのうちで特に好ましいのは、本発明で開示されている突然変異ＡＬＫポリペプチドの性質及び活性（例えば、キナーゼ活性）を変化させない、緩和な置換、付加及び欠失である。またこれに関して特に好ましいのは保存的置換である。 Such variants include those produced by nucleotide substitutions, deletions or additions. This substitution, deletion or addition comprises one or more nucleotides. The mutant can modify the coding region, the non-coding region, or both. Modifications of the coding region can produce conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Of these, particularly preferred are mild substitutions, additions and deletions that do not alter the properties and activities (eg, kinase activity) of the mutant ALK polypeptides disclosed in the present invention. Also particularly preferred in this regard is a conservative substitution.

本発明の更なる態様は、本発明の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド（例えば、図２（配列番号１）で示される完全アミノ酸配列を有するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；又はＥＭＬ−４のＮ-末端及びＡＬＫのキナーゼドメインをコードするヌクレオチド配列（図１Ａ-Ｂ、下の図；及び図３及び４を参照されたい）；又はそのような例示の配列と相補的なヌクレオチド）と、少なくとも９０％の相同性を有していて、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有する。 A further aspect of the invention is a polynucleotide sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide having the complete amino acid sequence set forth in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1) of the mutant ALK polynucleotide of the invention; or EML-. With nucleotide sequences encoding the N-terminal of 4 and the kinase domain of ALK (see Figures 1AB, below; and FIGS. 3 and 4); or nucleotides complementary to such exemplary sequences). Have at least 90% homology, and more preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homology.

突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「相同な」ヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各々の１００ヌクレオチド当たり、最大５箇所の突然変異を含んでいてもよいことを除いて、参照配列と相同であることを意図している。すなわち、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの最大５％を別のヌクレオチドで欠失又は置換させてもよい、又は参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％のヌクレオチドの数を参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’−又は３’−末端位置で、又はこれらの末端の間の何処かで、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に組み込むか、又は参照配列中に１つ又はそれ以上の連続群を組み込むかの何れかで、引き起こすことができる。 A nucleotide having a reference nucleotide sequence encoding a mutated ALK polypeptide and at least, for example, 95% "homologous" nucleotide sequence is a reference nucleotide in which the nucleotide sequence of the polynucleotide encodes a mutated ALK polypeptide. It is intended to be homologous to the reference sequence, except that each 100 nucleotides of the sequence may contain up to 5 mutations. That is, in order to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% homologous to the reference nucleotide sequence, up to 5% of the nucleotides in the reference sequence may be deleted or replaced with another nucleotide, or in the reference sequence. A number of up to 5% of the total nucleotides in the nucleotide may be inserted into the reference sequence. These mutations in the reference sequence are individually integrated or referenced between the nucleotides in the reference sequence at the 5'- or 3'-terminal positions of the reference nucleotide sequence, or somewhere between these ends. It can be triggered by either incorporating one or more contiguous groups in the sequence.

実際に、何れの特定の核酸分子が、例えば、図２Ａ−Ｂ（配列番号２及び１９）で示されるヌクレオチド配列、又は上記の寄託されているｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するか否かについては、ベストフィットプログラム（Bestfit program; Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) のような、公知のコンピュータープログラムを用いて通常の方法で判定することができる。ベストフィットは、二つの配列間の最良の相同性部分を見出すために、Smith and Waterman の局所相同性アルゴリズム（Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)) を用いる。特定の配列が、参照ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド配列又は本発明による切断されたＡＬＫポリヌクレオチド配列と、例えば、９５％の相同性を有するか否かを判定するために、ベストフィット又は他の配列配置プログラムの何れかを用いるときは、もちろん、参照ヌクレオチド配列の全長に対しての相同性のパーセントが計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の最大５％の相同性のずれが許容されるように、パラメーターがセットされる。 In fact, any particular nucleic acid molecule is at least 90%, 95%, with, for example, the nucleotide sequence shown in FIGS. 2AB (SEQ ID NOs: 2 and 19), or the nucleotide sequence of the deposited cDNA clone described above. For 96%, 97%, 98% or 99% homology, the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive) , Madison, Wis. 53711), and can be determined in the usual way using known computer programs. Bestfit uses Smith and Waterman's Local Homology Algorithm (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)) to find the best homology between the two sequences. Best fit or other sequence to determine if a particular sequence has, for example, 95% homology with the reference EML4-ALK fusion polynucleotide sequence or the truncated ALK polynucleotide sequence according to the invention. When using any of the placement programs, of course, the percentage of homology to the total length of the reference nucleotide sequence is calculated, and a deviation of up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence is allowed. The parameters are set so that they are.

本発明はその範囲に、それらがＡＬＫキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わりなく、図２（配列番号２）で示される核酸配列又は寄託されているｃＤＮＡの核酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有する核酸分子を包含している。これは特定の核酸分子がＡＬＫキナーゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードしなくても、当業者はこの核酸分子を如何に用いるか、例えばハイブリダイゼーションプローブとして又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いるかを既に知っているからである。キナーゼを有しているポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途は、とりわけ、（１）ＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失遺伝子、又は切断されたＡＬＫ遺伝子、又はｃＤＮＡライブラリー中のその対立遺伝子変異体を単離すること；（２）Verma et al., の HUMAN CHROSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York (1988) に記載のように、***中期の染色体拡散を、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば「ＦＩＳＨ」）してＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失遺伝子又は切断されたＡＬＫ遺伝子の正確な染色***置を提供すること；及び特定組織での、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質又は切断されたＡＬＫキナーゼｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析を包含する。 The present invention includes at least the nucleic acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) or the nucleic acid sequence of the deposited cDNA, whether or not they encode polypeptides having ALK kinase activity. It contains nucleic acid molecules having 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homology. It is used by those skilled in the art as to how to use this nucleic acid molecule, eg, as a hybridization probe or as a primer for the polymerase chain reaction (PCR), even if the particular nucleic acid molecule does not encode a fusion polypeptide having ALK kinase activity. Because I already know. The uses of the nucleic acid molecules of the invention that do not encode a polypeptide having a kinase are, among other things, (1) an EML4-ALK deleted gene, or a cleaved ALK gene, or its allelic variant in a cDNA library. (2) In situ hybridization, as described in HUMAN CHROSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York (1988) by Verma et al., For example, "FISH") to provide the exact chromosomal location of the EML4-ALK deleted gene or the cleaved ALK gene; and the expression of the EML4-ALK fusion protein or cleaved ALK kinase mRNA in a particular tissue. Includes Northern Blot Analysis for Detection.

しかしながら、実際にＡＬＫキナーゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードする、本発明の突然変異ＡＬＫポリペプチド又は寄託されているｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９５％相同な配列を有する核酸分子が好ましい。そのような活性は、特定な生物学的アッセイで測定して、本明細書に開示されるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（全長のタンパク質、成熟タンパク質、又はキナーゼ活性を保持しているタンパク質断片の何れか）と、同様であってよく、同一である必要はない。例えば、ＡＬＫのキナーゼ活性は、１つ又はそれ以上のチロシン含有ペプチド基質、例えば、ＡＬＫキナーゼの基質である、インシュリン受容体基質１又は２（ＩＲＳ１、ＩＲＳ２）をリン酸化する能力を判定するために試験することができる。 However, a nucleic acid molecule having a sequence that is at least 95% homologous to the nucleic acid sequence of the mutant ALK polypeptide of the invention or the deposited cDNA, which actually encodes a fusion polypeptide having ALK kinase activity, is preferred. Such activity is measured by a specific biological assay and is either an EML4-ALK fusion protein disclosed herein (a full-length protein, a mature protein, or a protein fragment that retains kinase activity. ), It does not have to be the same. For example, the kinase activity of ALK is to determine the ability to phosphorylate one or more tyrosine-containing peptide substrates, eg, insulin receptor substrates 1 or 2 (IRS1, IRS2), which are substrates for ALK kinase. Can be tested.

遺伝子コードを縮重すれば、寄託されているｃＤＮＡの核酸配列又は図２Ａ-Ｂ（配列番号２及び１９）に示される核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同な配列を有する多くの核酸分子が、ＡＬＫ活性を有する突然変異ポリペプチドをコードするであろうことを当業者は直ちに認識するであろう。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体の全てが同様なペプチドをコードするので、このことは上記の比較アッセイを行わなくても、当業者に明確であろう。更に、縮重変異体ではないそのような核酸分子に関しては、相当数がＡＬＫ活性を保持しているポリペプチドをコードするであろうことが、当該技術分野で認識されるだろう。それは、タンパク質機能に重要な影響を及ぼすことが殆ど無いか又は可能性がないアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換する）を、当業者が充分に認識しているからである。 To reduce the genetic code, at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or the nucleic acid sequence of the deposited cDNA or the nucleic acid sequence shown in FIGS. 2AB (SEQ ID NOs: 2 and 19). Those skilled in the art will immediately recognize that many nucleic acid molecules with 99% homologous sequences will encode mutant polypeptides with ALK activity. In fact, all of the degenerate variants of these nucleotide sequences encode similar peptides, which will be apparent to those of skill in the art without the above comparative assay. Furthermore, it will be recognized in the art that for such nucleic acid molecules that are not degenerate variants, a significant number will encode polypeptides that retain ALK activity. It is well recognized by those skilled in the art for amino acid substitutions (eg, replacing one aliphatic amino acid with a second aliphatic amino acid) that have little or no significant effect on protein function. Because it is.

例えば、表現型の上では軽微なアミノ酸置換を如何に行うかについての助言が、Bowie et al., 「Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions」, Science 247:1306-1310 (1990) に掲載されており、これは改変するアミノ酸配列の許容範囲を検討する２つの主要なアプローチを記載している。第一の方法は、突然変異は自然淘汰によって受け入れられるか又は拒絶されるかの何れかであるという、進化の過程に因っている。第２のアプローチは、クローン遺伝子の特定部位にアミノ酸変化を導入するための遺伝子組み換え技術、及び機能性を保持している配列を同定するための選択又はスクリーニングを利用している。これらの検討は、タンパク質がアミノ酸置換に意外に耐えるということを明確にした。そのような技術に精通している当業者は、タンパク質のある特定の位置においてどのアミノ酸変化が許容可能であるかも理解される。例えば、殆どの埋設アミノ酸残基は非極性の側鎖を必要としているのに対して、殆どの表面側鎖の特性は一般に保護されていない。他のそのような表現型の上での軽微な置換は、Bowie et al., supra.及びそこで引用されている引例に記載されている。 For example, Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306-1310 (1990), provides advice on how to make phenotypically minor amino acid substitutions. Published in, which describes two major approaches to assessing the tolerance of the amino acid sequence to be modified. The first method relies on an evolutionary process in which mutations are either accepted or rejected by natural selection. The second approach utilizes genetic recombination techniques to introduce amino acid changes at specific sites of cloned genes, and selection or screening to identify sequences that retain functionality. These studies have clarified that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions. Those skilled in the art who are familiar with such techniques will also understand which amino acid changes are acceptable at certain positions in the protein. For example, most embedded amino acid residues require non-polar side chains, whereas most surface side chain properties are generally unprotected. Minor substitutions on other such phenotypes are described in Bowie et al., Supra. And the references cited therein.

当該技術分野で公知かつ一般に利用可能な、ＤＮＡ配列を決定する方法は、本発明のポリヌクレオチドの態様の何れかを実施するために用いることができる。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片（Klenow fragement）、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio）、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham, Chicago, IL）、又は組み換えポリメラーゼと、Gibco BRL（Gaithersburg, Md.) が市販しているELONGASE Amplification Systemのような校正エクソヌクレアーゼとの組合わせのような酵素を用いることができる。この工程は、Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.)、Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, Mass.) 及び ABI 377 DNA sequencers (Perkin Elmer) のような器械を用いて自動化することが好ましい。 Methods known and generally available in the art for determining DNA sequences can be used to carry out any of the aspects of the polynucleotides of the invention. This method involves Klenow fragmentation of DNA polymerase 1, SEQENASE® (US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio), Taq polymerase (Perkin Elmer), thermostable T7 polymerase (Amersham, Chicago, IL), or Enzymes such as a combination of recombinant polymerase with a calibrated exonuclease such as the ELONGASE Amplification System commercially available by Gibco BRL (Gaithersburg, Md.) Can be used. This process should be automated using instruments such as the Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, Mass.) And the ABI 377 DNA sequencers (Perkin Elmer). Is preferable.

本発明の突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の部分を用い、プロモーター及び制御エレメントのような上流配列を検出するための、当該技術分野で公知の多数の方法を利用して拡張することができる。例えば、利用できる一つの方法である、「制限部位」ＰＣＲは、公知の遺伝子座に隣接している未知の配列を検索するユニバーサルプライマーを用いる（Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2:318-322(1993)）。特に、ゲノムＤＮＡは、リンカー配列に対するプライマー及び公知領域に特異的なプライマーの存在下で、最初に増幅される。典型的なプライマーは本明細書の実施例２に記載されるようなものである。増幅された配列は次いで、最初のＤＮＡ内部に同じリンカープライマー及び別の特異的プライマーを用いて、２回目のＰＣＲを受ける。ＰＣＲの各回の産物を適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写して、逆転写酵素を用いて配列を決定する。 The polynucleotide sequence encoding the mutant ALK polypeptide of the invention uses a portion of the nucleotide sequence to utilize a number of methods known in the art for detecting upstream sequences such as promoters and control elements. Can be extended. For example, one available method, "restricted site" PCR, uses universal primers to search for unknown sequences flanking known loci (Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2: 318- 322 (1993)). In particular, genomic DNA is first amplified in the presence of primers for the linker sequence and primers specific for known regions. Typical primers are as described in Example 2 herein. The amplified sequence is then subjected to a second PCR with the same linker and different specific primers inside the first DNA. The products of each PCR are transcribed with the appropriate RNA polymerase and sequenced with reverse transcriptase.

逆ＰＣＲも、公知領域に基づく分岐プライマーを用いて、配列を増幅又は拡張するために利用することができる（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)）。プライマーは、OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.)、又は別の適切なプログラムを用いて、２２−３０のヌクレオチドの長さに、５０％又はそれ以上のＧＣ含量を有するように、そして約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計することができる。この方法は、遺伝子の公知領域に適切な断片を産生するために幾つかの制限酵素を用いる。この断片は次いで、分子内ライゲーションによって環化されてＰＣＲテンプレートとして利用される。 Reverse PCR can also be used to amplify or extend the sequence with branched primers based on known regions (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16: 8186 (1988)). Primers have a GC content of 50% or more in a nucleotide length of 22-30, using OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), Or another suitable program. And can be designed to anneal to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. This method uses several restriction enzymes to produce suitable fragments in known regions of the gene. This fragment is then cyclized by intramolecular ligation and used as a PCR template.

使用可能な別の方法は、ヒト及び酵母の人工染色体ＤＮＡにおける公知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む捕捉ＰＣＲである（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-119 (1991)）。この方法では、ＰＣＲの実施前にＤＮＡ分子の未知部分へ改変二本鎖配列を挿入するために、多数の制限酵素による消化及びライゲーションを用いることもできる。未知の配列を検索するために用いることとができる別の方法は、Parker et al., Nucleic Acids Res. 19:3055-3060 (1991) に記載されているものである。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー（nested primers)、及びゲノムＤＮＡを扱うPROMOTERFINDER（登録商標）ライブラリーを用いることができる（Clontech, Palo Alto, Calif.）。この処理はスクリーンライブラリーを必要とせず、イントロン／エクソン連結を検出するために有用である。 Another method available is capture PCR involving PCR amplification of DNA fragments flanking known sequences in human and yeast artificial chromosome DNA (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-119 (1991)). ). In this method, digestion and ligation with multiple restriction enzymes can also be used to insert the modified double-stranded sequence into an unknown portion of the DNA molecule prior to PCR. Another method that can be used to search for unknown sequences is that described in Parker et al., Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060 (1991). In addition, PROMOTER FINDER® libraries for PCR, nested primers, and genomic DNA can be used (Clontech, Palo Alto, Calif.). This process does not require a screen library and is useful for detecting intron / exon connections.

全長のｃＤＮＡをスクリーニングする場合には、より大きいｃＤＮＡを包含するためにサイズ選択されているライブラリーを用いることが好ましい。また、ランダムプライムライブラリーは、遺伝子の５’領域を含むより多くの配列を含有しているので好ましい。ランダムプライムライブラリーは特に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが全長のｃＤＮＡをもたらさない状況で有用であろう。ゲノムライブラリーは５’及び３’非転写制御領域への配列の拡張のために有用であろう。 When screening full-length cDNAs, it is preferable to use a size-selected library to include larger cDNAs. Random prime libraries are also preferred as they contain more sequences containing the 5'region of the gene. Random prime libraries may be particularly useful in situations where oligo d (T) libraries do not yield full-length cDNA. Genomic libraries may be useful for extending sequences to 5'and 3'non-transcriptional regulatory regions.

市販されているキャピラリー電気泳動システムを、シーケンシング又はＰＣＲ産物のサイズを分析するために又はヌクレオチド配列を確認するために用いることができる。特に、キャピラリーシーケシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザーで活性化される４つの異なった蛍光染料（一つは各ヌクレオチド用）、及び電荷結合素子カメラによる放出波長の検出を利用する。光出力強度は適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER（登録商標）及びSEQUENCE NAVIGATOR（登録商標）、Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換でき、試料の挿入からコンピュータ分析及び電気データの表示までの全ての過程をコンピュータ制御できる。キャピラリー電気泳動は、特定試料に限られた量で存在しているかもしれないＤＮＡの小片の配列決定のために特に好ましい。 A commercially available capillary electrophoresis system can be used to analyze the size of sequencing or PCR products or to confirm nucleotide sequences. In particular, capillary sequencing utilizes fluid polymers for electrophoretic separation, four different optical brighteners activated by laser (one for each nucleotide), and emission wavelength detection with a charge-binding element camera. To do. Light output intensity can be converted to electrical signals using appropriate software (eg, GENOTYPER® and SEQUENCE NAVIGATOR®, Perkin Elmer), everything from sample insertion to computer analysis and display of electrical data. The process can be computer controlled. Capillary electrophoresis is particularly preferred for sequencing small pieces of DNA that may be present in limited amounts in a particular sample.

Ｃ．ベクター及び宿主細胞
本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、組み換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組み換え技術による組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫポリペプチド又はその断片の産生も提供する。 C. Vectors and Host Cells The invention also provides the production of recombinant vectors containing the isolated polynucleotides of the invention, host cells genetically engineered with recombinant vectors, and recombinant EML4-ALK polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques. To do.

組み換え構築物を、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、電気穿孔法及び形質転換のような周知の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。ベクターは例えば、ファージ、プラスミド、ウィルス又はレトロウィルスのベクターであってよい。レトロウィルスベクターは複製可能又は複製欠損であってもよい。後者の場合は、ウィルスの増殖は一般に、相補宿主細胞中のみで起こるであろう。 Recombinant constructs can be introduced into host cells using well-known techniques such as infection, transduction, transfection, transfection, electroporation and transformation. The vector may be, for example, a phage, plasmid, viral or retrovirus vector. The retrovirus vector may be replicable or replication-deficient. In the latter case, viral growth will generally occur only in complementary host cells.

ポリヌクレオチドを、宿主における増殖を選択可能なマーカーを含有しているベクターに結合することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物、又は荷電脂質との錯体に導入される。ベクターがウィルスの場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングし、次いで宿主細胞に形質導入することができる。 The polynucleotide can be attached to a vector containing markers that are selectable for growth in the host. Generally, the plasmid vector is introduced into a precipitate, such as a calcium phosphate precipitate, or a complex with a charged lipid. If the vector is a virus, it can be packaged in vitro using the appropriate packaging cell line and then transduced into host cells.

目的のポリヌクレオチドに対してシス作用制御領域を含有しているベクターが好ましい。適切なトランス作用因子を、宿主によって供給、相補ベクターによって供給、又は宿主に導入することによりベクター自身によって供給できる。これに関するある好ましい態様では、ベクターは、誘導可能な及び／又は細胞型固有の、特定な発現を行う。そのようなベクターのうち特に好ましいものは、温度及び栄養素添加物のような、容易に操作できる環境因子によって誘導可能なものである。 A vector containing a cis action control region with respect to the desired polynucleotide is preferable. Appropriate trans-acting factors can be supplied by the host, by the complementary vector, or by the vector itself by introduction into the host. In one preferred embodiment in this regard, the vector exhibits inducible and / or cell type specific, specific expression. Particularly preferred of such vectors are those that can be induced by easily manipulated environmental factors such as temperature and nutrient additives.

本発明で有用な発現ベクターは、染色体、エピソーム、及びウィルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシナウィルス、アデノウィルス、家禽ジフテリアウィルス、仮性狂犬病ウィルス及びレトロウィルス、及びコスミド及びファージミドのような、これらの組合わせ由来のベクターを包含する。 Expression vectors useful in the present invention include vectors derived from chromosomes, episomes, and viruses, such as bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast chromosomal elements, baculoviruses, papovaviruses, waxinaviruses, adenoviruses, poultry diphtheriaviruses, pseudomad dog diseases. Includes vectors from these combinations, such as viruses and retroviruses, and cosmid and phagemid.

ＥＭＬ４−ＡＬＫポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡの挿入物は、数例を挙げると、ラムダファージＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０早期及び後期プロモーター及びレトロウィルスＬＴＲｓのプロモーターのような、適切なプロモーターと操作可能に結合しなければならない。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物は更に、転写を開始、終了するための部位、及び転写領域に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有しているであろう。この構築物によって発現された成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの末端に正確に位置している開始及び終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）に翻訳開始部位を包含していることが好ましいだろう。 DNA inserts containing the EML4-ALK polynucleotide or the polynucleotide of the invention include the lambda phage PL promoter, the Escherichia coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and the promoters of the retrovirus LTRs, to name a few. Must operably bind to the appropriate promoter, such as. Other suitable promoters are known to those of skill in the art. The expression construct will further contain a site for initiating and terminating transcription, and a ribosome binding site for translation in the transcription region. The coding portion of the mature transcript expressed by this construct may include a translation initiation site at the start and stop codons (UAA, UGA or UAG) located exactly at the end of the polypeptide being translated. Would be preferred.

示されるように、発現ベクターは少なくとも１つの選択可能なマーカーを包含していることが好ましいだろう。そのようなマーカーは、真核細胞の培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、及び大腸菌及び他の細菌培養におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子を包含する。適切な宿主の代表的な例は、これに限定されないが、大腸菌、ストレプトミセス及びネズミチフス菌細胞のような細菌細胞；酵母細胞のような、真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ及びボーズ（Bowes）メラノーマ細胞のような動物細胞；及び植物細胞を包含する。上記宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当該技術分野で公知である。 As shown, it would be preferable that the expression vector contains at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell cultures, and tetracycline or ampicillin resistance genes in E. coli and other bacterial cultures. Representative examples of suitable hosts are, but are not limited to, bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces and murine typhoid cells; fungal cells such as yeast cells; Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells. Insect cells; animal cells such as CHO, COS and Bowes melanoma cells; and plant cells. Suitable culture media and conditions for the host cells are known in the art.

細菌において用いられるベクターで好ましいものは、Quiagen から入手できる、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；Stratagene から入手できるｐＢＳベクター、ファージスクリプト（Phagescript) ベクター、ブルースクリプト (Bluescript) ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及び Pharmacia から入手できるｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を包含する。真核ベクターのうち好ましいものは、Stratagene から入手できるｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；及び Pharmacia から入手できるｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬである。他の適切なベクターは当業者にとって明白であろう。 Preferred vectors used in bacteria are pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, available from Stratagene, Includes pNH46A; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be apparent to those of skill in the art.

公知の細菌プロモーターのうち本発明で用いるのに適しているものは、大腸菌ｌａｃ１及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ及びＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーターを包含する。適切な真核プロモーターはＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、後期及び前期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のような、レトロウィルスＬＴＲｓのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン−１プロモーターのような、メタロチオネインプロモーターを包含する。 Among the known bacterial promoters, those suitable for use in the present invention include the E. coli lac1 and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters are CMV pre-early promoter, HSV thymidine kinase promoter, late and early SV40 promoters, retrovirus LTRs promoters such as Rous sarcoma virus (RSV), and metallothioneine promoters such as mouse metallotionein-1 promoter. Including.

酵母、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨのような、構成的又は誘導性のプロモーターを含む多くのベクターを用いることができる。総説については、Ausubel et al. (1989) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 及び Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1997) を参照されたい。 In yeast, Saccharomyces cerevisiae, many vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used. For a review, see Ausubel et al. (1989) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y. and Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1997).

この構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、陽イオン性脂質介在トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染又は他の方法によって達成できる。そのような方法は、Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) のような、多くの標準的な実験用マニュアルに記載されている。 Introduction of this construct into host cells can be achieved by calcium phosphate transfection, DEAE dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard experimental manuals, such as Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986).

高等真核生物による、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増進させることができる。エンハンサーは、所定の宿主細胞においてプロモーターの転写活性を増大するように働く通常約１０〜３００ｂｐである、ＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーの例は、塩基対１００〜２７０の複写起点の後期部位に位置しているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス前期プロモーターエンハンサー、複写起点の後期部位にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウィルスエンハンサーを包含する。 Transcription of the DNA encoding the EML4-ALK fusion polypeptide of the invention by higher eukaryotes can be enhanced by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10-300 bp, that act to increase the transcriptional activity of promoters in a given host cell. Examples of enhancers include SV40 enhancers located at the late site of the copy origin of base pairs 100-270, cytomegalovirus early promoter enhancers, polyoma enhancers at the late site of the copy origin, and adenovirus enhancers.

翻訳されたタンパク質の、小胞体の内腔への、細胞膜周辺腔への、又は細胞外環境への分泌のために、適切な分泌シグナルを発現されたポリペプチド中に組み入れることができる。このシグナルはポリペプチドに対して内因性であってよく、又はこれらは異種シグナルであってもよい。 Appropriate secretory signals can be incorporated into the expressed polypeptide for secretion of the translated protein into the endoplasmic reticulum lumen, into the pericellular space, or into the extracellular environment. This signal may be endogenous to the polypeptide, or they may be heterologous signals.

ポリペプチドを、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ−融合）のような改変形態で発現してよく、そして分泌シグナルだけではなく、更なる異種の機能領域を含んでいてもよい。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域を、精製中、又はその後の処理又は貯蔵中に、安定性及び宿主細胞への残存を改善するために、ポリペプチドのＮ−末端に付加することができる。また、精製を促進するために、ペプチド残基をこのポリペプチドに付加してもよい。そのような領域はポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。とりわけ、分泌又は排出を引き起こすための、安定性を改善するための、そして精製を促進するための、ペプチド残基のポリペプチドへの付加は当該技術分野でよく知られていて通常の手法である。好ましい融合タンパク質はタンパク質を可溶化するのに有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含有している。 The polypeptide may be expressed in a modified form such as a fusion protein (eg, GST-fusion) and may contain additional heterologous functional regions as well as secretory signals. For example, the addition of additional amino acids, especially regions of charged amino acids, to the N-terminus of the polypeptide during purification or subsequent processing or storage to improve stability and retention in the host cell. Can be done. Peptide residues may also be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to the final preparation of the polypeptide. In particular, addition of peptide residues to a polypeptide to induce secretion or excretion, to improve stability, and to facilitate purification is a well-known and conventional procedure in the art. .. Preferred fusion proteins contain heterologous regions derived from immunoglobulins that are useful for solubilizing the protein.

ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸による抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを包含する、公知の方法で組み換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いることが最も好ましい。本発明のポリペプチドは、天然精製産物、化学合成過程の産物、及び例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類の細胞を含む、原核及び真核宿主から組み換え技術によって産生された産物を包含する。組み換え産生過程で用いられる宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていても、又はグリコシル化されていなくてもよい。更に、本発明のポリペプチドは、ある場合は宿主介在過程の結果、初期改変メチオニン残基を含有していてもよい。 EML4-ALK fusion polypeptide, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, cellulose phosphate chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography It can be recovered and purified from the recombinant cell culture by a known method including. Most preferably, high performance liquid chromatography (“HPLC”) is used for purification. The polypeptides of the invention include naturally purified products, products of chemical synthesis processes, and products produced by recombination techniques from prokaryotic and eukaryotic hosts, including, for example, bacterial, yeast, higher plant, insect and mammalian cells. To do. Depending on the host used in the recombinant production process, the polypeptides of the invention may or may not be glycosylated. In addition, the polypeptides of the invention may contain initially modified methionine residues, in some cases as a result of host-mediated processes.

従って、ある態様では、本発明は、組み換え宿主細胞（上記のような）を融合ポリペプチドの発現に適している条件下で培養して、ポリペプチドを回収することによって組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。宿主細胞の生育及びそのような細胞からの組み換えポリペプチドの発現に適している培養条件は、当業者にとって公知である。例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausbel FM et al., eds., Volume 2, Chapter 16, Wiley Interscience を参照されたい。 Thus, in some embodiments, the invention is a recombinant EML4-ALK fusion polypeptide by culturing recombinant host cells (as described above) under conditions suitable for expression of the fusion polypeptide and recovering the polypeptide. Provide a method of producing. Culture conditions suitable for the growth of host cells and the expression of recombinant polypeptides from such cells are known to those of skill in the art. See, for example, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausbel FM et al., Eds., Volume 2, Chapter 16, Wiley Interscience.

Ｄ．単離されたポリペプチド。
本発明は、ある部分では、単離された突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチド及びその断片を提供する。一態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１又は配列番号１８のアミノ酸配列を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−１２３、又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列；及び
（ｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４、又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするアミノ酸配列：
よりなる群から選ばれる配列と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチドを提供する。 D. An isolated polypeptide.
The present invention, in part, provides an isolated mutant ALK kinase polypeptide and fragments thereof. In one aspect, the invention
(A) Amino acid sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 18;
(B) The N-terminal amino acid sequence of EML-4 (residue 1-123 of SEQ ID NO: 3 or residue 1-495 of SEQ ID NO: 3) and the kinase domain of ALK (residue 1116-1383 of SEQ ID NO: 5). Amino acid sequence encoding an EML4-ALK fusion polypeptide containing: and (c) the fusion junction of the EML4-ALK fusion polypeptide (residue 233-234 of SEQ ID NO: 1 or residue 495 of SEQ ID NO: 18). Amino acid sequence encoding a polypeptide containing at least 6 adjacent amino acids, including -496):
Provided are an isolated polypeptide containing an amino acid sequence having at least 95% homology to a sequence selected from the group consisting of.

一つの好ましい態様では、上記のような組み換えベクター又は組み換え宿主細胞を用いて産生できる、本発明の組み換え突然変異ＡＬＫポリペプチドを提供する。 In one preferred embodiment, there is provided a recombinant mutant ALK polypeptide of the invention that can be produced using a recombinant vector or recombinant host cell as described above.

ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫキナーゼポリペプチドのアミノ酸配列の幾つかを、突然変異タンパク質の構造又は機能に有意な影響をもたらさずに、改変できるということは当該技術分野で認識されるであろう。配列中のそのような相違を検討する場合は、タンパク質に活性を決める重要な部位（例えばＡＬＫのキナーゼドメイン）があるようにすることを配慮すべきである。一般に、同じような機能を示す残基を用いれば、三次構造を形成する残基を置き換えることが可能である。他の例では、改変をタンパク質の重要ではない領域で行う場合は、残基のタイプは全く重要でなくてよい。 It has been recognized in the art that some of the amino acid sequences of the EML4-ALK fusion polypeptide or cleaved active ALK kinase polypeptide can be modified without significantly affecting the structure or function of the mutant protein. Will be. When considering such differences in the sequence, care should be taken to ensure that the protein has important sites that determine activity (eg, the kinase domain of ALK). In general, residues that exhibit similar function can be used to replace the residues that form tertiary structure. In another example, the type of residue does not have to be of any importance if the modification is made in a non-critical region of the protein.

従って、本発明は更に、実質的なＡＬＫキナーゼ活性を保持しているか、又は以下で検討するようなタンパク質部分のような、ＥＭＬ−４又はＡＬＫタンパク質の他の領域を含有している、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの変異体を包含している。そのような突然変異体は、欠失、挿入、反転、反復、及びタイプ置換（例えば、一つの親水性残基を別のものと置換するが、一般に親水性の強いものを疎水性の強いものとは置換しない）を包含する。小さな改変又は「中性」アミノ酸置換のようなものは、一般に活性に殆ど影響がないであろう。 Accordingly, the invention further retains substantial ALK kinase activity or contains EML-4 or other regions of the ALK protein, such as protein moieties as discussed below, EML4-. It contains variants of the ALK fusion polypeptide. Such mutants include deletions, insertions, inversions, repetitions, and type substitutions (eg, one that replaces one hydrophilic residue with another, but generally one that is highly hydrophilic and one that is highly hydrophobic. Does not replace). Something like minor modifications or "neutral" amino acid substitutions will generally have little effect on activity.

保存的置換として典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間での互いの置換；ヒドロキシ残基ＳｅｒとＴｈｒの交換、酸性残基ＡＳｐとＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの間での置換、塩基残基ＬｙｓとＡｒｇの交換、及び芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置き換えである。当業者に知られている保存的アミノ酸置換の例は；芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン；極性：グルタミン、アスパラギン；塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；小分子：アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシン；である。上で詳細に示したように、どのアミノ酸交換が表現型的に軽微であると思われるか（すなわち、機能に対して有意な悪影響をおよばさないと思われるか）についての更なる手引きをBowie et al., Science 247, supra に見出すことができる。 Typical conservative substitutions are mutual substitutions between the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu and Ile; exchange of hydroxy residues Ser and Thr, exchange of acidic residues ASP and Glu, amide residue. Substitution between groups Asn and Gln, exchange of base residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Ph and Tyr. Examples of conservative amino acid substitutions known to those of skill in the art are; aromatics: phenylalanine, tryptophan, tyrosine; hydrophobic: leucine, isoleucine, valine; polar: glutamine, aspartin; basic: arginine, lysine, histidine; acidic: Aspartic acid, glutamine; small molecules: alanine, serine, threonine, methionine, glycine; As detailed above, Bowie provides further guidance on which amino acid exchanges appear to be phenotypically minor (ie, do not appear to have a significant adverse effect on function). It can be found in et al., Science 247, supra.

本発明のポリペプチドは単離された形態、好ましくは実質的に精製された形態で、提供されることが好ましい。本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの組み換え産生物は、Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988) に記載されている一工程方法で実質的に精製することができる。 The polypeptides of the invention are preferably provided in isolated form, preferably in substantially purified form. The recombinant product of the EML4-ALK fusion polypeptide of the present invention can be substantially purified by the one-step method described in Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988).

本発明のポリペプチドは、図２Ａ−Ｂ（配列番号１及び１８）（リーダー配列を含んでいてもいなくても）のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド、ＥＭＬ−４のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号３の残基１−１２３、又は配列番号３の残基１−４９５）及びＡＬＫのキナーゼドメイン（配列番号５の残基１１１６−１３８３）を含有しているＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列、及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（配列番号１の残基２３３−２３４、又は配列番号１８の残基４９５−４９６）を包含する少なくとも６つの隣接アミノ酸を含有しているポリペプチドをコードするアミノ酸配列（図１Ａ−Ｂ、最下図も参照されたい）を、更に、上記のものと少なくとも９０％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、そして更に好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドも包含する。 The polypeptide of the present invention is the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO:) of EML4-ALK fusion polypeptide, EML-4, of FIGS. 2A-B (SEQ ID NOs: 1 and 18) (with or without a leader sequence). Amino acid encoding an EML4-ALK fusion polypeptide containing residue 1-123 of 3, or residue 1-495 of SEQ ID NO: 3) and the kinase domain of ALK (residue 1116-1383 of SEQ ID NO: 5). A polypeptide containing the sequence and at least 6 adjacent amino acids comprising the fusion junction of the EML4-ALK fusion polypeptide (residue 233-234 of SEQ ID NO: 1 or residue 495-49 of SEQ ID NO: 18). The amino acid sequence encoding the above (FIGS. 1AB, see also bottom figure) further comprises at least 90% homology, preferably at least 95% homology, and even more preferably at least 96%. It also includes polypeptides having 97%, 98% or 99% homology.

二つのポリペプチドに対する「％」の相同性とは、ベストフィットプログラム（Bestfit program; Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) 及び相同性を判定するためのデフォルト設定を用いて二つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較して作成した相同性スコアーを意図している。ベストフィットは、二つの配列間の相同性の最良の部分を見出すために、Smith and Waterman の局所相同性アルゴリズム（Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)) を用いる。 The "%" homology to two polypeptides is the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) and It is intended as a homology score created by comparing the amino acid sequences of two polypeptides using the default settings for determining homology. Bestfit uses Smith and Waterman's Local Homology Algorithm (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)) to find the best part of homology between two sequences.

ポリペプチドが、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの参照アミノ酸配列と、例えば少なくとも９５％「相同な」アミノ酸配列を有しているとは、このポリペプチドのアミノ酸配列が、突然変異ＡＬＫポリペプチドの参照アミノ酸配列の各々の１００のアミノ酸当たり５個までのアミノ酸改変をアミノ酸配列が含有していてもよいことを除いて、参照配列と相同であることを意図している。すなわち、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列の５％までのアミノ酸残基を欠失又は他のアミノ酸と置換させてもよい、又は参照配列中の総アミノ酸残基の５％までのアミノ酸の数を、参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端位置、又はこれら末端位置の間の何れかの位置に、参照配列中の残基間に個々に、又は参照配列内の１つ又はそれ以上の隣接基に散在させて、生じさせることができる。 When a polypeptide has, for example, at least 95% "homologous" amino acid sequence with the reference amino acid sequence of the EML4-ALK fusion polypeptide of the invention, the amino acid sequence of this polypeptide is a mutant ALK polypeptide. It is intended to be homologous to the reference sequence, except that the amino acid sequence may contain up to 5 amino acid modifications per 100 amino acids of each of the reference amino acid sequences of. That is, in order to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% homologous to the reference amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence may be deleted or replaced with other amino acids, or the reference sequence. The number of amino acids up to 5% of the total amino acid residues in may be inserted into the reference sequence. These modifications of the reference sequence can be made at either the amino-terminal or carboxy-terminal positions of the reference amino acid sequence, or between these terminal positions, individually between the residues in the reference sequence, or in one of the reference sequences. It can be generated by interspersing it with or more adjacent groups.

特定の配列が、本発明による参照配列と、例えば、９５％の相同性を有するか否かを判定するために、ベストフィット又は他の配列配置プログラムの何れかを用いるときは、もちろん、参照アミノ酸配列の全長に対して相同性のパーセントが計算されるように、そして参照配列のアミノ酸残基の総数の最大５％の相同性のずれが許容されるように、パラメーターがセットされる。 Of course, when using either Best Fit or any other sequencing program to determine if a particular sequence has 95% homology with a reference sequence according to the invention, the reference amino acid The parameters are set so that the percentage of homology is calculated relative to the total length of the sequence and that a deviation of up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence is allowed.

本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドは、例えば当業者に公知の方法を用いる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、モレキュラーシーブゲルろ過カラム上で分子量マーカーとして使用できる。 The EML4-ALK fusion polypeptide of the present invention can be used as a molecular weight marker on an SDS-PAGE gel or molecular sieve gel filtration column using, for example, a method known to those skilled in the art.

以下に更に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、以下に記載するような突然変異ＡＬＫポリペプチドの発現を検出するアッセイに、又は突然変異ＡＬＫタンパク質の機能／活性を増強又は阻害することが可能な作動薬又は拮抗薬として有用な、ポリクローナル及びモノクローナル抗体のような融合ポリペプチドに特異的な試薬、又は切断されたポリペプチドに特異的な試薬を作成するためにも用いることができる。更に、そのようなポリペプチドは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド、又は本発明による候補作動薬及び拮抗薬でもある断片ＡＬＫキナーゼポリペプチド結合タンパク質を「捕捉」するための、酵母２ハイブリッドシステムで使用することができる。酵母２ハイブリッドシステムは、Fields and Song, Nature 340:245-246 (1989) に記載されている。 As described in more detail below, the polypeptides of the invention can be used in assays to detect the expression of mutant ALK polypeptides as described below, or to enhance or inhibit the function / activity of mutant ALK proteins. It can also be used to create a fusion polypeptide-specific reagent, such as a polyclonal and monoclonal antibody, or a cleaved polypeptide-specific reagent that is useful as an agonist or antagonist capable of it can. In addition, such polypeptides are used in yeast 2-hybrid systems to "capture" EML4-ALK fusion polypeptides, or fragment ALK kinase polypeptide-binding proteins that are also candidate agonists and antagonists according to the invention. be able to. The yeast two hybrid system is described in Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989).

別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを含む部分、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（図１Ａ−Ｂ、最下図を参照されたい）を含有するエピトープ、を含むペプチド又はポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性又は抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫源であるときに抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義されている。これらの免疫原性エピトープは分子上の幾つかの遺伝子座に閉じこめられると考えられている。一方、抗体が結合できるタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」と定義されている。タンパク質の免疫原性エピトープの数は一般に抗原エピトープの数より少ない。例えば、Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983) を参照されたい。本発明の融合ポリペプチドに特異的な抗体の産生は以下に更に詳細に記載されている。 In another aspect, the invention comprises an epitope containing an epitope of the polypeptide of the invention, eg, an epitope containing a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide (FIG. 1AB, see bottom figure). Provided are peptides or polypeptides containing. The epitope portion of this polypeptide is an immunogenic or antigenic epitope of the polypeptide of the invention. An "immunogenic epitope" is defined as part of a protein that elicits an antibody response when all proteins are the source of immunity. These immunogenic epitopes are thought to be confined to several loci on the molecule. On the other hand, the region of the protein molecule to which the antibody can bind is defined as an "antigen epitope". The number of immunogenic epitopes of a protein is generally less than the number of antigenic epitopes. See, for example, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983). The production of antibodies specific for the fusion polypeptide of the invention is described in more detail below.

抗原エピトープを含むペプチド又はポリペプチドを用いて産生された抗体は模倣タンパク質の検出に有用であり、そして異なったペプチドに対する抗体は、翻訳後処理を受けているタンパク質前駆体の各種領域の運命を追跡するために用いることができる。ペプチド及び抗ペプチド抗体は、例えば、免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９のアミノ酸）であっても、より大きいペプチドに結合して置き換え得ることが示されているので、模倣タンパク質についての定性及び定量アッセイ、例えば競合アッセイに用いることができる。例えば、Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984) at 777 を参照されたい。本発明の抗ペプチド抗体は、例えば、当該技術分野で公知の方法を用いる吸着クロマトグラフィーによる、模倣タンパク質の精製に関して有用である。免疫アッセイの方式は以下により詳細に記載されている。 Antibodies produced with peptides or polypeptides containing antigenic epitopes are useful in detecting mimicking proteins, and antibodies against different peptides track the fate of various regions of the protein precursor undergoing post-translation treatment. Can be used to. Peptides and anti-peptide antibodies have been shown, for example, in immunoprecipitation assays to be able to bind and replace even shorter peptides (eg, about 9 amino acids) to larger peptides, and thus for mimetic proteins. It can be used in qualitative and quantitative assays, such as competitive assays. See, for example, Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984) at 777. The anti-peptide antibody of the present invention is useful, for example, for purifying mimic proteins by adsorption chromatography using methods known in the art. The method of immunoassay is described in more detail below.

組み換え突然変異ＡＬＫポリペプチドも本発明の範囲内であって、上記Ｂ欄に記載されるようにして、本発明のポリヌクレオチドを用いて産生することができる。例えば、本発明はある部分では、組み換え宿主細胞（上記のような）を融合ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で培養し、そしてポリペプチドを回収することによる、組み換えＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。宿主細胞の生育及びそのような細胞から組み換えポリペプチドを発現するのに適している条件は当業者にとって公知である。 The recombinant mutant ALK polypeptide is also within the scope of the present invention and can be produced using the polynucleotide of the present invention as described in column B above. For example, the present invention is, in part, a recombinant EML4-ALK fusion poly by culturing recombinant host cells (as described above) under conditions suitable for expressing the fusion polypeptide and then recovering the polypeptide. A method for producing a peptide is provided. Suitable conditions for the growth of host cells and the expression of recombinant polypeptides from such cells are known to those of skill in the art.

Ｅ．突然変異体に特異的な試薬
開示される方法の実施に有用な突然変異ＡＬＫポリペプチドに特異的な試薬は、とりわけ、融合ポリペプチドに特異的な抗体及び対応するＡＱＵＡペプチド（重同位体標識化ペプチド）を包含し、そして哺乳類の固形肉腫又は癌腫瘍のような、癌由来の生体試料におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現を検出及び定量化するのに適している。本発明の切断されたＡＬＫキナーゼポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在又は非存在を検出するのに適している、抗体、ＡＱＵＡペプチド又は核酸プローブのような、切断片に特異的な試薬も有用である。融合ポリペプチドに特異的な試薬は、生体試料中に発現されたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的に結合して、その存在／レベルを検出及び／又は定量化できる、生物学的又は化学的試薬の何れかである。この用語は、これに限定されないが、以下で検討する好ましい抗体及びＡＱＵＡペプチド試薬を包含し、均等な試薬は本発明の範囲内である。 E. Mutant-Specific Reagents Mutant ALK polypeptide-specific reagents useful for practicing the disclosed methods include, among other things, fusion polypeptide-specific antibodies and corresponding AQUA peptides (heavy isotope labeling). Peptides) and are suitable for detecting and quantifying the expression of EML4-ALK fusion polypeptides in biological samples derived from cancer, such as mammalian solid sarcoma or cancer tumors. Cleavage-specific reagents such as antibodies, AQUA peptides or nucleic acid probes suitable for detecting the presence or absence of a cleaved ALK kinase polynucleotide or polypeptide of the invention are also useful. Reagents specific for the fusion polypeptide are biological or chemical capable of specifically binding to the EML4-ALK fusion polypeptide expressed in a biological sample to detect and / or quantify its presence / level. It is one of the reagents. The term includes, but is not limited to, preferred antibodies and AQUA peptide reagents discussed below, and equivalent reagents are within the scope of the present invention.

抗体
本発明方法の実施で用いるのに適している試薬は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体及びＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体を包含する。本発明の融合体に特異的な抗体は、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド（例えば、配列番号１）に特異的に結合するが野生型のＥＭＬ−４又は野生型のＡＬＫの何れとも実質的に結合しない、又は本明細書に記載されるＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（例えば、配列番号２０）に特異的に結合するが野生型のＴＦＧ又は野生型のＡＬＫの何れとも実質的に結合しない、単離された抗体（複数を含む）である。他の適切な試薬は、野生型ＡＬＫタンパク質配列の細胞外ドメイン（このドメインは本明細書に開示される切断された活性ＡＬＫキナーゼ中に存在していない）中のエピトープに特異的に結合するので、試料中の野生型ＡＬＫの存在（又は非存在）を検出できる、エピトープに特異的な抗体を包含する。 Antibodies Suitable reagents for use in the practice of the methods of the invention include antibodies specific for the EML4-ALK fusion polypeptide and antibodies specific for the TFG-ALK fusion polypeptide. Antibodies specific for the fusions of the invention specifically bind to the EML4-ALK fusion polypeptide of the invention (eg, SEQ ID NO: 1) but are substantially either wild EML-4 or wild ALK. Does not bind, or specifically binds to the TFG-ALK fusion polypeptide described herein (eg, SEQ ID NO: 20) but does not substantially bind to either wild-type TFG or wild-type ALK. , An isolated antibody (including multiple). Because other suitable reagents specifically bind to epitopes in the extracellular domain of the wild-type ALK protein sequence, which domain is not present in the cleaved active ALK kinase disclosed herein. , Includes epitope-specific antibodies capable of detecting the presence (or absence) of wild-type ALK in samples.

ヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体は、他の哺乳類種、例えばネズミ又はウサギ中の高度に相同性かつ均等性を有するエピトープペプチド配列に結合してもよく、その逆も同様である。本発明の方法を実施するのに有用な抗体は、（ａ）モノクローナル抗体、（ｂ）標的のポリペプチド（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（図１Ａ−Ｂ、最下図を参照されたい）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（図１Ｃ、最下図を参照されたい）の融合接合部）に特異的に結合する精製されたポリクローナル抗体、（ｃ）他の非ヒト種（例えば、マウス、ラット）における均等で高度に相同性を有するエピトープか、又はリン酸化部位に結合する、上の（ａ）〜（ｂ）に記載されているような抗体、及び（ｄ）本明細書に開示される典型的な抗体が結合する抗原（又は、より好ましくはエピトープ）に結合する上記（ａ）〜（ｃ）の断片を包含する。 Antibodies specific for human EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptides may bind to highly homologous and homologous epitope peptide sequences in other mammalian species, such as mice or rabbits, and vice versa. Is the same. Antibodies useful for carrying out the methods of the present invention are (a) monoclonal antibodies, (b) fusion junctions of target polypeptides (eg, EML4-ALK fusion polypeptides (Fig. 1AB, see bottom figure). Purified polyclonal antibody that specifically binds to (see) or the fusion junction of the TFG-ALK fusion polypeptide (Fig. 1C, see bottom figure), (c) other non-human species (eg, mice). , Equal and highly homologous epitopes in (rats), or antibodies as described above (a)-(b) that bind to phosphorylation sites, and (d) disclosed herein. Includes fragments of (a)-(c) above that bind to an antigen (or more preferably an epitope) to which a typical antibody is bound.

本明細書で用いられる用語「抗体（複数を含む）」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む、全てのタイプの免疫グロブリンを示す。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであってもよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ又はヒトを含む、何れかの種を起源としていてもよく、又はキメラ抗体であってもよい。例えば、M. Walker et al., Molec. Immunol. 26:403-11 (1989); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984) を参照されたい。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号（Reading）又は米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.) に開示されている方法によって製造される組み換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体は米国特許第４，６７６，９８０号（Segel et al.) に開示されている方法によって作成される化学的に構築された特異抗体であってもよい。 As used herein, the term "antibody" refers to all types of immunoglobulins, including IgG, IgA, IgD, and IgE. The antibody may be monoclonal or polyclonal, may be of any species origin, including (eg) mouse, rat, rabbit, horse or human, or may be a chimeric antibody. For example, M. Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: See 604 (1984). The antibody may be a recombinant monoclonal antibody produced by the method disclosed in US Pat. No. 4,474,893 (Reading) or US Pat. No. 4,816,567 (Cabilly et al.). The antibody may be a chemically constructed specific antibody produced by the method disclosed in US Pat. No. 4,676,980 (Segel et al.).

本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体の好ましいエピトープ部位は、本質的にヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド配列（配列番号１及び１８）の約１１〜１７のアミノ酸から成っているペプチド断片であって、この断片は融合接合部（短い変異融合タンパク質の残基２３３−２３４、及び長い変異融合タンパク質の残基４９５−４９６に起こる（図１Ａ−Ｂ（最下図）を参照されたい）を包含している。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部を包含するより短い又はより長いペプチド／エピトープに特異的に結合する抗体が本発明の範囲内であるということは理解されるであろう。 The preferred epitope site of the antibody specific for the EML4-ALK fusion polypeptide of the invention is a peptide consisting essentially of about 11-17 amino acids of the human EML4-ALK fusion polypeptide sequences (SEQ ID NOs: 1 and 18). Fragments, which occur at fusion junctions (short mutant fusion protein residues 233-234 and long mutant fusion protein residues 495-436 (see Figure 1AB (bottom)). It is understood that an antibody that specifically binds to a shorter or longer peptide / epitope comprising a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide is within the scope of the invention. Let's go.

同様に、開示される方法の実施に有用なＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体の好ましいエピトープ部位は、本質的にヒトＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド配列（配列番号２０）の約１１〜１７のアミノ酸から成っているペプチド断片であって、この断片は融合接合部（残基１３７−１３８に起こる（図１Ｃ（最下図）を参照されたい）を包含している。 Similarly, preferred epitope sites for antibodies specific for the TFG-ALK fusion polypeptide useful in practicing the disclosed methods are essentially about 11-17 of the human TFG-ALK fusion polypeptide sequence (SEQ ID NO: 20). A peptide fragment consisting of the amino acids of, which contains the fusion junction (which occurs at residues 137-138 (see Figure 1C (bottom figure)).

本発明は抗体の使用に限定されず、本発明の方法で有用なＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体が結合するエピトープと本質的に同じエピトープに、融合タンパク質又は切断されたタンパク質に特異的な方法で結合する、タンパク質結合ドメイン又は核酸アプトマーのような、均等な分子の使用も包含する。例えば、Neuberger et al., Nature 312:604 (1984) を参照されたい。そのような均等な非抗体試薬は、以下に更に記載する本発明の方法において適切に利用することができる。 The invention is not limited to the use of antibodies, but fusion proteins or cleavages into essentially the same epitopes to which an antibody specific for an EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide useful in the methods of the invention binds. It also includes the use of equivalent molecules, such as protein binding domains or nucleic acid epitopes, that bind in a protein-specific manner. See, for example, Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984). Such uniform non-antibody reagents can be adequately utilized in the methods of the invention described further below.

本発明の方法を実施するのに有用なポリクローナル抗体は、公知の手法に従って、適当な動物（例えば、ウサギ、ヒツジなど）を、望ましい融合タンパク質に特異的なエピトープ（例えば、本明細書に記載されるＡＬＫ融合タンパク質の融合接合部）を包含する抗原で免疫し、動物から免疫血清を集めて、及び免疫血清からポリクロナール抗体を分離して、並びに所望の特異性を有するポリクローナル抗体を精製することによる標準的な技術に従って産生することができる。抗原は、公知の技術に従って選択されて構築された、所望のエピトープ配列を含有している合成ペプチド抗原であってもよい。例えば、ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p.75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods in Enzymology, 201:264-283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:21-49 (1962) を参照されたい。本明細書に記載のようにして産生したポリクローナル抗体は、以下に更に記載されるようにして、スクリーニング及び単離することができる。 Polyclonal antibodies useful for carrying out the methods of the invention are described herein in accordance with known techniques, with suitable animals (eg, rabbits, sheep, etc.) and epitopes specific for the desired fusion protein (eg, herein). By immunizing with an antigen containing (the fusion junction of the ALK fusion protein), collecting immune serum from the animal, and separating the polypeptide antibody from the immune serum, and purifying the polyclonal antibody having the desired specificity. It can be produced according to standard techniques. The antigen may be a synthetic peptide antigen containing the desired epitope sequence, selected and constructed according to known techniques. For example, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p.75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991); Merrifield, J. See Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962). Polyclonal antibodies produced as described herein can be screened and isolated as further described below.

モノクローナル抗体も本発明の方法で便利に利用することができ、Kohler and Milstein の公知技術に従ってハイブリドーマ細胞株中に産生することができる。Nature 265:495-97 (1975); Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Ausbel et al. Eds. (1989) も参照されたい。このようにして産生したモノクローナル抗体は高度に特異的で、本発明で提供されるアッセイ方法の選択性及び特異性を増強する。例えば、適切な抗原（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部を含有している合成ペプチド）を含有している溶液をマウスに注射して、十分な時間の後（通常の技術で保持して）、マウスをと殺して、脾臓細胞を得ることができる。次いでこの脾臓細胞を、一般にポリエチレングリコールの存在下で、骨髄腫細胞と融合して不死化してハイブリドーマ細胞を産生する。ウサギ融合ハイブリドーマは、例えば、１９９７年１０月７日登録の米国特許第５，６７５，０６３号（K.Knight）に記載されているようにして産生できる。次いでハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）のような、適切な選択培地中で生育して、上澄液を、以下に記載するような、所望の特異性を有するモノクローナル抗体についてスクリーニングする。分泌された抗体を、沈殿、イオン交換、親和性クロマトグラフィーなどのような通常の方法で組織培養上澄液から回収することができる。 Monoclonal antibodies can also be conveniently utilized in the methods of the invention and can be produced in hybridoma cell lines according to Kohler and Milstein's known techniques. See also Nature 265: 495-97 (1975); Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausbel et al. Eds. (1989). The monoclonal antibody thus produced is highly specific and enhances the selectivity and specificity of the assay methods provided in the present invention. For example, a solution containing a suitable antigen (eg, a synthetic peptide containing a fusion junction of an EML4-ALK fusion polypeptide) is injected into mice and retained after a sufficient period of time (conventional techniques). Then, the mice can be killed to obtain spleen cells. The spleen cells are then fused and immortalized with myeloma cells, generally in the presence of polyethylene glycol, to produce hybridoma cells. Rabbit fusion hybridomas can be produced, for example, as described in US Pat. No. 5,675,063 (K. Knight), registered October 7, 1997. Hybridoma cells are then grown in a suitable selective medium, such as hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT), and the supernatant is prepared for monoclonal antibodies with the desired specificity, as described below. Screen. The secreted antibody can be recovered from the tissue culture supernatant by conventional methods such as precipitation, ion exchange, affinity chromatography and the like.

モノクローナルＦａｂ断片も、当該技術分野で公知の組み換え技術によって大腸菌中に産生することができる。例えば、W. Huse, Science 246:1275-81 (1989); Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:8095 (1990) を参照されたい。１つのイソタイプのモノクローナル抗体が特定の適用に関して好ましい場合は、特定のイソタイプを最初の融合体から選択して直接的に作成するか、又はクラススイッチ変異体を単離するための同胞選択技術（Steplewski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74:307 (1984))を用いて、異なるイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に作成することができる。モノクローナル抗体の抗原結合部位を、ＰＣＲ及びファージディスプレー組み換え抗体又は大腸菌可溶性抗体のように産生させた単鎖抗体によってクローン化できる（例えば、ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor を参照されたい）。 Monoclonal Fab fragments can also be produced in E. coli by recombinant techniques known in the art. See, for example, W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8095 (1990). If a monoclonal antibody of one isotype is preferred for a particular application, a particular isotype is selected from the first fusion and made directly, or a sibling selection technique (Steplewski) for isolating class switch variants. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307 (1984)) to secrete monoclonal antibodies of different isotypes. It can be created secondarily from the parent hybridoma. The antigen binding site of a monoclonal antibody can be cloned by PCR and a single chain antibody produced such as a phage display recombinant antibody or an E. coli soluble antibody (see, eg, ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor). ).

更に、米国特許第５，１９４，３９２号（Geysen, 1990）は、目的の抗体の特定パラトープ（抗原結合部位）と相補的なエピトープ（すなわち、「ミモトープ」）の位相同型であるモノマー（アミノ酸又は他の化合物）の配列を検出又は決定する一般的な方法を記載している。より一般的には、この方法は、目的の特定の受容体のリガンド結合部位と相補的であるリガンドの局所的同型であるモノマーの配列の検出又は決定を含む。同様に、米国特許第５，４８０，９７１号（Houghten et al., 1996）は、直鎖Ｃ_１−Ｃ−アルキル過アルキル化オリゴペプチド及びセット及びそのようなペプチドのライブラリーを、更にそのようなペプチドセット及びライブラリーを用いて、目的の受容体分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定する方法も開示している。本発明のエピトープを含むペプチドの非ペプチド類縁体も、これらの方法で普通に作成することができる。 In addition, US Pat. No. 5,194,392 (Geysen, 1990) provides a monomer (amino acid) that is homeomorphic of an epitope (ie, "mimotope") complementary to a particular paratope (antigen binding site) of the antibody of interest. Or other compounds) describe general methods for detecting or determining the sequence. More generally, this method involves the detection or determination of a sequence of monomers that are locally isomorphic of a ligand that is complementary to the ligand binding site of a particular receptor of interest. Similarly, U.S. Patent No. 5,480,971 (Houghten et al., 1996 ) is a library of linear _C 1 -C- alkyl peralkylated oligopeptides and sets and such peptides, further such Also disclosed is a method of sequencing a hyperalkylated oligopeptide that preferentially binds to a receptor molecule of interest using a unique peptide set and library. Non-peptide analogs of peptides containing the epitopes of the invention can also be commonly made by these methods.

本発明の方法において有用な抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであろうと、標準的な技術によって、エピトープ及び融合タンパク質特異性についてスクリーニングすることができる。例えば、Czernik et al., Methods in Enzymology, 201:264-283 (1991) を参照されたい。例えば、抗体を、所望の抗体に対する特異性及び、所望により、例えば本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドとのみ反応して野生型のＥＭＬ−４又は野生型のＡＬＫとは反応しないという特異性の両方を確証するために、ＥＬＩＳＡによってペプチドライブラリーに対してスクリーニングすることができる。抗体を、所望の標的のみとの反応性を確認するために、そしてＡＬＫを含む他の融合タンパク質と感知可能程度に結合しないことを確証するために、標的タンパク質を含有する細胞調製物に対してウエスタンブロッティングで試験することもできる。融合タンパク質に特異的な抗体の産生、スクリーニング、及び使用は、当業者に公知であり、記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００５０２１４３０１号（Wetzel et al., September 29, 2005) を参照されたい。 Antibodies useful in the methods of the invention, whether polyclonal or monoclonal, can be screened for epitope and fusion protein specificity by standard techniques. See, for example, Czernik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991). For example, the specificity of the antibody to the desired antibody and, if desired, the specificity of reacting only with, for example, the EML4-ALK fusion polypeptide of the invention and not with wild-type EML-4 or wild-type ALK. To confirm both, the peptide library can be screened by ELISA. To cell preparations containing the target protein, to confirm reactivity of the antibody with only the desired target and to ensure that it does not sensibly bind to other fusion proteins, including ALK. It can also be tested by Western blotting. The production, screening, and use of antibodies specific for the fusion protein are known and described by those of skill in the art. See, for example, US Patent Application Publication No. 20050214301 (Wetzel et al., September 29, 2005).

本発明の方法で有用な融合ポリペプチドに特異的な抗体は、他の融合タンパク質の同様な融合エピトープと又は融合接合部を形成する野生型ＥＭＬ−４、野生型ＴＦＧ、及び野生型ＡＬＫのエピトープといくらかの限られた交差反応性を示す可能性がある。殆んどの抗体がある程度の交差反応性を示し、抗ペプチド抗体が免疫ペプチドと高い相同性又は同一性を有しているエピトープとしばしば交差反応するであろうことから、このことは予想外というわけではない。例えば、Czernic, supra を参照されたい。他の融合タンパク質との交差反応性は、分子量が知られているマーカーと並行して行うウェスタンブロッティングによって容易に明らかにすることができる。交差反応するタンパク質のアミノ酸配列を、抗体が結合するＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド配列と高い相同性又は同一性を有する部位を同定するために試験することができる。望ましくない交差反応性を、ペプチドカラム上での抗体精製を用いる陰性選択（例えば、野生型ＥＭＬ−４及び／又は野生型ＡＬＫの何れかと結合する抗体を選び出すこと）によって除くことができる。 Antibodies specific for fusion polypeptides useful in the methods of the invention are epitopes of wild-type EML-4, wild-type TFG, and wild-type ALK that form fusion junctions with similar fusion epitopes of other fusion proteins. May show some limited cross-reactivity. This is unexpected, as most antibodies will show some degree of cross-reactivity and anti-peptide antibodies will often cross-react with epitopes that have high homology or identity with immune peptides. is not. See, for example, Czernic, supra. Cross-reactivity with other fusion proteins can be easily clarified by Western blotting performed in parallel with markers of known molecular weight. The amino acid sequence of the cross-reacting protein can be tested to identify sites with high homology or identity to the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide sequence to which the antibody binds. Undesirable cross-reactivity can be eliminated by negative selection using antibody purification on a peptide column (eg, selecting an antibody that binds to either wild-type EML-4 and / or wild-type ALK).

本明細書に開示される方法を実施するために有用である本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体（及びＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体）は、理想的にはヒト融合ポリペプチドに特異的であるが、ヒトの種自体にだけに結合するようには限定されない。本発明は、他の哺乳類の種（例えばマウス、ラット、サル）にある保存されそして高い相同性又は同一性を有するエピトープにも結合する抗体の産生及び使用を包含する。他の種にある高い相同性又は同一性を有する配列は、本明細書で開示されるヒトＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド配列（配列番号１及び１８）又は本明細書で開示されるヒトＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド配列（配列番号２０）との、ＢＬＡＳＴを用いるような、標準的な配列比較によって容易に同定できる。 The EML4-ALK fusion polypeptide-specific antibodies (and TFG-ALK fusion polypeptide-specific antibodies) of the invention that are useful for carrying out the methods disclosed herein are ideally. It is specific for human fusion polypeptides, but is not limited to binding only to the human species itself. The present invention includes the production and use of antibodies that also bind to conserved and highly homologous or identical epitopes found in other mammalian species (eg, mice, rats, monkeys). Highly homologous or identical sequences in other species are the human EML4-ALK fusion polypeptide sequences (SEQ ID NOs: 1 and 18) disclosed herein or the human TFG-ALK disclosed herein. It can be easily identified by standard sequence comparison with the fusion polypeptide sequence (SEQ ID NO: 20), such as using BLAST.

本発明の方法で用いられる抗体は更に、特定のアッセイ形式、例えばフローサイトメリー（ＦＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び／又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）での使用、により特徴付けられて及び、これらに対して有効化することができる。そのような方法でのＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体の使用は、以下のＦ欄に更に記載されている。更にＦ欄に記載されるような、他のシグナル変換（ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２）及び／又は細胞マーカー（サイトケラチン）抗体と一緒に行う多重パラメータ解析で用いるために、蛍光染料（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ）、又は量子ドットのような標識と有利に結合させることもできる。 Antibodies used in the methods of the invention are further characterized by specific assay formats, such as use in flow cytometry (FC), immunohistochemistry (IHC), and / or immunocytochemistry (ICC). , Can be enabled for these. The use of antibodies specific for ALK fusion polypeptides in such a manner is further described in column F below. Optical brighteners for use in multi-parameter analysis with other signal conversions (phospho-AKT, phospho-Erk 1/2) and / or cellular marker (cytokeratin) antibodies, as described in column F. It can also be advantageously combined with labels such as (eg, Alexa488, PE), or quantum dots.

本発明方法の実施において、所定の生体試料中での野生型ＥＭＬ−４、野生型ＴＦＧ、及び／又は野生型ＡＬＫの発現及び／又は活性も、これらの野生型タンパク質に対する抗体（リン酸特異的又は全てに特異的の何れか）を用いて有利に試験することができる。例えば、ＡＬＫ全て及びリン酸化部位に特異的な抗体は市販されている（CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly MA. 2005/06 Catalogue, #s 3341, 3342 を参照されたい）。そのような抗体も上記のような、標準的な方法によって産生できる。ヒトＥＭＬ−４、ＴＦＧ、及びＡＬＫのアミノ酸配列は、他の種由来のこれらタンパク質の配列と同様に、公表されている（図３Ａ及び４Ａ−４Ｃ、及びSwissProt Accession Nos. を参照されたい） In the practice of the methods of the invention, the expression and / or activity of wild-type EML-4, wild-type TFG, and / or wild-type ALK in a given biological sample is also antibody (phosphate-specific) to these wild-type proteins. Or can be tested advantageously with any) specific to all. For example, antibodies specific for all ALK and phosphorylation sites are commercially available (see CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly MA. 2005/06 Catalog, # s 3341, 3342). Such antibodies can also be produced by standard methods such as those described above. The amino acid sequences of human EML-4, TFG, and ALK are published, as are the sequences of these proteins from other species (see Figures 3A and 4A-4C, and SwissProt Accession Nos.).

生体試料（例えば、腫瘍の試料）における、ＥＭＬ４−ＡＬＫ及び／又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現と共に、野生型ＥＭＬ−４、ＴＦＧ、及び野生型ＡＬＫの発現及び／又は活性を検出することは、融合タンパク質のみが腫瘍を促進するのか否か、又は野生型ＡＬＫも腫瘍を活性化して促進するのか否かについての情報を提供する。そのような情報は、融合タンパク質又は野生型タンパク質、又は両方を標的にするか否かを評価するのに臨床的に有用であり、又は腫瘍の進展の阻害に、そして適切な治療法又はその組合わせを選択するのに最も有益である。本明細書に開示される切断された活性ＡＬＫキナーゼに存在していない、野生型ＡＬＫキナーゼ細胞外ドメインに特異的な抗体は、突然変異ＡＬＫキナーゼの存在／非存在を判定するために特に有用である。 Detecting the expression and / or activity of wild-type EML-4, TFG, and wild-type ALK along with the expression of EML4-ALK and / or TFG-ALK fusion polypeptides in biological samples (eg, tumor samples) , Provides information on whether only fusion proteins promote tumors, or whether wild-type ALK also activates and promotes tumors. Such information is clinically useful in assessing whether to target fusion proteins, wild-type proteins, or both, or to inhibit tumor progression, and appropriate treatments or combinations thereof. Most useful for choosing a match. Antibodies specific for the wild-type ALK kinase extracellular domain that are not present in the truncated active ALK kinase disclosed herein are particularly useful for determining the presence / absence of mutant ALK kinase. is there.

１つ以上の抗体を上記の方法の実施に用いることができるということは理解されるであろう。例えば、一つ又はそれ以上のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体を、別のキナーゼ、受容体、又はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する癌の中で活性化されることが疑われているか、潜在的に活性化される、キナーゼ基質に特異的な１つ又はそれ以上の抗体と同時に用いて、そのような癌由来の細胞を含有している生体試料中のそのような他のシグナル伝達分子の活性を検出することができる。 It will be appreciated that one or more antibodies can be used to carry out the above method. For example, one or more EML4-ALK fusion polypeptide-specific antibodies are suspected to be activated in cancers expressing another kinase, receptor, or EML4-ALK fusion polypeptide. Such other in biological samples containing cells of such cancer origin, either at the same time as one or more antibodies specific for the kinase substrate that are potentially activated. The activity of signaling molecules can be detected.

本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド及び上記の融合接合部エピトープを含むそれらの断片を、キメラポリペプチドをもたらすように、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の構築ドメインの部分と組み合わせることができることを当業者は理解されるであろう。これらの融合タンパク質は精製を促進してインビボでの増大した半減期を示す。このことは、例えばヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメイン及び哺乳類の免疫グルブリンの重鎖又は軽鎖の構築領域の多数のドメインを含有しているキメラタンパク質に関して、示されている（ＥＰＡ３９４，８２７；Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988))。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結合二量体構造を有している融合タンパク質は、他の分子との結合及び中和を、単量体のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド単独よりも、より有効にすることができる（Fountoulakis et al., J. Biochem 270:3958-3964 (1995))。 Those skilled in the art can combine EML4-ALK fusion polypeptides of the invention and fragments thereof, including the fusion junction epitopes described above, with parts of the constructive domain of immunoglobulin (IgG) to result in chimeric polypeptides. Will be understood. These fusion proteins promote purification and exhibit an increased half-life in vivo. This has been shown for chimeric proteins containing, for example, the first two domains of human CD4-polypeptides and multiple domains of the heavy or light chain constructing regions of mammalian immune grubulin (EPA 394). , 827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). A fusion protein having a disulfide bond dimer structure with an IgG moiety can more effectively bind and neutralize with other molecules than the monomeric EML4-ALK fusion polypeptide alone. (Fountoulakis et al., J. Biochem 270: 3958-3964 (1995)).

重同位体標識化ペプチド（ＡＱＵＡペプチド）。
開示される方法の実施に有用なＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な試薬は、生体試料中の発現されたＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断されたＡＬＫキナーゼポリペプチドの絶対的定量化に適している重同位体標識化ペプチドを含有していてもよい。複合混合物中のタンパク質（ＡＱＵＡ）の絶対的定量化用のＡＱＵＡペプチド産生及び使用は記述されている。国際公開ＷＯ第０３／０１６８６１号公報、"Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry", Gygi et al. 及び Gerber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6940-5 (2003) も参照されたい；これらの教示はその全てを参照して本明細書に組み入れる）。 Heavy isotope labeled peptide (AQUA peptide).
EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide-specific reagents useful in carrying out the disclosed methods are absolute quantifications of the expressed ALK fusion polypeptide or cleaved ALK kinase polypeptide in a biological sample. It may contain a polyisotope-labeled peptide suitable for. The production and use of AQUA peptides for the absolute quantification of protein (AQUA) in complex mixtures has been described. WO 03/016681, "Absolute Quantization of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry", Gygi et al. And Gerber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6940-5 (2003) ) Also; all of these teachings are incorporated herein by reference).

ＡＱＵＡ手順は、少なくとも１つの重同位体標識化ペプチド標準品の既知量（これはＬＣ−ＳＲＭクロマトグラフィーで検出可能な固有の符号を有している）を検出するために消化した生体試料への導入、及びペプチド標準品と比較することによる、生体試料中の同じ配列及びタンパク質改変を持つペプチドの絶対的定量化を利用する。すなわち、ＡＱＵＡ手順は２つの段階：ペプチド内部標準品の選択及び検証及び方法の作成；及び検証されたペプチド内部標準品を用いて試料中の標的タンパク質を検出及び定量化するための実施：を有している。この方法は、細胞溶解物のような、複合生体混合物中の所定のペプチド／タンパク質を検出及び定量化するための強力な手法であって、例えば、薬物治療の結果としてのタンパク質リン酸化の変化を定量化するため、又は異なった生物学的状態におけるタンパク質濃度の違いを定量化するために、利用することができる。 The AQUA procedure involves digested biological samples to detect known amounts of at least one polyisotope-labeled peptide standard, which has a unique code detectable by LC-SRM chromatography. Utilize the absolute quantification of peptides with the same sequence and protein modification in biological samples by introduction and comparison with peptide standards. That is, the AQUA procedure has two steps: selection and verification of the peptide internal standard and preparation of the method; and implementation for detecting and quantifying the target protein in the sample using the verified peptide internal standard. are doing. This method is a powerful technique for detecting and quantifying certain peptides / proteins in complex biological mixtures, such as cell lysates, eg, changes in protein phosphorylation as a result of drug treatment. It can be used to quantify or to quantify differences in protein concentration in different biological states.

一般に、適切な内部標準品を作成するために、標的のタンパク質配列中の特定のペプチド（又は改変ペプチド）を、そのアミノ酸配列及び消化に用いられる特定のプロテアーゼに基づいて選択する。次いで１つの残基を安定な同位体（^１３Ｃ、^１５Ｎ）を含有している同じ残基で置き換えるように、固相ペプチド合成によってペプチドを生成する。得られたものは、タンパク質分解によって形成されるその天然の対応物と化学的に同定されるが、７−Ｄａ質量シフトを通してＭＳにより容易に区別できるペプチドである。次いで、新たに合成されたＡＱＵＡ内部標準ペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで評価する。この過程は、逆相クロマトグラフィーによるペプチドの保持率、イオン化効率、及び衝突誘起解離による断片化についての定量的情報をもたらす。天然及び内部標準ペプチドのセットについての有益且つ豊富な断片イオンを選択し、次いでペプチド標準品の固有なプロファイルに基づいて、選択された反応モニタリング（ＬＣ−ＳＲＭ）方法を形成するクロマトグラフ保持の機能として連続的に測定される。 In general, a particular peptide (or modified peptide) in a target protein sequence is selected based on its amino acid sequence and the particular protease used for digestion in order to create a suitable internal standard. Peptides are then produced by solid phase peptide synthesis so that one residue is replaced by the same residue containing a stable isotope ( ¹³ C, ¹⁵ N). The resulting peptide is chemically identified as its natural counterpart formed by proteolysis, but is readily distinguishable by MS through a 7-Da mass shift. The newly synthesized AQUA internal standard peptide is then evaluated by LC-MS / MS. This process provides quantitative information about peptide retention by reverse phase chromatography, ionization efficiency, and fragmentation by collision-induced dissociation. Chromatograph retention function to select beneficial and abundant fragment ions for a set of natural and internal standard peptides, and then to form a selected reaction monitoring (LC-SRM) method based on the unique profile of the peptide standard. Is continuously measured as.

ＡＱＵＡ手法の第２段階は、複合混合物からのタンパク質又は改変タンパク質の量を測定するためのその実施である。全細胞溶解物は典型的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分画されて、タンパク質移動と一致するゲルの領域を取り出す。この工程に続いて、ＡＱＵＡペプチドの存在下でインゲルタンパク質分解及びＬＣ−ＳＲＭ分析を行う。（Gerber et al. supra を参照されたい）。ＡＱＵＡペプチドを、全細胞分解物をタンパク分解酵素で消化して得られた複合ペプチド混合物に入れて、上記のような免疫親和性の精製を行う。消化（例えば、トリプシン処理）によって形成される天然ペプチドの保持時間及び断片化パターンは、先に測定したＡＱＵＡ内部標準ペプチドのそれと一致しているので、ＳＲＭ実験を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、内部標準品及び非常に複雑なペプチド混合物に直接由来する検体の両方について高い特異性及び感度を有する測定をもたらす。 The second step of the AQUA procedure is its implementation to measure the amount of protein or modified protein from the complex mixture. Whole cell lysates are typically fractionated by SDS-PAGE gel electrophoresis to remove regions of the gel that are consistent with protein transfer. This step is followed by Ingel proteolysis and LC-SRM analysis in the presence of AQUA peptide. (See Gerber et al. Supra). The AQUA peptide is placed in a complex peptide mixture obtained by digesting a whole cell degradation product with a proteolytic enzyme to purify the immunocompatibility as described above. Since the retention time and fragmentation pattern of the native peptide formed by digestion (eg, trypsin treatment) is consistent with that of the AQUA internal standard peptide measured earlier, LC-MS / MS analysis using the SRM experiment It provides measurements with high specificity and sensitivity for both internal standards and specimens directly derived from highly complex peptide mixtures.

ＡＱＵＡペプチドの絶対量を添加するので（例えば、２５０ｆモル）、曲線下の面積比を、タンパク質又は元の細胞分解物中のタンパク質のリン酸化形態の正確な発現レベルを判定するのに用いることができる。また、ゲル切片からのペプチド抽出効率、試料の処理（真空遠心分離を含む）中の絶対損失、及びＬＣ−ＭＳシステムへの導入中のばらつきが、天然及びＡＱＵＡペプチドの存在量の比に影響を与えないように、天然のペプチドを形成するようにインゲル消化の間に内部標準を存在させる。 Since the absolute amount of AQUA peptide is added (eg, 250 fmol), the area ratio below the curve can be used to determine the exact expression level of the phosphorylated form of the protein in the protein or the original cytolytic product. it can. Also, peptide extraction efficiency from gel sections, absolute loss during sample processing (including vacuum centrifugation), and variability during introduction into the LC-MS system affect the ratio of natural and AQUA peptide abundances. An internal standard is present during Ingel digestion to form the natural peptide so as not to give.

ＡＱＵＡペプチド標準品を、ＩＡＰ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって先に同定されている標的タンパク質中の既知配列に対して作成する。その部位が改変されている場合は、その部位内の特定残基の改変形態を包含する１つのＡＱＵＡペプチドを作成してもよく、改変されていない形態の残基を含有している第２のＡＱＵＡペプチドを作成する。このようにして、２つの標準品を、生体試料中の部位が改変されている形態及び改変されていない形態の両方を検出及び定量化するために用いることができる。 AQUA peptide standards are prepared for known sequences in the target protein previously identified by IAP-LC-MS / MS. If the site has been modified, one AQUA peptide may be prepared that includes a modified form of a particular residue within the site, with a second containing the residue in the unmodified form. Create an AQUA peptide. In this way, the two standards can be used to detect and quantify both modified and unmodified forms of sites in the biological sample.

ペプチド内部標準品は、タンパク質の第一次アミノ酸配列を試験して、プロテアーゼで切断して生成したペプチドの境界を判定することによっても生成することができる。あるいは、タンパク質を実際にプロテアーゼで消化することができ、次いで産生された特定のペプチド断片を配列決定することができる。適切なプロテアーゼは、これに限定されないが、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、ヘプシン）、メタロプロテアーゼ（例えば、ＰＵＭＰ１）、キモトリプシン、カテプシン、ペプシン、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼなどを包含する。 Peptide internal standards can also be produced by testing the primary amino acid sequence of a protein to determine the boundaries of the peptide produced by cleavage with a protease. Alternatively, the protein can actually be digested with a protease and then the specific peptide fragment produced can be sequenced. Suitable proteases include, but are not limited to, serine proteases (eg trypsin, hepsin), metalloproteases (eg PUMP1), chymotrypsin, cathepsins, pepsin, thermolysine, carboxypeptidase and the like.

標的タンパク質内のペプチド配列は、内部標準品としてのペプチドの使用を最適化する１つ又はそれ以上の基準に従って選択される。ペプチド配列が標的ではない他のタンパク質の何処かで複写されるであろう機会を最小にするようにペプチドの大きさを選択することが好ましい。従って少なくとも約６のアミノ酸であるペプチドが好ましい。ペプチドの大きさは、電離周波数を最大にするようにも最適化される。従って、約２０のアミノ酸より長いペプチドは好ましくない。好ましい範囲は約７〜１５のアミノ酸である。ペプチド配列は質量分析中に化学反応性が高くならないようにも選択されるので、システイン、トリプトファン、又はメチオニンを含有する配列は避けられる。 The peptide sequence within the target protein is selected according to one or more criteria that optimize the use of the peptide as an internal standard. It is preferable to choose the size of the peptide so as to minimize the chance that the peptide sequence will be replicated somewhere in other non-target proteins. Therefore, peptides having at least about 6 amino acids are preferred. The size of the peptide is also optimized to maximize the ionization frequency. Therefore, peptides longer than about 20 amino acids are not preferred. The preferred range is about 7 to 15 amino acids. Sequences containing cysteine, tryptophan, or methionine are avoided because the peptide sequences are also selected during mass spectrometry so that they do not become highly reactive.

タンパク質の全ての形態を定量化するために、ペプチド内部標準品を用いることができるように、標的領域の改変領域を含んでいないペプチド配列を選択することができる。もしくは、改変アミノ酸を包含しているペプチド内部標準品は、標的タンパク質の改変形態のみを検出及び定量化するために望ましいであろう。改変及び非改変領域の両方のためののペプチド標準品を、特定の試料中の改変の範囲を検出する（すなわち、タンパク質の総量のどの程度が改変形態によって表されているかを判定する）ために、一緒に用いることができる。例えば、特定部位でリン酸化されることが知られているタンパク質のリン酸化及び非リン酸化形態の両方のためのペプチド標準品は試料中のリン酸化形態の量を定量化するために用いることができる。 Peptide sequences that do not contain modified regions of the target region can be selected so that peptide internal standards can be used to quantify all morphologies of the protein. Alternatively, a peptide internal standard containing the modified amino acid may be desirable for detecting and quantifying only the modified form of the target protein. Peptide standards for both modified and unmodified regions to detect the extent of modification in a particular sample (ie, determine how much of the total amount of protein is represented by the modified form). , Can be used together. For example, peptide standards for both phosphorylated and non-phosphorylated forms of proteins known to be phosphorylated at specific sites can be used to quantify the amount of phosphorylated form in a sample. it can.

１つ又はそれ以上の標識化アミノ酸を用いてペプチドを標識化する（すなわち、標識はペプチドの実際の部分である）か、又はあまり好ましくはないが、標準的な方法に従って合成した後に標識を付加することもできる。好ましくは、標識は以下の検討に基づいて選ばれた質量を変える標識である：質量はＭＳ分析で産生される、低バックグランドを有するスペクトル領域へシフトする断片質量に特有でなければならない；イオン質量の特徴的成分は、ＭＳ分析において好ましくは特有なイオン質量の特徴を示す、標識部位の部分である；標識の構成原子の総質量は、全ての可能なアミノ酸の断片と一意的に異なることが好ましい。結果として、標識化アミノ酸及びペプチドは、得られる質量分析のイオン／質量パターンによって、標識化されていないものと容易に識別される。イオン質量の特徴的成分が、２０の天然アミノ酸の何れかについての残留質量に相当しないタンパク質断片に質量を与えることが好ましい。 Label the peptide with one or more labeled amino acids (ie, the label is the actual portion of the peptide), or, less preferably, add the label after synthesis according to standard methods. You can also do it. Preferably, the label is a mass-altering label chosen based on the following considerations: the mass must be specific to the mass-shifted fragment mass produced by MS spectrometry, which shifts to a spectral region with low background; The characteristic component of mass is the portion of the labeled site that preferably exhibits distinctive ionic mass characteristics in MS spectrometry; the total mass of the constituent atoms of the label is uniquely different from all possible amino acid fragments. Is preferable. As a result, labeled amino acids and peptides are readily distinguished from unlabeled by the resulting mass spectrometric ion / mass pattern. It is preferred that the characteristic component of the ionic mass imparts mass to protein fragments that do not correspond to the residual mass for any of the 20 natural amino acids.

標識は、ＭＳの断片化条件下に耐えることができて、好ましくない断片化を受けてはならない。標識化の化学反応は、条件、特に変性条件の範囲内で効率的であって、標識タグはＭＳでの選ばれた緩衝液系に好ましくは可溶性を保持していなければならない。標識が、タンパク質のイオン化効果を抑制せず化学的に反応性でないことが好ましい。それぞれの標識化された断片位置で特有な質量分析パターンを生じるように、標識が２つ又はそれ以上の同位体的に識別できる種の混合物を含むことができる。^２Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、又は^３４Ｓのような安定な同位体が、とりわけ好ましい標識である。異なった同位体標識を取り込んでいるペプチド内部標準品の対も作成できる。重同位元素標識を組み入れられる好ましいアミノ酸残基は、ロイシン、プロリン、バリン及びフェニルアラニンを包含する。 The label can withstand the fragmentation conditions of MS and must not undergo unfavorable fragmentation. The labeling chemistry must be efficient within conditions, especially denaturing conditions, and the labeled tag should preferably remain soluble in the buffer system of choice in MS. It is preferred that the label does not suppress the ionizing effect of the protein and is not chemically reactive. A mixture of two or more isotopically distinguishable species can be included such that each labeled fragment position produces a unique mass spectrometric pattern. Stable isotopes such as ² H, ¹³ C, ¹⁵ N, ¹⁷ O, ¹⁸ O, or ³⁴ S are particularly preferred labels. Pairs of peptide internal standards incorporating different isotope labels can also be created. Preferred amino acid residues that can incorporate heavy isotope labeling include leucine, proline, valine and phenylalanine.

ペプチド内部標準品は、その質量対電荷比（ｍ／ｚ）によって、及び好ましくは、クロマトグラフィーカラム（例えばＨＰＬＣカラム）上の保持時間によって特徴付けられる。相同性を有する配列の非標識化ペプチドと一緒に溶出する内部標準品が、最適な内部標準品として選択される。次いで内部標準品を、何れかの適切な方法、例えばアルゴン又はヘリウムを衝突ガスとして用いる、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって、ペプチドを断片化して分析する。次いで断片を、例えば、フラグメントイオンスペクトルを得るための多段階質量分析（ＭＳ^ｎ）によって、分析してペプチド断片化の特徴を得る。ペプチド断片が、それぞれの断片に対応するピークを良好に分離できるように有意に異なっているｍ／ｚ比を有していて、標的タンパク質に特有の特徴を得ることが好ましい。第１段階で適切な断片の特徴が得られない場合は、特有の特徴が得られるまでＭＳの追加段階を実施する。 Peptide internal standards are characterized by their mass-to-charge ratio (m / z) and preferably by retention time on a chromatography column (eg, HPLC column). An internal standard that elutes with an unlabeled peptide of a sequence having homology is selected as the optimal internal standard. The internal standard is then analyzed by fragmenting the peptide by any suitable method, such as using argon or helium as the collision gas, such as collision-induced dissociation (CID). Fragments are then analyzed, for example, by multi-step mass spectrometry (MS ⁿ ) to obtain fragment ion spectra to obtain the characteristics of peptide fragmentation. It is preferred that the peptide fragments have significantly different m / z ratios so that the peaks corresponding to each fragment can be well separated to obtain characteristics specific to the target protein. If the first step does not provide the appropriate fragment features, then an additional step of MS is performed until the unique features are obtained.

ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ^３スペクトルにおける断片イオンは、目的のペプチドに対して一般に非常に特異的であって、ＬＣ方法を併用すると、数千又は幾万ものタンパク質を含有している、細胞溶解物のような、複雑なタンパク質混合物中の標的ペプチド／タンパク質を検出及び定量化する高い選択性のある方法を可能にする。標的タンパク質／ペプチドを潜在的に含有している生体試料の何れもアッセイすることができる。粗製の又は部分的に精製した細胞抽出物を用いることが好ましい。一般に、試料は少なくとも０．０１ｍｇの、典型的には０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を有していて、所望の緩衝剤濃度及びｐＨに調節することができる。 Fragment ions in the MS / MS and MS ³ spectra are generally very specific for the peptide of interest and, when combined with the LC method, contain thousands or tens of thousands of proteins, cell lysates. It enables highly selective methods for detecting and quantifying target peptides / proteins in complex protein mixtures, such as. Any biological sample that potentially contains the target protein / peptide can be assayed. It is preferred to use crude or partially purified cell extracts. Generally, the sample has at least 0.01 mg of protein, typically 0.1-10 mg / mL, which can be adjusted to the desired buffer concentration and pH.

次いで、検出／定量化される標的タンパク質に対応する、標識化ペプチド内部標準品の既知量、好ましくは約１０フェムトモルを、細胞溶解物のような、生体試料に添加する。次いで、添加した試料が消化されるまでの適切な時間、１つ又はそれ以上のプロテアーゼで消化する。次いで、試料中の他のペプチドから標識化内部標準品及び対応する標的ペプチドを単離するために分離を行う（例えば、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、イオン交換クロマトグラフィーなどで）。マイクロキャピラリーＬＣが好ましい方法である。 A known amount of a labeled peptide internal standard, preferably about 10 femtomols, corresponding to the target protein to be detected / quantified is then added to the biological sample, such as cell lysate. The added sample is then digested with one or more proteases for an appropriate amount of time before digestion. Separation is then performed to isolate the labeled internal standard and the corresponding target peptide from the other peptides in the sample (eg, by HPLC, reverse phase HPLC, capillary electrophoresis, ion exchange chromatography, etc.). Microcapillary LC is the preferred method.

次いで、それぞれの単離したペプチドをＭＳにおける選択反応のモニタリングで試験する。これは、ペプチド内部標準品の特徴付けによって得られた予備知識を用いること、及び次いで目的のペプチド及び内部標準品の両方についてのＭＳ／ＭＳ又はＭＳ^ｎスペクトル中の特異イオンを連続的に観察するためのＭＳの必要性を包含している。溶出後に、ペプチド標準品及び標的ペプチドの両方のピークの曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算する。２つの面積の比が、分析で用いられた細胞の数及びタンパク質の分子量を標準化できる絶対的定量化を提供して、細胞当たりのタンパク質の複写の正確な数をもたらす。ＡＱＵＡ手法の更なる詳細は、Gygi et al., 及び Gerber et al. supra に記載されている。 Each isolated peptide is then tested by monitoring the selective response in MS. This uses the prior knowledge gained from the characterization of the peptide internal standard and then continuously observes specific ions in the MS / MS or MS ⁿ spectrum for both the peptide of interest and the internal standard. It embraces the need for MS for. After elution, the area under the curve (AUC) of the peaks of both the peptide standard and the target peptide is calculated. The ratio of the two areas provides an absolute quantification that can standardize the number of cells and the molecular weight of the protein used in the analysis, resulting in the exact number of protein copies per cell. Further details of the AQUA approach are described in Gygi et al., And Gerber et al. Supra.

ＡＱＵＱ内部ペプチド標準品（重同位元素標識ペプチド）を、本発明の突然変異ＡＬＫポリペプチド内の何れかの特有の部位（例えば、開示されるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド内の融合接合部）を検出及び定量化するために、上記のように、望ましく産生することができる。例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部配列（図１Ａ−Ｂ（最下図）を参照されたい）に対応するか又はＥＭＬ４、ＴＦＧ、又はＡＬＫの何れかの切断位置に対応するＡＱＵＡホスホペプチドを作成することができる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合接合部のためにペプチド標準品を産生することができ、そしてそのような標準品を生体試料中の融合接合部（すなわち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの存在）の検出及び定量化のためにＡＱＵＡ方法で利用することができる。 The AQUAQ internal peptide standard (heavy isotope-labeled peptide) detects any specific site within the mutant ALK polypeptide of the invention (eg, the fusion junction within the disclosed EML4-ALK fusion polypeptide). And for quantification, it can be preferably produced, as described above. For example, an AQUA phosphopeptide corresponding to a fusion junction sequence of an EML4-ALK fusion polypeptide (see Figure 1AB (bottom)) or a cleavage position of either EML4, TFG, or ALK. Can be created. Peptide standards can be produced for EML4-ALK or TFG-ALK fusion junctions, and such standards can be used for fusion junctions in biological samples (ie, the presence of EML4-ALK fusion polypeptide). It can be used in the AQUA method for detection and quantification.

例えば、本発明の代表的なＡＱＵＡペプチドは、アミノ酸配列ＩＮＱＶＹＲ（図１Ａ-Ｃ、最下図を参照されたい）を含有し、これはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド内の融合接合部（配列番号７を参照されたい）の各部位の直接側面に位置している３つのアミノ酸に対応している。融合接合部配列（及びその下流又は上流の更なる残基）を含有している、より大きいＡＱＵＡペプチドも構築できることは理解されるであろう。同様に、そのような配列の全ての残基より小さい残基を含有している（しかし融合接合部自体を未だ含有している）より小さいＡＱＵＡペプチドもまた構築されてもよい。そのようなより大きい又はより小さいＡＱＵＡペプチドは本発明の範囲内であり、そして好ましいＡＱＵＡペプチドの選択及び産生は上記のようにして実施することができる（Gygi et al., Gerber et al. supraを参照されたい）。 For example, a representative AQUA peptide of the invention contains the amino acid sequence INQVYR (FIGS. 1A-C, see bottom), which is a fusion junction within the EML4-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 7). Corresponds to the three amino acids located directly on the side of each site (see). It will be appreciated that larger AQUA peptides containing the fusion junction sequence (and additional residues downstream or upstream thereof) can also be constructed. Similarly, smaller AQUA peptides containing less than all residues of such sequences (but still containing the fusion junction itself) may also be constructed. Such larger or smaller AQUA peptides are within the scope of the invention, and the selection and production of preferred AQUA peptides can be carried out as described above (Gygi et al., Gerber et al. Supra). Please refer to).

核酸プローブ
本発明により提供される融合に特異的な試薬は、上記Ｂ欄に詳細に述べたように、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断されたＡＬＫキナーゼポリヌクレオチドの検出に適している核酸プローブ及びプライマーも包含している。そのようなプローブはとりわけ、融合を産生する野生型のＥＭＬ４及び／又は野生型ＡＬＫ遺伝子における切断点の両側に対応する切断点プローブを望ましく包含する。蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のようなアッセイ中でのそのようなプローブの特異的な使用は、以下のＦ欄に記載されている。同様な切断点プローブを、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（図１Ｃ（配列番号２１）を参照されたい）の存在を検出するために作成することができる。 Nucleic Acid Probes The fusion-specific reagents provided by the present invention include nucleic acid probes suitable for the detection of EML4-ALK fusion polypeptides or cleaved ALK kinase polynucleotides, as detailed in column B above. It also includes primers. Such probes preferably include, among others, the cleavage point probes corresponding to both sides of the cleavage point in the wild-type EML4 and / or wild-type ALK genes that produce the fusion. Specific use of such probes in assays such as fluorescence in situ hybridization (FISH) or polymerase chain reaction (PCR) amplification is described in column F below. A similar cleavage point probe can be made to detect the presence of a TFG-ALK fusion polynucleotide (see FIG. 1C (SEQ ID NO: 21)).

Ｆ．診断的適用及びアッセイの形式
本発明の方法は当該技術分野で公知の多種の異なったアッセイで実施することができる。 F. Diagnostic application and assay format The methods of the invention can be performed in a wide variety of different assays known in the art.

免疫アッセイ
本発明の方法の実施に有用な免疫アッセイは、同種免疫アッセイ又は異種免疫アッセイであってもよい。同種アッセイにおいては、免疫学的反応は一般に、突然変異ＡＬＫ−キナーゼポリペプチドに特異的な試薬（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な抗体）、標識化した検体、及び目的となる生体試料を包含している。抗体が標識化検体と結合すると、標識からのシグナル発生は、直接的に又は間接的に修飾される。免疫学的反応及びその程度の検出の両方は、同種溶液中で実施される。利用することのできる免疫化学的標識は、フリーラジカル、放射性同位元素、蛍光染料、酵素、バクテリオファージ、補酵素、などを包含する。半導体ナノ結晶標識、又は「量子ドット」も有利に使用でき、それらの作成及び使用は十分に記載されている。一般に、K. Barovsky, Nanotech. Law & Bus. 1(2): Article 14 (2004) 及びそこで引用されている特許を参照されたい。 Immunoassay An immunoassay useful for performing the methods of the invention may be an allogeneic or heterologous immunoassay. In allogeneic assays, the immunological response is generally a reagent specific for a mutant ALK-kinase polypeptide (eg, an antibody specific for an EML4-ALK fusion polypeptide), a labeled sample, and the organism of interest. Contains the sample. When the antibody binds to the labeled specimen, signal generation from the label is directly or indirectly modified. Both the immunological reaction and the detection of its extent are carried out in homologous solutions. Available immunochemical labels include free radicals, radioisotopes, optical brighteners, enzymes, bacteriophages, coenzymes, and the like. Semiconductor nanocrystal labels, or "quantum dots," can also be used advantageously, and their creation and use are well documented. In general, see K. Barovsky, Nanotech. Law & Bus. 1 (2): Article 14 (2004) and the patents cited therein.

異種アッセイ手法では、試薬は通常、生体試料、突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドに特異的な試薬（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合に特異的な抗体）、及び検出可能なシグナルを産生するための適切な手段である。以下に更に記載されるような生体試料を用いることができる。抗体は一般に、ビーズ、プレート又はスライドのような支持体に固定されていて、抗原を含有していると思われる試料と液相で接触させる。支持体を液相から分離して、支持体相又は液相のどちらかをそのようなシグナルを発生させるための手段を用いて検出可能なシグナルについて試験する。このシグナルは生体試料における検体の存在に関連している。検出可能なシグナルの発生方法は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、量子ドット、などの使用を包含する。例えば、検出すべき抗原が第２結合部位を含有している場合は、その部位に結合する抗体を検出可能な基に結合させて分離段階の前に液相反応溶液に添加することができる。固体支持体上に検出可能な基が存在していることは試験試料中に抗原が存在していることを示している。適切な免疫アッセイの例は、放射免疫アッセイ、免疫蛍光法、酵素結合免疫アッセイなどである。 In heterologous assay techniques, reagents are typically biological samples, reagents specific for mutant ALK kinase polypeptides (eg, antibodies specific for EML4-ALK fusion), and suitable means for producing detectable signals. Is. Biological samples as further described below can be used. Antibodies are generally immobilized on a support such as beads, plates or slides and contacted in liquid phase with a sample that appears to contain the antigen. The support is separated from the liquid phase and either the support phase or the liquid phase is tested for detectable signals using means for generating such signals. This signal is related to the presence of the specimen in the biological sample. Methods of generating detectable signals include the use of radioactive labels, fluorescent labels, enzyme labels, quantum dots, and the like. For example, if the antigen to be detected contains a second binding site, the antibody that binds to that site can be attached to a detectable group and added to the liquid phase reaction solution prior to the separation step. The presence of a detectable group on the solid support indicates the presence of the antigen in the test sample. Examples of suitable immunoassays include radioimmunoassays, immunofluorescence, enzyme-bound immunoassays, and the like.

本明細書に開示される方法を実施するのに有用な、免疫アッセイ形式及びその変法は当該技術分野で公知である。一般に、E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980)(CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.) を参照されたい。例えば、米国特許第４，７２７，０２２号（Skold et al., "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application")；米国特許第４，６５９，６７８号（Forrest et al., "Immunoassay of Antigens"）；米国特許第４，３７６，１１０号（David et al., "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"）も参照されたい。試薬−抗体複合体の形成に適している条件は当業者にとって公知である。同文献を参照されたい。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は「２サイト」又は「サンドイッチ」アッセイで用いることができ、標識化モノクローナル抗体及び結合モノクローナル抗体の両方の供給源として役立つ単一のハイブリドーマ細胞株を有している。そのようなアッセイは米国特許第４，３７６，１１０号に記載されている。検出可能な試薬の濃度は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの結合がバックグラウンドと比較して検出可能になるのに十分でなければならない。 Immunoassay formats and variants thereof that are useful in carrying out the methods disclosed herein are known in the art. In general, see E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.). For example, US Pat. No. 4,727,022 (Skold et al., "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"); US Pat. No. 4,659,678 (Forrest et al., "Immunoassay of Antigens"). See also US Pat. No. 4,376,110 (David et al., "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"). Suitable conditions for the formation of reagent-antibody complexes are known to those of skill in the art. Please refer to the same document. Monoclonal antibodies specific for the EML4-ALK fusion polypeptide can be used in "two-site" or "sandwich" assays to provide a single hybridoma cell line that serves as a source of both labeled and bound monoclonal antibodies. Have. Such an assay is described in US Pat. No. 4,376,110. The concentration of the detectable reagent must be sufficient to allow the binding of the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide to be detectable relative to the background.

本明細書に開示される方法の実施に有用な抗体は、沈殿法のような公知技術によって、診断アッセイに適している固体の支持体（例えば、ラテックス又はポリスチレンのような材料から作られるビーズ、プレート、スライド又はウェル）に結合させることができる。抗体又は他のＡＬＫ融合ポリペプチドに又は切断されたＡＬＫキナーゼポリペプチドに結合する試薬はさらに、公知技術によって、放射標識（例えば、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）及び蛍光標識（例えば、フルオレセイン）のような検出可能な基に結合させることができる。 Antibodies useful in practicing the methods disclosed herein are solid supports suitable for diagnostic assays, such as beads made from materials such as latex or polystyrene, by known techniques such as precipitation methods. It can be attached to a plate, slide or well). Reagents that bind to antibodies or other ALK fusion polypeptide or cleaved ALK kinase polypeptide are further subjected to known techniques such as radiolabeling (eg, ³⁵ S, ¹²⁵ I, ¹³¹ I), enzyme labeling (eg, horseradish). It can be attached to detectable groups such as peroxidase, alkaline phosphatase) and fluorescent labels (eg, fluorescein).

フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、又は免疫蛍光法（ＩＦ）のような、細胞に基づいたアッセイは、そのようなアッセイが臨床的に適しており、インビボでの突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現の検出を可能とし、そして抽出物を得るために例えば腫瘍試料から得られる細胞の操作をもたらす人為的な活性改変のリスクを回避するので、本発明の方法の実施に特に望ましい。従って、幾らかの好ましい態様では、本発明の方法は、フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、又は免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイ形式で実施される。 Cell-based assays, such as flow cytometry (FC), immunohistochemistry (IHC), or immunofluorescence (IF), are clinically suitable for such assays and are mutated in vivo. Particularly in the practice of the methods of the invention, as it allows detection of expression of ALK kinase polypeptides and avoids the risk of artificial activity alterations that result in manipulation of cells obtained, for example, from tumor samples, to obtain extracts. desirable. Therefore, in some preferred embodiments, the methods of the invention are performed in the form of flow cytometry (FC), immunohistochemistry (IHC), or immunofluorescence (IF) assays.

フローサイトメトリー（ＦＣ）を、ＡＬＫキナーゼ活性の阻害を標的とする薬剤による処置の前、その間、及びその後の、哺乳類腫瘍における突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現を判定するために使用することができる。例えば、骨髄試料由来の腫瘍細胞をフローサイトメトリーにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性について、更に所望により、癌細胞のタイプなどを同定するマーカーについても分析することができる。フローサイトメトリーは標準的な方法によって実施することができる。例えば、Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001) を参照されたい。つまり、例を挙げると、サイトメトリー分析についての以下のプロトコルを利用することができる；３７℃で１０分間２％のパラホルムアルデヒドで細胞の固定化、次いで氷上で３０分間９０％のメタノール中で透過化。次いで細胞をＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な一次抗体で染色し、洗浄して蛍光標識化二次抗体で標識化する。次いで、細胞はフローサイトメーター（例えば、Beckman Counter FC500) 上で、用いる器械の特定のプロトコルに従って分析されるだろう。そのような分析は、腫瘍中で発現されたＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドのレベルを同定することができるだろう。腫瘍のＡＬＫ阻害治療剤による処置後の同様な分析は、ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する腫瘍のＡＬＫキナーゼの標的阻害剤に対する応答性を明らかにするだろう。 Flow cytometry (FC) can be used to determine the expression of a mutant ALK kinase polypeptide in mammalian tumors before, during, and after treatment with agents that target inhibition of ALK kinase activity. .. For example, tumor cells derived from bone marrow samples may be analyzed by flow cytometry for the expression and / or activity of the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide, and, if desired, for markers that identify cancer cell types and the like. Can be done. Flow cytometry can be performed by standard methods. See, for example, Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). That is, for example, the following protocol for cytometric analysis can be utilized; cell immobilization with 2% paraformaldehyde for 10 minutes at 37 ° C., followed by permeation in 90% methanol for 30 minutes on ice. Conversion. The cells are then stained with a primary antibody specific for the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide, washed and labeled with a fluorescently labeled secondary antibody. The cells will then be analyzed on a flow cytometer (eg, Beckman Counter FC500) according to the specific protocol of the instrument used. Such an analysis would be able to identify the level of EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide expressed in the tumor. Similar analysis of tumors after treatment with ALK inhibitor therapeutics will reveal the responsiveness of tumors expressing ALK fusion polypeptides to targeted inhibitors of ALK kinase.

免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法も、ＡＬＫキナーゼ活性の阻害を標的とする薬剤による治療の前、その間、及びその後の、哺乳類の癌（例えば、ＮＳＣＬＣのような固形腫瘍）における突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現及び／又は活性の状態を判定するために使用することができる。ＩＨＣは公知の技術に従って実施することができる。例えば、ANTIBODIES: A LABOLATORY MANUAL, Chapter 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988) を参照されたい。つまり、例を挙げると、パラフィン包埋組織（例えば、生検で採取した腫瘍組織）をキシレン、次いでエタノールで組織切片を脱パラフィン化する；水、次いでＰＢＳ中で水和化する；クエン酸緩衝液中でスライドを加熱して抗原を脱マスキング化する；切片を過酸化水素中で培養する；ブロッキング溶液中でブロッキング化する；抗ＥＭＬ４−ＡＬＫ又は抗ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド一次抗体及び二次抗体中でスライドを培養する；そして最後に製造会社の使用説明書に従い、ＡＢＣアビジン／ビオチンを用いて検出することにより免疫組織化学染色用に調製される。 Immunohistochemistry (IHC) staining is also a mutant ALK kinase poly in mammalian cancers (eg, solid tumors such as NSCLC) before, during, and after treatment with agents that target inhibition of ALK kinase activity. It can be used to determine the state of expression and / or activity of a peptide. IHC can be performed according to known techniques. See, for example, ANTIBODIES: A LABOLATORY MANUAL, Chapter 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). That is, for example, paraffin-embedded tissue (eg, tumor tissue taken by biopsy) is deparaffinized with xylene and then ethanol to deparaffinize tissue sections; water and then hydrated in PBS; citrate buffer Heat the slides in liquid to demask the antigen; incubate the sections in hydrogen peroxide; block in blocking solution; anti-EML4-ALK or anti-TFG-ALK fusion polypeptide primary antibody and secondary The slides are cultured in the antibody; and finally prepared for immunohistochemical staining by detection with ABC avidin / biotin according to the manufacturer's instructions.

免疫蛍光法（ＩＦ）アッセイも、ＡＬＫキナーゼ活性の阻害を標的とする薬剤による処置の前、その間、及びその後の、哺乳類の癌における突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現及び／又は活性の状態を判定するために使用することができる。ＩＦは公知の技術に従って実施することができる。例えば、J.M. Polak and S. Van Noorden (1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2nd Ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK 37, BioScientific/Springer-Verlag を参照されたい。つまり、例を挙げると、患者の試料をパラホルムアルデヒド中で、次いでメタノールで固定化し、ウマ血清のようなブロッキング溶液でブロッキング化し、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに対する一次抗体と次いでＡｌｅｘａ４８８のような蛍光染料で標識化した第二抗体と培養して、落射蛍光顕微鏡法で分析する。 An immunofluorescence (IF) assay also determines the state of expression and / or activity of a mutant ALK kinase polypeptide in mammalian cancer before, during, and after treatment with a drug that targets inhibition of ALK kinase activity. Can be used to. IF can be performed according to known techniques. See, for example, J.M. Polak and S. Van Noorden (1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2nd Ed .; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK 37, BioScientific / Springer-Verlag. That is, for example, a patient's sample is immobilized in paraformaldehyde, then in methanol, blocked in a blocking solution such as horse serum, the primary antibody to the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide, followed by Alexa488 It is cultured with a second antibody labeled with such a fluorescent dye and analyzed by epifluorescence microscopy.

上記のアッセイで用いられる抗体は、他のシグナル変換（例えば、ＥＧＦＲ，ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２）及び／又は細胞マーカー（例えば、サイトケラチン）抗体を併用する多重パラメーター分析で用いるために、蛍光染料（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ）、又は量子ドットのような他の標識と有利に結合させることができる。 The antibodies used in the above assays are for use in multi-parameter analysis with other signal conversion (eg, EGFR, phospho-AKT, phospho-Erk1 / 2) and / or cellular marker (eg, cytokeratin) antibodies. , Fluorescent dyes (eg, Alexa488, PE), or other labels such as quantum dots can be advantageously combined.

突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドを測定するための、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を包含する、多種の他のプロトコルは、当該技術分野で公知であって、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現の変化及び異常なレベルを診断するための基礎を提供する。これらの融合ポリペプチド発現の正常値又は標準値は、正常な哺乳類対象、好ましくはヒト由来の体液又は細胞抽出物を、複合体形成に適している条件下で、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドに対する抗体と結合させることによって確定される。標準的な複合体形成の量は、多種の方法で定量化することができるが、光度測定法が好ましい。生検組織由来の対象、コントロール、及び病人の試料中で発現するＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と対象者の値の間の偏差が疾患を診断するためのパラメーターを確立する。 A wide variety of other protocols for measuring mutant ALK kinase polypeptide, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence activated cell sorting (FACS), are in the art. Known in Japan, it provides the basis for diagnosing altered expression and abnormal levels of EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide. Normal or standard values of expression of these fusion polypeptides are EML4-ALK or TFG-ALK fusions of normal mammalian subjects, preferably human-derived body fluids or cell extracts, under conditions suitable for complex formation. It is confirmed by binding to an antibody against the polypeptide. The amount of standard complex formation can be quantified by a variety of methods, but photometric methods are preferred. The amount of EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide expressed in subjects, controls, and sick samples from biopsy tissue is compared to standard values. The deviation between the standard value and the subject's value establishes the parameters for diagnosing the disease.

ペプチド及び核酸アッセイ
同様に、腫瘍由来細胞を含有する生体試料中で発現する突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドを検出／定量化するためのＡＱＵＡペプチドは、上のＥ欄で詳細に記載されるように作成されて、標準的なＡＱＵＡアッセイで使用することができる。従って、本発明方法のいくつかの好ましい態様では、ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な試薬は、上のＥ欄に記載されるように、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部よりなるペプチド配列に対応している重同位元素標識化ホスホペプチド（ＡＱＵＡペプチド）を含有している。 Similar to peptide and nucleic acid assays , AQUA peptides for detecting / quantifying mutant ALK kinase polypeptides expressed in biological samples containing tumor-derived cells were prepared as detailed in column E above. It can be used in standard AQUA assays. Therefore, in some preferred embodiments of the methods of the invention, the ALK fusion polypeptide-specific reagent is a fusion of an EML4-ALK fusion polypeptide or a TFG-ALK fusion polypeptide, as described in column E above. It contains a heavy isotope-labeled phosphopeptide (AQUA peptide) corresponding to the peptide sequence consisting of the junction.

本発明の方法を実施するのに有用な突然変異ＡＬＫポリペプチドに特異的な試薬は、生体試料中で融合又は切断されたポリペプチドが発現する転写物に直接ハイブリダイズして検出できる、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はＤＮＡプローブであってもよい。そのようなプローブは上のＢ欄で詳細に検討されている。つまり、例を挙げると、ホルマリンで固定化してパラフィンに包埋した患者の試料は、蛍光標識化ＲＮＡプローブで検索した後、ホルムアミド、ＳＳＣ及びＰＢＳで洗浄して、蛍光顕微鏡で分析することができる。染色体２上でのＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失変異のような、遺伝子再配列の蛍光検出が可能な、切断点プローブを含有するＦＩＳＨプローブも好ましい（実施例６を参照されたい）。 A reagent specific for a mutated ALK polypeptide useful for carrying out the method of the present invention can be detected by directly hybridizing to a transcript expressing a polypeptide fused or cleaved in a biological sample. It may be an oligonucleotide or a DNA probe. Such probes are discussed in detail in column B above. That is, for example, a sample of a patient immobilized with formalin and embedded in paraffin can be searched with a fluorescently labeled RNA probe, washed with formamide, SSC and PBS, and analyzed with a fluorescence microscope. .. FISH probes containing cut-point probes capable of fluorescent detection of gene rearrangements, such as EML4-ALK deletion mutations on chromosome 2, are also preferred (see Example 6).

突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、診断の目的で使用することができる。使用できるポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡを包含する。このポリヌクレオチドは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現が疾患と関連性があると思われる、生検で採取した固形腫瘍組織における遺伝子の発現を検出及び定量化するために用いることができる。例えば、この診断アッセイは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの存在、非存在、及び過剰発現を識別するために、及び治療的介入中のＡＬＫ融合ポリペプチドのレベルの制御を観察するために用いることができる。 A polynucleotide encoding a mutated ALK kinase polypeptide can also be used for diagnostic purposes. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, antisense RNA and DNA molecules, and PNA. This polynucleotide presents gene expression in biopsy-collected solid tumor tissue where expression of the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide or truncated active ALK kinase polypeptide appears to be associated with the disease. It can be used for detection and quantification. For example, this diagnostic assay is used to identify the presence, absence, and overexpression of EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptides, and to observe control of levels of ALK fusion polypeptides during therapeutic intervention. Can be used for.

ある好ましい態様では、ゲノム配列を含み、ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断されたＡＬＫキナーゼポリペプチド又はそれに近似する分子をコードする、ポリヌクレオチド配列を検出できるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションは、突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする核酸配列を同定するために用いることができる。そのようなプローブの構築及び使用は上のＢ欄に記載されている。プローブの特異性、すなわち、それが、特異性が高い領域、例えば融合接合部の１０の特有のヌクレオチド、又は特異性が低い領域、例えば３’コード領域、から作成されたかどうか、及びハイブリダイゼーション又は増幅の厳密性（最高、高度、中程度又は低度）により、このプローブが突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードする天然の配列、対立遺伝子、又は関連する配列のみを同定するか否かが判定されるであろう。 In one preferred embodiment, hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence containing a genomic sequence and encoding an ALK fusion polypeptide or a cleaved ALK kinase polypeptide or a molecule similar thereto is a mutant ALK polypeptide. Can be used to identify the nucleic acid sequence encoding. The construction and use of such probes is described in column B above. The specificity of the probe, i.e. whether it was created from a region of high specificity, eg, 10 unique nucleotides of the fusion junction, or region of low specificity, eg, a 3'coding region, and hybridization or The severity of amplification (highest, highest, moderate or low) determines whether this probe identifies only the native sequence, allele, or related sequence encoding the mutant ALK polypeptide. Will.

プローブは関連する配列を検出するためにも用いるこができ、そして配列をコードする突然変異ＡＬＫポリペプチドの何れか由来のヌクレオチドの少なくとも５０％を含有していることが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、及び配列番号２、１９、及び２１のヌクレオチド配列由来であってよく、もっとも好ましくは、融合接合部（図１Ａ−Ｃ、最下図及び配列番号７、２４、及び２６を参照されたい）、又は上のＢ欄に更に記載されるような、天然のＥＭＬ−４、ＴＦＧ、及びＡＬＫポリペプチドのプロモーター、エンハンサー構成要素、及びイントロンを包含するゲノム配列由来のものを包含している。 The probe can also be used to detect the relevant sequence and preferably contains at least 50% of nucleotides from any of the mutant ALK polypeptides encoding the sequence. The hybridization probe of the present invention may be derived from DNA or RNA and the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2, 19, and 21, most preferably fusion junctions (FIGS. 1AC, bottom figure and SEQ ID NO: 7, 24, and 26), or derived from genomic sequences that include promoters, enhancer components, and introns of native EML-4, TFG, and ALK polypeptides, as further described in column B above. Includes.

例えば、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドは、改変したＡＬＫポリペプチドの発現を検出するために、患者の生検から採取した体液又は組織を用いる、サウザン又はノーザン分析、ドットブロット、又は他の膜を基にした技術において；ＰＣＲ技術において；又はディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡ又はチップアッセイにおいて使用することができる。そのような定性的又は定量的な方法は当該技術分野において公知である。特定の態様では、本発明の突然変異ＡＬＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、肺癌を含む多種の癌の活性化及び誘発を検出するアッセイにおいて有用であろう。突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化して、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適している条件下で、患者由来の体液又は組織に添加することができる。適切な培養期間後に、試料を洗浄し、シグナルを計量して、標準値と比較する。生検由来又は抽出した試料中のシグナルの量が比較可能なコントロール試料のそれから有意に変化していたら、このヌクレオチド配列は試料中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしたこと、及び試料中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断されたＡＬＫキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変化したレベルが存在していることが、関連疾患の存在を示している。そのようなアッセイは、動物実験、臨床試験、又は個々の患者の治療の観察おける特定の治療処置計画の効果を評価するためにも使用できる。 For example, the EML4-ALK fusion polynucleotides of the invention use a body fluid or tissue taken from a patient's bioassay to detect the expression of a modified ALK polypeptide, Southern or Northern analysis, dot blot, or other. It can be used in membrane-based techniques; in PCR techniques; or in dipstick, pin, ELISA or chip assays. Such qualitative or quantitative methods are known in the art. In certain embodiments, the nucleotide sequences encoding the mutant ALK polypeptides of the invention will be useful in assays that detect activation and induction of a wide variety of cancers, including lung cancer. Mutant ALK polynucleotides can be labeled by standard methods and added to patient-derived body fluids or tissues under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After an appropriate culture period, the sample is washed, the signal is weighed and compared to standard values. If the amount of signal from the biopsy-derived or extracted sample was significantly different from that of the comparable control sample, then this nucleotide sequence hybridized with the nucleotide sequence in the sample and the EML4-ALK fusion in the sample. The presence of altered levels of the nucleotide sequence encoding the polypeptide or the cleaved ALK kinase polypeptide indicates the presence of the associated disease. Such assays can also be used to assess the effectiveness of specific treatment treatment schemes in animal experiments, clinical trials, or observations of treatment for individual patients.

突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現によって特徴付けられる疾患の診断の基礎を提供するために、発現に関する正常又は標準のプロファイルを確立する。これは、動物又はヒトの何れかの、正常な対象由来の体液又は細胞抽出物を、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードする配列、又はその断片と、ハイブリダイゼーション又は増幅に適している条件下で、混合することによって遂行することができる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な対象から得られた値を、実質的に精製されたポリヌクレオチドの既知量を用いる実験で得られたそれと比較して定量化することができる。正常者の試料から得られた標準値を、病状を示している患者の試料から得られる値と比較することができる。標準値と対象者の値の間の偏差が疾患の存在を立証するために用いられる。 Establish a normal or standard profile for expression to provide the basis for the diagnosis of diseases characterized by the expression of a mutant ALK kinase polypeptide. It is suitable for hybridization or amplification of a body fluid or cell extract from a normal subject, either animal or human, with a sequence encoding an EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide, or a fragment thereof. It can be accomplished by mixing under certain conditions. Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from normal subjects with those obtained in experiments with known amounts of substantially purified polynucleotides. Standard values obtained from a sample of a normal person can be compared with values obtained from a sample of a patient showing a medical condition. The deviation between the standard value and the subject's value is used to establish the presence of the disease.

疾患が立証されて治療プロトコルが開始されたら、患者における発現のレベルが正常患者から得られるレベルに近づき始めたかどうかを評価するために、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返すことができる。一連のアッセイから得られる結果を、数日〜数ヶ月の範囲の期間に渡る治療の効果を示すために用いることができる。 Once the disease has been demonstrated and the treatment protocol has begun, the hybridization assay can be repeated regularly to assess whether the level of expression in the patient has begun to approach the level obtained from normal patients. The results obtained from the series of assays can be used to show the effect of treatment over a period ranging from days to months.

本発明の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドの更なる診断的用途は、当業者にとって標準的な、好ましいアッセイ形式である、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に関していてもよい。例えば、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd edition, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) を参照されたい。ＰＣＲオリゴマーは化学的に合成、酵素的に生成、又は組み換えの供給源から産生することができる。オリゴマーは、一方がセンス方向（５’から３’）にあり、他方がアンチセンス方向（３’から５’）にある、２つのヌクレオチド配列からなり、特定の遺伝子又は条件を同定するのに最適化されている条件下で用いられることが好ましいであろう。２つの同じオリゴマー、オリゴマーの入れ子集合、又はオリゴマーの縮重プールでさえも、ストリンジェントでない条件下で、近似するＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出及び／又は定量化に用いることができる。 Further diagnostic uses of the mutant ALK polynucleotides of the invention may relate to the use of the polymerase chain reaction (PCR), a standard and preferred assay format for those skilled in the art. See, for example, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd edition, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). PCR oligomers can be chemically synthesized, enzymatically produced, or produced from recombinant sources. Oligomers consist of two nucleotide sequences, one in the sense direction (5'to 3') and the other in the antisense direction (3'to 5'), making them ideal for identifying specific genes or conditions. It would be preferable to use it under the conditions that have been modified. Two identical oligomers, nested aggregates of oligomers, or even degenerate pools of oligomers can be used to detect and / or quantify similar DNA or RNA sequences under non-stringent conditions.

ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断されたＡＬＫキナーゼポリペプチドの発現を定量化するためにも用いることができる方法は、放射性標識化又はビオチン化ヌクレオチド、コントロール核酸の共増幅、及び実験結果を挿入する標準曲線を包含する（Melby et al., J. Immunol. Methods, 159:235-244 (1993); Duplaa et al. Anal.Biochem. 229-236 (1993)）。複数の試料の定量の速度を、目的のオリゴマーを各種希釈度で存在させるＥＬＩＳＡ形式でアッセイを行うことによって加速することができ、そして分光光度又は比色分析応答は速い定量をもたらす。 Methods that can also be used to quantify the expression of ALK fusion polypeptides or cleaved ALK kinase polypeptides include radiolabeled or biotinylated nucleotides, co-amplification of control nucleic acids, and a standard curve into which experimental results are inserted. (Melby et al., J. Immunol. Methods, 159: 235-244 (1993); Duplaa et al. Anal.Biochem. 229-236 (1993)). The rate of quantification of multiple samples can be accelerated by assaying in an ELISA format in which the oligomer of interest is present at various dilutions, and the spectrophotometric or colorimetric response results in fast quantification.

本発明の別の態様では、本発明の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドを、更にそれらの近位及び遠位にある隣接ゲノム領域をも、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列を、公知の技術を用いて、特定の遺伝子又は遺伝子の特異的な領域に対してマッピングすることができる。そのような技術は、Price, C.M., Blood Rev. 7:127-134 (1993) 及び Trask, B.J., Trends Genet. 7:149-154 (1991) で概説されているように、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＦＡＣＳ、又は酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌Ｐ１構築物又は単一染色体ｃＤＮＡライブラリーのような人工染色体構築物を包含する。 In another aspect of the invention, the mutant ALK polynucleotides of the invention, and also adjacent genomic regions proximal and distal to them, generate hybridization probes useful for mapping native genomic sequences. Can be used to This sequence can be mapped to a particular gene or a specific region of a gene using known techniques. Such techniques are fluorescent in situ hybridization as outlined in Price, CM, Blood Rev. 7: 127-134 (1993) and Trask, BJ, Trends Genet. 7: 149-154 (1991). (FISH), FACS, or artificial chromosome constructs such as yeast artificial chromosomes, bacterial artificial chromosomes, bacterial P1 constructs or single chromosome cDNA libraries.

１つの好ましい態様では、ＦＩＳＨ法が用いられて（Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988) に記載のように）、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝子地図データと関連付けることができる。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f) 中に見出すことができる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド又は切断された活性ＡＬＫキナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の、物理的染色体地図上の位置と、特定の疾患又は特定の疾患に罹りやすい体質との相関関係は、遺伝疾患と関わりを持つＤＮＡの領域を区別するのに役立つであろう。本発明のそのようなヌクレオチド配列を、正常者、キャリアー、又は罹患者の間の遺伝子配列の相違を検出するために用いることができる。二色切断点ＦＩＳＨプローブを、例えば、試料中に突然変異ＥＭＬ−４、ＴＦＧ、及び／又はＡＬＫ遺伝子が存在しているか否かを検出するために用いることができる。 In one preferred embodiment, the FISH method is used (as described in Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, NY (1988)) and other physical chromosomal mappings. Can be associated with technology and genetic map data. Examples of genetic map data can be found in the 1994 Genome Issue of Science (265: 1981f). What is the correlation between the location of a gene encoding an EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide or a cleaved active ALK kinase polypeptide on a physical chromosomal map and a particular disease or predisposition to a particular disease? , Will help distinguish regions of DNA associated with genetic disorders. Such nucleotide sequences of the present invention can be used to detect differences in gene sequences between normal, carrier, or affected individuals. A bicolor cut-point FISH probe can be used, for example, to detect the presence of mutant EML-4, TFG, and / or ALK genes in a sample.

染色体調製物のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を、遺伝子地図を拡張するために用いることができる。多くの場合、マウスのような、別の哺乳類種の染色体上の遺伝子の置換により、たとえ特定のヒト染色体の数及び腕が未知であっても、関連マーカーを明らかにすることができる。新しい配列を、物理的マッピングによって、染色体の腕、又はその部分に割り当てることができる。これはポジショナルクローニング又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検討している研究者に価値ある情報を提供する。疾患又は症候群が遺伝子連鎖によって特定の遺伝子領域、例えば、ＡＴから１１ｑ２２−２３（Gatti et al., Nature 336:577-580 (1988))へ大まかに局限化されると、その領域にマッピングされる何れの配列も、更なる検討のための関連の又は制御の遺伝子を示すことができる。本発明のヌクレオチド配列を、正常者、キャリアー、又は罹患者の間の、転座、反転などによる染色***置の相違を検出するために用いることもできる。 Physical mapping techniques such as in situ hybridization of chromosomal preparations and linkage analysis with established chromosomal markers can be used to extend the genetic map. In many cases, gene substitutions on the chromosomes of other mammalian species, such as mice, can reveal relevant markers, even if the number and arm of a particular human chromosome is unknown. The new sequence can be assigned to the arm or part of the chromosome by physical mapping. This provides valuable information to researchers examining disease genes using positional cloning or other gene discovery techniques. When a disease or syndrome is loosely localized by genetic linkage from a particular genetic region, eg, AT to 11q22-23 (Gatti et al., Nature 336: 577-580 (1988)), it is mapped to that region. Any sequence can indicate a related or regulatory gene for further study. The nucleotide sequences of the present invention can also be used to detect differences in chromosomal position due to translocation, inversion, etc. between normal, carrier, or affected individuals.

副溝結合共役オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、米国特許第６，９５１，９３０号、"Hybridization-Triggered Fluorescent Detection of Nucleic Acids" を参照されたい）のような、核酸の検出に適している他の方法は、当業者にとって公知である。 Other methods suitable for the detection of nucleic acids, such as subgroove-bound conjugated oligonucleotide probes (see, eg, US Pat. No. 6,951,930, "Hybridization-Triggered Fluorescent Detection of Nucleic Acids") , Known to those skilled in the art.

生体試料
本発明の方法の実施において有用な生体試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現によって特徴付けられる癌が存在又は進展している哺乳類の何れかから得ることができる。ある態様では、哺乳類はヒトであって、そのヒトは癌、例えば、ＮＳＣＬＣの治療のためにＡＬＫ阻害療法の候補者であってよい。ヒト候補者はＷＨＩ−１３１及び／又はＷＨＩ−１５４のようなＡＬＫキナーゼ阻害剤で最近治療されている患者か又はそれで治療することが考えられている患者であってよい。別の態様では、哺乳類は、ウマ又はウシのような、大動物であり、一方他の態様では、哺乳類は、イヌ又はネコのような小動物であり、それらの全ては、肺癌を含む癌を発現することが知られている。 Biological Samples Biological samples useful in the practice of the methods of the invention can be obtained from either mammals in the presence or development of cancer characterized by the expression of EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptides. In some embodiments, the mammal may be a human, who may be a candidate for ALK inhibitory therapy for the treatment of cancer, eg, NSCLC. The human candidate may be a patient who has recently been treated with or is considered to be treated with an ALK kinase inhibitor such as WHI-131 and / or WHI-154. In another aspect, the mammal is a large animal, such as a horse or cow, while in another aspect, the mammal is a small animal, such as a dog or cat, all of which express cancer, including lung cancer. It is known to do.

哺乳類の癌由来の細胞（又は細胞の抽出物）を含有する何れの生体試料も本発明の方法での使用に適している。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの場合では、固形又は非固形に関わらず、何れの癌も適しているであろう。ＴＦＧ−ＡＬＫの場合は、固形腫瘍が本発明の方法の範囲内である。例えば、生体試料は、胸水のような浸出液から得られた細胞を含有していてもよい。胸水（腹腔内で肺の外に形成される液体であって癌細胞を含有している）は、進行性の肺癌（ＮＳＣＬＣを包含する）を有する多くの患者において形成されることが知られていて、そのような浸出液の存在が不良な転帰及び短い生存期間の前兆となる。胸水試料を得る標準的な技術は記述されていて、当該技術分野において公知である（Sahn, Clin Chest Med. 3(2):443-52 (1982) を参照されたい）。循環している腫瘍細胞も、腫瘍マーカー、サイトケラチンタンパク質マーカー又は記述されているような陰性選択の他の方法（Ma et al., Anticancer Res. 23(1A):49-62 (2003) を参照されたい）を用いて血清から得ることができる。血清及び骨髄試料は、白血病患者にとっては特に好ましい。肉腫及び癌腫のような、固形腫瘍を含む癌については、生体試料は標準的な臨床技術によって得ることができる、腫瘍生検から得られる細胞を含有することができる。例えば、神経芽細胞腫及び神経外胚葉性の癌を含む多種の癌においてＡＬＫの異常な発現が観察される。例えば、Pulford et al., supra を参照されたい。しかしながら、ＴＦＧ−ＡＬＫ転座突然変異体はリンパ腫中のみにあることが記述されていて、今までに固形腫瘍中では観察されていない。 Any biological sample containing cells (or cell extracts) from mammalian cancer is suitable for use in the methods of the invention. In the case of the EML4-ALK fusion polypeptide, any cancer, solid or non-solid, will be suitable. In the case of TFG-ALK, solid tumors are within the method of the invention. For example, the biological sample may contain cells obtained from an exudate such as pleural effusion. Pleural effusion (a fluid that forms in the abdominal cavity and outside the lungs and contains cancer cells) is known to form in many patients with advanced lung cancer (including NSCLC). Thus, the presence of such exudates heralds poor outcomes and short survival. Standard techniques for obtaining pleural effusion samples have been described and are known in the art (see Sahn, Clin Chest Med. 3 (2): 443-52 (1982)). Circulating tumor cells can also be referred to as tumor markers, cytokeratin protein markers or other methods of negative selection as described (Ma et al., Anticancer Res. 23 (1A): 49-62 (2003)). Can be obtained from serum using. Serum and bone marrow samples are particularly preferred for leukemia patients. For cancers, including solid tumors, such as sarcomas and carcinomas, biological samples can contain cells obtained from tumor biopsies, which can be obtained by standard clinical techniques. Abnormal expression of ALK is observed in a variety of cancers, including, for example, neuroblastoma and neuroectoderm cancer. See, for example, Pulford et al., Supra. However, the TFG-ALK translocation mutant has been described to be found only in lymphomas and has not been observed in solid tumors to date.

生体試料は、ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現及び／又は活性化するが野生型のＡＬＫキナーゼを発現及び／又は活性化しない癌由来の細胞（又は細胞抽出物）を含有することができる。また、試料は、突然変異ＡＬＫポリペプチド及び野生型のＡＬＫキナーゼの両方を発現及び／又は活性化するか、又は野生型のＡＬＫキナーゼ及び／又はＥＭＬ−４及び／又はＴＦＧを発現及び／又は活性化するが、突然変異ＡＬＫポリペプチドを発現及び／又は活性化しない癌由来の細胞を含有することもできる。 The biological sample can contain cancer-derived cells (or cell extracts) that express and / or activate the ALK fusion polypeptide but do not express and / or activate the wild-type ALK kinase. The sample also expresses and / or activates both the mutant ALK polypeptide and the wild-type ALK kinase, or expresses and / or activates the wild-type ALK kinase and / or EML-4 and / or TFG. It can also contain cancer-derived cells that are kinased but do not express and / or activate the mutant ALK polypeptide.

前述の生体試料の細胞抽出物を、標準的な技術に従って、粗製の又は部分的に（又は完全に）精製したものの何れかに調製して、本発明の方法に用いることができる。また、全細胞を含有している生体試料は、上記のような、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー法（ＦＣ）、免疫蛍光法（ＩＦ）及び蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）のような好ましいアッセイ形式において使用できる。そのような全細胞アッセイは、腫瘍細胞試料を処理する操作を最小にして、それによりインビボでの細胞のシグナル伝達／活性化状態の変化、及び／又は人為的なシグナルの導入に対するリスクを減少させるという点で有利である。全細胞アッセイは、腫瘍細胞と正常細胞の混合物にではなく、腫瘍細胞中にのみ発現及びシグナル伝達して特徴付けるという点でも有利である。 The cell extracts of the biological samples described above can be prepared according to standard techniques into either crude or partially (or completely) purified and used in the methods of the invention. In addition, biological samples containing whole cells include immunohistochemistry (IHC), flow cytometry (FC), immunofluorescence (IF) and fluorescence in situ hybridization (FISH) as described above. Can be used in preferred assay formats such as. Such whole-cell assays minimize the manipulation of tumor cell samples, thereby reducing the risk of changes in cellular signaling / activation status and / or the introduction of anthropogenic signals in vivo. It is advantageous in that. Whole-cell assays are also advantageous in that they are expressed and signaled and characterized only in tumor cells, not in a mixture of tumor cells and normal cells.

ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合遺伝子及び／又は融合ポリペプチドによって特徴付けられる腫瘍の進行を化合物が阻害するか否かを判定するための開示の方法の実施において、哺乳類の骨髄移植モデル又は異種移植片由来の細胞を含む生体試料も、有利に用いることができる。好ましい異種移植片（又は移植レシピエント）は、突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドを発現するヒト腫瘍を移植された、マウスのような、小哺乳類のものである。ヒトの腫瘍を移植された異種移植片については当該技術分野で公知であって（Kal, Cancer Treat Res. 72:155-69 (1995) を参照されたい）、ヒトの腫瘍を移植された異種移植片の産生に関しては十分に記述されている（Winograd et al., In Vivo. 1(1)1-13 (1987) を参照されたい）。同様に、骨髄移植モデルの生成及び使用に関しても十分に記述されている（例えば、Schwaller, et al., EMBO J. 17:5321-333 (1998); Kelly et al., Blood 99:310-318 (2002) を参照されたい）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチド「によって特徴付けられる癌」とは、そのような融合遺伝子及び／又は融合ポリペプチドが存在していない癌と比較して、そのような突然変異ＡＬＫ遺伝子及び／又は発現されたポリペプチドが存在している癌を示す。 A mammalian bone marrow transplant model or xenotransplantation in the practice of the disclosed method for determining whether a compound inhibits tumor progression characterized by an EML4-ALK or TFG-ALK fusion gene and / or fusion polypeptide. Biological samples containing hemi-derived cells can also be used advantageously. A preferred xenograft (or transplant recipient) is that of a small mammal, such as a mouse, transplanted with a human tumor expressing a mutant ALK kinase polypeptide. Xenografts transplanted with human tumors are known in the art (see Kal, Cancer Treat Res. 72: 155-69 (1995)) and xenografts transplanted with human tumors. The production of pieces is well described (see Winograd et al., In Vivo. 1 (1) 1-13 (1987)). Similarly, the generation and use of bone marrow transplantation models is well documented (eg, Schwaller, et al., EMBO J. 17: 5321-333 (1998); Kelly et al., Blood 99: 310-318. (2002)). "Cancers characterized by EML4-ALK or TFG-ALK fusion polynucleotides and / or fusion polypeptides" are such as compared to cancers in which such fusion genes and / or fusion polypeptides are not present. Indicates a cancer in which a mutant ALK gene and / or an expressed polypeptide is present.

哺乳類の癌腫瘍由来の細胞を含む生体試料中のＡＬＫポリヌクレオチドの存在又はポリペプチドの発現の評価において、そのような転座及び／又は融合タンパク質を生じない細胞を示すコントロール試料を、比較の目的で望ましく用いることができる。理想的には、コントロール試料は、突然変異（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失変異）が発生せず、そして／又は融合ポリペプチドが発現されないサブセットの象徴である特定の癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）のサブセットに由来する細胞を含んでいる。コントロール試料中と試験生体試料中のレベルを比較することによって、突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが存在しているか否かを同定する。あるいは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ及び／又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは大部分の癌に存在していないので、同様にそのような突然変異ＡＬＫポリペプチドを発現（又は突然変異ポリヌクレオチドを担持）しない組織の何れかをコントロールとして用いることができる。 Control samples showing cells that do not produce such translocations and / or fusion proteins in assessing the presence of ALK polynucleotides or expression of polypeptides in biological samples containing cells from mammalian cancer tumors are for comparison purposes. Can be preferably used in. Ideally, the control sample is a subset of a particular cancer (eg, NSCLC) that is symbolic of a subset that does not develop mutations (eg, EML4-ALK deletion mutations) and / or does not express the fusion polypeptide. Contains cells derived from. The presence or absence of mutant ALK polynucleotides and / or polypeptides is identified by comparing the levels in the control sample with those in the test biological sample. Alternatively, since EML4-ALK and / or TFG-ALK fusion polynucleotides and / or polypeptides are absent in most cancers, they also express (or mutated polynucleotides) such mutant ALK polypeptides. Any of the non-supporting tissues can be used as a control.

下記の方法は、突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドによって特徴付けられる癌、及びそれに関する治療方法の決定について、価値ある診断的用途を有するであろう。例えば、生体試料は、以前にＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失変異及び／又は融合ポリペプチドによって特徴付けられる癌を有していると診断されたことがなく、そのような癌の治療を受けたこともない対象から得ることができ、そして方法は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが存在及び／又は発現している腫瘍（例えば、ＮＳＣＬＣ）のサブセットと見なされる、対象の腫瘍を診断的に同定するために用いられる。本発明の方法は、対象をＡＬＫキナーゼを阻害する治療薬又は治療薬の組合わせを含有する組成物で治療した後に、突然変異ＡＬＫキナーゼポリペプチドを発現する癌の進行又は阻止を観察するためにも用いることができる。 The methods below will have valuable diagnostic uses for determining cancers characterized by mutant ALK polynucleotides and / or polypeptides, and treatment methods for them. For example, a biological sample has never been previously diagnosed with a cancer characterized by an EML4-ALK deletion mutation and / or fusion polypeptide and has never been treated for such a cancer. A method can be obtained from a subject, and the method is considered diagnostically for a tumor of interest that is considered a subset of the tumor in which the EML4-ALK fusion polynucleotide and / or polypeptide is present and / or expressed (eg, NSCLC). Used to identify. The method of the invention is to observe the progression or inhibition of a cancer expressing a mutant ALK kinase polypeptide after treating a subject with a therapeutic agent or composition containing a therapeutic agent combination that inhibits ALK kinase. Can also be used.

そのような診断アッセイは、予備的評価又は外科的診断手順の後又は前に実施することができる。本発明の同定方法は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ及び／又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質又は切断されたＡＬＫキナーゼによって促進される、ＮＳＣＬＣのような、癌を有している患者を同定するための診断に有利に用いることができ、そのような患者は、ＷＨＩー１３１及び／又はＷＨＩ−１５４又はそれらの類縁体のような、ＡＬＫキナーゼ活性を阻害することを標的とする治療薬に応答する可能性が最も高いだろう。そのような患者を選択する能力は、次世代のＡＬＫを標的とする薬剤の効果を臨床的に評価するために、さらに将来のそのような薬剤の患者への処方においても有用であろう。 Such diagnostic assays can be performed after or before preliminary evaluation or surgical diagnostic procedures. The identification methods of the present invention are advantageous for diagnosis to identify patients with cancer, such as NSCLC, promoted by EML4-ALK and / or TFG-ALK fusion proteins or cleaved ALK kinases. Such patients can be used and are most likely to respond to therapeutic agents that target to inhibit ALK kinase activity, such as WHI-131 and / or WHI-154 or their relatives. right. The ability to select such patients will be useful in clinically assessing the efficacy of next-generation ALK-targeting agents, as well as in future prescribing of such agents to patients.

診断
ＥＭＬ４−ＡＬＫ及び／又はＴＦＧ-ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドが存在している癌を選択的に同定する能力は、診断目的でそのような癌を的確に同定するための重要な新規な方法を、更にまたそのような癌がＡＬＫを阻害する治療薬組成物に応答しそうであるか、又は癌を治療するために単剤として投与したときに、異なるキナーゼを標的にしている阻害剤に部分的に又は全く応答しそうもないかを判定するのに有用な情報を得ることも可能にする。 The ability to selectively identify cancers in which a diagnostic EML4-ALK and / or TFG-ALK fusion polynucleotide and / or fusion polypeptide is present is important for the accurate identification of such cancers for diagnostic purposes. Inhibitions targeting different kinases when new methods are also applied, and when such cancers are likely to respond to therapeutic compositions that inhibit ALK, or when administered as a single agent to treat cancer. It also makes it possible to obtain useful information in determining whether a drug is unlikely to respond partially or at all.

従って、ある態様では、本発明は哺乳類の癌由来の生体試料における突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド及び／又はそれがコードする突然変異ＡＬＫポリペプチドの存在を検出する方法を提供し、当該方法は工程：
（ａ）哺乳類の癌から生体試料を得ること；及び
（ｂ）融合ポリヌクレオチド、又はＡＬＫの部分と二次タンパク質の部分を含有しており、それをコードする融合ポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて、ＡＬＫ突然変異ポリヌクレオチド及び／又はそれをコードする突然変異ＡＬＫポリペプチドが当該生体試料中に存在するか否かを判定すること：
を含んでいる。 Thus, in some embodiments, the invention provides a method of detecting the presence of a mutated ALK polynucleotide and / or a mutated ALK polypeptide encoded by it in a biological sample derived from mammalian cancer, the method of which is step:
(A) Obtaining a biological sample from mammalian cancer; and (b) At least one that contains a fusion polynucleotide, or portion of ALK and a portion of secondary protein, and detects a fusion polypeptide encoding it. Using a reagent to determine if an ALK mutant polynucleotide and / or a mutant ALK polypeptide encoding it is present in the biological sample:
Includes.

ある好ましい態様では、癌は固形肉腫又は癌腫であり、一態様では、癌腫は、ＮＳＣＬＣのような、肺癌である。別の好ましい態様では、突然変異ＡＬＫポリペプチドはＡＬＫ（配列番号５）の残基１１１６−１３８３を当該二次タンパク質の部分とともに含んでいる融合ポリペプチドである。別の好ましい態様では、二次タンパク質は、ＥＭＬ−４（配列番号３）及びＴＲＫ−融合遺伝子（ＴＦＧ）タンパク質（配列番号２２）よりなる群から選ばれる。更に別の好ましい態様では、融合ポリペプチドは、ＥＭＬ−４（配列番号３）の残基１−２３３若しくは残基１−４９５又はＴＦＧ（配列番号２２）の残基１−１３８を含んでいる。 In one preferred embodiment, the cancer is solid sarcoma or carcinoma, and in one embodiment, the carcinoma is lung cancer, such as NSCLC. In another preferred embodiment, the mutated ALK polypeptide is a fusion polypeptide comprising residue 1116-1383 of ALK (SEQ ID NO: 5) with a portion of the secondary protein. In another preferred embodiment, the secondary protein is selected from the group consisting of EML-4 (SEQ ID NO: 3) and TRK-fusion gene (TFG) protein (SEQ ID NO: 22). In yet another preferred embodiment, the fusion polypeptide comprises residue 1-233 or residue 1-495 of EML-4 (SEQ ID NO: 3) or residue 1-138 of TFG (SEQ ID NO: 22).

他の好ましい態様では、融合ポリヌクレオチドは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２又は１９）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２１）を含んでいて、更なる別の態様では、融合ポリペプチドはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号１又は１８）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号２０）を含んでいる。更に別の好ましい態様では、融合ポリヌクレオチドは前記のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。 In another preferred embodiment, the fusion polynucleotide comprises an EML4-ALK fusion polynucleotide (SEQ ID NO: 2 or 19) or a TFG-ALK fusion polynucleotide (SEQ ID NO: 21), and in yet another embodiment, the fusion polypeptide. Peptides include the EML4-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 1 or 18) or the TFG-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 20). In yet another preferred embodiment, the fusion polynucleotide is the EML4-ALK fusion polynucleotide or polypeptide described above.

より好ましい態様では、方法は、上記のような、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又は少なくとも１つのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な試薬（抗体又はＡＱＵＡペプチド）を含む試薬を用いる。いくつかの好ましい態様では、この試薬はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド（配列番号２０）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（配列番号２１）に特異的に結合するか又はこれを検出するが、野生型のＴＦＧ又は野生型のＡＬＫの何れかと結合せずこれを検出しない、単離された試薬を含む。その他の好ましい態様では、この試薬はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブ又は蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブである。ある好ましい態様は、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部又は野生型ＡＬＫ内の切断点のアミノ酸配列を含む重同位体標識化（ＡＱＵＡ）ペプチドを用いる。 In a more preferred embodiment, the method uses a reagent comprising an EML4-ALK fusion polynucleotide and / or at least one EML4-ALK fusion polypeptide-specific reagent (antibody or AQUA peptide) as described above. In some preferred embodiments, the reagent specifically binds to or detects a TFG-ALK fusion polypeptide (SEQ ID NO: 20) or TFG-ALK fusion polynucleotide (SEQ ID NO: 21), but in the wild type. Includes isolated reagents that do not bind to or detect either TFG or wild-type ALK. In another preferred embodiment, the reagent is a polymerase chain reaction (PCR) probe or a fluorescence in situ hybridization (FISH) probe. In one preferred embodiment, a heavy isotope-labeled (AQUA) peptide comprising the amino acid sequence of a fusion junction of a TFG-ALK fusion polypeptide or a cut point within a wild-type ALK is used.

いくつかの好ましい態様では、本発明の診断方法は、上記のように、フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、又は免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイ形式に組み入れられる。別の好ましい態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの活性を検出する。他の好ましい態様では。本発明の診断方法は、上記のように、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ形式に組み入れられる。 In some preferred embodiments, the diagnostic methods of the invention are incorporated into the assay form of flow cytometry (FC), immunohistochemistry (IHC), or immunofluorescence (IF), as described above. In another preferred embodiment, the activity of the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide is detected. In another preferred embodiment. The diagnostic methods of the present invention are incorporated into the fluorescence in situ hybridization (FISH) or polymerase chain reaction (PCR) assay format as described above.

本発明は更に、化合物が、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドによって特徴付けられる癌の進行を阻害するか否かを判定する方法を提供し、この方法は、当該化合物が、当該癌における当該ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害するか否かを判定する段階を含んでいる。ある好ましい態様では、ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性の阻害は、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド又はポリペプチド、及び／又は本明細書に記載されるＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて判定する。ＡＬＫキナーゼ活性の阻害に適している化合物は、以下のＧ欄でより詳細に検討されている。 The invention further provides a method of determining whether a compound inhibits the progression of cancer characterized by an EML4-ALK or TFG-ALK fusion polynucleotide and / or fusion polypeptide, which method is said to be relevant. It comprises the step of determining whether the compound inhibits the expression and / or activity of the EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptide in the cancer. In certain preferred embodiments, inhibition of expression and / or activity of the ALK fusion polypeptide is an EML4-ALK fusion polynucleotide or polypeptide of the invention and / or the TFG-ALK fusion polynucleotide or poly described herein. Judgment is made using at least one reagent that detects the peptide. Compounds suitable for inhibiting ALK kinase activity are investigated in more detail in column G below.

本発明方法の実施に有用な突然変異ＡＬＫポリヌクレオチドプローブ及びポリペプチドに特異的な試薬は、上のＢ欄及びＤ欄により詳細に記載されている。ある好ましい態様では、ＡＬＫ融合ポリペプチドに特異的な試薬は、融合ポリペプチドに特異的な抗体を含んでいる。別の好ましい態様では、融合ポリペプチドに特異的な試薬は、ＡＬＫ融合ポリペプチドの融合接合部（図１Ａ−Ｃ（最下図）を参照されたい）に対応する、重同位体標識化ホスホペプチド（ＡＱＵＡペプチド）を含んでいる。さらにその他の好ましい態様では、融合ポリヌクレオチドに特異的な試薬は、ＡＬＫ融合遺伝子の融合接合部及び／又は野生型ＥＭＬ４、ＴＦＧ、又はＡＬＫ遺伝子の切断点に対応する、ＦＩＳＨプローブを含んでいる。 Mutant ALK polynucleotide probes and polypeptide-specific reagents useful for practicing the methods of the invention are described in more detail in columns B and D above. In one preferred embodiment, the reagent specific for the ALK fusion polypeptide comprises an antibody specific for the fusion polypeptide. In another preferred embodiment, the reagent specific for the fusion polypeptide is a heavy isotope-labeled phosphopeptide corresponding to the fusion junction of the ALK fusion polypeptide (see FIGS. 1AC (bottom)). AQUA peptide) is contained. In yet another preferred embodiment, the fusion polynucleotide-specific reagent comprises a fusion junction of the ALK fusion gene and / or a FISH probe corresponding to the wild-type EML4, TFG, or cleavage point of the ALK gene.

上記の本発明方法は、当該生体試料中の、野生型ＡＬＫ及びＥＧＦＲのような他のキナーゼ、又は他の下流にあるシグナル伝達分子の発現又は活性化のレベルを判定する段階を任意に含んでいてもよい。所定の生体試料中の、ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現／活性化及び他のキナーゼ及び経路の発現／活性化の解明は、どのキナーゼ及び経路がこの疾患を促進するのか、及びどの治療計画が最も有益な可能性があるのかについての価値ある情報をもたらすことができる。 The method of the invention described above optionally comprises determining the level of expression or activation of other kinases, such as wild-type ALK and EGFR, or other downstream signaling molecules in the biological sample. You may. Elucidation of the expression / activation of ALK fusion polypeptides and the expression / activation of other kinases and pathways in a given biological sample is most beneficial in which kinases and pathways promote the disease and which treatment regimen Can provide valuable information about what is possible.

化合物のスクリーニング
本明細書に記載の新規なＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発見も、この突然変異ＡＬＫタンパク質の活性、特にそのＡＬＫキナーゼ活性を阻害する新規な化合物の開発を可能にする。従って、本発明は、ある側面で、化合物が、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドによって特徴付けられる癌の進行を阻害するか否かを判定する方法を提供し、その方法は当該化合物が当該癌において当該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害するか否かを判定する段階を含んでいる。ある好ましい態様では、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性の阻害は、本発明の融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドを検出する少なくとも１つの試薬を用いて判定する。本発明の好ましい試薬は上記されている。ＡＬＫキナーゼ活性を阻害するのに適している化合物は以下のＧ欄により詳細に記述されている。 Screening of Compounds The discovery of novel EML4-ALK fusion polypeptides described herein also allows the development of novel compounds that inhibit the activity of this mutant ALK protein, especially its ALK kinase activity. Accordingly, the present invention provides, in one aspect, a method of determining whether a compound inhibits the progression of a cancer characterized by an EML4-ALK fusion polynucleotide and / or a fusion polypeptide, which method is said to be relevant. It comprises the step of determining whether the compound inhibits the expression and / or activity of the EML4-ALK fusion polypeptide in the cancer. In certain preferred embodiments, inhibition of expression and / or activity of the EML4-ALK fusion polypeptide is determined using at least one reagent that detects the fusion polynucleotide and / or fusion polypeptide of the invention. The preferred reagents of the present invention are described above. Compounds suitable for inhibiting ALK kinase activity are described in more detail in column G below.

化合物は、例えば、小分子又は抗体阻害剤のような、キナーゼ阻害剤であってよい。これはいくつかの異なったキナーゼに対する活性を持っている、総キナーゼ（pan-kinase）、又はキナーゼに特異的な阻害剤であってよい。ＡＬＫキナーゼを阻害する化合物は以下のＧ欄により詳細に記述されている。阻害剤による治療の前後に患者の生体試料を採取し、次いで、上記の方法を用いて、下流の基質タンパク質のリン酸化を含む、ＡＬＫキナーゼ活性に対する阻害剤の生物学的効果を分析する。そのような薬力学的アッセイは、最大許容用量として好ましい、薬剤の生物学的活性用量を決定するのに有用であろう。そのような情報は、薬物作用のメカニズムを明らかにして、医薬品許可を申請する際にも有用であろう。そのような望ましい阻害特性を有する化合物の同定については、以下のＧ欄に更に記述されている。 The compound may be a kinase inhibitor, such as, for example, a small molecule or antibody inhibitor. It may be a pan-kinase, or a kinase-specific inhibitor, that has activity against several different kinases. Compounds that inhibit ALK kinase are described in more detail in column G below. Biological samples of the patient are taken before and after treatment with the inhibitor, and then the biological effects of the inhibitor on ALK kinase activity, including phosphorylation of downstream substrate proteins, are analyzed using the methods described above. Such a pharmacodynamic assay would be useful in determining the bioactive dose of the drug, which is preferred as the maximum acceptable dose. Such information may also be useful in clarifying the mechanism of drug action and applying for a drug license. The identification of compounds with such desirable inhibitory properties is further described in column G below.

Ｇ．癌の治療的阻害
本発明によって、そこでＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質が発現されるような哺乳類の固形癌腫瘍（ＮＳＣＬＣ）の進行を、インビボでそのような癌にあるＡＬＫキナーゼの活性を阻害することによって、阻止できるということが示された。同様に、本明細書に記載のように、インビボでそのような癌にあるＡＬＫキナーゼの活性を阻害することによって、ＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質が発現される哺乳類の固形癌腫瘍の活性も、同様に阻害できる。癌（例えば、腫瘍）を、ＷＨＩ−１３１又はＷＨＩ−１５４様の小分子キナーゼ阻害剤のようなＡＬＫキナーゼを阻害する治療薬と接触させることによって、突然変異ＡＬＫポリペプチドの発現によって特徴付けられる癌におけるＡＬＫ活性を阻害することができる。以下の実施例２に更に記述されるように、ＡＬＫ融合タンパク質を発現する腫瘍の生育阻害は、例えば、典型的なＡＬＫを阻害する治療薬である、ｓｉＲＮＡを用いて融合キナーゼを阻害することによって達成することができる。従って、本発明は、ある側面で、癌にある突然変異ＡＬＫキナーゼの発現及び／又は活性を阻害することによって、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する癌又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する固形腫瘍の進行を阻害する方法を提供する。 G. Therapeutic Inhibition of Cancer According to the present invention, the progression of mammalian solid cancer tumors (NSCLC) in which the EML4-ALK fusion protein is expressed, by inhibiting the activity of ALK kinase in such cancers in vivo. , It was shown that it can be stopped. Similarly, as described herein, the activity of mammalian solid tumors in which the TFG-ALK fusion protein is expressed by inhibiting the activity of ALK kinase in such cancers in vivo. Can be inhibited. Cancer characterized by the expression of a mutant ALK polypeptide by contacting the cancer (eg, tumor) with a therapeutic agent that inhibits ALK kinase, such as a small molecule kinase inhibitor such as WHI-131 or WHI-154. Can inhibit ALK activity in. As further described in Example 2 below, inhibition of growth of tumors expressing ALK fusion proteins is achieved, for example, by inhibiting fusion kinases with siRNA, a typical ALK-inhibiting therapeutic agent. Can be achieved. Therefore, the present invention, in one aspect, is a solid expressing a cancer or TFG-ALK fusion polypeptide expressing an EML4-ALK fusion polypeptide by inhibiting the expression and / or activity of a mutant ALK kinase in the cancer. Provided is a method of inhibiting the progression of a tumor.

ＡＬＫキナーゼを阻害する治療薬は、インビボでＡＬＫキナーゼの発現及び／又は活性を、直接的に又は間接的に、阻害するもので、下記の例示的な化合物群を包含する、生物学的又は化学的な化合物の少なくとも１つを含んでいる組成物の何れかであってよい。そのような化合物は、ＡＬＫキナーゼ自体、またはＡＬＫの活性を改変するタンパク質又は分子上で直接作用するか、又はＡＬＫの発現を阻害して間接的に作用する、治療薬を包含する。そのような組成物は、単一のＡＬＫキナーゼ阻害化合物のみを含む組成物を包含し、更には複数の治療薬（他のＲＴＫｓに対するものを含む）を含む組成物も包含していて、これは化学療法剤又は一般の転写阻害剤のような、非特異的な治療薬剤を含有していてもよい。 Therapeutic agents that inhibit ALK kinase directly or indirectly inhibit the expression and / or activity of ALK kinase in vivo, including the following exemplary compounds, biologically or chemically. It may be any of the compositions containing at least one of the compounds. Such compounds include therapeutic agents that act directly on ALK kinase itself, or on proteins or molecules that alter the activity of ALK, or act indirectly by inhibiting the expression of ALK. Such compositions include compositions containing only a single ALK kinase inhibitor compound, as well as compositions containing multiple therapeutic agents, including those for other RTKs. It may contain non-specific therapeutic agents, such as chemotherapeutic agents or general transcriptional inhibitors.

小分子阻害剤
いくつかの好ましい態様では、本発明方法を実施するのに有用なＡＬＫを阻害する治療薬は、ＷＨＩ−１３１及びＷＨＩ−１５４、又はその類縁体のような、小分子阻害剤を標的にしている。ＷＨＩ−１３１及びＷＨＩ−１５４は、ＡＬＫの阻害剤を標的にしているキナゾリンタイプの小分子であって、その性質については記述されている。Marzec et al., Lab. Invest. 85(12):1544-54 (2005)を参照されたい。これらの化合物がリンパ腫細胞のアポトーシスを誘発して、増殖を抑制することが示されている。キナーゼの阻害剤を標的としている他の小分子は当該技術分野において公知である。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合キナーゼ（他のキナーゼも）のＡＴＰ−結合部位に特異的に結合してブロックし、それによってこの酵素のリン酸化及び活性化を阻害する、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標；ＳＴＩ−５７１、Imatinib）は市販されていて、その性質はよく知られている。例えば、Dewar et al., Blood 105(8):3127-32(2005) を参照されたい。他のＡＬＫの小分子阻害剤は、Novartis, Inc. 及び Cephalon Inc. で現在開発中である。 Small Molecule Inhibitors In some preferred embodiments, ALK-inhibiting therapeutic agents useful in carrying out the methods of the invention include small molecule inhibitors such as WHI-131 and WHI-154, or analogs thereof. I'm targeting. WHI-131 and WHI-154 are quinazoline-type small molecules that target inhibitors of ALK and their properties have been described. See Marzec et al., Lab. Invest. 85 (12): 1544-54 (2005). These compounds have been shown to induce apoptosis of lymphoma cells and suppress their growth. Other small molecules targeting kinase inhibitors are known in the art. For example, Gleevec®, which specifically binds and blocks the ATP-binding site of BCR-ABL fusion kinases (as well as other kinases) and thereby inhibits phosphorylation and activation of this enzyme, STI-571. , Imatinib) is commercially available and its properties are well known. See, for example, Dewar et al., Blood 105 (8): 3127-32 (2005). Other small molecule inhibitors of ALK are currently under development at Novartis, Inc. and Cephalon Inc.

小分子を標的としている阻害剤は、特異的に、及びしばしば不可逆的にその酵素の触媒部位に結合して、及び／又はその活性に必要な配座由来の酵素を阻害する、酵素内のＡＴＰ−結合裂隙又は他の結合部位に結合して、主としてそれが標的とする酵素の活性を阻害する分子の類である。小分子阻害剤は、ＡＬＫキナーゼの三次元構造のＸ線結晶解析又はコンピューターモデリングを用いて合理的に設計するか、又はＡＬＫの阻害に関する化合物ライブラリーの高速大量処理スクリーニングによって見出すことができる。そのような方法は、当該技術分野において公知であって、既に記述されている。ＡＬＫ阻害の特異性は、例えば、ＡＬＫ活性を阻害するが、キナーゼ群の他のキナーゼ活性を阻害しないそのような化合物の能力を試験することによって、及び／又は上記のように、肺腫瘍細胞を含有する生体試料中のＡＬＫ活性の阻害を試験することによって、確認することができる。そのようなスクリーニング方法は更に以下に記述されている。 Inhibitors targeting small molecules specifically and often irreversibly bind to the catalytic site of the enzyme and / or inhibit the constellation-derived enzyme required for its activity, ATP within the enzyme. -A class of molecules that bind to a binding gap or other binding site and primarily inhibit the activity of the enzyme it targets. Small molecule inhibitors can be reasonably designed using X-ray crystallography or computer modeling of the three-dimensional structure of ALK kinase, or can be found by high-speed, high-volume screening of compound libraries for inhibition of ALK. Such methods are known in the art and have already been described. The specificity of ALK inhibition is, for example, by testing the ability of such compounds to inhibit ALK activity but not other kinase activities in the kinase group, and / or as described above, lung tumor cells. It can be confirmed by testing the inhibition of ALK activity in the contained biological sample. Such screening methods are further described below.

抗体阻害剤
本発明の方法において有用なＡＬＫキナーゼを阻害する治療薬は、ＡＬＫ活性に必要な臨界的触媒部位又はドメインに特異的に結合して、リガンド、基質又はＡＬＫに対する二次タンパク質の接近を妨害することにより、及び／又はその活性に必要な配座由来の酵素を阻害することによりキナーゼを阻害する、抗体を標的とすることもできる。ヒト化された標的に特異的な抗体の産生、スクリーニング及び治療的使用は、十分に記述されている。Merluzzi et al., Adv. Clin. Path. 4(2):77-85 (2000) を参照されたい。ヒト化された標的を特異的に阻害する抗体を高速大量処理で生成及びスクリーニングするための、Morphosys, Inc. の Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL(登録商標））のような、市販されている技術及びシステムが入手可能である。 Antibody Inhibitors The therapeutic agents that inhibit ALK kinase, which are useful in the methods of the invention, specifically bind to the critical catalytic sites or domains required for ALK activity to allow secondary proteins to approach ligands, substrates or ALK. Antibodies can also be targeted that inhibit the kinase by interfering and / or by inhibiting the enzyme from the coordination required for its activity. The production, screening and therapeutic use of antibodies specific for humanized targets is well documented. See Merluzzi et al., Adv. Clin. Path. 4 (2): 77-85 (2000). Commercially available technologies such as Morphosys, Inc.'s Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®) for the production and screening of antibodies that specifically inhibit humanized targets at high speed and high volume. The system is available.

多種の抗−受容体キナーゼ標的抗体の産生及び、標的受容体の活性を阻害するためのそれらの使用について記述されている。例えば、２００４年１０月１４日公開の米国特許出願公開第２００４０２０２６５５号、"Antibodies to IGF-I Receptor for the Treatment of Cancers", Morton et al.;２００４年４月１５日公開の米国特許出願公開第２００４００８６５０３号、"Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies", Raisch et al. ; ２００４年２月１９日公開の米国特許出願公開第２００４００３３５４３号、"Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr", Schwab et al. を参照されたい。受容体チロシンキナーゼ活性を阻害する抗体の産生及び使用のための標準化された方法は、当該技術分野において公知である。例えば、２００４年６月２日登録のヨーロッパ特許第１４２３４２８号、"Antibodies that Block Receptor Tyrosine KInase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof", Borges et al. を参照されたい。 The production of various anti-receptor kinase target antibodies and their use for inhibiting the activity of the target receptor has been described. For example, US Patent Application Publication No. 20040202655 published on October 14, 2004, "Antibodies to IGF-I Receptor for the Treatment of Cancers", Morton et al .; US Patent Application Publication No. published on April 15, 2004. 2004086503, "Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies", Raisch et al .; US Patent Application Publication No. 20040033543, published February 19, 2004, "Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr", See Schwab et al. Standardized methods for the production and use of antibodies that inhibit receptor tyrosine kinase activity are known in the art. See, for example, European Pat. No. 14,234,428, registered June 2, 2004, "Antibodies that Block Receptor Tyrosine KInase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof", Borges et al.

ファージ提示方法も、ＡＬＫに特異的な抗体阻害剤を生成するために利用することができ、バクテリオファージライブラリー構築物についてのプロトコル及び組み換え抗体の選択については、周知の参考文献である、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Colligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1. に記述されている。２００１年１１月２０日登録の米国特許第６，３１９，６９０号、Little et al.; ２００１年１０月９日登録の米国特許第６，３００，０６４号、Knappik et al.; １９９８年１１月２４日登録の米国特許第５，８４０，４７９号、、Little et al.; ２００３年１１月２７日公開の米国特許出願公開第２００３０２１９８３９号、Bowdish et al. も参照されたい。 Phage presentation methods can also be utilized to generate ALK-specific antibody inhibitors, a well-known reference for protocol and recombinant antibody selection for bacteriophage library constructs, CURRENT PROTOCOLS IN. It is described in IMMUNOLOGY, Colligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1. US Pat. No. 6,319,690, registered November 20, 2001, Little et al .; US Pat. No. 6,300,064, registered October 9, 2001, Knappik et al .; November 1998. See also U.S. Pat. No. 5,840,479, registered 24th, Little et al .; U.S. Patent Application Publication No. 2003219839, published November 27, 2003, Bowdish et al.

バクテリオファージの表面に表示される抗体断片のライブラリーを産生することができ（例えば、２００１年１０月９日登録の米国特許第６，３００，０６４号、Knappik et al. を参照されたい）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＡＬＫのような）の可溶性二量体形態との結合についてスクリーニングすることができる。スクリーニングに用いられるＲＴＫの可溶性二量体形態に結合する抗体断片は、細胞中の標的ＲＴＫの構造的活性化を妨害する候補分子として同定される。ヨーロッパ特許第１４２３４２８号、Borges et al., supra を参照されたい。 A library of antibody fragments displayed on the surface of bacteriophage can be produced (see, eg, US Pat. No. 6,300,064, registered October 9, 2001, Knappik et al.). Binding of the receptor protein tyrosine kinase (such as ALK) to soluble dimeric forms can be screened. Antibody fragments that bind to the soluble dimeric form of RTK used in screening are identified as candidate molecules that interfere with the structural activation of target RTK in cells. See European Pat. No. 14,234,428, Borges et al., Supra.

上記のように抗体ライブラリーのスクリーニングで同定されたＡＬＫ結合を標的とする抗体は、インビトロでのキナーゼアッセイ及びインビボでの細胞株及び／又は腫瘍中の両方で、ＡＬＫの活性を阻害する能力について更にスクリーニングすることができる。ＡＬＫの阻害は、例えば、そのような抗体治療薬のＡＬＫキナーゼ活性を阻害するが、キナーゼ群の他のキナーゼ活性を阻害しない能力を試験して、及び／又は上記のように、癌細胞を含んでいる生体試料中のＡＬＫ活性の阻害を試験して確認することができる。そのような化合物をＡＬＫキナーゼ阻害についてスクリーニングするための方法は上記されている。 Antibodies targeting ALK binding identified by screening antibody libraries as described above are for their ability to inhibit ALK activity both in vitro kinase assays and in vivo cell lines and / or tumors. Further screening is possible. Inhibition of ALK includes, for example, the ability to inhibit the ALK kinase activity of such antibody therapeutics, but not the activity of other kinases in the kinase group, and / or, as described above, cancer cells. Inhibition of ALK activity in living biological samples can be tested and confirmed. Methods for screening such compounds for ALK kinase inhibition are described above.

間接阻害剤
開示される方法の実施に有用なＡＬＫを阻害する化合物は、ＡＬＫキナーゼそれ自体以外の他のタンパク質又は分子の活性を阻害することによって、ＡＬＫ活性を間接的に阻害する化合物であってもよい。そのような阻害治療薬は、ＡＬＫ自体をリン酸化又は脱リン酸化する（そして活性化又は非活性化する）主要な制御キナーゼの活性を調節する、若しくはリガンドの結合を妨げるような阻害剤を標的にすることができる。他の受容体チロシンキナーゼと同様に、ＡＬＫは、アダプタータンパク質のネットワークを経て下流のシグナル伝達を、及びＳＴＡＴ５及びＡＫＴを包含する下流のキナーゼを、制御する。その結果、ＡＬＫ活性による細胞の生育及び生存の誘発を、これらの相互作用又は下流タンパク質を標的にすることによって、阻害することができる。この方法で使用できるように現在開発中の薬剤に、Ｗａｒｔｍａｎｉｎが含まれる。 Indirect Inhibitors ALK-inhibiting compounds useful in carrying out the disclosed methods are compounds that indirectly inhibit ALK activity by inhibiting the activity of other proteins or molecules other than ALK kinase itself. May be good. Such inhibitory therapeutics target inhibitors that regulate the activity of major regulatory kinases that phosphorylate or dephosphorylate (and activate or deactivate) ALK itself, or interfere with ligand binding. Can be. Like other receptor tyrosine kinases, ALK regulates downstream signaling via a network of adapter proteins and downstream kinases, including STAT5 and AKT. As a result, the induction of cell growth and survival by ALK activity can be inhibited by targeting these interactions or downstream proteins. Among the agents currently under development for use in this manner include Wartmanin.

ＡＬＫキナーゼ活性は、ＡＬＫをその活性立体配座にするのに必要な活性化分子の結合を阻害する化合物を用いることにより、間接的に阻害することもできる。同様に、例えば、ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼを下方制御する抗−ＰＤＧＦ抗体の産生及び使用について記述されている。米国特許出願公開第２００３０２１９８３９号、"Anti-PDF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies", Bowdish et al. を参照されたい。 ALK kinase activity can also be indirectly inhibited by using a compound that inhibits the binding of the activating molecule required to make ALK its active conformation. Similarly, for example, the production and use of anti-PDGF antibodies that down-regulate the PDGF receptor tyrosine kinase has been described. See U.S. Patent Application Publication No. 2003219839, "Anti-PDF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies", Bowdish et al.

ＡＬＫ活性の間接阻害剤は、ＡＬＫの三次元構造のＸ線結晶解析又はコンピューターモデリングを用いて合理的に設計することができ、若しくはＡＬＫキナーゼの阻害をもたらす、主要な上流の制御酵素及び／又は必要な結合分子の阻害に関する化合物ライブラリーの高速大量処理のスクリーニングによって見い出すことができる。そのような手段は当該技術分野で公知であって、既に記述されている。そのような治療薬によるＡＬＫ阻害は、例えば、ＡＬＫ活性を阻害するが、キナーゼ群の他のキナーゼ活性を阻害しない化合物の能力を試験して、及び／又は上記のように、癌細胞、例えばＮＳＣＬＣ細胞を含んでいる生体試料中のＡＬＫ活性の阻害を試験して確認することができる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドによって特徴付けられる癌を阻害する化合物を同定する方法は、更に以下に記述されている。 Indirect inhibitors of ALK activity can be reasonably designed using X-ray crystallography or computer modeling of the three-dimensional structure of ALK, or lead to inhibition of ALK kinase, major upstream regulatory enzymes and / or It can be found by screening fast mass processing of compound libraries for inhibition of the required binding molecule. Such means are known in the art and have already been described. Inhibition of ALK by such therapeutic agents, for example, tests the ability of compounds that inhibit ALK activity but not other kinase activities in the kinase group and / or as described above, cancer cells such as NSCLC. Inhibition of ALK activity in biological samples containing cells can be tested and confirmed. Methods for identifying cancer-inhibiting compounds characterized by EML4-ALK or TFG-ALK fusion polynucleotides and / or fusion polypeptides are further described below.

アンチセンス及び／又は転写阻害剤
ＡＬＫを阻害する治療薬は、ＡＬＫ及び／又はＥＭＬ４−ＡＬＫ若しくはＴＦＧ−ＡＬＫ融合遺伝子又は切断されたＡＬＫ遺伝子をコードする遺伝子の転写を阻害することによってＡＬＫキナーゼ活性を阻害する、アンチセンス及び／又は転写の阻害化合物を含んでいてもよい。例えば、癌の治療のためのアンチセンス治療薬による、ＶＥＧＦＥＲ、ＥＧＦＲ、及びＩＧＦＲ、及びＦＧＦＲを包含する、多種の受容体キナーゼの阻害については、既に記述されている。例えば、米国特許第６，７３４，０１７号、同第６，７１０，１７４号、同第６，６１７，１６２号、同第６，３４０，６７４号、同第５，７８３，６８３号、同第５，６１０，２８８号を参照されたい。 Therapeutic agents that inhibit the antisense and / or the transcription inhibitor ALK enhance ALK kinase activity by inhibiting the transcription of the ALK and / or EML4-ALK or TFG-ALK fusion gene or the gene encoding the truncated ALK gene. It may contain antisense and / or transcriptional inhibitory compounds that inhibit. For example, inhibition of a wide variety of receptor kinases, including VEGFER, EGFR, and IGFR, and FGFR, by antisense therapies for the treatment of cancer has already been described. For example, U.S. Pat. Nos. 6,734,017, 6,710,174, 6,617,162, 6,340,674, 5,783,683, and 5,783,683. See Nos. 5,610,288.

アンチセンスオリゴヌクレオチドを公知の技術に従って、標的遺伝子に対する治療薬として、設計し、構築し、そして用いることができる。例えば、Cohen J., Trends in Pharmacol. Sci. 10(11):435-437 (1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172:289-295 (1988); Weintraub, H., Sci. AM. pp.40-46 (1990); Van Der Krol et al., Bio Techniques 6(10):958-976 (1988); Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:4504-4508 を参照されたい。ＥＧＥＲのアンチセンスＲＮＡ阻害剤を用いて、ヒト癌腫の生育をインビボで阻害することが最近記述された。２００４年３月１１日公開の米国特許出願公開第２００４００４７８４７号、"Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth in vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from Pol III Promoter", He et al. を参照されたい。同様に、哺乳類ＡＬＫ遺伝子（図４（配列番号６）を参照されたい）又はＥＭＬ４−ＡＬＫ若しくはＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド又は切断されたＡＬＫポリヌクレオチド（図２Ａ−Ｃ（配列番号２、１９及び２１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでいるＡＬＫを阻害する治療薬を、上記の方法に従って製造することができる。ＡＬＫを阻害するアンチセンス化合物を含んでいる医薬組成物を製造して、以下に更に記述するように投与することができる。 Antisense oligonucleotides can be designed, constructed and used as therapeutic agents for target genes according to known techniques. For example, Cohen J., Trends in Pharmacol. Sci. 10 (11): 435-437 (1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295 (1988); Weintraub, H., Sci. AM. pp.40-46 (1990); Van Der Krol et al., Bio Techniques 6 (10): 958-976 (1988); Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 4504 See -4508. It has recently been described that EGER's antisense RNA inhibitors are used to inhibit the growth of human carcinoma in vivo. See US Patent Application Publication No. 20040047847, published March 11, 2004, "Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth in vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from Pol III Promoter", He et al. Similarly, the mammalian ALK gene (see FIG. 4 (SEQ ID NO: 6)) or EML4-ALK or TFG-ALK fusion polynucleotide or cleaved ALK polynucleotide (FIGS. 2AC (SEQ ID NOs: 2, 19 and 21). An ALK-inhibiting therapeutic agent containing at least one of the antisense oligonucleotides against) can be prepared according to the method described above. A pharmaceutical composition containing an antisense compound that inhibits ALK can be prepared. , Can be administered as further described below.

低分子干渉ＲＮＡ
ＲＮＡ干渉過程を経て翻訳を阻害し、それによってＡＬＫの活性を阻害する、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）も、望ましく本発明の方法に使用することができる。ＲＮＡ干渉、及び標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な配列を含有する外来性の低分子二本鎖ＲＮＡの導入による、標的遺伝子の選択的サイレンシングについては、十分に記述されている。例えば、２００４年２月２６日公開の米国特許出願公開第２００４００３８９２１号、"Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene", Kreutzer et al.; ２００３年６月１２日公開の米国特許出願公開第２００２００８６３５６号、"RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference", Tuschl et al.; ２００４年１１月１８日公開の米国特許出願公開第２００４０２２９２６６号、"RNA Interference Mediating Small RNA Molecules", Tuschl et al. を参照されたい。 Small interfering RNA
Small interfering RNA molecules (siRNAs) that inhibit translation through RNA interference processes and thereby inhibit the activity of ALK can also preferably be used in the methods of the invention. Selective silencing of the target gene by RNA interference and the introduction of exogenous low molecular weight double-stranded RNA containing a sequence complementary to the mRNA encoding the target protein is well documented. For example, US Patent Application Publication No. 20040038921 published February 26, 2004, "Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene", Kreutzer et al .; US Patent Application Publication No. 200886356 published June 12, 2003. See, "RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference", Tuschl et al .; US Patent Application Publication No. 20040229266, published November 18, 2004, "RNA Interference Mediating Small RNA Molecules", Tuschl et al. I want to.

例えば、ここに示されているように（実施例２を参照されたい）、融合タンパク質を発現するヒトＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の発現のｓｉＲＮＡ−介在サイレンシングは、これらの細胞において疾患の進行を選択的に阻害したが、突然変異ＡＬＫタンパク質を発現しないコントロール細胞では疾患の進行を阻害しなかった。 For example, as shown herein (see Example 2), siRNA-mediated silencing of EML4-ALK fusion protein expression in human NSCLC cell lines expressing the fusion protein is diseased in these cells. Although it selectively inhibited the progression of the disease, it did not inhibit the progression of the disease in control cells that did not express the mutant ALK protein.

二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている、高度に保存された制御機構における遺伝子発現を阻害することが示されている。すなわち、ＲＮＡｓｅＩＩＩＤｉｃｅｒが、ｄｓＲＮＡを処理して約２２ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にして、これはＲＮＡ誘発サイレンシング複合体ＲＩＳＣによる標的に特異的なｍＲＮＡの切断を誘発するガイド配列として働く（Hammond et al., Nature (2000) 404:293-296 を参照されたい）。ＲＮＡｉは、より長いｄｓＲＮＡの連続的な切断によって新規なｓｉＲＮＡが生成される触媒型反応に関与している。従って、アンチセンスとは異なって、ＲＮＡｉは非化学量論的方法で標的ＲＮＡを分解する。細胞又は臓器に投与すると、外来性ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを介して外来性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的な分解を促進するこが示されている。 Double-stranded RNA molecules (dsRNA) have been shown to inhibit gene expression in a highly conserved regulatory mechanism known as RNA interference (RNAi). That is, RNAse III Dicer processes the dsRNA into a small interfering RNA (siRNA) of approximately 22 nucleotides, which serves as a guide sequence to induce target-specific mRNA cleavage by the RNA-induced silencing complex RISC. It works (see Hammond et al., Nature (2000) 404: 293-296). RNAi is involved in a catalytic reaction in which new siRNAs are produced by continuous cleavage of longer dsRNAs. Therefore, unlike antisense, RNAi degrades target RNA in a non-stoichiometric way. It has been shown that when administered to cells or organs, exogenous dsRNA promotes sequence-specific degradation of exogenous messenger RNA (mRNA) via RNAi.

それを発現するため及び哺乳類細胞で使用するためのベクター及びシステムを包含する、多種類の標的に特異的なｓｉＲＮＡ産物は現在入手可能であり、哺乳類細胞に使用することができる。例えば、Promega, Inc. (promega.com); Dharmacon, Inc. (dharmacon.com.) を参照されたい。ＲＮＡｉに関するｄｓＲＮＡの設計、構造及び使用の詳細な技術マニュアルは入手可能である。例えば、 Dharmacon's "RNAi Thechnical Reference & Application Guide"; Promega's "RNAi: A Guide to Gene Silencing." を参照されたい。ＡＬＫを阻害するｓｉＲＮＡ産物も市販されていて、本発明の方法で使用するのに適している。例えば、Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (Cat Nos. M-003162-03, MU-003162-03, D-003162-07 thru -10; siGENOME（登録商標）SMARTselection and SMARTpool（登録商標）siRNAs)を参照されたい。 A wide variety of target-specific siRNA products, including vectors and systems for their expression and use in mammalian cells, are currently available and can be used in mammalian cells. See, for example, Promega, Inc. (promega.com); Dharmacon, Inc. (dharmacon.com.). Detailed technical manuals for the design, construction and use of dsRNA for RNAi are available. See, for example, Dharmacon's "RNAi Thechnical Reference & Application Guide"; Promega's "RNAi: A Guide to Gene Silencing." SiRNA products that inhibit ALK are also commercially available and are suitable for use in the methods of the invention. For example, Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (Cat Nos. M-003162-03, MU-003162-03, D-003162-07 thru -10; siGENOME® SMART selection and SMARTpool® siRNAs) Please refer.

そのｄｓＲＮＡが最適にはその末端に１〜４ヌクレオチド突出部を少なくとも１つ有している、標的ｍＲＮＡ配列の部分と実質的に相同性を有する配列を少なくとも１つ含んでいる、長さが４９ヌクレオチドより短い、好ましくは１９〜２５のヌクレオチドの小さいｄｓＲＮＡが、哺乳類においてＲＮＡｉを介在するのに最も効果があるということが最近立証された。米国特許出願公開第２００４００３８９２１号、Kreutzer et al., supra; 米国特許出願公開第２００４０２２９２６６号、Tuschl et al., supra を参照されたい。そのようなｄｓＲＮＡの構築物、及びインビボでの標的タンパク質の発現を消去するための医薬製剤でのそれらの用途は、上の文献に詳細に記述されている。 The dsRNA optimally contains at least one sequence having at least one 1-4 nucleotide overhang at its end, which is substantially homologous to a portion of the target mRNA sequence, 49 in length. It has recently been demonstrated that small dsRNAs, shorter than nucleotides, preferably 19-25 nucleotides, are most effective in mediating RNAi in mammals. See U.S. Patent Application Publication No. 20040038921, Kreutzer et al., Supra; U.S. Patent Application Publication No. 2004022926, Tuschl et al., Supra. The constructs of such dsRNAs, and their use in pharmaceutical formulations for eliminating expression of target proteins in vivo, are described in detail in the above literature.

哺乳類において標的とする遺伝子の配列が知られている場合は、２１〜２３ｎｔＲＮＡは、例えば、それらを産生して、ヒト又は他の霊長類の細胞のような哺乳類の細胞におけるＲＮＡｉを介在するそれらの能力について試験することができる。ＲＮＡｉを介在することが示されているそれらの２１〜２３ｎｔＲＮＡ分子は、所望により、適切な動物モデルにおいてそれらのインビボでの効果を更に評価するために試験することができる。既知の標的部位、例えば、他の核酸分子、例えばリボザイム又はアンチセンスでの検討に基づいて有効な標的部位であることが判定されている部位は、若しくは突然変異又は欠失を含んでいる部位のような、病気又は疾患に関連していることが知られているこれらの標的は、これらの部位を標的にするｓｉＲＮＡを設計するために同様に用いることができる。 If the sequences of the genes of interest in mammals are known, 21-23 ntRNAs produce them, for example, those that mediate RNAi in mammalian cells, such as human or other primate cells. Can be tested for ability. Those 21-23 ntRNA molecules that have been shown to mediate RNAi can optionally be tested in a suitable animal model to further assess their in vivo effects. Known target sites, such as sites that have been determined to be effective target sites based on studies with other nucleic acid molecules, such as ribozymes or antisense, or sites that contain mutations or deletions. These targets, such as those known to be associated with the disease or disease, can also be used to design siRNAs that target these sites.

あるいは、有効なｄｓＲＮＡの配列は、標的部位について目的となる標的ｍＲＮＡを、例えばコンピューター組み込みアルゴリズムを用いて、合理的に設計／予測スクリーニングを行うことができる。標的配列は、カスタムPerlスクリプト又は Oligo、MacVector、又はGCG Wisconsin Packageのような市販の配列解析プログラムを用いて、コンピューター内で解析して、全断片の又は特定の長さの部分列、例えば２３ヌクレオチド断片のリストにすることができる。 Alternatively, a valid dsRNA sequence can be reasonably designed / predicted screened for the target mRNA of interest for the target site, eg, using a computer-incorporated algorithm. Target sequences are analyzed in a computer using a custom Perl script or a commercially available sequence analysis program such as Oligo, MacVector, or GCG Wisconsin Package and subsequences of the entire fragment or of a particular length, such as 23 nucleotides. It can be a list of fragments.

標的ＲＮＡ配列中のどの部位が最も適した標的部位であるかを判定するために多種のパラメーターを用いることができる。これらのパラメーターは、これらに限定されないが、二次又は三次ＲＮＡ構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の多種領域間の相同性の程度、又はＲＮＡ複写物中の標的配列の相対位置を包含する。これらの測定に基づいて、ＲＮＡ複写物中のいずれの数の標的部位も、例えばインビトロＲＮＡ切断アッセイ、細胞培養、又は動物モデルを用いて、ｓｉＲＮＡ分子の有効性についてスクリーニングするために選択することができる。例えば、２００３年９月１１日公開の米国特許出願公開第２００３０１７０８９１号、McSwiggen J を参照されたい。ＲＮＡｉ標的部位を同定及び選択するアルゴリズムについても最近記述されている。２００４年１１月２５日公開の米国特許出願公開第２００４０２３６５１７号、"Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA", Drlica et al. を参照されたい。 A variety of parameters can be used to determine which site in the target RNA sequence is the most suitable target site. These parameters include, but are not limited to, the secondary or tertiary RNA structure, the nucleotide base composition of the target sequence, the degree of homology between the various regions of the target sequence, or the relative position of the target sequence in the RNA copy. To do. Based on these measurements, any number of target sites in the RNA copy can be selected to screen for the efficacy of siRNA molecules, eg, using in vitro RNA cleavage assays, cell cultures, or animal models. it can. See, for example, US Patent Application Publication No. 20130178091, published September 11, 2003, McSwiggen J. Algorithms for identifying and selecting RNAi target sites have also recently been described. See U.S. Patent Application Publication No. 20040236517, "Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA," published November 25, 2004, Drlica et al.

通常用いられる遺伝子導入技術は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクション及びウィルス法を包含する（Graham et al., (1973) Virol. 52:456; McCutchan et al., (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41:351; Chu et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15:1311; Fraley et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:10431; Capecchi (1980), cell 22:479）。ＤＮＡも陽イオンリポソームを用いて細胞に導入することができる（Feigner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413）。市販の陽イオン脂質製剤は、Ｔｆｘ５０（Promega）又はリポフェクタミン２００（Lipofectamin 200; Life Technologies）を包含する。また、ウィルスベクターはｄｓＲＮＡを細胞に送達してＲＮＡｉを介在させるために用いることができる。２００４年２月４日公開の米国特許出願公開第２００４００２３３９０号、"siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors", Davidson et al. を参照されたい。 Commonly used gene transfer techniques include calcium phosphate, DEAE dextran, electroporation and microinjection and viral methods (Graham et al., (1973) Virol. 52: 456; McCutchan et al., (1968), J. . Natl. Cancer Inst. 41: 351; Chu et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15:1311; Fraley et al. (1980), J. Biol. Chem. 255: 10431; Capecchi (1980), cell 22:479). DNA can also be introduced into cells using cationic liposomes (Feigner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413). Commercially available cationic lipid formulations include Tfx50 (Promega) or Lipofectamin 200 (Life Technologies). Viral vectors can also be used to deliver dsRNA to cells and intervene RNAi. See U.S. Patent Application Publication No. 20040023390, published February 4, 2004, "siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors", Davidson et al.

哺乳類の細胞におけるＲＮＡｉのトランスフェクション及びベクター／発現システムは、市販されていて、十分に記述されている。例えば、Dharmacon, Inc., DharmaFECT（登録商標）system; Promega, Inc., siSTRIKE（登録商標）system を参照されたい。Gou et al. (2003) FEBS. 548, 113-118; Sui et al. A DNA vector-based RNAi technology to supress gene expression in mammalian cells (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 5515-5520; Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6047-6052; Paul, C. et al. (2002) Nature Biotechnology 19,505-508; McManus et al. (2002) RNA 8, 842-850 も参照されたい。 RNAi transfection and vector / expression systems in mammalian cells are commercially available and well described. See, for example, Dharmacon, Inc., DharmaFECT® system; Promega, Inc., siSTRIKE® system. Gou et al. (2003) FEBS. 548, 113-118; Sui et al. A DNA vector-based RNAi technology to supress gene expression in mammalian cells (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 5515-5520; Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6047-6052; Paul, C. et al. (2002) Nature Biotechnology 19,505-508; McManus et al. (2002) RNA 8, 842-850 See also.

調製したｄｓＲＮＡ分子を用いる哺乳類におけるｓｉＲＮＡ干渉は、ｄｓＲＮＡを含有している医薬製剤を哺乳類に投与することによって達成される。医薬組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与される。ｄｓＲＮＡは、通常、１日に体重キログラム当たり５ｍｇ未満の用量で投与され、この用量は、標的遺伝子の発現を阻害するのに又は完全に止めるのに十分である。一般にｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日に被投与者の体重キログラム当たり０．０１〜２．５ミリグラムの範囲内、好ましくは１日に体重キログラム当たり０．１〜２００マイクログラムの範囲内、より好ましくは１日に体重キログラム当たり０．１〜１００マイクログラムの範囲内、更により好ましくは１日に体重キログラム当たり１．０〜５０マイクログラムの範囲内、そして最も好ましくは１日に体重キログラム当たり１．０〜２５マイクログラムの範囲内であろう。ｄｓＲＮＡを含有している医薬組成物は、１日１回、又は数回低用量で、例えば、当該技術分野で公知の徐放製剤を用いて、投与される。そのような医薬組成物の調製及び投与は、以下に更に記述するように、標準的な技術に従って実施することができる。 SiRNA interference in mammals using the prepared dsRNA molecules is achieved by administering to the mammal a pharmaceutical formulation containing the dsRNA. The pharmaceutical composition is administered at a dose sufficient to inhibit the expression of the target gene. The dsRNA is usually administered at a dose of less than 5 mg per kilogram of body weight per day, which dose is sufficient to inhibit or completely stop the expression of the target gene. In general, a suitable dose of dsRNA is in the range of 0.01-2.5 milligrams per kilogram of body weight per day, preferably in the range of 0.1-200 micrograms per kilogram of body weight per day, and more. Preferably within the range of 0.1 to 100 micrograms per kilogram of body weight per day, even more preferably within the range of 1.0 to 50 micrograms per kilogram of body weight per day, and most preferably per kilogram of body weight per day. It will be in the range of 1.0 to 25 micrograms. Pharmaceutical compositions containing dsRNA are administered once or several times daily at low doses, eg, using sustained release formulations known in the art. Preparation and administration of such pharmaceutical compositions can be carried out according to standard techniques, as further described below.

次いで、そのようなｄｓＲＮＡは、上記のように、治療有効量のそのようなｄｓＲＮＡを含有している医薬製剤を調製して、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質又は切断された活性ＡＬＫキナーゼを発現する癌を有するヒト対象に、この製剤を、例えば腫瘍への直接注射によって投与することにより、癌におけるＡＬＫの発現及び活性を阻害するために用いることができる。ｓｉＲＮＡ阻害剤を用いて、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲのような他の受容体チロシンキナーゼのそのような阻害について、最近記述されている。２００４年１０月２１日公開の米国特許出願公開第２００４０２０９８３２号、McSwiggen et al.; ２００３年９月１１日公開の米国特許出願公開第２００３０１７０８９１号、McSwiggen; ２００４年９月９日公開の米国特許出願公開第２００４０１７５７０３号、Kreutzer et al. を参照されたい。 Such dsRNAs are then prepared for therapeutically effective amounts of such dsRNAs as described above to prepare EML4-ALK or TFG-ALK fusion proteins or cleaved active ALK kinases. The formulation can be used to inhibit the expression and activity of ALK in cancer, for example by direct injection into the tumor, to human subjects with developing cancer. Such inhibition of other receptor tyrosine kinases such as VEGFR and EGFR has recently been described using siRNA inhibitors. U.S. Patent Application Publication No. 20040209832 published October 21, 2004, McSwiggen et al .; U.S. Patent Application Publication No. 20130178091 published September 11, 2003, McSwiggen; U.S. Patent Application published September 9, 2004 See Publication No. 20040175703, Kreutzer et al.

治療用組成物、投与
本発明方法の実施に有用なＡＬＫキナーゼを阻害する治療用組成物は、経口又は腹腔経路に限定されず、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内及び局所（口腔内、及び舌下を含む）投与を包含する、当該技術分野で公知の何れかの手段で哺乳類に投与することができる。 Therapeutic Compositions, Administration Therapeutic compositions that inhibit ALK kinase useful in the practice of the methods of the invention are not limited to the oral or peritoneal route, but are intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal. It can be administered to mammals by any means known in the art, including (aerosol), rectal, vaginal and topical (including intraoral and sublingual) administration.

経口投与のために、ＡＬＫを阻害する治療薬は一般に、粉末又は顆粒として、錠剤又はカプセル、又は水性溶液又は懸濁液の形態で提供されるであろう。経口用途の錠剤は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、着色剤、及び保存剤のような、薬学的に許容される賦形剤と混合した活性成分を含有してもよい。適切な不活性希釈剤は、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム、及びラクトースを包含し、一方コーンスターチ及びアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤はデンプン及びゼラチンを包含してもよく、滑沢剤は、加えるとすれば、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであろう。所望により、消化管で遅延吸収されるように、錠剤をモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのような物質でコーティングしてもよい。 For oral administration, therapeutic agents that inhibit ALK will generally be provided as powders or granules in the form of tablets or capsules, or aqueous solutions or suspensions. Tablets for oral use were mixed with pharmaceutically acceptable excipients such as Inactive diluents, disintegrants, binders, lubricants, sweeteners, flavoring agents, colorants, and preservatives. It may contain an active ingredient. Suitable Inactive Diluents include sodium and calcium carbonate, sodium and calcium phosphate, and lactose, while corn starch and alginic acid are suitable disintegrants. Binders may include starch and gelatin, and lubricants, if added, will generally be magnesium stearate, stearic acid or talc. If desired, the tablets may be coated with a substance such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate for delayed absorption in the gastrointestinal tract.

経口用のカプセルは、活性成分を固体の希釈剤と混合しているハードゼラチンカプセル、及び活性成分を水又は落花生油、流動パラフィン又はオリーブオイルのような油と混合しているソフトゼラチンカプセルを包含している。
筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内用途のために、本発明の医薬組成物は一般に、適切なｐＨ及び等張性に緩衝化した、無菌の水性溶液又は懸濁液で提供されるであろう。適切な水性賦形剤は、リンゲル溶液及び生理食塩水を包含する。担体のみで水性緩衝液を構成させることができる（「のみ」とは、ＡＬＫを阻害する治療薬の吸収に影響を及ぼすか又は介在するかもしれない、補助剤又は封入剤が存在していないことを意味する）。そのような物質は、例えば、下記するように、リポソーム又はカプシドのような、ミセル構造を包含する。水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及びトラガカントゴムのような懸濁化剤、及びレシチンのような湿潤剤を含有していてもよい。水性懸濁剤用の適切な保存剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル及びｎ−プロピルを包含する。 Oral capsules include hard gelatin capsules in which the active ingredient is mixed with a solid diluent, and soft gelatin capsules in which the active ingredient is mixed with water or an oil such as peanut oil, liquid paraffin or olive oil. are doing.
For intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous and intravenous applications, the pharmaceutical compositions of the present invention are generally provided in sterile aqueous solutions or suspensions buffered at appropriate pH and isotonicity. Let's go. Suitable aqueous excipients include Ringer's solution and saline. The carrier alone can constitute an aqueous buffer (“only” means the absence of an adjunct or encapsulant that may affect or intervene in the absorption of therapeutic agents that inhibit ALK. Means). Such substances include micellar structures, such as liposomes or capsids, as described below. The aqueous suspension may contain a cellulose derivative, a suspending agent such as sodium alginate, polyvinylpyrrolidone and tragacant rubber, and a wetting agent such as lecithin. Suitable preservatives for aqueous suspensions include ethyl p-hydroxybenzoate and n-propyl.

ＡＬＫキナーゼを阻害する治療用組成物は、移植片及びマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤のような、身体からの早い***から治療薬（例えばｄｓＲＮＡ化合物）を保護するカプセル化製剤も包含することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、及びポリ乳酸のような、生物分解性、生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような製剤の製造方法は当業者にとって明らかであろう。この物質も Alza Corporation 及び Nova Pharmaceuticals Inc, から市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス性抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的にするリポソームを含有している）も薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、当業者にとって公知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ第９１／０６３０９号公報、及びヨーロッパ特許公開ＥＰ−Ａ−４３０７５に記述されている方法に従って製造することができる。カプセル製剤は、ウィルス外被タンパク質を含有することができる。ウィルス外被タンパク質は、ポリオーマウィルスのような、ウィルスから得るか又はこれに付随していてもよく、又は部分的に又は完全に人工的であってよい。例えば、被覆タンパク質はポリオーマウィルスのウィルスタンパク質１及び／又はウィルスタンパク質２、若しくはそれらの誘導体であってよい。 Therapeutic compositions that inhibit ALK kinase also include encapsulating formulations that protect therapeutic agents (eg, dsRNA compounds) from premature excretion from the body, such as controlled release formulations, including implants and microencapsulated delivery systems. can do. Biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid can be used. Methods of making such formulations will be apparent to those skilled in the art. This material is also commercially available from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals Inc. Liposomal suspensions, which contain liposomes that target cells infected with monoclonal antibodies to viral antigens, can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These are manufactured according to methods known to those of skill in the art, such as those described in US Pat. No. 4,522,811, PCT International Publication WO 91/06309, and European Patent Publication EP-A-43075. be able to. Capsule formulations can contain viral coat proteins. The viral coat protein may be obtained from or associated with the virus, such as polyomavirus, or may be partially or completely artificial. For example, the coating protein may be viral protein 1 and / or viral protein 2 of polyomavirus, or derivatives thereof.

ＡＬＫを阻害する組成物は、対象に投与するための、リポソームを包含する送達賦形剤、担体、及び希釈剤及びその塩も含有することができ、そして／又は薬学的に許容される製剤中に存在させることができる。例えば、核酸分子を送達する方法は、Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS, ed. Akbtar, 1995; Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; 及び Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192 に記述されている。Beigelman et al. の米国特許第６，３９５，７１３号及び Sullivan et al. のＰＣＴ公開ＷＯ第９４／０２５９５号公報に核酸分子を送達する一般的な方法が更に記述されている。これらのプロトコルは事実上全ての核酸分子の送達に用いることができる。 Compositions that inhibit ALK can also contain delivery excipients, carriers, and diluents and salts thereof, including liposomes, for administration to the subject, and / or in pharmaceutically acceptable formulations. Can be present in. For example, methods for delivering nucleic acid molecules include Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS, ed. Akbtar, 1995; Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Described in Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; and Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192. ing. US Pat. No. 6,395,713 of Beigelman et al. And PCT Publication WO 94/02595 of Sullivan et al. Further describe general methods for delivering nucleic acid molecules. These protocols can be used to deliver virtually any nucleic acid molecule.

ＡＬＫを阻害する治療薬は、これらに限定されないが、リポソーム中にカプセル化、イオン導入による、若しくはヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル及び生体接着性小粒体のような他の賦形剤中に取り込むことによる、若しくはタンパク性ベクターによる、を含む、当業者にとって公知の多くの方法によって哺乳類の癌に対して投与することができる（O'Hare amd Normand のＰＣＴ国際公開ＷＯ第００／５３７２２号公報）。また、治療薬／賦形剤の混合物は、直接注射又は注入ポンプの使用によって、局所送達される。組成物の直接注射は、皮下、筋肉内、又は皮内であろうとも、標準的な針及び注射器の手法を用いて、又は Conry et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337 及び Barry et al. のＰＣＴ国際公開ＷＯ第９９／３１２６２号公報に記述されているように注射針を用いない技術によって行うことができる。 Therapeutic agents that inhibit ALK are, but are not limited to, encapsulated in liposomes, by iontophoresis, or in other excipients such as hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules and bioadhesive granules. It can be administered to mammalian cancer by many methods known to those of skill in the art, including by incorporation into or by a proteinaceous vector (O'Hare amd Normand PCT WO 00/53722). Gazette). Also, the therapeutic / excipient mixture is delivered topically by direct injection or the use of an infusion pump. Direct injection of the composition, whether subcutaneously, intramuscularly, or intradermally, using standard needle and syringe techniques, or Conry et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 2330- This can be done by needleless techniques as described in 2337 and Barry et al. PCT WO 99/31262.

ＡＬＫキナーゼを阻害する治療薬の薬学的に許容される製剤は、上記化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば塩酸、臭化水素酸、酢酸及びベンゼンスルホン酸の塩を包含する。薬理学的組成物又は製剤とは、細胞又は例えばヒトを含む患者へ、投与、例えば全身投与するのに適している形態の組成物又は製剤を示す。適切な形態は、用途又は投与経路、例えば経口、経皮又は注射による、に一部において依存している。そのような形態は、組成物又は製剤が標的細胞に到達するのを妨げてはならない。例えば、血流に注射される薬理学的組成物は可溶性でなければならない。他の要素は当該技術分野で公知であり、毒性、及び組成物又は製剤がその効果に影響を及ぼさせない形態のような考慮すべき事柄を含んでいる。 Pharmaceutically acceptable formulations of therapeutic agents that inhibit ALK kinase include salts of the above compounds, such as acid addition salts, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, acetic acid and benzenesulfonic acid salts. A pharmacological composition or formulation refers to a composition or formulation in a form suitable for administration, eg, systemic administration, to a patient, including cells or, for example, a human. Appropriate forms depend in part on the application or route of administration, eg, by oral, transdermal or injectable. Such morphology should not prevent the composition or formulation from reaching the target cells. For example, the pharmacological composition injected into the bloodstream must be soluble. Other factors are known in the art and include considerations such as toxicity and forms in which the composition or formulation does not affect its effectiveness.

全身吸収（すなわち、血流への薬剤の全身吸収又は蓄積、次いで全身への分布）をもたらす投与経路が好ましく、これらに限定されないが、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内を包含している。これらの投与経路のそれぞれが、ＡＬＫを阻害する治療薬を到達可能な病変組織又は腫瘍に触れさせる。薬剤の血液循環への流入速度は、分子量又はサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含有しているリポソーム又は他の薬剤担体の使用が、例えば、網状網内系（ＲＥＳ）の組織のような、ある特定の組織型に、薬剤を潜在的に局在化させることを可能にする。リンパ球及びマクロファージのような、細胞表面と薬剤との結合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。この手法は、癌細胞のような、異常細胞のマクロファージ及びリンパ球の免疫認識の特異性を駆使して、標的細胞への薬剤の増強された送達を可能にする。 Routes of administration that result in systemic absorption (ie, systemic absorption or accumulation of the drug into the bloodstream, and then systemic distribution) are preferred, but not limited to, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation, oral, intrapulmonary and. Intramuscular. Each of these routes of administration exposes a therapeutic agent that inhibits ALK to reachable lesion tissue or tumor. The rate of influx of the drug into the blood circulation has been shown to be a function of molecular weight or size. The use of liposomes or other drug carriers containing the compounds of the invention potentially localizes the drug to certain tissue types, such as, for example, the tissue of the reticuloendotheliate (RES). Make it possible. Liposomal formulations, such as lymphocytes and macrophages, that can promote the binding of cell surfaces to drugs are also useful. This technique takes advantage of the immune recognition specificity of macrophages and lymphocytes of abnormal cells, such as cancer cells, to enable enhanced delivery of the drug to target cells.

「薬学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子を、その望ましい活性に最も適している身体の部位へ効果的に分配できる組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子を含んでいる製剤に適している薬剤の限定されない例は、薬剤のＣＮＳへの流入を増強することができる、（Pluronic P85 のような）Ｐ−グリコプロテイン阻害剤（Jolliet-Riant and Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26)；大脳に移植した後の徐放送達用ポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）マイクロスフェア（Emerich et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58; Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.）のような、生物分解性ポリマー；薬剤を血液脳関門を通過して送達して、ニューロンへの取り込みメカニズムを変えることができる、ポリブチルシアノアクリレートでできているもののような、負荷ナノ粒子（Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999）を包含する。本発明の方法で有用なＡＬＫを阻害する化合物のための送達方策の限定されない他の例は、Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA, 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev. 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acid Res., 26, 4910-4916; 及び Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058 に記載されている物質を包含している。 "Pharmaceutically acceptable formulation" means a composition or formulation capable of effectively distributing the nucleic acid molecule of the invention to a body part most suitable for its desired activity. A non-limiting example of a drug suitable for a formulation containing the nucleic acid molecule of the invention is a P-glycoprotein inhibitor (such as Pluronic P85) (Jolliet-) that can enhance the influx of the drug into the CNS. Riant and Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); Poly (DL-lactide-coglycolide) microspheres for slow broadcasts after transplantation into the cerebrum (Emerich et al., 1999, Cell Transplant , 8, 47-58; biodegradable polymers such as Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); Poly, which can deliver drugs across the blood-cerebral barrier and alter the mechanism of uptake into neurons. Includes loaded nanoparticles (Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999), such as those made of butyl cyanoacrylate. Other examples of non-limiting delivery strategies for compounds that inhibit ALK useful in the methods of the invention are Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA, 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev. 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al. , 1998, Nucleic Acid Res., 26, 4910-4916; and Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058.

表面修飾リポソーム含有のポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾、又は長期血中滞留型リポソーム又はステルスリポソーム）を含有する治療用組成物も、本発明の方法で適切に使用することができる。これらの製剤は、標的組織に薬剤の蓄積を増大させる方法を提供する。この種の薬剤担体は、単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン化及び排出に抵抗するので、カプセル化した薬剤の長期血中循環及び組織への暴露の増強が可能になる（Lasic et al., Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem.Pharm. Bull. 1995, 43, 10005-1011）。そのようなリポソームは、恐らく管外遊出及び新血管形成された標的組織に捕捉されることによって、腫瘍に選択的に蓄積することが示されている（Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochem. Biophys. Acta, 1238, 86-90）。長期血中循環リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来の陽イオンリポソームと比べると、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬効を増強する（Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42,24864-24870; Choi et al., ＰＣＴ国際公開ＷＯ第９６／１０３９１号公報；Ansell et al.,ＰＣＴ国際公開ＷＯ第９６／１０３９０号公報；Holland et al., 国際特許出願公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。長期血中循環リポソームは、肝臓及び脾臓のような代謝的に活動的なＭＰＳ組織への蓄積を阻害する能力によって、陽イオンリポソームと比べて、より強くヌクレアーゼ分解から薬剤を保護するとも考えられる。 Therapeutic compositions containing poly (ethylene glycol) lipids containing surface-modified liposomes (PEG-modified or long-term blood-retaining liposomes or stealth liposomes) can also be appropriately used in the methods of the invention. These formulations provide a way to increase drug accumulation in the target tissue. This type of drug carrier resists opsonization and excretion by the mononuclear phagocyte lineage (MPS or RES), allowing enhanced long-term blood circulation and tissue exposure of the encapsulated drug (Lasic et. al., Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 10005-1011). Such liposomes have been shown to selectively accumulate in tumors, presumably by extraductal migration and capture in neoangiogenic target tissues (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275). -1276; Oku et al., 1995, Biochem. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Long-term circulating liposomes enhance the pharmacokinetics and efficacy of DNA and RNA, especially when compared to conventional cationic liposomes, which are known to accumulate in MPS tissues (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42,24864-24870; Choi et al., PCT International Publication WO 96/10391; Ansell et al., PCT International Publication WO 96/10390; Holland et al., International Patent Application Published WO 96/10392). Long-term circulating liposomes may also protect the drug from nuclease degradation more strongly than cationic liposomes due to their ability to inhibit accumulation in metabolically active MPS tissues such as the liver and spleen.

治療用組成物は、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に、望ましい化合物の薬学的に有効な量を含有することができる。治療に用いる許容される担体又は希釈剤は薬学分野で公知であって、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, Ed. 1985) に記載されている。例えば、保存剤、安定化剤、染料及び着香剤を提示することができる。これらは安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びＰ-ヒドロキシ安息香酸のエステル類を包含する。更に、抗酸化剤及び懸濁化剤を用いることができる。 Therapeutic compositions may contain a pharmaceutically effective amount of the desired compound in a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Acceptable carriers or diluents used for treatment are known in the pharmaceutical art and are described, for example, in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, Ed. 1985). For example, preservatives, stabilizers, dyes and flavoring agents can be presented. These include esters of sodium benzoate, sorbic acid and P-hydroxybenzoic acid. In addition, antioxidants and suspending agents can be used.

薬学的に有効な用量は、病状の発生を防止、阻止、又は病状を治療する（症状をある程度、好ましくは症状の全てを軽減する）のに必要な用量のことである。薬学的に有効な用量は、疾患のタイプ、用いられる組成物、投与経路、治療する哺乳類のタイプ、考慮中の特定哺乳類の身体的特徴、併用する薬剤、及び医療分野の当業者が認識できる他の因子によって決まる。一般に、負の電荷を帯びたポリマーの効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の活性成分を投与する。 A pharmaceutically effective dose is the dose required to prevent, prevent, or treat the condition (to some extent, preferably all of the symptoms). Pharmaceutically effective doses include the type of disease, composition used, route of administration, type of mammal to be treated, physical characteristics of the particular mammal under consideration, concomitant medications, and others recognized by those skilled in the art Depends on the factors of. Generally, the active ingredient is administered from 0.1 mg / kg to 100 mg / kg body weight / day, depending on the potency of the negatively charged polymer.

１日に体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ程度の用量レベルが上記の状態の治療に有用である（１日に患者当たり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単回用量形態を製造するために担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法によって変わる。用量単位形態は、一般に約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有している。何れかの特定患者に対する特定な用量レベルは、用いる特定化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康状態、性、食事、投与回数、投与経路、及び***速度、薬物の併用及び治療する特定疾患の重篤性を含む、多種の要因によって決まるということは理解されるだろう。 Dose levels of about 0.1 mg to about 140 mg / kg body weight per day are useful in treating the above conditions (about 0.5 mg to about 7 g per patient per day). The amount of active ingredient that can be mixed with the carrier material to produce a single dose form will vary depending on the subject being treated and the particular method of administration. The dose unit form generally contains from about 1 mg to about 500 mg of active ingredient. Specific dose levels for any particular patient are the activity, age, weight, overall health, sex, diet, frequency of administration, route of administration, and excretion rate of the specific compound used, the combination of drugs and the specific disease to be treated It will be understood that it depends on a number of factors, including the severity of the disease.

非ヒト動物に投与するために、組成物を動物の餌又は飲料水に添加することもできる。動物が処置に適した量の組成物を食事と一緒に摂取できるように、動物用の飼料又は飲料水組成物を便宜的に処方することができる。飼料又は飲料水に添加するように組成物を混合飼料としておくことも便利である。 The composition can also be added to animal food or drinking water for administration to non-human animals. Animal feed or drinking water compositions can be conveniently formulated so that the animal can ingest the appropriate amount of the composition with the meal. It is also convenient to keep the composition as a mixed feed for addition to feed or drinking water.

本発明の実施に有用なＡＬＫを阻害する治療薬は、上記のように単一化合物を、又は複数化合物の組合わせを、同じ種の阻害剤（すなわち、抗体阻害剤）又は異なった種の（すなわち、抗体阻害剤と小分子阻害剤）の何れかに含有していてもよい。化合物のそのような組合わせは、融合タンパク質を発現する癌の進行の阻害において全体的な治療効果を増強させることができる。例えば、治療用組成物は、ＷＨＩ−１３１及び／又はＷＨＩ−１５４のような小分子阻害剤、又はＡＬＫ活性を標的とする他の阻害剤及び／又は他の小分子阻害剤の組合わせであってよい。治療用組成物は、１つ以上の標的阻害剤に加えて、非特異的な化学療法剤を含有していてもよい。そのような組合わせは、多くの癌において相乗的な殺腫瘍効果をもたらすことが最近示された。インビボにおける、そのようなＡＬＫ活性及び腫瘍生育の阻害の組合わせの効果を、以下に記述するように評価することができる。 ALK-inhibiting therapeutic agents useful in the practice of the present invention are single compounds, or combinations of multiple compounds, as described above, of the same type of inhibitor (ie, antibody inhibitor) or of different types (ie, antibody inhibitors). That is, it may be contained in either an antibody inhibitor or a small molecule inhibitor). Such a combination of compounds can enhance the overall therapeutic effect in inhibiting the progression of cancer expressing the fusion protein. For example, a therapeutic composition may be a combination of small molecule inhibitors such as WHI-131 and / or WHI-154, or other inhibitors and / or other small molecule inhibitors that target ALK activity. You can. The therapeutic composition may contain a non-specific chemotherapeutic agent in addition to the one or more target inhibitors. Such a combination has recently been shown to have a synergistic tumorigenic effect in many cancers. The combined effect of such ALK activity and inhibition of tumor growth in vivo can be assessed as described below.

突然変異ＡＬＫキナーゼを阻害する化合物の同定
本発明は、ある側面において、化合物が癌におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合融合ポリペプチド又はＡＬＫキナーゼポリペプチドの活性を阻害するか否かを確認することによって、化合物がＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合融合ポリヌクレオチド及び／又は融合ポリペプチドによって特徴付けられる癌の進行を阻害できるか否かを確認する方法を提供する。いくつかの好ましい態様では、ＡＬＫの活性の阻害は、骨髄、血液、胸水、又は腫瘍由来の細胞を含有する生体試料を試験することによって確認される。その他の好ましい態様では、ＡＬＫの活性の阻害は、本発明の突然変異ＡＬＫポリヌクレオチド又はポリペプチドに特異的な試薬を用いて確認される。 Identification of Compounds that Inhibit Mutant ALK Kinases The present invention, in one aspect, confirms whether a compound inhibits the activity of an EML4-ALK or TFG-ALK fusion fusion polypeptide or ALK kinase polypeptide in cancer. Provides a method of ascertaining whether a compound can inhibit the progression of cancer characterized by EML4-ALK or TFG-ALK fusion fusion polynucleotides and / or fusion polypeptides. In some preferred embodiments, inhibition of ALK activity is confirmed by testing biological samples containing cells from bone marrow, blood, pleural effusion, or tumor. In another preferred embodiment, inhibition of ALK activity is confirmed using reagents specific for the mutant ALK polynucleotides or polypeptides of the invention.

試験化合物は、上記の治療薬又は組成物の何れかのタイプのものであってよい。インビトロ及びインビボの両方における、化合物の有効性を評価する方法は、十分に確立されていて、当該技術分野で公知である。例えば、組成物は、ＡＬＫが活性化されている細胞又は細胞抽出物を用いてインビトロでＡＬＫを阻害する能力についての試験を行うことができる。化合物群は、ＡＬＫに対する化合物の特異性を（ＥＧＦＲ又はＰＤＧＦＲのような、他の標的と対照的に）試験するために用いることができる。 The test compound may be of any type of therapeutic agent or composition described above. Methods for assessing the effectiveness of compounds, both in vitro and in vivo, are well established and known in the art. For example, the composition can be tested for its ability to inhibit ALK in vitro using cells or cell extracts in which ALK is activated. The group of compounds can be used to test the specificity of a compound for ALK (in contrast to other targets, such as EGFR or PDGFR).

使用可能な薬剤をスクリーニングするその他の技術は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ第８４／０３５６４号公報に記載されているような、目的のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する高速大量処理のスクリーニングを提供する。この方法では、突然変異ＡＬＫポリペプチドに適用するために、多数の異なった小分子試験化合物が、プラスチックピン又は幾つか他の表面のような、固体基質上で合成される。この試験化合物を、突然変異ＡＬＫポリペプチド、又はその断片と反応させて、洗浄する。次いで、結合した突然変異ポリペプチド（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド）を当該技術分野で公知の方法で検出する。精製した突然変異ＡＬＫポリペプチドを、上記の薬剤スクリーニング技術で用いるために、直接プレート上に塗布することもできる。また、中和していない抗体は、ペプチドを捕捉して、それを固体の支持体に固定するために用いることができる。 Other techniques for screening for available agents provide high-speed, high-dose screening with appropriate binding affinity for the protein of interest, as described in PCT WO 84/03564. To do. In this method, a number of different small molecule test compounds are synthesized on solid substrates, such as plastic pins or some other surface, for application to mutant ALK polypeptides. The test compound is washed by reacting it with a mutant ALK polypeptide or fragment thereof. The bound mutant polypeptide (eg, EML4-ALK fusion polypeptide) is then detected by methods known in the art. The purified mutant ALK polypeptide can also be applied directly onto the plate for use in the drug screening techniques described above. Unneutralized antibodies can also be used to capture the peptide and anchor it to a solid support.

インビトロでＡＬＫ活性の有効な阻害剤であることが見出された化合物は、続いて、例えばＮＳＣＬＣのような、ヒトの腫瘍を担持している哺乳動物の異種移植片を用いて、インビボで、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合ポリペプチド及び／又は切断されたＡＬＫキナーゼポリペプチドを発現する癌の進行を阻害するその能力についての試験を行うことができる。この方法では、患者に最も類似した生物学的環境で薬剤の効果を観察することができる。癌細胞又は周辺の間質細胞におけるシグナル伝達を変化させる薬剤の能力を、リン酸化に特異的な抗体を用いる分析で確認することができる。細胞死又は細胞増殖の阻害を誘発する薬剤の有効性も、切断されたカスパーゼ３及び切断されたＰＡＲＰのようなアポトーシスに特異的なマーカーで分析して観察することができる。同様に、突然変異ＡＬＫタンパク質で促進されるヒト白血病を担持している哺乳類の骨髄移植体（例えば、マウス）を使用することができる。この手順では、突然変異ＡＬＫキナーゼによって促進されることが知られている骨髄細胞をマウスに移植する。癌腫細胞の生育を観察してもよい。次いでマウスを薬剤で処置して、癌表現型又は進行に対する薬剤処置の効果を外部から観察することができる。次いでマウスをと殺して、移植した骨髄を取り出して、ＩＨＣ及びウェスタンブロットなどで分析する。 Compounds found to be effective inhibitors of ALK activity in vitro are subsequently used in vivo using xenografts of mammals carrying human tumors, such as NSCLC. EML4-ALK or TFG-ALK fusion polypeptides and / or cleaved ALK kinase polypeptides can be tested for their ability to inhibit the progression of cancer. This method allows the effect of the drug to be observed in a biological environment that most closely resembles the patient. The ability of agents to alter signal transduction in cancer cells or surrounding stromal cells can be confirmed by analysis with phosphorylation-specific antibodies. The effectiveness of agents that induce inhibition of cell death or cell proliferation can also be analyzed and observed with apoptosis-specific markers such as cleaved caspase 3 and cleaved PARP. Similarly, mammalian bone marrow transplants (eg, mice) carrying human leukemia promoted by the mutant ALK protein can be used. In this procedure, mice are transplanted with bone marrow cells that are known to be promoted by mutant ALK kinase. The growth of carcinoma cells may be observed. Mice can then be treated with drugs and the effect of drug treatment on cancer phenotype or progression can be observed externally. The mice are then killed and the transplanted bone marrow is removed and analyzed by IHC and Western blot.

そのような化合物の毒性及び治療効果、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％における治療有効用量）の判定は、細胞培養物又は実験動物で標準的な薬学的手順によって確認することができる。毒性と治療効果の用量比が治療インデックスであって、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療インデックスを示す化合物が好ましい。 Determining the toxicity and therapeutic effect of such compounds, such as LD50 (lethal dose to 50% of the population) and ED50 (effective therapeutic dose in 50% of the population), is a standard pharmaceutical procedure in cell cultures or laboratory animals. Can be confirmed by. The dose ratio of toxicity to therapeutic effect is the therapeutic index and can be expressed as the LD50 / ED50 ratio. Compounds that exhibit a high therapeutic index are preferred.

上記及び下記の引用された全ての引例の教示は、参照して本明細書に組み入れられる。以下の実施例は、本発明を更に説明するためにのみ提供されていて、本明細書に添付されている特許請求の範囲を除いて、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。本発明は本明細書で教示される方法の当業者にとって明瞭であろう修飾及び改変を包含している。 The teachings of all the references cited above and below are incorporated herein by reference. The following examples are provided solely to further illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention, except as claimed herein. .. The present invention includes modifications and modifications that will be apparent to those skilled in the art of the methods taught herein.

包括的なホスホペプチドのプロファイリングによる固形腫瘍におけるＡＬＫキナーゼ活性の検証
Ａ．ヒトＮＳＣＬＣ細胞株のプロファイリング
Ｈ２２２８を含む、２２のヒトＮＳＣＬＣ細胞株におけるキナーゼ活性の包括的なリン酸化プロファイルは、複合混合物由来の改変ペプチドの単離及び質量分析によって特徴付けるために、最近記述された有力な技術（「ＩＡＰ」技術、Rush et al., supra を参照されたい）を用いて、試験を行った。ホスホチロシンに特異的な抗体（CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411) を用いてＩＡＰ技術を実施し、ＮＳＣＬＣ細胞株の抽出物由来のホスホチロシンを含有するペプチドを単離し、次いで特徴付けを行った。 Verification of ALK Kinase Activity in Solid Tumors by Comprehensive Phosphopeptide Profiling A. Profiling Human NSCLC Cell Lines Comprehensive phosphorylation profiles of kinase activity in 22 human NSCLC cell lines, including H2228, have recently been described influential to characterize by isolation and mass spectrometry of modified peptides from complex mixtures. Tests were performed using different techniques (see "IAP" technique, Rush et al., Supra). IAP technology was performed using a phosphotyrosine-specific antibody (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. # 9411) to obtain a peptide containing phosphotyrosine derived from an extract of an NSCLC cell line. Separated and then characterized.

具体的には、ＩＡＰ手法は、それぞれのＮＳＣＬＣ細胞株において、タンパク質のリン酸化に関与するチロシンキナーゼの同定を促進するために用いた。特に、特殊な若しくは異常なキナーゼ活性を考慮した。 Specifically, the IAP approach was used to facilitate the identification of tyrosine kinases involved in protein phosphorylation in each NSCLC cell line. In particular, special or abnormal kinase activity was considered.

細胞培養
全ての細胞培養試薬は Invitrogen, Inc. から入手した。全部で４１のヒトＮＳＣＬＣ細胞株を試験した。ヒトＮＳＣＬＣ細胞株、Ｈ５２０、Ｈ８３８、Ｈ１４３７、Ｈ１５６３、Ｈ１５６８、Ｈ１７９２、Ｈ１９４４、Ｈ２１７０、Ｈ２１７２、Ｈ２２２８、Ｈ２３４７、Ａ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１７０３、Ｈ１３７３、及びＨ３５８を、American Type Culture Collection から得て、２ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するように調節した、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。さらに６つのヒトＮＳＣＬＣ細胞株、ＨＣＣ７８、Ｃａｌ-１２Ｔ、ＨＣＣ３６６、ＨＣＣ４４及びＬＯＵ−ＮＨ９１、をＤＳＭＺから入手して、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を３７℃で５％のＣＯ_２インキュベータ中に保持した。 Cell Culture All cell culture reagents were obtained from Invitrogen, Inc. A total of 41 human NSCLC cell lines were tested. 2 mM L -In RPMI1640 medium containing 10% FBS adjusted to contain glutamine, 1.5 g / L sodium bicarbonate, 4.5 g / L glucose, 10 mM HEPES, 10 mM sodium pyruvate, penicillin / streptomycin. Was cultured in. Six additional human NSCLC cell lines, HCC78, Cal-12T, HCC366, HCC44 and LOU-NH91, were obtained from DSMZ and cultured in RPMI1640 containing 10% FBS and penicillin / streptomycin. Cells were kept in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C.

免疫親和性沈降及びイムノブロット試験のために、細胞を８０％のコンフルエンスまで生育させて、次いで採取の前に一晩ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ培地中で飢餓させた。 For immunoaffinity precipitation and immunoblotting tests, cells were grown to 80% confluence and then starved overnight in RPMI medium without FBS prior to harvesting.

ホスホペプチドによる免疫沈降
１００万個の細胞を尿素溶菌緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）、９Ｍの尿素、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロリン酸エステル）中に溶解した。溶解物を超音波処理して、遠心分離で透明にした。透明にした溶解物をＤＴＴで還元して、先に記述されているように、ヨードアセトアミドでアルキル化した（Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1):94-101 (2005) を参照されたい）。次いで試料を２０ｍＭのＨｅｐｅｓで４倍に希釈して尿素の濃度を２Ｍに下げて、室温で静かに撹拌しながら１晩トリプシンで消化させた。 Immunoprecipitation with phosphopeptides 1 million cells in urea lysis buffer (20 mM Hepes (pH 8.0), 9 M urea, 1 mM sodium vanadium, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate) ) Dissolved in. The lysate was sonicated and centrifuged to make it transparent. The clarified lysate was reduced with DTT and alkylated with iodoacetamide as described above (see Rush et al., Nat. Biotechnol. 23 (1): 94-101 (2005)). I want to be). The sample was then diluted 4-fold with 20 mM Hepes to reduce the urea concentration to 2M and digested with trypsin overnight with gentle stirring at room temperature.

消化したペプチドを、先に記述されているように、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カラムで粗精製した（Rush et al., supra を参照されたい）。溶出液を凍結乾燥させて、乾燥したペプチドを１．４ｍｌのＭＯＰＳＩＰ緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、１０ｍＭのＮａ_２ＰＯ_４、５０ｍＭのＮａＣｌ）に溶解して、不溶性物質を遠心分離で除去した。プロテインＧアガロースビーズ（Roch) に結合したホスホチロシン１００抗体（Cell Signaling Technology) １６０μｇを用いて４℃で１晩免疫沈降を行った。冷所で、ビーズを１ｍｌのＭＯＰＳＩＰ緩衝液で３回、１ｍｌのＨＰＬＣｇｒａｄｅｄＨ２０で２回洗浄した。６０μｌの０．１％ＴＦＡでホスホペプチドをビーズから溶出した後、４０μｌの０．１％ＴＦＡで２回目の溶出を行ってこの画分を集めた。溶出したペプチドをＺｉｐＴｉｐカラム（Millipore）を用いて濃縮して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。マススペクトルをＬＴＱイオントラップ質量分析器（ThermoFinnigan）で集めた。 Digested peptides were crudely purified on a Sep-Pak C18 column as described above (see Rush et al., Supra). The eluate was lyophilized and the dried peptide was dissolved in 1.4 ml MOPS IP buffer (50 mM MOPS / NaOH, pH 7.2, 10 mM Na ₂ PO ₄ , 50 mM NaCl) to remove the insoluble material. It was removed by centrifugation. Immunoprecipitation was performed overnight at 4 ° C. using 160 μg of phosphotyrosine 100 antibody (Cell Signaling Technology) bound to protein G agarose beads (Roch). In a cool place, the beads were washed 3 times with 1 ml of MOPS IP buffer and 2 times with 1 ml of HPLC grade dH20. The phosphopeptide was eluted from the beads with 60 μl of 0.1% TFA followed by a second elution with 40 μl of 0.1% TFA to collect this fraction. The eluted peptides were concentrated using a ZipTip column (Millipore) and analyzed by LC-MS / MS. Mass spectra were collected on an LTQ ion trap mass spectrometer (ThermoFinnigan).

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析器による分析
ＩＰ溶出液（１００μｌ）中のペプチドを濃縮して、Stop and Go 抽出チップ（Stage Tips）（Rappsilber et al., Anal. Chem., 75(3):663-70 (2003) を参照されたい）を用いて溶出した抗体から分離した。ペプチドを、７．６μｌの０．４％酢酸／０．００５％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）中の１μｌの６０％ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡでマイクロカラムから溶出した。 Analysis by LC-MS / MS Mass Spectrometer Concentrate peptides in IP eluate (100 μl) to Stop and Go Extraction Chips (Stage Tips) (Rappsilber et al., Anal. Chem., 75 (3): 663): 663 -70 (2003)) was used to separate from the eluted antibody. Peptides were eluted from the microcolumn with 1 μl 60% MeCN, 0.1% TFA in 7.6 μl 0.4% acetic acid / 0.005% heptafluorobutyric acid (HFBA).

それぞれのホスホペプチド試料は、２回、ＬＣ−ＭＳで分析した。融合シリカマイクロキャピラルカラム（１２５μｍ×１８ｃｍ）にＣ１８逆相樹脂（Magic C18AQ、５μｍの粒子、細孔経２００Å、Michrom Bioresources, Auburn, CA）を充填した。試料（４μＬ）は、自動サンプラー（LC Packings Famos, San Francisico, CA) を用いてこのカラムに搭載させて、０．１％のギ酸中の７〜３０％のアセトニトリルの５５-分の直線濃度勾配法により質量分析器中に溶出させた。この勾配法を、インラインフロースプリッターを備えた二元ＨＰＬＣポンプ（Agilent 1100, Palo Alto, CA）を用いて、おおよそａｂｃｎｌ／ｍｉｎで実施した。溶出するペプチドのイオンをハイブリッド線形イオントラップ−７テスラ・イオン・サイクロトロン反応・フーリエ変換装置（Tesla ion cyclotron responce Fourier transform instrument (LTQ-FT, Thermo Finnigan, San Jose, CA)）で質量分析した。 Each phosphopeptide sample was analyzed twice by LC-MS. A fused silica microcapital column (125 μm × 18 cm) was packed with C18 reverse phase resin (Magic C18AQ, 5 μm particles, pore diameter 200 Å, Microchrom Bioresources, Auburn, CA). Samples (4 μL) were mounted on this column using an automatic sampler (LC Packings Famos, San Francisico, CA) with a 55-minute linear concentration gradient of 7-30% acetonitrile in 0.1% formic acid. It was eluted in a mass spectrometer by the method. This gradient method was performed at approximately abc nn / min using a dual HPLC pump (Agilent 1100, Palo Alto, CA) equipped with an in-line flow splitter. The ions of the eluted peptide were mass spectrometrically analyzed with a hybrid linear ion trap-7 Tesla ion cyclotron responce Fourier transform instrument (LTQ-FT, Thermo Finnigan, San Jose, CA).

線形イオントラップ及びフーリエ変換装置の操作と同時に行って、ＩＣＲ細胞で先に行ったＭＳサーベイスキャンの間になされた測定に基づいて、線状イオントラップでの７つのデータによるＭＳ／ＭＳスキャンを収集する、トップセブン法（top-seven method）を用いた。ＭＳスキャンは、８×１０６の自動利得制御（automatic gain control(AGC)）標的、及び１０５の質量分解能で、３７５〜１８００ｍ／ｚで行った。ＭＳ／ＭＳに対するＡＧＣは８×１０６、動体排出速度は２５ｓ、そしてわずかに帯電したイオンを荷電状態スクリーニングで排除した。 Simultaneously with the operation of the linear ion trap and Fourier transform device, collect MS / MS scans with 7 data in the linear ion trap based on the measurements made during the MS survey scan previously performed on the ICR cells. The top-seven method was used. MS scans were performed at 375-1800 m / z with an 8 × 106 automatic gain control (AGC) target and a mass resolution of 105. AGC for MS / MS was 8 × 106, moving body ejection rate was 25 s, and slightly charged ions were eliminated by charge state screening.

データーベース分析及び割り当て
ペプチド配列を、TurboSequest ソフトウェア（ｖ．２７、ｒｅｖ．１２）（ThermoFinnigan）及び複合順方向／逆方向ＩＰＩヒトタンパク質データベースを用いて、ＭＳ／ＭＳスペクトルにアサインした。探索パラメーターは：プロテアーゼとしてトリプシン；１．０８Ｄａの前躯体の質量トレーランス；システイン上で静的修正（＋５７．０２１４６、カルボキサミドメチル化）；及びセリン、スレオニン及びチロシン（＋７９．９６６３３Ｄａ、リン酸化）、リジン（＋８．０１４２０、^１３Ｃ６^１５Ｎ２）、アルギニン（＋６．０２０１３、^１３Ｃ６）及びメチオニン（＋１５．９９４９１、酸化）上で動的修正。ターゲット／デコイデータベース手法を、概算の偽陽性割り当て比が＜１％となる、適切なスコア選別基準を確立するために用いた。割り当てには、電荷依存性のＸＣｏｒｒ閾値（ｚ＝１、ＸＣｏｒｒ≧１．５、ｚ＝２に対して、ＸＣｏｒｒ≧２．２、ｚ＝３に対して、ＸＣｏｒｒ≧３．３）を上回ることに加えて、ホスホチロシンを含有すること、−５〜＋２５ｐｐｍの質量精度を有すること、及び全て軽（all-light）又は全て重（all-heavy）の形態の何れかのリジン／アルギニン残基を含有することを必要とした。 Database analysis and assigned peptide sequences were assigned to MS / MS spectra using TurboSequest software (v.27, rev.12) (ThermoFinnigan) and a composite forward / reverse IPI human protein database. The search parameters are: trypsin as a protease; mass tolerance of the precursor of 1.08 Da; static modification on cysteine (+57.02146, carboxamide methylation); and serine, threonine and tyrosine (+79.96633 Da, phosphorylation), Dynamic modification on lysine (+8.01420, ¹³ C6 ¹⁵ N2), arginine (+6.02013, ¹³ C6) and methionine (+15.94941, oxidation). The target / decoy database method was used to establish appropriate score selection criteria with an approximate false positive allocation ratio of <1%. The allocation is to exceed the charge-dependent XCorr threshold (z = 1, XCorr ≥ 1.5, z = 2, XCorr ≥ 2.2, z = 3, XCorr ≥ 3.3). In addition, it contains phosphotyrosine, has a mass accuracy of -5 to +25 ppm, and contains lysine / arginine residues in either all-light or all-heavy form. Needed to do.

これらの基準をパスした割り当てを、ピーク面積そして最終的にそれぞれのペプチドの重形態及び軽形態の相対存在量を計算するために、カスタム定量化プログラム、Ｖｉｓｔａ（Bakalarsky et al., manuscript in preparatin）を用いて更に評価した。ＭＳスキャンにおいて信号対ノイズが１５未満の同定したペプチドは、定量化について考慮しなかった。１つの状態にのみ見出されたこれらのペプチドについては、信号対ノイズ比を代わりに用いた。 A custom quantification program, Vista (Bakalarsky et al., Manuscript in preparatin), to calculate the peak area and finally the relative abundance of heavy and light forms of each peptide for assignments that pass these criteria Was further evaluated using. Peptides identified with a signal vs. noise of less than 15 on MS scans were not considered for quantification. For these peptides found in only one state, the signal-to-noise ratio was used instead.

動的修飾として酸化メチオニン（Ｍ＋１６）及びリン酸化（Ｙ＋８０）が可能な２７，１７５のタンパク質を含有している、２００４年８月２４日に公開されたＮＣＢＩヒトデータベースに対して検索を行った。割り当てられた配列（本明細書では示していない）の最終リストを支持する全てのスペクトルを、信頼性を確立するために、少なくとも３人の科学者によって再検討した。 A search was performed on the NCBI human database published on August 24, 2004, which contained 27,175 proteins capable of methionine oxide (M + 16) and phosphorylation (Y + 80) as dynamic modifications. All spectra supporting the final list of assigned sequences (not shown herein) were reviewed by at least three scientists to establish reliability.

上記のＩＡＰ分析で、試験した細胞株から、その大部分が新規な、２０００を超える重複しないホスホチロシンを含有するペプチド、１，５００を超えるホスホチロシン部位、及び１，０００より多いチロシンリン酸化タンパク質を同定した（データは示されていない）。ＮＳＣＬＣのシグナル伝達に関わっていることが知られている受容体チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＥｐｈＡ２及びＭｅｔのような、多くの細胞株中で、リン酸化されたチロシンとして観察された。増幅されたレベルのＥＧＦＲの遺伝的に活性化された形態を発現することが知られいる２つの細胞株、ＨＣＣ８２７及びＨ３２５５を含む、幾つかの細胞株中に高いレベルのＥＧＦＲホスホペプチドが観察されて、この方法が、ＮＳＣＬＣ細胞株中で活性化されることが知られている受容体チロシンキナーゼを同定することが確認された。 The above IAP analysis identified over 2000 novel, non-overlapping phosphotyrosine-containing peptides, over 1,500 phosphotyrosine sites, and over 1,000 tyrosine phosphorylated proteins from the cell lines tested. (Data not shown). Receptor tyrosine kinases known to be involved in NSCLC signaling have been observed as phosphorylated tyrosine in many cell lines, such as EGFR, Her2, Her3, EphA2 and Met. High levels of EGFR phosphopeptides have been observed in several cell lines, including two cell lines known to express the genetically activated form of amplified levels of EGFR, HCC827 and H3255. It was confirmed that this method identifies the receptor tyrosine kinase that is known to be activated in NSCLC cell lines.

３つの細胞株が、他のＮＳＣＬＣ細胞株では観察されなかった受容体チロシンキナーゼを発現した。Ｒｏｓ、ＡＬＫ、及びＰＤＧＦＲα由来の大量のチロシンリン酸化ペプチドが、それぞれ、ＨＣＣ７８、Ｈ２２２８、及びＨ１７０３細胞株中に観察された。ＡＬＫを高度に発現する、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２２８を、更なる実験のために選択した。 Three cell lines expressed receptor tyrosine kinases not observed in other NSCLC cell lines. Large amounts of tyrosine phosphorylated peptides from Ros, ALK, and PDGFRα were observed in the HCC78, H2228, and H1703 cell lines, respectively. The NSCLC cell line H2228, which highly expresses ALK, was selected for further experimentation.

Ｂ．ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料のプロファイリング
上記のＡ欄に詳細に記述したように、ＩＡＰ技術を引き続いてＮＳＣＬＣ患者由来の１５４のヒト腫瘍試料群の総括的リン-プロファイルを試験するために適用した。組織を、Second Xiangya Hospital,China から得た。 B. Profiling Human NSCLC Tumor Samples As described in detail in column A above, IAP technology was subsequently applied to test the overall phosphorus profile of 154 human tumor sample groups from NSCLC patients. The organization was obtained from Second Xiangya Hospital, China.

凍結した組織試料を小片に切断し、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、９Ｍの尿素、１ｍＮのバナジウム酸ナトリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウムで補完、１ｍＭのβ−グリセリンリン酸、凍結組織１００ｍｇ当たり溶解緩衝液１ｍｌ）中でポリトロンを用いて各回２０秒で２回ホモジナイズした。次いで、ホモジネートを短時間超音波処理した。透明化した溶解物をＤＴＴで還元して、既述のようにしてヨードアセトアミドでアルキル化した（Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1):94-101 (2005) を参照されたい）。次いで試料を２０ｍＭのＨｅｐｅｓで４回希釈して尿素濃度を２Ｍに下げて、静かに撹拌しながら室温で１晩、トリプシンで消化させた。 Frozen tissue samples are cut into small pieces and supplemented with lysis buffer (20 mM HEPES (pH 8.0), 9 M urea, 1 mN sodium vanadium, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerin phosphate , 1 ml of lysis buffer per 100 mg of frozen tissue), homogenized twice with Polytron for 20 seconds each time. The homogenate was then sonicated for a short time. The clarified lysate was reduced with DTT and alkylated with iodoacetamide as described above (see Rush et al., Nat. Biotechnol. 23 (1): 94-101 (2005)). .. The sample was then diluted 4 times with 20 mM Hepes to reduce the urea concentration to 2M and digested with trypsin overnight at room temperature with gentle stirring.

消化したペプチドを既述のようにしてＳｅｐ−ＰａｋＣ１８カラムで粗精製した（Rush et al., supra. を参照されたい）。溶出液を凍結乾燥させて、乾燥したペプチドを１．４ｍｌのＭＯＰＳＩＰ緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、１０ｍＭのＮａ_２ＰＯ_４、５０ｍＭのＮａＣｌ）に溶解して、不溶性物質を遠心分離で除去した。プロテインＧアガロースビーズ（Roch) に結合したホスホチロシン１００抗体（Cell Signaling Technology) １６０μｇを用いて４℃で１晩免疫沈降を行った。冷所で、ビーズを１ｍｌのＭＯＰＳＩＰ緩衝液で３回、１ｍｌのＨＰＬＣｇｒａｄｅｄＨ２０で２回洗浄した。６０μｌの０．１％ＴＦＡでホスホペプチドをビーズから溶出した後、４０μｌの０．１％ＴＦＡで２回目の溶出を行ってこの画分を集めた。溶出したペプチドをＺｉｐＴｉｐカラム（Millipore)を用いて濃縮して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。マススペクトルをＬＴＱイオントラップ質量分析器（ThermoFinnigan）で集めた。 The digested peptide was crudely purified on a Sep-Pak C18 column as described above (see Rush et al., Supra.). The eluate was lyophilized and the dried peptide was dissolved in 1.4 ml MOPS IP buffer (50 mM MOPS / NaOH, pH 7.2, 10 mM Na ₂ PO ₄ , 50 mM NaCl) to remove the insoluble material. It was removed by centrifugation. Immunoprecipitation was performed overnight at 4 ° C. using 160 μg of phosphotyrosine 100 antibody (Cell Signaling Technology) bound to protein G agarose beads (Roch). In a cool place, the beads were washed 3 times with 1 ml of MOPS IP buffer and 2 times with 1 ml of HPLC grade dH20. The phosphopeptide was eluted from the beads with 60 μl of 0.1% TFA followed by a second elution with 40 μl of 0.1% TFA to collect this fraction. The eluted peptides were concentrated using a ZipTip column (Millipore) and analyzed by LC-MS / MS. Mass spectra were collected on an LTQ ion trap mass spectrometer (ThermoFinnigan).

ホスホペプチドの免疫沈降、続いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分光分析を上のＡ欄に記述のようにして実施した。データベース検索及び配列割り当ては、上のＡ欄に詳述したように実施したが、２７，９７０のタンパク質を含有する２００４年８月２４日に公開されたＮＣＢＩヒトデータベースを用いた。 Immunoprecipitation of the phosphopeptide was followed by LC-MS / MS spectroscopy as described in column A above. Database searches and sequence assignments were performed as detailed in column A above, using the NCBI human database published on August 24, 2004, containing 27,970 proteins.

前記のＩＡＰ分析で、試験したヒト腫瘍試料由来の２０００を超える重複しないホスホチロシンを含有するペプチド、１，５００を超えるホスホチロシン部位、及び１，０００より多いチロシンリン酸化タンパク質が同定された（データは示されていない）。ＮＳＣＬＣシグナル伝達に関わっていることが知られている受容体チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＥｐｈＡ２及びＭｅｔのような、多くの腫瘍中でリン酸化されたチロシンとして再度観察された。幾つかの腫瘍試料中で高いレベルのＥＧＦＲリン酸ポリペプチドが再度観察されて、この方法がＮＳＣＬＣ細胞株中で活性であることが知られている受容体チロシンキナーゼを同定することが確認された。 The IAP analysis identified more than 2000 non-overlapping phosphotyrosine-containing peptides from the human tumor samples tested, more than 1,500 phosphotyrosine sites, and more than 1,000 tyrosine phosphorylated proteins (data shown). It has not been). Receptor tyrosine kinases known to be involved in NSCLC signaling have been re-observed as phosphorylated tyrosine in many tumors, such as EGFR, Her2, Her3, EphA2 and Met. High levels of EGFR phosphate polypeptide were re-observed in some tumor samples, confirming that this method identifies receptor tyrosine kinases known to be active in NSCLC cell lines. ..

５つの患者試料が、他のＮＳＣＬＣ細胞株及び腫瘍中では観察されない受容体チロシンキナーゼを発現した。大量のＡＬＫ由来チロシン−リン酸化ペプチドが、患者ＣＳ０１０／１１、ＣＳ０４５、及びＣＳ１１０中で観察された。ＡＬＫを高度に発現する、これらの３つの腫瘍を更なる実験のために選択した。 Five patient samples expressed receptor tyrosine kinases not observed in other NSCLC cell lines and tumors. Large amounts of ALK-derived tyrosine-phosphorylated peptides were observed in patients CS010 / 11, CS045, and CS110. These three tumors, which highly express ALK, were selected for further experimentation.

３つのＡＬＫ融合遺伝子の単離及び配列決定
Ａ．ヒトＮＳＣＬＣ細胞株中の配列決定
ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２２８中でＡＬＫキナーゼの高いリン酸化レベルが検出されたことを考慮して、キメラＡＬＫ転写物が存在するか否かを判定するために、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする配列のｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅を行った。 Isolation and Sequencing of Three ALK Fusion Genes
A. Sequencing in human NSCLC cell line ALK kinase to determine the presence of chimeric ALK transcripts, given the detection of high phosphorylation levels of ALK kinase in NSCLC cell line H2228. 5'Rapid amplification of the cDNA ends of the domain-encoding sequence was performed.

相補的ＤＮＡ末端の迅速増幅
RNeasy Mini Kit（Quiagen）を、Ｈ２２２８細胞株からＲＮＡを抽出するために用いた。ＤＮＡは DNeasy Tissue Kit（Quiagen）を用いて抽出した。ｃＤＮＡ末端の迅速増幅は、５’ＲＡＣＥシステム（Invitrogen）を、ｃＤＮＡ合成用のプライマーＡＬＫ−ＧＳＰ１及びネスト化ＰＣＲ反応用のＡＬＫ−ＧＳＰ２及びＡＬＫ−ＧＳＰ３で用いて実施した。 Rapid amplification of complementary DNA ends
The RNeasy Mini Kit (Quiagen) was used to extract RNA from the H2228 cell line. DNA was extracted using the DNeasy Tissue Kit (Quiagen). Rapid amplification of the cDNA ends was performed using the 5'RACE system (Invitrogen) with primers ALK-GSP1 for cDNA synthesis and ALK-GSP2 and ALK-GSP3 for nested PCR reactions.

５’ＲＡＣＥ
図５Ａは５’ＲＡＣＥによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子（短い変異体）の検出及び第２ラウンド後のＰＣＲ増幅産物の検出を示している。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Qiagen）で精製して、ＡＬＫ−ＧＳＰ３及びＡＢＩ３１３０キャピラリー自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems）を用いて配列決定を行った。得られた産物の配列分析は、ＡＬＫのキナーゼドメイン及びＣ末端がＥＭＬ−４遺伝子のＮ末端に融合したことを明らかにした（図１Ａ-Ｃ、下の図を参照されたい）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子（短い変異体）はフレーム単位であり、そしてＥＭＬ−４の最初の２３３のアミノ酸をＡＬＫの終わりの５６２のアミノ酸と融合した（図１Ａ-Ｃ、下の図を参照されたい）。ＥＭＬ−４及びＡＬＫ遺伝子の両方は染色体２に位置しているので、融合遺伝子はこの２つの遺伝子座の間の遺伝子欠失によって創出された。 5'RACE
FIG. 5A shows the detection of the EML4-ALK fusion gene (short mutant) by 5'RACE and the detection of the PCR amplification product after the second round. PCR products were purified with a PCR purification kit (Qiagen) and sequenced using ALK-GSP3 and ABI3130 capillary automated DNA sequencers (Applied Biosystems). Sequence analysis of the resulting product revealed that the kinase domain of ALK and the C-terminus were fused to the N-terminus of the EML-4 gene (Fig. 1AC, see figure below). The EML4-ALK fusion gene (short variant) is frame-by-frame and fused the first 233 amino acids of EML-4 with the last 562 amino acids of ALK (Fig. 1AC, see figure below). ). Since both the EML-4 and ALK genes are located on chromosome 2, the fusion gene was created by a gene deletion between the two loci.

次のプライマーを用いた：
ＡＬＫ−ＧＳＰ１：５’−ＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣ（配列番号９）
ＡＬＫ−ＧＳＰ２：５’−ＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴ（配列番号１０）
ＡＬＫ−ＧＳＰ３：５’−ＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣ（配列番号１１）。 The following primers were used:
ALK-GSP1: 5'-GCAGTAGTTGGGGGTTGTAGTC (SEQ ID NO: 9)
ALK-GSP2: 5'-GCGGAGCTTGCTCAGCTTGT (SEQ ID NO: 10)
ALK-GSP3: 5'-TGCAGCTCTCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 11).

ＰＣＲアッセイ
ＥＭＬ−４のＮ末端が融合タンパク質中に無傷で存在しているかを確認するためにＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（図６を参照されたい）。ｃＤＮＡの第１鎖を、SuperScript（登録商標）III 第１鎖合成システム（Invitrogen）をオリゴ（ｄＴ）_２０で用いて２．５ｍｇの全ＲＮＡから合成した。次いで、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子をＥＭＬ−ＡｔｇとＡＬＫ−ＧＳＰ３のプライマー対を用いて増幅した。ＥＭＬ−４−４３とＡＬＫ−ＧＳＰ３、及びＥＭＬ−４−９４とＡＬＫ−ＧＳＰ３、及びＥＭＬ−４−２０２とＡＬＫ−ＧＳＰ３のプライマー対を用いて相互融合を検出した。ゲノムＰＣＲについて、Platinum Taq ＤＮＡポリメラーゼハイファイ（Invitrogen）を用いて、ＥＭＬ−４ａｔｇとＡＬＫ−ｔｇａのプライマー対で融合遺伝子の増幅を実施した。 PCR Assay RT-PCR analysis was performed to confirm that the N-terminus of EML-4 was intact in the fusion protein (see Figure 6). The first strand of cDNA was synthesized from 2.5 mg of total RNA using the SuperScript® III First Strand Synthesis System (Invitrogen) at Oligo (dT) ₂₀ . The EML4-ALK fusion gene was then amplified using a primer pair of EML-Atg and ALK-GSP3. Mutual fusion was detected using primer pairs of EML-4-43 and ALK-GSP3, EML-4-94 and ALK-GSP3, and EML-4-202 and ALK-GSP3. For genomic PCR, fusion gene amplification was performed with a primer pair of EML-4atg and ALK-tga using Platinum Taq DNA polymerase Invitrogen.

次のプライマーを用いた：
ＡＬＫ−ＧＳＰ３：５’−ＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣ（配列番号１２）
ＥＭＬ４−Ａｔｇ：５’−ＣＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧＧＴＴＴＧＧＣ（配列番号１３）
ＥＭＬ４−４３：５’−ＴＧＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号１４）
ＥＭＬ４−９４：５’−ＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＧＧＣ（配列番号１５）
ＥＭＬ４−２０２：５’−ＡＡＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号１６）
ＡＬＫ−Ｔｇａ：５’−ＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧ（配列番号１７）。 The following primers were used:
ALK-GSP3: 5'-TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 12)
EML4-Atg: 5'-CGCAAGATGGACGGGTTTGGC (SEQ ID NO: 13)
EML4-43: 5'-TGTTCAAGATCGCCCTGTCAGCCTCT (SEQ ID NO: 14)
EML4-94: 5'-TGAAATCACTGTGCTAAAGGCGGC (SEQ ID NO: 15)
EML4-202: 5'-AAGCCCTCGAGCAGTATTCCCAT (SEQ ID NO: 16)
ALK-Tga: 5'-GAATTCCGCCGAGCTCAGGCCCAG (SEQ ID NO: 17).

注目すべきことは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体（短い変異体）において、ＡＬＣＬで起こるＮＰＭ−ＡＬＫ融合体のような、他のＡＬＫ融合体で観察されているＡＬＫの全く同じ位置でＡＬＫ部分がＥＭＬ−４部分と融合するということである。Ｈ２２２８細胞株中のＡＬＫのキナーゼドメインは更にゲノムＤＮＡから配列決定を行い、野生型であることを見いだした。従って、Ｈ２２２８中に見出した欠失変異は、ＡＬＫキナーゼドメインに影響を及ぼさないものである。更に、野生型のＥＭＬ−４は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い変異体）に存在していない部位でのみチロシンがリン酸化されていて、融合タンパク質中で保存されているＮ末端コイルドコイルドメイン（図１Ａを参照されたい）がＡＬＫを二量化及び活性化する機能を、更には野生型ＡＬＫとの相互作用を促進する機能を果たす可能性があることを示唆している。 Notably, in the EML4-ALK fusion (short variant), the ALK moiety is EML at exactly the same position as the ALK observed in other ALK fusions, such as the NPM-ALK fusion that occurs in ALCL. -4 It is to fuse with the part. The kinase domain of ALK in the H2228 cell line was further sequenced from genomic DNA and found to be wild-type. Therefore, the deletion mutations found in H2228 do not affect the ALK kinase domain. In addition, wild-type EML-4 has an N-terminal coiled coil domain in which tyrosine is phosphorylated only at sites that are not present in the EML4-ALK fusion protein (short mutant) and is conserved in the fusion protein (Fig. (See 1A) suggests that it may play a role in dimerizing and activating ALK, as well as promoting interaction with wild-type ALK.

Ｂ．ヒトＮＳＣＬＣ細胞株中の配列決定
同様に、患者ＣＳ０１０／１１、ＣＳ０４５、及びＣＳ１１０由来のヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料中で高いリン酸化レベルのＡＬＫキナーゼが検出されたことを考慮して、キメラＡＬＫ転写物がこれらの腫瘍中に存在したか否かを判定するために、ＡＬＫのキナーゼドメインをコードする配列のｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅を行った。 B. Similar to sequencing in human NSCLC cell lines , chimeric ALK transcripts were found in view of the detection of high phosphorylated levels of ALK kinase in human NSCLC tumor samples from patients CS010 / 11, CS045, and CS110. 5'Rapid amplification of the cDNA ends of the sequence encoding the kinase domain of ALK was performed to determine if it was present in these tumors.

相補的ＤＮＡ末端及び５’ＲＡＣＥの迅速増幅を、上のＡ欄の詳述のように、ｃＤＮＡ合成用のプライマーＡＬＫ−ＧＳＰ１及びネスト化ＰＣＲ反応用のＡＬＫ−ＧＳＰ２及びＡＬＫ−ＧＳＰ３を用いて実施した。 Rapid amplification of complementary DNA ends and 5'RACE was performed using primers ALK-GSP1 for cDNA synthesis and ALK-GSP2 and ALK-GSP3 for nested PCR reactions, as detailed in column A above. did.

図５Ｃは、２つの患者試料中の５’ＲＡＣＥによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子（短い変異体及び長い変異体の両方）の検出、及び１人の患者におけるＴＦＧ−ＡＬＫ融合遺伝子の検出、及び第２ラウンド後のＰＣＲ増幅産物の検出を示している。ＰＣＲ産物は、上のＡ欄に詳述するように、精製して配列決定を行った。得られた産物の配列分析は、ＡＬＫのキナーゼドメイン及びＣ末端が、２つの異なった変異体のＥＭＬ−４遺伝子のＮ末端に融合したことを明らかにした（図１Ａ−１Ｂ、下の図を参照されたい）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子はフレーム単位であり、そしてＥＭＬ−４の最初の２３３のアミノ酸（短い変異体）又は最初の４９５のアミノ酸（長い変異体）はＡＬＫの終わりの５６２のアミノ酸と融合した（図１Ａ−１Ｂ、下の図を参照されたい）。ＥＭＬ−４及びＡＬＫ遺伝子の両方は染色体２に位置しているので、融合遺伝子はこの２つの遺伝子座の間の遺伝子欠失によって創出された。患者ＣＳ０４５中での融合遺伝子（短い変異体）の観察は、ヒト細胞株Ｈ２２２８でこの突然変異遺伝子の発見を裏付けるものであった。 FIG. 5C shows the detection of the EML4-ALK fusion gene (both short and long mutants) by 5'RACE in two patient samples, and the detection of the TFG-ALK fusion gene in one patient, and a second. It shows the detection of PCR amplification products after the round. The PCR product was purified and sequenced as detailed in column A above. Sequence analysis of the resulting product revealed that the kinase domain of ALK and the C-terminus were fused to the N-terminus of the EML-4 gene of two different mutants (Fig. 1A-1B, figure below). Please refer to). The EML4-ALK fusion gene is on a frame-by-frame basis, and the first 233 amino acids (short variants) or the first 495 amino acids (long variants) of EML-4 are fused with the 562 amino acids at the end of ALK (Figure). 1A-1B, see figure below). Since both the EML-4 and ALK genes are located on chromosome 2, the fusion gene was created by a gene deletion between the two loci. Observation of the fusion gene (short mutant) in patient CS045 confirmed the discovery of this mutant gene in human cell line H2228.

ＴＦＧ−ＡＬＫ融合遺伝子もフレーム単位であって、ＴＦＧの最初の１３８のアミノ酸がＡＬＫの終わりの５６２のアミノ酸と融合した（図１Ｃ、下の図を参照されたい）。ＴＦＧ及びＡＬＫ遺伝子は異なった染色体（それぞれ染色体６及び２）に位置しているので、融合遺伝子はこの２つの遺伝子座の間での遺伝子転座によって創出された。興味深いことに、ＴＦＧのＡＬＫとの融合が、２つのＥＭＬ４−ＡＬＫ変異体の融合について観察されたＡＬＫの全く同じ位置で生じていて、固形腫瘍中のこの位置でのＡＬＫの切断が頻繁に起きている可能性があることを示唆している。 The TFG-ALK fusion gene was also on a frame-by-frame basis, with the first 138 amino acids of TFG fused to the last 562 amino acids of ALK (Fig. 1C, see figure below). Since the TFG and ALK genes are located on different chromosomes (chromosomes 6 and 2 respectively), the fusion gene was created by a gene translocation between the two loci. Interestingly, fusion of TFG with ALK occurs at exactly the same location of ALK observed for fusion of two EML4-ALK variants, with frequent cleavage of ALK at this location in solid tumors. It suggests that it may be.

上のＡ欄に記述のものと同じプライマーを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、上のＡ欄に詳述のように実施して、ＥＭＬ−４及びＴＦＧのＮ末端が融合タンパク質中に無傷で存在していることを確認した（図６を参照されたい）。ＥＭＬ−４及びＡＬＫ用のプライマー対は上のＡ欄に記述の通りであり、次のプライマー対をＴＦＧに用いた。
ＴＦＧ−Ｆ１：５’−ＴＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣ−３（配列番号２８）。 The same primers as described in column A above were used. RT-PCR analysis was performed as detailed in column A above to confirm that the N-terminus of EML-4 and TFG was intact in the fusion protein (see Figure 6). ). The primer pairs for EML-4 and ALK are as described in column A above, and the following primer pairs were used for TFG.
TFG-F1: 5'-TTTGTTTAATGGCCAGCCAAAGACCC-3 (SEQ ID NO: 28).

注目すべきことは、両方のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合突然変異体において、ＡＬＣＬで起こるＮＰＭ−ＡＬＫ融合体のような、他のＡＬＫ融合体で観察されているＡＬＫの全く同じ位置でＡＬＫ部分がＥＭＬ−４部分と融合するということである。更に、野生型のＥＭＬ−４は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質に存在していない部位でのみチロシンがリン酸化されていて、融合タンパク質中で保存されているＮ末端コイルドコイルドメイン（図１Ａ−１Ｂを参照されたい）がＡＬＫを二量化及び活性化する機能を、更には野生型ＡＬＫとの相互作用を促進する機能を果たす可能性があることを示唆している。また注目すべきことには、ＴＧ部分のＡＬＫとの融合もＡＬＫの全く同じ位置で生じていて、確かにこの位置でのＴＦＧのＡＬＫとの融合について、ヒトリンパ腫においては記述されている（Hernandez et al. (2002), Supra. を参照されたい）が、ＮＳＣＬＣのような、ヒト固形腫瘍においてはこれまで記述されていなかった。 Of note, in both EML4-ALK fusion mutants, the ALK moiety is EML-at exactly the same position as the ALK observed in other ALK fusions, such as the NPM-ALK fusion that occurs in ALCL. It means that it fuses with the four parts. In addition, wild-type EML-4 has an N-terminal coiled coil domain (see FIG. 1A-1B) in which tyrosine is phosphorylated only at sites not present in the EML4-ALK fusion protein and is conserved in the fusion protein. It suggests that it may play a role in dimerizing and activating ALK, as well as promoting interaction with wild-type ALK. Also noteworthy is that the fusion of the TG portion with ALK also occurs at the exact same position of ALK, and certainly the fusion of TFG with ALK at this position has been described in human lymphoma (Hernandez). Et al. (2002), Supra.), But have not previously been described in human solid tumors such as NSCLC.

ｓｉＲＮＡを用いるＡＬＫ融合体を発現する哺乳類固形腫瘍の生育阻害
ＡＬＫの切断／融合形態がＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２２８、更に患者ＣＳ０１０／１１、ＣＳ０４５、及びＣＡ１１０由来のＮＳＣＬＣ腫瘍試料における、細胞の生育及び生存を促進していることを確認するために、これらの細胞及び腫瘍の生育を阻害するｓｉＲＮＡの（ＡＬＫに対する）能力を試験することができる。 Growth Inhibition of ALK Fusion Expressing Mammalian Solid Tumors Using SiRNA Cell Growth and Survival in NSCLC Tumor Samples Derived from NSCLC Cell Line H2228, Patients CS010 / 11, CS045, and CA110 with ALK cleavage / fusion form To confirm that it promotes, the ability of siRNA (against ALK) to inhibit the growth of these cells and tumors can be tested.

ＡＬＫのＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ二本鎖（優先的標的配列−データは示されていない）は例えば Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO）から入手できる。非特異的なＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡをコントロールとして用いる。細胞を電気穿孔法によってｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。すなわち、２×１０^７の細胞（Ｈ２２２８）に、方形波エレクトロポレーター（BTX Genetronics San Diego, CA）を用いて１回パルス（２０ｍｓ；２７５Ｖ、Ｋ５６２２０ｍｓ；２８５Ｖ）を与え、室温で３０分間培養して、３０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳを用いてＴ１５０フラスコに移す。 ALK's SMART pool siRNA double strand (preferred target sequence-data not shown) is available, for example, from Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO). A non-specific SMART pool siRNA is used as a control. Cells are transfected with siRNA by electroporation. That is, 2 × 10 ⁷ cells (H2228) are given a single pulse (20 ms; 275 V, K562 20 ms; 285 V) using a square wave electropolator (BTX Genetronics San Diego, CA) and cultured at room temperature for 30 minutes. Then, transfer to a T150 flask using 30 ml RPMI-1640 / 10% FBS.

生存している細胞の数を、CellTiter 96 AQ_{ｕｅｏｕｓ} One solution 細胞増殖アッセイ（Promega）で測定する。ＩＣ_５０を OriginPro 6.1 ソフトウェア（OriginLab) を用いて計算する。４８時間におけるアポトーシス細胞の割合を Cleaved-Caspase-3 （Cell Signalling Technolgy) のフローサイトメトリー分析で測定できる。 The number of surviving cells is measured with the CellTiter 96 AQ _ueuous One solution Cell Proliferation Assay (Promega). Calculate the IC ₅₀ using OriginPro 6.1 software (OriginLab). The percentage of apoptotic cells at 48 hours can be measured by flow cytometric analysis of Cleaved-Caspase-3 (Cell Signaling Technolgy).

イムノブロット分析は、Ｈ２２２８細胞又は患者ＣＳ０１０／１１、ＣＳ０４５、及びＣＳ１１０由来の腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション後７２時間で、ＡＬＫの発現が特異的且つ有意に減少することを明らかにするだろう。ＡＬＫの発現低下が細胞の生育の強力な阻害をもたらすことが期待される。ＡＬＫｓｉＲＮＡによる処置も、これらの固形腫瘍細胞のアポトーシスの増加をもたらすことが期待される。これらの結果は更に、Ｈ２２２８細胞株及び患者の腫瘍にある、突然変異／融合ＡＬＫキナーゼがこれらのＮＳＣＬＣ細胞の増殖及び生育を促進していて、そのような生育及び増殖が、ｓｉＲＮＡを用いてＡＬＫキナーゼの発現及び活性を阻害することによって阻止できるということを示唆するだろう。 Immunoblotting analysis will reveal that ALK expression is specifically and significantly reduced 72 hours after transfection of siRNA into H2228 cells or tumor cells from patients CS010 / 11, CS045, and CS110. .. It is expected that reduced expression of ALK will result in a strong inhibition of cell growth. Treatment with ALK siRNA is also expected to result in increased apoptosis of these solid tumor cells. These results further indicate that mutant / fused ALK kinases in the H2228 cell line and patient tumors promote the growth and growth of these NSCLC cells, and such growth and growth is ALK using siRNA. It would suggest that it can be blocked by inhibiting the expression and activity of the kinase.

ＷＩ−１３１及び／又はＷＩ−１５４を用いるＡＬＫ融合体を発現する哺乳類固形腫瘍の生育阻害
突然変異ＡＬＫ融合タンパク質がＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２２８及び患者ＣＳ０１０／１１、ＣＳ０４５、及びＣＳ１１０由来のＮＳＣＬＣ腫瘍株の生育及び生存を促進していることを更に確認するために、ＷＩ−１３１及び／又はＷＩ−１５４のようなＡＬＫキナーゼの標的阻害剤で細胞を処理してもよい。ＷＩ−１３１及びＷＩ−１５４はキナゾリンタイプのＡＬＫキナーゼの小分子阻害剤であって、Ｔ細胞リンパ腫においてＮＰＭ−ＡＬＫ融合タンパク質に対するそれらの活性については記述されている。Marzec et al., supra. を参照されたい。 Growth inhibition of solid mammalian tumors expressing ALK fusion using WI-131 and / or WI-154 Growth of mutant ALK fusion proteins in NSCLC cell line H2228 and patients CS010 / 11, CS045, and CS110-derived NSCLC tumor lines And to further confirm that it promotes survival, cells may be treated with targeted inhibitors of ALK kinase such as WI-131 and / or WI-154. WI-131 and WI-154 are small molecule inhibitors of quinazoline-type ALK kinase and their activity against the NPM-ALK fusion protein in T-cell lymphoma has been described. See Marzec et al., Supra.

すなわち、ＮＳＣＬＣ細胞を培養して、CellTiter 96 AQueous One solution 細胞増殖アッセイ（Promega）で、製造会社の提示に従って細胞生育阻害アッセイを実施する。すなわち、１０００〜５０００の細胞を平底９６ウェルのプレート上に蒔種して、１０％ＦＢＳを含む完全培地中で生育する。２４時間後に、細胞の培地を各種濃度の薬剤を含有する１０％のＦＢＳを含む１００μｌの完全生育培地に換えて、細胞を更に７２時間培養する。それぞれの薬剤濃度を３通りの細胞のウェルに適用させる。培養の終期に２０μｌのCellTiter 96 AQ_{ｕｅｏｕｓ} One solution を各ウェルに添加して、プレートを１〜４時間培養する。Titan Multiskan Ascentマイクロプレートリーダー (Titertek Instrument) を用いて、４９０ｎｍで吸光度を読み取る。生育阻害を処置細胞対未処置細胞から読み取った吸光度のパーセントの平均±ＳＤ値で表すことができる。 That is, NSCLC cells are cultured and a cell growth inhibition assay is performed in the CellTiter 96 AQueous One solution cell proliferation assay (Promega) according to the manufacturer's suggestion. That is, 1000-5000 cells are sown on a flat-bottomed 96-well plate and grown in complete medium containing 10% FBS. After 24 hours, the cell medium is replaced with 100 μl complete growth medium containing 10% FBS containing various concentrations of drug and the cells are cultured for an additional 72 hours. Each drug concentration is applied to the wells of three cells. At the end of culturing, _add 20 μl of CellTiter 96 AQ _euous One solution to each well and incubate the plates for 1-4 hours. Read the absorbance at 490 nm using a Titan Multiskan Ascent microplate reader (Titertek Instrument). Growth inhibition can be expressed as the mean ± SD value of the percentage of absorbance read from treated cells vs. untreated cells.

このような分析により、ＡＬＫ融合タンパク質（ＥＭＬ４−ＡＬＫ（短い変異体及び長い変異体）、ＴＦＧ−ＡＬＫ）が、これらの突然変異タンパク質が発現しているヒトＮＳＣＬＣ腫瘍のサブセットの生育及び生存を促進していること、及びＷＩ−１３１及び／又はＷＩ−１５４のような、標的阻害剤を用いて融合ＡＬＫキナーゼの活性を阻害することによってそのような細胞を阻害できることを確認できると期待される。 In such analysis, ALK fusion proteins (EML4-ALK (short and long mutants), TFG-ALK) promote the growth and survival of a subset of human NSCLC tumors expressing these mutant proteins. It is expected that it can be confirmed that such cells can be inhibited by inhibiting the activity of the fusion ALK kinase with a target inhibitor such as WI-131 and / or WI-154.

ＡＬＫ融合タンパク質は形質転換した哺乳類細胞株の生育及び生存を促進する
１つ又はそれ以上のＡＬＫ融合タンパク質の発現が正常細胞を癌表現型に転換できるかを確認するために、３Ｔ＃細胞を、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（短い変異体及び長い変異体）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質をそれぞれ発現する、上記（実施例２）のｃＤＮＡ構築物で形質転換してもよい。 ALK fusion proteins promote the growth and survival of transformed mammalian cell lines 3T # cells, to see if expression of one or more ALK fusion proteins can convert normal cells to a cancer phenotype. It may be transformed with the cDNA construct of the above (Example 2), which expresses EML4-ALK (short mutant and long mutant) or TFG-ALK fusion protein, respectively.

すなわち、細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Sigma) 及び１．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（R&D Systems）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitogen) 中に保持する。レトロウィルス上清の産生及び形質導入を既述のようにして実施する。Schwaller et al., Embo J. 17(18):5321-33 (1988) を参照されたい。３Ｔ３細胞をＭＳＣＶ−Ｎｅｏ／ＥＭＬ４−ＡＬＫ（又はＴＦＧ−ＡＬＫ）ベクターを含有するレトロウィルス上清を用いて形質導入して、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）用に選択した。次いで、形質転換された細胞の軟寒天上での生育能力は、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄した後、形質導入細胞をプレートに蒔いて評価した。所望により、用量反応曲線用に、上記（実施例３を参照されたい）のようにしてＡＬＫに対してｓｉＲＮＡを用いて処理して、生存している細胞の数を、CellTiter 96 AQ_{ｕｅｏｕｓ} One solution 細胞増殖アッセイ（Promega）で測定する。ＩＣ_５０を OriginPro 6.1 ソフトウェア（OriginLab) を用いて計算することができる。４８時間におけるアポトーシス細胞の割合を、この標的に対して特異的な抗体を用いて、Cleaved-Caspase-3 （Cell Signaling Technology) のフローサイトメトリー分析で測定できる。このような分析により、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い変異体又は長い変異体）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質の発現が、３Ｔ３細胞を形質転換して、これらの細胞がこのＡＬＫ融合タンパク質により促進される場合に軟寒天上での生存及び生育を確認できること、更に形質転換細胞におけるＡＬＫ発現の阻害が生存能力を減少させ及びアポトーシスを増加させるということが示されるだろう。 That is, cells are retained in RPMI-1640 medium (Invitogen) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Sigma) and 1.0 ng / ml IL-3 (R & D Systems). Production of retrovirus supernatant and transduction are carried out as described above. See Schwaller et al., Embo J. 17 (18): 5321-33 (1988). 3T3 cells were transduced with a retrovirus supernatant containing the MSCV-Neo / EML4-ALK (or TFG-ALK) vector and selected for G418 (1 mg / ml). The viability of the transformed cells on soft agar was then evaluated by washing the cells 3 times in PBS and then sowing the transduced cells on a plate. If desired, for dose-response curves, _ALKs are treated with siRNA as described above (see Example 3) to determine the number of surviving cells in the CellTiter 96 AQ _ueuous One solution. Measured by cell proliferation assay (Promega). IC _50s can be calculated using OriginPro 6.1 software (OriginLab). The percentage of apoptotic cells at 48 hours can be measured by flow cytometric analysis of Cleaved-Caspase-3 (Cell Signaling Technology) using antibodies specific for this target. By such analysis, expression of the EML4-ALK fusion protein (short or long variant) or TFG-ALK fusion protein transforms 3T3 cells and these cells are promoted by this ALK fusion protein. In some cases, it will be shown that survival and growth on soft agar can be confirmed, and that inhibition of ALK expression in transformed cells reduces viability and increases apoptosis.

ＦＩＳＨアッセイを用いる、ヒト固形腫瘍におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質発現の検出
ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い変異体）の存在を、既述のようにして、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを用いて検出した。例えば、Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988) を参照されたい。２００を超えるパラフィン包埋ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料を試験した。 Detection of EML4-ALK Fusion Protein Expression in Human Solid Tumors Using FISH Assay The presence of the EML4-ALK fusion protein (short mutant) in human NSCLC tumor samples is demonstrated by fluorescence in situ hybridization as described above. Detected using a FISH) assay. See, for example, Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, NY (1988). Over 200 paraffin-embedded human NSCLC tumor samples were tested.

ＡＬＫの２色分解再配列プローブ（dual color, break-apart rearrangement probe）を Vysis (Vysis, Dowers Grove, IL, USA）から入手して、以下の修飾を加えて製造会社の使用説明書に従って使用した。すなわち、パラフィン包埋組織切片を再水和して、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１１分間、超音波による抗原回復を行った。切片をプロテアーゼ（４ｍｇ／ｍｌのペプシン、２０００〜３０００Ｕ／ｍｇ）を用いて３７℃で２５分間消化し、脱水して、ＦＩＳＨプローブセットを用いて３７℃で１８時間ハイブリダイズした。洗浄後、ベクタシールド（Vectashield）封入培地中の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルリンドール（ＤＡＰＩ；ｍｇ／ｍｌ）を核対比染色のために適用した。 ALK's dual color, break-apart rearrangement probe was obtained from Vysis (Vysis, Dowers Grove, IL, USA) and used with the following modifications according to the manufacturer's instructions. .. That is, the paraffin-embedded tissue section was rehydrated, and the antigen was recovered by ultrasonic waves in 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) for 11 minutes. Sections were digested with protease (4 mg / ml pepsin, 2000-3000 U / mg) at 37 ° C. for 25 minutes, dehydrated and hybridized at 37 ° C. for 18 hours using the FISH probe set. After washing, 4', 6-diamidino-2-phenyllindol (DAPI; mg / ml) in Vectashield-encapsulated medium was applied for nuclear counterstaining.

ＡＬＫの再配列プローブは、野生型配列（配列番号６）中のＡＬＫ遺伝子の切断点（ヌクレオチド３１７１での）の対側に２つの異なった標識化プローブを含有している。ハイブリダイズすると、元のＡＬＫ領域は橙色／緑色の融合シグナルとして示され、一方この遺伝子座における再配列は（ＥＭＬ４−ＡＬＫ欠失変異体中で起きる場合）分離した橙色と緑色のシグナルをもたらすであろう。図６を参照されたい。 The ALK rearrangement probe contains two different labeled probes contralateral to the cut point (at nucleotide 3171) of the ALK gene in the wild-type sequence (SEQ ID NO: 6). When hybridized, the original ALK region is shown as an orange / green fusion signal, while rearrangement at this locus results in a separated orange and green signal (if it occurs in an EML4-ALK deletion mutant). There will be. See FIG.

このＦＩＳＨ分析により、検討した試料群におけるこの短い型のＥＭＬ４−ＡＬＫ突然変異の比較的低い発生率が明らかになった（２２９試料中の１つ）。しかしながら、世界規模のＮＳＣＬＣの高い発生率（年間に米国だけで、１５１，０００人を越える新症例）を考慮すると、この突然変異体ＡＬＫを担持している有意な数の患者がいることが見込まれ、この患者はＡＬＫを阻害する治療計画による恩恵を受けることができる。 This FISH analysis revealed a relatively low incidence of this short form of EML4-ALK mutation in the sample group examined (one of 229 samples). However, given the high incidence of NSCLC worldwide (more than 151,000 new cases annually in the United States alone), it is expected that there will be a significant number of patients carrying this mutant ALK. This patient can benefit from a treatment plan that inhibits ALK.

ＰＣＲアッセイを用いる、ヒト固形腫瘍におけるＡＬＫ融合タンパク質発現の検出
ヒト固形腫瘍試料中の１つ又はそれ以上のＡＬＫ融合タンパク質の存在は、既述のように、ゲノム又は逆転写酵素（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の何れかを用いても検出することができる。例えば、Cools et al., N. Engl. J. Med. 348:1201-12014 (2003) を参照されたい。つまり例を挙げると、標準的な技術を用いて、例えばＮＳＣＬＣを有する患者から固形腫瘍試料を得てもよい。切断されたＡＬＫキナーゼ又はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（短い変異体又は長い変異体）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質に対するＰＣＲプローブを構築する。RNeasy Mini Kit(Qiagen）を、腫瘍試料からＲＮＡを抽出するために用いてもよい。ＤＮＡは、DNeasy Tissue Kit (Quiagen）を用いて抽出してもよい。ＲＴ−ＰＣＲについては、第１鎖は、例えば、SuperScript（登録商標）III 第１鎖合成システム（Invitrogen）をオリゴ（ｄＴ）_２０で用いて、例えば２．５μｇの全ＲＮＡから合成される。 Detection of ALK Fusion Protein Expression in Human Solid Tumors Using PCR Assays The presence of one or more ALK fusion proteins in human solid tumor samples is, as previously described, genomic or reverse transcriptase (RT) polymerase linkage. It can also be detected using any of the reactions (PCR). See, for example, Cools et al., N. Engl. J. Med. 348: 1201-12014 (2003). Thus, for example, solid tumor samples may be obtained from patients with, for example, NSCLC, using standard techniques. Construct a PCR probe for the cleaved ALK kinase or EML4-ALK fusion protein (short or long mutant) or TFG-ALK fusion protein. The RNeasy Mini Kit (Qiagen) may be used to extract RNA from tumor samples. DNA may be extracted using the DNeasy Tissue Kit (Quiagen). For RT-PCR, the first strand is synthesized, for example, from 2.5 μg of total RNA using, for example, SuperScript® III First Strand Synthesis System (Invitrogen) at oligo (dT) ₂₀ .

次いで、プライマー対、例えばＥＭＬ４−２０２及びＡＬＫ−ＧＳＰ３（上の実施例２を参照されたい）を用いて、ＡＬＫ融合遺伝子を増幅する。ゲノムＰＣＲについては、融合遺伝子の増幅は、Platinum TaqＤＮＡポリメラーゼハイファイ（Invitrogen）を用いて、プライマー対、例えばＥＭＬ４−２０２とＡＬＫ−ＧＳＰ３（上の実施例２を参照されたい）で実施することができる。このような分析により、切断されたＡＬＫキナーゼ（及び／又はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質（複数も含む）又はＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質）の発現によって特徴付けられる固形腫瘍を有する患者が同定されるであろう。この患者が、ＷＨＩ−１３１及び／又はＷＨＩ−１５４のような、ＡＬＫを阻害する治療薬を用いる治療の候補者である。 Primer pairs such as EML4-202 and ALK-GSP3 (see Example 2 above) are then used to amplify the ALK fusion gene. For genomic PCR, fusion gene amplification can be performed with a primer pair, eg EML4-202 and ALK-GSP3 (see Example 2 above), using Platinum Taq DNA polymerase Invitrogen. .. Such analysis will identify patients with solid tumors characterized by expression of cleaved ALK kinase (and / or EML4-ALK fusion protein (s) or TFG-ALK fusion protein). .. This patient is a candidate for treatment with a therapeutic agent that inhibits ALK, such as WHI-131 and / or WHI-154.

Claims

ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者から得られる生体試料において突然変異未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
配列番号５で表されるアミノ酸配列のうち１１１６−１３８３番目のアミノ酸残基を含有し且つＡＬＫキナーゼ活性を有するＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするＡＬＫ融合ポリヌクレオチドが該試料中に存在することを検出することを含み、該検出がＡＬＫ融合ポリヌクレオチドのＡＬＫ部分にハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施を含む、方法。 A method for detecting the presence of mutated anaplastic lymphoma kinase (ALK) polynucleotides in biological samples obtained from human non-small cell lung cancer (NSCLC) patients.
It is detected that an ALK fusion polynucleotide encoding an ALK fusion polypeptide containing the amino acid residue at position 1116-1383 and having ALK kinase activity in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is present in the sample. A method comprising performing a polymerase chain reaction (PCR) with a pair of oligonucleotides whose detection hybridizes to the ALK portion of the ALK fusion polynucleotide.

ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the ALK fusion polynucleotide is mRNA or DNA.

検出が、核酸の配列決定を含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the detection comprises sequencing the nucleic acid.

生体試料が、生検組織試料又は胸水試料である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the biological sample is a biopsy tissue sample or a pleural effusion sample.