JP2020150946A - METHOD FOR MEASURING METHYLATION MODIFICATION SITE AT microRNA - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring methylation modification sites in microRNA.
リボ核酸（ＲＮＡ）の生体内におけるメチル化修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるものと比較してもより多彩であり、疾患との深い関連性等が指摘されている。 The methylation modification of ribonucleic acid (RNA) in vivo is more diverse than that of deoxyribonucleic acid (DNA), and it has been pointed out that it is closely related to diseases.
特に、発生を含む生物学、並びに慢性炎症、生活習慣病及び癌を含む疾患における重要性から、２３塩基対にサイズピークを有するマイクロＲＮＡが注目されている。所望のマイクロＲＮＡの検出には、定量ＲＴ−ＰＣＲ等が用いられる（非特許文献１）。 In particular, microRNAs having a size peak at 23 base pairs are attracting attention because of their importance in biology including development and diseases including chronic inflammation, lifestyle-related diseases and cancer. Quantitative RT-PCR and the like are used to detect the desired microRNA (Non-Patent Document 1).
ＲＮＡのメチル化修飾を計測する方法として、核酸シークエンス法や液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）等を用いることも提案されている。しかし、従来の方法は、生体内におけるマイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするためには適しておらず、このため、マイクロＲＮＡのメチル化に関する生物医学的な意義の解明がほとんど進んでいない。 It has also been proposed to use a nucleic acid sequencing method, a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), or the like as a method for measuring methylation modification of RNA. However, conventional methods are not suitable for comprehensive and highly accurate profiling of microRNA methylation modifications in vivo, and thus elucidation of the biomedical significance of microRNA methylation. Has hardly progressed.
本発明者らは、マイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするのに適した計測方法を提供することを課題とする。 It is an object of the present inventors to provide a measurement method suitable for comprehensively and highly accurate profiling of methylation modification of microRNA.
本発明者らは、ＲＮＡのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤を利用し、かつ質量分析により断片化測定を行うことにより、上記課題を解決できることを見出し、さらに試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。 The present inventors have found that the above problems can be solved by using a modifier that can selectively act on one of the RNA methylation candidate sites and by performing fragmentation measurement by mass spectrometry, and further trial and error. The present invention has been completed through repeated errors.
すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。
項２．
前記工程（２）における断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行う、項１に記載の方法。
項３．
リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したプレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記スポットを、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得る、項３に記載の方法。
項５．
１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを有する前記プレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項３又は４に記載の方法。
項６．
前記工程（２）における質量分析により、リボヌクレオチドの量及び核酸配列情報も同時に計測する、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．
項５に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップ。
That is, the present invention includes the following aspects.
Item 1.
A method for measuring methylation modification sites in microRNAs.
(1) A step of allowing a modifier that can selectively act on one of the methylation candidate sites of a ribonucleotide to act on a microRNA;
(2) A step of performing fragmentation measurement by mass spectrometry on the microRNA obtained in step (1); and (3) Detection of the mass number of each ribonucleotide obtained in step (2). A method comprising a step of comparing a value with the mass number of the corresponding unmodified ribonucleotide and determining that the methylation candidate site is methylated when there is no difference.
Item 2.
Item 2. The method according to Item 1, wherein fragmentation in the step (2) is carried out by alkaline hydrolysis with ammonia.
Item 3.
Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the steps (1) and (2) are performed on a plate in which ribonucleotides are arranged in spots for each type.
Item 4.
Item 3. The method according to Item 3, wherein the spot is obtained by binding a ribonucleotide containing a nucleic acid sequence complementary to a capture nucleic acid immobilized on the plate.
Item 5.
Item 3. The method according to Item 3 or 4, wherein the steps (1) and (2) are performed on the plate having 1000 to 3000 kinds of the spots in 1 mm square.
Item 6.
Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the amount of ribonucleotide and nucleic acid sequence information are also measured at the same time by mass spectrometry in the step (2).
Item 7.
A chip in which a capturing nucleic acid for forming the spot according to Item 5 is immobilized on the surface.
本発明によれば、マイクロＲＮＡのメチル化修飾を簡便にかつ高精度に計測できる。 According to the present invention, methylation modification of microRNA can be measured easily and with high accuracy.
１． メチル化修飾部位を計測する方法
本発明の、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法は、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む。
1. 1. Method for Measuring Methylation Modulation Site The method for measuring methylation modification site in microRNA according to the present invention is
(1) A step of allowing a modifier that can selectively act on one of the methylation candidate sites of a ribonucleotide to act on a microRNA;
(2) A step of performing fragmentation measurement by mass spectrometry on the microRNA obtained in step (1); and (3) Detection of the mass number of each ribonucleotide obtained in step (2). A step of comparing the value with the mass number of the corresponding unmodified ribonucleotide and determining that the methylation candidate site is methylated when there is no difference is included.
１．１ 工程（１）
計測対象とするマイクロＲＮＡは特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。マイクロＲＮＡは、特に限定されないが、典型的には、塩基数２０〜２５である。
1.1 Step (1)
The microRNA to be measured is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. The microRNA is not particularly limited, but typically has 20 to 25 bases.
計測対象とするリボヌクレオチドの例として、ヒトマイクロＲＮＡ等が挙げられる。ヒトマイクロＲＮＡは現在、２５７８種からなるとされている。 Examples of ribonucleotides to be measured include human microRNA and the like. Human microRNAs are currently believed to consist of 2578 species.
一種のリボヌクレオチドのみを計測対象としてもよいし、複数種のリボヌクレオチドを計測対象としてもよい。例えば、ヒトから採取した検体に含まれるヒトマイクロＲＮＡ総体をそのまま計測対象とすることもできる。この場合、必要に応じて、後述する工程（２）における質量分析により、個々のヒトマイクロＲＮＡについて、発現量及び核酸配列に関する情報も同時に取得できる。 Only one type of ribonucleotide may be measured, or a plurality of types of ribonucleotides may be measured. For example, the total amount of human microRNA contained in a sample collected from a human can be used as a measurement target as it is. In this case, if necessary, information on the expression level and nucleic acid sequence of each human microRNA can be obtained at the same time by mass spectrometry in the step (2) described later.
また、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を測定対象とすることもできる。本発明によれば、ＲＮＡ及びＤＮＡのそれぞれの鎖の識別が可能となる。 In addition, RNA-DNA chimera double strand can be used as a measurement target. According to the present invention, it is possible to identify each strand of RNA and DNA.
リボヌクレオチドのメチル化候補部位は、既に明らかにされており、具体的には、表１に示す通りである。 Ribonucleotide methylation candidate sites have already been clarified and are specifically shown in Table 1.
それぞれの部位に対して使用できる修飾剤の例も表１に示す。ハロゲン化アセトアルデヒドは、好ましくは、ブロモアセトアルデヒド又はクロロアセトアルデヒドであり、より好ましくはブロモアセトアルデヒドである。 Table 1 also shows examples of modifiers that can be used for each site. The halogenated acetaldehyde is preferably bromoacetaldehyde or chloroacetaldehyde, and more preferably bromoacetaldehyde.
本発明において、修飾剤は、特に表１に記載のものに限定されず、同様の作用を有するものを適宜使用することができる。後述する工程（３）において、修飾剤の作用による質量数の変化の有無により計測を行うことが重要である。したがって、本発明で用いる修飾剤は、個々のメチル化候補部位に選択的に作用するものであり、かつ後述の工程（２）で検出可能な質量変化を生じうるものであればよい。 In the present invention, the modifier is not particularly limited to that shown in Table 1, and those having the same action can be appropriately used. In the step (3) described later, it is important to measure by the presence or absence of a change in the mass number due to the action of the modifier. Therefore, the modifier used in the present invention may be any one that selectively acts on individual methylation candidate sites and can cause a mass change that can be detected in the step (2) described later.
修飾剤を作用させる条件は、修飾剤毎により異なり、適宜選択することができる。 The conditions under which the modifier acts differ depending on the modifier and can be appropriately selected.
必要に応じて、複数種の修飾剤を同時に作用させることもできる。 If necessary, multiple modifiers can be allowed to act simultaneously.
１．２ 工程（２）
質量分析による核酸の断片化測定の方法は既に知られており、特に限定されないが、例えば、ブルカーダルトニクス社製ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ｔｏｆ／ｔｏｆ等に代表されるような、ＭＡＬＤＩ型質量分析計を利用できる。
1.2 Step (2)
The method for measuring the fragmentation of nucleic acid by mass spectrometry is already known and is not particularly limited, but for example, a MALDI type mass spectrometer such as ultraflex tof / tof manufactured by Brucardaltonix can be used.
この場合、特に限定されないが、断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行うとＤＮＡは分解を受けずＲＮＡのみが断片化を受ける上に、塩の除去が不要なために、ターゲットプレート上での操作が可能となり有利である。この場合、加水分解は主として５’末端側から進行する。アンモニアによる加水分解の条件としては、特に限定されないが、例えば、０．１Ｎ アンモニア水６０℃、３０分間等が挙げられる。 In this case, although not particularly limited, when fragmentation is performed by alkaline hydrolysis with ammonia, DNA is not decomposed and only RNA is fragmented, and salt removal is not required. Therefore, the target plate is used. It is advantageous because it can be operated. In this case, hydrolysis proceeds mainly from the 5'end side. The conditions for hydrolysis with ammonia are not particularly limited, and examples thereof include 0.1N aqueous ammonia at 60 ° C. for 30 minutes.
ターゲットプレート上の断片化処理を行った検体、又は未処理の検体について、ＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）を塗布した後に、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行う。この場合、特に限定されないが、例えば、３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）、ＣＨＣＡ（α-シアノ-4-ヒドロキシけい皮酸）等が利用出来る。 After applying the MALDI matrix (ionization aid) to the fragmented or untreated sample on the target plate, mass spectrometry is performed with a MALDI mass spectrometer. In this case, although not particularly limited, for example, 3-HPA (3-hydroxypicolinic acid), DHC (diammonium citrate), CHCA (α-cyano-4-hydroxycytic acid) and the like can be used.
特に限定されないが、リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したターゲットプレート上において、工程（１）及び（２）を行うと、一度に複数種のリボヌクレオチドに対する計測結果を得ることができ、有利である。 Although not particularly limited, if steps (1) and (2) are performed on a target plate in which ribonucleotides are arranged in spots for each type, measurement results for a plurality of types of ribonucleotides can be obtained at one time, which is advantageous. Is.
特に限定されないが、そのようなスポットとしては、例えば、直径１０μｍ〜１００μｍのもの等が挙げられる。そのスポット内に、特に限定されないが、例えば、１０７以上の同一種のリボヌクレオチドを配置してもよい。 Although not particularly limited, such spots include, for example, spots having a diameter of 10 μm to 100 μm. As in the spot is not particularly limited, for example, it may be arranged 10 7 or more of the same kind of ribonucleotides.
そのようなスポットは、特に限定されないが、例えば、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得ることができる。 Such spots are not particularly limited, but can be obtained, for example, by binding a ribonucleotide containing a nucleic acid sequence complementary to the capture nucleic acid immobilized on the plate.
特に限定されないが、アビジンからなる基盤をスポット内に配置し、捕捉用核酸をビオチン化したものをかかる基盤に固定化することにより、上記スポットを作成することができる。 Although not particularly limited, the spot can be prepared by arranging a substrate made of avidin in the spot and immobilizing a biotinylated capture nucleic acid on the substrate.
特に限定されないが、１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを配置することができる。一例として、２５７８種のヒトマイクロＲＮＡをそれぞれ選択的に捕捉しうる捕捉核酸が種類毎に固定化されている２５７８種のスポットを、１ミリ四方内に配置することができる。 Although not particularly limited, 1000 to 3000 kinds of the spots can be arranged in 1 mm square. As an example, 2578 types of spots in which capture nucleic acids capable of selectively capturing 2578 types of human microRNAs are immobilized for each type can be arranged within 1 mm square.
異なるスポット同士が互いに近接している場合には、質量分析による断片化測定の際に近接するスポットにそれぞれ由来するシグナル同士が干渉し合い、スポット毎の計測値に影響が生じ得る。したがって、必要に応じて、所定領域内における各スポットの配置に際しては、シグナル間の干渉が生じても影響が最小限で済むように配置順に配慮することが重要となる。配置順の決定においては、必要に応じて数理的統計的手法を利用することができる。 When different spots are close to each other, signals derived from the adjacent spots interfere with each other during fragmentation measurement by mass spectrometry, which may affect the measured value for each spot. Therefore, if necessary, when arranging each spot in a predetermined region, it is important to consider the arrangement order so that the influence can be minimized even if interference between signals occurs. Mathematical statistical methods can be used as needed to determine the order of placement.
特に限定されないが、各スポットの配置順の決定は、例えば以下のようにして行うことができる。 Although not particularly limited, the arrangement order of each spot can be determined, for example, as follows.
（１）全マイクロＲＮＡの分類
この段階においては、全マイクロＲＮＡを、それぞれ特定の部分配列を共有するもの同士からなる集団に分類する。この際、同じ集団に属するマイクロＲＮＡ同士の間に、観測機器により判別可能な質量差があることが必要となる。この条件を満たす部分配列が、捕捉核酸の候補となる。
(1) Classification of all microRNAs At this stage, all microRNAs are classified into a group consisting of those sharing a specific partial sequence. At this time, it is necessary that there is a mass difference that can be discriminated by the observation instrument between the microRNAs belonging to the same population. A partial sequence satisfying this condition is a candidate for a capture nucleic acid.
（２）捕捉核酸の最適化
上記（１）により得られた捕捉核酸の候補の中には、捕捉しようとするマイクロＲＮＡが互いに重複しているものがある場合がある。この場合、全マイクロＲＮＡを漏れなく捕捉しつつ、捕捉核酸の総数が最小となるように捕捉核酸の集約を行う。
(2) Optimization of Captured Nucleic Acid Among the candidates for captured nucleic acid obtained in (1) above, there are cases where the microRNAs to be captured overlap with each other. In this case, all the microRNAs are captured without omission, and the captured nucleic acids are aggregated so that the total number of captured nucleic acids is minimized.
（３）捕捉核酸の配置最適化
上記（２）により集約された捕捉核酸を、隣接する捕捉核酸により捕捉されるマイクロＲＮＡ同士の質量差が最大となるように、配置順を最適化する。この際に、必要に応じてモンテカルロ法等の数理的統計的手法を利用することができる。
(3) Optimization of Arrangement of Captured Nucleic Acids The arrangement order of the captured nucleic acids aggregated in (2) above is optimized so that the mass difference between the microRNAs captured by the adjacent captured nucleic acids is maximized. At this time, a mathematical statistical method such as the Monte Carlo method can be used as needed.
１．３ 工程（３）
工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する。このとき、修飾剤がその標的箇所を修飾できなかったことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されているといえる。
1.3 Step (3)
The detected value of the mass number for each ribonucleotide obtained in step (2) is compared with the mass number of the corresponding unmodified ribonucleotide, and when there is no difference, the methylation candidate site is methylated. Judged as At this time, it means that the modifier could not modify the target site. That is, it can be said that the target site is methylated.
反対に、上記において差があるときは、修飾剤がその標的箇所を修飾したことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されていないといえる。 On the contrary, when there is a difference in the above, it means that the modifier has modified the target site. That is, it can be said that the target site is not methylated.
２． 計測用チップ
本発明の計測用チップは、上記に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップである。
2. 2. Instrumentation Chip The instrumentation chip of the present invention is a chip in which a capturing nucleic acid for forming the above-mentioned spot is immobilized on the surface.
特に限定されないが、そのようなスポットとしては、例えば、直径１０μｍ〜１００μｍのもの等が挙げられる。そのスポット内に、特に限定されないが、例えば、１０７以上の同一種のリボヌクレオチドが配置されていてもよい。 Although not particularly limited, such spots include, for example, spots having a diameter of 10 μm to 100 μm. As in the spot is not particularly limited, for example, 10 7 or more of the same type of ribonucleotide may be disposed.
そのようなスポットは、特に限定されないが、例えば、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得ることができる。 Such spots are not particularly limited, but can be obtained, for example, by binding a ribonucleotide containing a nucleic acid sequence complementary to the capture nucleic acid immobilized on the plate.
特に限定されないが、アビジンからなる基盤をスポット内に配置し、捕捉用核酸をビオチン化したものをかかる基盤に固定化することにより、上記スポットを作成することができる。 Although not particularly limited, the spot can be prepared by arranging a substrate made of avidin in the spot and immobilizing a biotinylated capture nucleic acid on the substrate.
特に限定されないが、１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを配置することができる。一例として、２５７８種のヒトマイクロＲＮＡをそれぞれ選択的に捕捉しうる捕捉核酸が種類毎に固定化されている２５７８種のスポットを、１ミリ四方内に配置することができる。 Although not particularly limited, 1000 to 3000 kinds of the spots can be arranged in 1 mm square. As an example, 2578 types of spots in which capture nucleic acids capable of selectively capturing 2578 types of human microRNAs are immobilized for each type can be arranged within 1 mm square.
スポットの配置順については、既に説明した通りである。 The order of spot arrangement is as described above.
チップの基材としては、特に限定されないが、例えば、導電性を付与したガラス及びプラスチック（ポリエチレン）等が挙げられる。 The base material of the chip is not particularly limited, and examples thereof include glass and plastic (polyethylene) to which conductivity is imparted.
特に限定されないが、高速解析を行うため、上記のスポットを有する多数のウェルを備える計測用チップとすることができる。特に限定されないが、３８４ウェルプレート等が例示できる。 Although not particularly limited, a measurement chip having a large number of wells having the above spots can be used for high-speed analysis. Although not particularly limited, a 384-well plate or the like can be exemplified.
この計測用チップは、既に説明した、メチル化修飾部位を計測する方法のために使用できる。また、メチル化修飾の有無とは無関係に、質量分析により、リボヌクレオチドの量及び／又は核酸配列情報を計測するために使用することもできる。 This instrumentation chip can be used for the method described above for measuring methylation modification sites. It can also be used to measure the amount and / or nucleic acid sequence information of ribonucleotides by mass spectrometry, with or without methylation modification.
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto.
以下の手順においては、質量分析用試薬（マトリクスなど）、化学合成用試薬（クロロアセトアルデヒドなど）、分子生物学用（塩基や合成核酸など）、特級試薬（アンモニア水など）を使用した。 In the following procedure, reagents for mass spectrometry (matrix, etc.), reagents for chemical synthesis (chloroacetaldehyde, etc.), molecular biology reagents (base, synthetic nucleic acid, etc.), and special grade reagents (water ammonia, etc.) were used.
測定１
メチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）を分け取り、ＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解し吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。この同じ位置に先のマイクロＲＮＡ水溶液１μＬを重層して乾燥した。完全な乾燥を確認した後、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、該プリカーサーイオンに対して、ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ（インソース分解、ＩＳＤ）を用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認した。図に示さないが濃度を増減させることである程度の定量性が確保されることもあわせて確認した（図１）。
Measurement 1
MicroRNA200-c-5p (human sequence / single strand) synthesized so as to contain methylated adenine and methylated cytosine was separated, dissolved in RNase-Free ultrapure water, and the concentration was confirmed by absorbance measurement. Was adjusted to 1 pmole / μL. As a matrix for MALDI (ionization aid), 1 μL of a 10 mg / mL 3-HPA (3-hydroxypicolinic acid) 10 mg / mL DHC (diammonium citrate) aqueous solution was applied to a target plate and dried. 1 μL of the above microRNA aqueous solution was layered on this same position and dried. After confirming complete drying, mass spectrometry is performed with a MALDI type mass spectrometer to confirm the total mass by observing the precursor ion, and in source decay (ISD) for the precursor ion. The internal sequence including the methylated base was confirmed by carrying out the measurement using. Although not shown in the figure, it was also confirmed that a certain degree of quantification can be ensured by increasing or decreasing the concentration (Fig. 1).
測定２
先述のメチル化塩基を含む合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）水溶液に、０．１Ｎ アンモニア水を等量加え、６０℃、３０分反応させた後、遠心乾燥によりアンモニアを除去した後、先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、アルカリ加水分解が５’末端側から進行すること、並びにアルカリ加水分解が内部塩基配列の確認にきわめて有効であることを確認した（図２）。
Measurement 2
To the above-mentioned synthesized microRNA200-c-5p (human sequence / single-stranded) aqueous solution containing the methylated base, an equal amount of 0.1N aqueous ammonia is added, and the mixture is reacted at 60 ° C. for 30 minutes and then centrifuged to ammonia. After removing the above, apply and dry it on the target plate together with the matrix as described above, and perform mass spectrometry with a MALDI type mass spectrometer. Alkaline hydrolysis proceeds from the 5'end side, and alkali hydrolysis is inside. It was confirmed that it was extremely effective in confirming the base sequence (Fig. 2).
測定３
合成したマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト配列／１本鎖）とその相補配列を有する合成ＤＮＡ（ヒト配列の３６９−３ｐの相補鎖／１本鎖）を同じモル数ずつ混合し、いったん加熱させた後に、徐冷することでアニールさせ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を形成し、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。このＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれについてプリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、ＩＳＤによりＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれの鎖の識別および配列決定が可能であることを確認した（図３）。
Measurement 3
Synthesized microRNA 369-3p (human sequence / single strand) and synthetic DNA having its complementary sequence (complementary strand / single strand of human sequence 369-3p) are mixed in the same number of moles, and then heated once. , It was annealed by slow cooling to form RNA-DNA chimeric double strand, and the concentration was adjusted to 1 pmole / μL. As described above, this RNA-DNA chimeric double strand is applied and dried on the target plate together with the matrix, mass spectrometry is performed with a MALDI type mass spectrometer, and the total mass is confirmed by observing precursor ions for each of DNA and RNA. At the same time, it was confirmed that ISD can identify and sequence the strands of DNA and RNA (Fig. 3).
測定４
ヒト培養細胞を開始材料として抽出・精製して得られた小分子ＲＮＡ画分をＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解して、吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１００ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。ターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察によりマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト）に相当する質量数の親イオンを見いだし、該プリカーサーイオンに対してＩＳＤを用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認し、マイクロＲＮＡ３６９−３ｐであることを確認した（図５）。
Measurement 4
The small RNA fraction obtained by extracting and purifying human cultured cells as a starting material was dissolved in RNase-Free ultrapure water, the concentration was confirmed by absorbance measurement, and then the concentration was adjusted to 100 pmole / μL. As a matrix for MALDI (ionization aid), 1 μL of a 10 mg / mL 3-HPA (3-hydroxypicolinic acid) and 10 mg / mL DHC (diammonium citrate) aqueous solution was applied to the target plate in advance and dried. After coating and drying on a target plate, mass spectrometry was performed with a MALDI type mass spectrometer, and by observing precursor ions, a parent ion having a mass number corresponding to microRNA369-3p (human) was found, and the precursor ion was subjected to mass spectrometry. By carrying out measurement using ISD, the internal sequence including the methylated base was confirmed, and it was confirmed that it was microRNA369-3p (Fig. 5).
硫酸ジメチル処理
図５に模式的に示したとおり、アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン
について、硫酸ジメチル処理によるメチル化処理においては、アデニン、Ｎ６−メチルアデニンの２種の分子では１位の窒素メチル化を受けることが期待されるが、すでにメチル化を受けている１−メチルアデニンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数は変化しない。
Dimethyl Sulfate Treatment As schematically shown in FIG. 5, adenine, 1-methyladenine, and N6-methyladenine are at the 1st position among the two molecules of adenine and N6-methyladenine in the methylation treatment by dimethyl sulfate treatment. However, 1-methyladenine, which has already been methylated, does not undergo further methylation and its mass number does not change.
以下に示す手順に従って反応を行い、ＨＰＬＣによる溶出位置の変化およびＬＣ−ＭＳＭＳによる溶出位置および質量数の変化は期待通りのものであった。アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニンを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、それぞれ個別に溶解し、用時調整した１５％硫酸ジメチルのエタノール溶液を終濃度０．５％添加し、２５℃で１分処理を行った。終濃度２％となるようβメルカプトエタノールを添加し、十分に攪拌することで、反応を停止させた後、ＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳＭＳによる測定に供した。また、上述のメチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）についても同様に硫酸ジメチル処理を行い、先述の手段に従ってＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、誘導体化の有効性を確認した。 The reaction was carried out according to the procedure shown below, and the change in the elution position by HPLC and the change in the elution position and mass number by LC-MSMS were as expected. Adenin, 1-methyladenine, and N6-methyladenine were individually dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.5) to a concentration of 100 μM, and a time-adjusted ethanol solution of 15% dimethyl sulfate was added to the final concentration. 0.5% was added, and the treatment was carried out at 25 ° C. for 1 minute. Β-mercaptoethanol was added so that the final concentration was 2%, and the reaction was stopped by stirring sufficiently, and then the mixture was subjected to measurement by HPLC or LC-MSMS. Further, the microRNA200-c-5p (human sequence / single strand) synthesized so as to contain the above-mentioned methylated adenine and methylated cytosine is also subjected to dimethyl sulfate treatment in the same manner, and a MALDI type mass spectrometer according to the above-mentioned means. Mass spectrometry was performed at the site to confirm the effectiveness of derivatization.
クロロアセトアルデヒド処理
図６に模式的に示したとおり、シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンについて、クロロアセトアルデヒド処理によるメチル化処理においては、シトシン、５−メチルシトシンの２種の分子では３位窒素原子とＮ４位窒素原子による環状化が期待されるが、３位窒素原子がメチル化を受けている３−メチルシトシンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数の変化は生じない。
Chloroacetaldehyde treatment As shown schematically in FIG. 6, about cytosine, 3-methylcytosine, and 5-methylcytosine, in the methylation treatment by chloroacetaldehyde treatment, the position is 3 in the two molecules of cytosine and 5-methylcytosine. Cyclization by the nitrogen atom and the N4-position nitrogen atom is expected, but further methylation does not occur and the mass number does not change for 3-methylcytosine in which the 3-position nitrogen atom is methylated.
以下に示す手順に従って反応を行い、ＨＰＬＣによる溶出位置の変化およびＬＣ−ＭＳＭＳによる溶出位置および質量数の変化は期待通りのものであった。シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５）に、それぞれ個別に溶解し、終濃度１％となるようにブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行った。過剰のブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドをジエチルエーテル抽出により除去した後、水層を乾燥させて得られた残渣をＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳＭＳによる測定に供した。また、上述のメチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）についても同様にブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行い、先述の手段に従ってＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、誘導体化の有効性を確認した。 The reaction was carried out according to the procedure shown below, and the change in the elution position by HPLC and the change in the elution position and mass number by LC-MSMS were as expected. Cytosine, 3-methylcytosine, and 5-methylcytosine were individually dissolved in 10 mM potassium phosphate (pH 5) to a concentration of 100 μM, and bromoacetaldehyde or chloroacetaldehyde was added to a final concentration of 1%. The treatment was carried out at 37 ° C. for 2 hours. After removing excess bromoacetaldehyde or chloroacetaldehyde by diethyl ether extraction, the aqueous layer was dried and the obtained residue was subjected to measurement by HPLC or LC-MSMS. Similarly, bromoacetaldehyde or chloroacetaldehyde was added to the microRNA200-c-5p (human sequence / single strand) synthesized so as to contain the above-mentioned methylated adenine and methylated cytosine, and treated at 37 ° C. for 2 hours. And mass spectrometry was performed with a MALDI type mass spectrometer according to the above-mentioned means, and the effectiveness of derivatization was confirmed.
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