JP2020146034A - Tertプロモーター変異を検出するプローブセット - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 以下の2種類のプローブを含む、TERTプロモーター変異の検出用プローブセット。
(1)配列番号1で示されるヌクレオチド配列又は該配列に相補的なヌクレオチド配列からなるプローブ、及び
(2)配列番号2で示されるヌクレオチド配列又は該配列に相補的なヌクレオチド配列からなるプローブ
[2] 上記各プローブに標識物質が結合されていることを特徴とする、[1]に記載のプローブセット。
[3] 前記標識物質が蛍光色素であり、かつ前記各プローブにクエンチャーが結合されていることを特徴とする、[2]に記載のプローブセット。
[4] 各プローブが糖−リン酸骨格の1種以上の修飾を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載のプローブセット。
[5] 各プローブの40%以上のヌクレオチド残基が修飾されたものである、[4]に記載のプローブセット。
[6] 前記修飾が、糖の2’位の酸素原子と4’位の炭素原子とのメチレンを介した架橋である、[4]又は[5]に記載のプローブセット。
[7] 以下の工程(1)〜(4)を含む、TERTプロモーターの変異を検出する方法。
(1)[3]〜[6]のいずれかに記載のプローブセットと、TERTプロモーターの標的領域を含む核酸とを接触させる工程、
(2)該標的領域を含む領域をPCRにより増幅する工程、
(3)前記工程(2)で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程、及び
(4)前記(3)の測定結果に基づき、TERTプロモーターの変異を検出する工程
[8] 前記PCRがデジタルPCRである、[7]に記載の方法。
[9] [1]〜[6]のいずれかに記載のプローブセット、並びにTERTプロモーターの標的領域を増幅可能な2種類のPCRプライマーセットを含む、TERTプロモーター変異の検出用キット。
[10] 前記プライマーの一方が、
(1)配列番号5で示されるヌクレオチド配列、又は
(2)上記(1)の配列において、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された配列
からなり、かつ前記プライマーのもう一方が、
(3)配列番号6で示されるヌクレオチド配列、又は
(4)前記(3)の配列において、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された配列
からなる、[9]に記載のキット。
本発明は、変異配列を検出するプローブ(「変異型プローブ」又は「mut probe」ともいう)と、野生型配列を検出するプローブ(「野生型プローブ」又は「wt probe」ともいう)を含む、TERTプロモーターの変異の検出用プローブセット(以下「本発明のプローブセット」と称することがある)を提供する。以下では、変異型プローブと野生型プローブを纏めて、「本発明のプローブ」と称することがある。
別の態様において、本発明は、上記1.で記載の本発明のプローブセットを用いたTERTプロモーター変異の検出方法(以下「本発明の検出方法」と称することがある)を提供する。変異の検出又は測定法は、特に限定されるものではないが、例えば、PCR法を用いた方法が挙げられる。また、本明細書において、TERTプロモーター変異の検出方法には、TERTプロモーター変異の検出を補助する方法も包含されるものである。
(1)本発明のプローブセットと、TERTプロモーターの標的領域を含む核酸とを接触させる工程、
(2)該標的領域を含む領域をPCRにより増幅する工程、
(3)工程(2)で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程、及び
(4)前記(3)の測定結果に基づき、TERTプロモーターの変異を検出する工程
別の態様において、本発明は、本発明のプローブセット、及びTERTプロモーターの標的領域を増幅可能な2種類のPCRプライマーセットを含む、TERTプロモーターの変異検出用キット(以下「本発明のキット」と称することがある)を提供する。かかるPCRプライマーの具体例については、上記2.に記載の通りである。本発明のキットには、PCRに必要な他の試薬を含んでいてもよい。前記試薬が、本発明のプローブセット及び/又はプライマーセットと共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない試薬である場合には、プローブセット及び/又はプライマーセットと混合してキットに含めることができる。あるいは、前記試薬と本発明のプローブ及び/又はプライマーセットとは混合せずに別個で提供されてもよい。前記試薬としては、DNA抽出用試薬、DNAポリメラーゼ、dNTP、反応緩衝液、PCRの陽性コントロールとなる標的領域を含む核酸、容器、器具、説明書などが挙げられる。
上記2.で記載した本発明の検出方法の結果、被験哺乳動物において、TERTプロモーターに変異が検出された場合、該被験哺乳動物に投与すべき甲状腺がんの治療薬又は予防薬(以下では纏めて「治療薬」と称する)を選択(又は決定)し、該被験哺乳動物に治療上又は予防上有効量の該治療薬を投与することにより、甲状腺がんを治療又は予防することができる。あるいは、外科手術により、甲状腺を全摘出するか、一部分を摘出すること、又は放射線療法により、甲状腺がんを治療することができる。本明細書において、「治療薬」には、甲状腺がんの根治治療を目的とする医薬だけでなく、例えば、これらの疾患の進行抑制を目的とする医薬又は症状の軽減を目的する医薬も含まれるものとする。治療又は予防の対象となる甲状腺がんとしては、例えば、乳頭がん、濾胞がん、髄様がん、未分化がん、悪性リンパ腫などが挙げられる。
<手順>
1.PTCサンプル及び患者情報
2001年11月から2017年12月の間に長崎大学病院(長崎県)と隈病院(神戸市)で行われた159個のPTCサンプルを収集した。臨床病理学的データを患者の医療記録から収集した。手術時の患者の年齢は14〜81歳であった(年齢の中央値:54歳、男性17.0%)。病期分類には、AJCC/TNM病期分類システム(第8版)を用いた。それらの組織学的なサブタイプは以下の通りである:146個は古典的Nippon GenePTC(25個は微小がんであった)、10個は濾胞型(follicular variant)PTC(4個は微小がんであった)、2個はびまん性硬化型(diffuse sclerosing variant)PTC、及び1個は高細胞型(tall cell variant)PTCであった。研究プロトコルは、長崎大学及び隈病院の施設内倫理委員会により承認された。各患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。外科手術中に新鮮な腫瘍組織サンプルを採取し、液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存した。ISOGEN試薬(ニッポンジーン)を用いて、メーカーの説明書に従いDNA及び全RNAを同時に抽出した。
BRAFの変異の状態(c.1799A>T付近)及びTERTのプロモーター領域を、以前に記載したように(Matsuse M. et al., Sci Rep, 7:41752 (2017))、直接DNAシーケンシング(サンガー法)により分析した。
High Capacity RNA-to-cDNAキット(アプライドバイオシステムズ)を用いて全RNAを逆転写した。以下のPCR反応は、Thermal Cycler Dice real-time system(タカラバイオ)により、SYBR Premix Ex Taq II(タカラバイオ)を用いて行った。二次微分法を用いて決定したサイクル閾値(CT)値を用いて相対的な発現を計算した。TERT mRNAレベルを、TATA結合タンパク質(TBP)のmRNA発現を参照として用いて正規化した。プライマー配列は次の通りである:TERT ex 6-7 F;5'-AGCCACGTCTCTACCTTGAC-3'(配列番号5)及びTERT ex7-8 R;5'-CTCATTCAGGGAGGAGCTCT-3'(配列番号6)、TBP ex2 F;5’-CCTGCCACCTTACGCTCAG-3’(配列番号7)及びTBP ex3 R;5'-TGGTGTTCTGAATAGGCTGTGG-3'(配列番号8)。
ddPCRを、QX100 Droplet Generator(バイオ・ラッド)、C1000 Touch thermal cycler(バイオ・ラッド)、及びQX100 droplet reader(バイオ・ラッド)により、ddPCR Supermix for Probes(バイオ・ラッド)を用いてddPCRを行った。ddPCRに用いたプローブは、次の通りである:TERT mut; 5’-/56-FAM/C+CC+C+T+TC+CGG(配列番号3)/3IABkFQ/-3’及びTERT wt 228;5’-/5HEX/C+CC+C+C+TC+CGG(配列番号4)/3IABkFQ/-3’(+の後ろの塩基は、ロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)である)。プライマーは直接DNAシーケンシングで用いたものと同じである。TERT mutプローブは、C228T及びC250Tの両方に結合することができるが、wtプローブはC228のみに結合することができるため、上記の2つのプローブを同時に用いた二次元(2D)表示において、C228TとC250Tとを区別することが可能となる(図2)。C250T変異の場合、FAM及びHEXシグナルの両方が検出され、一方で変異がC228Tの場合、FAMシグナルのみが検出される。配列番号3で示されるヌクレオチド配列において、各糖−リン酸骨格が修飾されていないものを配列番号1として示す。同様に、配列番号4で示されるヌクレオチド配列において、各糖−リン酸骨格が修飾されていないものを配列番号2として示す。
疾患の再発は、最初の治療から6ヶ月以内に、外科的に切除され、超音波、シンチグラフィー又は他のイメージングにより病理学的に確認された、局所病変又は局所転移/遠隔転移として定義した。再発までの時間を、再手術日又は医用画像による再発検出日に基づいて計算した。
カテゴリーデータ分析には、単変量フィッシャー又はフィッシャー・フリーマン・ハルトンの正確確率検定を用いた。SASのCOMPPROPマクロ(http://www2.sas.com/proceedings/sugi31/204-31.pdf)を使用して、3つ以上のグループの比率のペアワイズ統計比較(Pairwise statistical comparison)を行った。ノンパラメトリックマン・ホイットニー(Nonparametric Mann-Whitney)検定又はクラスカルワリス(Kruskal-Wallis)検定、及びそれに次ぐ連続データのためのDwass, Steel, Critchlow-Fligner多重比較法を用いて、異なるPTCサブグループの特性を比較した。無再発生存期間(RFS)を分析するために、カプラン−マイヤー法及び対数順位検定を用いた。RFSに影響を与える要因を、コックス比例ハザードモデルで評価した。TERTの発現レベルの閾値を決定するために、ハザード比(HR)を5パーセンタイル刻みに増加させて計算した。多変量ロジスティック回帰モデルを、甲状腺被膜外浸潤(ETE:extrathyroidal extension)又はpTカテゴリに関連付けられている要因を同定するために用いた。ごく少数の結果(1セルあたり5未満)の分析、又は準完全分離が観察された場合の分析は、偏りを減らすペナルティー付きの最大尤度(penalized maximum likelihood)を適合させるためのFirthアプローチ(Firth's approach)を用いて行った。赤池の情報量基準を用いて、非自動のモデル最適化を日常的に行った。自動最適化に修正可能なモデルに、段階的な変数選択を適用した。最も適切なモデルが決定されると、それぞれのパラメータの最大尤度推定値及びそれらのWald型の95%信頼区間が計算された。統計的評価は、9.4M5バージョンのSAS用のSAS Studio(3.71リリース)(SAS Institute)又はIBM SPSS Statisticsバージョン24ソフトウェア(IBM)を用いて行った。GraphPad Prism 6(GraphPad)を用いてグラフを作成した。全てのp値は両側であり、p<0.05の場合に有意とみなした。
まず、直接DNAシーケンシングにより、TERTプロモーター領域(C228T及びC250T)の変異について、159個のPTCサンプルをスクリーニングした。TERTプロモーターの変異は、20(12.6%)のサンプルで認められ、それらの全てはC228Tであり、進行中のシリーズでは、C250Tは認められなかった。次に、リアルタイムqRT-PCRによりTERT mRNAの発現を調べた。TERTの発現は、全てのTERTプロモーターの変異が陽性のサンプルで確認された。興味深いことに、139個の変異が陰性のサンプルにさえ、56個(40.3%)がTERTの発現を示した。次に、通常のシーケンシングでは検出できないTERTプロモーターの変異の対立遺伝子頻度が低い腫瘍が存在する可能性を探求した。変異の存在を高感度で調べるために、ddPCRを用いた。まず、野生型プロモーターのPCR産物中のC228T又はC250Tを含むTERTプロモーター領域のPCR産物の系列希釈を用いて、TERTプロモーター変異に対するddPCRの検出限界を決定した。変異の対立遺伝子頻度の検出限界は約0.25%であった(図3)。次に、ddPCRを用いて56個のTERTを発現するサンプルを分析した。3つのサンプル(5.4%)において、対立遺伝子頻度が低い変異を同定し、以後PTC A、B及びCとした(図4A)。2D表示によると、全てC228T変異を有していた。PTC A、B及びCの変異の対立遺伝子頻度は、それぞれ17%、10%、及び5%であった(表1)。腫瘍組織は、腫瘍細胞だけでなく、間質細胞、内皮細胞、及び血液細胞も含むため、腫瘍細胞における突然変異対立遺伝子頻度は、TERTプロモーター変異とBRAFT1799A変異との比率に基づく腫瘍密度について補正された。なぜなら、議論はあるものの、BRAFT1799A変異は腫瘍細胞におけるクローンのヘテロ接合変異であると考えられるためである。補正後、腫瘍細胞におけるTERTプロモーター変異の対立遺伝子頻度は次の通りであった:PTC A;14%、PTC B;4%、PTC C;3%であるが、これらの数値は、それぞれ28%、8%及び6%の腫瘍細胞がPTC A、B及びCにおいてTERTプロモーター変異を有することを意味する(表1)。次に、これらのサンプルの直接DNAシーケンシングのクロマトグラムを遡及的に確認した。C228Tの極小ピークが見られたが(図4B)、これらのシグナルと、バックグラウンドシグナルとを確信をもって区別することは不可能であった。直接DNAシーケンシング、発現解析、及びddPCRの結果を図5A〜Cにまとめた。
TERTプロモーターの変異/発現の状態と臨床病理学的特徴との関連性を分析した。159症例を3つのグループに分類した:TERTプロモーター変異が陰性/mRNA発現が陰性のグループ(mut-/exp-)、TERTプロモーター変異が陰性/mRNA発現が陽性のグループ(mut-/ exp+)、及びTERTプロモーター変異が陽性のグループ(mut +/exp+)。表2に示すように、変異(mut+/exp+)を有する腫瘍は、他の2つのグループ(mut-/exp-及びmut-/exp +)と比較して、年齢、甲状腺被膜外浸潤、ステージII/III/IVにおいて、統計的に有意な差を示した)(1対3及び2対3)。これらの知見から、TERTプロモーター変異がPTCに侵襲性の性質を付与することが示唆される。
次に、本発明のプローブと穿刺吸引細胞診針洗浄液を用いた場合のTERTの変異検出結果と、摘出標本(surgical specimen)での評価結果とを比較することで、該プローブの変異検出の感度(Sensitivity)、特異度(Specificity)、陽性的中度(Positive predictive value)、陰性的中度(Negative predictive value)を解析した。まず、細胞診の針をRNAlater(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)で洗浄し、患者の甲状腺から採取した細胞抽出物をスピンダウンして細胞を沈殿させた。次に、ISOGEN試薬(ニッポンジーン)を用いてDNAを抽出し、ddPCRを行った。なお、本実施例で用いたプローブ及びddPCRのプライマー、並びにddPCRの方法は実施例1と同じである。
Claims (10)
- 以下の2種類のプローブを含む、TERTプロモーター変異の検出用プローブセット。
(1)配列番号1で示されるヌクレオチド配列又は該配列に相補的なヌクレオチド配列からなるプローブ、及び
(2)配列番号2で示されるヌクレオチド配列又は該配列に相補的なヌクレオチド配列からなるプローブ - 上記各プローブに標識物質が結合されていることを特徴とする、請求項1に記載のプローブセット。
- 前記標識物質が蛍光色素であり、かつ前記各プローブにクエンチャーが結合されていることを特徴とする、請求項2に記載のプローブセット。
- 各プローブが糖−リン酸骨格の1種以上の修飾を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプローブセット。
- 各プローブの40%以上のヌクレオチド残基が修飾されたものである、請求項4に記載のプローブセット。
- 前記修飾が、糖の2’位の酸素原子と4’位の炭素原子とのメチレンを介した架橋である、請求項4又は請求項5に記載のプローブセット。
- 以下の工程(1)〜(4)を含む、TERTプロモーターの変異を検出する方法。
(1)請求項3〜6のいずれか1項に記載のプローブセットと、TERTプロモーターの標的領域を含む核酸とを接触させる工程、
(2)該標的領域を含む領域をPCRにより増幅する工程、
(3)前記工程(2)で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程、及び
(4)前記(3)の測定結果に基づき、TERTプロモーターの変異を検出する工程 - 前記PCRがデジタルPCRである、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のプローブセット、並びにTERTプロモーターの標的領域を増幅可能な2種類のPCRプライマーセットを含む、TERTプロモーター変異の検出用キット。
- 前記プライマーの一方が、
(1)配列番号5で示されるヌクレオチド配列、又は
(2)上記(1)の配列において、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された配列
からなり、かつ前記プライマーのもう一方が、
(3)配列番号6で示されるヌクレオチド配列、又は
(4)前記(3)の配列において、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された配列
からなる、請求項9に記載のキット。
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Cited By (1)
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