JP2020139770A - Diagnostic index of parkinson disease - Google Patents

Abstract

To provide a simple diagnostic method of Parkinson disease.SOLUTION: A method for providing information to determine a possibility that a subject suffers from a Parkinson disease includes the steps of: (i) measuring a p3-Alcα level in a body fluid specimen of a subject; (ii) comparing a p3-Alcα level in a body fluid specimen of a negative contrast measured in the same way with a p3-Alcα level measured in (i); and (iii) providing information that a subject at a p3-Alcα level being higher compared with a p3-Alcα level of a negative contrast has a higher possibility of suffering from a Parkinson disease.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、パーキンソン病の診断の領域に関する。 The present invention relates to the area of diagnosis of Parkinson's disease.

パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）は進行性の神経変性疾患であり、黒質ドパミン神経の変性により投射先の線条体においてドパミンが減少し、これに起因する安静時振戦・筋固縮・無動・姿勢障害等を主徴とする。６０才以上では１％程度の有病率を表するコモンディジーズであり、超高齢化社会の健全性を維持する上で克服すべき疾病の一つである。しかしながら、その診断には病識認知後の精密検査が必要であり、簡便な診断マーカーが求められている。こうしたＰＤ診断指標として、これまでにαアドレナリン受容体作動薬含有点眼剤と、ノルアドレナリン再取り込み阻害薬及び／又はノルアドレナリン放出薬含有点眼剤とを用いた診断薬（特許文献１）、神経栄養因子である血液中のＮＲＧ１タイプＩＩＩの濃度を測定する方法（特許文献２）、脳脊髄液サンプル中の可溶性α−シヌクレインオリゴマー量を測定する方法（特許文献３）、皮膚ガス又は汗中のベンジルアルコール等の量を測定する方法（特許文献４）生体由来試料中の中鎖〜長鎖アシルカルニチン及び２次胆汁酸から選ばれる成分の濃度を測定する方法（特許文献５）が報告されている。しかしながら、これらは採取時の侵襲性が高い脳脊髄液を検体としたり高価な検査機器が必要とされたりする等の問題があり、より簡便性の高い指標が求められている。 Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disease in which degeneration of the substantia nigra dopaminergic nerve reduces dopamine in the striatum to which it is projected, resulting in resting tremor and muscle stiffness. The main symptoms are contraction, immobility, and posture disorders. It is a common disease with a prevalence of about 1% for people aged 60 and over, and is one of the diseases that must be overcome in order to maintain the soundness of a super-aging society. However, the diagnosis requires a detailed examination after recognition of the disease, and a simple diagnostic marker is required. As such PD diagnostic indicators, diagnostic agents using α-adrenergic receptor agonist-containing eye drops, noradrenaline reuptake inhibitors and / or noradrenaline-releasing drug-containing eye drops (Patent Document 1), and neuronutrient factors have been used. A method for measuring the concentration of NRG1 type III in a certain blood (Patent Document 2), a method for measuring the amount of soluble α-sinucrane oligomer in a cerebrospinal fluid sample (Patent Document 3), benzyl alcohol in skin gas or sweat, etc. Method for measuring the amount of (Patent Document 4) A method for measuring the concentration of a component selected from medium- to long-chain acylcarnitine and secondary bile acid in a biological sample (Patent Document 5) has been reported. However, these have problems such as using highly invasive cerebrospinal fluid at the time of collection as a sample and requiring expensive testing equipment, and a more convenient index is required.

アルカデイン（Ａｌｃａｄｅｉｎ：以下、「Ａｌｃ」という）は、主に神経細胞に発現している、進化的に保存されたタイプＩ膜タンパク質のファミリーから構成される。Ａｌｃは、神経特異的アダプタータンパク質Ｘ１１Ｌ結合タンパク質（非特許文献１）、及び、シナプス後のＣａ２＋結合タンパク質（カルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）とも呼ばれている）（非特許文献２）の両方として個別に同定されてきた。哺乳類では、Ａｌｃには次の４つの異性体が報告されている：Ａｌｃα１（ヒトでは９７１アミノ酸）、Ａｌｃα２（ヒトでは９８１アミノ酸）、Ａｌｃβ（ヒトでは９５６アミノ酸）、及び、Ａｌｃγ（ヒトでは９５５アミノ酸）（非特許文献３）。Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγは、独立した遺伝子によりコードされる一方、Ａｌｃα１及びＡｌｃα２はＡｌｃα遺伝子のスプライスバリアントである。 Arcadein (hereinafter referred to as "Alc") is composed of a family of evolutionarily conserved type I membrane proteins that are mainly expressed in nerve cells. Alc has been individually identified as both a nerve-specific adapter protein X11L binding protein (Non-Patent Document 1) and a post-synaptic Ca2 + binding protein (also referred to as calcintenin) (Non-Patent Document 2). I came. In mammals, the following four isomers of Alc have been reported: Alcα1 (971 amino acids in humans), Alcα2 (981 amino acids in humans), Alcβ (956 amino acids in humans), and Alcγ (955 amino acids in humans). ) (Non-Patent Document 3). Alcα, Alcβ, and Alcγ are encoded by independent genes, while Alcα1 and Alcα2 are spliced variants of the Alcα gene.

ＡＰＰのｐ３ドメインに該当する、Ａｌｃα由来の短鎖ペプチド（以下、「ｐ３−Ａｌｃα」という）が、Ａｌｃ ＣＴＦのγセクレターゼによる切断により分泌されることから、Ａｌｃの二次切断（Ａｌｃ ＣＴＦの切断）には、プレセニン（以下、「ＰＳ」という）依存性γセクレターゼが関与していることが報告されている。（特許文献６）。 Since the short-chain peptide derived from Alcα (hereinafter referred to as “p3-Alcα”) corresponding to the p3 domain of APP is secreted by cleavage of Alc CTF by γ-secretase, secondary cleavage of Alc (cleavement of Alc CTF) It has been reported that presenin (hereinafter referred to as "PS") -dependent γ-secretase is involved in). (Patent Document 6).

また、細胞培養実験により、野生型及び家族性アルツハイマー病関連ＰＳ１変異の発現は、延長し又は短縮したｐ３−Ａｌｃ種を生成させるような切断を生じ、変異型ＰＳ１が産生するＡβの分子種の比率を変化させるのと同様に、ｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−ＡｌｃγのＣ末断端が異なる分子種の産生比率変化をひき起こすこと、及び、プレセニリンの変異型を有する家族性アルツハイマー病患者の脳髄液中のｐ３−Ａｌｃα、ｐ３−Ａｌｃβ、及び、ｐ３−Ａｌｃγについても検出される分子種比率変化が認められることが報告されている（特許文献７）。 In addition, in cell culture experiments, the expression of wild-type and familial Alzheimer's disease-related PS1 mutations resulted in cleavage that produced prolonged or shortened p3-Alc species, and the Aβ molecular species produced by the mutant PS1. Similar to changing the ratio, the C-terminal stump of p3-Alcα, p3-Alcβ, and p3-Alcγ causes a change in the production ratio of different molecular species, and familial with a mutant form of presenilin. It has been reported that changes in the molecular species ratio detected in p3-Alcα, p3-Alcβ, and p3-Alcγ in the cerebral spinal fluid of patients with Alzheimer's disease are also observed (Patent Document 7).

特開２００５−１６２６９３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-162693 特開２０１３−１８１８２３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2013-181823 特表２０１３−５０４７６６号公報Special Table 2013-504766 特開２０１５−５５６２０号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-55620 特開２０１７−１３８１４１JP-A-2017-138141 国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７International Publication WO 2005/0444847 国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４International Publication WO2009 / 075084

Ｋａｎａｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４４，１７−２６．Kanai, et al. , (1998) Ann. Neurol. 44, 17-26. Ｇｒａｆｆ−Ｒａｄｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６４，３５４−３６２．Graff-Radford, et al. , (2007) Arch. Neurol. 64,354-362. Ａｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９４５８．Araki, et al. , (2003) J.M. Biol. Chem. 278, 49448-49458.

本発明は、パーキンソン病のより簡便な診断方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a simpler method for diagnosing Parkinson's disease.

本発明者らは、ＰＤ患者に特徴的なバイオマーカーについて探索した結果、中枢神経系に発現する１回膜貫通型タンパク質Ａｌｃαの限定分解代謝物であるｐ３−ＡｌｃαがＰＤ患者の血液中に高レベルで存在することを見出し、新たな血液診断マーカーとなり得ることを初めて見出した。更に、本発明者らは、これまでｐ３−Ａｌｃαの測定に必要であったクロロホルム・メタノール抽出が、血中のｐ３−Ａｌｃα測定においては不要であることを見出した。これにより、血液を希釈するのみでＰＤ診断に用いることができることから、従来の方法と比較してより簡便で迅速なＰＤの血液診断を提供することに成功した。 As a result of searching for biomarkers characteristic of PD patients, the present inventors have high levels of p3-Alcα, which is a limited degradation metabolite of the single transmembrane protein Alcα expressed in the central nervous system, in the blood of PD patients. For the first time, we have found that it exists at the level and that it can be a new blood diagnostic marker. Furthermore, the present inventors have found that the extraction of chloroform / methanol, which has been necessary for the measurement of p3-Alcα, is not necessary for the measurement of p3-Alcα in blood. As a result, since it can be used for PD diagnosis only by diluting blood, we have succeeded in providing a simpler and faster PD blood diagnosis as compared with the conventional method.

本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、以下の発明に関する：
（１） 被検者がＰＤに罹患している可能性を判定するための情報を提供する方法であって、
（ｉ）該被検者の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定すること、
（ｉｉ）同様に測定された陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルと前記（ｉ）で測定されたｐ３−Ａｌｃαレベルとを比較すること、
（ｉｉｉ）陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者をＰＤに罹患している可能性が高いとの情報が提供される方法、
ここで、前記陰性対照は、ＰＤに罹患していない者又は健常者である。
（２） 陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルが、複数の陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルの平均値＋２標準偏差である、（１）に記載の方法。
（３） ｐ３−Ａｌｃαレベルの測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡにより行われることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 体液検体が血液検体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５） 血液検体がクロロホルム・メタノール抽出されていないことを特徴とする、（４）に記載の方法。
（６） ＰＤの治療方法であって、
（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法により被検者がＰＤに罹患している可能性を判定するための情報を提供すること、及び
ＰＤに罹患している可能性が高いとの情報が提供された被検者にＰＤ治療薬を投与することを含む方法。
（７） 被検者由来の血液中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定する方法であって、
該被検者の血液検体を調製すること、及び
前記血液検体中のｐ３−ＡｌｃαレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定することを含む方法。
（８） 前記血液検体がクロロホルム・メタノール抽出されていないことを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９） ｐ３−Ａｌｃαからなるパーキンソン病のバイオマーカー。
（１０） ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする、パーキンソン病に罹患している可能性を判定するためのキット。
（１１） ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化されたハプテンもしくは不溶性担体、をさらに含むことを特徴とする（１０）に記載のキット。
（１２） （ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする（１０）に記載のキット。
（１３） 標識と反応する基質をさらに含む（１２）に記載のキット。
（１４）（１）ヒトｐ３−Ａｌｃと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（２）ヒトｐ３−Ａｌｃと特異的に結合する第二抗体が固定化されたハプテン、
を含むことを特徴とする（１０）に記載のキット。
（１５） 前記ハプテンと特異的に結合する、標識された物質をさらに含むことを特徴とする（１４）に記載のキット。 The present invention has been completed based on such findings, and relates to the following inventions:
(1) A method for providing information for determining the possibility that a subject has PD.
(I) Measuring the p3-Alcα level in the body fluid sample of the subject,
(Ii) Comparing the p3-Alcα level in the negative control body fluid sample measured in the same manner with the p3-Alcα level measured in (i) above.
(Iii) A method by which information is provided that a subject showing higher p3-Alcα levels compared to a negative control is more likely to have PD.
Here, the negative control is a person who does not suffer from PD or a healthy person.
(2) The method according to (1), wherein the p3-Alcα level in the body fluid sample of the negative control is the average value + 2 standard deviations of the p3-Alcα level of a plurality of negative controls.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the measurement of p3-Alcα level is performed by sandwich ELISA.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the body fluid sample is a blood sample.
(5) The method according to (4), wherein the blood sample is not extracted with chloroform / methanol.
(6) PD treatment method
To provide information for determining the possibility that the subject has PD by the method according to any one of (1) to (5), and the possibility that the subject has PD. A method that involves administering a PD treatment to a subject for whom information is provided that it is high.
(7) A method for measuring the p3-Alcα level in blood derived from a subject.
A method comprising preparing a blood sample of the subject and measuring p3-Alcα levels in the blood sample by sandwich ELISA.
(8) The method according to (7), wherein the blood sample is not extracted with chloroform / methanol.
(9) A biomarker for Parkinson's disease consisting of p3-Alcα.
(10) Parkinson's disease, wherein the first antibody that specifically binds to human p3-Alcα contains a carrier selected from the group consisting of a solid phase, a hapten, magnetic beads, and an insoluble carrier. A kit for determining the possibility of suffering from.
(11) The description according to (10), further comprising a labeled second antibody that specifically binds to human p3-Alcα, or a hapten or insoluble carrier on which the second antibody is immobilized. kit.
(12) (i) A carrier selected from the group consisting of a solid phase on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized, a hapten, magnetic beads and an insoluble carrier, and (ii) human p3- A labeled secondary antibody that specifically binds to Alcα,
The kit according to (10), which comprises.
(13) The kit according to (12), which further comprises a substrate that reacts with the label.
(14) (1) A carrier selected from the group consisting of a solid phase on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alc is immobilized, magnetic beads and an insoluble carrier, and (2) human p3-Alc. A hapten on which a second antibody that specifically binds is immobilized,
The kit according to (10), which comprises.
(15) The kit according to (14), which further comprises a labeled substance that specifically binds to the hapten.

本発明の方法は血液検体を用いてＰＤの診断が可能であることから、また、診療や検診の際に行われる採血で実施することができることから、早期かつ簡便なＰＤの発見に寄与する。 Since the method of the present invention can diagnose PD using a blood sample and can be carried out by blood sampling performed at the time of medical treatment or examination, it contributes to the early and simple discovery of PD.

健常者４０人とＰＤと診断された患者２７人の血漿中のｐ３−Ａｌｃα濃度を測定した結果を示すグラフである。Ｎｏｒｍａｌは健常者、ＰＤはＰＤと診断された患者を示す。縦軸はｐ３−Ａｌｃαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ＰＤ患者において血漿中のｐ３−Ａｌｃα濃度が有意に高値を示した。It is a graph which shows the result of having measured the p3-Alcα concentration in the plasma of 40 healthy subjects and 27 patients diagnosed with PD. Normal indicates a healthy person, and PD indicates a patient diagnosed with PD. The vertical axis represents the concentration of p3-Alcα (pg / mL). Plasma p3-Alcα concentration was significantly higher in PD patients. 血漿希釈サンプルと血漿をクロロホルム・メタノール抽出したサンプルの測定値を比較したグラフである。黒色が血漿希釈サンプルを示し、灰色が血漿からロホルム・メタノール抽出したサンプルを示す。縦軸はｐ３−Ａｌｃαの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。横軸のＡ〜Ｅはサンプルが由来した異なる個人を示す。It is a graph which compared the measured value of the plasma diluted sample and the sample which extracted plasma with chloroform / methanol. Black indicates a plasma diluted sample, and gray indicates a sample extracted from plasma with loform / methanol. The vertical axis represents the concentration of p3-Alcα (pg / mL). A to E on the horizontal axis indicate different individuals from which the sample was derived.

（ｐ３−Ａｌｃα）
本願において「ｐ３−Ａｌｃα」とは、ヒトＡｌｃα（配列番号１）がα−セクレターゼにより一次切断を受けて生じたＡｌｃの細胞結合型Ｃ末端断片（ａｌｃａｄｅｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、以下「ＣＴＦ」という）が、更に膜間部切断プロテアーゼ（γ−セクレターゼ）により二次切断されて生じたＣＴＦのＮ末端側のペプチド断片である。アルカデインのαセクレターゼ切断部位及びγセクレターゼ切断部位として複数の部位が存在する（国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７及び国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４参照）ことから、ｐ３−Ａｌｃとしては複数種類が存在し得る。よって、ｐ３−ＡｌｃαのＮ末端のアミノ酸としては、Ａｌｃαの８１５〜８１７番目のアミノ酸、又は当該アミノ酸に近接する１〜数個隣のアミノ酸（すなわち、Ａｌｃαの８１２〜８２０番目のアミノ酸）であってもよい。また、ｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸長としては、３０〜４５アミノ酸であり、好ましくは、３２〜４２アミノ酸、又は３４〜４０アミノ酸である。具体的には、ｐ３−Ａｌｃαは、ｐ３−Ａｌｃα３４（配列番号２）、ｐ３−Ａｌｃα３５（配列番号３）、ｐ３−Ａｌｃα３６（配列番号４）、ｐ３−Ａｌｃα３７（配列番号５）、ｐ３−Ａｌｃα３８（配列番号６）、ｐ３−Ａｌｃα３９（配列番号７）、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３５（配列番号８）、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３８（配列番号９）、ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋３９（配列番号１０）、及びｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋４０（配列番号１１）を含む（国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４参照）。ここで、「ｐ３−ＡｌｃαＸ」とは、Ａｌｃα１の８１７番目のアラニン（Ａ）から（８１６＋Ｘ）番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するＸ個のアミノ酸からなるペプチドを意味する。また、「ｐ３−Ａｌｃα２Ｎ＋Ｙ」とは、Ａｌｃαの８１５番目のメチオニン（Ｍ）から（８１４＋Ｙ）番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するＹ個のアミノ酸からなるペプチドを意味する。本明細書においてｐ３−Ａｌｃαとは、これらの全てのｐ３−Ａｌｃα種を包含する。例えば、ｐ３−Ａｌｃαは、全てのｐ３−Ａｌｃα種、２種類又はそれ以上のｐ３−Ａｌｃα種、又は１種類のｐ３−Ａｌｃαであってもよく、好ましくは全てのｐ３−Ａｌｃα種である。また、ヒトＡｌｃαは個体差により配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１〜数個又はそれ以上の変異を含んでいる可能性がある。よって、本願のｐ３−Ａｌｃαは、厳密に配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部である必要はなく、ヒトＡｌｃαがα−セクレターゼとγ−セクレターゼにより切断されて生じたペプチド断片である限り、このようなヒトＡｌｃαの変異に由来する変異を含んでいてもよい。 (P3-Alcα)
In the present application, "p3-Alcα" refers to a cell-linked C-terminal fragment of Alc (arcadein carboxyl tertiary flagments, hereinafter referred to as "CTF") produced by primary cleavage of human Alcα (SEQ ID NO: 1) by α-secretase. Further, it is a peptide fragment on the N-terminal side of CTF produced by secondary cleavage by an intermembrane cleavage protease (γ-secretase). Since there are a plurality of sites as α-secretase cleavage sites and γ-secretase cleavage sites of arcadein (see International Publication WO2005 / 044847 and International Publication WO2009 / 075084), there may be a plurality of types of p3-Alc. Therefore, the N-terminal amino acid of p3-Alcα is the 815-817th amino acid of Alcα, or one to several adjacent amino acids adjacent to the amino acid (that is, the 812-820th amino acid of Alcα). May be good. The amino acid length of p3-Alcα is 30 to 45 amino acids, preferably 32 to 42 amino acids, or 34 to 40 amino acids. Specifically, p3-Alcα is p3-Alcα34 (SEQ ID NO: 2), p3-Alcα35 (SEQ ID NO: 3), p3-Alcα36 (SEQ ID NO: 4), p3-Alcα37 (SEQ ID NO: 5), p3-Alcα38 (SEQ ID NO: 5). SEQ ID NO: 6), p3-Alcα39 (SEQ ID NO: 7), p3-Alcα2N + 35 (SEQ ID NO: 8), p3-Alcα2N + 38 (SEQ ID NO: 9), p3-Alcα2N + 39 (SEQ ID NO: 10), and p3-Alcα2N + 40 (SEQ ID NO: 11). (See International Publication WO2009 / 075084). Here, "p3-AlcαX" means a peptide consisting of X amino acids having an amino acid sequence from the 817th alanine (A) to the (816 + X) amino acid of Alcα1. Further, "p3-Alcα2N + Y" means a peptide consisting of Y amino acids having an amino acid sequence from the 815th methionine (M) to the (814 + Y) amino acid of Alcα. As used herein, the term p3-Alcα includes all of these p3-Alcα species. For example, p3-Alcα may be all p3-Alcα species, two or more p3-Alcα species, or one type of p3-Alcα species, preferably all p3-Alcα species. In addition, human Alcα may contain one to several or more mutations in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 due to individual differences. Therefore, p3-Alcα of the present application does not have to be strictly a part of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, as long as human Alcα is a peptide fragment produced by cleavage by α-secretase and γ-secretase. Mutations derived from such human Alcα mutations may be included.

（体液検体）
本願において、体液検体とは、ヒトの体液そのもの又は体液を処理して得られる検体を意味する。体液としては、血液（血漿、血清）、脳脊髄液、リンパ液、尿、漿液、関節液、眼房水、涙液、唾液等を挙げることができる。体液を処理して得られる検体としては、体液の分画物若しくは処理物を挙げることができる。検出用検体は、被検者から採取した検体の種類及び検出方法に応じて適宜調製することができる。例えば脳脊髄液のようにそのまま検出に使用できる場合、適宜遠心分離、希釈等により検出用検体を調整してもよい。また、血液のように被検者から採取した検体中に検出を阻害する物質が含まれる場合には、前処理（例えば、プロテインＧカラムによるイムノグロブリン除去）によって阻害物質を除去／不活化して検出用検体を調整してもよい。また、血液検体の場合、低極性有機溶媒及び親水性有機溶媒（双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒及び双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒であり、典型的には、クロロホルム：メタノール）により脱脂処理された検体であってもよい。あるいは、体液検体は、体液から所望のｐ３−Ａｌｃαを分離した分離検体であってもよい。体液からのｐ３−Ａｌｃαの分離は、ペプチドの分離に使用される方法であって、当業者周知の方法により行うことができ、例えば、免疫沈降、ウエスタンブロット、又は、アフィニティクロマトグラフィ等により行うことができる。好ましくは、体液は血液であり、クロロホルム：メタノールによる脱脂処理はされない検体である。 (Body fluid sample)
In the present application, the body fluid sample means a human body fluid itself or a sample obtained by processing a body fluid. Examples of body fluids include blood (plasma, serum), cerebrospinal fluid, lymph, urine, serous fluid, joint fluid, aqueous humor, tears, saliva and the like. Examples of the sample obtained by treating the body fluid include a fractionated product of the body fluid or a processed product. The detection sample can be appropriately prepared according to the type of sample collected from the subject and the detection method. For example, when it can be used for detection as it is like cerebrospinal fluid, the detection sample may be adjusted by centrifugation, dilution or the like as appropriate. In addition, when a substance that inhibits detection is contained in a sample collected from a subject such as blood, the inhibitor is removed / inactivated by pretreatment (for example, removal of immunoglobulin by a protein G column). The detection sample may be adjusted. Further, in the case of a blood sample, it is a low-polarity organic solvent and a hydrophilic organic solvent (an organic solvent having a dipole moment of 1.10 to 1.20 and an organic solvent having a dipole moment of 1.65 to 1.75, which are typically. May be a sample degreased with chloroform: methanol). Alternatively, the body fluid sample may be a separated sample obtained by separating the desired p3-Alcα from the body fluid. Separation of p3-Alcα from body fluid is a method used for peptide separation and can be performed by a method well known to those skilled in the art, for example, immunoprecipitation, Western blotting, affinity chromatography or the like. it can. Preferably, the body fluid is blood and is a sample that has not been degreased with chloroform: methanol.

（体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルの測定）
体液検体中のｐ３−Ａｌｃαの測定は、例えば、ｐ３−Ａｌｃαに特異的な抗体を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等等で測定することもできる。また、分離検体を用いる場合、ペプチドのアミノ酸配列、分子量、物理的性質、又は、化学的性質に関する情報であって、ｐ３−Ａｌｃαを特定可能な情報が得られる方法を用いることができ、例えば、マススペクトル、プロテインシーケンサー、ウェスタンブロッティング、又はＥＬＩＳＡ等で測定することもできる。例えば、体液検体中のｐ３−Ａｌｃαは、抗ｐ３−Ａｌｃα抗体を用いてｐ３−Ａｌｃαペプチドを免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＭＳや、ＬＣ−ＭＳで定量する方法により測定することもできる。 (Measurement of p3-Alcα level in body fluid sample)
For the measurement of p3-Alcα in a body fluid sample, for example, using an antibody specific for p3-Alcα, an enzyme immunoassay (EIA method), a simple EIA method, an enzyme-bound immunosolvent assay method (ELISA method), a radio Labeled immunoassays such as immunoassay (RIA) and fluorescent immunoassay (FIA); Immunobrotting methods such as Western blotting; Immunochromatography such as gold colloid aggregation; Ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Chromatography method; turbidimetric method (TIA method); brazing method (NIA method); colorimetric method; latex agglomeration method (LIA method); particle counting method (CIA method); chemical luminescence measurement method (CLIA method, CLEIA method) ); Precipitation reaction method; Surface plasmon resonance method (SPR method); Resonant mirror detector method (RMD method); Comparative interference method and the like. When a separated sample is used, a method can be used that can obtain information on the amino acid sequence, molecular weight, physical properties, or chemical properties of the peptide that can identify p3-Alcα, for example. It can also be measured by mass spectrum, protein sequencer, Western blotting, ELISA or the like. For example, p3-Alcα in a body fluid sample can also be measured by immunoprecipitation of a p3-Alcα peptide using an anti-p3-Alcα antibody and then quantification by MALDI TOF / MS or LC-MS.

例えば、ＥＬＩＳＡ法は、Ｈｎａｓｋｏ， Ｒｏｂｅｒｔ， “ＥＬＩＳＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；２０１５ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ １０， ２０１５）や試薬メーカー提供のプロトコルに従って行うことができる。また、ｐ３−ＡｌｃαレベルをＥＬＩＳＡにより測定する方法は、国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４及び本明細書記載を参照して行うこともできる。 For example, the ELISA method can be performed according to Hnasko, Robert, “ELISA Methods and Protocols”, Humana Press; 2015 edition (July 10, 2015) and protocols provided by reagent manufacturers. Further, a method for measuring the p3-Alcα level by ELISA can also be performed with reference to WO2009 / 075084 and the description of the present specification.

ｐ３−Ａｌｃαの測定は、定性的、定量的又は半定量的とすることができるが、好ましくは定量的である。 The measurement of p3-Alcα can be qualitative, quantitative or semi-quantitative, but is preferably quantitative.

（陰性対照）
本願において、「陰性対照」とは、ＰＤに罹患していない被検者又は健常者を意味する。ｐ３−Ａｌｃα値は若年層では低く、高年齢層では高くなる傾向があるため、被検者と陰性対照の年代は同じか又は近いことが好ましい。例えば、被検者が５０〜７０代の場合には、陰性対照はＰＤに罹患していない被検者又は健常者のうち５０代から７０代の者を意味してもよい。「陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベル」は、陰性比較対象におけるｐ３−Ａｌｃαレベルを上述の方法に従って被検者の体液検体と同様に測定することにより決定することができる。あるいは、被検者の体液検体とは異なる場所及び／又は異なる時に測定した陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルが既に得られている場合には、そのようなレベルを陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルとして利用することもできる。また、陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルが既に知られている場合、当該レベルと同量のｐ３−Ａｌｃαを含有する比較検体を陰性対照の体液検体の代わりに用いて、その測定値を陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルとしてもよい。 (Negative control)
In the present application, the "negative control" means a subject or a healthy person who does not suffer from PD. Since the p3-Alcα value tends to be low in the younger group and higher in the older group, it is preferable that the subject and the negative control age are the same or close to each other. For example, when the subject is in his 50s to 70s, the negative control may mean a subject in his 50s to 70s among the subjects or healthy subjects who do not suffer from PD. The "p3-Alcα level in the body fluid sample of the negative control" can be determined by measuring the p3-Alcα level in the negative comparison target in the same manner as the body fluid sample of the subject according to the above method. Alternatively, if the p3-Alcα level in the negative control body fluid sample measured at a different location and / or at a different time from the subject's body fluid sample has already been obtained, such level is used as the negative control p3-. It can also be used as an Arcα level. If the p3-Alcα level of the negative control is already known, a comparative sample containing the same amount of p3-Alcα as the level is used instead of the body fluid sample of the negative control, and the measured value is used as the negative control. It may be the p3-Alcα level in the body fluid sample.

（レベル）
本明細書全体において、「レベル」とは、数値化されたｐ３−Ａｌｃαの存在量に関する指標を意味し、例えば、濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる数値化可能なあらゆる指標を含む。よって、レベルは蛍光等の測定値そのものであってもよいし、濃度や量に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位体積又は単位面積当たりの存在量など）であっても良いし、又は相対的な数値であってもよい。更に、同一サンプルについて（同時に又は異なる時期に）複数回測定した場合には、レベルはその平均値又は中央値とすることができる。 (level)
As used herein, "level" means a quantified indicator of the abundance of p3-Alcα, including, for example, concentration, amount or any quantifiable indicator that can be used as an alternative. Therefore, the level may be a measured value such as fluorescence itself, or may be a value converted into a concentration or an amount. Further, the level may be an absolute numerical value (abundance amount, abundance amount per unit volume or unit area, etc.), or may be a relative numerical value. Further, when the same sample is measured multiple times (at the same time or at different times), the level can be the average value or the median value.

（ＰＤの罹患可能性の判定）
ＰＤの罹患可能性の判定は、決定されたｐ３−Ａｌｃαレベルを利用して行うことができる。判定ステップは、決定された被検者のｐ３−Ａｌｃαレベルを、陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較することにより行うことができる。被検者由来の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルが、対応する陰性対照の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルよりも高い場合には、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す。このように、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者は、ＰＤに罹患している可能性が高いと判定される。逆に、被検者由来の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルが、陰性対照由来の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較して同等か低い場合には、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示さない。このように、陰性対照と比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示さない被検者は、ＰＤに罹患している可能性が低いと判定される。 (Determination of PD susceptibility)
The determination of PD susceptibility can be made using the determined p3-Alcα levels. The determination step can be performed by comparing the p3-Alcα level of the determined subject with the p3-Alcα level of the negative control. When the p3-Alcα level of the body fluid sample derived from the subject is higher than the p3-Alcα level of the corresponding negative control body fluid sample, it shows a higher p3-Alcα level as compared with the negative control. Thus, a subject showing higher p3-Alcα levels compared to the negative control is determined to be more likely to have PD. Conversely, when the p3-Alcα level of the body fluid sample derived from the subject is equal to or lower than the p3-Alcα level of the body fluid sample derived from the negative control, the p3-Alcα level is higher than that of the negative control. Does not show. Thus, subjects who do not show high p3-Alcα levels compared to the negative control are determined to be less likely to have PD.

また、ＰＤの罹患可能性の判定は、決定された被検者のｐ３−Ａｌｃαレベルを、特定の閾値（カットオフ値）と比較することにより行うことができる。このような閾値は、過去の被検者とＰＤへの罹患の有無から得られたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線に基づいて、感度及び特異度が最適となるカットオフ値（例えば、｛感度（１−特異度）｝が最大となる数値）として得ることができる。あるいは、感度を優先する場合には、被検者の体液検体の測定と同時に又はそれ以前に測定された複数の陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルの｛平均値＋２×（標準偏差）｝をカットオフ値として用いることもできる。 Further, the determination of the susceptibility to PD can be performed by comparing the p3-Alcα level of the determined subject with a specific threshold value (cutoff value). Such a threshold is based on a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve obtained from past subjects and the presence or absence of PD morbidity, and a cutoff value for which sensitivity and specificity are optimal (for example, {sensitivity (eg, {sensitivity (eg, {sensitivity)). 1-Specificity)} can be obtained as the maximum numerical value). Alternatively, if sensitivity is prioritized, cut off the {mean + 2 × (standard deviation)} of the p3-Alcα levels of multiple negative controls measured at the same time as or before the measurement of the subject's body fluid sample. It can also be used as a value.

ＰＤの罹患可能性の判定は、それにより被検者の疾病の有無を推測することを意味し、疾病の有無を１００％の正確さで判定可能であることを意味するものではない。ＰＤの罹患可能性の判定は、疾病発症のリスクが増大しているか否かを意味するものである。即ち、ＰＤの罹患可能性の判定結果は、体液中のｐ３−Ａｌｃαレベルが上昇している被検者において、そのような特徴を示さない被検者と比較して、ＰＤの罹患可能性がより高いことを意味する。 The determination of the susceptibility to PD means that the presence or absence of the disease of the subject can be estimated by it, and does not mean that the presence or absence of the disease can be determined with 100% accuracy. Determining the likelihood of developing PD means whether or not the risk of developing the disease is increased. That is, the determination result of the susceptibility to PD shows that the subject with elevated p3-Alcα levels in body fluids has a higher susceptibility to PD as compared with a subject who does not show such characteristics. Means higher.

（ＰＤの治療方法）
本発明はさらに、上記方法によりＰＤに罹患している可能性が高いと判定された被検者にＰＤ治療薬を投与することを含むＰＤの治療方法に関する。ＰＤ治療薬としてはレボドパ、カルビドパ、ベンセラジド、エンダカポン、アマンタジン、イストラデフィリン、及び／又はドロキシドパなどが挙げられる。これらの治療薬の投与は当該治療薬の添付文書に従って行うことができる。 (PD treatment method)
The present invention further relates to a method for treating PD, which comprises administering a therapeutic agent for PD to a subject who is determined to have a high possibility of suffering from PD by the above method. PD therapeutic agents include levodopa, carbidopa, benserazide, endercapon, amantadine, isstradefylline, and / or droxidopa. Administration of these therapeutic agents can be performed according to the package insert of the therapeutic agent.

（マーカー）
本発明はさらに、血液や尿などの体液や組織に含まれる、タンパク質や遺伝子などの生体内の物質で、病気の変化や治療に対する反応に相関する指標、すなわちマーカーに関する。本発明者らの見出したところによれば、ＰＤ患者の血中においてｐ３−Ａｌｃαレベルが上昇していることから、ｐ３−ＡｌｃαはＰＤのマーカー、特には血中マーカーとして利用することができる。 (marker)
The present invention further relates to in vivo substances such as proteins and genes contained in body fluids and tissues such as blood and urine, which are indicators that correlate with changes in diseases and responses to treatment, that is, markers. According to the findings of the present inventors, since the p3-Alcα level is elevated in the blood of PD patients, p3-Alcα can be used as a marker for PD, particularly as a marker in blood.

（キット）
また、本発明は、ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とするキットに関する。すなわち、本願のキットは免疫化学測定用キットである。本発明のキットは、更に、ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化されたハプテンもしくは不溶性担体を含んでいてもよい。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。 (kit)
The present invention also relates to a kit comprising a carrier selected from the group consisting of a solid phase, a hapten, and an insoluble carrier on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized. .. That is, the kit of the present application is a kit for immunochemical measurement. The kit of the present invention may further include a labeled secondary antibody that specifically binds to human p3-Alcα, or a hapten or insoluble carrier on which the secondary antibody is immobilized. The measurement kit of the present invention can be based on a known method using an antibody molecule. Examples of such a method include an enzyme immunoassay method (EIA method), a simplified EIA method, an enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), a radioimmunoassay method (RIA method), and a fluorescent immunoassay method (FIA method). Labeled immunoassay method; Immunobrotting method such as Western blotting method; Immunochromatography method such as gold colloid aggregation method; Chromatography method such as ion exchange chromatography method and affinity chromatography method; Turbidity method (TIA method); NIA method); Colorimetric method; Latex agglomeration method (LIA method); Particle counting method (CIA method); Chemical luminescence measurement method (CLIA method, CLIIA method); Precipitation reaction method; Surface plasmon resonance method (SPR method); Resonant Mirror detector method (RMD method); comparative interference method and the like can be mentioned.

本発明のキットは、定性的、定量的又は半定量的分析用とすることができるが、好ましくは定量的分析用である。また、本発明のキットが含有する抗体は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域）であってもよい。 The kit of the present invention can be used for qualitative, quantitative or semi-quantitative analysis, but is preferably for quantitative analysis. Further, the antibody contained in the kit of the present invention is an antibody fragment (for example, F (ab') ₂ , Fab', Fab, single-strand Fv, disulfide bond Fv or a polymer thereof, a dimerized V region). There may be.

例えば、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相又はハプテン、及び（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。 For example, the kits of the present invention include (i) a solid phase or hapten on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized, and (ii) a label that specifically binds to human p3-Alcα. It can be a kit for immunochemical measurement containing the second antibody. When the kit of the present invention contains a hapten, it may further contain a solid phase in which a substance that specifically binds to the hapten is immobilized.

または、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、及び、（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第二抗体が固定化されたハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。 Alternatively, the kit of the present invention comprises (i) a solid phase on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized, and (ii) a second antibody that specifically binds to human p3-Alcα. Can be an immunochemical measurement kit containing an immobilized hapten. The kit may also include a labeled substance that specifically binds to the hapten.

あるいは、本発明のキットは、（ｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された不溶性担体、及び、（ｉｉ）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第二抗体が固定化された不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。 Alternatively, the kit of the present invention comprises (i) an insoluble carrier on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized, and (ii) a second antibody that specifically binds to human p3-Alcα. Can be an immunochemical measurement kit containing an immobilized insoluble carrier.

本発明のキットにおいて、固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を挙げることができ、好ましくは、プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは、ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し、例えば、セファロースビーズ、ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。 In the kit of the present invention, the solid phase is not particularly limited as long as it is a solid phase that can be used for immunochemical measurement, and for example, nitrocellulose, cepharose, nylon, vinylidene, polyester, acrylic, polyolefin, polyurethane, rayon, polynosic, cupra, etc. Rayon, acetate, polyvinylidene difluoride, silicon rubber, latex, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polystyrene, polyvinyl acetate, fluoroprocessed resin, ABS resin, AS resin, acrylic resin, polymer alloy, Plates, tubes, chips (eg, protein chips, lab chips, etc.), beads, membranes, absorbers and / or particles containing glass fiber, carbon fiber, glass, gelatin, polyamino acids and / or magnetically sensitive materials, etc. Can be mentioned, preferably plates and magnetic beads. In the present specification, the insoluble carrier means a suspendable insoluble solid phase such as beads, and examples thereof include cepharose beads, latex beads and magnetic beads.

本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、^３２Ｐ、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。 When the kit of the present invention contains a labeled antibody, a detectable label such as a radiolabel, an enzyme, a fluorescent label, a bioluminescent label, or a chemiluminescent labeled metal can be used as the label. Examples of such labels include, but are not limited to, radioactive labels such as ³² P, ³ H, ¹²⁵ I, ¹⁴ C; β-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, lactic acid oxidase, etc. Enzymes such as alcohol oxidase, monoamine oxidase, horseradish peroxidase; co-enzymes such as FAD, FMN, ATP, biotin, hem, etc. or deficient molecular groups; (Tetramethyl Rhodamine, trimethyl Rhodamine (RITC), Texas Red, Rhodamine 110, etc.), Cy Dyes (Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7), Cy-Chrome, Spectrum Green, Spectrum Orange, Propidium Iodide, Aloficocyanine ( APC), fluorescent labels such as R-phycoerythrin (R-PE); bioluminescent labels such as luciferase; or luminol, isoluminol, N- (4-aminobutyl) -N-ethylisoluminose ester, etc. Luminol derivatives, acridinium derivatives such as N-methylacrydinium ester, N-methylacrydinium acylsulfonamide ester, chemical emission labels such as lucigenin, adamantyldioxetane, indoxyl derivative, ruthenium complex; metals such as gold colloid Detectable signs can be mentioned.

本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。 The kit of the present invention may include a coloring reagent, a reaction termination reagent, a standard antigen reagent, a sample pretreatment reagent, a blocking reagent, and the like, if necessary. Further, when the kit of the present invention contains a labeled antibody, it may further contain a substrate that reacts with the label.

抗体は、所望のｐ３−Ａｌｃαのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒトの免疫動物に免疫することにより作製することができる。また、短い抗原ペプチドのみでは抗原性が低い場合、必要に応じて、例えば前記ペプチドにシステインを付加し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのキャリアタンパクをＳ−Ｓ結合で化学結合したものを抗原として用いることができる。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウス、ラット又はウサギである。 The antibody uses a peptide consisting of an amino acid sequence having a desired p3-Alcα amino acid sequence as an antigen, and if necessary, an immunostimulant (for example, mineral oil or aluminum precipitate and heat-killed bacteria or lipopolysaccharide, a complete adjuvant of Freund). , Or, with Freund's incomplete adjuvant, etc.), it can be produced by immunizing a non-human immune animal. If the antigenicity is low with only a short antigenic peptide, for example, a cysteine is added to the peptide and a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) is chemically bonded by an SS bond, if necessary. It can be used as an antigen. The immune animal is not particularly limited as long as it is an animal capable of producing hybridomas such as mice, rats, hamsters, rabbits, chickens and ducks, but is preferably mice, rats or rabbits.

動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射又は腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩又は尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。 Administration of the immunogen to animals can be performed, for example, by subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, intramuscular injection or footpad injection, preferably by subcutaneous or intraperitoneal injection. is there. The amount of the immunogen used is not particularly limited as long as it can produce an antibody, but is preferably 0.1 to 1000 μg, more preferably 1 to 500 μg, and even more preferably 10 to 10. It is 100 μg. Immunization can be performed once or several times at appropriate intervals. Preferably, immunization once every 1 to 5 weeks is performed 2 to 5 times in total, and more preferably, immunization once every 3 weeks is performed 3 times in total. One to two weeks after the last immunization, blood is collected from the orbit or tail vein of the immunized animal, and the antibody titer is measured using the serum. The antibody titer can be measured by a method well known to those skilled in the art. For example, a radioisotope immunoassay method (RIA method), a solid phase enzyme immunoassay method (ELISA method), a fluorescent antibody method, and a passive hemagglutination reaction method can be mentioned, and the ELISA method is preferable. The antibody of the present invention can be obtained by purifying from the serum of an animal showing a sufficient antibody titer.

抗体としてモノクローナル抗体を使用する場合、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示した免疫動物の脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、in vitro で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ,２５６,４９５,１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２，１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６,２６９,１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）等を挙げることができる。 When a monoclonal antibody is used as an antibody, it can be obtained by culturing a hybridoma obtained by fusing an antibody-producing cell obtained from an immunosensitizer immunized by the above method with a myeloma cell (myeloma cell). it can. Examples of the fusion method include the method of Milstein et al. (Galfr, G. & Milstein, C., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). The antibody-producing cells to be used can be collected from the spleen, pancreas, lymph nodes, and peripheral blood of an immune animal that has been immunized by the above method and whose serum has a sufficient antibody titer, and is preferably collected from the spleen. The myeloma cells to be used are, for example, cells derived from mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits and humans, and are not particularly limited as long as they are cells capable of in vitro proliferation. Examples of such cells include P3-X63Ag8 (X63) (Nature, 256,495,1975) and P3 / NS1 / 1-1-Ag4-1 (NS1) (Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976). ), P3X63Ag8U1 (P3U1) (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978), P3X63Ag 8.653 (653) (J. Immunol., 123, 1548, 1979), Sp2 / 0-Ag14 (Sp2 / O) (Nature, 276,269,1978), Sp2 / O / FO-2 (FO-2) (J. Immunol. Methods, 35,1,1980) and the like.

上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ)等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択する。 The antibody-producing cells and myeloma cells obtained according to the above method are washed with a medium, phosphate buffered saline (PBS) or the like, and then a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol (hereinafter referred to as “PEG”) is added. , Fuse cells. The ratio of antibody-producing cells to myeloma cells at the time of fusion is, for example, 2: 1 to 1: 2. After cell fusion, the hybridoma is selectively grown by culturing in a medium such as HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium. After culturing, the culture supernatant is collected, and a sample that binds to the antigen protein and does not bind to the non-antigen protein is selected by ELISA or the like. The sample is monocellularized by the limiting dilution method, and cells that stably show a high antibody titer are selected.

モノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、モノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物又は免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。 The monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma obtained by the above method in vitro and purifying the culture solution. The monoclonal antibody can also be obtained by transplanting a hybridoma into a syngeneic animal or an immunodeficient animal to which Pristan has been intraperitoneally administered in advance, then ascites, and purifying the collected ascites. Purification can be obtained by centrifuging and then recovering the IgG fraction using a protein A column, a protein G column, or the like.

抗体の標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５５５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴＭ） Ｐｉｅｒｃｅ社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）等を用いて標識することもできる。 Binding of the antibody label can be performed by methods common in the art. For example, when a protein or peptide is fluorescently labeled, the protein or peptide is washed with a phosphate buffer solution, a dye prepared with DMSO, a buffer solution or the like is added, mixed, and then allowed to stand at room temperature for 10 minutes for binding. be able to. In addition, as commercially available labeling kits, biotin labeling kits (Biotin Labeling Kit-NH2, Biotin Labeling Kit-SH: Dojin Chemical Research Institute Co., Ltd.), alkaline phosphatase labeling kits (Alkaline Protein Labeling Kit-NH2, Alkaline Labeling Kit-NH2, Alkaline SH: Dojin Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.), Peroxidase Labeling Kit-NH2, Peroxydase Labeling Kit-NH2: Dojin Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.), Phycobiliprotein Labeling Kit (Allophycocyanin Labeling Kit-NH2, Allophys SH, B-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2, B-Phycoerythrin Labeling Kit-SH, R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2, R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2, R-Phycoerythrin Labeling NH2, HiLite Fluor (registered trademark) 555 Labeling Kit-NH2, HiLyte Fluor (registered trademark) 647 Labeling Kit-NH2: Dojin Kagaku Kenkyusho Co., Ltd., DyLight (registered trademark) 547, DyLight (registered trademark) 647 Scientific (TM) Pierce), Zenon (registered trademark) Alexa Fluor (registered trademark) antibody labeling kit, Qdot (registered trademark) antibody labeling kit (Invitrogen), EZ-Label Protein Labeling Kit (BioVision), etc. Can also be labeled.

本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体（又は標識化した抗体）を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法用のキットとして当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。 The kit of the present invention uses an antibody (or a labeled antibody) prepared according to the above method, and uses an enzyme immunoassay (EIA method), a simplified EIA method, an enzyme-binding immunosolvent assay method (ELISA method), and a radioimmunoassay. Labeled immunoassays such as method (RIA method) and radioimmunoassay (FIA method); immunobrotting methods such as western blotting method; immunochromatography methods such as gold colloid aggregation method; ion exchange chromatography method, affinity chromatography method, etc. Chromatography method; turbidimetric method (TIA method); brazing method (NIA method); colorimetric method; latex aggregation method (LIA method); particle counting method (CIA method); chemical luminescence measurement method (CLIA method, CLEIA method) Precipitation reaction method; Surface plasmon resonance method (SPR method); Resonant mirror detector method (RMD method); As a kit for comparative interference method, it can be produced by a technique commonly used by those skilled in the art.

例えば、本発明のキットは、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体固相化プレート、ＨＲＰ標識抗ｐ３−Ａｌｃαポリクローナル抗体溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、標準物質（ｐ３−Ａｌｃペプチド）を備えるキットとして製造することができる。また、別の例として、本発明のキットは、抗ｐ３−Ａｌｃモノクローナル抗体、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットとして製造することができる。当該キットにおいて、テストプレートは、検体を挿入する検体採取部、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体結合金コロイドを含む感作金コロイド塗布部、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体を含む判定部（テストライン）、抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体を含む判定部（リファレンスライン）、吸収剤、及び、メンブレンフィルターを備えていてもよい。 For example, a kit of the invention comprises an anti-p3-Alcα monoclonal antibody-immobilized plate, HRP-labeled anti-p3-Alcα polyclonal antibody solution, washing solution, TMB reagent, _1N H 2 SO _4, the standard (p3-Alc peptides) It can be manufactured as a kit. As another example, the kit of the present invention can be produced as a kit including an anti-p3-Alc monoclonal antibody, an anti-p3-Alcα monoclonal antibody-bound gold colloid, a rabbit immunoglobulin-bound gold colloid, and a test plate. .. In the kit, the test plate includes a sample collection section for inserting a sample, a sensitized gold colloid coating section containing an anti-p3-Alcα monoclonal antibody-binding gold colloid, a determination section (test line) containing an anti-p3-Alcα monoclonal antibody, and an anti-p3-Alcα monoclonal antibody. A determination unit (reference line) containing a rabbit immunoglobulin polyclonal antibody, an absorbent, and a membrane filter may be provided.

以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples of the present invention, but the present invention is not limited thereto. All documents cited throughout the present application are incorporated herein by reference.

（実施例１）
健常者４０人、ＰＤと診断された患者２７人の血液を用いて以下の方法によりサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。 (Example 1)
The blood of 40 healthy subjects and 27 patients diagnosed with PD was measured by the sandwich ELISA method by the following method.

（１）希釈サンプルの調製
血漿を希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｉｎ ＰＢＳ）で二倍に希釈したものを希釈サンプルとして用いた。 (1) Preparation of diluted sample Plasma diluted 2-fold with a dilution buffer (1% BSA, 0.05% Tween-20 in PBS) was used as a diluted sample.

（２）抽出サンプルの調製
血漿２００μＬに８００μＬのクロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を加えた後、１０秒間ソニケーターで撹拌し、１時間室温で静置した。１６０μＬの水を加え、１０秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、２０，０００ｇで１５分遠心した。上層（水層）を回収し、Ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾枯させた後、希釈用緩衝液２５０μＬを加え、３０分間転倒混和により撹拌・溶解したものを抽出サンプルとして用いた。 (2) Preparation of Extracted Sample After adding 800 μL of a mixture of chloroform and methanol (chloroform: methanol = 2: 1) to 200 μL of plasma, the mixture was stirred with a sonicator for 10 seconds and allowed to stand at room temperature for 1 hour. 160 μL of water was added, the mixture was stirred with a vortex mixer for 10 seconds, and then centrifuged at 20,000 g for 15 minutes. The upper layer (aqueous layer) was recovered, dried with Speed vac, 250 μL of a buffer for dilution was added, and the mixture was stirred and dissolved by inversion mixing for 30 minutes and used as an extraction sample.

（３）サンドイッチＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡには、市販のＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）測定用のバッファーセット（＃１９９０３ ＥＩＡ ｓｙｓｔｅｍ （ＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、株式会社免疫生物研究所、群馬、日本）を用いた。調製したサンプル１００μＬずつを抗ｐ３−Ａｌｃα抗体を固相化させた９６ウェルマイクロプレートに入れ、４℃で一晩反応させた。洗浄液で洗浄後、標識抗体を添加し、４℃で１時間反応させた。再度洗浄液で洗浄後、発色基質としてＴＭＢを加え、室温で遮光しながら反応させ、３０分後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。 (3) Sandwich ELISA
For the sandwich ELISA, a commercially available buffer set for EIA (Enzyme Immuno Assay) measurement (# 19903 EIA system (TMB solution, Immuno-Biological Laboratory Co., Ltd., Gunma, Japan) was used. 100 μL of each prepared sample was anti-p3. -Alcα antibody was placed in a immobilized 96-well microplate and reacted at 4 ° C. overnight. After washing with a washing solution, a labeled antibody was added and reacted at 4 ° C. for 1 hour. After washing again with a washing solution. , TMB was added as a color-developing substrate, the reaction was carried out at room temperature while shading, a stop solution was added after 30 minutes, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader.

結果を図１に示す。健常者群とＰＤ患者群との間で明瞭な有意差が確認された（ｐ＝０．００７）。また、健常者値の平均＋２ＳＤをカットオフ値としたときに健常者０人に対しＰＤ患者９人（対象患者数の１／３）が判別された。このことから、血液中のｐ３−ＡｌｃαはＰＤ診断指標として有用であることが示された。 The results are shown in FIG. A clear significant difference was confirmed between the healthy subject group and the PD patient group (p = 0.007). In addition, 9 PD patients (1/3 of the number of target patients) were discriminated against 0 healthy subjects when the average of healthy subjects + 2SD was used as the cutoff value. From this, it was shown that p3-Alcα in blood is useful as a PD diagnostic index.

また、（１）で得られた希釈サンプルと（２）で得られた抽出サンプルの測定値の比較結果を図２に示す。従前測定されていた脳脊髄液とは異なり、血漿中のｐ３−Ａｌｃαはクロロホルム・メタノール抽出することなく希釈のみで測定可能であることが見出された。 Further, FIG. 2 shows a comparison result of the measured values of the diluted sample obtained in (1) and the extracted sample obtained in (2). It was found that, unlike the previously measured cerebrospinal fluid, p3-Alcα in plasma can be measured only by dilution without extraction with chloroform / methanol.

Claims (11)

被検者がパーキンソン病に罹患している可能性を判定するための情報を提供する方法であって、
（ｉ）該被検者の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルを測定すること、
（ｉｉ）同様に測定された陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルと前記（ｉ）で測定されたｐ３−Ａｌｃαレベルとを比較すること、
（ｉｉｉ）陰性対照のｐ３−Ａｌｃαレベルと比較して高いｐ３−Ａｌｃαレベルを示す被検者をパーキンソン病に罹患している可能性が高いとの情報が提供される方法、
ここで、前記陰性対照は、パーキンソン病に罹患していない者又は健常者である。 A method of providing information to determine a subject's likelihood of having Parkinson's disease.
(I) Measuring the p3-Alcα level in the body fluid sample of the subject,
(Ii) Comparing the p3-Alcα level in the negative control body fluid sample measured in the same manner with the p3-Alcα level measured in (i) above.
(Iii) A method by which information is provided that a subject showing a higher p3-Alcα level compared to a negative control p3-Alcα level is more likely to have Parkinson's disease.
Here, the negative control is a person who does not have Parkinson's disease or a healthy person. 陰性対照の体液検体中のｐ３−Ａｌｃαレベルが、複数の陰性対照の体液検体のｐ３−Ａｌｃαレベルの平均値＋２標準偏差である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the p3-Alcα level in the negative control body fluid sample is the average value + 2 standard deviations of the p3-Alcα level in the plurality of negative control body fluid samples. ｐ３−Ａｌｃαレベルの測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡにより行われることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。 The method of claim 1 or 2, wherein the measurement of p3-Alcα levels is performed by sandwich ELISA. 前記体液検体が血液検体である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the body fluid sample is a blood sample. ｐ３−Ａｌｃαからなるパーキンソン病のバイオマーカー。 A biomarker for Parkinson's disease consisting of p3-Alcα. ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする、パーキンソン病に罹患している可能性を判定するためのキット。 Affected by Parkinson's disease, which comprises a carrier selected from the group consisting of solid phase, hapten, magnetic beads and insoluble carrier on which a primary antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized. A kit for determining the possibility of being ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、又は該第二抗体が固定化されたハプテンもしくは不溶性担体、をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。 The kit according to claim 6, further comprising a labeled second antibody that specifically binds to human p3-Alcα, or a hapten or insoluble carrier on which the second antibody is immobilized. （１）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（２）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する標識化された第二抗体、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。 (1) A carrier selected from the group consisting of a solid phase on which a first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized, a hapten, magnetic beads and an insoluble carrier, and (2) specific to human p3-Alcα. Labeled secondary antibody, which binds
The kit according to claim 6, wherein the kit comprises. 標識と反応する基質をさらに含む請求項８に記載のキット。 The kit of claim 8, further comprising a substrate that reacts with the label. （１）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第一抗体が固定化された固相、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体、及び
（２）ヒトｐ３−Ａｌｃαと特異的に結合する第二抗体が固定化されたハプテン、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のキット。 (1) A carrier selected from the group consisting of a solid phase on which the first antibody that specifically binds to human p3-Alcα is immobilized, magnetic beads and an insoluble carrier, and (2) specifically to human p3-Alcα. Hapten on which the second antibody to bind is immobilized,
The kit according to claim 6, wherein the kit comprises. 前記ハプテンと特異的に結合する、標識された物質をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のキット。 The kit according to claim 10, further comprising a labeled substance that specifically binds to the hapten.