JP2020130018A

JP2020130018A - Jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues

Info

Publication number: JP2020130018A
Application number: JP2019026160A
Authority: JP
Inventors: 篤史松澤; Atsushi Matsuzawa
Original assignee: Mitsubishi Paper Mills Ltd
Current assignee: Mitsubishi Paper Mills Ltd
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2019-02-18
Publication date: 2020-08-31

Abstract

To provide a jig for cryopreservation, with which freezing operation may be executed easily and reliably.SOLUTION: There is provided a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues, that comprises a main body member having a mounting part for mounting the cells or tissues and a gripping part, and a cover member that covers the mounting part. The gripping part has a tapered structure part for fixing the cover member. The tapered structure part has a non-contact part upon being fitted. The cover member is made of a crystalline polymer compound.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、細胞又は組織を凍結保存する際に使用する、細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具に関する。 The present invention relates to a vitrification cryopreservation jig for cells or tissues used for cryopreserving cells or tissues.

細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。 Excellent cell or tissue preservation techniques are sought after in various industrial fields. For example, in the embryo transfer technique for cattle, embryos are cryopreserved, thawed and transplanted in accordance with the estrous cycle of the recipient cattle. Further, in human infertility treatment, after collecting an egg or an ovary from a mother, it is cryopreserved in order to adjust to a timing suitable for transplantation, and thawed at the time of transplantation for use.

一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われたり、形質の変化が生じることから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を保った状態で長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。 In general, cells or tissues collected from a living body gradually lose their activity or change their traits even in a culture medium. Therefore, long-term culture of cells or tissues in vitro is performed. Is not desirable. Therefore, a technique for long-term storage while maintaining biological activity is important. Superior preservation techniques allow for more accurate analysis of harvested cells or tissues. In addition, excellent preservation technology makes it possible to use cells or tissues for transplantation while maintaining higher biological activity, and it is expected that the survival rate after transplantation will be improved. Furthermore, it is also possible to sequentially produce and store artificial tissues for transplantation such as cultured skin cultured in vitro and so-called cell sheets constructed in vitro, and use them when necessary. , Not only in terms of medical care, but also in terms of industry, great merits can be expected.

細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化する現象であるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。 As a method for preserving cells or tissues, for example, a slow freezing method is known. In this method, first, cells or tissues are immersed in a preservation solution obtained by containing a freezing agent in a physiological solution such as phosphate buffered saline. As the antifreeze agent, compounds such as glycerol, ethylene glycol and dimethyl sulfoxide are used. After immersing the cells or tissues in the preservation solution, the cells or tissues are cooled to -30 to -35 ° C. at a relatively slow cooling rate (for example, a rate of 0.3 to 0.5 ° C./min) to enter or outside the cells or the tissues. The inner and outer solutions are sufficiently cooled and become more viscous. In such a state, when the cells or tissues in the preservation solution are further cooled to the temperature of liquid nitrogen (-196 ° C.), the minute solutions inside and around the cells or tissues are solidified in an amorphous state. Vitrification occurs, which is a phenomenon that occurs. When the inside and outside of cells or the inside and outside of tissues are solidified by vitrification, the movement of molecules is substantially stopped. Therefore, it is considered that the vitrified cells or tissues can be stored semi-permanently by storing them in liquid nitrogen.

しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。 However, in the slow freezing method, it takes time for the operation for cryopreservation because it is necessary to cool at a relatively slow cooling rate. Further, there is a problem that a device or a jig for controlling the cooling rate is required. In addition, in the slow freezing method, ice crystals are formed in the storage solution outside the cells or tissues, so that the cells or tissues may be physically damaged by the ice crystals.

前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化凍結法が提案されている。ガラス化凍結法とは、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。 A vitrification freezing method has been proposed as a method for solving the problems in the slow freezing method. The vitrification freezing method uses the principle that ice crystals are less likely to form even below freezing point due to the freezing point depression of a storage solution containing a large amount of antifreezing agent such as glycerol, ethylene glycol, and dimethyl sulfoxide. When this preservation solution is rapidly cooled in liquid nitrogen, it can be solidified without forming ice crystals. This solidification is called vitrification freezing. A preservative solution containing a large amount of antifreeze is called a vitrification solution.

前記ガラス化凍結法の具体的な操作としては、耐凍剤を多量に含む保存液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化凍結法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。 As a specific operation of the vitrification freezing method, cells or tissues are immersed in a preservation solution containing a large amount of antifreezing agent, and then cooled at the temperature of liquid nitrogen (-196 ° C.). Since the vitrification freezing method is such a simple and rapid process, it does not require a long time for the operation for cryopreservation, and has the advantage that it does not require a device or jig for temperature control. There is.

ガラス化凍結法を用いると、原理的には、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、適切なガラス化凍結を成し得るためには、ガラス化に用いる保存液に含有される耐凍剤の濃度を高いものとしなければならない。一方で、保存液に含まれる高濃度の耐凍剤は細胞にとっての化学的毒性が高い。 In principle, the vitrification freezing method can avoid physical damage (freezing damage) to cells during freezing and thawing because ice crystals do not form inside or outside the cells, but it is appropriate. In order to achieve the vitrification freezing, the concentration of the antifreezing agent contained in the preservative solution used for vitrification must be high. On the other hand, the high concentration of antifreeze contained in the preservation solution is highly chemically toxic to cells.

上記した背景から、細胞又は組織の凍結保存においては、保存液に含まれる高濃度の耐凍剤に由来する毒性を回避する観点から、細胞又は組織が保存液に暴露される時間（つまりは凍結されるまでの時間）が短時間であることが好ましく、操作者は迅速な操作が求められる。 From the above background, in the cryopreservation of cells or tissues, the time during which the cells or tissues are exposed to the preservation solution (that is, frozen) from the viewpoint of avoiding toxicity due to the high concentration of the antifreeze agent contained in the preservation solution. It is preferable that the time required for the operation is short, and the operator is required to perform a quick operation.

また、適切なガラス化凍結を成し得るために、凍結速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。さらに、凍結後の融解時においても、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で、融解速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。 It is also known that the faster the freezing rate, the better, in order to achieve proper vitrification freezing. Further, it is known that the faster the thawing rate is, the more preferable it is from the viewpoint of suppressing the formation of re-ice crystals in cells or tissues even at the time of thawing after freezing.

ガラス化凍結法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。 Regarding cryopreservation of cells or tissues using the vitrification freezing method, examples using various types of cells or tissues are shown by various methods. For example, Patent Document 1 shows that the application of the vitrification freezing method to animal or human germ cells or somatic cells is extremely useful in terms of cryopreservation and survival rate after thawing.

ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。このように、ガラス化凍結法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。 The vitrification freezing method is a technique that has been developed mainly using human germ cells, but recently, its application to iPS cells and ES cells has been widely studied. In addition, Non-Patent Document 1 shows that the vitrification freezing method was effective for the preservation of Drosophila embryos. Further, Patent Document 2 shows that the vitrification freezing method is effective in preserving cultured plant cells and tissues. As described above, the vitrification freezing method is known to be useful for the preservation of cells and tissues of a wide variety of species.

特許文献３、特許文献４では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ（登録商標）法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、凍結保存する方法が提案されている。この方法では作業者の操作によって、卵子や胚は少量の保存液と共にフィルム上に載置され、かかる手法は操作の難度が高いといった問題があるものの、高い生存率で卵子又は胚を凍結できることが知られている。また、特許文献３、特許文献４には、前記卵付着保持用ストリップを被包する目的で、液体窒素耐性材料により形成された筒状部材を有することが記載されおり、該卵付着保持用ストリップを有する本体部材は筒状部材を係合するための円柱状部を有し、この円柱状部はテーパー状に縮径している。 In Patent Documents 3 and 4, a strip-shaped flexible and colorless transparent film is used as a strip for holding egg adhesion by the so-called cryotop (registered trademark) method used in the field of human infertility treatment. A method has been proposed in which an egg or an embryo is placed on the film together with a very small amount of a preservation solution and cryopreserved by using the egg cryopreservation tool. In this method, the egg or embryo is placed on the film together with a small amount of preservative solution by the operator's operation, and although there is a problem that the operation is difficult, the egg or embryo can be frozen with a high survival rate. Are known. Further, Patent Documents 3 and 4 describe that the egg adhesion-holding strip has a tubular member formed of a liquid nitrogen-resistant material for the purpose of encapsulating the egg adhesion-holding strip. The main body member having the above has a columnar portion for engaging the tubular member, and the columnar portion has a tapered diameter.

特許文献５では、卵子又は胚を、耐凍剤を多量に含む保存液と共に保存液除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、保存液除去材としては、金網、紙等の天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。また、特許文献５には、保存液吸収材を含む本体部を収納可能な鞘部が記載されており、該鞘部を金属製とすれば、熱伝導性に優れるため、鞘部に収納された動物の胚等を迅速にガラス化保存できる旨、記載されている。 In Patent Document 5, an egg or embryo is placed on a preservation solution removing material together with a preservation solution containing a large amount of antifreeze agent, and the excess preservation solution adhering to the periphery of the egg or embryo is removed by sucking from the lower part. , A method of cryopreservation with excellent survival rate has been proposed. As the preservative solution removing material, a film-like material made of a natural product such as wire mesh or paper or a synthetic resin having through holes is described. Further, Patent Document 5 describes a sheath portion capable of accommodating a main body portion including a storage liquid absorbent, and if the sheath portion is made of metal, it is stored in the sheath portion because it has excellent thermal conductivity. It is described that the embryos of animals can be rapidly vitrified and stored.

特許文献６では、生物試料を置くための試料載置部と、該試料載置部を収納しうる凍結保存容器からなる構造の生物学的試料保存用デバイスが提案されている。該生物学的試料保存用デバイスでは、生物学的試料を置くための試料載置部の先端側の位置にテーパー部が設けられており、また特許文献６の図３によれば、該試料載置部はバイアル内に収納されており、該バイアルを密閉するキャップはテーパー構造を有している。 Patent Document 6 proposes a device for storing a biological sample having a structure consisting of a sample placing portion for placing a biological sample and a cryopreservation container capable of accommodating the sample placing portion. In the biological sample storage device, a tapered portion is provided at a position on the tip end side of the sample mounting portion for placing the biological sample, and according to FIG. 3 of Patent Document 6, the sample mounting is performed. The placement portion is housed in a vial, and the cap that seals the vial has a tapered structure.

特許第３０４４３２３号公報Japanese Patent No. 3044323 特開２００８−５８４６号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-5846 特開２００２−３１５５７３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-315573 特開２００６−２７１３９５号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-271395 国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレットInternational Publication No. 2011/070973 Pamphlet 国際公開第２００６／０５９６２６号パンフレットInternational Publication No. 2006/059626 Pamphlet

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４５：１７０−１７２（１９９０）Steponkus et al. , Nature 345: 170-172 (1990)

特許文献３〜６で提案されている凍結保存用治具は、ガラス化凍結保存で用いられるものであり、例えば液体窒素のような冷媒を用いて、極低温環境下で用いられる。また、これらの凍結保存用治具では、載置部に載置された細胞又は組織は、筒状部材や鞘部等の被包部材によって保護される。しかしながら極低温の液体窒素中において、細胞又は組織を載置する載置部を有する本体部材と、該載置部を被包するための被包部材を嵌合させるなどして固定する場合、極低温下における各部材の寸法変化や、各部材の柔軟性低下などに起因して、スムーズな嵌合が難しいといった問題、あるいは嵌合後に本体部材と被包部材を強固に固定することが難しいといった問題、さらには前記した嵌合・固定を解除する際にスムーズに解除することが難しいといった問題があった。 The cryopreservation jigs proposed in Patent Documents 3 to 6 are used in vitrification cryopreservation, and are used in an extremely low temperature environment using a refrigerant such as liquid nitrogen. Further, in these cryopreservation jigs, the cells or tissues placed on the mounting portion are protected by an encapsulating member such as a tubular member or a sheath portion. However, in the case of fixing the main body member having a mounting portion on which cells or tissues are placed in cryogenic liquid nitrogen by fitting the encapsulating member for encapsulating the mounting portion, the electrode There is a problem that smooth fitting is difficult due to dimensional changes of each member at low temperature and a decrease in flexibility of each member, or it is difficult to firmly fix the main body member and the encapsulating member after fitting. There is a problem that it is difficult to release the fitting / fixing smoothly when releasing the fitting / fixing.

本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞又は組織の凍結作業において、細胞又は組織を載置した載置部を有する本体部材と、載置部を被包する被包部材を嵌合・固定する際に、破損等の不具合の生じないスムーズな嵌合及び強固な固定を行うことが可能であり、また、前記した嵌合・固定をスムーズに解除することが可能な、細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具を提供することである。 A main object of the present invention is to provide a jig for cryopreservation of cells or tissues capable of easily and surely performing cryopreservation work of cells or tissues. More specifically, in the freezing operation of cells or tissues, the main body member having the mounting portion on which the cells or tissues are placed and the encapsulated member covering the mounting portion are damaged when they are fitted and fixed. It is possible to perform smooth fitting and firm fixing without causing problems such as the above, and it is possible to smoothly release the above-mentioned fitting and fixing for vitrification cryopreservation of cells or tissues. To provide the ingredients.

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具（本明細書中、「細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具」を、単に「ガラス化凍結保存用治具」、または「凍結保存用治具」ともいう）によって、上記課題を解決できることを見出した。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventor has made a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues having the following constitution (in the present specification, "treatment for vitrification cryopreservation of cells or tissues". It has been found that the above-mentioned problems can be solved by simply using "tools" as "vitrification for vitrification and cryopreservation" or "jigs for cryopreservation").

（１）細胞又は組織を載置する載置部および該載置部に付設された把持部を少なくとも有する本体部材と、該本体部材の載置部を被包する被包部材とを有する細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具であって、前記した把持部は該被包部材を固定するためのテーパー構造部を有し、且つ該テーパー構造部が嵌合時非接触部を有し、さらに該被包部材が結晶性高分子化合物により形成された部材であることを特徴とする、細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具。
（２）被包部材がポリエチレンテレフタレート樹脂あるいはポリプロピレン樹脂により形成された部材であることを特徴とする、前記（１）に記載の細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具。 (1) A cell or a cell having a main body member having at least a mounting portion on which a cell or tissue is placed and a grip portion attached to the mounting portion, and an encapsulating member covering the mounting portion of the main body member. A jig for vitrification and cryopreservation of a tissue, wherein the grip portion has a tapered structure portion for fixing the encapsulated member, and the tapered structure portion has a non-contact portion at the time of fitting. Further, a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues, wherein the encapsulating member is a member formed of a crystalline polymer compound.
(2) The jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues according to (1) above, wherein the encapsulating member is a member formed of polyethylene terephthalate resin or polypropylene resin.

本発明によれば、細胞又は組織を載置した載置部を有する本体部材と、載置部を被包する被包部材を嵌合・固定する際に、破損等の不具合の生じないスムーズな嵌合及び強固な固定を行うことが可能であり、また、前記した嵌合・固定をスムーズに解除することが可能な細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具を提供することができる。 According to the present invention, when fitting and fixing a main body member having a mounting portion on which cells or tissues are placed and an encapsulated member covering the mounting portion, problems such as breakage do not occur smoothly. It is possible to provide a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues capable of performing fitting and firm fixing, and capable of smoothly releasing the fitting / fixing described above.

本発明の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。It is an overall view which shows an example of the cryopreservation jig of this invention. 被包部材が本体部材に嵌合・固定された状態の一例を示す全体図である。It is an overall view which shows an example of the state in which the encapsulating member is fitted and fixed to the main body member. 本発明の凍結保存用治具の別の一例を示す全体図である。It is an overall view which shows another example of the cryopreservation jig of this invention. 本体部材が有するテーパー構造部の側面図の一例である。This is an example of a side view of the tapered structure portion of the main body member. 本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図の一例である。This is an example of a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of a main body member. 本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図の別の一例である。This is another example of a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of a main body member. 本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。This is another example of a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of a main body member. 本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。This is another example of a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of a main body member. 本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。This is another example of a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of a main body member. 本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。This is another example of a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of a main body member.

本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本発明において、細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。 The cryopreservation jig of the present invention is used for cryopreserving cells or tissues. In the present invention, a cell includes not only a single cell but also a cell population of an organism composed of a plurality of cells. The cell population composed of a plurality of cells may be a cell population composed of a single type of cell or a cell population composed of a plurality of types of cells. Further, the tissue may be a tissue composed of a single type of cells or a tissue composed of a plurality of types of cells, and may contain a non-cellular substance such as an extracellular matrix in addition to the cells. It may be a thing.

本発明において、本発明の凍結保存用治具を用いた凍結保存作業は、細胞又は組織を極低温の冷媒を用いて凍結させる凍結作業、細胞又は組織を極低温の冷媒中で貯蔵する保管作業、細胞又は組織を融解液中で解凍する融解作業の一連の操作を含むものとする。 In the present invention, the cryopreservation work using the cryopreservation jig of the present invention includes a freezing operation in which cells or tissues are frozen using a cryogenic refrigerant, and a storage operation in which cells or tissues are stored in a cryogenic refrigerant. , Shall include a series of operations of thawing operations in which cells or tissues are thawed in a thawing solution.

本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織のガラス化凍結保存作業に用いるものである。詳細には、本発明のガラス化凍結保存用治具は、保存液に浸漬された細胞又は組織を液体窒素等の冷却媒体に浸漬し凍結させるためのものである。かかるガラス化凍結保存作業では、載置部上に載置された細胞又は組織を保護することを目的として、細胞又は組織を冷却媒体に浸漬する作業の前、あるいは細胞又は組織を冷却媒体に浸漬する作業の後に、本体部材が有する載置部に対して、被包部材を嵌合・固定する。また、該載置部上に載置された細胞又は組織を融解する際には、細胞又は組織が載置されたガラス化凍結保存用治具を冷却媒体から取りだし、冷却媒体下で、本体部材と嵌合・固定された被包部材の嵌合・固定を解除し、被包部材を取り外し、本体部材が有する載置部上に載置した細胞又は組織を融解液中に浸漬させて融解する。本発明のガラス化凍結保存用治具を用いると、凍結作業の際に、本体部材と被包部材を、破損等が生じることなくスムーズに嵌合・固定することができ、凍結保存作業の操作性を向上させることができる。また、凍結保管する際に、載置部上の細胞又は組織を確実に被包・保護することができる。さらに、融解作業の際に、本体部材と被包部材の嵌合・固定をスムーズに解除することが可能である。本発明のガラス化凍結保存用治具は、細胞又は組織の保存用具、細胞又は組織の凍結保存器具、細胞又は組織の保存用器具と言い換えることができる。 The cryopreservation jig of the present invention is used for vitrification cryopreservation work of cells or tissues. Specifically, the vitrification cryopreservation jig of the present invention is for immersing cells or tissues immersed in a preservation solution in a cooling medium such as liquid nitrogen to freeze them. In such a vitrification cryopreservation work, for the purpose of protecting the cells or tissues placed on the placement portion, before the work of immersing the cells or tissues in the cooling medium, or by immersing the cells or tissues in the cooling medium. After the work, the encapsulating member is fitted and fixed to the mounting portion of the main body member. Further, when the cells or tissues placed on the mounting portion are thawed, the vitrified cryopreservation jig on which the cells or tissues are placed is taken out from the cooling medium, and the main body member is under the cooling medium. The fitted / fixed encapsulating member is released from the mating / fixing, the encapsulating member is removed, and the cells or tissues placed on the mounting portion of the main body member are immersed in a melting solution to melt. .. By using the vitrification cryopreservation jig of the present invention, the main body member and the encapsulating member can be smoothly fitted and fixed without being damaged during the freezing operation, and the operation of the cryopreservation work can be performed. The sex can be improved. In addition, the cells or tissues on the placement portion can be reliably encapsulated and protected during cryopreservation. Further, during the melting operation, it is possible to smoothly release the fitting / fixing of the main body member and the encapsulating member. The vitrification cryopreservation jig of the present invention can be rephrased as a cell or tissue preservation tool, a cell or tissue cryopreservation device, or a cell or tissue preservation device.

以下に本発明を詳細に説明する。本発明の凍結保存用治具は、少なくとも本体部材と被包部材を有する。 The present invention will be described in detail below. The cryopreservation jig of the present invention has at least a main body member and an encapsulating member.

本発明の凍結保存用治具が有する本体部材は、細胞又は組織を載置する載置部と、該載置部に付設された把持部を有する。 The main body member of the cryopreservation jig of the present invention has a mounting portion on which cells or tissues are placed, and a grip portion attached to the mounting portion.

本発明の凍結保存用治具が有する載置部は、短冊状であることが好ましい。短冊状であると載置部を被包部材によって被包・保護することが容易である。 The mounting portion of the cryopreservation jig of the present invention is preferably in the shape of a strip. If it is in the shape of a strip, it is easy to enclose and protect the mounting portion with an encapsulating member.

本発明の凍結保存用治具が有する載置部としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられる。載置部は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また、載置部の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を、透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。 Examples of the mounting portion included in the cryopreservation jig of the present invention include various resin films, metal plates, glass plates, rubber plates and the like. The mounting portion may be made of one kind of material or may be made of two or more kinds of materials. Among them, the resin film is preferably used from the viewpoint of handling. Specific examples of the resin film include polyester resins such as polyethylene terephthalate and polyethylene naphthalate, acrylic resins, epoxy resins, silicon resins, polycarbonate resins, diacetate resins, triacetate resins, polyacrylate resins, polyvinyl chloride resins, and polysulphon resins. , A resin film made of polyether sulfone resin, polyimide resin, polyamide resin, polyolefin resin, cyclic polyolefin resin and the like. Further, when the total light transmittance of the placement portion is 80% or more, the cells or tissues placed on the placement portion can be easily confirmed using a transmission microscope, which is preferable.

本発明の凍結保存用治具が有する載置部として、熱伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。また目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面を、例えばコロナ放電処理のような電気的な方法や、あるいは化学的な方法により親水化することもでき、更には粗面化することも可能である。 As the mounting portion of the cryopreservation jig of the present invention, a metal plate can also be preferably used from the viewpoint of excellent thermal conductivity and enabling rapid freezing. Specific examples of the metal plate include copper, copper alloy, aluminum, aluminum alloy, gold, gold alloy, silver, silver alloy, iron, stainless steel and the like. The thickness of the various resin films, metal plates, glass plates, rubber plates and the like described above is preferably 10 μm to 10 mm. Further, depending on the purpose, the surfaces of various resin films, metal plates, glass plates, rubber plates and the like can be hydrophilized by an electrical method such as corona discharge treatment or a chemical method. Can also be roughened.

本発明の凍結保存用治具が有する載置部として保存液吸収材を用いることもでき、例えば金網、紙等や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが例示される。その他の保存液吸収材としては屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体が例示される。該多孔質構造体により、細胞又は組織の周囲に存在するガラス化液を除去することができる。また、透過型の光学顕微鏡観察下において、細胞または組織の凍結作業および凍結後の融解作業を、容易にかつ確実に行うことができる。 A preservative liquid absorber can also be used as the mounting portion of the cryopreservation jig of the present invention, and examples thereof include a film-like material made of wire mesh, paper, or synthetic resin having through holes. Examples of other preservative liquid absorbers include porous structures formed using a material having a refractive index of 1.45 or less. The porous structure can remove the vitrified liquid present around the cells or tissues. Further, the cell or tissue freezing operation and the post-freezing thawing operation can be easily and surely performed under the observation of a transmission type optical microscope.

上記した多孔質構造体の素材の屈折率は、例えば、アッベ屈折計（Ｎａ光源、波長：５８９ｎｍ）を用いてＪＩＳＫ００６２：１９９２、ＪＩＳＫ７１４２：２０１４に準じて測定できる。多孔質構造体を形成する屈折率が１．４５以下の素材としては、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリクロロトリフルオロエチレンなどのフッ素樹脂やシリコン樹脂のようなプラスチック樹脂材料、二酸化ケイ素のような金属酸化物材料、フッ化ナトリウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウムのような無機材料が挙げられる。 The refractive index of the material of the above-mentioned porous structure can be measured, for example, using an Abbe refractometer (Na light source, wavelength: 589 nm) according to JIS K 0062: 1992 and JIS K 7142: 2014. Materials having a refractive index of 1.45 or less that form a porous structure include fluororesins such as polytetrafluoroethylene, polyvinylidene difluorolide, and polychlorotrifluoroethylene, plastic resin materials such as silicon resins, and dioxide. Examples include metal oxide materials such as silicon and inorganic materials such as sodium fluoride, magnesium fluoride and calcium fluoride.

多孔質構造体の細孔径は５．５μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．７５μｍ以下である。これにより光学顕微鏡観察下における細胞又は組織の視認性を高めることができる。多孔質構造体の厚みは、１０〜５００μｍであることが好ましく、より好ましくは２５〜１５０μｍである。多孔質構造体の空隙率は３０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上である。 The pore size of the porous structure is preferably 5.5 μm or less, more preferably 1.0 μm or less, still more preferably 0.75 μm or less. This makes it possible to improve the visibility of cells or tissues under observation with an optical microscope. The thickness of the porous structure is preferably 10 to 500 μm, more preferably 25 to 150 μm. The porosity of the porous structure is preferably 30% or more, more preferably 70% or more.

また、多孔質構造体は該構造体単独で載置部としても良く、また、多孔質構造体は前記した各種樹脂フィルム、ガラス板等と積層体を形成し、これを載置部とすることも可能である。この場合、樹脂フィルムやガラス板の全光線透過率は８０％以上であることが好ましい。また、この積層体を形成するにあたり接着剤は好適に用いられ、該接着剤としては低温に強いシリコン系やフッ素系の接着剤を好適に用いることができる。 Further, the porous structure may be used as a mounting portion by itself, and the porous structure may be used as a mounting portion by forming a laminated body with the various resin films, glass plates and the like described above. Is also possible. In this case, the total light transmittance of the resin film or glass plate is preferably 80% or more. Further, an adhesive is preferably used in forming this laminated body, and as the adhesive, a silicon-based or fluorine-based adhesive that is resistant to low temperatures can be preferably used.

本発明において本体部材が有する把持部は、把持のしやすさや、操作性の向上を目的として、角柱状であることが好ましい。 In the present invention, the grip portion of the main body member is preferably prismatic for the purpose of improving gripability and operability.

本発明の凍結保存用治具が有する把持部は、耐液体窒素素材により形成された部材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いることができる。 The grip portion of the cryopreservation jig of the present invention is preferably a member formed of a liquid nitrogen resistant material. As such a material, for example, various metals such as aluminum, iron, copper and stainless alloy, ABS resin, acrylic resin, polypropylene resin, polyethylene resin, fluororesin and various engineering plastics, and glass are preferably used. Can be done.

本発明の凍結保存用治具は、本体部に付設された載置部を被包可能な被包部材を有する。該被包部材は、一方の端部が本体部が有するテーパー構造部と嵌合・固定するための開口部を有し、もう一方の端部が開口部を有さない筒状の被包部材であることが好ましく、作業性の観点から該被包部材は円筒形状であることが好ましい。 The cryopreservation jig of the present invention has an encapsulating member capable of encapsulating a mounting portion attached to the main body portion. The encapsulating member is a tubular encapsulating member having an opening at one end for fitting and fixing to a tapered structure portion of the main body and the other end having no opening. From the viewpoint of workability, the encapsulated member preferably has a cylindrical shape.

本発明の凍結保存用治具は、結晶性高分子化合物により形成された被包部材を有する。結晶性高分子化合物とは、高分子鎖が規則正しく配列している所謂結晶状態を有する高分子化合物であり、結晶状態を有さず非晶状態のみからなる所謂、非晶性高分子化合物とは区別される化合物である。本発明において被包部材を形成する結晶性高分子化合物としては、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリエチレンナフタレート樹脂、ポリアミド樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリブチレンテレフタラート樹脂、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、液晶ポリマー等が例示される。中でも破損等の不具合の生じないスムーズな嵌合と、嵌合後の強固な固定を両立することが可能であり、かつ被包部材への加工性に優れるとの観点から、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、およびポリエチレンテレフタレート樹脂により形成された被包部材は好適である。被包部材は、一種類の結晶性高分子化合物を含有してもよいし、複数種類の結晶性高分子化合物を含有してもよい。また、本発明の被包部材は、結晶性高分子化合物の他に、フィラーや可塑剤などの結晶性高分子化合物以外の成分を含有することができる。被包部材が該結晶性高分子化合物以外の成分を含有する場合には、結晶性高分子化合物に対する割合が１０質量％を超えない範囲とすることが好ましい。 The cryopreservation jig of the present invention has an encapsulating member formed of a crystalline polymer compound. The crystalline polymer compound is a polymer compound having a so-called crystalline state in which polymer chains are regularly arranged, and is a so-called amorphous polymer compound having only an amorphous state without having a crystalline state. It is a distinct compound. In the present invention, the crystalline polymer compound forming the encapsulating member includes polyethylene terephthalate resin, polyethylene naphthalate resin, polyamide resin, polyacetal resin, polybutylene terephthalate resin, polyphenylene sulfide resin, polyether ether ketone resin, and polytetra. Examples thereof include fluoroethylene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, and liquid crystal polymer. Above all, polyethylene resin and polypropylene resin are made of polyethylene resin and polypropylene resin from the viewpoints that smooth fitting that does not cause problems such as breakage and strong fixing after fitting can be achieved and that the workability to the encapsulating member is excellent. , And an encapsulating member made of polyethylene terephthalate resin is suitable. The encapsulating member may contain one kind of crystalline polymer compound, or may contain a plurality of kinds of crystalline polymer compounds. Further, the encapsulating member of the present invention may contain components other than the crystalline polymer compound such as a filler and a plasticizer in addition to the crystalline polymer compound. When the encapsulating member contains a component other than the crystalline polymer compound, it is preferable that the ratio to the crystalline polymer compound does not exceed 10% by mass.

本発明の凍結保存用治具が有する被包部材は透明性を有することが好ましい。被包部材が透明性を有する場合、凍結作業の際に、被包部材に被包された載置部の様子を確認でき、作業性が向上する。また、保管作業、融解作業の際にも、載置部材を本体部材に嵌合・固定したまま載置部の様子を確認することができる。本発明において透明性を有するとは、被包部材のヘイズが３０％以下であることを意味し、より好ましくは１５％以下である。かかる被包部材として、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂により形成された被包部材は好適である。 The encapsulated member of the cryopreservation jig of the present invention preferably has transparency. When the encapsulating member has transparency, the state of the mounting portion encapsulated by the encapsulating member can be confirmed during the freezing operation, and the workability is improved. Further, even during the storage work and the melting work, the state of the mounting portion can be confirmed while the mounting member is fitted and fixed to the main body member. Having transparency in the present invention means that the haze of the encapsulated member is 30% or less, more preferably 15% or less. As such an encapsulating member, an encapsulating member formed of polypropylene resin or polyethylene terephthalate resin is suitable.

本発明の凍結保存用治具が有する被包部材の厚み（被包部材の側面部を形成する部材の厚み）は、０．１〜０．５ｍｍであることが好ましい。より好ましくは、０．２〜０．４ｍｍである。被包部材の厚みが０．１ｍｍを下回る場合、液体窒素中で被包部材を嵌合した際、被包部材の強度が十分でない場合がある。一方、被包部材の厚みが０．５ｍｍを超える場合には、液体窒素下で本体部材と被包部材を嵌合・固定した際に、強固な固定ができない場合や、本体部材と被包部材の嵌合・固定を解除する際にスムーズに解除することができない場合がある。 The thickness of the encapsulated member (thickness of the member forming the side surface portion of the encapsulated member) of the cryopreservation jig of the present invention is preferably 0.1 to 0.5 mm. More preferably, it is 0.2 to 0.4 mm. If the thickness of the encapsulating member is less than 0.1 mm, the strength of the encapsulating member may not be sufficient when the encapsulating member is fitted in liquid nitrogen. On the other hand, when the thickness of the encapsulating member exceeds 0.5 mm, when the main body member and the encapsulating member are fitted and fixed under liquid nitrogen, it may not be firmly fixed, or the main body member and the encapsulating member may not be firmly fixed. It may not be possible to release the fitting / fixing smoothly.

前述したように、本発明の凍結保存用治具が有する被包部材は、本体部材が有するテーパー構造部と嵌合・固定が可能な側が開口部を有し、もう一方の端部が封止されている筒状の被包部材であることが好ましい。被包部材の一端が封止されていることによって、より効果的に細胞又は組織を保護することが可能となる。被包部材の一端を封止する際には、載置部を完全に外界と遮断することを目的として、例えば、熱処理等による二次加工を用いて完全に封止する他に、例えば封止部として通気可能なフィルター部材を用いて封止することもできる。通気可能なフィルター部材を用いて封止すると、仮に、液体窒素下で凍結保管中の被包部材と本体部が嵌合・固定された状態のガラス化凍結保存用治具が、不意な事故により室温下にさらされ、被包部内の空気の体積膨張が生じた際にも、被包部材の破裂・破損を防止することができるため、好ましい。 As described above, the encapsulated member of the cryopreservation jig of the present invention has an opening on the side capable of fitting and fixing with the tapered structure portion of the main body member, and the other end is sealed. It is preferably a tubular encapsulation member. By sealing one end of the encapsulating member, it is possible to protect cells or tissues more effectively. When sealing one end of the encapsulating member, for the purpose of completely blocking the mounting portion from the outside world, for example, in addition to completely sealing by secondary processing such as heat treatment, for example, sealing. It can also be sealed using a filter member that can be ventilated as a part. When sealed using a breathable filter member, a vitrified cryopreservation jig in which the encapsulating member and the main body, which are frozen and stored under liquid nitrogen, are fitted and fixed, is unexpectedly accidentally caused. It is preferable because it can prevent the encapsulating member from bursting or breaking even when it is exposed to room temperature and the volume of air in the encapsulating portion expands.

本発明の凍結保存用治具が有する被包部材は、前記した封止部として、重りによって被包部材の一端を封止することが好ましい。被包部材が重りを有すると、液体窒素等の冷媒中で嵌合・固定作業をする際に、被包部材の浮上による作業性の低下を緩和できる。 The encapsulated member of the cryopreservation jig of the present invention preferably has one end of the encapsulated member sealed with a weight as the sealing portion described above. When the encapsulating member has a weight, it is possible to alleviate a decrease in workability due to floating of the encapsulating member when fitting / fixing work in a refrigerant such as liquid nitrogen.

本発明の凍結保存用治具が有する本体部材は、被包部材を固定するためのテーパー構造部を有する。本発明の本体部材が有するテーパー構造部は、本体部材の載置部側に位置し、該載置部側を最小外径として、該載置部側とは反対側に向かって拡径する円錐台の側面状の構造を有することが好ましい。 The main body member of the cryopreservation jig of the present invention has a tapered structure for fixing the encapsulated member. The tapered structure portion of the main body member of the present invention is located on the mounting portion side of the main body member, and the diameter of the conical portion expands toward the side opposite to the mounting portion side with the mounting portion side as the minimum outer diameter. It is preferable to have a side surface structure of the table.

本発明の凍結保存用治具において本体部材が有するテーパー構造部は、その側面部に、嵌合方向に対して略平行な嵌合時非接触部を有する。嵌合時非接触部とは、本体部材に被包部材を嵌合させたときに、テーパー構造部表面で被包部材の内壁と接しない部位のことである。該嵌合時非接触部を有することにより、本体部材と被包部材を嵌合・固定する際、および本体部材と被包部材の嵌合・固定を解除する際において、スムーズな嵌合・固定、およびその解除が可能となる。 In the cryopreservation jig of the present invention, the tapered structure portion of the main body member has a non-contact portion at the time of fitting substantially parallel to the fitting direction on the side surface portion thereof. The non-contact portion at the time of fitting is a portion on the surface of the tapered structure portion that does not come into contact with the inner wall of the encapsulated member when the encapsulated member is fitted to the main body member. By having the non-contact portion at the time of fitting, smooth fitting / fixing is performed when fitting / fixing the main body member and the encapsulated member and when releasing the fitting / fixing of the main body member and the encapsulated member. , And its release is possible.

上述した嵌合時非接触部は、被包部材を本体部材に嵌合した際に、本体部材と被包部材が接さない部分をテーパー構造部に付与することから、挿入・嵌合時及び、嵌合を解除する際の抵抗感を軽減することができる。液体窒素中のような極低温環境下では、素材の熱収縮による寸法変化が生じ、常温環境下における抵抗感と異なることがあり、抵抗感の低減が特に重要である。この抵抗感の低減により、極低温環境下での、強固な固定と、スムーズな挿入・嵌合及びその解除を両立することができる。 The above-mentioned non-contact portion at the time of fitting provides a portion where the main body member and the enclosed member do not contact the tapered structure portion when the encapsulated member is fitted to the main body member. , It is possible to reduce the feeling of resistance when releasing the fitting. In a cryogenic environment such as in liquid nitrogen, dimensional changes occur due to heat shrinkage of the material, which may differ from the resistance feeling in a normal temperature environment, and reduction of the resistance feeling is particularly important. By reducing this feeling of resistance, it is possible to achieve both strong fixing in an extremely low temperature environment, smooth insertion / fitting, and release thereof.

本発明において本体部材のテーパー構造部が有する嵌合時非接触部の形状は、被包部材を本体部材に嵌合した際に、被包部材の内壁に接しない構造であれば、特に限定されない。溝状の形状や、テーパー構造の一部に平坦構造を有する形状などが挙げられる。また、該嵌合時非接触部は、本体部材のテーパー構造中、被包部材の内径と等しい箇所および／または被包部材の内径よりも大きい箇所に位置することが好ましい。被包部材を嵌合する方向に対する嵌合時非接触部表面の角度は４５°の範囲内であることが好ましく、より好ましくは３０°の範囲内である。４５°を上回った場合、嵌合・固定された被包部材のスムーズな解除が困難になる場合がある。 In the present invention, the shape of the non-contact portion at the time of fitting of the tapered structure portion of the main body member is not particularly limited as long as the structure does not come into contact with the inner wall of the enclosed member when the encapsulated member is fitted to the main body member. .. Examples thereof include a groove-like shape and a shape having a flat structure as a part of the tapered structure. Further, the non-contact portion at the time of fitting is preferably located at a portion equal to the inner diameter of the encapsulated member and / or a portion larger than the inner diameter of the encapsulated member in the tapered structure of the main body member. The angle of the surface of the non-contact portion at the time of fitting with respect to the fitting direction of the encapsulating member is preferably within the range of 45 °, more preferably within the range of 30 °. If it exceeds 45 °, it may be difficult to smoothly release the fitted / fixed encapsulating member.

本発明において本体部材のテーパー構造部が有する嵌合時非接触部は、１カ所以上であることが好ましい。より好ましくは３カ所以上である。本体部材のテーパー構造部が有する嵌合時非接触部が多いほど、抵抗感を均一に分散でき、挿入・嵌合時及び、嵌合を解除する際の作業性の観点で好ましい。また、上記した嵌合時非接触部は、テーパー構造部の表面積に対して、８０％を超えない範囲であることが好ましい。 In the present invention, it is preferable that the tapered structure portion of the main body member has one or more non-contact portions at the time of fitting. More preferably, there are three or more places. The more the tapered structure of the main body member has a non-contact portion at the time of fitting, the more the resistance feeling can be uniformly dispersed, which is preferable from the viewpoint of workability at the time of insertion / fitting and at the time of releasing the fitting. Further, the non-contact portion at the time of fitting is preferably in a range not exceeding 80% with respect to the surface area of the tapered structure portion.

本発明の凍結保存用治具が有する本体部材のテーパー構造部の拡径の程度［（径の拡張幅）／（テーパー構造部の嵌合方向の長さ）］は、０．０１〜０．２５であることが好ましい。より好ましくは０．０６〜０．１５である。拡径の程度が０．０１を下回る場合には、極低温環境下での部材の寸法変化により、本体部材のテーパー構造部に被包部材をスムーズに嵌合することが困難な場合がある。一方で、拡径の程度が０．２５を超える場合には、被包部材を強固に固定することが困難な場合がある。なお、本発明の凍結保存用治具が有する本体部材のテーパー構造部はその拡径構造が連続せずに、複数個所に分かれていても良い。 The degree of diameter expansion of the tapered structure portion of the main body member [(diameter expansion width) / (length in the fitting direction of the taper structure portion)] of the cryopreservation jig of the present invention is 0.01 to 0. It is preferably 25. More preferably, it is 0.06 to 0.15. When the degree of diameter expansion is less than 0.01, it may be difficult to smoothly fit the encapsulated member to the tapered structure portion of the main body member due to the dimensional change of the member in an extremely low temperature environment. On the other hand, when the degree of diameter expansion exceeds 0.25, it may be difficult to firmly fix the encapsulated member. The tapered structure of the main body member of the cryopreservation jig of the present invention may be divided into a plurality of places without the diameter-expanding structure being continuous.

本発明の凍結保存用治具は、本体部材のテーパー構造部の拡径した最大径部分が被包部材の開口部の最大内径よりも大きいことが好ましい。本体部材のテーパー構造部の最大拡径部分が、被包部材の最大内径よりも大きいことにより、極低温環境下において本体部材に被包部材を強固に嵌合させることができる。被包部材は、本体部材のテーパー構造部に追従する形で変形・拡張して嵌合されることにより、より強固な嵌合が可能となる。 In the cryopreservation jig of the present invention, it is preferable that the enlarged maximum diameter portion of the tapered structure portion of the main body member is larger than the maximum inner diameter portion of the opening portion of the encapsulated member. Since the maximum diameter-expanded portion of the tapered structure portion of the main body member is larger than the maximum inner diameter of the encapsulated member, the encapsulated member can be firmly fitted to the main body member in a cryogenic environment. The encapsulated member is deformed / expanded and fitted so as to follow the tapered structure portion of the main body member, so that a stronger fitting is possible.

以上、本発明における凍結保存用治具の構成について説明した。以下、本発明の凍結保存用治具を、図面に沿ってさらに詳細に説明する。 The configuration of the cryopreservation jig in the present invention has been described above. Hereinafter, the cryopreservation jig of the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.

図１は、本発明の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において、凍結保存用治具８は、本体部材４と被包部材５から構成される。本体部材４は、細胞又は組織を載置する短冊状の載置部１とそれに付設された把持部３を有する。また、本体部材４は被包部材を嵌合・固定可能なテーパー構造部２を有する。なお、図１では本体部材のテーパー構造部２が有する嵌合時非接触部は記載していない。 FIG. 1 is an overall view showing an example of the cryopreservation jig of the present invention. In FIG. 1, the cryopreservation jig 8 is composed of a main body member 4 and an encapsulating member 5. The main body member 4 has a strip-shaped mounting portion 1 on which cells or tissues are placed and a grip portion 3 attached thereto. Further, the main body member 4 has a tapered structure portion 2 into which the encapsulated member can be fitted and fixed. Note that FIG. 1 does not show the non-contact portion at the time of fitting that the tapered structure portion 2 of the main body member has.

図２は、被包部材が本体部材に嵌合・固定された状態の一例を示す全体図である。図２において、被包部材５は、その一端が本体部材４が有するテーパー構造部２に嵌合・固定されている。このようにして、細胞又は組織が載置される載置部１は被包部材５に被包され、保護される。なお、図２では、図１と同様に、本体部材のテーパー構造部２が有する嵌合時非接触部は記載していない。 FIG. 2 is an overall view showing an example of a state in which the encapsulated member is fitted and fixed to the main body member. In FIG. 2, one end of the enclosed member 5 is fitted and fixed to the tapered structure portion 2 of the main body member 4. In this way, the mounting portion 1 on which the cells or tissues are placed is encapsulated and protected by the encapsulating member 5. Note that, as in FIG. 1, FIG. 2 does not show the non-contact portion at the time of fitting that the tapered structure portion 2 of the main body member has.

図３は、本発明の凍結保存用治具の別の一例を示す全体図であり、被包部材５が本体部材４に嵌合・固定された状態を示している。なお図３では、図１、図２と同様に、本体部材のテーパー構造部２が有する嵌合時非接触部は記載していない。図３において凍結保存用治具８は、被包部材５の開口部と反対側の一端に封止部６を有する。封止部６を有することにより、細胞又は組織を載置した載置部１をより効果的に保護することができる。 FIG. 3 is an overall view showing another example of the cryopreservation jig of the present invention, showing a state in which the encapsulated member 5 is fitted and fixed to the main body member 4. Note that FIG. 3 does not show the non-contact portion at the time of fitting that the tapered structure portion 2 of the main body member has, as in FIGS. 1 and 2. In FIG. 3, the cryopreservation jig 8 has a sealing portion 6 at one end opposite to the opening of the enclosed member 5. By having the sealing portion 6, the placement portion 1 on which the cells or tissues are placed can be more effectively protected.

図４は、本体部材が有するテーパー構造部の側面図の一例である。図４に示す凍結保存用治具の本体部が有するテーパー構造部２は、それぞれが対向する位置に嵌合時非接触部７を都合４カ所有する。テーパー構造部２が嵌合時非接触部７を有することにより、本体部材と被包部材を嵌合・固定する際、および本体部材と被包部材の嵌合・固定を解除する際において、スムーズな嵌合・固定、およびその解除が可能となる。 FIG. 4 is an example of a side view of the tapered structure portion of the main body member. The tapered structure portion 2 of the main body portion of the cryopreservation jig shown in FIG. 4 has four non-contact portions 7 at the time of fitting at positions facing each other. Since the tapered structure portion 2 has the non-contact portion 7 at the time of fitting, it is smooth when fitting / fixing the main body member and the encapsulated member and when releasing the fitting / fixing between the main body member and the encapsulated member. It is possible to fit, fix, and release it.

図５は、図４に示す凍結保存用治具の本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図である。テーパー構造部２の外周は、破線で示す被包部材５（実在しない仮の被包部材）の内壁と接することにより、強固に固定される。一方で、４カ所の嵌合時非接触部７においては、被包部材５（実在しない仮の被包部材）の内壁と接しないことから、スムーズな嵌合・固定が可能となる。また、嵌合・固定の解除の際には、スムーズな解除が可能となる。 FIG. 5 is a vertical cross-sectional view of a tapered structure portion of the main body member of the cryopreservation jig shown in FIG. The outer circumference of the tapered structure portion 2 is firmly fixed by being in contact with the inner wall of the encapsulating member 5 (temporary encapsulating member that does not exist) shown by the broken line. On the other hand, since the four non-contact portions 7 at the time of fitting do not come into contact with the inner wall of the encapsulated member 5 (temporary encapsulated member that does not exist), smooth fitting and fixing are possible. In addition, when the fitting / fixing is released, smooth release is possible.

図６は、本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図の別の一例であり、嵌合時非接触部７が１カ所に設けられた例である。この形態は先に示した図５のテーパー構造部を有する凍結保存用治具よりもやや劣るが、スムーズな嵌合・固定と強固な固定、および嵌合・固定のスムーズな解除を達成することができる。 FIG. 6 is another example of a vertical cross-sectional view of the tapered structure portion of the main body member, and is an example in which the non-contact portion 7 at the time of fitting is provided at one place. This form is slightly inferior to the cryopreservation jig having the tapered structure of FIG. 5 shown above, but it achieves smooth fitting / fixing and firm fixing, and smooth fitting / fixing release. Can be done.

図７は、本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。図７に示すテーパー構造部２は、その断面形状が溝形状の嵌合時非接触部７を有する。 FIG. 7 is another example of a vertical cross-sectional view of the tapered structure portion of the main body member. The tapered structure portion 2 shown in FIG. 7 has a non-contact portion 7 at the time of fitting whose cross-sectional shape is a groove shape.

図８は、本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。図８に示すテーパー構造部２は、その断面形状がＶ字型の嵌合時非接触部７を有する。 FIG. 8 is another example of a vertical cross-sectional view of the tapered structure portion of the main body member. The tapered structure portion 2 shown in FIG. 8 has a non-contact portion 7 at the time of fitting having a V-shaped cross section.

図９は、本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。図９に示すテーパー構造部２は、対向する２カ所に嵌合時非接触部７を有する。 FIG. 9 is another example of a vertical cross-sectional view of the tapered structure portion of the main body member. The tapered structure portion 2 shown in FIG. 9 has two non-contact portions 7 at the time of fitting, which are opposed to each other.

図１０は、本体部材が有するテーパー構造部の垂直断面図のまた別の一例である。図１０に示すテーパー構造部２は、嵌合時非接触部７を８カ所有する。 FIG. 10 is another example of a vertical cross-sectional view of the tapered structure portion of the main body member. The tapered structure portion 2 shown in FIG. 10 has eight non-contact portions 7 at the time of fitting.

本発明の凍結保存用治具を用いて細胞又は組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、凍結作業を行う際には、まず保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置部上に滴下する。次いで、前記細胞又は組織を載置部に保持させたまま該凍結保存用治具の本体部材を液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結することができる。次いで、被包部材を、液体窒素中で、本体部材のテーパー構造部に嵌合・固定する。この状態で、長期間、保管作業を行うことができる。保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有する保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含有する保存液を使用できる。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中に該凍結保存用治具の載置部を浸漬したまま、本体部材のテーパー構造部と被包部材の嵌合・固定を解除する。その後、凍結された細胞又は組織を載せた載置部を融解液中に浸漬させ、細胞又は組織を回収する。 The method of cryopreserving cells or tissues using the cryopreservation jig of the present invention is not particularly limited. For example, when performing a freezing operation, cells or tissues immersed in a preservation solution are first placed together with the preservation solution. Drop on the part. Next, the cells or tissues can be frozen by immersing the main body member of the cryopreservation jig in liquid nitrogen or the like while holding the cells or tissues in the placement portion. Next, the encapsulated member is fitted and fixed to the tapered structure portion of the main body member in liquid nitrogen. In this state, the storage work can be performed for a long period of time. As the storage solution, those usually used for freezing cells such as eggs and embryos can be used. For example, a freezing agent (glycerol, ethylene glycol, etc.) is added to a physiological solution such as the above-mentioned phosphate buffered saline. Preservation solution containing a large amount of various antifreeze agents such as glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide) (at least 10% by mass or more, more preferably 20% by mass or more based on the total mass of the preservation solution). Liquid can be used. During the thawing operation, the taper structure portion of the main body member and the encapsulating member are released from fitting / fixing while the mounting portion of the cryopreservation jig is immersed in a cooling solvent such as liquid nitrogen. Then, the place where the frozen cells or tissues are placed is immersed in the thawing solution, and the cells or tissues are collected.

本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、***等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織等）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２−２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。 Examples of cells that can be cryopreserved using the cryopreservation jig of the present invention include eggs, embryos, and sperms of mammals (for example, humans, cows, pigs, horses, rabbits, rats, mice, etc.). Germ cells such as: induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells) and other pluripotent stem cells. In addition, cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells can be mentioned. In addition, in one or more embodiments, the cells include cancer-derived cells such as fibroblasts, pancreatic cancer / hepatic cancer cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, nerve cells, chondrocytes, and tissue stem cells. And adhesive cells such as immune cells. Further, examples of tissues that can be cryopreserved include tissues composed of allogeneic or heterologous cells, such as tissues such as ovary, skin, corneal epithelium, periodontal ligament, and myocardium. The present invention is particularly suitable for cryopreservation of tissues having a sheet-like structure (for example, cell sheets, skin tissues, etc.). The jig for cryopreservation of the present invention is not limited to tissues directly collected from a living body, for example, cultured skin cultured and grown in vitro, a so-called cell sheet constructed in vitro, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-205516. It can also be suitably used for cryopreservation of artificial tissues such as the proposed tissue model having a three-dimensional structure. The cryopreservation jig of the present invention is suitably used as a cryopreservation jig for cells or tissues as described above.

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, and the present invention will be specifically described, but the present invention is not limited to the following Examples.

（実施例１）
図１に示す形態で実施例１の凍結保存用治具を作製した。該凍結保存用治具の被包部材としては、押出成型によりポリプロピレン樹脂からなる筒状部材を作製し、被包部材とした。被包部材の内径は２．７ｍｍ、外径は３．２ｍｍである。一方、本体部材については、射出成型したＡＢＳ樹脂からなる把持部をポリエチレンテレフタレート樹脂フィルムからなる載置部と連結させることで、本体部材を作製した。本体部材が有するテーパー構造部は、円錐台の側面状の形状であり、テーパー構造部の嵌合方向の長さ３ｍｍに対し、外径２．５ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍまで均一に拡径（径の拡張幅は０．３ｍｍ）する構造を基本とし、拡径の外径２．７ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍにわたって、図６に示すようなテーパー構造部の側面１カ所に平坦な嵌合時非接触部を有する構造とした。被包部材を嵌合する方向に対する嵌合時非接触部表面の角度は０°である。 (Example 1)
The cryopreservation jig of Example 1 was produced in the embodiment shown in FIG. As the encapsulating member of the cryopreservation jig, a tubular member made of polypropylene resin was produced by extrusion molding to form an encapsulating member. The inner diameter of the encapsulating member is 2.7 mm, and the outer diameter is 3.2 mm. On the other hand, as for the main body member, the main body member was manufactured by connecting the grip portion made of injection-molded ABS resin with the mounting portion made of polyethylene terephthalate resin film. The tapered structure of the main body member has a side shape of a conical base, and the outer diameter is from 2.5 mm to 2.8 mm of the maximum diameter expansion portion with respect to the length of the tapered structure in the fitting direction of 3 mm. Based on a structure that uniformly expands the diameter (expansion width of the diameter is 0.3 mm), the tapered structure portion as shown in FIG. 6 extends from the outer diameter of 2.7 mm of the expanded diameter to the outer diameter of 2.8 mm of the maximum expanded portion. The structure has a flat non-contact portion at the time of fitting at one position on the side surface of the above. The angle of the surface of the non-contact portion during fitting with respect to the fitting direction of the encapsulating member is 0 °.

（実施例２）
本体部材が有するテーパー構造部として、円錐台の側面状の形状であり、テーパー構造部の嵌合方向の長さ３ｍｍに対し、外径２．５ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍまで均一に拡径（径の拡張幅は０．３ｍｍ）する構造を基本とし、拡径の外径２．７ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍにわたって、図９に示すようなテーパー構造部の側面２カ所（向かい合った２面）に平坦な嵌合時非接触部を有する構造とした以外は、実施例１と同様にして、実施例２の凍結保存用治具を作製した。被包部材を嵌合する方向に対する嵌合時非接触部表面の角度は０°である。 (Example 2)
As the tapered structure part of the main body member, it has a side shape of a conical base, and the outer diameter is from 2.5 mm to 2.8 mm of the maximum diameter expansion part with respect to the length of 3 mm in the fitting direction of the tapered structure part. Based on a structure that uniformly expands the diameter (expansion width of the diameter is 0.3 mm), the tapered structure portion as shown in FIG. 9 extends from the outer diameter of 2.7 mm of the expanded diameter to the outer diameter of 2.8 mm of the maximum expanded portion. The cryopreservation jig of Example 2 was produced in the same manner as in Example 1 except that the structure had flat non-contact portions at the time of fitting on two side surfaces (two facing surfaces). The angle of the surface of the non-contact portion during fitting with respect to the fitting direction of the encapsulating member is 0 °.

（実施例３）
本体部材が有するテーパー構造部として、円錐台の側面状の形状であり、テーパー構造部の嵌合方向の長さ３ｍｍに対し、外径２．５ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍまで均一に拡径（径の拡張幅は０．３ｍｍ）する構造を基本とし、拡径の外径２．７ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍにわたって、図５に示すような、均等に位置するテーパー構造部の側面４カ所に平坦な嵌合時非接触部を有する構造とした以外は、実施例１と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。被包部材を嵌合する方向に対する嵌合時非接触部表面の角度は０°である。 (Example 3)
As the tapered structure part of the main body member, it has a side shape of a conical base, and the outer diameter is from 2.5 mm to 2.8 mm of the maximum diameter expansion part with respect to the length of 3 mm in the fitting direction of the tapered structure part. Based on a structure that uniformly expands the diameter (expansion width of the diameter is 0.3 mm), the outer diameter of the expanded diameter ranges from 2.7 mm to the outer diameter of the maximum expanded portion of 2.8 mm, as shown in FIG. The cryopreservation jig of Example 3 was produced in the same manner as in Example 1 except that the structure had flat non-contact portions at the time of fitting at four positions on the side surface of the tapered structure portion. The angle of the surface of the non-contact portion during fitting with respect to the fitting direction of the encapsulating member is 0 °.

（実施例４）
本体部材が有するテーパー構造部として、円錐台の側面状の形状であり、テーパー構造部の嵌合方向の長さ３ｍｍに対し、外径２．５ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍまで均一に拡径（径の拡張幅は０．３ｍｍ）する構造を基本とし、拡径の外径２．７ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍにわたって、図１０に示すような、均等に位置するテーパー構造部の側面８カ所に平坦な嵌合時非接触部を有する構造とした以外は、実施例１と同様にして、実施例４の凍結保存用治具を作製した。被包部材を嵌合する方向に対する嵌合時非接触部表面の角度は０°である。 (Example 4)
As the tapered structure part of the main body member, it has a side shape of a conical base, and the outer diameter is from 2.5 mm to 2.8 mm of the maximum diameter expansion part with respect to the length of 3 mm in the fitting direction of the tapered structure part. Based on a structure that uniformly expands the diameter (expansion width of the diameter is 0.3 mm), the outer diameter of the expanded diameter ranges from 2.7 mm to the outer diameter of the maximum expanded portion of 2.8 mm, as shown in FIG. The cryopreservation jig of Example 4 was produced in the same manner as in Example 1 except that the structure had flat non-contact portions at the time of fitting at eight positions on the side surface of the tapered structure portion. The angle of the surface of the non-contact portion at the time of fitting with respect to the direction in which the encapsulating member is fitted is 0 °.

（実施例５）
被包部材として、押出成型によりポリエチレンテレフタレート樹脂からなる筒状部材を作製し、被包部材とした以外は、実施例３と同様にして、実施例５の凍結保存用治具を作製した。 (Example 5)
As the encapsulating member, a tubular member made of polyethylene terephthalate resin was produced by extrusion molding, and the cryopreservation jig of Example 5 was produced in the same manner as in Example 3 except that the encapsulating member was used.

（実施例６）
被包部材として、押出成型により高密度ポリエチレン樹脂からなる筒状部材を作製し、被包部材とした以外は、実施例３と同様にして、実施例６の凍結保存用治具を作製した。 (Example 6)
As the encapsulating member, a tubular member made of high-density polyethylene resin was produced by extrusion molding, and the cryopreservation jig of Example 6 was produced in the same manner as in Example 3 except that the encapsulating member was used.

（比較例１）
被包部材として、押出成型によりポリ塩化ビニル樹脂からなる筒状部材を作製し、被包部材とした以外は、実施例３と同様にして、比較例２の凍結保存用治具を作製した。 (Comparative Example 1)
As the encapsulating member, a tubular member made of a polyvinyl chloride resin was produced by extrusion molding, and the cryopreservation jig of Comparative Example 2 was produced in the same manner as in Example 3 except that the encapsulating member was used.

（比較例２）
本体部材が有するテーパー構造部として、円錐台の側面状の形状であり、テーパー構造部の嵌合方向の長さ３ｍｍに対し、外径２．５ｍｍから最大拡径部分の外径２．８ｍｍまで均一に拡径（径の拡張幅は０．３ｍｍ）する構造とした以外は実施例１と同様にして、比較例２の凍結保存用治具を作製した。 (Comparative Example 2)
As the tapered structure part of the main body member, it has a side shape of a truncated cone, and the outer diameter is from 2.5 mm to 2.8 mm of the maximum diameter expansion part with respect to the length of 3 mm in the fitting direction of the tapered structure part. The cryopreservation jig of Comparative Example 2 was produced in the same manner as in Example 1 except that the structure was uniformly expanded (the expanded width of the diameter was 0.3 mm).

実施例１〜６及び比較例１、２の凍結保存用治具について、その嵌合性及び嵌合・固定の解除の作業性について、以下のように評価した。なお、各凍結保存用治具についてのそれぞれの評価は、３回繰り返して実施した。 The cryopreservation jigs of Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 and 2 were evaluated as follows regarding their fitability and workability of fitting / fixing release. Each evaluation of each cryopreservation jig was repeated three times.

＜嵌合性の評価＞
実施例１〜６及び比較例１、２の凍結保存用治具の載置部上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として、保存液０．１μＬと共に滴下付着させた。なお、保存液は、シグマアルドリッチ社製Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地に、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、１７質量％スクロースが含まれる組成のものを用いた。その後、載置部を液体窒素に浸漬させた。次に、ピンセットを用いて、液体窒素中で被包部材と本体部材を嵌合・固定させた。この際に被包部材の破損などが生じるか否かと、被包部材の固定の強さを「嵌合性の評価」として、以下の基準で評価し、結果を表１に示す。なお、嵌合部材を嵌合した状態で、載置部の様子を目視で確認する作業性については、実施例６のガラス化凍結保存用治具がやや劣っていた。 <Evaluation of fitability>
Glass beads (diameter 100 μm) were added dropwise together with 0.1 μL of the preservation solution as pseudo cells on the mounting portions of the cryopreservation jigs of Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 and 2. As the storage solution, a medium 199 medium manufactured by Sigma-Aldrich Co., Ltd. containing 15% by volume DMSO, 15% by volume ethylene glycol, and 17% by mass sucrose was used. Then, the mounting portion was immersed in liquid nitrogen. Next, using tweezers, the encapsulating member and the main body member were fitted and fixed in liquid nitrogen. At this time, whether or not the encapsulated member is damaged and the fixing strength of the encapsulated member are evaluated as "evaluation of fitability" according to the following criteria, and the results are shown in Table 1. The vitrification cryopreservation jig of Example 6 was slightly inferior in terms of workability for visually confirming the state of the mounting portion with the fitting member fitted.

○：被包部材に破損が生じずスムーズな嵌合作業が可能であり、被包部材は強固に固定されていた。
×：被包部材に破損が生じることがあった。または被包部材の固定が不十分であった。 ◯: The encapsulating member was not damaged and smooth fitting work was possible, and the encapsulating member was firmly fixed.
X: The encapsulating member may be damaged. Alternatively, the encapsulating member was not sufficiently fixed.

＜嵌合・固定の解除の作業性の評価＞
上記「嵌合性の評価」に次いで、実施例１〜６及び比較例１、２の凍結保存用治具について、嵌合・固定し、液体窒素中で１日間の保管作業の後に、融解作業を行う際に液体窒素中で、ピンセットを用いて被包部材の嵌合・固定を解除する際の作業性について、「嵌合・固定の解除の作業性の評価」として、以下の基準で評価し、結果を表１に示す。 <Evaluation of workability for releasing fitting / fixing>
Following the above "evaluation of fitability", the cryopreservation jigs of Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 and 2 were fitted and fixed, stored in liquid nitrogen for 1 day, and then thawed. The workability when releasing the fitting / fixing of the encapsulated member using a tweezers in liquid nitrogen is evaluated as "evaluation of the workability of fitting / fixing" according to the following criteria. The results are shown in Table 1.

◎：１０回の試行において９回以上スムーズな作業が可能だった。
○：１０回の試行においてスムーズな作業が可能な回数が５回以上９回未満だった。
△：１０回の試行においてスムーズな作業が可能な回数が５回未満だった。
×：１０回の試行においてスムーズに嵌合・固定の解除が行えず、作業が煩雑だった。または破損が生じるなどの不具合が生じた。 ⊚: Smooth work was possible 9 times or more in 10 trials.
◯: In 10 trials, the number of times that smooth work was possible was 5 times or more and less than 9 times.
Δ: The number of times that smooth work was possible in 10 trials was less than 5.
X: The fitting and fixing could not be smoothly released in 10 trials, and the work was complicated. Or, a problem such as damage has occurred.

上記の結果から、本発明の凍結保存用治具は凍結作業時において、載置部を含む本体部材と、載置部を被包・保護するための筒状の被包部材を嵌合・固定する際に、破損等の不具合の生じないスムーズな嵌合と、嵌合後の強固な固定、および嵌合・固定を解除する際のスムーズな作業性について、優れた性能を有することが分かる。 From the above results, the cryopreservation jig of the present invention fits and fixes the main body member including the mounting portion and the tubular encapsulating member for encapsulating and protecting the mounting portion during the freezing operation. It can be seen that it has excellent performance in terms of smooth fitting that does not cause problems such as breakage, firm fixing after fitting, and smooth workability when releasing fitting / fixing.

本発明は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織等の凍結保存に用いることができる。 The present invention relates to tests collected from living organisms including iPS cells, ES cells, commonly used cultured cells, embryos or eggs, as well as embryo transfer, artificial insemination, and artificial insemination of domestic animals such as cattle and animals. It can be used for cryopreservation of cells or tissues for use or transplantation, cells or tissues cultured in vitro.

１載置部
２テーパー構造部
３把持部
４本体部材
５被包部材
６封止部
７嵌合時非接触部
８凍結保存用治具 1 Mounting part 2 Tapered structure part 3 Gripping part 4 Main body member 5 Encapsulating member 6 Sealing part 7 Non-contact part at the time of fitting 8 Freezing storage jig

Claims

細胞又は組織を載置する載置部および該載置部に付設された把持部を少なくとも有する本体部材と、該本体部材の載置部を被包する被包部材とを有する細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具であって、前記した把持部は該被包部材を固定するためのテーパー構造部を有し、且つ該テーパー構造部が嵌合時非接触部を有し、さらに該被包部材が結晶性高分子化合物により形成された部材であることを特徴とする、細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具。 Glass of a cell or tissue having a mounting portion on which cells or tissues are placed, a main body member having at least a grip portion attached to the mounting portion, and an encapsulating member covering the mounting portion of the main body member. A jig for cryopreservation, wherein the grip portion has a tapered structure portion for fixing the encapsulating member, and the tapered structure portion has a non-contact portion at the time of fitting, and further, the covering portion. A jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues, wherein the packaging member is a member formed of a crystalline polymer compound.

被包部材がポリエチレンテレフタレート樹脂あるいはポリプロピレン樹脂により形成された部材であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具。 The jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues according to claim 1, wherein the encapsulating member is a member formed of polyethylene terephthalate resin or polypropylene resin.