JP2020127365A - Reaction mixture for cell-free protein synthesis, and cell-free protein synthesis method and cell-free protein synthesis kit using the same - Google Patents

Abstract

To provide a novel approach for inexpensively performing protein synthesis in a cell-free protein synthesis method.SOLUTION: A reaction mixture for cell-free protein synthesis contains a cell extract and inosinic acid.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法、及び無細胞タンパク質合成用キットに関する。 The present invention relates to a reaction mixture for cell-free protein synthesis, a cell-free protein synthesis method using the same, and a cell-free protein synthesis kit.

組換えタンパク質の生産方法としては、形質転換された細胞を培養することを含む、インビボでの方法と、いわゆる無細胞タンパク質合成方法と呼ばれる、細胞由来の抽出物（細胞抽出物）を用いるインビトロでの方法が知られている。 As a method for producing a recombinant protein, an in vivo method including culturing a transformed cell and an in vitro method using a cell-derived extract (cell extract), which is a so-called cell-free protein synthesis method, can be used. Is known.

工業規模でのタンパク質の生産方法としては、現段階ではインビボでの方法が優れていると考えられている。しかしながら、インビボでの方法と比較して、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、（１）タンパク質の合成のための資源を、目的とするタンパク質の独占的な産生に向けることができる点、（２）細胞の増殖又は生存に関わることがないため、遺伝子のコドン使用を反映させたｔＲＮＡレベルの変更、酸化還元電位、ｐＨ、あるいはイオン強度といった条件等、合成環境を柔軟に変更できる点、（３）精製されて適切に折りたたまれたタンパク質産物をそのまま簡単に回収できる点、（４）非天然で同位体標識されたアミノ酸を組み入れことができる点、（５）インビボで不安定、不溶性又は細胞毒性であるタンパク質を合成することができる点、（６）独特の補因子を必要とするためにインビボでは作ることが難しいタンパク質を合成することができる点、及び（７）インビボにおける発現のためのクローニング、細胞の形質転換等のプロセスを回避することができる点等の利点を有すると考えられる。このため、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、この分野の基盤技術になりつつあり、ある程度、確立された方法となっている（非特許文献１）。 As a method for producing a protein on an industrial scale, an in vivo method is considered to be excellent at this stage. However, compared to the in vivo method, the in vitro method for cell-free protein synthesis (1) can direct resources for protein synthesis to the exclusive production of the target protein, ( 2) Since it is not involved in cell growth or survival, the synthetic environment can be flexibly changed by changing the tRNA level reflecting the codon usage of the gene, conditions such as redox potential, pH, or ionic strength. 3) The purified and properly folded protein product can be easily recovered as it is, (4) the unnatural and isotope-labeled amino acid can be incorporated, and (5) the in vivo unstable, insoluble or cell. The ability to synthesize toxic proteins, (6) the ability to synthesize proteins that are difficult to make in vivo due to the need for unique cofactors, and (7) for in vivo expression. It is thought to have advantages such as the ability to avoid processes such as cloning and cell transformation. Therefore, the in vitro method of cell-free protein synthesis is becoming a basic technology in this field, and has been established to some extent (Non-Patent Document 1).

また、無細胞タンパク質合成方法に用いられる細胞抽出物としては、植物、動物、培養細胞、微生物等から調製した細胞抽出物が知られており、現在、キット化されたものが数社から市販されている。 Further, as cell extracts used in the cell-free protein synthesis method, cell extracts prepared from plants, animals, cultured cells, microorganisms, etc. are known, and currently, kits are commercially available from several companies. ing.

しかしながら、インビボでの方法と比較して、無細胞タンパク質合成方法は、タンパク質を合成するための反応持続時間が短いため、生産効率が低い。この反応持続時間を増加させるため、翻訳反応により消費される基質を供給するとともに、反応を阻害する副産物を透析により除去する透析膜を使用した連続的流系が開発された。しかしながら、この連続的流系によりタンパク質合成量を増加させるためには連続的に試薬を追加することが必要となり、試薬等のコストが嵩む等の問題があった。 However, compared with the in vivo method, the cell-free protein synthesis method has a low reaction duration for synthesizing the protein, and thus the production efficiency is low. In order to increase the duration of this reaction, a continuous flow system using a dialysis membrane has been developed, which supplies the substrate consumed by the translation reaction and removes by-products that inhibit the reaction by dialysis. However, in order to increase the amount of protein synthesis by this continuous flow system, it is necessary to continuously add reagents, and there is a problem that the cost of reagents and the like increases.

特に、無細胞タンパク質合成方法に用いられる試薬には、タンパク質合成反応に必要なＡＴＰ及びＧＴＰ、並びに、ＤＮＡを鋳型核酸として使用した場合にｍＲＮＡの合成に必要なＵＴＰ及びＣＴＰなどがあり、これらはかなり高価な試薬であるため、無細胞タンパク質合成方法はコストが極めて高い。この点に対して、上記のヌクレオシド三リン酸等より安価なヌクレオチド、例えば、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ及びＣＭＰを使用した無細胞タンパク質合成方法（特許文献１）、又はヌクレオシド、例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジン及びシチジンを使用した無細胞タンパク質合成方法（特許文献２）が報告されているが、それらの試薬もインビボでの方法に使用する試薬と比較して、かなり高価なものである。また、アデノシン、グアノシン等は水への溶解度が低いため、工業利用には適していない。 In particular, the reagents used in the cell-free protein synthesis method include ATP and GTP necessary for protein synthesis reaction, and UTP and CTP necessary for mRNA synthesis when DNA is used as a template nucleic acid. Since it is a fairly expensive reagent, the cell-free protein synthesis method is extremely expensive. In this respect, nucleotides cheaper than the above nucleoside triphosphates, for example, a cell-free protein synthesis method using AMP, GMP, UMP and CMP (Patent Document 1), or nucleosides such as adenosine, guanosine, A cell-free protein synthesis method using uridine and cytidine has been reported (Patent Document 2), but those reagents are considerably expensive as compared with the reagents used in the in vivo method. In addition, adenosine, guanosine and the like have low solubility in water and are not suitable for industrial use.

また、反応持続時間を増加させる別のアプローチとして、インビトロでの反応におけるエネルギー再生系を見直すことにより、一定の成果が得られており（特許文献３、非特許文献２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を１０時間で７００ｍｇ／Ｌ合成することに成功している（非特許文献３）。 Further, as another approach to increase the reaction duration, certain results have been obtained by reviewing the energy regeneration system in the reaction in vitro (Patent Document 3, Non-Patent Document 2), and granulocyte macrophage colony stimulation We succeeded in synthesizing 700 mg/L of the factor in 10 hours (Non-patent Document 3).

しかしながら、工業規模での生産においては、生産量及びコストを更に改善することが求められている。 However, in the production on an industrial scale, it is required to further improve the production amount and the cost.

特許第５０７４７６８号公報Japanese Patent No. 5074768 国際公開第２０１３/１８３６２７号International Publication No. 2013/183627 特許第５２５９０４６号公報Japanese Patent No. 5259046

Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６７，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．１６９−１８２Methods in molecular biology, vol. 267, Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, Second Edition, Humana Press Inc. , Totowa, NJ, pp. 169-182 Ｍｏｌ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｌ．，２００８年，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２２０，ｐｐ．１−１０Mol. Syst. Biol. , 2008, vol. 4, No. 220, pp. 1-10 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，２０１１年，ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．７，ｐｐ．１５７０−１５７８Biotechnol. Bioeng. , 2011, vol. 108, No. 7, pp. 1570-1578

本発明は、無細胞タンパク質合成方法において安価にタンパク質合成を行うための新規なアプローチを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel approach for inexpensive protein synthesis in a cell-free protein synthesis method.

本発明者らは、タンパク質合成のコストを低下させることを狙って無細胞タンパク質合成方法に関する反応条件を鋭意検討した結果、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰに対応したヌクレオチド及びヌクレオシドの代替物質としてイノシン酸を用いることにより、無細胞タンパク質合成方法により、安価にタンパク質を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have diligently studied reaction conditions relating to a cell-free protein synthesis method with the aim of reducing the cost of protein synthesis. As a result, inosinic acid as a substitute for nucleotides and nucleosides corresponding to ATP, GTP, UTP and CTP has been obtained. It was found that the protein can be synthesized at low cost by using the cell-free protein synthesis method, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
細胞抽出物とイノシン酸とを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。
［２］
上記細胞抽出物が、植物、動物及び微生物からなる群より選択される少なくとも１種の細胞由来の細胞抽出物である、［１］に記載の反応混合物。
［３］
上記微生物が大腸菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、［２］に記載の反応混合物。
［４］
上記大腸菌が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、［３］に記載の反応混合物。
［５］
上記細胞抽出物が、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物である、［１］〜［４］のいずれかに記載の反応混合物。
［６］
鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の反応混合物。
［７］
上記鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、［６］に記載の反応混合物。
［８］
上記エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート及びグルコース−６−ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［６］に記載の反応混合物。
［９］
［１］〜［８］のいずれかに記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
［１０］
細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
［１１］
［９］に記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。 That is, the present invention relates to the following inventions, for example.
[1]
A reaction mixture for cell-free protein synthesis, comprising a cell extract and inosinic acid.
[2]
The reaction mixture according to [1], wherein the cell extract is a cell extract derived from at least one cell selected from the group consisting of plants, animals and microorganisms.
[3]
The reaction mixture according to [2], wherein the microorganism is at least one selected from the group consisting of Escherichia coli and yeast.
[4]
The reaction mixture according to [3], wherein the E. coli is E. coli expressing T7 RNA polymerase.
[5]
The reaction mixture according to any one of [1] to [4], wherein the cell extract is a cell extract obtained from Escherichia coli cultured in a medium containing glycerol as a carbon source.
[6]
The reaction mixture according to any one of [1] to [5], further including a template nucleic acid, a substrate for protein synthesis of interest, and an energy source.
[7]
The reaction mixture according to [6], wherein the template nucleic acid contains at least one promoter and a DNA encoding a target protein.
[8]
The energy source is ATP, GTP, glucose, ribose, pyruvate, phosphoenolpyruvate, carbamoyl phosphate, acetyl phosphate, creatine phosphate, phosphopyruvate, glyceraldehyde-3-phosphate, 3-phosphoglycerate and glucose-6. -Phosphate, citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, α-ketoglutaric acid, succinyl CoA, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, glyoxylic acid and glutamic acid, at least one selected from the group consisting of: The reaction mixture according to [6].
[9]
A cell-free protein synthesis method using the reaction mixture according to any one of [1] to [8].
[10]
A cell-free protein synthesis kit comprising a cell extract and inosinic acid, a template nucleic acid, a substrate for protein synthesis of interest, and/or an energy source.
[11]
A protein obtained by the cell-free protein synthesis method according to [9].

本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、細胞抽出物と、工業的に大量生産可能なイノシン酸とを含むことにより、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ及びＣＭＰを用いるときと同等の生産性で安価にタンパク質を合成することができる。イノシン酸は、アデノシン及びグアノシンと比較して、溶解度が高いため取扱いが容易であるという利点もある。さらに、本発明の無細胞タンパク質合成方法によれば、上記本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いることにより、当該方法におけるタンパク質合成のコストを削減することができ、効率よく工業的にタンパク質生産を行うことができる。 Since the reaction mixture for cell-free protein synthesis of the present invention contains a cell extract and inosinic acid that can be industrially mass-produced, it has the same productivity and low cost as when AMP, GMP, UMP and CMP are used. A protein can be synthesized. Inosinic acid also has an advantage that it is easy to handle because it has a higher solubility than adenosine and guanosine. Furthermore, according to the cell-free protein synthesis method of the present invention, by using the above-mentioned reaction mixture for cell-free protein synthesis of the present invention, the cost of protein synthesis in the method can be reduced, and the protein can be efficiently and industrially produced. Production can be done.

試験例１において、グリセロールを炭素源とした改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒三角）と、グルコースを炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒丸）の比較を示すグラフである。In Test Example 1, the growth curve of the BL21 strain cultured in the modified 2×YTPG medium containing glycerol as a carbon source (black triangle) and the growth curve of the BL21 strain cultured in the normal 2×YTPG medium containing glucose as the carbon source. It is a graph which shows the comparison of (black circle). 試験例２において、無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。白三角は、改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果、白丸は通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果を示し、黒三角及び黒丸はｐＵＣ−ＧＦＰの代わりに水を加えたネガティブコントロールの結果を示す（黒三角：改変２×ＹＴＰＧ培地、黒丸：通常の２×ＹＴＰＧ培地）。7 is a graph showing the results of time-dependent measurement of fluorescence intensity of GFP synthesized by the cell-free protein synthesis method in Test Example 2. Open triangles show the results of using the BL21 strain cultivated in the modified 2×YTPG medium, open circles show the results of using the BL21 strain cultivated in the usual 2×YTPG medium, and the filled triangles and filled circles are instead of pUC-GFP. The results of the negative control to which water is added are shown (black triangle: modified 2×YTPG medium, black circle: normal 2×YTPG medium). 実施例１において、無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を比較した結果を示すグラフである。黒棒は、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ及びＣＭＰを含む反応混合物の結果を示し、斜線棒は、イノシン酸を含む反応混合物の結果を示す。3 is a graph showing the results of comparing the fluorescence intensities of GFP synthesized by the cell-free protein synthesis method in Example 1. Black bars show the results of the reaction mixture containing AMP, GMP, UMP and CMP, and the shaded bars show the results of the reaction mixture containing inosinic acid.

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施態様に限定されるものではない。 Hereinafter, modes for carrying out the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.

〔無細胞系タンパク質合成用反応混合物〕
本発明に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物（以下、単に「反応混合物」ともいう。）は、細胞抽出物とイノシン酸とを含む。 [Reaction mixture for cell-free protein synthesis]
The reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present invention (hereinafter, also simply referred to as “reaction mixture”) contains a cell extract and inosinic acid.

（細胞抽出物）
本実施形態に係る細胞抽出物は、鋳型核酸にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば、例えば、植物、動物、培養細胞、微生物等の任意の細胞由来のものを、当業者が適宜選択し用いることができる。 (Cell extract)
The cell extract according to the present embodiment is appropriately selected by those skilled in the art as long as it can produce a protein encoded by a template nucleic acid, for example, those derived from any cells such as plants, animals, cultured cells, and microorganisms. It can be selected and used.

植物由来の細胞抽出物としては、例えば、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科植物、ホウレンソウ等の種子の胚芽由来の細胞抽出物を挙げることができる。市販されている植物由来の細胞抽出物としては、例えばコムギ胚芽由来のｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ（プロメガ社製）、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（株式会社セルフリーサイエンス製）等を挙げることができる。 Examples of plant-derived cell extracts include cell extracts derived from wheat plants such as wheat, barley, rice, and corn, and seed germs such as spinach. Examples of commercially available plant-derived cell extracts include wheat germ-derived heat germ extract (manufactured by Promega Corp.) and PROTEIOS (manufactured by Cell Free Science Co., Ltd.).

動物由来の細胞抽出物としては、例えば、ウサギ、ヒト、ラット、マウス、サル等の哺乳動物の血球細胞及び生殖巣由来細胞等由来の細胞抽出物を挙げることができる。市販されている動物由来の細胞抽出物としては、例えばｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）等を挙げることができる。 Examples of animal-derived cell extracts include cell extracts derived from mammalian blood cells and gonad-derived cells of mammals such as rabbits, humans, rats, mice, and monkeys. Examples of commercially available animal-derived cell extracts include rabbit bit reticulocyte lysate systems (manufactured by Promega).

培養細胞由来の細胞抽出物としては、例えば、リンパ腫（リンホーマ）由来細胞、腫瘍細胞、幹細胞等、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（インヴィトロジェン株式会社製）及びＳｆ２１（インヴィトロジェン株式会社製）等の昆虫培養細胞、カイコ組織等由来の細胞抽出物を挙げることができる。また、昆虫細胞由来の細胞抽出物としては、Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ（島津製作所製）等の市販の昆虫細胞由来の細胞抽出物を利用することもできる。 Examples of the cell extract derived from cultured cells include lymphoma (lymphoma)-derived cells, tumor cells, stem cells, etc., insect cultured cells such as High Five (manufactured by Invitrogen Corporation) and Sf21 (manufactured by Invitrogen Corporation). , Cell extracts derived from silkworm tissues and the like. In addition, as the insect cell-derived cell extract, a commercially available insect cell-derived cell extract such as Transdirect insect cell (manufactured by Shimadzu Corporation) can also be used.

微生物由来の細胞抽出物としては、例えば、酵母、大腸菌等由来の細胞抽出物を用いることができる。酵母の細胞抽出物としては、例えば、Ｙｅａｓｔ， １９８６， Ｖｏｌ．２， ３５−５２、蛋白質核酸酵素， １９９１， Ｖｏｌ．３６， ２５４８−２５５４、特開２００４−２０８６４０号公報等に記載の方法で調製することができる。 As the cell extract derived from a microorganism, for example, a cell extract derived from yeast, Escherichia coli or the like can be used. Examples of the cell extract of yeast include Yeast, 1986, Vol. 2, 35-52, protein nucleic acid enzyme, 1991, Vol. 36, 2548-2554, JP 2004-208640 A, and the like.

酵母としては、有胞子酵母、担子菌酵母、不完全酵母のいずれも用いることができるが、有胞子酵母が好ましい。有胞子酵母としては***酵母が好ましい。***酵母としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等を挙げることができる。 As the yeast, any of spore yeast, basidiomycete yeast, and incomplete yeast can be used, and spore yeast is preferable. Fission yeast is preferred as the spore yeast. Examples of the fission yeast include Schizosaccaromyces cerevisiae and Schizosaccaromyces pombe.

また、酵母由来の細胞抽出物の調製は、例えば以下のように行うことができる。 The yeast-derived cell extract can be prepared, for example, as follows.

酵母菌体を、液体窒素などの不活性ガス、アセトン−ドライアイス等を用いて急激に凍結させ、菌体が凍結した状態で細胞の破砕を行う。 The yeast cells are rapidly frozen using an inert gas such as liquid nitrogen or acetone-dry ice, and the cells are crushed in the frozen state.

当該凍結した酵母菌体を破砕する方法としては、乳鉢中で乳棒を用いて当該酵母菌体をすり潰す方法、メタルコーンを破砕媒体としてマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いる方法などを挙げることができる。 As a method of crushing the frozen yeast cells, a method of grinding the yeast cells with a pestle in a mortar, a method of using a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) as a crushing medium with a metal cone Can be mentioned.

当該破砕した酵母菌体に、抽出用液を添加することにより酵母菌体抽出用液を調製することができる。抽出用液としては、当該抽出用液にプロテアーゼインヒビターを含有するものが好ましく、少なくともカリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール及び緩衝剤を含有するものがより好ましい。 A liquid for yeast cell extraction can be prepared by adding a liquid for extraction to the crushed yeast cells. The extraction liquid preferably contains a protease inhibitor in the extraction liquid, and more preferably contains at least a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol and a buffer.

上記カリウム塩としては、酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウム等を挙げることができ、酢酸カリウムが好ましい。当該カリウム塩の含有量は、１ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜３００ｍＭであることがより好ましい。 Examples of the potassium salt include potassium acetate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen citrate, potassium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide, potassium phthalate and the like. And potassium acetate is preferred. The content of the potassium salt is preferably 1 mM to 500 mM, more preferably 10 mM to 300 mM.

上記マグネシウム塩としては、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム等を挙げることができ、酢酸マグネシウムが好ましい。当該マグネシウム塩の含有量は、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましい。 Examples of the magnesium salt include magnesium acetate, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium iodide, magnesium lactate, magnesium nitrate, magnesium oxalate, and the like, and magnesium acetate is preferable. The content of the magnesium salt is preferably 0.01 mM to 10 mM, more preferably 0.1 mM to 5 mM.

上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）の含有量は、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましい。 The content of dithiothreitol (hereinafter sometimes referred to as “DTT”) is preferably 0.01 mM to 10 mM, more preferably 0.1 mM to 5 mM.

上記緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ等を挙げることができる。具体的には、当該緩衝剤は、上記抽出用液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用することが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものがより好ましい。当該緩衝剤の含有量は、５ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭであることがより好ましい。 Examples of the buffer include HEPES-KOH, Tris-HCl, acetic acid-sodium acetate, citric acid-sodium citrate, phosphoric acid, boric acid, MES, PIPES and the like. Specifically, it is preferable to use a buffering agent in which the pH of the extraction liquid is maintained at 4 to 10, and more preferably a buffering agent in which the pH is maintained at 6 to 8. The content of the buffer is preferably 5 mM to 200 mM, more preferably 10 mM to 100 mM.

大腸菌の細胞抽出物は、例えば、非特許文献１又は非特許文献３に記載の公知の方法に準じて行うことができ、例えば、１）大腸菌を培養する工程、２）大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程を経て得ることができる。 The cell extract of Escherichia coli can be performed, for example, according to a known method described in Non-Patent Document 1 or Non-Patent Document 3, for example, 1) a step of culturing E. coli, 2) collecting E. coli, and It can be obtained through a step of obtaining an extract.

１）大腸菌を培養する工程
細胞抽出物の作製に用いる大腸菌としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれも用いることができ、例えば、エシェリヒア・コリ Ａ１９、ＢＬ２１（ノバジェン株式会社）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ株式会社）、ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、ＤＨ１、ＧＩ６９８、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、Ｋ５（ＡＴＣＣ２３５０６）、Ｋ−１２、ＫＹ３２７６、ＭＣ１０００、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）、ＮＭＲ２、Ｎｏ．４９、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン株式会社）、ＴＢ１、Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン株式会社）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン株式会社）、Ｗ１４８５、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等の株を挙げることができる。 1) Step of culturing Escherichia coli Any Escherichia coli microorganism can be used as Escherichia coli used in the preparation of the cell extract. For example, Escherichia coli A19, BL21 (Novagen Corporation), BL21 ( DE3) (Life Technologies Co., Ltd.), BLR (DE3) (Merck Millipore), DH1, GI698, HB101, JM109, K5 (ATCC23506), K-12, KY3276, MC1000, MG1655 (ATCC47076), NMR2, No. 49, Rosetta (DE3) (Novagen Corporation), TB1, Tuner (Novagen Corporation), Tuner (DE3) (Novagen Corporation), W1485, W3110 (ATCC27325), XL1-Blue, XL2-Blue and the like. be able to.

また、細胞抽出物中にタンパク質合成に不利益を及ぼす内因性タンパク質が含まれる場合には、公知の遺伝子工学的手法により、使用する大腸菌から当該内因性タンパク質に関連する遺伝子を予め除去してもよい。 In addition, when the cell extract contains an endogenous protein that has a detrimental effect on protein synthesis, the gene associated with the endogenous protein may be previously removed from the E. coli to be used by a known genetic engineering technique. Good.

大腸菌を培養するための培地としては、大腸菌が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有する液体培地であり、培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。 The medium for culturing Escherichia coli is a liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by Escherichia coli, and any natural medium or synthetic medium can be used as long as the medium can be cultured efficiently. You may use.

炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、マルトース、グリセロールを用いることができる。炭素源としては、グルコース及びグリセロールが好ましく、グリセロールがより好ましい。 As the carbon source, for example, glucose, sucrose, maltose, glycerol can be used. As the carbon source, glucose and glycerol are preferable, and glycerol is more preferable.

窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。 As the nitrogen source, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.

無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。 As the inorganic salt, for example, potassium primary phosphate, potassium secondary phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.

大腸菌を培養するための培地の具体例としては、例えば、２×ＹＴＰＧ培地、２×ＹＴＰＧ培地のグルコースをグリセロールに替えた、改変２×ＹＴＰＧ培地（表１）等を挙げることができる。培養時の発泡を防ぐために、当該培地に公知の消泡剤を添加することが好ましい。消泡剤としては、例えばアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓ等が挙げられる。消泡剤の添加量としては、例えば、０．５〜２ｍｌ／Ｌであってよく、１ｍｌ／Ｌであることが好ましい。培地のｐＨは、例えば、６〜８であってよく、ｐＨ７であることが好ましい。培地のｐＨの調整は、ＮａＯＨ等を用いて行うことができる。 Specific examples of the medium for culturing Escherichia coli include, for example, a modified 2×YTPG medium (Table 1) in which 2×YTPG medium and 2×YTPG medium glucose are replaced with glycerol. In order to prevent foaming during culture, it is preferable to add a known antifoaming agent to the medium. Examples of the defoaming agent include ADEKA (registered trademark) LG-295S and the like. The amount of defoaming agent added may be, for example, 0.5 to 2 ml/L, and is preferably 1 ml/L. The pH of the medium may be, for example, 6 to 8, preferably pH 7. The pH of the medium can be adjusted using NaOH or the like.

また、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能な大腸菌を用いた場合には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ等を予め含んだ細胞抽出物が得られる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の発現がＩＰＴＧのような誘導剤により惹起される場合には培地にＩＰＴＧ等の誘導剤を加えればよい。 When Escherichia coli capable of expressing T7 RNA polymerase or the like is used, a cell extract containing T7 RNA polymerase or the like in advance can be obtained. When the expression of T7 RNA polymerase or the like is induced by an inducer such as IPTG, an inducer such as IPTG may be added to the medium.

培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、例えば、１５〜４０℃で行うことができる。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養中のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。 The culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature can be, for example, 15 to 40°C. The pH of the culture medium during culturing is preferably maintained at 3.0 to 9.0. The pH adjustment during the culture can be performed using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.

培養は、例えば、対数増殖初期〜後期に達するまで行ってよく、対数増殖中期に達するまで行うのが好ましい。培養時間がこれらの範囲にあることで、タンパク質合成効率がより優れる細胞抽出物を得ることができる。培養培地として改変２×ＹＴＰＧ培地を用いる場合には、培養温度３６℃で、４〜６時間培養することで通常対数増殖中期に達する。 The culturing may be carried out, for example, until the early logarithmic phase to the late logarithmic growth, and preferably until the midlogarithmic growth phase is reached. When the culturing time is within these ranges, a cell extract having more excellent protein synthesis efficiency can be obtained. When a modified 2×YTPG medium is used as the culture medium, the medium logarithmic growth phase is usually reached by culturing at a culture temperature of 36° C. for 4 to 6 hours.

高濃度の菌体培養液を得るために、培養時間の経過に応じて連続的又は断続的に培地（フィード液）を培養液中へ流加する流加培養を行ってもよい。流加培養は大腸菌において公知の方法に準じて行えばよい。また、この流加培養において、フィード液中の炭素源としては、上記培養培地で挙げた炭素源を用いることができる。例えば、培養培地においてグリセロールを用いた場合には、フィード液の炭素源としてグリセロールを用いることが好ましい。炭素源の濃度を菌体の増殖に応じて調製したフィード液を準備してもよいが、３０〜７０％の炭素源を含むフィード液を、菌体の増殖に合わせて適切な量で培養液中へ添加してもよい。 In order to obtain a high-concentration cell culture solution, fed-batch culture may be carried out in which the medium (feed solution) is fed into the culture solution continuously or intermittently according to the lapse of culture time. Fed-batch culture may be performed according to a known method in E. coli. Further, in this fed-batch culture, the carbon source mentioned in the above culture medium can be used as the carbon source in the feed solution. For example, when glycerol is used in the culture medium, it is preferable to use glycerol as the carbon source of the feed solution. A feed solution may be prepared in which the concentration of the carbon source is adjusted according to the growth of the bacterial cells, but the feed solution containing 30 to 70% of the carbon source is a culture solution in an appropriate amount according to the growth of the bacterial cells. You may add in.

２）培養した大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程
１）の工程で培養した大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程は、無細胞タンパク質合成の目的のために当該分野において既知の方法により行うことができる。例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載のプロトコルに準じて行うことができる。細胞抽出物を得るための具体的な方法としては、例えば以下のような、培養した大腸菌の菌体を回収し、回収した大腸菌の菌体を破壊する方法等を挙げることができる。 2) Step of recovering cultured Escherichia coli and obtaining cell extract The step of recovering Escherichia coli cultured in the step 1) and obtaining a cell extract from the recovered Escherichia coli is performed in the art for the purpose of cell-free protein synthesis. Can be carried out by a known method. For example, it can be performed according to the protocols described in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2. As a specific method for obtaining the cell extract, for example, a method of recovering the cultured Escherichia coli cells and destroying the recovered E. coli cells can be mentioned, for example.

２）の工程において、培養液から菌体を回収し、細胞抽出物を得るまでは低温に保って行うことが好ましい。具体的には、例えば、０〜１５℃、好ましくは２〜１０℃の低温に保って行うことができる。 In the step 2), it is preferable that the cells are collected from the culture solution and kept at a low temperature until the cell extract is obtained. Specifically, it can be carried out, for example, at a low temperature of 0 to 15°C, preferably 2 to 10°C.

大腸菌培養液から大腸菌の菌体を回収する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、７，０００〜１４，０００×ｇの条件で２０〜５０分間、遠心分離することにより大腸菌の菌体を回収することができる。 Examples of the method for recovering Escherichia coli cells from the E. coli culture solution include a centrifugation method and a filtration method. For example, the bacterial cells of Escherichia coli can be recovered by centrifugation for 20 to 50 minutes under the condition of 4° C. and 7,000 to 14,000×g.

回収後に、培地成分等を除去するため、回収した大腸菌の菌体を洗浄する工程を含むことが好ましい。洗浄溶液としては、無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液、例えば、Ｓ３０緩衝液等が用いられる。Ｓ３０緩衝液は以下のように調製することができる。例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール６．０６ｇ、酢酸マグネシウム四水和物１５．０ｇ及び酢酸カリウム２９．４ｇを約４５０ｍｌの純水、好ましくはｍｉｌｉ−Ｑ等の超純水に溶解する。溶解後、酢酸でｐＨ８．２に調整し、５００ｍｌにメスアップし、０．２２μｍのフィルターで滅菌する。得られたＳ３０緩衝液は４℃で保存することができ、使用直前に超純水で１０倍に希釈し、最終濃度が２ｍＭになるよう１Ｍ ＤＴＴ水溶液を加えたものを使用する。 After the collection, it is preferable to include a step of washing the collected Escherichia coli cells in order to remove the medium components and the like. As the washing solution, a solution containing an inorganic salt and a compound having a buffer action, for example, S30 buffer solution or the like is used. The S30 buffer can be prepared as follows. For example, 6.06 g of 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 15.0 g of magnesium acetate tetrahydrate and 29.4 g of potassium acetate are added to about 450 ml of pure water, preferably mili-Q. Dissolve in ultrapure water. After dissolution, the pH is adjusted to 8.2 with acetic acid, the volume is adjusted to 500 ml, and sterilized with a 0.22 μm filter. The obtained S30 buffer solution can be stored at 4° C., is diluted 10-fold with ultrapure water immediately before use, and 1 M DTT aqueous solution is added so that the final concentration becomes 2 mM.

上記の無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）を用いて大腸菌の菌体を洗浄する工程は、例えば、回収した菌体を、当該溶液に懸濁し、遠心分離で回収する工程を例えば２〜３回繰り返すことにより行うことができる。懸濁はホモジナイザー等を用いることにより効率的に均質化できる。均質化した懸濁液からの菌体の回収は、例えば４℃、９，０００〜１４，０００×ｇの条件で１０〜５０分間遠心分離することにより行うことができる。 The step of washing the bacterial cells of Escherichia coli using a solution containing the above-mentioned inorganic salt and a compound having a buffer action (for example, S30 buffer solution) includes, for example, suspending the recovered bacterial cells in the solution and centrifuging the suspension. It can be performed by repeating the collecting step, for example, 2-3 times. The suspension can be efficiently homogenized by using a homogenizer or the like. The cells can be recovered from the homogenized suspension by centrifugation at, for example, 4° C. and 9,000 to 14,000×g for 10 to 50 minutes.

当該洗浄した菌体は−８０℃で保存することができる。−８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。 The washed cells can be stored at -80°C. Freezing at −80° C. is preferably performed by rapid cooling using liquid nitrogen or the like.

大腸菌の菌体を破壊する手段としては、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、高圧ホモゲナイザー、ダイノミル、乳鉢、ガラスビーズ及びリゾチーム等の溶菌酵素を用いる手段を挙げることができる。例えば、高圧ホモゲナイザーを用いて菌体を破砕する場合には、６００〜１，７００ｂａｒの圧力で、約１ｍｌ／分の流速の条件で行えばよい。実用的な観点では、６００〜１０００ｂａｒの圧力で数回破砕を繰り返すことが好ましい。 Examples of means for destroying the bacterial cells of Escherichia coli include means using ultrasonic crusher, French press, high-pressure homogenizer, dynomill, mortar, glass beads, and lysing enzyme such as lysozyme. For example, when the cells are disrupted by using a high-pressure homogenizer, the pressure may be 600 to 1,700 bar and the flow rate may be about 1 ml/min. From a practical viewpoint, it is preferable to repeat the crushing several times at a pressure of 600 to 1000 bar.

破壊前後の液を粒度分布計で分析することにより破壊の状況を確認することができる。菌体破壊液にはＤＴＴを最終濃度１ｍＭになるように添加することが好ましい。 The state of destruction can be confirmed by analyzing the liquid before and after destruction with a particle size distribution analyzer. It is preferable to add DTT to the cell disruption solution so that the final concentration will be 1 mM.

大腸菌の菌体を破壊する方法においては、上記の無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）に、回収した菌体を再懸濁した、菌体懸濁液を用いることが好ましい。菌体懸濁液としては、例えば、回収した菌体１ｇあたり１〜２ｍＬのＳ３０緩衝液等の溶液を添加することにより得た菌体懸濁液を挙げることができる。−８０℃で保存した当該菌体を用いる場合には氷上で融解させて懸濁液を作製することが好ましい。 In the method for destroying the bacterial cells of Escherichia coli, the recovered bacterial cells are resuspended in a solution (for example, S30 buffer solution) containing the above-mentioned inorganic salt and a compound having a buffer action, and a bacterial cell suspension is used. It is preferable. Examples of the bacterial cell suspension include a bacterial cell suspension obtained by adding 1 to 2 mL of a solution such as S30 buffer solution per 1 g of the recovered bacterial cells. When using the cells stored at −80° C., it is preferable to melt them on ice to prepare a suspension.

細胞抽出物としては、細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去したものを用いることが好ましい。除去する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、１０，０００〜３０，０００×ｇの条件で２０〜５０分間、遠心分離し、上清を取得する工程を、例えば２〜３回繰り返すことにより細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去することができる。 As the cell extract, it is preferable to use a cell extract from which cell debris, genomic DNA and the like have been removed. Examples of the method for removing may include a centrifugal separation method and a filtration method. For example, cell debris, genomic DNA, etc. are removed by repeating the step of centrifuging for 20 to 50 minutes under conditions of 4° C. and 10,000 to 30,000×g for 20 to 50 minutes, for example 2 to 3 times can do.

また、細胞抽出物としては、１／３〜１／４容量の活性化ミックス（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．２、１３．２ｍＭ 酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭ ＡＴＰ、４．４ｍＭ ＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬ ピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭ ホスホエノールピルビン酸及びタンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを指す。以下同様である。）（各０．０４ｍＭ））を加え、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、１０〜３００分、好ましくは３０〜１８０分間インキュベートしたものを用いることができる。このような処理をした細胞抽出物を用いることにより効率よくタンパク質合成を行うことができる。 As a cell extract, 1/3 to 1/4 volume of activation mix (300 mM Tris-acetic acid, pH 8.2, 13.2 mM magnesium acetate, 13.2 mM ATP, 4.4 mM DTT, 6.7 U/ mL Pyruvate kinase, 84 mM Phosphoenolpyruvate and all 20 kinds of amino acids constituting proteins (alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine , Proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine, the same applies hereinafter) (each 0.04 mM)) at 15 to 42° C., preferably 20 to 37° C. for 10 to 300 minutes, preferably What was incubated for 30 to 180 minutes can be used. Protein synthesis can be efficiently performed by using the cell extract treated as described above.

さらに、細胞抽出物としては、内在性の核酸を除いたものを用いることが好ましい。上記活性化ミックスを加えた処理によって発生した不溶性成分は上記と同条件の遠心分離法等で除去できる。当該操作によって内在性のＲＮＡを除去できる。内在性の核酸は、ヌクレアーゼ等を更に添加することにより分解できる。その場合、核酸の分解後にヌクレアーゼ阻害剤を加えて処理することが好ましい。また、透析により内在性のアミノ酸、核酸及びヌクレオシド等を除くこともできる。 Furthermore, as the cell extract, it is preferable to use a cell extract from which endogenous nucleic acids have been removed. The insoluble component generated by the treatment with the activated mix added can be removed by a centrifugation method under the same conditions as above. By this operation, endogenous RNA can be removed. Endogenous nucleic acid can be decomposed by further adding nuclease or the like. In that case, it is preferable to add a nuclease inhibitor after the decomposition of the nucleic acid for treatment. In addition, endogenous amino acids, nucleic acids, nucleosides and the like can be removed by dialysis.

当該細胞抽出物は−８０℃で保存することができる。−８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。 The cell extract can be stored at -80°C. Freezing at −80° C. is preferably performed by rapid cooling using liquid nitrogen or the like.

（細胞抽出物の含有量）
本実施形態に係る反応混合物中の細胞抽出物の含有量は、反応混合物全量を基準として、５〜７０％（容量／容量）であってよく、１０〜５０％（容量／容量）であってよく、２０〜４０％（容量／容量）であってよく、２０〜３０％（容量／容量）であってよい。細胞抽出物を得るために用いた湿菌体（ｇ）／反応混合物（ｍＬ）の割合は、０．０１〜１ｇ／ｍＬであってよく、０．０５〜０．３ｇ／ｍＬであってよい。 (Content of cell extract)
The content of the cell extract in the reaction mixture according to the present embodiment may be 5 to 70% (volume/volume), or 10 to 50% (volume/volume) based on the total amount of the reaction mixture. It may be 20-40% (volume/volume) or 20-30% (volume/volume). The wet cell (g)/reaction mixture (mL) ratio used to obtain the cell extract may be 0.01 to 1 g/mL, or 0.05 to 0.3 g/mL. ..

（イノシン酸）
本発明に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、エネルギー源及びｍＲＮＡの合成に必要な基質の供給源として、イノシン酸を含有する。 (Inosinic acid)
The reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present invention contains inosinic acid as an energy source and a source of a substrate required for mRNA synthesis.

上記エネルギー源としては、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸等が挙げられる。また、リン酸基を含まないエネルギー源の場合、反応混合物に無機リン酸を加えることが好ましい。 Examples of the energy source include ATP, GTP, glucose, ribose, pyruvate, phosphoenolpyruvate (PEP), carbamoyl phosphate, acetyl phosphate, creatine phosphate, phosphopyruvate, glyceraldehyde-3-phosphate, 3-phospho. Examples thereof include glycerate, glucose-6-phosphate, citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, α-ketoglutaric acid, succinyl CoA, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, glyoxylic acid and glutamic acid. Further, in the case of an energy source containing no phosphate group, it is preferable to add inorganic phosphoric acid to the reaction mixture.

また、イノシン酸は、旨味成分として工業生産プロセスが確立されており、通常の無細胞タンパク質合成に用いられるヌクレオチドと比較して非常に安価である。さらに、ヌクレオチドの前駆体となりうるアデノシンやグアノシンより１０００倍以上、水に溶けやすい。従って、本発明に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、バッチ法の反応混合物のみならず、透過法の外液成分としても容易に使用することができる。 Further, inosinic acid has a well-established industrial production process as a umami component, and is very inexpensive as compared with nucleotides used for ordinary cell-free protein synthesis. Furthermore, it is more than 1000 times more soluble in water than adenosine or guanosine, which can be a precursor of nucleotides. Therefore, the reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present invention can be easily used not only as a reaction mixture for a batch method but also as an external liquid component for a permeation method.

本実施形態に係る反応混合物には、イノシン酸を塩として添加することが好ましい。イノシン酸の塩としては、ナトリウム塩を挙げることができ、例えばイノシン酸二ナトリウム等を挙げることができる。 It is preferable to add inosine acid as a salt to the reaction mixture according to the present embodiment. Examples of the salt of inosinic acid include a sodium salt, and examples thereof include disodium inosinate.

（イノシン酸の含有量）
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物中のイノシン酸の含有量は、反応混合物全量を基準として、０．１〜１０ｍＭであってよく、０．５〜８ｍＭであってよく、１〜５ｍＭであってよく、２〜４ｍＭであってよい。 (Content of inosinic acid)
The content of inosine acid in the reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present embodiment may be 0.1 to 10 mM, may be 0.5 to 8 mM, and may be 1 to 10 mM based on the total amount of the reaction mixture. It may be 5 mM and may be 2-4 mM.

また、上記イノシン酸をｍＲＮＡの合成に必要なＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰの供給源として利用する場合には、鋳型核酸を入れる前に、細胞抽出物、エネルギー源を含む反応混合物に当該イノシン酸を添加することが好ましい。 When the inosinic acid is used as a source of ATP, GTP, UTP and CTP required for mRNA synthesis, the inosinic acid is added to a reaction mixture containing a cell extract and an energy source before adding a template nucleic acid. Is preferably added.

（反応混合物のその他の成分）
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、必要に応じて以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の成分の少なくとも１種を含むことができる。 (Other components of reaction mixture)
The reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present embodiment may include at least one of the following components (i) to (viii), if necessary.

（ｉ）鋳型核酸
鋳型核酸は、発現させたい目的タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと、適当な発現調節領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいればよく、直鎖状及び環状の何れの形態であってもよい。発現調節領域としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列、ポリＡ付加シグナル及びリボソーム結合配列などを挙げることができる。また、鋳型核酸は、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含むことが好ましい。添加する鋳型核酸の量は、反応混合物全体の容量を基準として、０．１〜５０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜２０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。 (I) Template Nucleic Acid The template nucleic acid only needs to contain DNA or RNA that encodes the desired protein to be expressed and DNA or RNA that contains an appropriate expression control region, and may be either linear or circular. May be. Examples of the expression control region include a promoter sequence, a terminator sequence, an enhancer sequence, a poly A addition signal and a ribosome binding sequence. Further, the template nucleic acid preferably contains at least one promoter and a DNA encoding the target protein. The amount of the template nucleic acid to be added is preferably 0.1 to 50 μg/mL, more preferably 1 to 20 μg/mL, based on the volume of the entire reaction mixture.

合成されたタンパク質を容易に検出又は精製できるよう、タグ配列を組み込んだ融合タンパク質が合成できるように鋳型核酸を設計してもよい。タグ配列としては、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用した、例えばヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）のようなアフィニティタグ、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を挙げることができる。また、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用してもよい。エピトープタグとしては、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。さらに、タグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも利用できる。 The template nucleic acid may be designed so that a fusion protein incorporating a tag sequence can be synthesized so that the synthesized protein can be easily detected or purified. As the tag sequence, for example, an affinity tag such as a histidine tag (His tag) that utilizes specific affinity (binding property) with other molecules, or glutathione-S- that specifically binds to glutathione is used. Examples include tag sequences such as transferase (GST) and maltose binding protein (MBP) that specifically bind to maltose. Alternatively, an "epitope tag" that utilizes an antigen-antibody reaction may be used. Examples of the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like. Furthermore, a tag sequence that can be cleaved with a specific protease can also be used.

（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、上記鋳型核酸を対象とする１つ又は複数の転写因子を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。本発明の反応混合物は、目的タンパク質の生産効率を向上させる観点から、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むことが好ましい。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物を調製する際に添加してもよく、上述したように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能なＢＬ２１（ＤＥ３）等の株を用いて細胞抽出物にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが含まれるようにしてもよい。 (Ii) RNA polymerase When the template nucleic acid is DNA, RNA polymerase can be included. As the RNA polymerase, an RNA polymerase that recognizes one or more transcription factors targeted for the template nucleic acid can be used. From the viewpoint of improving the production efficiency of the target protein, the reaction mixture of the present invention preferably contains T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase may be added when preparing a reaction mixture, and as described above, T7 RNA polymerase is added to cell extracts using a strain such as BL21 (DE3) capable of expressing T7 RNA polymerase. It may be included.

（ｉｉｉ）目的タンパク質合成のための基質
目的タンパク質合成のための基質として、本実施形態に係る反応混合物は、目的タンパク質を合成するために必要なアミノ酸を含むことができる。アミノ酸としては、タンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸を含んでもよく、目的タンパク質や用いる試薬等を考慮して２０種類から適宜選択して用いてもよい。また、非天然アミノ酸を用いてもよい。非天然アミノ酸を用いる場合、非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために必要な改変がなされたｔＲＮＡ、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素等の因子を添加する必要がある。 (Iii) Substrate for synthesis of target protein As a substrate for synthesis of target protein, the reaction mixture according to the present embodiment may contain amino acids necessary for synthesizing the target protein. The amino acids may include all 20 kinds of amino acids constituting proteins, and may be appropriately selected from the 20 kinds in consideration of a target protein, a reagent to be used and the like. Also, non-natural amino acids may be used. When an unnatural amino acid is used, it is necessary to add factors such as modified tRNA and aminoacylated tRNA synthetase necessary for introducing the unnatural amino acid into a protein.

上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、更なるタンパク質合成量の増強を狙ってイノシン酸の他に、ＲＮＡ合成のための基質を含むことができる。ＲＮＡ合成のための基質としては、例えば、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、リボヌクレオチド一リン酸（ｒＮＭＰ）等のリボヌクレオチド、アデノシン等のリボヌクレオシドが挙げられる。 When the template nucleic acid is DNA, it may contain a substrate for RNA synthesis in addition to inosinic acid for the purpose of further enhancing the amount of protein synthesis. Examples of the substrate for RNA synthesis include ribonucleotides such as ribonucleotide triphosphate (rNTP) and ribonucleotide monophosphate (rNMP), and ribonucleosides such as adenosine.

（ｉｖ）ポリアミン類
本実施形態に係る反応混合物は、ポリアミン類を含むことができる。反応混合物に含め得るポリアミン類としては、例えば、スペルミン、スペルミジン及びプトレシン等が挙げられる。 (Iv) Polyamines The reaction mixture according to this embodiment may contain polyamines. Examples of polyamines that can be included in the reaction mixture include spermine, spermidine, putrescine and the like.

（ｖ）塩
本実施形態に係る反応混合物は、塩を含むことができる。反応混合物に含め得る塩としては、例えば、酢酸、グルタミン酸、又は硫酸のカリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、及びマンガン塩が挙げられる。 (V) Salt The reaction mixture according to this embodiment may contain a salt. Salts that may be included in the reaction mixture include, for example, potassium, magnesium, ammonium, and manganese salts of acetic acid, glutamic acid, or sulfuric acid.

（ｖｉ）酸化／還元調整剤
本実施形態に係る反応混合物は、酸化／還元調整剤を含むことができる。酸化／還元調整剤としては、例えば、ＤＴＴ、アスコルビン酸、グルタチオン、及び／又はそれらの酸化物が挙げられる。 (Vi) Oxidation/reduction modifier The reaction mixture according to this embodiment may include an oxidation/reduction modifier. Examples of the oxidation/reduction modifier include DTT, ascorbic acid, glutathione, and/or their oxides.

（ｖｉｉ）その他の添加物
また、必要に応じて本実施形態に係る反応混合物に、下記の成分を補充又は添加してもよい。 (Vii) Other Additives The following components may be supplemented or added to the reaction mixture according to the present embodiment, if necessary.

すなわち、リボソーム、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、任意選択の翻訳因子（例えば、翻訳開始因子、伸長因子終結因子、リボソームリサイクリング因子等）及びその補因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、メチオニルｔＲＮＡホルミル転移酵素（ＭＴＦ）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、四級アミノエチル及びアミノエチルデキストラン等）、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定剤、シャペロン、可溶化剤、非変性界面活性物質（例えば、トリトンＸ１００）等を必要に応じて上記反応混合物に添加してもよい。 That is, ribosome, transfer RNA (tRNA), optional translation factor (eg, translation initiation factor, elongation factor termination factor, ribosomal recycling factor, etc.) and its cofactor, aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), methionyl-tRNA formyl transfer. Enzyme (MTF), polymer compound (eg, polyethylene glycol, dextran, diethylaminoethyl dextran, quaternary aminoethyl and aminoethyl dextran, etc.), nuclease, nuclease inhibitor, protein stabilizer, chaperone, solubilizer, non-denaturing interface An active substance (for example, Triton X100) or the like may be added to the above reaction mixture as needed.

上記反応混合物の成分に関しては、例えば米国特許第７，３３８，７８９号及び同第７，３５１，５６３号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１８４１３５号及び米国特許出願公開第２０１０／００９３０２４号の記載を参考とすることができる。 Regarding the components of the above reaction mixture, for example, the descriptions in US Pat. Nos. 7,338,789 and 7,351,563, and US Patent Application Publication No. 2010/0184135 and US Patent Application Publication No. 2010/0093302 are described. Can be used as a reference.

〔無細胞タンパク質合成方法〕
本発明に係る無細胞タンパク質合成方法は、本発明に係る反応混合物を用いて、透析法及びバッチ法いずれも行うことができる。透析法の場合は、上記反応混合物を含む内液と限外濾過膜のような透析膜により隔離した目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等を含む外液からなる閉鎖系でタンパク質の合成が行われる。透析法では、透析膜を介して、目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等が外液から反応混合物に供給されるとともに、反応混合物中の余計な副産物を外液中に拡散させることができるため、より長時間、反応を持続させることができる。バッチ法は、タンパク質合成に必要な成分すべてを含む上記反応混合物を反応溶液と混合し、反応溶液中に均一に含ませ、反応を行う合成法であり、透析法と比較すると反応時間は短いが、結果がすぐに得られる。 [Cell-free protein synthesis method]
The cell-free protein synthesis method according to the present invention can be performed by the dialysis method or the batch method using the reaction mixture according to the present invention. In the case of the dialysis method, protein synthesis is carried out in a closed system consisting of an inner solution containing the above reaction mixture and an outer solution containing a substrate and an energy source for target protein synthesis separated by a dialysis membrane such as an ultrafiltration membrane. Done. In the dialysis method, a substrate and an energy source for synthesizing a target protein are supplied from the external liquid to the reaction mixture through a dialysis membrane, and unnecessary byproducts in the reaction mixture can be diffused into the external liquid. Therefore, the reaction can be continued for a longer time. The batch method is a synthetic method in which the reaction mixture containing all of the components necessary for protein synthesis is mixed with a reaction solution and uniformly contained in the reaction solution to carry out the reaction, but the reaction time is shorter than the dialysis method. , The results are available immediately.

タンパク質の合成は、例えば、２０〜４０℃で行えばよく、３０℃で行うのが好ましい。 The protein may be synthesized at, for example, 20 to 40°C, preferably 30°C.

バッチ法によるタンパク質合成の反応時間は、鋳型核酸の添加の有無に関わらず、細胞抽出物とイノシン酸を混合してから２時間以上であることが好ましい。反応時間は、細胞抽出物とイノシン酸を混合してから、３〜４０時間であることが好ましく、５〜２５時間であることがより好ましい。 The reaction time for protein synthesis by the batch method is preferably 2 hours or more after mixing the cell extract and inosinic acid, regardless of the presence or absence of addition of the template nucleic acid. The reaction time is preferably 3 to 40 hours, more preferably 5 to 25 hours after mixing the cell extract and inosinic acid.

〔無細胞タンパク質合成用キット〕
本発明に係る無細胞タンパク質合成用キット（以下、「本キット」とも表す。）は、大腸菌から得られた細胞抽出物及びイノシン酸を含む。イノシン酸は、上記細胞抽出物（大腸菌から得られた細胞抽出物）と予め混合され、イノシン酸を含む細胞抽出物として本キットに含まれていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。また、本キットは、大腸菌から得られた細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含むものであってもよい。鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。本キットは、上述したＲＮＡポリメラーゼ、ポリアミン類、塩、酸化／還元調整剤、その他の添加物をさらに含んでいてもよい。これらの添加物は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。 [Kit for cell-free protein synthesis]
The cell-free protein synthesis kit according to the present invention (hereinafter, also referred to as "the present kit") contains a cell extract obtained from Escherichia coli and inosinic acid. Inosinic acid may be premixed with the above-mentioned cell extract (cell extract obtained from Escherichia coli) and contained in this kit as a cell extract containing inosinic acid, independently of the above-mentioned cell extract. It may be included in the kit. The kit may also contain a cell extract obtained from Escherichia coli and inosinic acid, a template nucleic acid, a substrate for protein synthesis of interest, and/or an energy source. The template nucleic acid, the substrate for synthesizing the target protein, and the energy source may be premixed with the cell extract, or may be contained in the kit independently of the cell extract. The kit may further contain the above-mentioned RNA polymerase, polyamines, salts, oxidation/reduction adjusting agent, and other additives. These additives may be premixed with the cell extract, or may be contained in the kit independently of the cell extract.

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

〔試験例１：大腸菌の培養（炭素源の影響）〕
大腸菌ＢＬ２１株（ノバジェン株式会社）を２×ＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ_６００が４．２になるまでフラスコ培養した。 [Test Example 1: Culture of Escherichia coli (effect of carbon source)]
Escherichia coli BL21 strain (Novagen Corporation) was subjected to flask culture in 2×YT medium (1.6% Bacto Tripton, 1% Yeast Extract, 0.5% NaCl) until the OD ₆₀₀ reached 4.2.

当該培養液を、グリセロールを炭素源とした、表１の組成の改変２×ＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）５００ｍＬが入った１ＬジャーファメンターにＯＤ_６００が０．０５になるように添加した。 A modified 2×YTPG medium having the composition shown in Table 1 using glycerol as a carbon source (Adeka (registered trademark) LG-295S (1 ml/L as an antifoaming agent was added, and the pH was adjusted to 7 using NaOH)) It was added to a 1 L jar fermentor containing 500 mL so that the OD ₆₀₀ was 0.05.

比較として、グルコース（１８ｇ／Ｌ）を炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地を用いて、同じ株を同様に培養した。培養温度は３６℃に保ち、培地のｐＨ７．０で一定に制御して培養した。溶存酸素濃度は２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持した。増殖曲線を図１に示す。改変２×ＹＴＰＧ培地と通常の２×ＹＴＰＧ培地で培養した際の比増殖速度は、それぞれ１．０８ｈ−１と０．７４ｈ−１であった。この結果は、グリセロールで培養した細胞内のリボソームやエネルギー再生系の酵素群がより高い活性を有することを示唆していると推察される。 For comparison, the same strain was similarly cultured using a normal 2×YTPG medium containing glucose (18 g/L) as a carbon source. The culturing temperature was maintained at 36° C., and the medium was cultivated at a constant pH of 7.0 and controlled. The dissolved oxygen concentration was maintained at 2.4 mg/L or more. The growth curve is shown in FIG. The specific growth rates when cultured in the modified 2xYTPG medium and the normal 2xYTPG medium were 1.08h-1 and 0.74h-1, respectively. It is speculated that this result suggests that ribosomes in the cells cultured in glycerol and enzymes in the energy regeneration system have higher activity.

グリセロールを炭素源として用いた培養により、グルコースを炭素源として用いた培養よりもより短時間で好ましい菌体濃度の培養液が得られることから、より短時間で細胞抽出物を得ることが可能であることが示された。 Culturing using glycerol as a carbon source can obtain a cell broth with a preferable cell concentration in a shorter time than culture using glucose as a carbon source, and thus a cell extract can be obtained in a shorter time. It was shown to be.

〔試験例２：無細胞タンパク質合成（細胞抽出物の影響）〕
（細胞抽出物の調製）
上記試験例１と同様の方法により、改変２×ＹＴＰＧ培地及び通常の２×ＹＴＰＧ培地のそれぞれにおいて、対数中期ＯＤ_６００が１２になるまで培養したＢＬ２１株を用いて、下記の方法で細胞抽出物を調製した。 [Test Example 2: Cell-free protein synthesis (effect of cell extract)]
(Preparation of cell extract)
By the same method as in Test Example 1 above, a cell extract was obtained by the following method using the BL21 strain cultivated until each of the modified 2×YTPG medium and the normal 2×YTPG medium until the mid-logarithmic OD ₆₀₀ was 12. Was prepared.

当該ＢＬ２１株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１４ｍＭ 酢酸マグネシウム、６０ｍＭ 酢酸カリウム及び２ｍＭ ＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて−８０℃に急冷した。 2 L of the culture broth of the BL21 strain was centrifuged under the conditions of 7,000 xg and 4°C for 20 minutes to recover 31 g of wet bacterial cells. The cells were washed with S30 buffer (pH 8.2) containing 10 mM Tris-acetic acid, 14 mM magnesium acetate, 60 mM potassium acetate and 2 mM DTT, and then rapidly cooled to -80°C using liquid nitrogen.

菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ.Ｎｉｒｏ ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。 2 mL of S30 buffer was added per 1 g of the cells, thawed and suspended, and the cells were crushed using a high pressure homogenizer (PandaPLUS2000) manufactured by GEA. Niro soavi at a pressure of 1300 bar or more.

次いで、菌体破砕物を２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。 Next, the disrupted cell bodies were centrifuged twice under the conditions of 20,400×g, 4° C. and 30 minutes to remove cell residue.

当該遠心分離上清２００μＬに、３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭ ＡＴＰ、４．４ｍＭ ＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬ ピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭ ホスホエノールピルビン酸及びタンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（各０．０４ｍＭ）を含む活性化ミックス６０μＬを加え、３０℃で１５０分間インキュベートした。 20 kinds of 300 mM Tris-acetic acid, 13.2 mM magnesium acetate, 13.2 mM ATP, 4.4 mM DTT, 6.7 U/mL pyruvate kinase, 84 mM phosphoenolpyruvate and protein were added to 200 μL of the centrifugation supernatant. 60 μL of activation mix containing all amino acids (0.04 mM each) of was added and incubated at 30° C. for 150 minutes.

インキュベート後、２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心分離を行い、不溶性画分を取り除くことで細胞抽出物２３０μＬを得た。 After the incubation, centrifugation was performed under the conditions of 20,400×g, 4° C., and 30 minutes, and the insoluble fraction was removed to obtain 230 μL of cell extract.

（ｐＵＣ−ＧＦＰの作製）
ｐＥＴ３ａ（ノバジェン株式会社）を利用し、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）及びＴ７ターミネーターの配列を含むＤＮＡ断片（１）をＰＣＲ法によって調製した。 (Preparation of pUC-GFP)
Using pET3a (Novagen Corporation), a DNA fragment (1) containing the sequences of T7 promoter, ribosome binding site (RBS) and T7 terminator was prepared by the PCR method.

ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）を利用し、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（２）をＰＣＲ法によって調製した。 Using pUC19 (Takara Bio Inc.), a DNA fragment (2) containing the origin of replication and the sequence of the ampicillin resistance gene was prepared by the PCR method.

ＤＮＡ断片（１）及びＤＮＡ断片（２）を公知のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。形質転換した大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、プラスミドを抽出した。 The DNA fragment (1) and the DNA fragment (2) were fused by a known In-Fusion reaction and transformed into Escherichia coli HST08. After culturing the transformed Escherichia coli, a plasmid was extracted using QIAGEN Plasmid Kit (manufactured by Qiagen Co., Ltd.).

抽出したプラスミドを利用し、Ｔ７プロモーター、ＲＢＳ、Ｔ７ターミネーター、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（３）をＰＣＲ法によって調製した。 Using the extracted plasmid, a DNA fragment (3) containing the sequences of T7 promoter, RBS, T7 terminator, origin of replication and ampicillin resistance gene was prepared by the PCR method.

Ｔ５−ＨｏｌｌｙＧＦＰ（コスモバイオ株式会社）を利用し、Ｈｏｌｌｙ−ＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（４）をＰＣＲ法によって調整した。 A DNA fragment (4) containing the Holly-GFP gene was prepared by PCR using T5-HollyGFP (Cosmo Bio Inc.).

ＤＮＡ断片（３）及びＤＮＡ断片（４）を公知のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。形質転換した大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、ｐＵＣ−ＧＦＰを抽出し、無細胞タンパク質合成反応の鋳型核酸として利用した。 The DNA fragment (3) and the DNA fragment (4) were fused by a known In-Fusion reaction and transformed into Escherichia coli HST08. After culturing the transformed Escherichia coli, pUC-GFP was extracted using QIAGEN Plasmid Kit (manufactured by Qiagen Co., Ltd.) and used as a template nucleic acid for cell-free protein synthesis reaction.

鋳型核酸用のｐＵＣ−ＧＦＰは、分光光度計を用いて高純度（Ａ_２６０／Ａ_２８０が１．８以上、Ａ_２６０／Ａ_２３０が２．０以上）であること、さらに、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を読み取り、不必要な変異が入っていないことを確認した。 PUC-GFP for template nucleic acid has a high purity (A ₂₆₀ /A ₂₈₀ is 1.8 or more, A ₂₆₀ /A ₂₃₀ is 2.0 or more) using a spectrophotometer, and a DNA sequencer is used. Then, the nucleotide sequence was read and it was confirmed that there were no unnecessary mutations.

（無細胞タンパク質合成反応）
表２の化合物を含むマスターミックス１０μＬ、調製した細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ ｐＵＣ−ＧＦＰ（鋳型核酸）２μＬ及び１０００Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてｐＵＣ−ＧＦＰの代わりにＲＯ水２μＬを加えたものを用意した。３８４ウェルマイクロプレートに反応混合物を移し、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（テカンジャパン株式会社製）を使用して３０℃でインキュベートしながら、経時的に蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図２に蛍光強度の測定結果を示す。 (Cell-free protein synthesis reaction)
10 μL of master mix containing the compounds of Table 2, 6 μL of prepared cell extract, 1 μL of 40 mM DTT aqueous solution, 2 μL of 0.2 g/L pUC-GFP (template nucleic acid) and 1 μL of 1000 U/μL T7 RNA polymerase were added, and total reaction volume was 20 μL. A mixture (liquid) was prepared. A negative control (NC) was prepared by adding 2 μL of RO water instead of pUC-GFP. The reaction mixture was transferred to a 384-well microplate, and fluorescence intensity was measured over time while incubating at 30° C. using a microplate reader TECANinfinite F200 (manufactured by Tecan Japan Co., Ltd.) to compare the amount of GFP synthesis. FIG. 2 shows the measurement result of the fluorescence intensity.

反応を開始して５時間後、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた場合のＧＦＰの蛍光強度は、グルコースを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた場合のＧＦＰの蛍光強度よりも約２倍高い値を示した（図２）。これにより、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法によるＧＦＰの合成量は、グルコースを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法と比較して、約２倍多いことが示された。 5 hours after the reaction was started, the fluorescence intensity of GFP when the cell extract derived from Escherichia coli cultured in a medium containing glycerol as a carbon source was used. The value was about 2-fold higher than the fluorescence intensity of GFP when the extract was used (Fig. 2). Thus, the amount of GFP synthesized by the cell-free protein synthesis method using the cell extract derived from Escherichia coli cultured in the medium containing glycerol as the carbon source was the cell extract derived from Escherichia coli derived from the medium containing glucose as the carbon source. It was shown to be about 2-fold higher than that of the cell-free protein synthesis method using.

〔実施例１：無細胞タンパク質合成方法〕
（グリセロールを炭素源とした培養）
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法によりｒｎａ遺伝子を欠損したＢＷ２５１１３株を作製し、Ｐ１トランスダクションによってＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（ニューイングランドバイオラボ社）に欠損を導入し、当該ｒｎａ遺伝子が欠損したＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株を作製した。ｒｎａ遺伝子はリボヌクレアーゼ Ｉの合成に関わる遺伝子であり、ｍＲＮＡの安定性に関与する。 [Example 1: Cell-free protein synthesis method]
(Culture using glycerol as a carbon source)
A BW25113 strain deficient in the rna gene was prepared by the method of Datsenko and Wanner, and a deficiency was introduced into the T7 Express strain (New England Biolabs) by P1 transduction to prepare a T7 Express strain deficient in the rna gene. The rna gene is a gene involved in the synthesis of ribonuclease I and is involved in the stability of mRNA.

上記ｒｎａ遺伝子が欠損したＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株を２×ＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ_６００が３．５になるまでフラスコ培養した。 The T7 Express strain lacking the rna gene was subjected to flask culture in 2×YT medium (1.6% Bacto Tripton, 1% Yeast Extract, 0.5% NaCl) until the OD ₆₀₀ reached 3.5.

次いで、当該培養液を、表１の組成の改変２×ＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）２．１Ｌが入った３ＬジャーファメンターにＯＤ_６００が０．０５になるように添加し、本培養を行った。 Next, 2.1 L of the culture solution was added to the modified 2×YTPG medium having the composition shown in Table 1 (adding 1 ml/L of ADEKA (registered trademark) LG-295S as an antifoaming agent and adjusting the pH to 7 using NaOH). It was added to another 3 L jar famentor so that the OD ₆₀₀ was 0.05, and main culture was performed.

本培養は、培養温度を３６℃に保ち、培地のｐＨを７．０で一定に制御し、培地の溶存酸素濃度を２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持して行った。ＯＤ_６００が２に達した時点で、培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを誘導した。その後、対数中期ＯＤ_６００が１２になるまで培養を継続した。 The main culture was performed while maintaining the culture temperature at 36° C., controlling the pH of the medium to be constant at 7.0, and maintaining the dissolved oxygen concentration in the medium at 2.4 mg/L or more. When the OD ₆₀₀ reached 2, 1 mM IPTG was added to the medium to induce T7 RNA polymerase. Then, the culture was continued until the mid-logarithmic OD ₆₀₀ reached 12.

（細胞抽出物の調製）
上記のように培養したＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１４ｍＭ 酢酸マグネシウム、６０ｍＭ 酢酸カリウム及び２ｍＭ ＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて−８０℃に急冷した。 (Preparation of cell extract)
2 L of the culture broth of the T7 Express strain cultured as described above was centrifuged under the conditions of 7,000×g, 4° C. and 20 minutes to recover 31 g of wet bacterial cells. The cells were washed with S30 buffer (pH 8.2) containing 10 mM Tris-acetic acid, 14 mM magnesium acetate, 60 mM potassium acetate and 2 mM DTT, and then rapidly cooled to -80°C using liquid nitrogen.

菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ.Ｎｉｒｏ ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。 2 mL of S30 buffer was added per 1 g of the cells, thawed and suspended, and the cells were crushed using a high pressure homogenizer (PandaPLUS2000) manufactured by GEA. Niro soavi at a pressure of 1300 bar or more.

次いで、菌体破砕物を２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。得られた上清を細胞抽出物とした。 Next, the disrupted cell bodies were centrifuged twice under the conditions of 20,400×g, 4° C. and 30 minutes to remove cell residue. The obtained supernatant was used as a cell extract.

（鋳型核酸：ｐＵＣ−ＧＦＰ）
鋳型核酸として、試験例２で作製したｐＵＣ−ＧＦＰを用いた。 (Template nucleic acid: pUC-GFP)
As the template nucleic acid, pUC-GFP prepared in Test Example 2 was used.

（無細胞タンパク質合成反応）
表２に示したマスターミックス、並びに当該マスターミックスに含まれているＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰの代わりに、０．２Ｍイノシン酸二ナトリウム水溶液を終濃度２ｍＭになるように添加したマスターミックスの２種類のマスターミックスを調製した。当該マスターミックス１０μＬに、調製した細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ ｐＵＣ−ＧＦＰ２μＬ及び超純水１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。 (Cell-free protein synthesis reaction)
2 of the master mix shown in Table 2 and 0.2 M disodium inosinate aqueous solution added to a final concentration of 2 mM instead of AMP, GMP, CMP and UMP contained in the master mix. A variety of master mixes were prepared. 6 μL of the prepared cell extract, 1 μL of 40 mM DTT aqueous solution, 2 μL of 0.2 g/L pUC-GFP and 1 μL of ultrapure water were added to 10 μL of the master mix to prepare a total reaction mixture (liquid) of 20 μL.

上記反応混合物を調製する際、観察前のタンパク質合成反応の進行を防ぐため、氷上で調製した。 When preparing the above reaction mixture, it was prepared on ice in order to prevent the progress of the protein synthesis reaction before observation.

上記反応混合物２０μＬを３８４ウェルマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を使用して３０℃でインキュベートした。３０時間後蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図３に蛍光強度の測定結果を示す。 20 μL of the above reaction mixture was transferred to a 384-well microplate and incubated at 30° C. using the microplate reader TECANinfinite F200. The amount of GFP synthesis was compared by measuring the fluorescence intensity after 30 hours. FIG. 3 shows the measurement results of fluorescence intensity.

図３に示すとおり、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ無添加の反応混合物であっても、これらの代替物質としてイノシン酸を単独で添加することにより、無細胞タンパク質合成方法によりタンパク質合成が可能であることが確認できた。イノシン酸は、安価に入手でき、また水への溶解度が高くて扱いやすいため、本無細胞タンパク質合成方法は、工業的なタンパク質生産に好適に利用可能である。
As shown in FIG. 3, even in a reaction mixture without addition of AMP, GMP, CMP and UMP, protein synthesis can be performed by a cell-free protein synthesis method by adding inosinic acid alone as a substitute substance for these. I was able to confirm that. Since inosinic acid can be obtained at low cost and has high solubility in water and is easy to handle, the present cell-free protein synthesis method can be suitably used for industrial protein production.

Claims (11)

細胞抽出物とイノシン酸とを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。 A reaction mixture for cell-free protein synthesis, comprising a cell extract and inosinic acid. 前記細胞抽出物が、植物、動物及び微生物からなる群より選択される少なくとも１種の細胞由来の細胞抽出物である、請求項１に記載の反応混合物。 The reaction mixture according to claim 1, wherein the cell extract is a cell extract derived from at least one cell selected from the group consisting of plants, animals and microorganisms. 前記微生物が、大腸菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の反応混合物。 The reaction mixture according to claim 2, wherein the microorganism is at least one selected from the group consisting of Escherichia coli and yeast. 前記大腸菌が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、請求項３に記載の反応混合物。 The reaction mixture according to claim 3, wherein the E. coli is E. coli expressing T7 RNA polymerase. 前記細胞抽出物が、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応混合物。 The reaction mixture according to claim 1, wherein the cell extract is a cell extract obtained from Escherichia coli cultured in a medium containing glycerol as a carbon source. 鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応混合物。 The reaction mixture according to any one of claims 1 to 5, further comprising a template nucleic acid, a substrate for protein synthesis of interest, and an energy source. 前記鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項６に記載の反応混合物。 The reaction mixture according to claim 6, wherein the template nucleic acid comprises at least one promoter and DNA encoding a protein of interest. 前記エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、グリセロール、ピルベート、ホスホエノールピルベート、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート及びグルコース−６−ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸、グルタミン酸及びグルタミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６に記載の反応混合物。 The energy source is ATP, GTP, glucose, ribose, glycerol, pyruvate, phosphoenolpyruvate, carbamoyl phosphate, acetyl phosphate, creatine phosphate, phosphopyruvate, glyceraldehyde-3-phosphate, 3-phosphoglycerate and glucose. At least one selected from the group consisting of -6-phosphate, citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, α-ketoglutaric acid, succinyl CoA, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, glyoxylic acid, glutamic acid and glutamine. The reaction mixture of claim 6, which is a seed. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。 A cell-free protein synthesis method using the reaction mixture according to claim 1. 細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キット。 A cell-free protein synthesis kit comprising a cell extract and inosinic acid, a template nucleic acid, a substrate for protein synthesis of interest, and/or an energy source. 請求項９記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
A protein obtained by the cell-free protein synthesis method according to claim 9.

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