JP2020103321A - 前原始線条及び中内胚葉細胞 - Google Patents

前原始線条及び中内胚葉細胞 Download PDF

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Abstract

【課題】ｈＥＳＣの効率的な指示分化を達成することに加えて、ｈＥＳＣからの分化の初期段階で細胞を同定するか及び／又は分離するために用いられ得るマーカーを同定することを課題とする。【解決手段】培地の５％（ｖ／ｖ）未満が血清である、培地及びヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物を提供する。【選択図】なし

Description

［発明の分野］
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に本発明は、前原始線条及び／又は中内胚葉細胞を含む組成物、並びにこのような細胞の産生、単離及び使用方法に関する。
［背景］
ヒト多能性幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞は、１９９４年に線維芽細胞フィーダーを含有しない培養物中（Bongso et al., 1994）、そして線維芽
細胞フィーダーを含有する（Hogan, 1997）培養物中で最初に単離された。後に、Thomson、Reubinoff及びShamblottは、有糸***不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトＥＳ及びＥＧ細胞の連続培養を確立した（Reubinoff et al., 2000；Shamblott et al., 1998；Thomson et al., 1998）。
ヒトＥＳ及びＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発達の早期段階を研究するための、並びにいくつかの疾患状態、例えば真性糖尿病及びパーキンソン病における療法的介入のための独特の機会を提供する。例えばｈＥＳＣ由来のインスリン生産β細胞の使用は、糖尿病の治療のためにドナー膵臓からの細胞を利用する一般的細胞療法手順を上回る膨大な改善を提供する。しかしながら現在、ｈＥＳＣからインスリン生産β細胞を生成する方法は分かっていない。したがって、ドナー膵臓からの島細胞を利用する真性糖尿病のための一般的細胞療法処置は、移植に必要とされる高品質の島細胞の不足により制限される。単一Ｉ型糖尿病患者のための細胞療法は、約８×１０8個の膵臓島細胞の移植を要する（Shapiro et al., 2000；Shapiro et al., 2001a；Shapiro et al., 2001b）。したがって、少なくと
も２つの健常ドナー器官が、首尾よいの移植のための十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発達させるための出発物質の供給源を提供する。
ｈＥＳＣを細胞療法用途に独特に適合させる２つの特性は、多能性、並びに長期間培養中にこれらの細胞を保持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）すべての誘導体に分化し、次に胚体外組織（例えば胎盤）及び生殖細胞のほかに、成熟生物体のすべての体細胞型を形成するｈＥＳＣの能力により決定される。多能性はｈＥＳＣに並外れた有用性を付与するが、しかしこの特性は、これらの細胞及びそれらの誘導体の研究及び操作のための独特の好機もあたえる。ｈＥＳＣ培養物を分化するに際して生じ得る非常に種々の細胞型のために、膨大な数の細胞型が極めて低い効率で産生される。さらに、任意の所定の細胞型の産生を評価する場合の結果は、適切なマーカーの測定に応じて決定的に決まる。効率的な指示分化は、ｈＥＳＣの療法的用途のために大きな重要性を有する。
したがって、ｈＥＳＣの効率的な指示分化を達成することに加えて、ｈＥＳＣからの分化の初期段階で細胞を同定するか及び／又は分離するために用いられ得るマーカーを同定することが有益である。さらに細胞療法に有用な細胞型へのｈＥＳＣ由来のこれらの初期前駆体細胞の分化を促進する因子を同定することが有益である。
本発明の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物に関する。このような細胞培養物では、
ヒト細胞の少なくとも約５％が前原始線条細胞であり、この場合、前原始線条細胞は、中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である。他の実施形態では、培養中のヒト細胞の少なくとも約１０％〜少なくとも約９０％が前原始線条細胞である。本明細書中に記載される或る特定のいくつかの実施形態では、ヒトフィーダー細胞も細胞培養物中に存在する。このような実施形態では、フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約７５％が前原始線条細胞である。いくつかの実施形態では、前原始線条細胞は、マーカー、例えばＦＧＦ８及び／又は核局在化β−カテニンを発現する。或る特定のいくつかの実施形態では、これらのマーカーの一方又は両方の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１の発現より大きい。本明細書中に記載されるさらに他の実施形態では、細胞培養物は、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞、原始内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、外胚葉細胞及び／又は中胚葉細胞を実質的に含有しない。
本明細書中に記載される或る特定のいくつかの実施形態に関しては、前原始線条細胞培養物は、多能性ヒト細胞、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む。このような実施形態では、少なくとも約２から少なくとも約１０個までの前原始線条細胞が細胞培養物中のほぼ１つ毎のｈＥＳＣに関して存在する。いくつかの実施形態では、ｈＥＳＣは、桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）又は胚の生殖***に由来する。いくつかの実施形態では、ヒト前原始線条細胞を含有する細胞培養物は、約２％（ｖ／ｖ）未満から約０．２％（ｖ／ｖ）未満までの血清を含む培地を含む。好ましい実施形態では、このような細胞培養物は、血清又は血清代替物を欠く培地を含む。他の実施形態では、ヒト前原始線条細胞を含有する細胞培養物はＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの成長因子を含む。好ましい実施形態では、成長因子はアクチビンＡである。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、中胚葉又は胚体内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である中内胚葉細胞を含む細胞培養物に関する。このような実施形態では、細胞培養物は、少なくとも約５％が中内胚葉細胞であるヒト細胞を含む。他の実施形態では、培養中のヒト細胞の少なくとも約１０％〜少なくとも約９０％は中内胚葉細胞である。本明細書中に記載される或る特定のいくつかの実施形態では、ヒトフィーダー細胞も、細胞培養物中に存在する。このような実施形態では、フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約７５％は中内胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、中内胚葉細胞は、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１のようなマーカーを発現する。或る特定のいくつかの実施形態では、1つ又は複数のこれらのマーカーの発現は、ＯＣ
Ｔ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１の発現より大きい。本明細書中に記載されるさらに他の実施形態では、細胞培養物は、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞、原始内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、外胚葉細胞及び／又は中胚葉細胞を実質的に含有しない。
本明細書中に記載される或る特定のいくつかの実施形態に関しては、中内胚葉細胞培養物は、多能性ヒト細胞、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む。このような実施形態では、少なくとも約２〜少なくとも約１０個の中内胚葉細胞が、細胞培養物中のほぼ１つ毎のｈＥＳＣに関して存在する。いくつかの実施形態では、ｈＥＳＣは、桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）又は胚の生殖***に由来する。いくつかの実施形態では、ヒト中内胚葉細胞を含有する細胞培養物は、約２％（ｖ／ｖ）未満から約０．２％（ｖ／ｖ）未満までの血清を含む培地を含む。好ましい実施形態では、このような細胞培養物は、血清又は血清代替物を欠く培地を含む。他の実施形態では、ヒト中内胚葉細胞を含有する細胞培養物はＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの成長因子を含む。好ましい実施形態では、成長因子はアクチビンＡである。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、細胞の少なくとも約９０％がヒト前原始線
条細胞である細胞を含む細胞集団に関する。これらの実施形態では、前原始線条細胞は、中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である。他の実施形態では、集団中のヒト細胞の少なくとも約９５％〜少なくとも約９８％は前原始線条細胞である。いくつかの実施形態では、前原始線条細胞は、ＦＧＦ８及び／又は核局在化β−カテニンのようなマーカーを発現する。或る特定のいくつかの実施形態では、これらのマーカーの一方又は両方の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１の発現より大きい。本明細書中に記載されるさらに他の実施形態では、細胞集団は、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞、原始内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、外胚葉細胞及び／又は中胚葉細胞を実質的に含有しない。
本明細書中に記載されるさらに他の実施形態は、細胞の少なくとも約９０％がヒト中内胚葉細胞である細胞を含む細胞集団に関する。これらの実施形態では、中内胚葉細胞は、中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である。他の実施形態では、集団中のヒト細胞の少なくとも約９５％〜少なくとも約９８％は中内胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、中内胚葉細胞は、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１のようなマーカーを発現する。或る特定のいくつかの実施形態では、これらのマーカーの一方又は両方の発現は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１の発現より大きい。本明細書中に記載されるさらに他の実施形態では、細胞集団は、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞、原始内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、外胚葉細胞及び／又は中胚葉細胞を実質的に含有しない。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、前原始線条細胞を産生する方法に関する。このような方法では、多能性ヒト細胞、例えばｈＥＳＣを含む細胞集団が得られる。細胞集団内の多能性ヒト細胞は、約２％未満の血清及びＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子を含む培地中で分化され、この場合、成長因子は、多分化能でありそして中内胚葉細胞に分化し得る前原始線条細胞への上記多能性細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な量で培地中に存在する。いくつかの実施形態は、前原始線条細胞を十分な時間生成させる工程をさらに包含し、この場合、前原始線条細胞を生成させるための上記の十分な時間が上記細胞集団中の前原始線条細胞の存在を検出することにより決定された。いくつかの実施形態では、十分な時間は少なくとも約６時間である。他の実施形態では、細胞集団中の前原始線条細胞の存在の検出は、細胞集団の細胞中での、ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から選択される少なくとも１つのマーカー、並びにブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを包含し、この場合、上記前原始線条細胞中での、ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から選択されるマーカーの発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい。このような実施形態では、マーカー検出は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、免疫細胞化学又は他の匹敵する方法によるものであり得る。
本明細書中に記載される或る特定の方法に関しては、培養中のヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９０％が前原始線条細胞に分化する。本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態では、培地中に存在する成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの一成長因子である。好ましい実施形態では、成長因子はアクチビンＡである。他の好ましい実施形態では、成長因子は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ〜少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で培地中に存在する。或る特定のいくつかの実施形態では、成長因子は、約６時間、１２時間又は１８時間後に除かれる。さらなる実施形態では、培地は、約１％（ｖ／ｖ）未満〜約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む。他の実施形態では、培地は低血清ＲＰＭＩである。さらに他の実施形態では、細胞集団は、血清又は血清代替物の非存在下で分化される。
本明細書中に記載される他の方法は、中内胚葉細胞を産生する方法である。このような方法では、多能性ヒト細胞、例えばｈＥＳＣを含む細胞集団が得られる。細胞集団内の多能性ヒト細胞は、約２％未満の血清及びＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子を含む培地中で分化され、この場合、成長因子は、多分化能でありそして中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞に分化し得る中内胚葉細胞への上記多能性細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な量で培地中に存在する。いくつかの実施形態は、中内胚葉細胞を十分な時間生成させるさらなる工程を包含し、この場合、中内胚葉細胞を生成させるための上記の十分な時間が上記細胞集団中の中内胚葉細胞の存在を検出することにより決定された。いくつかの実施形態では、十分な時間は少なくとも約２４時間である。他の実施形態では、細胞集団中の中内胚葉細胞の存在の検出は、細胞集団の細胞中での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカー、並びにＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを包含し、この場合、上記中内胚葉細胞での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１から成る群から選択されるマーカーの発現がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい。このような実施形態では、マーカー検出は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、免疫細胞化学又は他の匹敵する方法によるものであり得る。
本明細書中に記載される或る特定の方法に関しては、培養中のヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９０％が中内胚葉細胞に分化する。本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態では、培地中に存在する成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの一成長因子である。好ましい実施形態では、成長因子はアクチビンＡである。他の好ましい実施形態では、成長因子は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ〜少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で培地中に存在する。或る特定のいくつかの実施形態では、成長因子は、約２４時間、３６時間又は４８時間後に除かれる。さらなる実施形態では、培地は、約１％（ｖ／ｖ）未満〜約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む。他の実施形態では、培地は低血清ＲＰＭＩである。さらに他の実施形態では、細胞集団は、血清又は血清代替物の非存在下で分化される。
本明細書中に記載されるさらに他の実施形態は、前原始線条細胞に富んだ細胞集団を産生する方法に関する。このような方法は、（ａ）多能性細胞集団の少なくとも１つの細胞がＦＧＦ８プロモーターの制御下でグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列又はその生物学的活性断片のコピーを含む多能性細胞、例えばｈＥＳＣの集団を生成する工程、（ｂ）中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である前原始線条細胞を産生するように多能性細胞を分化させる工程、及び（ｃ）前原始線条細胞をＧＦＰを発現しない細胞から分離する工程を包含する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも約９５％〜少なくとも約９８％の前原始線条細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法の分化させる工程は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡを多能性細胞集団に提供することを包含する。アクチビンＡの好ましい濃度は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ〜少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、細胞集団は、約１％（ｖ／ｖ）未満〜約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される。他の実施形態では、培地は低血清ＲＰＭＩである。さらに他の実施形態では、細胞集団は、血清又は血清代替物の非存在下で分化される。
本明細書中に記載される他の実施形態は、中内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する方法に関する。このような方法は、（ａ）多能性細胞集団の少なくとも１つの細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１プロモーターの制御下でグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
をコードする核酸配列又はその生物学的活性断片のコピーを含む多能性細胞、例えばｈＥＳＣの集団を生成する工程、（ｂ）中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である中内胚葉細胞を産生するように多能性細胞を分化させる工程、及び（ｃ）中内胚葉細胞をＧＦＰを発現しない細胞から分離する工程を包含する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも約９５％〜少なくとも約９８％の中内胚葉細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法の分化させる工程は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡを多能性細胞集団に提供することを包含する。アクチビンＡの好ましい濃度は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ〜少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、細胞集団は、約１％（ｖ／ｖ）未満〜約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される。他の実施形態では、培地は低血清ＲＰＭＩである。さらに他の実施形態では、細胞集団は、血清又は血清代替物の非存在下で分化される。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、ヒト細胞を含む細胞集団における前原始線条細胞の分化を促進し得る分化因子を同定するスクリーニング方法である。このような方法は、（ａ）ヒト前原始線条細胞を含む細胞集団を得る工程、（ｂ）細胞集団に候補分化因子を提供する工程、（ｃ）第１の時点での細胞集団におけるマーカーの発現を測定する工程、第２の時点での細胞集団における同一マーカーの発現を測定する工程、及び（ｄ）第２の時点での細胞集団におけるマーカーの発現が第１の時点での細胞集団におけるマーカーの発現と比較して増大又は減少されているかを判定する工程、であって、第２の時点は第１の時点の後であり、第２の時点は候補分化因子を集団に提供した後であるり、細胞集団におけるマーカーの発現の増大又は減少は候補分化因子が前原始線条細胞の分化を促進し得ることを示す、工程を包含する。或る特定のいくつかの実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を提供する前であるか又はそれとほぼ同一時点である。他の実施形態では、第１の時点は、候補分化因子の提供の後である。本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、ヒト前原始線条細胞は、候補分化因子に応答して、中内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞のような細胞に分化する。いくつかの実施形態では、中内胚葉細胞は、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１のようなマーカーの発現により示される。他の実施形態では、中胚葉は、ＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１及びＳＤＦ１のようなマーカーの発現により示される。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４及び／又はＳＯＸ１７のようなマーカーの発現により示される。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法に関しては、或る特定のいくつかの実施形態は、候補分化因子、例えばＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡの提供に関する。他の実施形態では、候補分化因子は、小分子又はポリペプチドである。さらに他の実施形態では、候補分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの因子でない。さらに他の実施形態では、候補分化因子は、前原始線条細胞の分化を引き起こすことが知られていない因子である。
本明細書中に記載される他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞集団における中内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定するスクリーニング方法である。このような方法は、（ａ）ヒト中内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、（ｂ）細胞集団に候補分化因子を提供する工程、（ｃ）第１の時点での細胞集団におけるマーカーの発現を測定する工程、第２の時点での細胞集団における同一マーカーの発現を測定する工程、及び（ｄ）第２の時点での細胞集団におけるマーカーの発現が第１の時点での細胞集団におけるマーカーの発現と比較して増大又は減少されているかを判定する工程、であって、第２の時点は第１の時点の後であり、第２の時点は候補分化因子を細胞集団に提供した後であり、細胞集団におけるマーカーの発現の増大又は減少は候補分化因子が中内胚葉細胞の分化を促進し得ることを示す、工程を包含する。或る特定のいくつかの実施形態では、第１の時点は、候補
分化因子を提供する前であるか又はそれとほぼ同一時点である。その他の実施形態では、第１の時点は、候補分化因子の提供の後である。本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、ヒト中内胚葉細胞は、候補分化因子に応答して、中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞のような細胞に分化する。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、ＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１及びＳＤＦ１のようなマーカーの発現により示される。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４及び／又はＳＯＸ１７のようなマーカーの発現により示される。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法に関しては、或る特定のいくつかの実施形態は、候補分化因子、例えばＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡの提供に関する。他の実施形態では、候補分化因子は、小分子又はポリペプチドである。さらに他の実施形態では、候補分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの因子でない。さらに他の実施形態では、候補分化因子は、中内胚葉細胞の分化を引き起こすことが知られていない因子である。
さらなる実施形態は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＧＦ８遺
伝子産物の発現を増大する方法に関する。当該方法は、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中でｈＥＳＣを得ること、及び、ｈＥＳＣを、ＦＧＦ８遺伝子産物の発現を増大するのに十分な量で分化因子と接触させることを包含する。いくつかの実施形態では、分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡである。いくつかの実施形態では、培地は、血清代替物を含まない。
さらに他の実施形態は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのブラキュ
リ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択される遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。当該方法は、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中でｈＥＳＣを得ること、及びｈＥＳＣをブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択される遺伝子産物の発現を増大するのに十分な量で分化因子と接触させることを包含する。いくつかの実施形態では、分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡである。いくつかの実施形態では、培地は血清代替物を含まない。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含む細胞培養物に関するが、この場合、ＦＧＦ８ ｍ
ＲＮＡの発現がベースラインＦＧＦ８ ｍＲＮＡ発現と比較して、参照時点から約６時間
までに実質的にアップレギュレートされるようにｈＥＳＣが参照時点で分化し始める。いくつかの実施形態では、β−カテニンポリペプチドの発現は、参照時点から約１７時間までに細胞核に局在されるようになり始める。他の実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現は、参照時点から約２４時間までに実質的にアップ
レギュレートされる。さらに他の実施形態では、Ｅ−カドヘリン ｍＲＮＡの発現は、参
照時点から約１２時間までにダウンレギュレートされ始める。さらにいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡの発現は、参照時点から約４８時間までに実質的にアップレ
ギュレートされ、及び／又はＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡの発現が参照時点から約９６時間まで
に実質的にアップレギュレートされる。本明細書中に記載される細胞培養物の或る特定のいくつかの実施形態では、培地は、約１％（ｖ／ｖ）未満から約０．２％（ｖ／ｖ）未満までの血清を含む。他の実施形態では、培地は約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む。さらに他の実施形態では、培地は血清代替物を含まない。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト胚性幹細胞と、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子と、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含む細胞培養物であって、第１の組のマーカー遺伝子が、第２の組及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のアッ
プレギュレート又は発現ピークの前に、又はアップレギュレート又は発現ピークとほぼ同時に、アップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされる細胞培地に関する。いくつかの実施形態では、培地は血清又は血清代替物を含まない。
さらに他の実施形態は、ヒト胚性幹細胞を約２％未満の血清を含む培地と接触させ、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をｈＥＳＣに提供し、そしてｈＥＳＣの分化を起こさせることによる細胞培養物における細胞を分化する方法に関する。いくつかの実施形態では、このような方法は、第２の組及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のアップレギュレート又は発現ピークの前、又はアップレギュレート又は発現ピークとほぼ同時にアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされる第１の組のマーカー遺伝子を有する細胞を産生する。いくつかの実施形態では、培地は血清又は血清代替物を含まない。
或る特定の権限において、「〜を含む」という用語の任意の一般的に許容される定義は存在し得ない。本明細書中で用いる場合、「〜を含む」という用語は、任意の付加的要素の包含を可能にする「限定しない」文言を表わすように意図される。これに留意して、以下の数字を付した項目を参照しながら、本発明のさらなる実施形態を記載する。
１． ヒト細胞を含む細胞培養物であって、当該ヒト細胞の少なくとも約５％が前原始線
条細胞であり、当該前原始線条細胞が中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である前記細胞培養物。
２． 上記ヒト細胞の少なくとも約１０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
３． 上記ヒト細胞の少なくとも約２０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
４． 上記ヒト細胞の少なくとも約３０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
５． 上記ヒト細胞の少なくとも約４０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
６． 上記ヒト細胞の少なくとも約５０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
７． 上記ヒト細胞の少なくとも約６０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
８． 上記ヒト細胞の少なくとも約７０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
９． 上記ヒト細胞の少なくとも約８０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培
養物。
１０． 上記ヒト細胞の少なくとも約９０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞
培養物。
１１． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約５％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培養物。
１２． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約２５％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培養物。
１３． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約５０％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培養物。
１４． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約７５％が前原始線条細胞である、項目１記載の細胞培養物。
１５． 上記原始線条細胞がＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から選択され
るマーカーを発現する、項目１記載の細胞培養物。
１６． 上記前原始線条細胞中での、ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から
選択されるマーカーの発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、項目１５記載の細胞培養物。
１７． 上記前原始線条細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸ
Ａ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない、項目１５記載の細胞培養物。
１８． 上記前原始線条細胞がＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンを発現する、項目１記
載の細胞培養物。
１９． 上記前原始線条細胞中での、ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンの発現がブラキ
ュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１の発現より大きい、項目１８記載の細胞培養物。
２０． 上記前原始線条細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸ
Ａ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１を実質的に発現しない、項目１８記載の細胞培養物。
２１． 上記細胞培養物が臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞、原始内胚葉細胞、胚体内胚
葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞から成る群から選択される細胞を実質的に含有しない、項目１記載の細胞培養物。
２２． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をさらに含む、項目１記載の細胞培養物。
２３． 少なくとも約２つの前原始線条細胞が上記細胞培養物中のほぼ１つ毎のｈＥＳＣ
に関して存在する、項目２２記載の細胞培養物。
２４． 少なくとも約１０個の前原始線条細胞が上記細胞培養物中のほぼ１つ毎のｈＥＳ
Ｃに関して存在する、項目２２記載の細胞培養物。
２５． 上記ｈＥＳＣが桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）、及び胚の生殖***から成る
群から選択される組織に由来する、項目２２記載の細胞培養物。
２６． 約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目１記載の細胞培養物
。
２７． 約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目１記載の細胞培養物
。
２８． 約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目１記載の細胞培
養物。
２９． 約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目１記載の細胞培
養物。
３０． 血清を欠くか又は血清代替物を欠く培地をさらに含む、項目１記載の細胞培養物
。
３１． ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの成長因子を
さらに含む、項目１記載の細胞培養物。
３２． ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの上記成長因
子がアクチビンＡを含む、項目３１記載の細胞培養物。
３３． ヒト細胞の少なくとも約５％が中内胚葉細胞であり、当該中内胚葉細胞が中胚葉
細胞又は胚体内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である上記ヒト細胞を含む細胞培養物。
３４． 上記ヒト細胞の少なくとも約１０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
３５． 上記ヒト細胞の少なくとも約２０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
３６． 上記ヒト細胞の少なくとも約３０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
３７． 上記ヒト細胞の少なくとも約４０％が前原始線条細胞である、項目３３記載の細
胞培養物。
３８． 上記ヒト細胞の少なくとも約５０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
３９． 上記ヒト細胞の少なくとも約６０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
４０． 上記ヒト細胞の少なくとも約７０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
４１． 上記ヒト細胞の少なくとも約８０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
４２． 上記ヒト細胞の少なくとも約９０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞
培養物。
４３． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約５％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞培養物。
４４． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約２５％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞培養物。
４５． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約５０％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞培養物。
４６． ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約７５％が中内胚葉細胞である、項目３３記載の細胞培養物。
４７． 上記中内胚葉細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択さ
れるマーカーを発現する、項目３３記載の細胞培養物。
４８． 上記中内胚葉細胞中での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から
選択されるマーカーの発現がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、項目４７記載の細胞培養物。
４９． 上記中内胚葉細胞がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７
及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない、項目４７記載の細胞培養物。
５０． 上記中内胚葉細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１を発現する、項目３３
記載の細胞培養物。
５１． 上記中内胚葉細胞中での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１の発現がＯＣＴ
４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１の発現より大きい、項目５１記載の細胞培養物。
５２． 上記中内胚葉細胞がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７
及びＳＯＸ１を実質的に発現しない、項目５１記載の細胞培養物。
５３． 上記細胞培養物が臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞、原始内胚葉細胞、胚体内胚
葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞から成る群から選択される細胞を実質的に含有しない、項目３３記載の細胞培養物。
５４． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をさらに含む、項目３３記載の細胞培養物。
５５． 少なくとも約２つの中内胚葉細胞が上記細胞培養物中のほぼ１つ毎のｈＥＳＣに
関して存在する、項目５４記載の細胞培養物。
５６． 少なくとも約１０個の中内胚葉細胞が上記細胞培養物中のほぼ１つ毎のｈＥＳＣ
に関して存在する、項目５４記載の細胞培養物。
５７． 上記ｈＥＳＣが桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）、及び胚の生殖***から成る
群から選択される組織に由来する、項目５４記載の細胞培養物。
５８． 約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目３３記載の細胞培養
物。
５９． 約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目３３記載の細胞培養
物。
６０． 約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目３３記載の細胞
培養物。
６１． 約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地をさらに含む、項目３３記載の細胞
培養物。
６２． 血清を欠くか又は血清代替物を欠く培地をさらに含む、項目３３記載の細胞培養
物。
６３． ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの成長因子を
さらに含む、項目３３記載の細胞培養物。
６４． ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの上記成長因
子がアクチビンＡを含む、項目６３記載の細胞培養物。
６５． 細胞の少なくとも約９０％がヒト前原始線条細胞であり、上記前原始線条細胞が
中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である上記細胞を含む細胞集団。
６６． 上記細胞の少なくとも約９５％がヒト前原始線条細胞である、項目６５記載の細
胞集団。
６７． 上記細胞の少なくとも約９８％がヒト前原始線条細胞である、項目６５記載の細
胞集団。
６８． 上記ヒト前原始線条細胞がＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から選
択されるマーカーを発現する、項目６５記載の細胞集団。
６９． 上記ヒト前原始線条細胞中での、ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群
から選択されるマーカーの発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、項目６８記載の細胞集団。
７０． 上記ヒト前原始線条細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、Ｆ
ＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない、項目６８記載の細胞集団。
７１． 上記ヒト原始線条細胞がＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンを発現する、項目６
５記載の細胞集団。
７２． 上記ヒト前原始線条細胞中での、ＦＧＦ８及びβ−カテニンの発現がブラキュリ
、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１の発現より大きい、項目７１記載の細胞集団。
７３． 上記ヒト前原始線条細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、Ｆ
ＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１を実質的に発現しない、項目７１記載の細胞集団。
７４． 細胞の少なくとも約９０％がヒト中内胚葉細胞であり、上記中内胚葉細胞が中胚
葉細胞又は胚体内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である上記細胞を含む細胞集団。
７５． 上記細胞の少なくとも約９５％がヒト中内胚葉細胞である、項目７４記載の細胞
集団。
７６． 上記細胞の少なくとも約９８％がヒト中内胚葉細胞である、項目７４記載の細胞
集団。
７７． 上記ヒト中内胚葉細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選
択されるマーカーを発現する、項目７４記載の細胞集団。
７８． 上記ヒト中内胚葉細胞中での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群
から選択されるマーカーの発現がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、項目７７記載の細胞集団。
７９． 上記ヒト中内胚葉細胞がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯ
Ｘ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない、項目７７記載の細胞集団。
８０． 上記ヒト中内胚葉細胞がブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１を発現する、項目
７４記載の細胞集団。
８１． 上記ヒト中内胚葉細胞中での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１の発現がＯ
ＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１の発現より大きい、項目７７記載の細胞集団。
８２． 上記ヒト中内胚葉細胞がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯ
Ｘ７及びＳＯＸ１を実質的に発現しない、項目７７記載の細胞集団。
８３． 前原始線条細胞を産生する方法であって、多能性ヒト細胞を含む細胞集団を得る
工程、及び、約２％未満の血清及びＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子を含む培地中で上記多能性ヒト細胞を分化させる工程を包含し、上記成長因子が前原始線条細胞への上記多能性ヒト細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な量で上記培地中に存在し、上記前原始線条細胞が中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である上記方法。
８４． 前原始線条細胞を十分な時間生成させる工程をさらに包含し、前原始線条細胞を
生成させるための上記十分な時間が上記細胞集団中の前原始線条細胞の存在を検出することにより決定された項目８３記載の方法。
８５． 上記十分な時間が少なくとも約６時間である、項目８４記載の方法。
８６． 上記細胞集団中の前原始線条細胞の存在の検出が上記細胞集団の細胞中での、Ｆ
ＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から選択される少なくとも１つのマーカー、並びにブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを包含し、上記前原始線条細胞中での、ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニンから成る群から選択されるマーカーの発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、Ｓ
ＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、項目８４記載の方法。
８７． 上記マーカーの少なくとも１つの発現が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣ
Ｒ）により測定される、項目８６記載の方法。
８８． 上記マーカーの少なくとも１つの発現が免疫細胞化学により測定される、項目８
６記載の方法。
８９． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約５％が前原始線条細胞に分化する、項目８３
記載の方法。
９０． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約１０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９１． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約２０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９２． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約３０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９３． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約４０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９４． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約５０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９５． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約６０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９６． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約７０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９７． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約８０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９８． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約９０％が前原始線条細胞に分化する、項目８
３記載の方法。
９９． 上記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アク
チビンサブグループに属する、項目８３記載の方法。
１００． ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの上記少な
くとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、項目９９記載の方法。
１０１． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で提供さ
れる、項目８３記載の方法。
１０２． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供
される、項目８３記載の方法。
１０３． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供
される、項目８３記載の方法。
１０４． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で提
供される、項目８３記載の方法。
１０５． 上記少なくとも１つの成長因子が約６時間後に除かれる、項目８３記載の方法
。
１０６． 上記少なくとも１つの成長因子が約１２時間後に除かれる、項目８３記載の方
法。
１０７． 上記少なくとも１つの成長因子が約１８時間後に除かれる、項目８３記載の方
法。
１０８． 上記細胞集団が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、項目
８３記載の方法。
１０９． 上記細胞集団が約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目８３記載の方法。
１１０． 上記細胞集団が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目８３記載の方法。
１１１． 上記細胞集団が約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目８３記載の方法。
１１２． 上記細胞集団が血清の非存在下又は血清代替物の非存在下で分化される、項目
８３記載の方法。
１１３． 上記細胞集団が上記少なくとも１つの成長因子を添加後約１日目に約０％（ｖ
／ｖ）の血清、上記少なくとも１つの成長因子を添加後約２日目に約０．２％（ｖ／ｖ）以下の血清、そして上記少なくとも１つの成長因子を添加後約３日目に約２％（ｖ／ｖ）以下の血清を含む培地中で分化される、項目８３記載の方法。
１１４． 上記細胞集団が低血清ＲＰＭＩ培地中で分化される、項目８３記載の方法。
１１５． 上記多能性ヒト細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む、項目８３記載の方
法。
１１６． 上記ヒト胚性幹細胞が桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）、及び胚の生殖***
から成る群から選択される組織に由来する、項目１１５記載の方法。
１１７． 項目８３記載の方法により産生される前原始線条細胞。
１１８． 中内胚葉細胞を産生する方法であって、多能性ヒト細胞を含む細胞集団を得る
工程、及び、約２％未満の血清及びＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子を含む培地中で上記多能性ヒト細胞を分化させる工程を包含し、上記成長因子が中内胚葉細胞への上記多能性ヒト細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な量で上記
培地中に存在し、上記中内胚葉細胞が中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である上記方法。
１１９． 中内胚葉細胞を十分な時間生成させる工程をさらに包含し、中内胚葉細胞を生
成させるための上記十分な時間が上記細胞集団中の中内胚葉細胞の存在を検出することにより決定された項目１１８記載の方法。
１２０． 上記十分な時間が少なくとも約２４時間である、項目１１９記載の方法。
１２１． 上記細胞集団中の中内胚葉細胞の存在の検出が、上記細胞集団の細胞中での、
ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカー、並びにＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを包含し、上記中内胚葉細胞中での、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択されるマーカーの発現がＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及びＳＯＸ１から成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、項目１１８記載の方法。
１２２． 上記マーカーの少なくとも１つの発現が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−Ｐ
ＣＲ）により測定される、項目１２１記載の方法。
１２３． 上記マーカーの少なくとも１つの発現が免疫細胞化学により測定される、項目
１２１記載の方法。
１２４． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約５％が中内胚葉細胞に分化する、項目１１
８記載の方法。
１２５． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約１０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１２６． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約２０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１２７． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約３０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１２８． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約４０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１２９． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約５０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１３０． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約６０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１３１． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約７０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１３２． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約８０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１３３． 上記多能性ヒト細胞の少なくとも約９０％が中内胚葉細胞に分化する、項目１
１８記載の方法。
１３４． 上記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／ア
クチビンサブグループに属する、項目１１８記載の方法。
１３５． ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの上記少な
くとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、項目１３４記載の方法。
１３６． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で提供さ
れる、項目１１８記載の方法。
１３７． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供
される、項目１１８記載の方法。
１３８． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供
される、項目１１８記載の方法。
１３９． 上記少なくとも１つの成長因子が少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で提
供される、項目１１８記載の方法。
１４０． 上記少なくとも１つの成長因子が約２４時間後に除かれる、項目１１８記載の
方法。
１４１． 上記少なくとも１つの成長因子が約３６時間後に除かれる、項目１１８記載の
方法。
１４２． 上記少なくとも１つの成長因子が約４８時間後に除かれる、項目１１８記載の
方法。
１４３． 上記細胞集団が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、項目
１１８記載の方法。
１４４． 上記細胞集団が約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１１８記載の方法。
１４５． 上記細胞集団が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１１８記載の方法。
１４６． 上記細胞集団が約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１１８記載の方法。
１４７． 上記細胞集団が血清の非存在下又は血清代替物の非存在下で分化される、項目
１１８記載の方法。
１４８． 上記細胞集団が上記少なくとも１つの成長因子を添加後約１日目に約０％（ｖ
／ｖ）の血清、上記少なくとも１つの成長因子を添加後約２日目に約０．２％（ｖ／ｖ）以下の血清、そして上記少なくとも１つの成長因子を添加後約３日目に約２％（ｖ／ｖ）以下の血清を含む培地中で分化される、項目１１８記載の方法。
１４９． 上記細胞集団が低血清ＲＰＭＩ培地中で分化される、項目１１８記載の方法。
１５０． 上記多能性ヒト細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む、項目１１８記載の
方法。
１５１． 上記ヒト胚性幹細胞が桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）、及び胚の生殖腺隆
起から成る群から選択される組織に由来する、項目１５０記載の方法。
１５２． 項目１１８記載の方法により産生される中内胚葉細胞。
１５３． 前原始線条細胞に富んだ細胞集団を産生する方法であって、
多能性細胞の集団を得る工程、
前原始線条細胞を産生するように上記多能性細胞を分化させる工程及び、
上記前原始線条細胞をＧＦＰを発現しない細胞から分離する工程を包含し、前記多能性細胞の集団の少なくとも１つの細胞がＦＧＦ８プロモーターの制御下の核酸の少なくとも１つのコピーを含み、当該核酸がグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列又はその生物学的活性断片を含み、前記前原始線条細胞が中内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である、上記方法。
１５４． 上記富化細胞集団が少なくとも約９５％の前原始線条細胞を含む、項目１５３
の方法。
１５５． 上記富化細胞集団が少なくとも約９８％の前原始線条細胞を含む、項目１５３
の方法。
１５６． 上記分化させる工程が前原始線条細胞への上記多能性細胞の分化を促進するの
に十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を上記多能性細胞集団に提供することを包含する、項目１５３記載の方法。
１５７． ＴＧＦβスーパーファミリーの上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡ
である、項目１５６記載の方法。
１５８． 上記アクチビンＡが少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目１
５７記載の方法。
１５９． 上記アクチビンＡが少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目
１５７記載の方法。
１６０． 上記アクチビンＡが少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目
１５７記載の方法。
１６１． 上記細胞集団が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、項目
１５３記載の方法。
１６２． 上記細胞集団が約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１５３記載の方法。
１６３． 上記細胞集団が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１５３記載の方法。
１６４． 上記細胞集団が約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１５３記載の方法。
１６５． 上記細胞集団が血清の非存在下又は血清代替物の非存在下で分化される、項目
１５３記載の方法。
１６６． 上記細胞集団が上記少なくとも１つの成長因子を添加後約１日目に約０％（ｖ
／ｖ）の血清、上記少なくとも１つの成長因子を添加後約２日目に約０．２％（ｖ／ｖ）以下の血清、そして上記少なくとも１つの成長因子を添加後約３日目に約２％（ｖ／ｖ）以下の血清を含む培地中で分化される、項目１５３記載の方法。
１６７． 上記細胞集団が低血清ＲＰＭＩ培地中で分化される、項目１５３記載の方法。
１６８． 項目１５３記載の方法により産生される前原始線条細胞の富化集団。
１６９． 中内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する方法であって、
多能性細胞の集団を得る工程、
中内胚葉細胞を産生するように上記多能性細胞を分化させる工程及び、
上記中内胚葉細胞をＧＦＰを発現しない細胞から分離する工程を包含し、前記多能性細胞の集団の少なくとも１つの細胞がブラキュリプロモーター、ＦＧＦ４プロモーター及びＳＮＡＩ１プロモーターから成る群から選択されるプロモーターの制御下の核酸の少なくとも１つのコピーを含み、当該核酸がグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列又はその生物学的活性断片を含み、前記中内胚葉細胞が中胚葉細胞又は胚体内胚葉細胞に分化し得る多分化能細胞である、上記方法。
１７０． 上記富化細胞集団が少なくとも約９５％の中内胚葉細胞を含む、項目１６９記
載の方法。
１７１． 上記富化細胞集団が少なくとも約９８％の中内胚葉細胞を含む、項目１６９記
載の方法。
１７２． 上記分化させる工程が中内胚葉細胞への上記多能性細胞の分化を促進するのに
十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を上記多能性細胞集団に提供することを包含する、項目１６９記載の方法。
１７３． ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡであ
る、項目１７２記載の方法。
１７４． 上記アクチビンＡが少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目１
７３記載の方法。
１７５． 上記アクチビンＡが少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目
１７３記載の方法。
１７６． 上記アクチビンＡが少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目
１７３記載の方法。
１７７． 上記細胞集団が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、項目
１６９記載の方法。
１７８． 上記細胞集団が約０．５％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１６９記載の方法。
１７９． 上記細胞集団が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１６９記載の方法。
１８０． 上記細胞集団が約０．１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で分化される、
項目１６９記載の方法。
１８１． 上記細胞集団が血清の非存在下又は血清代替物の非存在下で分化される、項目
１６９記載の方法。
１８２． 上記細胞集団が上記少なくとも１つの成長因子を添加後約１日目に約０％（ｖ
／ｖ）の血清、上記少なくとも１つの成長因子を添加後約２日目に約０．２％（ｖ／ｖ）以下の血清、そして上記少なくとも１つの成長因子を添加後約３日目に約２％（ｖ／ｖ）以下の血清を含む培地中で分化される、項目１６９記載の方法。
１８３． 上記細胞集団が低血清ＲＰＭＩ培地中で分化される、項目１６９記載の方法。
１８４． 項目１６９記載の方法により産生される中内胚葉細胞の富化集団。
１８５． ヒト細胞を含む細胞集団における前原始線条細胞の分化を促進し得る分化因子
を同定する方法であって、
ヒト前原始線条細胞を含む細胞集団を得る工程、
前記細胞集団に候補分化因子を提供する工程、
第１の時点での上記細胞集団におけるマーカーの発現を測定する工程、
第２の時点での上記細胞集団における同一マーカーの発現を測定する工程、及び
前記第２の時点での上記細胞集団におけるマーカーの発現が上記第１の時点での上記細胞集団におけるマーカーの発現と比較して増大又は減少されているかを判定する工程を含み、前記第２の時点は上記第１の時点の後であり、当該第２の時点は上記候補分化因子を上記集団に提供した後であり、上記細胞集団における上記マーカーの発現の増大又は減少は上記候補分化因子が上記前原始線条細胞の分化を促進し得ることを示す、上記方法。
１８６． 上記ヒト前原始線条細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約１０％を
含む、項目１８５記載の方法。
１８７． ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細
胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％が前原始線条細胞である、項目１８５記載の方法。
１８８． 上記ヒト前原始線条細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約５０％を
含む、項目１８５記載の方法。
１８９． 上記ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして上記フィーダー細
胞以外のヒト細胞の少なくとも約５０％が前原始線条細胞である、項目１８５記載の方法。
１９０． 上記ヒト前原始線条細胞が上記候補分化因子に応答して中内胚葉、中胚葉及び
胚体内胚葉から成る群から選択される細胞に分化する、項目１８５記載の方法。
１９１． 上記ヒト前原始線条細胞が上記候補分化因子に応答して中内胚葉細胞に分化す
る、項目１８５記載の方法。
１９２． 上記マーカーがブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択され
る、項目１９１記載の方法。
１９３． 上記ヒト前原始線条細胞が上記候補分化因子に応答して中胚葉細胞に分化する
、項目１８５記載の方法。
１９４． 上記マーカーがＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１及びＳＤＦ１から
成る群から選択される、項目１９３記載の方法。
１９５． 上記ヒト前原始線条細胞が上記候補分化因子に応答して胚体内胚葉細胞に分化
する、項目１８５記載の方法。
１９６． 上記マーカーがＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７から成る群から選択される、項目１
９５記載の方法。
１９７． 上記第１の時点が上記細胞集団への上記候補分化因子の提供の前である、項目
１８５記載の方法。
１９８． 上記第１の時点が上記細胞集団への上記候補分化因子の提供とほぼ同時である
、項目１８５記載の方法。
１９９． 上記第１の時点が上記細胞集団への上記候補分化因子の提供の後である、項目
１８５記載の方法。
２００． 上記マーカーの発現が増大される、項目１８５記載の方法。
２０１． 上記マーカーの発現が減少される、項目１８５記載の方法。
２０２． 上記マーカーの発現が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により測定
される、項目１８５記載の方法。
２０３． 上記マーカーの発現が免疫細胞化学により測定される、項目１８５記載の方法
。
２０４． 上記候補分化因子がＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子
を含む、項目１８５記載の方法。
２０５． ＴＧＦβスーパーファミリーの上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡ
である、項目２０４記載の方法。
２０６． 上記候補分化因子が小分子を含む、項目１８５記載の方法。
２０７． 上記候補分化因子がポリペプチドを含む、項目１８５記載の方法。
２０８． 上記候補分化因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子でない、項目１８
５記載の方法。
２０９． 上記候補分化因子が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で上記細胞
集団に提供される、項目１８５記載の方法。
２１０． 上記候補分化因子が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団に
提供される、項目１８５記載の方法。
２１１． 上記候補分化因子が約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞
集団に提供される、項目１８５記載の方法。
２１２． 上記候補分化因子が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞
集団に提供される、項目１８５記載の方法。
２１３． 上記候補分化因子が約１μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団に提供される、項目
１８５記載の方法。
２１４． ヒト細胞を含む細胞集団における中内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を
同定する方法であって、
ヒト中内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、
前記細胞集団に候補分化因子を提供する工程、
第１の時点での上記細胞集団におけるマーカーの発現を測定する工程、
第２の時点での上記細胞集団における同一マーカーの発現を測定する工程、及び、
前記第２の時点での上記細胞集団におけるマーカーの発現が上記第１の時点での上記細胞集団におけるマーカーの発現と比較して増大又は減少されているかを判定する工程を含み、上記第２の時点は上記第１の時点の後であり、上記第２の時点は上記候補分化因子を上記集団に提供した後であり、上記細胞集団における上記マーカーの発現の増大又は減少は上記候補分化因子が上記中内胚葉細胞の分化を促進し得ることを示す、上記方法。
２１５． 上記ヒト中内胚葉細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約１０％を含
む、項目２１４記載の方法。
２１６． ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして当該フィーダー細胞以
外のヒト細胞の少なくとも約１０％が中内胚葉細胞である、項目２１４記載の方法。
２１７． 上記ヒト中内胚葉細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約５０％を含
む、項目２１４記載の方法。
２１８． 上記ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして上記フィーダー細
胞以外のヒト細胞の少なくとも約５０％が中内胚葉細胞である、項目２１４記載の方法。
２１９． 上記ヒト中内胚葉細胞が上記候補分化因子に応答して中胚葉及び胚体内胚葉か
ら成る群から選択される細胞に分化する、項目２１４記載の方法。
２２０． 上記ヒト中内胚葉細胞が上記候補分化因子に応答して中胚葉細胞に分化する、
項目２１４記載の方法。
２２１． 上記マーカーがＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１及びＳＤＦ１から
成る群から選択される、項目２２０記載の方法。
２２２． 上記ヒト中内胚葉細胞が上記候補分化因子に応答して胚体内胚葉細胞に分化す
る、項目２１４記載の方法。
２２３． 上記マーカーがＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７から成る群から選択される、項目２
２２記載の方法。
２２４． 上記第１の時点が上記細胞集団への上記候補分化因子の提供の前である、項目
２１４記載の方法。
２２５． 上記第１の時点が上記細胞集団への上記候補分化因子の提供とほぼ同時である
、項目２１４記載の方法。
２２６． 上記第１の時点が上記細胞集団への上記候補分化因子の提供の後である、項目
２１４記載の方法。
２２７． 上記マーカーの発現が増大される、項目２１４記載の方法。
２２８． 上記マーカーの発現が減少される、項目２１４記載の方法。
２２９． 上記マーカーの発現が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により測定
される、項目２１４記載の方法。
２３０． 上記マーカーの発現が免疫細胞化学により測定される、項目２１４記載の方法
。
２３１． 上記候補分化因子がＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子
を含む、項目２１４記載の方法。
２３２． ＴＧＦβスーパーファミリーの上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡ
である、項目２３１記載の方法。
２３３． 上記候補分化因子が小分子を含む、項目２１４記載の方法。
２３４． 上記候補分化因子がポリペプチドを含む、項目２１４記載の方法。
２３５． 上記候補分化因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子でない、項目２１
４記載の方法。
２３６． 上記候補分化因子が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で上記細胞
集団に提供される、項目２１４記載の方法。
２３７． 上記候補分化因子が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団に
提供される、項目２１４記載の方法。
２３８． 上記候補分化因子が約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞
集団に提供される、項目２１４記載の方法。
２３９． 上記候補分化因子が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞
集団に提供される、項目２１４記載の方法。
２４０． 上記候補分化因子が約１μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団に提供される、項目
２１４記載の方法。
２４１． ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中のＦＧＦ８遺伝子産物の発現を増大する方法であって、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記ｈＥＳＣを生成する工程、及び、上記ｈＥＳＣを、ＦＧＦ８遺伝子産物の発現を増大するのに十分な量で分化因子と接触させる工程を包含する前記方法。
２４２． 上記分化因子がＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子を含
む、項目２４１記載の方法。
２４３． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目２４２記載の方法。
２４４． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目２４１記載の方法。
２４５． ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は前原始線条細胞中のブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択される遺伝子産物の発現を増大する方法であって、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記ｈＥＳＣ又は前原始線条細胞を得る工程、及び、上記ｈＥＳＣ又は上記前原始線条細胞を、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１から成る群から選択される遺伝子産物の発現を増大するのに十分な量で分化因子と接触させる工程を包含する、前記方法。
２４６． 上記分化因子がＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子を含
む、項目２４５記載の方法。
２４７． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目２４６記載の方法。
２４８． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目２４５記載の方法。
２４９． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含
む細胞培養物であって、前記ｈＥＳＣにおいてＦＧＦ８ ｍＲＮＡの発現がベースライン
ＦＧＦ８ ｍＲＮＡ発現と比較して、参照時点から約６時間までに実質的にアップレギュ
レートされるような上記参照時点で上記ｈＥＳＣが分化し始める、前記細胞培養物。
２５０． ＦＧＦ８ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約２４時間後にダウンレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２５１． ＦＧＦ８ ｍＲＮＡの発現ピークが上記参照時点から約６時間〜約２４時間の時間で到達する、項目２５０記載の細胞培養物。
２５２． β−カテニンポリペプチドが上記参照時点から約１７時間までに細胞核に局在
化されるようになり始める、項目２４９記載の細胞培養物。
２５３． ブラキュリ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２５４． ブラキュリ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる、項目２５３記載の細胞培養物。
２５５． ブラキュリ ｍＲＮＡの発現ピークが上記参照時点から約１２時間〜約４８時間の時間で到達する、項目２５４記載の細胞培養物。
２５６． ブラキュリ ｍＲＮＡが上記参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない、項目２５５記載の細胞培養物。
２５７． ＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２５８． ＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる、項目２５７記載の細胞培養物。
２５９． ＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現ピークが上記参照時点から約１２時間〜約４８時間の時間で到達する、項目２５８記載の細胞培養物。
２６０． ＦＧＦ４ ｍＲＮＡが上記参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない、項目２５９記載の細胞培養物。
２６１． ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２６２． ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる、項目２６１記載の細胞培養物。
２６３． ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現ピークが上記参照時点から約１２時間〜約４８時間の時間で到達する、項目２６２記載の細胞培養物。
２６４． ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡが上記参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない、項目２６３記載の細胞培養物。
２６５． ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２６６． ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる、項目２６５記載の細胞培養物。
２６７． ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現ピークが上記参照時点から約１２時間〜約４８時間の時間で到達する、項目２６６記載の細胞培養物。
２６８． Ｅ−カドヘリン ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約１２時間までにダウンレギュレートし始める、項目２４９記載の細胞培養物。
２６９． Ｅ−カドヘリン ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２７０． ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約４８時間までに実質的にアップレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２７１． ＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡの発現が上記参照時点から約９６時間までに実質的にアップレギュレートされる、項目２４９記載の細胞培養物。
２７２． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目２４９記載の細胞培養物
。
２７３． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目２４９記載の細胞培
養物。
２７４． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目２４９記載の細胞培養物。
２７５． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目２４９記載の細胞培養物
。
２７６． ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をさらに含む、項目２４９記載の細胞
培養物。
２７７． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目２７６記載の細胞培養物。
２７８． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目２７７記載の
細胞培養物。
２７９． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子と、
約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含む細胞培養物。
２８０． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前にアップレギュレートされる、項目２７９記載の細胞培養物。
２８１． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前にアップレギュレートされる、項目２８０記載の細胞培養物。
２８２． 上記細胞培養物の細胞中で、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成
る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前又は当該発現ピークとほぼ同時にダウンレギュレートされる、項目２８１記載の細胞培養物。
２８３． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前にアップレギュレートされる、項目２７９記載の細胞培養物。
２８４． 上記細胞培養物の細胞中で、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、
ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現の
アップレギュレートの前又は当該アップレギュレートとほぼ同時にアップレギュレートされる、項目２８３記載の細胞培養物。
２８５． 上記細胞培養物の細胞中で、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、
ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークがＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又は当該アップレギュレートとほぼ同時に到達される、項目２８４記載の細胞培養物。
２８６． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前にアップレギュレートされる、項目２８３記載の細胞培養物。
２８７． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目２７９記載の細胞培養物
。
２８８． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目２７９記載の細胞培
養物。
２８９． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目２７９記載の細胞培養物。
２９０． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目２７９記載の細胞培養物
。
２９１． ＴＧＦβスーパーファミリーの上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目２７
９記載の細胞培養物。
２９２． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、項目
２９１記載の細胞培養物。
２９３． 細胞培養物中の細胞を分化する方法であって、（ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ
Ｃ）を含む細胞培養物を約２％未満の血清を含む培地と接触させること、（ｂ）ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子を上記ｈＥＳＣに提供すること、及び（ｃ）上記ｈＥＳＣの分化を起こさせることを包含する上記方法。
２９４． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前にアップレギュレートされる、項目２８３記載の方法。
２９５． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマー
カー遺伝子の発現ピークの前にアップレギュレートされる、項目２９４記載の方法。
２９６． 上記細胞培養物の細胞中で、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成
る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前又はほぼ同時にダウンレギュレートされる、項目２９５記載の方法。
２９７． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前にアップレギュレートされる、項目２９３記載の方法。
２９８． 上記細胞培養物の細胞中で、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、
ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又はほぼ同時にアップレギュレートされる、項目２９７記載の方法。
２９９． 上記細胞培養物の細胞中で、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、
ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークがＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又はほぼ同時に到達される、項目２９８記載の方法。
３００． 上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴ
Ａ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前にアップレギュレートされる、項目２９７記載の方法。
３０１． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目２９３記載の方法。
３０２． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目２９３記載の方法。
３０３． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目２９３記載の方法。
３０４． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目２９３記載の方法。
３０５． ＴＧＦβスーパーファミリーの上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目２９
３記載の方法。
３０６． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、項目
３０５記載の方法。
３０７． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含
む細胞培養物であって、ＦＺＤ１０、ＦＧＦ５及びＯＣＴ４から成る群から選択されるｍＲＮＡの発現が上記ｈＥＳＣ中のＦＺＤ１０、ＦＧＦ５及びＯＣＴ４から成る群から選択
される対応するｍＲＮＡのベースライン発現と比較して、参照時点から約２時間までに実質的にアップレギュレートされるように上記ｈＥＳＣが上記参照時点で分化し始める細胞培養物。
３０８． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３０７記載の細胞培養物
。
３０９． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３０７記載の細胞培
養物。
３１０． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目３０７記載の細胞培養物。
３１１． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目３０７記載の細胞培養物
。
３１２． ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をさらに含む、項目３０７記載の細胞
培養物。
３１３． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目３１２記載の細胞培養物。
３１４． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目３１３記載の
細胞培養物。
３１５． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含
む細胞培養物であって、ＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２から成る群から選択されるｍＲＮＡの発現が上記ｈＥＳＣ中のＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２から成る群から選択される対応するｍＲＮＡのベースライン発現と比較して、参照時点から約２時間までに実質的にダウンレギュレートされるように上記ｈＥＳＣが上記参照時点で分化し始める上記細胞培養物。
３１６． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３１５記載の細胞培養物
。
３１７． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３１５記載の細胞培
養物。
３１８． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目３１５記載の細胞培養物。
３１９． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目３１５記載の細胞培養物
。
３２０． ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をさらに含む、項目３１５記載の細胞
培養物。
３２１． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目３２０記載の細胞培養物。
３２２． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目３２１記載の
細胞培養物。
３２３． ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子と、
約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地とを含む細胞培養物であって、当該細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前に、ＦＺＤ１０、ＦＧＦ５、Ｎａｎｏｇ及びＯＣＴ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がアップレギュレートされるか、又はＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がダウンレギュレートされる前記細胞培養物。
３２４． ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥ
ＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前に、ＦＺＤ１０、ＦＧＦ５、Ｎａｎｏｇ及びＯＣＴ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がアップレギュレートされるか、又はＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がダウンレギュレートされる、項目３２３記載の細胞培養物。
３２５． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３２３記載の細胞培養物
。
３２６． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３２３記載の細胞培
養物。
３２７． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目３２３記載の細胞培養物。
３２８． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目３２３記載の細胞培養物
。
３２９． ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をさらに含む、項目３２３記載の細胞
培養物。
３３０． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目３２９記載の細胞培養物。
３３１． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目３３０記載の
細胞培養物。
３３２． 細胞培養物中の細胞を分化する方法であって、（ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ
Ｃ）を含む細胞培養物を約２％未満の血清を含む培地と接触させること、（ｂ）ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子を上記ｈＥＳＣに提供すること、及び（ｃ）上記ｈＥＳＣの分化を起こさせることを包含する方法であって、上記細胞培養物の細胞中で、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前に、ＦＺＤ１０、ＦＧＦ５、Ｎａｎｏｇ及びＯＣＴ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がアップレギュレートされるか、又はＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がダウンレギュレートされる前記方法。
３３３． ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥ
ＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前に、ＦＺＤ１０、ＦＧＦ５、Ｎａｎｏｇ及びＯＣＴ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がアップレギュレートされるか、又はＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現がダウンレギュレートされる、項目３３２に記載の方法。
３３４． 上記培地が約１％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３３２記載の方法。
３３５． 上記培地が約０．２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む、項目３３２記載の方法。
３３６． 上記培地が約０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、項目３３２記載の方法。
３３７． 上記培地が血清を欠くか又は血清代替物を欠く、項目３３２記載の方法。
３３８． ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をさらに含む、項目３３２記載の方法
。
３３９． 上記分化因子がアクチビンＡを含む、項目３３８記載の方法。
３４０． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目３３９記載の
方法。
上記の方法及び組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関する、と理解される。
しかしながら上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ用途に用いられ得る。
本発明のさらなる実施形態は、２００３年１２月２３日に出願された胚体内胚葉細胞（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５３２，００４号；２００４
年４月２７日に出願された内胚葉を発現するＰＤＸ１（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号；２００４年７月９日に出願された胚体内胚葉細胞の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号；２００４年７月１４日に出願された胚体内胚葉細胞の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号；２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許出
願第１１／０２１，６１８号；２００５年４月２６日に出願された内胚葉を発現するＰＤＸ１（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）という表題の米国特許出願第１１／１１５，８６８号；２００５年６月２３日に出願された胚体内胚葉を分化するための因子を同定する方法（METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM）という
表題の米国特許出願第１１／１６５，３０５号；及び２００５年６月２３日に出願された前原始線条細胞及び中内胚葉細胞（PREPRIMITIVE STREAK CELLS AND MESENDODERM CELLS
）という表題の米国特許仮出願第６０／６９３，３６４号（これらの開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）にも見出され得る。
図１は、アクチビンの存在下での、ＢＭＰ４及びＳＵ５４０２の組合せの存在下での、並びに任意の分化因子の非存在下での、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の分化を示す略図である。各細胞型の同定及び／又は検出のためのいくつかの有用なマーカー遺伝子も列挙されている。 図２−１は、胚体内胚葉細胞を同定するために用いられ得るマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。上記系列マーカー遺伝子ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析を、それぞれパネルＡ〜Ｆに示す。パネルＡ〜Ｆの各々に関して、カラム標識ｈＥＳＣは、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示す；２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理し、アクチビンを添加しない細胞を示す；０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す；１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す；そして２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。 図２−２は、胚体内胚葉細胞を同定するために用いられ得るマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析も、それぞれパネルＧ〜Ｌに示す。パネルＧ〜Ｌの各々に関して、カラム標識ｈＥＳＣは、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示す；２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理し、アクチビンを添加しない細胞を示す；０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す；１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す；そして２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。 図２−３は、胚体内胚葉細胞を同定するために用いられ得るマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＭに関して、カラム標識ｈＥＳＣは、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示す；２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理し、アクチビンを添加しない細胞を示す；０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す；１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す；そして２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。 図３−１は、（Ａ）前原始線条細胞、（Ｂ〜Ｄ）原始線条（内胚葉系中胚葉）細胞、（Ｅ〜Ｆ）中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞中で発現される或る特定のマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。細胞培養物への１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（「Ａ」で示す）又は１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２．５μＭのＳＵ５４０２の組合せ（「Ｂ／ＳＵ」として示す）の添加後０、６、１２、２４、４８，７２及び９６時間目の分化経過中に、Ｑ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。１日目（最初の２４時間）に０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを、２日目（２４〜４８時間）に０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを、そして３日目及び４日目（４８〜９６時間）に２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で、全細胞を増殖させた。各マーカー遺伝子の正式名称を表１に提示する。 図３−２は、（Ｇ）胚体内胚葉細胞、並びに（Ｈ〜Ｌ）栄養外胚葉及び原始線条細胞中で発現される或る特定のマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。細胞培養物への１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（「Ａ」で示す）又は１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２．５μＭのＳＵ５４０２の組合せ（「Ｂ／ＳＵ」として示す）の添加後０、６、１２、２４、４８，７２及び９６時間目の分化経過中に、Ｑ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。１日目（最初の２４時間）に０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを、２日目（２４〜４８時間）に０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを、そして３日目及び４日目（４８〜９６時間）に２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で、全細胞を増殖させた。各マーカー遺伝子の正式名称を表１に提示する。 図４Ａ〜図４Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの存在下でのｈＥＳＣ（「ＥＳＣ」で示す）からの分化の最初の４８時間中の、（Ａ）中内胚葉のためのブラキュリマーカー（ＢＲＡＣＨ）、（Ｂ）ｈＥＳＣのためのＢ−カドヘリンマーカー、並びに（Ｃ）中内胚葉のためのＳＮＡＩ１マーカーのｍＲＮＡ発現パターンを示す棒グラフである。 図５Ａ及び図５Ｂは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの存在下でのｈＥＳＣ（「ＥＳ」で示す）からの分化の最初の４８時間中の、それぞれ中内胚葉のためのブラキュリマーカー（ＢＲＡＣＨ）、並びに胚体内胚葉のための性決定領域Ｙ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）マーカーのｍＲＮＡ発現パターンを示す棒グラフである。 図６Ａ〜図６Ｄは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの存在下でのｈＥＳＣからの分化後４８時間の細胞を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ＤＡＰＩで染色した細胞の一視野を示す。パネルＢ〜Ｄは、ブラキュリ（Ｂ）、ＳＯＸ１７（Ｃ）、又はブラキュリ及びＳＯＸ１７の両方（Ｄ）に対する一次抗体を用いて染色した細胞の同一視野を示す。 図７は、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下（Ａ１００）又はその非存在下（ＮＦ）での低血清条件下での胚性幹細胞（ＥＳＣ）の分化を示す略図である。ＰＳは原始線条細胞（中内胚葉細胞）を示す；ＤＥは胚体内胚葉細胞を示す；そしてＭは中胚葉細胞を示す。 図８Ａ〜図８Ｆは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの連続存在下（Ａ１００）での４日間のインキュベーション後の、あるいはアクチビンＡが第一日後に取り除かれる場合（ＮＦ）の４日間のインキュベーション後の、細胞培養物中の中胚葉マーカー遺伝子（Ａ）ＢＲＡＣＨ、（Ｂ）ＦＯＸＦ１、（Ｃ）ＦＬＫ１、（Ｄ）ＢＭＰ４、（Ｅ）ＭＯＸ１及び（Ｆ）ＳＤＦ１の発現を示す棒グラフである。Ｑ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。 図９Ａ〜図９Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの連続存在下（Ａ１００）での４日間のインキュベーション後の、あるいはアクチビンＡが第一日後に取り除かれる場合（ＮＦ）の４日間のインキュベーション後の、細胞培養物中の胚体内胚葉マーカー遺伝子（Ａ）ＧＳＣ、（Ｂ）ＳＯＸ１７、及び（Ｃ）ＦＯＸＡ２の発現を示す棒グラフである。Ｑ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。 図１０−１は、胚体内胚葉細胞の同定及び／又は検出に有用な或る特定のマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。０．５％、２％又は１０％の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有するか（Ａ１００）又はアクチビンＡを含有しない（ＮＦ）５日齢細胞培養物から、Ｑ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。 図１０−２は、胚体内胚葉細胞の同定及び／又は検出に有用な或る特定のマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。０．５％、２％又は１０％の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有するか（Ａ１００）又はアクチビンＡを含有しない（ＮＦ）５日齢細胞培養物から、Ｑ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、４日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下で分化させた細胞培養物中の胚体内胚葉細胞マーカー（Ａ）ＳＯＸ１７及び（Ｂ）ＦＯＸＡ２のｍＲＮＡ発現パターンを示す棒グラフである。アクチビンＡの添加後０、６、２４、３０、４８及び９６時間目の分化の経過中のＱ−ＰＣＲにより、マーカー発現を測定した。 図１２Ａ〜図１２Ｄは、免疫無防備状態マウスの腎被膜下に移植された胚体内胚葉細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化を示す。パネルＡ − 腸管様構造を示すヘマトキシリン−エオシン染色；Ｂ − 肝細胞特異的抗原に対する抗体免疫反応性（肝臓）；Ｃ − ビリンに対する抗体免疫反応性（腸）；並びにＤ − ＣＤＸ２に対する抗体免疫反応性（腸）。
［詳細な説明］
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後２〜３週間で起こる。原腸形成は、３つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である（Lu et al., 2001；Schoenwolf and Smith, 2000）
。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及びその他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される（Grapin-Botton and Melton, 2000；Kimelman and Griffin, 2000；Tremblay et al., 2000；Wells and Melton,
1999；Wells and Melton, 2000）。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼
ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質である。
原腸形成中、胚体内胚葉形成のプロセスは、中内胚葉細胞（中胚葉又は内胚葉を形成するための細胞構成成分）が原始線条と呼ばれる構造を介して移動する細胞移動事象で開始する。中内胚葉細胞は原始線条を介して入る場合、それらは上皮−間充織転換（ＥＭＴ）を受けて、中胚葉又は胚体内胚葉になる。胚体内胚葉は、線条の前部分を通して、そして結節（線条の最前領域での特殊化構造）を通して移動する細胞に由来する。移動が起こると、胚体内胚葉はまず最前腸管に存在し、そして腸管の後端の形成に伴って完結する。
原始線条前駆体細胞（前原始線条細胞）及び原始線条細胞（中内胚葉細胞）はともに、中胚葉及び胚体内胚葉細胞を生じる初期前駆体である。実際、前原始線条細胞及び中内胚葉細胞は、多分化能から、中胚葉系統及び胚体内胚葉系統から作られる最終分化細胞、組織及び／又は器官への発達プロセスにおける最初期前駆体であり得る。今日まで、ヒト前原始線条細胞中に富化された細胞集団も、ヒト中内胚葉細胞中に富化された細胞集団も得られていない。さらに、このような細胞集団の細胞はこれまで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴づ
けされていない。
上記を考慮して、本明細書中に記載される本発明のいくつかの実施形態は、ヒト前原始線条細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団、並びにヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団に関する。このような実施形態では、前原始線条細胞及び中内胚葉細胞は、中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞に、並びにこれらの系統に由来する細胞、組織及び／又は器官にさらに分化し得る。
本発明のその他の実施形態は、ヒト前原始線条細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団を産生する方法、並びにヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団を産生する方法に関する。
本明細書中に記載されるさらに他の実施形態は、前原始線条細胞又は中内胚葉細胞を含む細胞集団中の細胞を分化するのに有用である1つ又は複数の分化因子を同定するスクリー
ニング方法に関する。このような因子は、中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞、並びにこれらの細胞系統のいずれかに由来する細胞、組織及び／又は器官へのこれらの細胞型の分化を促進するのに有用である。
本発明の或る特定のいくつかの他の態様は、或る特定のいくつかの初期細胞マーカーの発現を増大する方法に関する。さらなる態様は、分化の経過中に或る特定のいくつかのマーカーを発現する細胞を含む細胞組成物に関する。
定義
本出願全体を通して用いられるような或る特定のいくつかの用語及び語句は、以下のように提示される意味を有する：
本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合子で開始し、発達配偶子細胞以外の多能性又は全能性細胞をもはや含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発達段階を指す。配偶子融合により得られる胚に加えて、「胚性」という用語は、体細胞核移植により得られる胚を指す。
本明細書中で用いる場合、「多分化能」又は「多分化能細胞」は、限られた数の他の特定細胞型を生じ得る細胞型を指す。
本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、並びに材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の測定は、発現されるマーカーの相対量又は絶対量の検出、あるいは単にマーカーの存在又は非存在の検出を指す。
本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写体、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は小分子（例えば１０，０００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して用いられる場合、「部分」という用語は、単細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲である任意の非ゼロの量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という語句は、細胞培養物又は細胞集団を含有しない特殊化細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在する、ということを意味する。
細胞培地に関して、本明細書中で用いる場合、「低血清ＲＰＭＩ」は低血清含有培地を指し、この場合、血清濃度は限定時間中に漸次増大される。例えば一実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、細胞成長の第１日目に約０．２％の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、細胞成長の第２日目に約０．５％のＦＢＳ、そして細胞成長の第３〜第５日目に約２％のＦＢＳを含む。別の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１日目に約０％、２日目に約０．２％、そして３日目及びその後に約２％の濃度を含む。
本明細書中で用いる場合、「血清代替物」とは、ＩＧＦ又はインスリンを含む血清代替物を指す。
胚体内胚葉細胞へのｈＥＳＣの分化における初期事象のモデル
図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の初期移行を要約するモデル
を示す。原腸形成を厳密に発達反復するプロセスを通してのｈＥＳＣの分化は、低血清補充の状況での高用量アクチビンＡの適用により編成され得る。ＦＧＦ８の発現及びβ−カテニンの核局在化（原始線条形成前の近位の原外胚葉原に起こる事象である）は、約２４時間前に明らかである（前原始線条細胞）。原始線条発現遺伝子（ブラキュリ及びＦＧＦ４）の高レベルの発現は、約２４時間で起こる。高用量のアクチビンＡ中に保持される場合、原始線条細胞（中内胚葉細胞）は胚体内胚葉に効率的に転換される。逆に、アクチビンの非存在下では、これらの中内胚葉前駆体は中胚葉になる。ＢＭＰ４及びＳＵ５４０２によるｈＥＳＣの処理は、原始内胚葉及び栄養外胚葉に関連した遺伝子発現を誘導する。
前原始線条細胞及び中内胚葉細胞及びそれに関連したプロセス
本明細書中に記載される実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞を前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞に分化させることによる培養物中での前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の産生のための新規の限定プロセスに関する。上記のように、前原始線条細胞は、中内胚葉細胞に、並びにそれに由来する細胞、組織及び／又は器官に分化し得る。中内胚葉細胞は、中胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞、並びにこれらの系統のいずれかに由来する細胞、組織及び／又は器官に分化し得る。いくつかの実施形態では、前原始線条細胞は、内胚葉系中胚葉中間体を介して、中胚葉又は胚体内胚葉系統のいずれかの最終分化細胞に転換される。以下でさらに詳細に記載されるように、このようなプロセスは、種々のヒト内胚葉及び中胚葉由来組織の効率的産生のための基礎を提供し得る。例えばこのよう
なプロセスは、ヒト内胚葉由来組織、例えば膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の効率的産生のための基礎を提供し得る。重要なことに、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の産生が、機能性インスリン産生β細胞への幹細胞の分化における初期段階である。別の例として、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞分化は、ヒト中胚葉由来組織、例えば血球細胞、心臓血管性組織、骨格組織、並びにその他の構造及び結合組織の効率的産生のための基礎を提供し得る。有用量の上記細胞又は組織型のいずれかを得るために、分化細胞の最終形に到達する前に起こる分化工程の各々に関して高効率性分化が望ましい。前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞への幹細胞の分化は中胚葉及び胚体内胚葉細胞系統の機能的最終分化細胞の産生に向かう極初期段階を表わすため（図１に示すように）、この工程での高効率性分化が特に望ましい。
前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞への多能性細胞の効率的分化の望ましさに鑑みて、本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかの態様は、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞への多能性細胞の約５〜９０％の転換を生じるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法論に関
する。典型的には、このような方法は、限定性及び一時的特定化様式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、分化蛍光マーカー発現に基づいて細胞を類別することにより、集団中の他の細胞からの前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の単離及び／又は精製により達成され得る。したがって、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、前原始線条細胞、並びにこのような細胞を産生し、単離し、及び／又は精製するための方法に関する。他の実施形態は、中内胚葉細胞、並びにこのような細胞を産生し、単離し、及び／又は精製するための方法に関する。
細胞培養物又は細胞集団中の前原始線条細胞の量を測定するためには、培養物中又は集団中の他の細胞からこの細胞型を区別する方法が望ましい。したがって、本明細書中に記載される或る特定のいくつかの実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルが前原始線条細胞に特異的である細胞マーカー、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、測定するための方法に関する。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばＯＣＴ４、ＥＣＡＤ、ＦＧＦ８、β−カテニン、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＬ４、ＭＯＸ１、ＳＤＦ１、並びに本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写体の量が、定量的Ｑ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、免疫組織化学／免疫細胞化学を用いて、或る特定のポリペプチドマーカーの細胞区画局在化、例えばβ−カテニンの核局在化を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的割合を同定すると共に測定するために用いられる。
1つ又は複数の適切なマーカーの発現を測定するための方法、例えば上記の方法を用いる
ことにより、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を同定し、並びに細胞培養物又は細胞集団中の前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の割合を測定することができる。例えば本発明のいくつかの実施形態では、産生される前原始線条細胞又は細胞集団は、ＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンを、非前原始線条細胞型又は細胞集団より約２オーダー大きいレベルで発現する。他の実施形態では、産生される前原始線条細胞又は細胞集団は、ＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンを、非前原始線条細胞型又は細胞集団より２オーダー以上大きいレベルで発現する。本発明の他の実施形態では、産生される中内胚葉細胞又は細胞集団は、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マ
ーカーを、非中内胚葉細胞型又は細胞集団より約２オーダー大きいレベルで発現する。他の実施形態では、産生される中内胚葉細胞又は細胞集団は、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーを、非中内胚葉細胞型又は細胞集団より２オーダー以上大きいレベルで発現する。
本明細書中に記載される実施形態は、前原始線条及び／又は中内胚葉組成物にも関する。例えばいくつかの実施形態は前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を含む細胞培養物に関するが、一方、他の実施形態は、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞中に富化された細胞集団に関する。いくつかの好ましい実施形態は、細胞培養物中の細胞の少なくとも約５〜９０％が前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞である前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を含む細胞培養物に関する。特に好ましい実施形態は、細胞培養物中のヒト細胞の少なくとも約５〜９０％が前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞であるヒト細胞を含む細胞培養物に関する。分化手法の効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。他の好ましい実施形態では、実質的に純粋な前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞集団への多能性細胞集団、例えば幹細胞集団の転換が意図される。
本明細書中に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにこのような細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発達の初期をモデリングするのに有用である。さらに、本明細書中に記載される組成物及び方法は、疾患状態、例えば糖尿病における治療的介入にも役立ち得る。例えば前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞は限定数のみの組織のための供給源として役立つため、それらは純粋組織又は細胞型の発達に用いられ得る。
多能性細胞からの前原始線条細胞の産生
前原始線条細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、出発材料として用いられる多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、前原始線条細胞培養物、及び前原始線条細胞を含む富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。前原始線条細胞を得るための好ましい方法は、前原始線条細胞産生のための出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。このような多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚生殖***から得られるものから生じる細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知である方法を用いて、実質的分化を伴わない多能性状態で培養物中に保持され得る。このような方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号に記載されている（これらの開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）。
前原始線条細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に保持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に保持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（米国特許出願第２００２／００７２１１７号（この開示内容は各々、参照により本明細書中に完全に援用される）参照）。前原始線条細胞を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの保持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの保持
方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）に記載されている。
本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に保持され得る。いくつかの胚性幹細胞保持手法では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）に記載される技法が用いられる。
幹細胞は、前原始線条細胞に分化されることが所望されるまで、ルーチン継代により多能性状態で培養物中に保持される。いくつかのプロセスでは、前原始線条細胞への分化は、前原始線条細胞への分化を促進するのに十分な量で、分化因子、例えばＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物に提供することにより達成される。前原始線条細胞の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビンサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢから成る群から選択される。或る特定の分化プロセスでは、成長因子アクチビンＡが用いられる。
前原始線条細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、前原始線条細胞への幹細胞の少なくとも一部の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するように、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
前原始線条細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約９時間以内、約１０時間以内、約１１時間以内、約１２時間以内、約１３時間以内、約１４時間以内、約１５時間以内、約１６時間以内、約１７時間以内、約１８時間以内、約１９時間以内、約２０時間以内、約２１時間以内、約２２時間以内、約２３時間以内、約２４時間以内、約２４時間より長い時間以内に除去され得る。
前原始線条細胞の培養物は、低血清又は無血清を含有する培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満又は約１０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、前原始線条細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いずに増殖される。さらに他のプロセスでは、前原始線条細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
前原始線条細胞への多能性細胞の分化のモニタリング
前原始線条細胞へのｈＥＳＣ培養の進行は、前原始線条細胞に特徴的なマーカーの一過性発現を測定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより決定される。あるいは或る特定のマーカーの発現は、分化因子の添加後の1つ又は複数の時点でマーカーが細
胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより決定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知である他の方法は、マーカー遺伝子発現を定量するためにも用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、前原始線条細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が決定される。さらに他のプロセスでは、分化因子の添加後の1つ又は複数の
時点での前原始線条細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現の時機及び量が測定される。
以下の実施例でさらに記載されるように、前原始線条細胞のマーカーは、ＦＧＦ８及びβ−カテニンである。このようなものとして、本明細書中に記載されるプロセスにより産生される前原始線条細胞はＦＧＦ８及びβ−カテニンマーカー遺伝子を発現し、それによりＦＧＦ８及びβ−カテニンマーカー遺伝子産物を産生する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ８ ｍＲＮＡは、前原始線条細胞中で実質的に発現されるが、しかしｈＥＳＣ中では
発現されない。ほぼピークレベルへのＦＧＦ８ ｍＲＮＡの実質的なアップレギュレート
は、ｈＥＳＣを適切な分化因子、例えばアクチビンＡと接触させた後６時間までに分化中ｈＥＳＣ培養物中で観察され得る。この時点で、他の細胞型、例えば中内胚葉細胞、原始内胚葉、胚体内胚葉細胞、中胚葉及び外胚葉を示すマーカーの発現（表１参照）は、依然として比較的低い。いくつかの実施形態では、中内胚葉細胞、原始内胚葉、胚体内胚葉細胞、中胚葉及び外胚葉を示すマーカーは、ｈＥＳＣを分化因子と接触させた後、６時間までに実質的に発現されない。ＦＧＦ８ ｍＲＮＡ発現は、ｈＥＳＣを分化因子と接触させ
た後、少なくとも約２４時間高レベルで保持されるが、しかしその後、減少し始める。さらに、ｈＥＳＣを適切な分化因子、例えばアクチビンＡと接触させた後約１７時間までに、β−カテニンポリペプチドの核局在化（核局在化β−カテニンの発現）が、免疫細胞化学により観察される。ｈＥＳＣ中では、β−カテニンポリペプチドは細胞周辺に存在するが、しかし核中には存在しない。
ＦＧＦ８及び核局在化β−カテニン発現は、分化条件に応じて、前原始線条細胞における一連の異なるレベルにわたって誘導される、と理解される。このようなものとして、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、前原始線条細胞又は細胞集団中でのＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンマーカーの発現は、ｈＥＳＣからの分化の最初のおよそ６〜１８時間の間、非前原始線条細胞又は細胞集団中でのこれらのマーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍である。他の実施形態では、前原始線条細胞又は細胞集団中でのＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンマーカーの発現は、ｈＥＳＣからの分化の最初のおよそ６〜１８時間の間、非前原始線条細胞又は細胞集団中でのＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンマーカーの発現より少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１０，０００倍高い。いくつかの実施形態では、前原始線条細胞又は細胞集団中でのＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カ
テニンマーカーの発現は、ｈＥＳＣからの分化の最初のおよそ６〜１８時間の間、非前原始線条細胞又は細胞集団中でのＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンマーカーの発現より非常に高い。
さらに、前原始線条細胞中でのＦＧＦ８マーカーの発現レベルと、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルとの間に一連の差が存在する、と理解される。同様に、前原始線条細胞中での核局在化β−カテニンマーカーの発現レベルと、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルとの間に一連の差が存在する。このようなものとして、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンマーカーの発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルより少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、ＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化β−カテニンマーカーの発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルより少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１０，０００倍高い。いくつかの実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーは、前原始線条細胞中で有意に発現されない。
前原始線条細胞の富化、単離及び／又は精製
本明細書中に記載されるプロセスのさらなる態様に関しては、前原始線条細胞は富化され、単離され、且つ／又は精製され得る。いくつかの実施形態では、このような細胞を細胞培養物から単離することにより、前原始線条細胞に関して富化された細胞集団が産生される。
本明細書中に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、前原始線条細胞は蛍光標識され、次に蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いることにより非標識細胞から単離される。このような実施形態では、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸、又は発現可能蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を用いて、前原始線条細胞を標識する。例えばいくつかの実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片の少なくとも１つのコピーは、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的活性断片の発現がＦＧＦ８プロモーターの制御下にあるように、ＦＧＦ８プロモーターの下流で、多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ８をコードする核酸の全コード領域は、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片により置き換えられる。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片は、フレーム内で、ＦＧＦ８をコードする核酸の少なくとも一部分と融合され、それにより融合タンパク質を生成する。このような実施形態では、融合タンパク質は、ＧＦＰと類似の蛍光活性を保持する。
蛍光標識される細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように前原始線条細胞に分化される。前原始線条細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現するが、非前原始線条細胞は発現しないため、これら２つの細胞型が分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識前原始線条細胞及び非標識非前原始線条細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて選別される。前原始線条細胞は、非前原始線条細胞と別個に収集され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物はさらに、前原始線条細胞に特異
的である同一の又は異なるマーカーを用いて、さらに数回選別することによりさらに精製され得る。
直前で記載された手法に加え、前原始線条細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに前原始線条細胞は、前原始線条細胞の選択的生存又は選択的拡大を促す増殖条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。
上記の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階で、このような培養物とともに用いられ得る、と理解される。
本明細書中に記載される方法を用いて、前原始線条細胞及び／又は組織の富化、単離及び／又は精製集団が、約１時間〜約２４時間の間分化を受けたｈＥＳＣ培養物又は細胞集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの実施形態では、細胞は無作為分化を受
ける。しかしながら好ましい実施形態では、細胞は主として前原始線条細胞に分化するように指示される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの前原始線条細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。
本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約１０００倍、前原始線条細胞内容物を富化され得る。いくつかの実施形態では、前原始線条細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５倍〜約５００倍、富化され得る。他の実施形態では、前原始線条細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０倍〜約２００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、前原始線条細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０倍〜約１００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、前原始線条細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０倍〜約８０倍、富化され得る。或る特定のいくつかの実施形態では、前原始線条細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約２０倍、富化され得る。
前原始線条細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、前原始線条細胞を含む細胞培養物、並びに前原始線条細胞を富化された細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約５〜９０％が前原始線条細胞である前原始線条細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、前原始線条細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。前原始線条細胞の単離が用いられるプロセスでは、実質的に純粋な前原始線条細胞集団が回収され得る。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞と、前原始線条細胞の両方を含む細胞集団及び細胞培養物のような組成物に関する。例えば本明細書中に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び前原始線条細胞の混合物を含む組成物が産生され得る。いくつかの実施形態では、約９５個の多能性細胞につき少なくとも約５個の前原始線条細胞を含む組成物が産生される。他の実施形態では、約５個毎の多能性細胞に関して少なくとも約９５個の前原始線条細胞を含む組成物が産生される。さらに、他の割合の前原始線条細胞対多能性細胞を含む組成物が意図される。例えば約１，０００，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約１００，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約１０，０００個毎の多能性細胞
に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約１０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約５００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約１００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約１０個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約５個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約２個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約２個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約５個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約２０個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約５０個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１００個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０００個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０，０００個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１００，０００個の前原始線条細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１，０００，０００個の前原始線条細胞を含む組成物が意図される。いくつかの実施形態では、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定のいくつかの実施形態では、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖***に由来する。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発達した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、少なくとも約５％の前原始線条細胞〜少なくとも約９９％の前原始線条細胞から成る細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えば或る特定の特定の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９９％が前原始線条細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は９９％より多くが前原始線条細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト前原始線条細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化βカテニンマーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現より多い。他の実施形態では、ＦＧＦ８マーカー及び／又は核局在化βカテニンマーカーの発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、少なくとも約９８％のヒト細胞では、少なくとも約９９％のヒト細胞では、又は９９％より多くのヒト細胞では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現より多い。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダ
ー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒトｈＥＳＣ及びヒト前原始線条細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ＦＧＦ８ ｍＲＮＡの
発現の実質的なアップレギュレートは、培養中のｈＥＳＣを適切な分化因子、例えばアクチビンＡと接触させた後、約１時間までに、約２時間までに、約３時間までに、約４時間までに、約５時間までに、約６時間までに、約７時間までに、約８時間までに、約９時間までに、約１０時間までに、約１１時間までに、約１２時間までに、約１３時間までに、約１４時間までに、約１５時間までに、約１６時間までに、約１７時間までに、約１８時間までに、約１９時間までに、約２０時間までに、約２１時間までに、約２２時間までに、約２３時間までに、約２４時間までに、又は２４時間より長い時間までに、細胞培養物又は細胞集団の細胞中で起こる。このような実施形態では、ＦＧＦ８ ｍＲＮＡの発現の
実質的なアップレギュレートは、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、ヒト細胞の少なくとも約９８％で、ヒト細胞の少なくとも約９９％で、又はヒト細胞の９９％より多くで起こる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒトｈＥＳＣ及びヒト前原始線条細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、β−カテニンポリペプチドの実質的核局在化（核局在化β−カテニンマーカーの発現）は、培養中のｈＥＳＣを適切な分化因子、例えばアクチビンＡと接触させた後、約１時間までに、約２時間までに、約３時間までに、約４時間までに、約５時間までに、約６時間までに、約７時間までに、約８時間までに、約９時間までに、約１０時間までに、約１１時間までに、約１２時間までに、約１３時間までに、約１４時間までに、約１５時間までに、約１６時間までに、約１７時間までに、約１８時間までに、約１９時間までに、約２０時間までに、約２１時間までに、約２２時間までに、約２３時間までに、約２４時間までに、又は２４時間より長い時間までに、細胞培養物又は細胞集団の細胞中で起こる。このような実施形態では、核局在化β−カテニンの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、ヒト細胞の少なくとも約９８％で、ヒト細胞の少なくとも約９９％で、又はヒト細胞の９９％より多くで起こる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載される方法を用いて、他の細胞型を実質的に含有しない前原始線条細胞
を含む組成物が産生され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される前原始線条細胞集団又は細胞培養物は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた前原始線条細胞の説明は、ＦＧＦ８高、核局在化β−カテニン高、ブラキュリ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ１低、ＳＯＸ１７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低及びＳＯＸ１低である。
多能性細胞からの中内胚葉細胞の産生
中内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、出発材料として用いられる多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、中内胚葉細胞培養物並びに中内胚葉細胞を含む富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。中内胚葉細胞を得るための好ましい方法は、中内胚葉細胞産生のための出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。このような多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚生殖***から得られるものから生じる細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知である方法を用いて、実質的分化を伴わない多能性状態で培養物中に保持され得る。このような方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号に記載されている（これらの開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）。
中内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に保持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に保持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（米国特許出願第２００２／００７２１１７号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）参照）。中内胚葉細胞を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの保持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの保持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）に記載されている。
本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に保持され得る。いくつかの胚性幹細胞保持手法では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）に記載される技法が用いられる。
幹細胞は、中内胚葉細胞に分化されることが所望されるまで、ルーチン継代により多能性状態で培養物中に保持される。いくつかのプロセスでは、中内胚葉細胞への分化は、中内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量で、分化因子、例えばＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物に提供することにより達成される。中内胚葉細胞の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビンサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢから成る群から選択される。或る特定の分化プロセスでは、成長因子アクチビンＡが用いられる。
中内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、中内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するよう、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／
ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
中内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、約１８時間以内、約１９時間以内、約２０時間以内、約２１時間以内、約２２時間以内、約２３時間以内、約２４時間以内、約２５時間以内、約２６時間以内、約２７時間以内、約２８時間以内、約２９時間以内、約３０時間以内、約３１時間以内、約３２時間以内、約３３時間以内、約３４時間以内、約３５時間以内、約３６時間以内、約３７時間以内、約３８時間以内、約３９時間以内、約４０時間以内、約４１時間以内、約４２時間以内、約４３時間以内、約４４時間以内、約４５時間以内、約４６時間以内、約４７時間以内、約４８時間以内、又は約４８時間より長い時間以内に除去され得る。
中内胚葉細胞の培養は、低血清を含有するか又は血清を含有しない培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満又は約１０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、中内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いずに増殖される。さらに他のプロセスでは、中内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
中内胚葉細胞への多能性細胞の分化のモニタリング
中内胚葉細胞へのｈＥＳＣ培養の進行は、中内胚葉細胞に特徴的なマーカーの一過性発現を決定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより決定される。あるいは或る特定のマーカーの発現は、分化因子の添加後の1つ又は複数の時点でマーカーが細胞培
養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより決定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、Ｑ−ＰＣＲの使用による。当該技術分野で既知である他の方法は、マーカー遺伝子発現を定量するためにも用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、中内胚葉細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が決定される。さらに他のプロセスでは、分化因子の添加後の1つ又は複数の時点での中
内胚葉細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現の時機及び量の双方が測定される。
以下の実施例でさらに記載されるように、中内胚葉細胞のマーカーは、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１である。このようなものとして、本明細書中に記載されるプロセスにより産生される中内胚葉細胞は、ブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１マーカー遺伝子を発現し、それによりブラキュリ、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１マーカー遺伝子産物を産生する
。いくつかの実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡは中
内胚葉細胞中で実質的に発現されるが、しかしｈＥＳＣ中では発現されない。ほぼピークレベルへのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの実質的なアップレギ
ュレートは、ｈＥＳＣを適切な分化因子、例えばアクチビンＡと接触させた後２４時間までに分化中ｈＥＳＣ培養物中で観察され得る。この時点で、他の細胞型、例えば原始内胚葉、胚体内胚葉細胞、中胚葉及び外胚葉を示す或る特定のマーカーの発現（表１参照）は、依然として比較的低い。いくつかの実施形態では、原始内胚葉、胚体内胚葉細胞、中胚葉及び外胚葉を示す或る特定のマーカーは、ｈＥＳＣを分化因子と接触させた後、２４時間までに実質的に発現されない。いくつかの実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡ発現は、ｈＥＳＣを分化因子と接触させた後、約２４時間後に
減少し始める。いくつかの実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡ発現は、ｈＥＳＣを分化因子と接触させた後、約３０時間後、約３６時間後、約４２時間後、約４８時間後又は約４８時間より長い時間の後に減少し始める。
ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１発現は、分化条件によって、中内胚葉細胞における一連の異なるレベルにわたって誘導される、と理解される。このようなものとして、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、中内胚葉細胞又は細胞集団中でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、ｈＥＳＣからの分化の約２４時間、非中内胚葉細胞又は細胞集団中でのこれらのマーカーの発現より少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、中内胚葉細胞又は細胞集団中でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、ｈＥＳＣからの分化の約２４時間後、非中内胚葉細胞又は細胞集団中でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現より少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１０，０００倍高い。いくつかの実施形態では、中内胚葉細胞又は細胞集団中でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、ｈＥＳＣからの分化の約２４時間後、非中内胚葉細胞又は細胞集団中でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現より非常に高い。
さらに、中内胚葉細胞中でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルとの間に一連の差が存在する、と理解される。このようなものとして、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルより少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現レベルより少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１０，０００倍高い。いくつかの実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーは、中内胚葉細胞中で有意に発現されない。
中内胚葉細胞の富化、単離及び／又は精製
本明細書中に記載されるプロセスのさらなる態様に関しては、中内胚葉細胞は富化され、単離され且つ／又は精製され得る。いくつかの実施形態では、このような細胞を細胞培養物から単離することにより、中内胚葉細胞に関して富化された細胞集団が産生される。
本明細書中に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、中内胚葉細胞は蛍光標識され、次にＦＡＣＳを用いることにより非標識細胞から単離される。このような実施形態では、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸、又は発現可能蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を用いて、中内胚葉細胞を標識する。例えばいくつかの実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片の少なくとも１つのコピーは、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的活性断片の発現がブラキュリ、ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１プロモーターの制御下にあるよう、ブラキュリ、ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１プロモーターの下流で、多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１をコードする核酸の全コード領域は、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片により置き換えられる。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片は、フレーム内で、ブラキュリ、ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１をコードする核酸の少なくとも一部分と融合され、それにより融合タンパク質を生成する。このような実施形態では、融合タンパク質は、ＧＦＰと類似の蛍光活性を保持する。
蛍光標識される細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように中内胚葉細胞に分化される。中内胚葉細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現する一方、非中内胚葉細胞は発現しないため、これら２つの細胞型が分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識中内胚葉細胞及び非標識非中内胚葉細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて選別される。中内胚葉細胞は、非中内胚葉細胞と別個に収集され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物はさらに、中内胚葉細胞に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いて、さらに数回選別することにより精製され得る。
直前で記載された手法のほかに、中内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに中内胚葉細胞は、中内胚葉細胞の選択的生存又は選択的拡大を促す増殖条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。
上記の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階で、このような培養物とともに用いられ得る、と理解される。
本明細書中に記載される方法を用いて、中内胚葉細胞及び／又は組織の富化、単離及び／又は精製集団が、約１８時間〜約４８時間の間分化を受けたｈＥＳＣ培養物又は細胞集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの実施形態では、細胞は無作為分化を受
ける。しかしながら好ましい実施形態では、細胞は主として中内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの中内胚葉細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。
本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約１０００倍、中内胚葉細胞内容物を富化され得る。いくつかの実施形態では、中内胚葉細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５倍〜約５００倍、富化され得る。他の実施形態では、中内胚葉細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０倍〜約２００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、中内胚葉細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０倍〜約１００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、中内胚葉細胞は、未処理又は未富化細胞集
団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０倍〜約８０倍、富化され得る。或る特定のいくつかの実施形態では、中内胚葉細胞は、未処理又は未富化細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約２０倍、富化され得る。
中内胚葉細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、中内胚葉細胞を含む細胞培養物、並びに中内胚葉細胞を富化された細胞集団が挙げられる。例えば、培養中の細胞の少なくとも約５〜９０％が中内胚葉細胞である中内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、中内胚葉細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。中内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、実質的に純粋な中内胚葉細胞集団が回収され得る。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞と、中内胚葉細胞の両方を含む細胞集団及び細胞培養物のような組成物に関する。例えば本明細書中に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び中内胚葉細胞の混合物を含む組成物が産生され得る。いくつかの実施形態では、約９５個の多能性細胞につき少なくとも約５個の中内胚葉細胞を含む組成物が産生される。他の実施形態では、約５個毎の多能性細胞につき少なくとも約９５個の中内胚葉細胞を含む組成物が産生される。さらに、他の割合の中内胚葉細胞対多能性細胞を含む組成物が意図される。例えば約１，０００，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約１００，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約１０，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約１０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約５００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約１００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約１０個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約５個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約２個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約２個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約５個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約２０個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約５０個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１００個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０００個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０，０００個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１００，０００個の中内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１，０００，０００個の中内胚葉細胞を含む組成物が意図される。いくつかの実施形態では、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定のいくつかの実施形態では、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖***に由来する。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発達した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、少なくとも約５％の中内胚葉細胞〜少なくとも約９９％の中内胚葉細胞から成る細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えば或る特定の特定の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９９％が中内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少
なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は９９％より多くが中内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現より多い。他の実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１マーカーの発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、少なくとも約９８％のヒト細胞では、少なくとも約９９％のヒト細胞では、又は９９％より多くのヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカーの発現より多い。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒトｈＥＳＣ及びヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現の実質的なアップレギュレートは、培養中のｈＥＳ
Ｃを適切な分化因子、例えばアクチビンＡと接触させた後、約１８時間までに、約１９時間までに、約２０時間までに、約２１時間までに、約２２時間までに、約２３時間までに、約２４時間までに、約２５時間までに、約２６時間までに、約２７時間までに、約２８時間までに、約２９時間までに、約３０時間までに、約３１時間までに、約３２時間までに、約３３時間までに、約３４時間までに、約３５時間までに、約３６時間までに、約３７時間までに、約３８時間までに、約３９時間までに、約４０時間までに、約４１時間までに、約４２時間までに、約４３時間までに、約４４時間までに、約４５時間までに、約４６時間までに、約４７時間までに、約４８時間までに、又は４８時間より長い時間までに、細胞培養物又は細胞集団の細胞中で起こる。このような実施形態では、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現の実質的なアップレギュレートは、ヒト
細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、ヒト細胞の少なくとも約９８％で、ヒト細胞の少なくとも約９９％で、又はヒト細胞の９９％より多くで起こる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物
又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載される方法を用いて、他の細胞型を実質的に含有しない中内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される中内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ７及び／又はＳＯＸ１マーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた中内胚葉細胞の説明は、ブラキュリ高、ＦＧＦ４高、ＳＮＡＩ１高、ＳＯＸ１７低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低及びＳＯＸ１低である。
胚体内胚葉細胞の産生
胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化細胞集団を産生するよう多能性細胞を分化させるためのプロセスは、以下で簡単に、そして２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許第１１／０２１，６１８号（この開示内
容は参照により本明細書中に完全に援用される）で詳細に記載される。これらのプロセスのうちのいくつかでは、出発材料として用いられる多能性細胞は幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞培養物及び胚体内胚葉細胞を含む富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。胚体内胚葉細胞を得るための好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発物質としてヒト胚性幹細胞を利用する。このような多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚生殖***から得られるものから生じる細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知である方法を用いて、実質的分化を伴わない多能性状態で培養物中に保持され得る。このような方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号に記載されている（これらの開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）。
胚体内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に保持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に保持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（米国特許出願第２００２／００７２１１７号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）参照）。胚体内胚葉を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの保持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの保持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）に記載されている。
本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に保持され得る。いくつかの胚性幹細胞保持手法では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（この開示内容は参照により本明細書中に完全に援用される）に記載される技法が用いられる。
幹細胞は、胚体内胚葉に分化されることが所望されるまで、ルーチン継代により多能性状態で培養物中に保持される。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量で、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物に提供することにより達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビンサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ
から成る群から選択される。或る特定の分化プロセスでは、上記の成長因子のいずれかの組合せが用いられる。
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、胚体内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するよう、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、それらの添加後約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内、又は約１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、成長因子は、それらの添加の４日後に除去される。
胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清を含有する又は血清を含有しない培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０．０５％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いずに増殖される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉は、血清代替物を用いて増殖される。さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲であり得る。
胚体内胚葉細胞への多能性細胞の分化のモニタリング
胚体内胚葉細胞へのｈＥＳＣ培養の進行は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーの発現を決定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより決定される。あるいは或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより決定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、Ｑ−ＰＣＲの使用による。当該技術分野で既知である他の方法は、マーカー遺伝子発現を定量するためにも用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が決定される。
以下の実施例でさらに記載されるように、胚体内胚葉の信頼できるマーカーはＳＯＸ１７遺伝子である。このようなものとして、本明細書中に記載されるプロセスにより産生され
る胚体内胚葉細胞はＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現し、それによりＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１である。胚体内胚葉細胞はＳＯＸ１７マーカー遺伝子を、原始及び臓側内胚葉に特徴的であるＳＯＸ７マーカー遺伝子より高いレベルで発現するため、いくつかのプロセスでは、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、ｈＥＳＣに特徴的であるＳＯＸ１７マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞はＳＯＸ１７マーカー遺伝子を、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルで発現するため、これらの遺伝子の発現もモニタリングされる。
胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、そのリガンドが化学誘導物質ＳＤＦ−１である細胞表面ケモカイン受容体をコードする。成体におけるＣＸＣＲ４受容体保有細胞の主な役割は、骨髄への造血細胞の移動、リンパ球輸送、並びに種々のＢ細胞及びマクロファージ血球系統の分化であると考えられる［Kim, C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］。ＣＸＣＲ４受容体は、Ｔ細胞中へのＨＩＶ−１の進入のための補助受容体としても機能する［Feng, Y., et al. Science, 272, 872-877 (1996)］。[McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]により実行された一連の広範な研究において、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びその独特のリガンドＳＤＦ−１の発現［Kim, C., and Broxmyer, H.，J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］は、マウスの初期発達及び成体生涯中で概説された。発達におけるＣＸＣ
Ｒ４／ＳＤＦ１相互作用は、どちらかの遺伝子がトランスジェニックマウスにおいて破壊された場合には［Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996)］；Ma, Q., et al Immunity, 10, 463-471 (1999)］後期胚致死性を生じる、ということが実証された場合、明
らかになった。ＲＮアーゼ保護及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法の組み合
わせを用いて、ＣＸＣＲ４は、初期原腸形成胚（Ｅ７．５）中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡである、ということをMcGrath等は実証した。原腸
形成胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞の移動誘導に主に関与すると思われ、そしてこの時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。Ｅ７．２〜７．８マウス胚では、ＣＸＣＲ４及びα−フェトタンパク質は互いに排他的であり、これは、臓側内胚葉での発現の欠如を示す［（McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］。
多能性細胞を分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞はＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、ＣＸＣＲ４の発現は、胚体内胚葉細胞の産生を追跡するためにモニタリングされ得る。さらに、本明細書中に記載される方法により産生される胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉の他のマーカー、例えばＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１（これらに限定されない）を発現する。胚体内胚葉細胞はＣＸＣＲ４マーカー遺伝子をＳＯＸ７マーカー遺伝子より高いレベルで発現するため、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされ得る。他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞はＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルで発現するため、これらの遺伝子の発現もモニタリングされ得る。
内胚葉細胞中のＣＸＣＲ４の発現はＳＯＸ１７の発現を妨げない、と理解される。このようなものとして、本明細書中に記載されるプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４を実質的に発現するが、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ又はＰＤＸ１を実質的に発現しない。
胚体内胚葉細胞の富化、単離及び／又は精製
上記のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、このような細胞に特異的であるアフィニティー・タグを用いることにより、富化され、単離され且つ／又は精製され得る。胚体内胚葉細胞に特異的なアフィニティー・タグの例は、抗体、リガンド、あるいは胚体内胚葉細胞の細胞表面に存在するが、しかし本明細書中に記載される方法により産生される細胞培養物中に見出される他の細胞型上には実質的に存在しないポリペプチド等のマーカー分子に特異的なその他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、ＣＸＣＲ４と結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製のためのアフィニティー・タグとして用いられる。他のプロセスでは、ケモカインＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１を基礎にしたその他の分子もアフィニティー・タグとして用いられ得る。このような分子としては、ＳＤＦ−１断片、ＳＤＦ−１融合体、又はＳＤＦ−１模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体を製造する方法並びに細胞単離のためにそれらを使用する方法は当該技術分野で既知であり、そしてこのような方法は、本明細書中に記載される抗体及び胚体内胚葉細胞とともに用いるために意図され得る。一プロセスでは、ＣＸＣＲ４と結合する抗体は、磁気ビーズに取り付けられ、次に、細胞内及び基質接着を低減するよう酵素処理された細胞培養物中で胚体内胚葉細胞と結合させられる。細胞／抗体／ビーズ複合体は次に、ビーズ結合胚体内胚葉細胞を非結合細胞と分離するために用いられる可動性磁場にさらされる。一旦胚体内胚葉細胞が培養中の他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合が破壊され、細胞は適切な組織培地中に再プレート化される。
富化、単離又は精製胚体内胚葉細胞培養物又は集団を得るためのさらなる方法も用いられ得る。例えばいくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４抗体は、細胞内及び基質接着を低減するよう処理された胚体内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートされる。次に細胞は洗浄され、遠心分離されて、再懸濁される。次に細胞懸濁液は、一次抗体と結合し得る二次抗体、例えばＦＩＴＣ接合抗体とともにインキュベートされる。細胞は次に、洗浄され、遠心分離され、そして緩衝液中に再懸濁される。次に細胞懸濁液は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて分析され、選別される。ＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＸＣＲ４陰性細胞と別個に収集され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物は、代替的アフィニティーベースの方法を用いることにより、あるいは胚体内胚葉に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いてさらに数回選別することにより、さらに精製され得る。
さらに他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４と結合するリガンド又は他の分子を用いて、胚体内胚葉細胞は富化され、単離され、且つ／又は精製される。いくつかのプロセスでは、分子はＳＤＦ−１あるいはその断片、融合体又は模倣体である。
好ましいプロセスでは、幹細胞培養物が胚体内胚葉系統に向けて分化するよう誘導された後、胚体内胚葉細胞は、他の非胚体内胚葉細胞から富化され、単離され、且つ／又は精製される。上記の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階で、このような培養物とともに用いられ得る、と理解される。
直前で記載された手法のほかに、胚体内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の選択的生存又は選択的拡大を促す増殖条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。
本明細書中に記載される方法を用いて、胚体内胚葉細胞及び／又は組織の富化、単離及び／又は精製集団が、少なくとも何らかの分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの方法では、
細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい方法では、細胞は主として胚体内胚葉に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。本明細書中に記載される
方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約１０００倍、胚体内胚葉細胞内容物を富化され得る。
胚体内胚葉細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉を富化された細胞集団が挙げられる。例えば、細胞培養物又は細胞集団中の細胞の少なくとも約５０〜９９％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、胚体内胚葉への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は約９９％より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
前原始線条及び／又は中内胚葉の分化を促進し得る因子の同定
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも１つの分化因子を同定する方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞、例えばヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を提供される。候補分化因子の提供の前であるか又はほぼ同時である第１の時点で、マーカーの発現が測定される。あるいはマーカーの発現は、候補分化因子の提供後に測定され得る。第１の時点の後であり、候補分化因子を細胞集団に提供する工程の後である第２の時点で、同一マーカーの発現が再び測定される。候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第１の時点でのマーカーの発現を、第２の時点でのマーカーの発現と比較することにより決定される。第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は減少される場合には、候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を含む細胞集団又は細胞培養物を利用する。例えば細胞集団は、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の実質的に純粋な集団であり得る。あるいは細胞集団は、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の富化集団であって、この場合、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９％以上が、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞である。本明細書中に記載される他の実施形態では、細胞集団は、ヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも８５％以上がヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞であるヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非ヒト細胞、例えば非ヒトフィーダー細胞を含む。他の実施形態では、細胞集
団は、ヒトフィーダー細胞を含む。このような実施形態では、上記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９５％以上がヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞である。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の実施形態では、細胞集団は、候補（試験）分化因子と接触されるか、そうでなければそれを提供される。候補分化因子は、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の分化を促進する能力を有し得る任意の分子を含み得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の
型の細胞に関する分化因子であることが知られている分子を含む。代替的な実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、小分子を含む。好ましい実施形態では、小分子は、約１０，０００ａｍｕ以下の分子量を有する分子である。いくつかの実施形態では、小分子はレチノイド、例えばレチノイン酸である。
本明細書中に記載される他の実施形態では、候補分化因子はポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチド、例えば糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキン又は成長因子であり得る（これらに限定されない）。好ましいポリペプチドとしては、成長因子が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、候補分化因子は、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４、ＦＧＦ２及びＷｎｔ３Ｂから成る群から選択される1つ又は複数の成長因子を含む
。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、アンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激剤、ＩＬ−１６、サイモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／アポ−２、プレＢ細胞コロニー強化因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞強化因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質８（骨形成タンパク質２）、骨形態形成タンパク質６、骨形態形成タンパク質７、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症タンパク質１−α）、グリア芽細胞腫(Gliablastoma)細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝細胞腫由来成長因子、ニューロメジンＵ−２５前駆体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ前駆体、胸腺樹状細胞由来因子１、トランスフェリン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ビタミンＤ3、表皮成長因子（
ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞成
長因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ、β神経成長因子、アクチビンＡ、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性（ＢＰＡ）、赤血球系促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ2、インスリン成長因子
−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニュートロフィン成長因子（ＮＧＦ）、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン４／５、毛様体神経栄養因子、グリア由来ネキシン、デキサメタソン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンフォテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレッシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、ヒト甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、性腺刺激ホルモン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン放出抑制因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、上皮小体ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性小腸ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシンチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤ラクトゲン、レラキシン、アンギオテンシンＩＩ、カルシトリオール、心房性ナトリウム利尿ペプチド及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフェリン、アンドロスチエン（androstiene）、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタソン、β−メルカプトエタノ
ール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンフォテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン及びＴＷＳ１１９から成る群から選択される1つ又は複数の成長因子を含む。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の濃度で、細胞集団に提供される。いくつかの実施形態では、候補分化因
子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であるよう、細胞集団に提供される。いくつかの実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約
１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌであるか、又は約１０００μｇ／ｍｌより高い。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の或る特定のいくつかの実施形態では、細胞集団は、前腸分化因子以外の任意の分子を含む候補分化因子を提供される。例えばいくつかの実施形態では、細胞集団は、レチノイド、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーの一成員、ＦＧＦ１０又はＦＧＦ４以外の任意の分子を含む候補分化因子を提供される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、レチノイン酸以外の任意の分子を含む候補分化因子を提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるスクリーニング方法の工程は、第１の時点及び第２の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を測定することを包含する。これらの実施形態のいくつかでは、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に提供する前、又はそれとほぼ同時期であり得る。あるいはいくつかの実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に提供した後である。いくつかの実施形態では、複数のマーカーの発現は、第１の時点で測定される。
第１の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を測定することのほかに、本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、第１の時点の後であり且つ候補分化因子を細胞集団に提供した後である第２の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を測定することを意図する。このような実施形態では、同一マーカーの発現が、第１及び第２の時点の両方で測定される。いくつかの実施形態では、複数のマーカーの発現が、第１及び第２の時点の両方で測定される。そのような実施形態では、同一の複数のマーカーの発現が、第１及び第２の時点の両方で測定される。いくつかの実施形態では、その各々が第１の時点の後であり、且つその各々が候補分化因子を細胞集団に提供した後である複数の時点で、マーカー発現が測定される。或る特定のいくつかの実施形態では、マーカー発現はＱ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態では、マーカー発現は免疫細胞化学により測定される。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の或る特定のいくつかの実施形態では、その発現が第１及び第２の時点で測定されるマーカーは、腸管由来である組織及び／又は器官を作り上げる細胞の前駆体である細胞へのヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞の分化に関連するマーカーである。いくつかの実施形態では、腸管に由来する組織及び／又は器官は、最終分化細胞を含む。いくつかの実施形態では、マーカーは、膵臓細胞又は膵臓前駆体細胞を示す。好ましい実施形態では、マーカーは、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）である。他の実施形態では、マーカーはホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）又はホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）である。さらに、他の実施形態では、マーカーは肝細胞又は肝臓前駆体細胞を示す。或る特定の好ましい実施形態では、マーカーは、アルブミン、肝細胞特異的抗原（ＨＳＡ）又はプロスペロ(prospero)関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）である。他の実施形態では、マーカーは、肺又は肺前駆体細胞を示す。いくつかの好ましい実施形態では、マーカーは、甲状腺転写因子１（ＴＩＴＦ１）である。さらに他の実施形態では、マーカーは、腸又は腸前駆体細胞を示す。さらなる好ましい実施形態では、マーカーは、ビリン又は尾型ホメオボックス転写因子２（ＣＤ
Ｘ２）である。さらに他の実施形態では、マーカーは、胃又は胃前駆体細胞を示す。さらなる好ましい実施形態では、マーカーは、ＶＣＡＭ１、ＶＷＦ又はＣＸＣＲ４である。他の実施形態では、マーカーは甲状腺又は甲状腺前駆体細胞を示す。そのような実施形態では、マーカーはＴＩＴＦ１である。さらなる他の実施形態では、マーカーは、胸腺又は胸腺前駆体細胞を示す。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供することと、第２の時点でのマーカー発現を測定することとの間に十分な時間を経過させる。候補分化因子を細胞集団に提供することと第２の時点でのマーカーの発現を測定することとの間の十分な時間は、約１時間という短い時間から、約１０日間という長い時間までであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマーカーの発現は、候補分化因子を細胞集団に提供した後の複数の時点で測定される。いくつかの実施形態では、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約７８時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０２時間、少なくとも約１０８時間、少なくとも約１１４時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１２６時間、少なくとも約１３２時間、少なくとも約１３８時間、少なくとも約１４４時間、少なくとも約１５０時間、少なくとも約１５６時間、少なくとも約１６２時間、少なくとも約１６８時間、少なくとも約１７４時間、少なくとも約１８０時間、少なくとも約１８６時間、少なくとも約１９２時間、少なくとも約１９８時間、少なくとも約２０４時間、少なくとも約２１０時間、少なくとも約２１６時間、少なくとも約２２２時間、少なくとも約２２８時間、少なくとも約２３４時間又は少なくとも約２４０時間である。
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態では、第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのこのマーカーの発現と比較して、増大したか又は減少したかがさらに測定される。少なくとも１つのマーカーの発現の増大又は減少は、候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る、ということを示す。同様に、複数のマーカーの発現が測定される場合、第２の時点での複数のマーカーの発現が、第１の時点でのこの複数のマーカーの発現と比較して、増大したか又は減少したかがさらに測定される。マーカー発現の増大又は減少は、第１及び第２の時点での細胞集団中のマーカーの量、レベル又は活性を測定するか又は評価することにより決定され得る。このような決定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現と相対的であるか、あるいは絶対的であり得る。マーカー発現が第１の時点と比較して第２の時点で増大される或る特定のいくつかの実施形態では、増大の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であるか、又は少なくとも約１００倍より多い。いくつかの実施形態では、増大の量は、２倍未満である。マーカー発現が第１の時点と比較して第２の時点で減少される実施形態では、減少の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であるか、又は少なくとも約１００倍より多い。いくつかの実施形態では、減少の量は、２倍未満である。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供後、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞は、1つ又は複数の細胞
型の胚体内胚葉系統に分化する。いくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提
供後、ヒト前原始線条細胞及び／又は胚体内胚葉細胞は、腸管に由来する細胞に分化する。このような細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の細胞、並びにこのような細胞の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの細胞は、より高度な構造、例えば組織及び／又は器官にさらに発達し得る。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の他の実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供後、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞は1つ又は複数の細胞型の中内
胚葉系統に分化する。いくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供後、ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞は、例えば血球、心臓血管性系、骨格組織並びにその他の構造及び結合組織の細胞、そして上記細胞型の各々の前駆体（これらに限定されない）を含む細胞に分化する。さらに、これらの細胞は、より高度な構造、例えば組織及び／又は器官にさらに発達し得る。
ＦＧＦ８遺伝子産物の発現を増大する方法
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト胚性幹
細胞中でのＦＧＦ８遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。このような方法は、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記ｈＥＳＣを生成する工程を包含する。例えば培地は、約０％（ｖ／ｖ）、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約１．１％（ｖ／ｖ）、約１．２％（ｖ／ｖ）、約１．３％（ｖ／ｖ）、約１．４％（ｖ／ｖ）、約１．５％（ｖ／ｖ）、約１．６％（ｖ／ｖ）、約１．７％（ｖ／ｖ）、約１．８％（ｖ／ｖ）又は約１．９％（ｖ／ｖ）の濃度で血清を含み得る。いくつかの実施形態では、培地は、血清代替物を含まない。ｈＥＳＣは、ＦＧＦ８遺伝子産物の発現を増大するのに十分な量の分化因子と接触される。いくつかの実施形態では、分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子である。好ましい実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、アクチビンＡである。ｈＥＳＣを接触するために用いられる分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。例えばｈＥＳＣは、１ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ
／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ又は約１０００μｇ／ｍｌ以上の濃度の分化因子と接触され得る。
ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１遺伝子産物の発現の増大方法
本明細書中に記載される方法の他の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト胚性幹細胞中
でのブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。このような方法は、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記ｈＥＳＣを生成する工程を包含する。例えば培地は、約０％（ｖ／ｖ）、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約１．１％（ｖ／ｖ）、約１．２％（ｖ／ｖ）、約１．３％（ｖ／ｖ）、約１．４％（ｖ／ｖ）、約１．５％（ｖ／ｖ）、約１．６％（ｖ／ｖ）、約１．７％（ｖ／ｖ）、約１．８％（ｖ／ｖ）又は約１．９％（ｖ／ｖ）の濃度で血清を含み得る。いくつかの実施形態では、培地は、血清代替物を含まない。ｈＥＳＣは、ブラキュリ、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１遺伝子産物の発現を増大するのに十分な量の分化因子と接触される。いくつかの実施形態では、分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子である。好ましい実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、アクチビンＡである。ｈＥＳＣを接触するために用いられる分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。例えばｈＥＳＣは、１ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ又は約１０００μｇ／ｍｌ以上の濃度の分化因子と接触され得る。
細胞培養物中の遺伝子産物の一過性発現
本発明のさらなる実施形態は、或る特定の一過性パターンの遺伝子発現を有する細胞培養物に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含有する培地を含む。例えば培地は、約０％（ｖ／ｖ）、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ
）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約１．１％（ｖ／ｖ）、約１．２％（ｖ／ｖ）、約１．３％（ｖ／ｖ）、約１．４％（ｖ／ｖ）、約１．５％（ｖ／ｖ）、約１．６％（ｖ／ｖ）、約１．７％（ｖ／ｖ）、約１．８％（ｖ／ｖ）又は約１．９％（ｖ／ｖ）の濃度で血清を含み得る。いくつかの実施形態では、培地は血清代替物を含まない。いくつかの実施形態では、培地は低血清ＲＰＭＩである。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、培地中のｈＥＳＣは参照時点で分化し始める。参照時点は、分化因子が細胞に提供される時点である。いくつかの実施形態では、分化因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子である。好ましい実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、アクチビンＡである。ｈＥＳＣに提供される分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。例えばｈＥＳＣは、１ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ又は約１０００μｇ／ｍｌ以上の濃度の分化因子と接触され得る。
分化因子をｈＥＳＣに提供後、ＦＧＦ８ ｍＲＮＡの発現は、ｈＥＳＣ中でのベースライ
ンＦＧＦ８ ｍＲＮＡ発現と比較して、実質的にアップレギュレートされる。ｈＥＳＣ中
でのベースラインＦＧＦ８発現は、その未分化状態で保持されるｈＥＳＣ細胞培養物中に存在するＦＧＦ８遺伝子産物、例えばｍＲＮＡの発現である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ８ ｍＲＮＡ発現は、参照時点から約６時間までに実質的にアップレギュレートさ
れる。本明細書中に記載されるさらなる実施形態では、ＦＧＦ８ ｍＲＮＡの発現は、参
照時点から約２４時間後にダウンレギュレートされる。他の実施形態では、ＦＧＦ８ ｍ
ＲＮＡの発現ピークは、参照時点から約６時間〜約２４時間の間の時点で到達される。他の実施形態では、ＦＧＦ８の発現ピークは、参照時点から約６時間未満の時点で到達され得る。
本明細書中に記載される他の実施形態は、β−カテニンポリペプチドの核局在化増大を示す細胞培養物に関する。このような実施形態では、β−カテニンポリペプチドは、参照時点から約１７時間までに細胞核に局在されるようになり始める。いくつかの実施形態では、β−カテニンポリペプチドは、参照時点から約１７時間未満までに細胞核に局在される
ようになり始める。さらに他の実施形態では、β−カテニンポリペプチドは、参照時点から約１７時間までに細胞核に優勢的に局在されるようになる。
本明細書中に記載される細胞培養物のさらに他の実施形態は、ブラキュリｍＲＮＡの発現増大を有する細胞培養物に関する。このような細胞培養物では、ブラキュリｍＲＮＡ発現は、参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ブラキュリｍＲＮＡ発現は、参照時点から約２４時間前に実質的にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ブラキュリｍＲＮＡの発現は、参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる。或る特定のいくつかの実施形態では、ブラキュリｍＲＮＡの発現ピークは、参照時点から約１２時間〜約４８時間の時点で到達される。好ましい実施形態では、ブラキュリｍＲＮＡは参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない。他の好ましい実施形態では、ブラキュリｍＲＮＡは参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされ、そして参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない。
本明細書中に記載される細胞培養物のさらなる実施形態は、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現増
大を有する細胞培養物に関する。このような細胞培養物ではＦＧＦ４ ｍＲＮＡ発現は参
照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡ発現は、参照時点から約２４時間前に実質的にアップレギュレー
トされる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現は、参照時点から約４８
時間までに実質的にダウンレギュレートされる。或る特定のいくつかの実施形態では、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現ピークは、参照時点から約１２時間〜約４８時間の時点で到達さ
れる。好ましい実施形態では、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡは参照時点から約７２時間までに実質
的に発現されない。他の好ましい実施形態では、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡは参照時点から約２
４時間までに実質的にアップレギュレートされ、そして参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない。
本明細書中に記載される細胞培養物の好ましい実施形態は、ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍ
ＲＮＡの発現増大を有する細胞培養物に関する。このような細胞培養物では、ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡ発現は、参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレ
ートされる。いくつかの実施形態では、ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡ発現は、参照
時点から約２４時間前に実質的にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡの発現は、参照時点から約４８時間までに実質的にダ
ウンレギュレートされる。或る特定のいくつかの実施形態では、ブラキュリ及びＦＧＦ４
ｍＲＮＡのピーク発現は、参照時点から約１２時間〜約４８時間の時点で到達される。
好ましい実施形態では、ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲＮＡは参照時点から約７２時間ま
でに実質的に発現されない。他の好ましい実施形態では、ブラキュリ及びＦＧＦ４ ｍＲ
ＮＡは参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされ、そして参照時点から約７２時間までに実質的に発現されない。
本明細書中に記載される細胞培養物のさらなる実施形態は、ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現
増大を有する細胞培養物に関する。このような細胞培養物では、ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡ発
現は参照時点から約２４時間までに実質的にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡ発現は、参照時点から約２４時間前に実質的にアップレ
ギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現は、参照時点
から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる。或る特定のいくつかの実施形態では、ＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡの発現ピークは、参照時点から約１２時間〜約４８時間の
時点で到達される。
本明細書中に記載される細胞培養物の実施形態は、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）遺伝子産
物の特定の一過性発現を有する細胞培養物にも関する。このような実施形態では、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡの発現は、参照時点から約１２時間までにダウンレギュレートされ始める。他の実施形態では、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡの発現は、参照時点から約１２時間未満までにダウンレギュレートされ得る。好ましい実施形態では、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡの発現は、参照時点から約４８時間までに実質的にダウンレギュレートされる。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ＳＯＸ１７及び／又はＦＯＸＡ２マーカーを発現する細胞培養物に関する。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡの発現
は、参照時点から約４８時間までに実質的にアップレギュレートされる。他の実施形態では、ＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡの発現は参照時点から約９６時間までに実質的にアップレギュ
レートされる。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、遺伝子発現の或る特定の特定化パターンを有する細胞を含む細胞培養物に関する。このような実施形態では、細胞培養物は、ｈＥＳＣ、分化因子、例えばＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子、及び約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含有する培地を含む。代替的な実施形態では、培地は２％（ｖ／ｖ）より多い血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は血清代替物を欠く。
いくつかの実施形態では、細胞培養物が分化因子を提供される時点で、細胞培養物はすべての又はほとんどすべてのｈＥＳＣを含む。分化の経過中、ｈＥＳＣの少なくとも一部分は、或る特定のマーカー遺伝子の産物（ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド）の発現により示されるように、他の細胞型に分化する。
本明細書中に記載される細胞培養物のいくつかの実施形態では、第１の組のマーカー遺伝子の発現は、第２及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のアップレギュレート前にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子の各組は、1つ又は複数
のマーカー遺伝子を含み得る。遺伝子発現のアップレギュレートは、わずかなものから大幅なものまで様々であり得る。例えばマーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％アップレギュレートされ得る。他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９０％より多くアップレギュレートされ得る。さらに他の実施形態では、マーカー遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍より多くアップレギュレートされ得る。
本明細書中に記載される細胞培養物の他の実施形態では、第１の組のマーカー遺伝子の発現は、第２及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のアップレギュレート前に、ダウンレギュレートされる。このような実施形態では、各組のマーカー遺伝子は、1つ又は複数のマ
ーカー遺伝子を含み得る。遺伝子発現のアップレギュレートに関する場合と同様に、ダウンレギュレートはわずかなものから大幅なものまで様々であり得る。例えばマーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％ダウンレギュレートされ得る。他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９０％より多くダウンレギュレートされ得る。さらに他の実施形態では、マーカー遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍より多くダウンレギュレートされ得る。
本明細書中に記載される細胞培養物のさらに他の実施形態では、第１の組のマーカー遺伝子の発現は、第２の組及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のピーク発現の前又はそれとほぼ同時にアップレギュレートされる。このような実施形態では、各組のマーカー遺伝子は、1つ又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。他の実施形態では、第１の組のマーカー
遺伝子の発現は、第２の組及び／又は第３の組のマーカー遺伝子の発現ピークの前又はそれとほぼ同時にダウンレギュレートされる。上記のように、このような実施形態では、各組のマーカー遺伝子は、1つ又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。さらに、上記の実施
形態では、遺伝子発現のアップレギュレート及びダウンレギュレートはともに、わずかなものから大幅なものまで様々であり得る。例えばマーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％アップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得る。他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９０％より多くアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得る。さらに他の実施形態では、マーカー遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍より多くアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得る。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレート前に、アップレギュレートされる。他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前に、アップレギュレートされる。さらに他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前又はそれとほぼ同時に、ダウンレギュレートされる。さらなる実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ＳＯＸ１７、
ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレート前に、アップレギュレートされる。さらに他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又はそれとほぼ同時に、アップレギュレートされる。さらに他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークは、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又はそれとほぼ同時に、到達される。さらなる実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレート前に、アップレギュレートされる。
上記の1つ又は複数の一過性遺伝子発現パターンを有する細胞培養物のいくつかは、約２
％（ｖ／ｖ）未満の血清を含有する培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は血清を含有しない。他の実施形態では、培地は血清代替物を欠く。本明細書中に記載される細胞培養物中に用いられる培地のうちのいくつかは、約１．９％（ｖ／ｖ）未満、約１．８％（ｖ／ｖ）未満、約１．７％（ｖ／ｖ）未満、約１．６％（ｖ／ｖ）未満、約１．５％（ｖ／ｖ）未満、約１．４％（ｖ／ｖ）未満、約１．３％（ｖ／ｖ）未満、約１．２％（ｖ／ｖ）未満、約１．１％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満又は約０．０５％（ｖ／ｖ）未満の濃度で血清を含む。
上記の1つ又は複数の一過性遺伝子発現パターンを有する細胞培養物のいくつかは、ＴＧ
Ｆβスーパーファミリーの少なくとも１つの分化因子を含む。いくつかの実施形態では、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢである。好ましい実施形態では、分化因子はアクチビンＡである。さらに好ましい実施形態では、アクチビンＡは、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で倍地中に存在する。
しかしながら、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で細胞培養物に供給され得る、と理解される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、
約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ、又は約１０００μｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物に供給される。
或る特定の一過性マーカー遺伝子発現パターンを有する細胞を産生するためのｈＥＳＣを分化する方法も、本明細書中で意図される。例えばいくつかの実施形態は、ｈＥＳＣを約２％未満の血清を含有する培地と接触させ、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子をｈＥＳＣに提供し、次にｈＥＳＣの分化を起こさせることによるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を分化する方法に関する。
上記のｈＥＳＣ分化方法のいくつかの実施形態では、第１の組のマーカー遺伝子の発現は、第２及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のアップレギュレート前にアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子の各組は、1つ又は複数のマーカー
遺伝子を含み得る。遺伝子発現のアップレギュレートは、わずかなものから大幅なものまで様々であり得る。例えばマーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％アップレギュレートされ得る。他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９０％より多くアップレギュレートされ得る。さらに他の実施形態では、マーカー遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍より多くアップレギュレートされ得る。
本明細書中に記載されるｈＥＳＣを分化する方法の他の実施形態では、第１の組のマーカー遺伝子の発現は、第２及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のアップレギュレート前に、ダウンレギュレートされる。このような実施形態では、各組のマーカー遺伝子は、1つ
又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。遺伝子発現のアップレギュレートに関する場合と同様に、ダウンレギュレートはわずかなものから大幅なものまで様々であり得る。例えばマーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％ダウンレギュレートされ得る。他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９０％より多くダウンレギュレートされ得る。さらに他の実施形態では、マーカー遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、
少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍より多くダウンレギュレートされ得る。
本明細書中に記載されるｈＥＳＣ分化方法のさらに他の実施形態では、第１の組のマーカー遺伝子の発現は、第２の組及び／又は第３の組のマーカー遺伝子のピーク発現の前又はそれとほぼ同時にアップレギュレートされる。このような実施形態では、各組のマーカー遺伝子は、1つ又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。他の実施形態では、第１の組のマ
ーカー遺伝子の発現は、第２の組及び／又は第３の組のマーカー遺伝子の発現ピークの前又はそれとほぼ同時にダウンレギュレートされる。上記のように、このような実施形態では、各組のマーカー遺伝子は、1つ又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。さらに、上記
の実施形態では、遺伝子発現のアップレギュレート及びダウンレギュレートはともに、わずかなものから大幅なものまで様々であり得る。例えばマーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％アップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得る。他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９０％より多くアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得る。さらに他の実施形態では、マーカー遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣ中の同一マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍より多くアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得る。
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレート前に、アップレギュレートされる。他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前に、アップレギュレートされる。さらに他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現ピークの前又はそれとほぼ同時に、ダウンレギュレートされる。さらなる実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレート前に、アップレギュレートされる。さらに他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ
２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又はそれとほぼ同時に、アップレギュレートされる。さらに他の実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子のピーク発現は、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４及びＭＩＸＬ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレートの前又はそれとほぼ同時に、到達される。さらなる実施形態では、細胞培養物の少なくともいくつかの細胞中では、ＦＧＦ８、ノーダル、ＨＥＧ、ＨＥＹ１、ＧＡＴＡ２、ＢＩＫ及びＩＤ１から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現は、ブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、Ｗｎｔ３、ＭＩＸＬ１、ＤＫＫ４、ＮＥＴＯ１、Ｔ、ＤＡＣＴ１、ＦＬＪ２２６６２、ＳＬＩＴ２、ＧＡＤ１及びＧＲＭ４から成る群から選択されるマーカー遺伝子の発現のアップレギュレート前に、アップレギュレートされる。
本明細書中に記載される分化方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞が、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含有する培地と接触されるか、又は他の方法でこれを与えられる。いくつかの実施形態では、培地は血清を含有しない。他の実施形態では、培地は血清代替物を欠く。本明細書中に記載される方法で用いられる培地のうちのいくつかは、約１．９％（ｖ／ｖ）未満、約１．８％（ｖ／ｖ）未満、約１．７％（ｖ／ｖ）未満、約１．６％（ｖ／ｖ）未満、約１．５％（ｖ／ｖ）未満、約１．４％（ｖ／ｖ）未満、約１．３％（ｖ／ｖ）未満、約１．２％（ｖ／ｖ）未満、約１．１％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満又は約０．０５％（ｖ／ｖ）未満の濃度で血清を含む。
上記の一過性遺伝子発現パターンを生成するためのｈＥＳＣ分化方法のいくつかは、ｈＥＳＣ等の培養中の細胞に、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの分化因子を与えることを含む。いくつかの実施形態では、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢである。好ましい実施形態では、分化因子はアクチビンＡである。さらに好ましい実施形態では、アクチビンＡは、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で倍地中に存在する。
しかしながら、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で細胞培養物に供給され得る、と理解される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの分化因子は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、
約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ、又は約１０００μｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物に供給される。
本発明を一般的に記載してきたが、例証の目的のためにのみ本明細書中に提供され、限定的であるよう意図されない或る特定の特定の実施例を参照することによりさらなる理解が得られる。
以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用を記載する。多能性ヒト細胞を産生する方法は、当該技術分野で既知であり、多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第６，０９０，６２２号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号に記載されている（これらの開示内容は全体が参照により本明細書中に完全に援用される）。
［実施例１］
ヒトＥＳ細胞
初期発達についてのわれわれの研究のために、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に***し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受
精サイクルからの過剰凍結胚から得た。解凍時に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ＩＴＳサプリメント）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に孵化胚盤胞をプレート化した。胚が培養皿に接着し、そして約２週間後、未分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再プレート化することにより移動を成し遂げた。誘導以来、ｈＥＳＣｙｔ−２５を、１００回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。
幹細胞又は他の多能性細胞は本明細書中に記載される分化手法のための出発物質としても用いられ得る、と当業者により理解される。例えば当該技術分野で既知の方法により単離され得る胚性生殖***から得られる細胞は、多能性細胞出発物質として用いられ得る。
［実施例２］
ｈＥＳＣｙｔ−２５特徴づけ
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養中に１８ヶ月にわたって、正常形態学、核型、増殖及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、未分化ｈＥＳＣに特有である）に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたｈＥＳＣ株と同一の形態学を示す。さらにヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）により
、外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、臓側内胚葉（ＶＥ）、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理細胞は、高レベルのα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を５４時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下で記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現の非存在下でのＳＯＸ１７に関する実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のＥＢを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表わす細胞を形成する能力により示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。
［実施例３］
胚体内胚葉細胞
２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の
同時係属中の共有米国特許第１１／０２１，６１８号は、ヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団を記載する。そこには、分化因子の存在下での分化によるｈＥＳＣからの胚体内胚葉を産生する方法、並びに混合細胞培養物及び／又は細胞集団からこれらの胚体内胚葉細胞を富化、単離及び／又は精製するための方法も記載されている。さらにそこには、胚体内胚葉細胞の同定及び／又は検出のために有用であるマーカー、並びにこのような細胞の精製に有用なマーカーが記載されている。２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許出願第１１／０２１
，６１８号の開示内容は、全体が参照により本明細書中に完全に援用される。
本実施例は、上記の同時係属中特許出願から再生される胚体内胚葉細胞の検出及び／又は同定のための有用なマーカーを記載する。
以下の実験において、精製された胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からＲＮＡを単離した。次に、各精製された集団からのＲＮＡの遺伝子チップ分析により、遺伝子発現を分析した。胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉中で発現されるが胚性幹細胞中では発現されない遺伝子のポテンシャルをさらに検査するために、Ｑ−ＰＣＲも実施した。
２０％ノックアウト血清代替物、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を保持した。１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアクチビンＡ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ倍地中で５日間培養することにより、ｈＥＳＣを胚体内胚葉に分化させた。ＦＢＳの濃度を以下のように日毎に変更した：０．１％（１日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。
遺伝子発現分析のためのｈＥＳＣ及び胚体内胚葉の精製された集団を得るために、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により細胞を単離した。ＳＳＥＡ４抗原（R&D Systems、カ
タログ番号ＦＡＢ１４３５Ｐ）を用いてｈＥＳＣに関して、そしてＣＸＣＲ４（R&D Systems、カタログ番号ＦＡＢ１７０Ｐ）を用いて、胚体内胚葉に関して、免疫精製を達成し
た。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen、 カタログ番号２５３００−０５４）
を用いて解離し、２％ヒト血清を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、氷上で１０分間、１００％ヒト血清中に再懸濁して、非特異的結合を遮断した。８００μｌのヒト血清中の５×１０6細胞に２００μｌのフィコエリスリン接合抗体を添加する
ことにより、氷上で３０分間、染色を実行した。細胞をＰＢＳ緩衝液８ｍｌで２回洗浄し
、同一緩衝液１ｍｌ中に再懸濁した。ＦＡＣＳバンテージ（BD Biosciences）を用いて、The Scripps Research Instituteの中心設備により、ＦＡＣＳ単離を実行した。細胞をＲＬＴ溶解緩衝液中に直接収集し、メーカーの使用説明書（Qiagen）に従ってＲＮｅａｓｙによりＲＮＡを単離した。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットホーム及びＵ１３３プラス２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いて、発現プロファイルデータの生成のために、精製されたＲＮＡを反復実験で発現分析（Durham, NC）に付した。提示されるデータは、２つの集団、ｈＥＳＣ及び胚体内胚葉間で差動的に発現される遺伝子を同定する群比較である。ｈＥＳＣにおいて見出されるものを上回る発現レベルで強い上方変化を示した遺伝子を、胚体内胚葉に非常に特有の新規の候補マーカーとして選択した。上記のようにＱ−ＰＣＲにより選択遺伝子を検定して、遺伝子チップ上に見出される遺伝子発現変化を立証し、そしてｈＥＳＣ分化の時間経過中のこれらの遺伝子の発現パターンも調査した。
図２Ａ〜図２Ｍは、或る特定のマーカーに関する遺伝子発現結果を示す。１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの添加後１、３及び５日目に分析された細胞培養物、５日間分化手法の終了時に精製されたＣＸＣＲ４発現胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）に関する、そして精製ｈＥＳＣにおける結果を示す。図２Ｃ及び図２Ｇ〜図２Ｍの比較は、６つのマーカー遺伝子ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、互いにほとんど同一であり、そしてＣＸＣＲ４の発現パターン並びにＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比とも同一である発現パターンを示した、ということを実証する。上記のように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉並びにＳＯＸ７発現胚体外内胚葉の両方で発現された。ＳＯＸ７は胚体内胚葉中で発現されなかったため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比は、全体としての集団中で見られるＳＯＸ１７発現に対する胚体内胚葉の寄与の信頼できる概算を提供する。パネルＧ−Ｌ及びＭとパネルＣとの類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が胚体内胚葉のマーカーであること、そしてそれらが胚体外内胚葉細胞中で有意に発現されない、ということを示す。
本明細書中に記載されるＱ−ＰＣＲ結果はＩＣＣによりさらに確証され得る、と理解される。
［実施例４］
胚体内胚葉前駆体細胞における遺伝子発現の時系列
胚体内胚葉への分化中に起こる遺伝子発現のダイナミクスを査定するために、２つの異なる４日間分化プロトコール中の種々の時点での分化中の細胞培養物において、多数の遺伝子の発現をモニタリングした。
具体的には、最初の２４時間はＦＢＳの非存在下で、２回目の２４時間には０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中で、そして３及び４日目には２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中で、ｈＥＳＣを培養して、胚体内胚葉への分化を誘導するために１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡに連続曝露するか、又は栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰｒＥ）の混合細胞集団への分化を誘導するために１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２．５μＭのＦＧＦＲ１阻害剤、ＳＵ５４０２に連続曝露した。分化手法中の種々の時点で遺伝子発現を測定することにより、このような培養物における遺伝子発現のダイナミクスを測定した。特に、分化因子の添加の時点、並びにこれらの因子の添加後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で、Ｑ−ＰＣＲにより遺伝子発現を測定した。いくつかの異なるマーカー遺伝子に関するこの時間経過中の遺伝子発現プロファイルを、図３Ａ〜図３Ｌに示す。
図３Ａは、ＦＧＦ８の発現が、アクチビンＡでの処理後６時間以内にほぼその最大レベルに増大したことを示す。ＦＧＦ８発現は約２４時間高いままであり、次にその後、減少し
始めた。ＢＭＰ４／ＳＵ５４０２による処理は、ＦＧＦ８発現のレベルの非常に少ない変化を引き起こした（図３Ａ）。これらの結果は、アクチビンＡがＦＧＦ８発現細胞へのｈＥＳＣの迅速な移行を媒介する、ということを実証する。ＦＧＦ８発現は原外胚葉における後方パターン形成の第一指標の１つであるので、分化中のｈＥＳＣにおけるＦＧＦ８の急速なアップレギュレートは、これらの初期段階の細胞がｈＥＳＣ細胞型から分化して、「前線条」（前原始線条）細胞集団を形成した、ということを示す。
図３Ｂ〜図３Ｆに示したように、或る特定の原始線条（中内胚葉）マーカー、例えばブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１及びＧＳＣの誘導は、アクチビンＡによる処理後約６時間で開始した。しかしながらＦＧＦ８誘導と対比して、これらのマーカーの発現は増大し続け、そしてアクチビンＡの添加後約２４時間で、又はいくつかの場合には４８時間で最大レベルに達した。原始線条マーカーのいずれかの発現増大は、ＢＭＰ４／ＳＵ５４０２処理培養物ではほとんど又は全く認められなかった（図３Ｂ〜図３Ｆ）。さらに、胚体内胚葉細胞中では発現されないブラキュリ及びＦＧＦ４の発現レベルは、アクチビンＡ処理後４８〜７２時間までに、ｈＥＳＣレベルに又はそれより低いレベルに、非常に急速にダウンレギュレートされた（図３Ｂ〜図３Ｃ）。逆に、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１及びＧＳＣは４８〜９６時間で有意に発現され続けた（図３Ｄ〜図３Ｆ）。
アクチビンＡによる処理後約７２時間で、ＳＯＸ１７は強いアップレギュレートを示し、これは原始線条（中内胚葉）中間体から胚体内胚葉細胞最終形への移行と一致する（図３Ｇ）。ＳＯＸ１７発現のこのようなアップレギュレートは、ＢＭＰ４／ＳＵ５４０２処理細胞培養物では生じなかった（図３Ｇ）。
アクチビンＡ処理ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物に関して直前に記載した遺伝子発現のこの
時系列は、初期脊椎動物原腸形成で起こる事象を模倣し、したがってｈＥＳＣがこの分化プロセス中に類似の中間体を介して移行中である、ということを示唆する。
胚体内胚葉をもたらす上記の事象順序に加えて、図３Ｈ〜図３Ｌは、約２４〜４８時間で、栄養外胚葉及び原始内胚葉マーカー、例えばＨＣＧ、ＤＡＢ２、ＳＯＸ７、ＣＨＲＤ及びＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）の強固なアップレギュレートがＢＭＰ４／ＳＵ５４０２で処理した細胞中で開始した、ということを示す。これらのマーカーのアップレギュレートは、７２〜９６時間継続した。逆に、ＨＣＧ、ＤＡＢ２、ＳＯＸ７、ＣＨＲＤ又はＥ−カドヘリンのアップレギュレートは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡに曝露された細胞培養物中では生じなかった（図３Ｈ〜図３Ｌ）。これらの結果は、ｈＥＳＣが適切な条件下で栄養外胚葉及び原始内胚葉に分化する能力を有する、ということを示すが、しかしながらこれらの系統への分化はアクチビン処理培養物中では有意程度には起きなかった。
［実施例５］
ヒト胚性幹細胞上皮−間充織転換
脊椎動物原腸形成中、原始線条での上皮−間充織転換（ＥＭＴ）を受けている原外胚葉細胞は、細胞表面でのＥ−カドヘリンタンパク質の発現パターンを変える。ＦＧＦ及びＴＧＦβシグナル伝達の複合作用は、Ｅ−カドヘリンの直接転写抑制因子であるジンクフィンガー転写因子ＳＮＡＩ１を誘導するのに役立つ。本実施例は、原腸形成中にｉｎ ｖｉｖ
ｏで起こるＥＭＴにおけるのとまさに同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアクチビン曝露ｈＥＳ
Ｃ培養物の初期分化段階中に、Ｅ−カドヘリンの転写が抑制される、ということを示す。
０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＭＰＩ培地中で、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下で２日間、ヒト胚性幹細胞培養物を分化させた。Ｑ−ＰＣＲ及び／又は免疫細胞化学を用いて、或る特定のマーカー遺伝子の発現を測定した。図４Ａ〜図４Ｃは、それぞれブラキュリ、Ｅ−カドヘリン及びＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡのＱ−ＰＣＲ測定発現を示す。
免疫細胞化学を用いて、ブラキュリ、Ｅ−カドヘリン及び活性化（非リン酸化）Ｂ−カテニンの発現を測定した。
上記のように、培養中のアクチビン曝露前原始線条細胞は、アクチビン曝露の約２４時間後に原始線条（中内胚葉）細胞に分化した（実施例４及び図７）。図４Ａと図４Ｃの比較は、ブラキュリ及びＳＮＡＩ１ ｍＲＮＡレベルがともに、約２４時間でピークに達した
、ということを示す。発現における同様のピークは、ＦＧＦ４ ｍＲＮＡに関して観察さ
れた（図３Ｃ）。この時間中のブラキュリ発現に関連して、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡの発現は減少しつつあり、そしてアクチビンＡ処理の開始後４８時間までに３分の１以下に減少し続けた（図４Ｂ）。アクチビン曝露後１２時間までに、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡレベルが分化中細胞培養物におけるそれらの最初のレベルから約３３％低下した場合、コロニーの周辺のブラキュリ陽性細胞中のＥ−カドヘリンの特徴的頂端細胞表面免疫局在化（粘着性接合部に関与すると思われる）の同時消失が認められた。２４時間後、ブラキュリ発現細胞の数が増大すると、ブラキュリ陽性細胞中の接合部関連Ｅ−カドヘリンの損失はより強くなった。さらに、細胞の形態は、１２時間及び２４時間の両方でのＤＡＰＩ及びブラキュリ染色核の形態における差により立証されるように、低均一に見えたが、このことは、ＥＭＴの出現をさらに支持する。
上記の遺伝子発現に加えて、胚体内胚葉に分化したｈＥＳＣとして、β−カテニンの細胞内局在化を決定した。非リン酸化（Ｓｅｒ７及びＴｈｒ４１）形態のβ−カテニンのみを認識する抗体を用いて、このタンパク質は未分化ｈＥＳＣ中の細胞質表面でのみ局在化される、ということを見出した。アクチビン処理後１７時間までに、核及び膜結合β−カテニンの両方を、ブラキュリ陰性及びブラキュリ発現細胞の両方で検出した。さらに、ウエスタンブロット分析は、分化中であるがしかし未分化の細胞の可溶性膜排除タンパク質分画中のβ−カテニンの存在を確証した。これらの結果は、β−カテニンの核局在化がブラキュリタンパク質発現より前に起こるという仮説と一致する。さらに、総合すれば、アクチビン曝露細胞培養物中では、原始線条様状態が発達すると、古典的ＥＭＴが生じるが、この場合、活性化β−カテニンはブラキュリタンパク質の発現の前に核に場所を移し、そして細胞間の上皮境界での粘着性接合部の分解と同時に起こる、ということを上記のデータは示唆する。
［実施例６］
胚体内胚葉への中内胚葉の分化
本実施例は、胚体内胚葉に分化する中内胚葉前駆体細胞の応答能を実証する。
０．１％（ｖ／ｖ）ＦＳＢの血清濃度を有するＲＰＭＩ培地中で、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下で２日間、ヒト胚性幹細胞培養物をインキュベートした。図５Ａに示したように、ブラキュリｍＲＮＡ発現は、約２４時間でピークに達した。これと同時に、ＳＯＸ１７遺伝子の発現が増大し始めた（図５Ｂ）。約４８時間までに、ブラキュリｍＲＮＡ発現はベースラインレベルに戻り（図５Ａ）、そしてＳＯＸ１７がベースラインを約１８倍上回って発現された（図５Ｂ）。７より多くの個々の実験で立証されたこれらの結果は、ブラキュリ発現中内胚葉細胞が、アクチビン処理後約３６〜４８時間でＳＯＸ１７発現胚体内胚葉への転換を開始する、という仮説と一致する。
上記の仮説の妥当性を実証するために、ブラキュリ及びＳＯＸ１７マーカーの免疫細胞化学ベースの分析を実施した。ブラキュリタンパク質発現に関する時間経過は、１２時間でほとんどの大型コロニーの周辺部で開始し、そして３６〜４８時間までにコロニーの内部に急速に広がった免疫反応性細胞の出現を示す。これらの後の時間に、培養物中の細胞の大多数がブラキュリタンパク質に関して陽性であった。このようなものとして、ブラキュリタンパク質発現パターンは、図５Ａに示したブラキュリｍＲＮＡ発現のピークに関連し
て１２〜２４時間までに遅延された。分化の４８時間後、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ及びタン
パク質発現が急速に増大しつつあり、そしてブラキュリ発現が急速に減少しつつあった場合、ＳＯＸ１７陽性細胞のほとんどがブラキュリを同時発現した（図６Ａ〜図６Ｄ）。これらのデータは、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビン及び低血清の存在下で、大多数のＳＯＸ１７陽性細胞がブラキュリ陽性中内胚葉細胞に由来した、ということを明らかに実証する。さらに、これらの知見は、ヒト発達における中内胚葉中間体の存在を高度に示唆する。さらに、ブラキュリ発現は発達中の任意の時点で原始内胚葉系統の細胞中で起きないため、これらの知見は最終的に、アクチビン産生内胚葉の決定的性質を立証する。
［実施例７］
中内胚葉細胞からの中胚葉及び胚体内胚葉の形成
上記の実施例に加えて、本明細書中に記載される中内胚葉中間体が中胚葉又は胚体内胚葉細胞への分化を受け得る、ということを実証するために実験を実行した。
図７は、この実施例に用いた実験計画及び培養条件を示す。具体的には、２つの並行ｈＥＳＣをＲＰＭＩ培地中で４日間培養した。実施例４の場合と同様に、第１日目は０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、第２日目には０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、そして第３及び４日目には２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するよう、この培地の血清濃度を調整した。並行培養物の各々において、最初の２４時間、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、アクチビンＡを培地中に供給した。この時間の終了時に、アクチビンＡを並行培養物の一方から除去し（ＮＦ）、そして他方の培養物中では保持した（Ａ１００）。
図８Ａ〜図８Ｆは、高アクチビン及び低ＦＢＳ条件下で、中胚葉マーカーであるブラキュリ、ＭＯＸ１、ＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４及びＳＤＦ１に関する発現の欠如が認められたことを示す。これらの結果は、ブラキュリ／ＦＧＦ４／ＭＩＸＬ１発現中内胚葉細胞が、高アクチビンＡ条件下で、中胚葉にというよりむしろ胚体内胚葉の産生に向けてパターン化された、ということを実証する。これは、全４日間の期間中にアクチビンで処理された培養物中の胚体内胚葉マーカー、ＧＳＣ、ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２の強い発現によっても実証された（図９Ａ〜図９Ｃ）。逆に、より低いノーダル／アクチビンシグナル伝達をシミュレートする２４時間でのアクチビンＡの除去は、胚体内胚葉遺伝子発現の劇的な損失（図９Ａ〜図９Ｃ）を、中胚葉特質の劇的な獲得（図８Ａ〜図８Ｆ）と同時に生じた。
［実施例８］
０．５％血清を含有する培地中での胚体内胚葉産生
胚体内胚葉細胞の産生に及ぼす血清低減の作用をさらに実証するために、ｈＥＳＣを、種々の血清濃度を含有する培地中で胚体内胚葉細胞に分化させた。
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ又は０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの存在下で、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを含有するＲＰＭＩ培地中で５日間、ヒト胚性幹細胞を培養した。アクチビンＡを含有しない対照細胞培養物も、３つの試験血清レベルの各々で確立した。これらの培養物の各々に関して、Ｑ−ＰＣＲにより、いくつかのマーカー遺伝子の発現を測定した（図１０Ａ〜図１０Ｉ）。さらに、これらの培養物中の細胞により産生されるＳＯＸ１７タンパク質の量を、本明細書中に上記したＳＯＸ１７に対する抗体を用いて免疫細胞化学により測定した。
図１０Ａ〜図１０Ｉは、ＦＢＳの種々の濃度での或る特定の胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現を示す。特に図１０Ａ〜図１０Ｄは、アクチビンＡで処理した細胞培養物中の血清濃度の低減は、胚体内胚葉陽性マーカー、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＦＯＸＡ２に対応するｍＲＮＡの産生の実質的増大を生じた、ということを示す。ｍＲＮＡ発現がア
クチビンＡに応答して減少されるマーカー（非胚体内胚葉細胞型のマーカー、例えばブラキュリ、ＭＯＸ１、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１及びＺＩＣ１）の場合、血清濃度の低減はこれらのマーカーに対応するｍＲＮＡの産生の実質的低減を生じた（図１０Ｅ〜図１０Ｉ）。
ＳＯＸ１７に対する抗体を用いて、免疫細胞化学により、血清濃度の各々で胚体内胚葉細胞に転換されるｈＥＳＣの相対的割合を測定した。０．５％ＦＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ中での分化の５日後、ＳＯＸ１７陽性細胞の割合は８０％より大きく（＞３の別個の実験）、並びにそれぞれＶＥ／ＰＥ及び栄養外胚葉（ＴＥ）のマーカーであるα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）又はトロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）の検出可能な免疫反応性は認められなかった。ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ発現の増大とこれらの条件全体のＳＯＸ
１７免疫反応性細胞の数の増大との間の相関は、相対的遺伝子発現測定値が集団内のＳＯＸ１７陽性細胞数の合理的測定値でもある、ということを示す。
［実施例９］
ＳＯＸ１７発現のアップレギュレートはＦＯＸＡ２発現のアップレギュレートに先行する本実施例は、胚体内胚葉へのｈＥＳＣのアクチビン媒介性分化において、ＳＯＸ１７ ｍ
ＲＮＡ発現はＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡ発現の前にアップレギュレートされる、ということを
実証する。
実施例４に上記したように、アクチビンＡ及び低血清の存在下で４日間、ＲＰＭＩ培地中でヒト胚性幹細胞を培養した。ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡの発現を、Ｑ−ＰＣ
Ｒにより測定した。
図１１Ａに示したように、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ発現は、アクチビン添加後約４８時間に
開始して実質的に増加した。ＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡに関する発現の同様の実質的増大は、
アクチビンＡ添加後約９６時間まで観察されなかった。これらの結果は、胚体内胚葉の産生と一致したが、中軸中胚葉とは一致しなかった（図９Ａ〜図９Ｃも参照）。しかしながらこれらの結果は、ＦＯＸＡ２発現がＳＯＸ１７の発現に先行する場合の、アクチビンとともにインキュベートされたマウス胚様体中でのＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２の一過性発現と対照を成す。このようなものとして、マウス胚様体系は、胚体内胚葉というよりむしろ中軸中胚葉の産生に関して最適化される、と思われる。
［実施例１０］
８つの異なるｈＥＳＣ株中での胚体内胚葉の産生
本実施例は、本明細書中に記載される方法を用いて、８つの独立して得られたｈＥＳＣ株から胚体内胚葉細胞が産生され得る、ということを示す。
低血清ＲＰＭＩ培地中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で５日間、８つの異なるｈＥＳＣ株（ＣｙＴ２５、ＣｙＴ−ＤＭ３、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、Ｈ７、Ｈ９及びＨＵＥＳ７）を別々に培養した。具体的には、ＲＰＭＩ培地は、１日目に０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２日目に０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、そして３〜５日目に２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有した。
８つの細胞株は各々、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞に分化した。
［実施例１１］
マウス腎臓被膜下のヒト胚体内胚葉細胞の移植
本明細書中に記載される方法を用いて産生されたヒト胚体内胚葉細胞が、腸管由来細胞を産生するよう分化因子に応答し得ることを実証するために、このようなヒト胚体内胚葉細胞をｉｎ ｖｉｖｏ分化プロトコールに付した。
ヒト胚体内胚葉細胞を、上記実施例に記載されたように産生した。このような細胞を収穫し、標準手法を用いて免疫無防備状態マウスの腎臓被膜下に移植した。３週間後、マウスを屠殺し、移植組織を取り出して、切片にして、組織学的解析及び免疫細胞化学的解析に付した。
図１２Ａ〜図１２Ｄは、移植後３週間目に、ヒト胚体内胚葉細胞は腸管由来の細胞及び細胞構造物に分化した、ということを示す。特に図１２Ａは、腸管様構造物に分化した移植ヒト胚体内胚葉組織のヘマトキシリン及びエオシン染色切片を示す。図１２Ｂは、肝細胞特異的抗原（ＨＳＡ）に対する抗体で免疫染色した移植ヒト胚体内胚葉切片を示す。この結果は、ヒト胚体内胚葉細胞が肝臓又は肝臓前駆体細胞に分化し得る、ということを示す。図１２Ｃ及び図１２Ｄはそれぞれ、ビリンに対する抗体及び尾型ホメオボックス転写因子２（ＣＤＸ２）に対する抗体で免疫染色した移植ヒト胚体内胚葉切片を示す。これらの結果は、ヒト胚体内胚葉細胞が腸細胞又は腸細胞前駆体に分化し得る、ということを示す。
［実施例１２］
ＦＧＦ８プロモーター−ＥＧＦＰ及びブラキュリプロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックヒト胚性幹細胞株の生成
細胞単離のためにＦＧＦ８及びブラキュリマーカーを使用するために、発現可能レポーター遺伝子と融合されたＦＧＦ８又はブラキュリ遺伝子プロモーターを有するｈＥＳＣを構築する。特に本実施例は、ＦＧＦ８調節領域の制御下のレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築を記載する。さらに、ブラキュリ調節領域の制御下のレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築が記載される。本実施例は、1つ又は複数のこれらのベクターでトランスフェクトされた細胞、例えばヒト胚性幹
細胞、並びにそのゲノム中に組み込まれたこれらのレポーターカセットのこの一方又は両方を有する細胞の調製も記載する。
ぞれぞれＦＧＦ８遺伝子又はブラキュリ遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を置くことにより、レポーター遺伝子で遺伝子標識されたＦＧＦ８発現前原始線条細胞株及びブラキュリ発現中内胚葉細胞株を構築する。まず、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clonetech）のＣＭＶプロモーターをヒトＦＧＦ８又はブラキュリ制御
領域で置き換えることにより、ＥＧＦＰ発現がヒトＦＧＦ８又はブラキュリ遺伝子プロモーターにより駆動されるプラスミド構築物を生成する。これらの制御領域はＦＧＦ８又はブラキュリ遺伝子の特性化調節素子を含有し、そしてそれらはトランスジェニックマウスにおけるこれらの遺伝子の正常発現パターンを付与するのに十分である。その結果生じるベクターでは、ＥＦＧＰの発現はＦＧＦ８プロモーター又はブラキュリプロモーターにより駆動される。いくつかの実験では、このベクターはｈＥＳＣ中にトランスフェクトされ得る。
ＦＧＦ８プロモーター／ＥＧＦＰカセット又はブラキュリプロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記ベクターから切り出して、次に、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する選択ベクター中にサブクローニングする。ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位を選択カセットに隣接させて、カセットを除去させる。この選択ベクターを線状化し、次に、標準リポフェクション方法を用いてｈＥＳＣ中に導入する。Ｇ４１８における選択の１０〜１４日後に、未分化トランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離し、展開する。
ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１プロモーターの制御下のＧＦＰ又はＥＧＦＰレポーター遺伝子を含有するベクターも構築され得る、と理解される。さらに、上記の構築物のいずれかにお
いてＧＦＰ又はＥＧＦＰ以外のレポーター遺伝子を用い得るが、但しレポーターはＦＡＣＳにより細胞分離を可能にする、と理解される。
［実施例１３］
前原始線条細胞に富んだ細胞集団の産生
以下の実施例は、ＦＧＦ８プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣが前原始線条細胞に分化し、次にその後、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により単離し得る、ということを実証する。
１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有し、血清を含有しない増殖培地中で約６、１２及び１８時間、ＦＧＦ８プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣを分化させる。次に分化細胞をトリプシン消化により収穫し、ベクトン・ディッキンソンＦＡＣＳ Ｄ
ｉｖａで直接的にＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳ中に選別する。単一生細胞の試料をＥＧＦＰに対するゲーティングを伴わずに採取し、そして単一生細胞をＥＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性集団中に選び出す。別個の実験では、蛍光強度（高及び低）によって、ＥＧＦＰ陽性分画を２つの等サイズの集団に分離する。
選別後、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学の両方により、細胞集団を分析する。Ｑ−ＰＣＲ分析のために、QiagenのＲＮｅａｓｙカラムを用いてＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡに転化する。Ｑ−ＰＣＲを上記と同様に実行する。免疫細胞化学分析のために、細胞をＰＢＳ中に選別し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定して、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機を用いてスライドガラスに接着する。一次抗体はβ−カテニンに対するものである。ＦＩＴＣ（緑色）又はローダミン（赤色）に接合された適切な二次抗体を用いて、一次抗体の結合を検出する。
選別細胞をさらにＱ−ＰＣＲ分析に付す。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＦＧＦ８遺伝子発現との相関を示す。非蛍光細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＦＧＦ８発現レベルの２倍より大きい増大を示す。高及び低ＥＧＦＰ強度細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがＦＧＦ８発現レベルと相関する、ということを示す。ＦＧＦ８マーカー分析のほかに、選別細胞を、核局在化β−カテニン（核β−カテニン）の免疫細胞化学分析に付す。このマーカーの核局在化は、ＥＧＦＰ陽性分画をに富んでいる。逆に、β−カテニンの核局在化は、ＥＧＦＰ陰性分画でほとんど観察されない。
これらの結果が示された場合、選別前に分化細胞培養物中に存在する細胞の少なくとも約５％はＦＧＦ８／核β−カテニン陽性細胞である。選別細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％は、ＦＧＦ８／核β−カテニン陽性前原始線条細胞である。
［実施例１４］
中内胚葉細胞に富んだ細胞集団の産生
以下の実施例は、ブラキュリプロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣが原始線条（中内胚葉）細胞に分化し、次にその後、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により単離し得る、ということを実証する。
１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有し、血清を含有しない増殖培地又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する増殖培地中で約２４時間、ブラキュリプロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣを分化させる。次に分化細胞をトリプシン消化により収穫し、ベクトン・ディッキンソンＦＡＣＳ Ｄｉｖａで直
接的にＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳ中に選別する。単一生細胞の試料をＥＧＦＰに対するゲーティングを伴わずに採取し、そして単一生細胞をＥＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性集団中に選び出す。別個の実験では、蛍光強度（高及び低）によって、ＥＧＦＰ陽性分画を２つ
の等サイズの集団に分離する。
選別後、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学の両方により、細胞集団を分析する。Ｑ−ＰＣＲ分析のために、QiagenのＲＮｅａｓｙカラムを用いてＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡに転化する。Ｑ−ＰＣＲを上記と同様に実行する。免疫細胞化学分析のために、細胞をＰＢＳ中に選別し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定して、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機を用いてスライドガラスに接着する。一次抗体はＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１に対するものである。ＦＩＴＣ（緑色）又はローダミン（赤色）に接合された適切な二次抗体を用いて、一次抗体の結合を検出する。
選別細胞をさらにＱ−ＰＣＲ分析に付す。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ブラキュリ遺伝子発現との相関を示す。非蛍光細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ブラキュリ発現レベルの２倍より大きい増大を示す。高及び低ＥＧＦＰ強度細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがブラキュリ発現レベルと相関する、ということを示す。ブラキュリマーカー分析に加えて、選別細胞を、ＦＧＦ４及びＳＮＡＩ１の免疫細胞化学分析に付す。これらのマーカーはそれぞれ、ＥＧＦＰ陽性分画に富んでいる。逆に、ＦＧＦ４及び／又はＳＮＡＩ１は、ＥＧＦＰ陰性分画でほとんど観察されない。
これらの結果が示された場合、選別前に分化細胞培養物中に存在する細胞の少なくとも約５％はブラキュリ／ＦＧＦ４／ＳＮＡＩ１陽性細胞である。選別細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％は、ブラキュリ／ＦＧＦ４／ＳＮＡＩ１陽性中内胚葉細胞である。
ＥＧＦＰ／ブラキュリ構築物を含むベクターの代替物として、ＦＧＦ４又はＳＮＡＩ１プロモーターの制御下のＧＦＰ又はＥＧＦＰレポーター遺伝子を含むベクターが、本実施例に記載された中内胚葉富化方法に用いられ得る、と理解される。
［実施例１５］
ヒト前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を促進し得る分
化因子の同定
本明細書中に記載される分化因子スクリーニング方法を例示するために、種々の時点で或る特定のマーカー遺伝子産物の正規化発現レベルを測定しながら、本明細書中に記載される方法を用いて産生されるヒト前原始線条細胞及び中内胚葉細胞の集団に、別々にいくつかの候補分化因子を提供する。
ヒト前原始線条細胞及び中内胚葉細胞培養物を、上記実施例に記載したように産生する。要するに、血清を含有しないＲＰＭＡ培地中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、１２時間（前原始線条）又は２４時間（中内胚葉）、ｈＥＳＣ細胞を増殖させた。前原始線条細胞及び中内胚葉細胞の形成後、細胞集団を０．２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で個々のプレート中に保持し、以下の：２０ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３Ｂ、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２又は１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２のうちの１つで処理する。アルブミン、ＰＲＯＸ１及びＴＩＴＥ１に関するマーカー遺伝子産物の発現を、Ｑ−ＰＣＲを用いて定量する。
上記の分子を用いた前原始線条細胞及び中内胚葉細胞のインキュベーションは、前原始線条細胞及び中内胚葉細胞を胚体内胚葉系統由来の細胞に分化させると予測される。
［実施例１６］
初期胚細胞型におけるマーカー発現の要約
本実施例は、ｈＥＳＣの初期分化中に得られる細胞型の同定及び／又は検出に有用なマーカー遺伝子の発現を要約する表を提供する。下記の表１において、各マーカーに関する正
式名及び略号を最初の２つの縦列に提示する。次の縦列の各々は、遺伝子が特定組織型中で発現されるか否かを記載する。細胞型に関する以下の略号を用いる：ＩＣＭ／ＥＳＣはｈＥＳＣを指す；ＰＳは原始線条（中内胚葉）細胞を指す；Ｅｃｔｏは外胚葉細胞を指す；Ｍｅｓｏは中胚葉細胞を指す；ＤＥは胚体内胚葉細胞を指す；ＰｒＥは原始内胚葉を指す；ＶＥは臓側内胚葉を指す；そしてＰＥは壁側内胚葉を指す。
Figure 2020103321
［実施例１７］
前原始線条細胞及び中内胚葉細胞を同定及び／又は検出するために有用な付加的マーカー
本実施例は、前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を同定及び／又は検出するのに有用な付加的マーカーを記載する。本実施例中に記載される前原始線条マーカーは、前原始線条細胞に関する上記のマーカーのいずれかの代わりに又はそのほかに用いられ得る、と理解される。本実施例中に記載される中内胚葉マーカーは、中内胚葉細胞に関する上記のマーカーのいずれかの代わりに又はそのほかに用いられ得る、とも理解される。
前原始線条、中内胚葉への、そしてその後の内胚葉及び中胚葉へのｈＥＳＣ分化のプロセスを調べるために、分化の最初の２４時間後に、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＳＵ５４０２の添加をした場合と添加しない場合とで、低血清（≦２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）及び高アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）下で、短時間増分でのｈＥＳＣ培養物の分化の全体的発現プロファイリングを実行した。２４時間目のアクチビンＡへのＳＵ５４０２の添加は、胚体内胚葉に特有の遺伝子の発現の劇的な減少を生じ、そして中胚葉マーカーの発現を大いに増大する。
細胞分化を媒介するために、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、低血清ＲＰＭＩ倍地中で、４日間、ｈＥＳＣを増殖させた。血清補充は、分化の最初の２４時間は０％（ｖ／ｖ）、２回目の２４時間は０．２％（ｖ／ｖ）、そして３及び４日目は２％（ｖ／ｖ）であった。分化の最初の２４時間後、アクチビンＡのほかにＳＵ５４０２を５μＭで適用することにより、一組の培養物で中胚葉を誘導した。他の組の培養物はアクチビンＡ単独中に存続し、したがって高効率で胚体内胚葉を産生した。０、２、６、２４、３０、４８及び９６時間の時点で、反復実験で試料を採取した。４８及び９６時間点は胚体内胚葉（アクチビンＡ単独）又は中胚葉（アクチビンＡにＳＵ５４０２を伴う）であった。全ＲＮＡを抽出し、Affymetrix高密度オリゴヌクレオチドアレイ（Ｕ１３３プラス２．０）を用いて、全体的発現プロファイリングのためにExpression Analysis（Durham, NC）へ
提出した。
階層的クラスター分析、並びに種々の時点での対合試料の群間の比較分析を用いて、ｈＥＳＣ分化の時間経過中の遺伝子発現パターンを試験した。最初の６時間の間の発現における強い増大と、その後の時点での発現における保持又は減少とにより特性化される発現パターンを示す遺伝子を、その後の前原始線条細胞へのｈＥＳＣの分化に関与する遺伝子として同定した。２４〜３０時間時点で発現のピークを示した遺伝子を、中内胚葉分化に関与する遺伝子として同定した。
下記の表２は、ｈＥＳＣをアクチビンＡと接触後、６時間までに非常に高レベルで発現されたマーカー遺伝子を記載する。これらの遺伝子は、前原始線条細胞を示す。以下の表３は、ｈＥＳＣをアクチビンＡと接触後、約２４〜約３０時間までにピークレベルで発現されたマーカー遺伝子を記載する。これらの遺伝子は、中内胚葉細胞を示す。これらの表の各々において、最初の縦列はプローブセット識別番号を列挙し、そして２番目の縦列はユニジーン識別番号を提示する。ユニジーンデータベースは、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）ウエブサイトを介して公的に利用可能である。したが
って、これらの表中に記載されたマーカー遺伝子のいずれかに関するヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩウエブサイトでの適切なユニジーン識別番号に関する照会により得ることができる。ユニジーンデータベースは、その開示内容が参照により本明細書中に完全に援用される。各表の縦列３は、マーカーの各々に関する一般的に既知の遺伝子記号を提示する。各表の残りの部分は、０、２、６、２４、３０、４８及び９６時間時点での遺伝子発現の相対的レベルを提示する。これらの表中で用いる場合、「ＤＥ」は胚体内胚葉を指し、そして「Ｍ」は中胚葉を指す。
Figure 2020103321
Figure 2020103321
［実施例１８］
前原始線条段階（原始外胚葉細胞）前に胚性幹細胞分化を同定及び／又は検出するために有用なマーカー
本実施例は、前原始線条段階前に幹細胞分化を同定及び／又は検出するのに有用であるマーカーを記載する。このような細胞型は、ここでは、原始外胚葉細胞と呼ぶ。本実施例中に記載される原始外胚葉細胞マーカーは、原始外胚葉細胞組成物と関連付けられ、そして前原始線条細胞及び／又は中内胚葉細胞を産生し、スクリーニングするためにすでに記載した方法で用いられ得る、と理解される。
原始外胚葉へのｈＥＳＣ分化のプロセスを調べるために、実施例１７に記載したように、分化中のｈＥＳＣ培養物の全体的発現プロファイリングを実行した。
下記の表４は、ｈＥＳＣをアクチビンＡと接触後、６時間より前に増大又は減少高レベルで発現されたマーカー遺伝子を記載する。これらの遺伝子は、原始外胚葉細胞を示す。上記の表２及び表３に関して示したのと同様に、表４では、最初の縦列はプローブ組識別番号を列挙し、そして２番目の縦列はユニジーン識別番号を提示する。ユニジーンデータベースは、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）ウエブサイトを
介して公的に利用可能である。したがって、この表中に記載されたマーカー遺伝子のいずれかに関するヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩウエブサイトでの適切なユニジーン識別番号に関する照会により得ることができる。ユニジーンデータベースは、その開示内容が参照により本明細書中に完全に援用される。表４の縦列３は、マーカーの各々に関する一般的に既知の遺伝子記号を提示する。残りの縦列は、０、２、６、２４、３０、４８及び９６時間時点での遺伝子発現の相対的レベルを提示する。この表中で用いる場合、「ＤＥ」は胚体内胚葉を指し、そして「Ｍ」は中胚葉を指す。
表４は、ＦＺＤ１０、ＦＧＦ５及びＯＣＴ４ ｍＲＮＡの発現が、ｈＥＳＣを１００ｎｇ
／ｍｌのアクチビンＡと接触させた後２時間までに実質的にアップレギュレートされる、ということを示す。逆に、ＧＢＸ２、ＺＦＰ４２及びＳＯＸ２ ｍＲＮＡの発現は、アク
チビンＡ処理後２時間までに実質的にダウンレギュレートされる。Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡ
の発現は、アクチビンＡ処理後６時間より前の時点で実質的にアップレギュレートされると予測される。
Figure 2020103321
本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、目下、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及びその他の使用で当業者に思い付かれるものは本発明の精神に包含され、そして開示の範囲により限定される。したがって本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示される発明に種々の置換及び修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。
特許請求の範囲及び本開示全体を通して用いられる場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙した要素に関する開示において特定される活性又は作用を妨害しないか又は関与しない他の要素に限定される。したがって「本質的に〜から成る」という語句は、列挙した要素が必要とされるか又は必須であるが、しかし他の要素は任意であり、それらが列挙した要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かによって、存在することもあり、しないこともあり得る、ということを示す。
［参考文献］
多数の文献及び特許参考文献を、本特許出願中で引用してきた。本特許出願中で引用される各々のそしてすべての参考文献は、その開示内容が参照により本明細書中に完全に援用される。
いくつかの参考文献に関しては、全引用が文書の本文中に存在する。他の参考文献に関しては、文書の本文中における引用は著者及び年で示しているが、全引用を以下に示す：
Figure 2020103321
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Claims (20)

  1. 培地の５％（ｖ／ｖ）未満が血清である、培地及びヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物。
  2. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子のメンバーをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養物。
  3. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢから成る群より選択される、請求項２に記載の細胞培養物。
  4. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、請求項３に記載の細胞培養物。
  5. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡ及びアクチビンＢである、請求項３に記載の細胞培養物。
  6. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡ及びノーダルである、請求項３に記載の細胞培養物。
  7. Ｗｎｔファミリーのメンバーをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  8. ＷｎｔファミリーのメンバーがＷｎｔ３ａである、請求項７に記載の細胞培養物。
  9. 培地の２％（ｖ／ｖ）未満が血清である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  10. 培地の１％（ｖ／ｖ）未満が血清である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  11. 培地の０．５％（ｖ／ｖ）未満が血清である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  12. 血清を含まない培地及びヒト中内胚葉細胞を含む細胞培養物。
  13. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子のメンバーをさらに含む、請求項１２に記載の細胞培養物。
  14. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢから成る群より選択される、請求項１３に記載の細胞培養物。
  15. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、請求項１４に記載の細胞培養物。
  16. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡ及びアクチビンＢである、請求項１４に記載の細胞培養物。
  17. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡ及びノーダルである、請求項１４に記載の細胞培養物。
  18. Ｗｎｔファミリーのメンバーをさらに含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  19. ＷｎｔファミリーのメンバーがＷｎｔ３ａである、請求項１８に記載の細胞培養物。
  20. 中内胚葉細胞がヒト多能性細胞に由来する、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の細胞培養物。
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