JP2020098199A - プローブ、ミトコンドリアの状態判定用キット、ミトコンドリアの状態判定方法及びミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
PKR−like endoplasmic reticulum kinaseのキナーゼインサートのN末端側からC末端側に向かってRSRSFSVで示されるアミノ酸配列における少なくとも1個のリン酸化されたセリン残基を認識して、前記PKR−like endoplasmic reticulum kinaseに結合する。
抗体である、
こととしてもよい。
上記本発明の第1の観点に係るプローブを備える。
細胞において、PKR−like endoplasmic reticulum kinaseのキナーゼインサートのN末端側からC末端側に向かってRSRSFSVで示されるアミノ酸配列における少なくとも1個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップを含む。
褐色脂肪細胞である、
こととしてもよい。
細胞を被験物質に暴露する暴露ステップと、
前記細胞において、PKR−like endoplasmic reticulum kinaseのキナーゼインサートのN末端側からC末端側に向かってRSRSFSVで示されるアミノ酸配列における少なくとも1個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップと、
前記検出ステップの結果に基づいて前記被験物質を選択する選択ステップと、
を含む。
褐色脂肪細胞である、
こととしてもよい。
本実施の形態に係るプローブは、PERKのキナーゼインサートに含まれるリン酸化されたセリン残基を認識して、PERKに結合する。図1は全長1114残基からなるマウスPERKの構造を示す。PERKは、ER内腔に配置されるER内腔領域、膜貫通領域及びキナーゼ領域を含む。キナーゼ領域にはキナーゼインサートが含まれる。上記セリン残基はキナーゼインサートにおける3個のセリン残基である。マウスPERKのアミノ酸配列を配列番号1に示す。マウスPERKの場合、上記の3個のセリン残基は、PERKのN末端側から715、717及び719番目のセリン残基である。
続いて、実施の形態2について説明する。本実施の形態に係るミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法は、暴露ステップと、検出ステップと、選択ステップとを含む。暴露ステップでは、細胞を被験物質に暴露する。例えば、暴露ステップでは、細胞の培地に被験物質を添加すればよい。暴露ステップで用いる細胞は、上記ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法における細胞と同様である。被験物質に暴露する前に、細胞にCCCP又はβ3アドレナリン受容体アゴニスト等で刺激を与えてもよい。被験物質は、特に限定されず、化合物、ペプチド及び核酸等、任意の物質である。検出ステップは、上記ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法における検出ステップと同様である。
ICRマウスの新生仔の褐色脂肪組織から未分化細胞を単離し、8日間培養後(day 0)に分化誘導培地に培地交換し、分化誘導した。分化誘導培地の組成は、20%FBS、20nMインシュリン、1nMトリヨードサイロニン(T3)、5μMデキサメタゾン、0.125mMインドメタシン、0.5mM IBMX及び1μMロシグリタゾンを含むDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)とした。分化誘導から2日後及び4日後に分化増強培地に培地交換し、細胞を維持した。分化増強培地の組成は、20% FBS(ウシ胎児血清)、20nMインシュリン、1nM T3を含むDMEMとした。分化誘導6日目の細胞を成熟褐色脂肪細胞(day 6)とした。
図2(A)及び図2(B)は、それぞれday 0の細胞及びday 6の細胞の電子顕微鏡画像を示す。観察像中の点線はミトコンドリア−ER近接領域である。図2(C)は、26枚の観察像におけるミトコンドリア−ER近接領域の長さの平均値を示す。分化誘導に伴ってミトコンドリア−ER近接領域の長さが有意に長くなる、すなわちミトコンドリアとERとが近接することが示された(t検定、n=3)。
未分化細胞(day −2)を24ウェルプレートに0.5×105細胞/ウェルで播種し、2日後(day 0)に分化誘導培地に培地交換することで分化誘導し、4日後(day 2)及び6日後(day 4)に分化増強培地に培地交換した。分化誘導2日目(day 2)の分化増強培地への培地交換前及び培地交換してから6時間後及び12時間後に細胞を回収した。
図4は、day 2の分化増強培地への培地交換前(0hr)及び培地交換してから6時間後(6hr)及び12時間後(12hr)の細胞におけるPERK、IRE1α及びGRP78のバンドを示す。PERKでは高分子量側にシフトしたバンドが見られた。これにより、分化過程においてPERKがリン酸化されていることが示された。ERには3つのセンサータンパク質(PERK、IRE1α及びATF6)があり、いずれもER膜貫通型である。IRE1α及びATF6の下流で発現誘導されるGRP78に関してはバンドに変化が見られなかった。このことから、分化過程におけるリン酸化は、PERKに特異的であることが示唆された。
試験例2と同様にday −2において未分化細胞にコントロールとしての標的のないsiRNA(Stealth RNAi(商標) Negative Control Medium GC Duplex、Invitrogen社製、以下「sictrl」ともいう)又はsiPERK(MSS203821、Invitrogen社製(配列番号5))を導入後、分化誘導し、day 6まで培養した。試験例1と同様に、細胞を固定、染色し、電子顕微鏡で観察した。平行で密度の大きいクリステの構造を有するミトコンドリアを発達したミトコンドリアとして、計数した。
図6(A)及び(B)は、それぞれsictrl及びsiPERKを導入した細胞の電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは2μmを示す。図6(C)及び(D)は、それぞれ図5(A)及び(B)の白枠で囲った部分の拡大像を示す。図6(E)は、細胞あたりの発達したミトコンドリアの割合を示す。当該割合は、50細胞の平均値である。PERKの発現を抑制すると、正常なミトコンドリアで見られる平行で密度の大きいクリステの割合が減少し、異常な形態のクリステの割合が増加した。分化誘導した細胞におけるミトコンドリアの発達にはPERKが重要であることが示された。
試験例2と同様にday −2において未分化細胞にsictrl又はsiPERK(MSS203821)を導入後、分化誘導し、0、2、4、6日目に細胞を回収した。試験例2と同様の方法で、ミトコンドリア、熱産生関連タンパク質及びERストレス関連タンパク質についてウエスタンブロッティング解析を行った。
図7に示すように、分化過程におけるPERKの発現抑制によって、主にミトコンドリア内膜を構成するタンパク質及び熱産生に関連するUCP1の発現が低下した。
試験例2と同様にday −2において未分化細胞にsictrl又はsiPERK(MSS203821)を導入後、分化誘導し、0、2、4、6日目に細胞を回収した。回収した細胞を、1μg/mLオリゴマイシン Aで45分間処理又は無処理後、PBSで洗浄し、500μLのATP assay buffer(100mM Tris−HCl pH7.5、4mM EDTA pH7.5)を加え、回収した。細胞懸濁液を98℃で3分間ボイルし、4℃、15000rpmで1分間遠心後に上清を回収した。上清中のATPは、ATP Bioluminescence Assay Kit HS II(Roche社製)を用いて測定した。オリゴマイシン Aで処理しなかった無処理群の細胞内のATP量を細胞内の総ATP量とし、処理群を解糖系依存的なATP産生量とした。ミトコンドリアでの酸化的リン酸化依存的なATP産生量は、細胞内の総ATP量と解糖系依存的なATP産生量の測定値とから算出した。
図8に示すように、sictrlを導入した細胞では、分化誘導に伴って酸化的リン酸化依存的なATP産生量の割合が増加した。一方、PERKの発現を抑制することで、酸化的リン酸化依存的なATP産生量の割合が増加しなかった。このことから、PERKが分化過程におけるミトコンドリアでの酸化的リン酸化によるATP産生に関与することが示された。
試験例2で示されたERストレス非依存的にリン酸化されるセリン残基の予想部位は、図1に示すキナーゼインサート内の3個のセリン残基である(N末端側から715、717及び719番目)。そこで、リン酸化された715、717及び719番目のセリン残基を含む13個のアミノ酸からなるペプチド(配列番号3)を抗原として抗体(pPERK(3S)抗体)を作製した。pPERK(3S)抗体の作製では、ウサギに上記ペプチドをアジュバントとともに4回皮内注射することで感作させ、9週後に全採血し、上記ペプチドによりaffinity精製した後、上記ペプチドと同じアミノ酸配列で、かつ3個のセリン残基がリン酸化されていないペプチドにより吸収作業を行った。
図9はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。PERKは、CCCPによるミトコンドリアストレスによってリン酸化され、当該リン酸化を示すバンドをpPERK(3S)抗体で検出できた。siPERKでPERKをノックダウンした細胞にPERK−ΔLD−KAを発現させた細胞でもpPERK(3S)抗体でバンドを検出できた。これにより、ミトコンドリアストレスによるERストレス非依存的なPERKのリン酸化をpPERK(3S)抗体で検出できることが示された。
day −2の未分化細胞にsictrl又はsiPERK(MSS203819)を導入し、24時間後(day −1)にレトロウイルスを用いて、Venus−FLAG、PERK−ΔLD又はPERK−ΔLD−3SAを発現させ、分化誘導を行った。分化誘導2日目に分化増強培地に培地交換し、12時間後に細胞を回収した。回収した細胞を試験例2と同様の方法で、ウエスタンブロッティング解析へと供した。
図10はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ER内腔領域の欠失によって、PERKのリン酸化は影響を受けなかった(“PERK”参照)。pPERK(3S)抗体によって、褐色脂肪細胞の分化における3個のセリン残基の少なくとも1つのリン酸化がPERK及びPERK−ΔLDで検出できたが、PERK−ΔLD−3SAでは、検出されなかった。pPERK(3S)抗体によって、褐色脂肪細胞の分化においてPERKのキナーゼインサート内が生理的にリン酸化されることが示された。
day −2の未分化細胞にsiPERK(MSS203819)を導入し、day −1においてPERK−ΔLD−KA又はPERK−ΔLD−3SAを発現させ、分化誘導を行った。
図11はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。PERK−ΔLD−KAを発現させた細胞では、CL316,243による刺激によって3個のセリン残基のリン酸化が誘導された。一方、PERK−ΔLD−3SAを発現させた細胞では、pPERK(3S)抗体でバンドが検出されないことを確認した。これにより、β3アドレナリン受容体の刺激によって、ERストレス非依存的にPERKがリン酸化されることが示された。
6ウェルプレートに10%FBSを含んだDMEMで維持したHeLa細胞を2.0×105細胞/ウェルで播種し12〜16時間後に、PERK−ΔLD−KAをコードする遺伝子を0.5μg/ウェルで導入した。遺伝子導入から24時間後に、コラーゲンコートしたカバーガラスを1枚入れた24ウェルプレートに細胞を0.5×105細胞/ウェルで播種し、24時間後にグルコースフリー培地(10%FBS、1mM ピルビン酸ナトリウム、10mMガラクトースを含んだグルコース不含DMEM)に培地交換した。培地交換から24時間後、細胞を10μM CCCPで1時間刺激し、PBSで2回洗浄し、4%パラフォルムアルデヒドにて固定した。
図12(A)はCCCPで刺激しなかった細胞の顕微鏡画像を示す。CCCPによる刺激がない場合、PLAシグナルは検出されなかった。図12(B)はCCCPで刺激した細胞の顕微鏡画像を示す。pPERK(3S)抗体によって、CCCP刺激によるERストレス非依存的なPERKのリン酸化を検出することができた。
ドットブロット法でPERK3Sのリン酸化誘導因子、すなわちミトコンドリア機能改善剤を同定するためのアッセイ系を構築した。35mmディッシュに10%FBSを含むDMEMで維持したPERK−FLAG−ノックインHEK293細胞を1×106細胞播種した。PERK−FLAG−ノックインHEK293細胞における細胞内因性PERKのC末端には、3×FLAGタグが付加されている。3×FLAGタグのアミノ酸配列及び3×FLAGタグをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号6及び配列番号7に示す。
図13に示すように、無刺激の細胞(レーン1)又はグルコース不含培地に順化させた細胞(レーン2)ではpPERK(3S)抗体によるシグナルが検出されなかった。一方、CCCPで刺激した細胞(レーン3)では、pPERK(3S)抗体による明確なシグナルが検出された。CCCPの代わりに被験物質を作用させてpPERK(3S)抗体のシグナルを検出することで、当該被験物質をPERK3Sのリン酸化誘導因子又はミトコンドリア機能改善剤として同定できる。
β3アドレナリン受容体刺激時の熱産生におけるPERKの機能を解析した。day −2において、sictrl又はsiPERK(MSS203819)を未分化細胞に導入した。24時間後のsiPERK細胞にレトロウイルスを用いて、PERK−ΔLD又はPERK−ΔLD−3SAを発現させ、分化誘導を行った。day 5まで培養し、ガラスボトムディッシュに細胞を播種した。24時間後(day 6)、細胞をPBSで1回、0.5%グルコース溶液で1回洗浄し、温度センサープローブ溶液(0.04%Cellular Thermoprobe for Fluorescence(フナコシ社製)、5%グルコース)を10分間遮光しながら室温に静置することでプローブを細胞に取り込ませた。
図14は、各細胞の蛍光強度を示す。sictrlで確認されたCL316,243刺激による細胞内温度の上昇がPERKの発現を抑制することで抑制された(siPERK)。PERKの発現抑制によって上昇が抑制された細胞内温度は、外因性のPERK−ΔLDの発現で上昇したが(siPERK+PERK−ΔLD)、PERK−ΔLD−3SAではほとんど上昇しなかった(siPERK+PERK−ΔLD−3SA)。本試験例の結果及び試験例4の結果によって、PERKのキナーゼインサート内の3個のセリン残基のリン酸化によって制御されるミトコンドリア発生が熱産生に必須であることが示された。
Claims (7)
- PKR−like endoplasmic reticulum kinaseのキナーゼインサートのN末端側からC末端側に向かってRSRSFSVで示されるアミノ酸配列における少なくとも1個のリン酸化されたセリン残基を認識して、前記PKR−like endoplasmic reticulum kinaseに結合する、
プローブ。 - 抗体である、
請求項1に記載のプローブ。 - 請求項1又は2に記載のプローブを備える、
ミトコンドリアの状態判定用キット。 - 細胞において、PKR−like endoplasmic reticulum kinaseのキナーゼインサートのN末端側からC末端側に向かってRSRSFSVで示されるアミノ酸配列における少なくとも1個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップを含む、
ミトコンドリアの状態判定方法。 - 前記細胞は、
褐色脂肪細胞である、
請求項4に記載のミトコンドリアの状態判定方法。 - 細胞を被験物質に暴露する暴露ステップと、
前記細胞において、PKR−like endoplasmic reticulum kinaseのキナーゼインサートのN末端側からC末端側に向かってRSRSFSVで示されるアミノ酸配列における少なくとも1個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップと、
前記検出ステップの結果に基づいて前記被験物質を選択する選択ステップと、
を含む、ミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法。 - 前記細胞は、
褐色脂肪細胞である、
請求項6に記載のミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法。
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