JP2020092700A

JP2020092700A - Method for producing liver organoid, culture medium for production of liver organoid, liver organoid, cell preparation, and method of evaluating test substance

Info

Publication number: JP2020092700A
Application number: JP2019215543A
Authority: JP
Inventors: 範生増田; Norio Masuda; 俊朗佐藤; Toshiaki Sato
Original assignee: JSR Corp; Keio University
Current assignee: JSR Corp; Keio University
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-06-18

Abstract

To provide a method for producing a liver organoid with a high expression level of albumin.SOLUTION: A method for producing a liver organoid includes a differentiation step in which a liver cell aggregate is cultured in a culture medium for differentiation that contains at least one selected from the group consisting of ROCK inhibitor and YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide, to obtain a liver organoid.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、肝臓オルガノイドの製造方法、肝臓オルガノイド製造用培地、肝臓オルガノイド、細胞製剤、及び被験物質の評価方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a liver organoid, a medium for producing a liver organoid, a liver organoid, a cell preparation, and a test substance evaluation method.

医薬品開発の薬物動態試験において、げっ歯類を用いたインビボ試験や、げっ歯類由来の初代（凍結）肝細胞を用いたインビトロ試験が行われている。しなしながら、種差があるためヒト特異的に発生する毒性を予測することが困難である。一方、ヒト初代（凍結）肝細胞ではロット間差が大きく、良質の肝細胞を安定して入手することが難しい。また、ＨｅｐＧ２細胞等のヒト由来の肝癌細胞株はシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の活性が低く、ＣＹＰによる代謝に関連した毒性を評価できない。そのためより安定に使用できるヒト由来の肝細胞が必要とされている。 In pharmacokinetic tests for drug development, in vivo tests using rodents and in vitro tests using primary (frozen) hepatocytes derived from rodents have been performed. However, it is difficult to predict human-specific toxicity due to species differences. On the other hand, human primary (frozen) hepatocytes have large lot-to-lot differences, making it difficult to stably obtain good quality hepatocytes. In addition, human-derived hepatoma cell lines such as HepG2 cells have low cytochrome P450 (CYP) activity, and toxicity related to metabolism by CYP cannot be evaluated. Therefore, there is a need for human-derived hepatocytes that can be used more stably.

肝臓オルガノイドは２０１３年にＨａｎｓＣｌｅｖｅｒｓらによって樹立された。この肝臓オルガノイドは、医薬品開発のための安定した肝細胞供給源として期待される（特許文献１〜特許文献４を参照）。 Liver organoids were established in 2013 by Hans Cleavers et al. This liver organoid is expected as a stable hepatocyte source for drug development (see Patent Documents 1 to 4).

特表２０１３−５３５２０１号公報Japanese Patent Publication No. 2013-535201 国際公開第２０１３／１８３５７１号International Publication No. 2013/183571 米国特許出願公開第２０１７／０１９１０３１号明細書U.S. Patent Application Publication No. 2017/0191031 米国特許出願公開第２０１６／０２６６０９６号明細書U.S. Patent Application Publication No. 2016/0266096

Liao J. K., et al, Rho Kinase (ROCK) Inhibitors, J Cardiovasc Pharmacol., 50 (1), 17-24, 2007.Liao J. K., et al, Rho Kinase (ROCK) Inhibitors, J Cardiovasc Pharmacol., 50 (1), 17-24, 2007. Dupont S., et al, Role of YAP/TAZ in mechanotransduction, Nature, 474(7350), 179-183, 2011.Dupont S., et al, Role of YAP/TAZ in mechanotransduction, Nature, 474(7350), 179-183, 2011.

本発明は、アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドの製造方法を提供することが課題である。 An object of the present invention is to provide a method for producing a liver organoid excellent in the expression amount of albumin.

本発明は以下の実施形態を含む。
［１］肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドを得る分化工程を含む、肝臓オルガノイドの製造方法。
［２］前記分化工程において、前記肝臓細胞凝集塊と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、［１］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［３］前記分化用培地中に含まれる前記ジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、［１］又は［２］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［４］前記分化用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［５］前記分化用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［６］前記分化用培地が、さらに、ＤＡＰＴ、ジベンザゼピン、ベンゾジアゼピン、及びＬＹ−４１１５７５からなる群より選択される少なくとも１種のＮｏｔｃｈ阻害剤を含有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［７］前記分化用培地が、さらに、デキサメタゾンを含有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［８］前記分化工程の前に、さらに、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地中で培養し、前記肝臓細胞凝集塊を得る増殖工程を有する、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［９］前記増殖用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、［８］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１０］前記増殖用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、［８］又は［９］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１１］前記増殖用培地が、さらに、ニコチンアミドを含有する、［８］〜［１０］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１２］前記増殖用培地が、さらに、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ、及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種のＷｎｔアゴニストを含有する、［８］〜［１１］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１３］前記増殖用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、［８］〜［１２］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１４］前記増殖用培地が、さらに、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質、からなる群より選択される少なくとも１種のＢＭＰ阻害剤を含有する、［８］〜［１３］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１５］ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイド製造用培地。
［１６］［１］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法により製造された、肝臓オルガノイド。
［１７］上皮肝幹細胞を培養して得られる肝臓オルガノイドであって、アルブミンの発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のアルブミンの発現量に対して、２倍〜１０００倍である肝臓オルガノイド。
［１８］ＣＹＰ２Ｃ１９の発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のＣＹＰ２Ｃ１９の発現量に対して、５０％〜２００％である、［１７］に記載の肝臓オルガノイド。
［１９］［１６］〜［１８］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドを含有する細胞製剤。
［２０］［１６］〜［１８］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドに被験物質を接触させる工程、前記被験物質に対する前記肝臓オルガノイドの代謝能を評価する工程、を含む前記被験物質の評価方法。 The present invention includes the following embodiments.
[1] A differentiation step of culturing a liver cell aggregate in a differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide to obtain a liver organoid. A method for producing a liver organoid, comprising:
[2] The method for producing a liver organoid according to [1], wherein in the differentiation step, the hepatic cell aggregate is brought into contact with the extracellular matrix and cultured.
[3] The method for producing a liver organoid according to [1] or [2], wherein the volume fraction of the dimethyl sulfoxide contained in the differentiation medium is 0.1% by volume or more.
[4] The liver according to any one of [1] to [3], wherein the differentiation medium further contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, HGF, and IGF. A method for producing an organoid.
[5] The differentiation medium further comprises at least one TGF-β inhibitor selected from the group consisting of A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY3644947, SD-208, and SJN2511. The method for producing a liver organoid according to any one of [1] to [4], which comprises an agent.
[6] Any one of [1] to [5], wherein the differentiation medium further contains at least one Notch inhibitor selected from the group consisting of DAPT, dibenzazepine, benzodiazepine, and LY-411575. A method for producing the described liver organoid.
[7] The method for producing a liver organoid according to any one of [1] to [6], wherein the differentiation medium further contains dexamethasone.
[8] Prior to the differentiation step, epithelial hepatic stem cells are further cultured in a growth medium containing at least one selected from the group consisting of ROCK inhibitors and YAP inhibitors, and dimethyl sulfoxide. The method for producing a liver organoid according to any one of [1] to [7], which comprises a proliferation step of obtaining the liver cell aggregate.
[9] The method for producing a liver organoid according to [8], wherein the volume fraction of dimethyl sulfoxide contained in the growth medium is 0.1% by volume or more.
[10] Production of the liver organoid according to [8] or [9], wherein the growth medium further contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, HGF, and IGF. Method.
[11] The method for producing a liver organoid according to any of [8] to [10], wherein the growth medium further contains nicotinamide.
[12] The growth medium further contains at least one Wnt agonist selected from the group consisting of Wnt family members, R-spondins 1 to 4, Norrin, and a GSK inhibitor, [8] to [8] [11] The method for producing a liver organoid according to any one of [11].
[13] The growth medium further comprises at least one TGF-β inhibitor selected from the group consisting of A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY3644947, SD-208, and SJN2511. The method for producing a liver organoid according to any one of [8] to [12], which comprises an agent.
[14] [8] to [13], wherein the growth medium further contains at least one BMP inhibitor selected from the group consisting of Noggin, DAN, and a DAN-like protein containing Cerberug and Gremlin. 8. The method for producing a liver organoid according to any one of 1.
[15] A medium for producing a liver organoid, comprising at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide.
[16] A liver organoid produced by the production method according to any one of [1] to [14].
[17] A liver organoid obtained by culturing epithelial hepatic stem cells, wherein the expression level of albumin is 2 to 1000 times higher than the expression level of albumin in the tissue piece containing the epithelial hepatic stem cells. ..
[18] The liver organoid according to [17], wherein the expression level of CYP2C19 is 50% to 200% of the expression level of CYP2C19 in the tissue piece containing the epithelial hepatic stem cells.
[19] A cell preparation containing the liver organoid according to any of [16] to [18].
[20] A method of evaluating the test substance, which comprises a step of bringing the test substance into contact with the liver organoid according to any of [16] to [18], and a step of evaluating the metabolic ability of the liver organoid to the test substance.

本発明は以下の実施形態を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］肝臓細胞塊の製造方法であって、肝臓オルガノイドを分化用培地中で分化させ、肝臓細胞塊を得る分化工程を含み、前記分化用培地が、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、製造方法。
［Ｐ２］前記分化工程において、前記肝臓オルガノイドと細胞外マトリックスとを接触させて培養する、［Ｐ１］に記載の製造方法。
［Ｐ３］前記分化用培地が、前記分化用培地を１００体積％として、前記ジメチルスルフォキシドを０．１体積％以上含む、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の製造方法。
［Ｐ４］前記分化用培地が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ及びＩＧＦからなる群より選択される成長因子；Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択されるＴＧＦ−β阻害剤；ＤＡＰＴ、ジベンザゼピン（ＤＢＺ）、ベンゾジアゼピン（ＢＺ）及びＬＹ−４１１５７５からなる群より選択されるＮｏｔｃｈ阻害剤；及び、デキサメタゾン；からなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ１］〜［Ｐ３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ５］前記分化用培地が、ガストリン、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、及び、Ｎ−アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ１］〜［Ｐ４］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ６］前記分化工程の前に、増殖用培地中で肝臓オルガノイドを増殖させる増殖工程を更に含み、前記増殖用培地が、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、［Ｐ１］〜［Ｐ５］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ７］前記増殖工程において、前記肝臓オルガノイドと細胞外マトリックスとを接触させて培養する、［Ｐ６］に記載の製造方法。
［Ｐ８］前記増殖用培地が、前記増殖用培地を１００体積％として、前記ジメチルスルフォキシドを０．１体積％以上含む、［Ｐ６］又は［Ｐ７］に記載の製造方法。
［Ｐ９］前記増殖用培地が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ及びＩＧＦからなる群より選択される成長因子；ニコチンアミド；Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択されるＷｎｔアゴニスト；Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択されるＴＧＦ−β阻害剤；及び、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質からなる群より選択されるタンパク質からなる群より選択されるＢＭＰ阻害剤；からなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ６］〜［Ｐ８］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１０］前記増殖用培地が、ガストリン、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、及び、Ｎ−アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ６］〜［Ｐ９］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１１］前記増殖工程を開始してから少なくとも１日後に前記分化工程を開始する、［Ｐ６］〜［Ｐ１０］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１２］前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ、Ｙ３９９８３、Ｗｆ−５３６、ＳＬｘ−２１１９、Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ、ＤＥ−１０４、Ｈ−１１５２Ｐ、ＲＯＫα ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＸＤ−４０００、ＨＭＮ−１１５２、４−（１−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ、Ｒｈｏｓｔａｉｎ、ＢＡ−２１０、ＢＡ−２０７、Ｋｉ−２３０９５及びＶＡＳ−０１２からなる群より選択され、前記ＹＡＰ阻害剤が、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ、Ｃ３、ＣＡ３、（Ｒ）−ＰＦＩ２ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｕｐｅｒ−ＴＤＵ及びＹＡＰ−ＴＥＡＤＩｎｈｉｂｉｔｅｒ１からなる群より選択される、［Ｐ１］〜［Ｐ１１］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１３］ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイドを肝臓細胞塊に分化誘導するための分化用培地。
［Ｐ１４］ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイドを増殖させるための増殖用培地。
［Ｐ１５］［Ｐ１］〜［Ｐ１２］のいずれかに記載の製造方法により製造された、肝臓細胞塊。
［Ｐ１６］２００,０００個／ｍＬ以上の密度で容器に収容された、肝臓細胞塊。
［Ｐ１７］［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の肝臓細胞塊からなる細胞製剤。
［Ｐ１８］被験物質の存在下で［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の肝臓細胞塊を培養する工程と、前記肝臓細胞塊の応答を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法。
［Ｐ１９］［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の前記肝臓細胞塊に被験物質を作用させる工程と、前記肝臓細胞塊の応答を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法。 It can be said that the present invention includes the following embodiments.
[P1] A method for producing a liver cell mass, comprising a differentiation step of differentiating a liver organoid in a differentiation medium to obtain a liver cell mass, wherein the differentiation medium comprises a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor A manufacturing method comprising at least one selected from the above and dimethylsulfoxide.
[P2] The production method according to [P1], wherein in the differentiation step, the liver organoid and the extracellular matrix are contacted and cultured.
[P3] The production method according to [P1] or [P2], wherein the differentiation medium contains 0.1% by volume or more of the dimethyl sulfoxide, with the differentiation medium being 100% by volume.
[P4] From the A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY3664947, SD-208 and SJN2511, wherein the differentiation medium is a growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, HGF and IGF. A TGF-β inhibitor selected from the group consisting of: DAPT, dibenzazepine (DBZ), a benzodiazepine (BZ) and a Notch inhibitor selected from the group consisting of LY-411575; and dexamethasone; The manufacturing method in any one of [P1]-[P3] which further contains one.
[P5] The medium for differentiation according to any one of [P1] to [P4], further including at least one selected from the group consisting of gastrin, B27 supplement, N2 supplement, and N-acetylcysteine. Production method.
[P6] Prior to the differentiation step, a growth step of growing a liver organoid in a growth medium is further included, wherein the growth medium is at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, And the manufacturing method in any one of [P1]-[P5] containing dimethyl sulfoxide.
[P7] The production method according to [P6], wherein in the proliferation step, the liver organoid and the extracellular matrix are contacted and cultured.
[P8] The production method according to [P6] or [P7], wherein the growth medium contains 0.1% by volume or more of the dimethyl sulfoxide, with 100% by volume of the growth medium.
[P9] The growth medium is selected from the group consisting of growth factors selected from the group consisting of EGF, FGF, HGF and IGF; nicotinamide; Wnt family members, R-spondins 1-4, Norrin and GSK inhibitors. Wnt agonist; A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY3664947, SD-208 and SJN2511, a TGF-β inhibitor selected from the group; and Noggin, DAN, and Cerberug and Any of [P6] to [P8], further comprising at least one selected from the group consisting of a BMP inhibitor selected from the group consisting of proteins selected from the group consisting of DAN-like proteins containing Gremlin; The manufacturing method described.
[P10] The growth medium further contains at least one selected from the group consisting of gastrin, B27 supplement, N2 supplement, and N-acetylcysteine, [P6] to [P9]. Production method.
[P11] The production method according to any one of [P6] to [P10], wherein the differentiation step is started at least one day after the proliferation step is started.
[P12] The ROCK inhibitor is Y-27632, Fasudil, Y39983, Wf-536, SLx-2119, Azabenzimidazole-aminofurazans, DE-104, H-1152P, ROKα inhibitor, XD-4000, HMN-1152, 4-. (1-aminoalkyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexane-carboxamides, Rhostain, BA-210, BA-207, Ki-23095 and VAS-012, and the YAP inhibitor is Verteporfin, C3. , CA3, (R)-PFI 2 hydrochloride, Super-TDU, and YAP-TEAD Inhibitor 1, the production method according to any one of [P1] to [P11].
[P13] A differentiation medium for inducing differentiation of a liver organoid into a liver cell mass, which comprises at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide.
[P14] A growth medium for growing a liver organoid, which contains at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide.
[P15] A liver cell mass produced by the production method according to any one of [P1] to [P12].
[P16] A liver cell mass stored in a container at a density of 200,000 cells/mL or more.
[P17] A cell preparation comprising the liver cell mass according to [P15] or [P16].
[P18] A method for evaluating a test substance, comprising the step of culturing the liver cell mass according to [P15] or [P16] in the presence of the test substance, and the step of evaluating the response of the liver cell mass.
[P19] A method for evaluating a test substance, comprising: a step of causing a test substance to act on the liver cell mass according to [P15] or [P16]; and a step of evaluating a response of the liver cell mass.

本発明の実施形態によれば、アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドを製造することができる。 According to the embodiment of the present invention, it is possible to produce a liver organoid excellent in the expression amount of albumin.

以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by showing embodiments, but the present invention is not limited to the following embodiments.

本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種を単独で用いることができ、または２種以上を併用して用いることができる。 Unless otherwise specified, each component exemplified in the present specification, for example, a component contained in a medium or a component used in each step can be used alone or in combination of two or more. Can be used.

本明細書で、「Ａ〜Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義である。また、本明細書で、「Ａ〜Ｂ、好ましくはａ〜ｂ」等との数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」、「Ａ以上、ｂ以下」、「ａ以上、Ｂ以下」、及び「ａ以上、ｂ以下」と同義である。 In the present specification, a notation representing a numerical range such as “A to B” is synonymous with “A or more and B or less”. Further, in the present specification, a notation indicating a numerical range such as "A to B, preferably a to b" is "A or more and B or less", "A or more and b or less", "a or more and B or less". And “a or more and b or less”.

本明細書において、「物質Ｘを含む培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地、外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないものとする。 In the present specification, the term “medium containing substance X” and “in the presence of substance X” mean a medium containing an exogenous substance X, a medium containing an exogenous substance X, or an exogenous substance X. Means the presence of substance X. That is, when a cell or tissue present in the medium expresses, secretes or produces the substance X endogenously, the endogenous substance X is distinguished from the exogenous substance X, and the exogenous substance X is A medium not containing X does not fall under the category of "medium containing substance X" even if it contains an endogenous substance X.

［肝臓オルガノイドの製造方法］
本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法は、肝臓細胞凝集塊をＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養する分化工程を有する。 [Method for producing liver organoid]
The method for producing a liver organoid of the present embodiment is a method in which a liver cell aggregate is cultured in a differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide. Have steps.

本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法は、分化工程の前に、さらに、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地で培養し、肝臓細胞凝集塊を得る増殖工程を有することができる。増殖工程を行うことで、分化工程で用いる肝臓細胞凝集塊を得ることができる。 The method for producing a liver organoid of the present embodiment further comprises, prior to the differentiation step, at least one epithelial hepatic stem cell selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide. It may have a growth step of culturing in a growth medium to obtain liver cell aggregates. By performing the proliferation step, the liver cell aggregate used in the differentiation step can be obtained.

肝臓細胞凝集塊は市販されたものであってもよく、例えば、商品名「ＭｏｕｓｅＨｅｐａｔｉｃＯｒｇａｎｏｉｄｓ」（カタログ番号「＃７０９３２」、ステムセルテクノロジーズ社）が挙げられる。 The liver cell aggregate may be commercially available, and examples thereof include trade name “Mouse Hepatic Organoids” (catalog number “#70932”, Stem Cell Technologies).

細胞凝集塊とは２個以上の細胞が接着して形成された凝集塊を示す。本実施形態の肝臓オルガノイドも細胞凝集塊の一形態である。また、肝臓オルガノイドとは、肝臓組織に解剖学的に近い構造を有する培養物を示す。 The cell aggregate refers to an aggregate formed by adhering two or more cells. The liver organoid of the present embodiment is also a form of cell aggregate. The liver organoid refers to a culture having a structure that is anatomically similar to liver tissue.

本明細書において、「分化させる」、「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本実施形態の製造方法では肝臓細胞凝集塊を肝臓オルガノイドへと分化誘導する。 As used herein, the terms “differentiate” and “differentiate” refer to act to differentiate along a specific cell lineage. In the production method of the present embodiment, differentiation of liver cell aggregates into liver organoids is induced.

〈分化工程〉
分化工程では、肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドへ分化させる。培養は、通常、浮遊培養が好ましい。分化工程の培養期間は、通常、５日間〜１５日間、好ましくは７日間〜１２日間である。 <Differentiation process>
In the differentiation step, the liver cell aggregate is cultured in a differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide to differentiate into a liver organoid. The culture is preferably a suspension culture. The culture period of the differentiation step is usually 5 to 15 days, preferably 7 to 12 days.

分化工程では、肝臓細胞凝集塊と細胞外マトリックス（以下、「ＥＣＭ」ともいう）とを接触させて培養することが好ましい。肝臓オルガノイドと溶解させたＥＣＭとを混合し、ＥＣＭをゲル化させた後に、ゲル化したＥＣＭに分化用培地を重層して培養してもよい。本明細書では、肝臓オルガノイドを含む重合したＥＣＭに、分化用培地を重層して培養する態様を含めて、肝臓オルガノイドを分化用培地で培養することを「分化用培地中で培養する」と表現する。 In the differentiation step, it is preferable that the liver cell aggregate and the extracellular matrix (hereinafter, also referred to as “ECM”) are brought into contact with each other and cultured. The liver organoid and the dissolved ECM may be mixed to gelate the ECM, and the gelled ECM may be overlaid with a differentiation medium and cultured. In the present specification, culturing a liver organoid in a differentiation medium, including a mode of culturing by superimposing a differentiation medium on a polymerized ECM containing a liver organoid, is expressed as "culturing in a differentiation medium". To do.

ＥＣＭとしては、少なくとも２種類を含むＥＣＭが好ましい。例えば、コラーゲン及びラミニンを含むＥＣＭが挙げられる。ＥＣＭとしては、合成ＥＣＭ、天然ＥＣＭが挙げられる。ＥＣＭとしては、ラミニン、エンタクチン及びコラーゲンＩＶを含む、マトリゲル（登録商標）（ＢＤバイオサイエンス社）が好ましい。細胞外マトリックス材料は、細胞培養容器の上にコーティングされた状態のもの、及び溶解状態のものが挙げられる。 As the ECM, an ECM containing at least two types is preferable. For example, ECM containing collagen and laminin is mentioned. Examples of ECM include synthetic ECM and natural ECM. As the ECM, Matrigel (registered trademark) (BD Biosciences) containing laminin, entactin and collagen IV is preferable. Extracellular matrix materials include those coated on the cell culture vessel and those dissolved.

《分化用培地》
分化用培地は、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含有する。分化用培地には、さらに、細胞外マトリクスを含有することができる。分化用培地は、通常、基礎培地に、各種成分を添加して調製する。 <Differentiation medium>
The differentiation medium contains at least one selected from the group consisting of ROCK inhibitor and YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide. The differentiation medium may further contain an extracellular matrix. A differentiation medium is usually prepared by adding various components to a basal medium.

基本培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地（ＭＥＭ）、ノックアウト−ＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、グラスゴー基本培地（Ｇ−ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／ハムＦ１２、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、１９９培地、及びＲＰＭＩ１６４０培地等を挙げることができる。 As the basal medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), basal medium (MEM), knockout-DMEM (KO-DMEM), Glasgow basal medium (G-MEM), Eagle basal medium (BME), DMEM/Ham F12, Examples include Advanced DMEM/Ham's F12, Iscove's modified Dulbecco's medium, Ham's F-10, Ham's F-12, 199 medium, RPMI1640 medium and the like.

基本培地としては、グルタミン、インシュリン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びトランスフェリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０；無血清培養に最適化され、インシュリンを既に含んでいるＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２；及びＡｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩ；が好ましい。ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２、及びＡｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩ培地には、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加することが好ましい。 As a basal medium, DMEM/F12 containing glutamine, insulin, penicillin/streptomycin, and transferrin, RPMI1640; Advanced DMEM/F12 optimized for serum-free culture and already containing insulin; and Advanced RPMI; are preferable. Glutamine and penicillin/streptomycin are preferably added to the Advanced DMEM/F12 and the Advanced RPMI medium.

ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６−５０−７）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＣＡＳ番号：１０５６２８−０７−７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１−２６−６）、Ｗｆ−５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７−６４−２）、ＳＬｘ−２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７−８７−３）、Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ（ＣＡＳ番号：８５０６６４−２１−０）、ＤＥ−１０４（非特許文献１参照）、Ｈ−１１５２Ｐ（非特許文献１参照）、ＲＯＫα ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（非特許文献１参照）、ＸＤ−４０００（非特許文献１参照）、ＨＭＮ−１１５２（非特許文献１参照）、４−（１−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ（非特許文献１参照）、Ｒｈｏｓｔａｉｎ（非特許文献１参照）、ＢＡ−２１０（非特許文献１参照）、ＢＡ−２０７（非特許文献１参照）、Ｋｉ−２３０９５（非特許文献１参照）、及びＶＡＳ−０１２（非特許文献１参照）が挙げられる。これらの中でもＹ−２７６３２が好ましい。分化用培地中に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の終濃度は、通常、０．１μＭ〜２０μＭである。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。なお、終濃度とは、特定成分を培地に添加した結果、培地中に含まれる特定成分の濃度を示す。 ROCK inhibitors include Y-27632 (CAS number: 146986-50-7), Fasudil (CAS number: 105628-07-7), Y39983 (CAS number: 2039111-26-6), Wf-536 (CAS number). : 538857-64-2), SLx-2119 (CAS number: 911417-87-3), Azabenzimidazole-aminofurazans (CAS number: 850664-21-0), DE-104 (see Non-Patent Document 1), H-1152P. (See Non-Patent Document 1), ROKα inhibitor (See Non-Patent Document 1), XD-4000 (See Non-Patent Document 1), HMN-1152 (See Non-Patent Document 1), 4-(1-aminoalkyl)-N- (4-pyridyl)cyclohexane-carboxamides (see Non-Patent Document 1), Rhostain (see Non-Patent Document 1), BA-210 (see Non-Patent Document 1), BA-207 (see Non-Patent Document 1), Ki-23095. (See Non-Patent Document 1) and VAS-012 (see Non-Patent Document 1). Of these, Y-27632 is preferable. The final concentration of the ROCK inhibitor contained in the differentiation medium is usually 0.1 μM to 20 μM. The ROCK inhibitors may be used alone or in combination of two or more. The final concentration refers to the concentration of the specific component contained in the medium as a result of adding the specific component to the medium.

ＹＡＰ阻害剤としては、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ（ＣＡＳ番号：１２９４９７−７８−５）、ボツリヌス菌産生Ｃ３毒素（非特許文献２参照）、ＣＡ３（ＣＡＳ番号：３００８０２−２８−２）、（Ｒ）−ＰＦＩ２ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ番号：１６２７６０７−８７−７）、Ｓｕｐｅｒ−ＴＤＵ（ＣＡＳ番号：１５９９４４１−７１−０）、及びＹＡＰ−ＴＥＡＤＩｎｈｉｂｉｔｅｒ１（カタログ番号「Ｓ８１６４」、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍｉｃａｌｓ社等）が挙げられる。分化用培地中に含まれるＹＡＰ阻害剤の終濃度は、通常、０．１μＭ〜１０μＭである。ＹＡＰ阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。 Examples of YAP inhibitors include Verteporfin (CAS number: 129497-78-5), C3 toxin produced by Clostridium botulinum (see Non-patent Document 2), CA3 (CAS number: 300802-28-2), (R)-PFI 2 hydrochloride. (CAS number: 1627607-87-7), Super-TDU (CAS number: 1599441-71-0), and YAP-TEAD Inhibitor 1 (catalog number "S8164", Selleck Chemicals, etc.). The final concentration of the YAP inhibitor contained in the differentiation medium is usually 0.1 μM to 10 μM. The YAP inhibitors may be used alone or in combination of two or more.

分化用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率は、好ましくは０．１体積％以上、より好ましくは０．３体積％以上、さらに好ましくは０．５体積％以上である。また、分化用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率は、通常、１０体積％以下、好ましくは５体積％以下、より好ましくは３体積％以下である。上記の数値の範囲内であると、アルブミン産生能が高まった肝臓オルガノイドを得ることができる。 The volume fraction of dimethyl sulfoxide contained in the differentiation medium is preferably 0.1% by volume or more, more preferably 0.3% by volume or more, still more preferably 0.5% by volume or more. The volume fraction of dimethyl sulfoxide contained in the differentiation medium is usually 10% by volume or less, preferably 5% by volume or less, more preferably 3% by volume or less. Within the above numerical range, a liver organoid with enhanced albumin producing ability can be obtained.

分化用培地は、さらに、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有することができる。 The differentiation medium further comprises at least one growth selected from the group consisting of EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), hepatocyte growth factor (HGF) and insulin-like growth factor (IGF). Factors can be included.

分化用培地中に含まれるＥＧＦの終濃度は、通常、５ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０〜１００ｎｇ／ｍＬである。 The final concentration of EGF contained in the differentiation medium is usually 5 ng/mL to 500 ng/mL, preferably 25 ng/mL to 300 ng/mL, and more preferably 50 to 100 ng/mL.

ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、及びＦＧＦ１０が挙げられ、これらの中でもＦＧＦ１０が好ましい。分化用培地中に含まれるＦＧＦの終濃度は、通常、２０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００〜５００ｎｇ／ｍＬである。 Examples of FGF include FGF2, FGF4, FGF7, and FGF10. Of these, FGF10 is preferable. The final concentration of FGF contained in the differentiation medium is usually 20 ng/mL to 500 ng/mL, preferably 50 ng/mL to 500 ng/mL, and more preferably 100 to 500 ng/mL.

分化用培地中に含まれるＨＧＦの終濃度は、通常、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。 The final concentration of HGF contained in the differentiation medium is usually 1 ng/mL to 100 ng/mL, preferably 10 ng/mL to 100 ng/mL, more preferably 20 ng/mL to 100 ng/mL, and further preferably 40 ng/mL. ~100 ng/mL.

ＩＧＦとしては、ＩＧＦ１が好ましい。分化用培地中に含まれるＩＧＦの終濃度は、通常、５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬである。 As IGF, IGF1 is preferable. The final concentration of IGF contained in the differentiation medium is usually 5 ng/mL to 1000 ng/mL, preferably 10 ng/mL to 1000 ng/mL, and more preferably 50 ng/mL to 1000 ng/mL.

分化用培地は、さらに、Ａ８３−０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０−４３−６）、ＳＢ−４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６−４１−９）、ＳＢ−５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３−５９−５）、ＳＢ−５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９−２０−１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９−５３−６）、ＳＤ−２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６−０９−８）、及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９−３３−２）からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤（形質転換因子β阻害剤）を含有することができる。 The differentiation medium further includes A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB-431542 (CAS number: 301836-41-9), SB-505124 (CAS number: 694433-59-5), SB. -525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364947 (CAS number: 396129-53-6), SD-208 (CAS number: 627536-09-8), and SJN2511 (CAS number: 446859-33-2). ) And at least one TGF-β inhibitor (transforming factor β inhibitor) selected from the group consisting of

ＴＧＦ−β阻害剤としては、Ａ８３−０１が好ましく用いることができる。分化用培地中に含まれるＴＧＦ−β阻害剤の終濃度は、通常、０．０１ｎＭ〜６００ｎＭである。 A83-01 can be preferably used as the TGF-β inhibitor. The final concentration of the TGF-β inhibitor contained in the differentiation medium is usually 0.01 nM to 600 nM.

分化用培地は、さらに、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５−８０−５）、ジベンザゼピン（ＤＢＺ）（ＣＡＳ番号：２０９９８４−５６−５）、ベンゾジアゼピン（ＢＺ）（ＣＡＳ番号：２０９９８６−１７−４）、及びＬＹ−４１１５７５（ＣＡＳ番号：２０９９８４−５７−６）からなる群より選択される少なくとも１種のＮｏｔｃｈ阻害剤を含有することができる。 The differentiation medium further includes DAPT (CAS number: 208255-80-5), dibenzazepine (DBZ) (CAS number: 209984-56-5), benzodiazepine (BZ) (CAS number: 209986-17-4), and It may contain at least one Notch inhibitor selected from the group consisting of LY-411575 (CAS number: 209984-57-6).

Ｎｏｔｃｈ阻害剤としては、ＤＡＰＴが好ましく用いることができる。分化用培地中に含まれるＮｏｔｃｈ阻害剤の終濃度は、通常、１μＭ〜５０μＭ、好ましくは５μＭ〜３０μＭ、より好ましくは５μＭ〜２０μＭである。 DAPT can be preferably used as the Notch inhibitor. The final concentration of the Notch inhibitor contained in the differentiation medium is usually 1 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 30 μM, more preferably 5 μM to 20 μM.

分化用培地は、さらに、デキサメタゾン（ＣＡＳ番号：５０−０２−２）を含むことができる。分化用培地に含まれるデキサメタゾンの終濃度は、１μＭ〜５０μＭであってもよく、１μＭ〜４０μＭであってもよく、１μＭ〜３５μＭであってもよい。 The differentiation medium can further contain dexamethasone (CAS number: 50-02-2). The final concentration of dexamethasone contained in the differentiation medium may be 1 μM to 50 μM, 1 μM to 40 μM, or 1 μM to 35 μM.

分化用培地は、さらに、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及びＮ−アセチルシステイン等の神経生物系サプリメントを含有することができる。 The differentiation medium can further contain a neurobiological supplement such as gastrin, B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), and N-acetyl cysteine.

分化用培地中に含まれるガストリンの終濃度は、通常、５ｎＭ〜１５ｎＭ、好ましくは７ｎＭ〜１０ｎＭである。 The final concentration of gastrin contained in the differentiation medium is usually 5 nM to 15 nM, preferably 7 nM to 10 nM.

Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリンを含む組成物であり、５０倍液体濃縮液として市販されている。これらの成分のうち、少なくともリノレン酸、レチノール、酢酸レチニル及びトリヨードチロニン（Ｔ３）は核ホルモン受容体アゴニストである。 B27 supplements include biotin, cholesterol, linoleic acid, linolenic acid, progesterone, putrescine, retinol, retinyl acetate, sodium selenite, triiodothyronine (T3), DL-α-tocopherol (vitamin E), albumin, insulin and A composition containing transferrin, which is commercially available as a 50-fold liquid concentrate. Among these components, at least linolenic acid, retinol, retinyl acetate and triiodothyronine (T3) are nuclear hormone receptor agonists.

Ｎ２サプリメントは、５００μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、５００μｇ／ｍＬウシインシュリン、０．６３μｇ／ｍＬプロゲステロン、１６１μｇ／ｍＬプトレシン及び０．５２μｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウムを含む組成物であり、１００倍液体濃縮液として市販されている。 N2 supplement is a composition containing 500 μg/mL human transferrin, 500 μg/mL bovine insulin, 0.63 μg/mL progesterone, 161 μg/mL putrescine and 0.52 μg/mL sodium selenite, and as a 100-fold liquid concentrate. It is commercially available.

分化用培地中に含まれるＮ−アセチルシステインの終濃度は、通常、１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１７０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬである。 The final concentration of N-acetylcysteine contained in the differentiation medium is usually 150 ng/mL to 250 ng/mL, preferably 170 ng/mL to 200 ng/mL.

〈増殖工程〉
増殖工程では、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地で培養し、前記肝臓細胞凝集塊を得る。増殖工程を有することにより、アルブミン産生能が高い肝臓オルガノイドを製造することができる。 <Proliferation process>
In the proliferation step, the epithelial hepatic stem cells are cultured in a proliferation medium containing at least one selected from the group consisting of ROCK inhibitor and YAP inhibitor and dimethyl sulfoxide to obtain the liver cell aggregate. By having the proliferation step, it is possible to produce a liver organoid having a high albumin producing ability.

増殖工程では、肝臓オルガノイドと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを接触させて培養することが好ましい。例えば、実施例において後述するように、肝臓オルガノイドとＥＣＭとを混合し、ＥＣＭを重合させた後に、重合したＥＣＭに増殖用培地を重層して培養してもよい。本明細書では、肝臓オルガノイドを含む重合したＥＣＭに、増殖用培地を重層して培養する態様を含めて、肝臓オルガノイドを増殖用培地で培養することを「増殖用培地中で培養する」と表現する。増殖工程において使用するＥＣＭは、上述した、分化工程で使用するＥＣＭと同様であってよい。 In the proliferation step, it is preferable that the liver organoid and the extracellular matrix (ECM) are brought into contact with each other and cultured. For example, as will be described later in Examples, liver organoids and ECM may be mixed and ECM may be polymerized, and then the polymerized ECM may be overlaid with a growth medium to culture. In the present specification, culturing a liver organoid in a growth medium, including a mode in which a polymerized ECM containing a liver organoid is overlaid with a growth medium, is expressed as "culturing in a growth medium". To do. The ECM used in the expansion step may be the same as the ECM used in the differentiation step described above.

上皮肝幹細胞は、肝臓断片又は肝臓胆管から単離される。これらの細胞を単離する方法は公知である。例えば、本明細書の実施例に記載のように、成体肝臓組織を解離することにより上皮肝幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。組織の解離は酵素的解離により行うことができ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等の酵素を用いることができる。 Epithelial hepatic stem cells are isolated from liver fragments or hepatic bile ducts. Methods for isolating these cells are known. For example, as described in the Examples herein, a cell population containing epithelial hepatic stem cells can be obtained by dissociating adult liver tissue. Tissue dissociation can be performed by enzymatic dissociation, and enzymes such as collagenase and dispase can be used.

《増殖用培地》
増殖用培地は、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む。増殖用培地において、ＲＯＣＫ阻害剤、ＹＡＰ阻害剤としては、上述した分化用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。また、増殖用培地は、増殖用培地を１００体積％として、ジメチルスルフォキシド（ＣＡＳ番号：６７−６８−５）を０．１体積％以上含むことが好ましく、０．３体積％以上含むことがより好ましく、０．５体積％以上含むことがさらに好ましい。また、増殖用培地は、増殖用培地を１００体積％として、ジメチルスルフォキシド（ＣＡＳ番号：６７−６８−５）を１０体積％以下含むことが好ましく、５体積％以下含むことがより好ましく、３体積％以下含むことがさらに好ましい。上記の数値の範囲内であると、アルブミン産生能が高まった肝臓細胞塊が得られる。 <Growth medium>
The growth medium contains at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide. As the ROCK inhibitor and the YAP inhibitor in the growth medium, the same ones as those in the above-mentioned differentiation medium can be used at the same concentration. The growth medium preferably contains dimethyl sulfoxide (CAS number: 67-68-5) in an amount of 0.1% by volume or more, and 0.3% by volume or more, with the growth medium being 100% by volume. Is more preferable, and it is further preferable that the content is 0.5 vol% or more. In addition, the growth medium preferably contains 10 volume% or less of dimethyl sulfoxide (CAS number: 67-68-5), more preferably 5 volume% or less, with 100% by volume of the growth medium. It is more preferable that the content is 3 vol% or less. Within the above numerical range, a liver cell mass having an increased albumin producing ability can be obtained.

《その他の添加剤》
増殖用培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群より選択される成長因子；ニコチンアミド（ＣＡＳ番号：９８−９２−０）；Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択されるＷｎｔアゴニスト；Ａ８３−０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０−４３−６）、ＳＢ−４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６−４１−９）、ＳＢ−５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３−５９−５）、ＳＢ−５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９−２０−１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９−５３−６）、ＳＤ−２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６−０９−８）及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９−３３−２）からなる群より選択されるＴＧＦ−β阻害剤；及び、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質からなる群より選択されるタンパク質からなる群より選択される骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤；からなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことが好ましい。 <Other additives>
The growth medium is a growth factor selected from the group consisting of epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) and insulin-like growth factor (IGF); nicotinamide (CAS). No. 98-92-0); Wnt agonist selected from the group consisting of Wnt family members, R-spondins 1-4, Norrin and GSK inhibitors; A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB -431542 (CAS number: 301836-41-9), SB-505124 (CAS number: 694433-59-5), SB-525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364947 (CAS number: 396129-53-). 6), a TGF-β inhibitor selected from the group consisting of SD-208 (CAS number: 627536-09-8) and SJN2511 (CAS number: 446859-33-2); and Noggin, DAN, and Cerberug and It is preferable to further include at least one selected from the group consisting of a bone morphogenetic protein (BMP) inhibitor selected from the group consisting of proteins selected from the group consisting of DAN-like proteins including Gremlin.

増殖用培地におけるＥＧＦの含有量は、上述した分化用培地におけるＥＧＦの含有量と同様である。 The EGF content in the growth medium is the same as the EGF content in the differentiation medium described above.

増殖用培地は、ＦＧＦとして、上述した分化用培地におけるＦＧＦと同様のものを同様の含有量で含むことができる。 The growth medium can contain, as FGF, the same FGF as that in the above-described differentiation medium with the same content.

増殖用培地におけるＨＧＦの含有量は、上述した分化用培地におけるＨＧＦの含有量と同様である。 The HGF content in the growth medium is the same as the HGF content in the differentiation medium described above.

増殖用培地は、ＩＧＦとして、上述した分化用培地におけるＩＧＦと同様のものを同様の含有量で含むことができる。 The growth medium can contain, as IGF, the same content as IGF in the above-mentioned differentiation medium with the same content.

増殖用培地におけるニコチンアミドの含有量は、５〜１５ｍＭであってもよく、８〜１２ｍＭであってもよい。 The content of nicotinamide in the growth medium may be 5 to 15 mM, or 8 to 12 mM.

Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、Ｎｏｒｒｉｎ、ＧＳＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種であってよい。Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。Ｒ−スポンジンとしては、Ｒ−スポンジン１又はＲ−スポンジン４が好ましく、Ｒ−スポンジン１が特に好ましい。 The Wnt agonist may be at least one selected from the group consisting of Wnt family members, R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, Norrin, and GSK inhibitors. Examples of Wnt family members include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 and the like. As the R-spondin, R-spondin 1 or R-spondin 4 is preferable, and R-spondin 1 is particularly preferable.

Ｗｎｔアゴニストは、Ｒ−スポンジン１を含むことが好ましい。増殖用培地におけるＷｎｔアゴニストの含有量は、２００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、３００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、４００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、５００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよい。Ｗｎｔアゴニストの含有量の上限は特に限定されないが、例えば６００ｎｇ／ｍＬ程度であってもよい。 The Wnt agonist preferably comprises R-spondinl. The content of the Wnt agonist in the growth medium may be 200 ng/mL or more, 300 ng/mL or more, 400 ng/mL or more, or 500 ng/mL or more. .. The upper limit of the content of the Wnt agonist is not particularly limited, but may be about 600 ng/mL, for example.

肝臓オルガノイドがヒト由来のものである場合、増殖用培地がＴＧＦ−β阻害剤を含むことが好ましい。ＴＧＦ−β阻害剤としてはＡ８３−０１が好ましく用いられる。増殖用培地におけるＴＧＦ−β阻害剤の含有量は、０〜２０μＭであってもよく、０〜１０μＭであってもよい。 When the liver organoid is of human origin, the growth medium preferably contains a TGF-β inhibitor. A83-01 is preferably used as the TGF-β inhibitor. The content of the TGF-β inhibitor in the growth medium may be 0 to 20 μM or 0 to 10 μM.

ＢＭＰ阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎであることが好ましい。分化用培地におけるＢＭＰ阻害剤の含有量は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０〜１００ｎｇ／ｍＬであってもよく、５０〜１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。ＢＭＰ阻害剤の含有量の上限は特に限定されないが、例えば１５０ｎｇ／ｍＬ程度であってもよい。 The BMP inhibitor is preferably Noggin. The content of the BMP inhibitor in the differentiation medium may be 10 to 100 ng/mL, 20 to 100 ng/mL, or 50 to 100 ng/mL. The upper limit of the content of the BMP inhibitor is not particularly limited, but may be, for example, about 150 ng/mL.

増殖用培地は、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及び、Ｎ−アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことが好ましい。増殖用培地において、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ−アセチルシステインとしては、上述した分化用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。 The growth medium may further contain at least one selected from the group consisting of gastrin, B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), and N-acetyl cysteine. preferable. In the growth medium, as Gastrin, B27 supplement (Thermo Fisher Scientific Co.), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific Co.), and N-acetyl cysteine, the same ones as those in the above-mentioned differentiation medium can be used. It can be used at a concentration.

本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法において、増殖工程を行う場合には、増殖工程を開始してから少なくとも１日以上後に分化工程を開始することが好ましい。増殖工程の期間（培養期間）は、例えば１〜１５日間であってもよく、例えば１〜５日間であってもよく、例えば２〜４日間であってもよい。 In the method for producing a liver organoid of the present embodiment, when the proliferation step is performed, it is preferable to start the differentiation step at least one day after the proliferation step is started. The period of the proliferation step (culture period) may be, for example, 1 to 15 days, for example 1 to 5 days, for example, 2 to 4 days.

肝臓オルガノイドが増殖したことは、Ｌｇｒ５遺伝子又はＬｇｒ５タンパク質の発現量を測定することにより評価することができる。肝臓オルガノイドはＬｇｒ５タンパク質を発現する。 Proliferation of the liver organoid can be evaluated by measuring the expression level of the Lgr5 gene or Lgr5 protein. Liver organoids express the Lgr5 protein.

また、本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法において、肝臓細胞凝集塊が肝臓オルガノイドに分化したことは、肝細胞マーカーの発現や薬物代謝活性等を指標にして判定又は評価することができる。肝細胞マーカーとしては、例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、チロシン−アミノ基転移酵素（ＴＡＴ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）等が挙げられる。肝細胞マーカーの発現量の測定は、遺伝子レベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。 In addition, in the method for producing a liver organoid of the present embodiment, the fact that the liver cell aggregate has differentiated into a liver organoid can be determined or evaluated by using the expression of a hepatocyte marker, drug metabolism activity, or the like as an index. Examples of hepatocyte markers include albumin (ALB), α-fetoprotein (AFP), tyrosine-aminotransferase (TAT), pregnane X receptor (PXR) and the like. The expression level of the hepatocyte marker may be measured at the gene level or the protein level.

肝臓細胞凝集塊の集団から、肝臓オルガノイドのみからなる集団を得る方法としては、例えば、肝臓オルガノイドに特徴的な細胞表面マーカーの存在を指標にして、肝臓細胞凝集塊を選別・分取する方法が挙げられる。 From the population of liver cell aggregates, as a method of obtaining a population consisting only of liver organoids, for example, a method of selecting and sorting liver cell aggregates using the presence of cell surface markers characteristic of liver organoids as an index. Can be mentioned.

薬物代謝活性は、薬物代謝酵素の発現の検出又は薬物代謝アッセイによって評価することができる。薬物代謝酵素としては、例えば、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）、シトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、シトクロムＰ４５０３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）、シトクロムＰ４５０１Ａ（ＣＹＰ１Ａ）、シトクロムＰ４５０３Ａ（ＣＹＰ３Ａ）、シトクロムＰ４５０２Ｂ（ＣＹＰ２Ｂ）、シトクロムＰ４５０２Ｄ（ＣＹＰ２Ｄ）、ウリジン二リン酸−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）、硫酸転移酵素（ＳＵＬＴ）等が挙げられる。 Drug metabolism activity can be assessed by detection of expression of drug metabolizing enzymes or by drug metabolism assays. Examples of drug metabolizing enzymes include cytochrome P450 2C19 (CYP2C19), cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), cytochrome P450 3A7 (CYP3A7), cytochrome P450 1A (CYP1A), cytochrome P450 3A (CYP3P2B), cytochrome P450 3A7 (CYP3A2), and cytochrome P450 3A (CYP3P2B). Cytochrome P450 2D (CYP2D), uridine diphosphate-glucuronosyltransferase (UGT), sulfate transferase (SULT) and the like can be mentioned.

増殖工程及び分化工程における、培養温度等の条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。具体的には、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で培養すればよい。 The conditions such as the culture temperature in the proliferation step and the differentiation step may be those generally adopted in the culture of animal cells. Specifically, for example, the culture may be performed in an environment of 37° C. and 5% CO ₂ .

［肝臓オルガノイド］
本実施形態の肝臓オルガノイドは、上述した肝臓オルガノイドの製造方法により製造することができる。本実施形態の肝臓オルガノイドは、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、トランスポーター活性等のインビトロ評価に好適に用いることができる。また、肝疾患患者に移植して肝疾患を治療する細胞製剤として利用することもできる。 [Liver organoids]
The liver organoid of the present embodiment can be manufactured by the above-described method for manufacturing a liver organoid. The liver organoid of the present embodiment can be preferably used for in vitro evaluation of metabolism, drug interaction, liver toxicity, transporter activity, etc. of a test substance. It can also be used as a cell preparation for treating liver disease by transplanting it to a liver disease patient.

本実施形態の肝臓オルガノイドのアルブミンの発現量は、培養に用いた上皮肝幹細胞を含む組織片のアルブミンの発現量に対して、好ましくは２倍〜１０００倍、より好ましくは２．５倍〜１００倍、さらに好ましくは３倍〜５０倍である。 The albumin expression level of the liver organoid of the present embodiment is preferably 2 to 1000 times, more preferably 2.5 to 100 times the albumin expression level of the tissue piece containing epithelial hepatic stem cells used for culture. Times, and more preferably 3 to 50 times.

本実施形態の肝臓オルガノイドのＣＹＰ２Ｃ１９の発現量は、培養に用いた上皮肝幹細胞を含む組織片のＣＹＰ２Ｃ１９の発現量に対して、好ましくは５０％〜２００％、より好ましくは８０％〜１８０％倍、さらに好ましくは１００％〜１５０％である。 The expression level of CYP2C19 of the liver organoid of the present embodiment is preferably 50% to 200%, more preferably 80% to 180% times the expression level of CYP2C19 of a tissue piece containing epithelial hepatic stem cells used for culture. , And more preferably 100% to 150%.

本実施形態の肝臓オルガノイドの密度は、好ましくは２００，０００個／ｍＬ以上である。 The density of the liver organoid of the present embodiment is preferably 200,000/mL or more.

［細胞製剤］
本実施形態の細胞製剤は、上述したオルガノイドを含有する。本実施形態の細胞製剤中に含まれる肝臓オルガノイドの由来となる上皮肝幹細胞は、遺伝子工学的手法等により免疫原性が低減された肝臓組織由来であってもよいし、患者由来の肝臓組織由来であってもよいし、患者と免疫学的に適合した第３者の肝臓組織由来であってもよい。 [Cell preparation]
The cell preparation of the present embodiment contains the above-mentioned organoid. The epithelial hepatic stem cells from which the liver organoid contained in the cell preparation of the present embodiment is derived may be derived from liver tissue whose immunogenicity is reduced by a genetic engineering method or the like, or derived from a patient-derived liver tissue. Or a third party liver tissue immunologically compatible with the patient.

本実施形態の細胞製剤は、各種肝疾患の治療に利用することができる。例えば、傷害や機能不全の肝臓組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。したがって、本実施形態の細胞製剤は再生医療用として用いることができる。 The cell preparation of this embodiment can be used for treating various liver diseases. For example, it can be used as a material for the regeneration and reconstruction of injured or dysfunctional liver tissue. Therefore, the cell preparation of this embodiment can be used for regenerative medicine.

本実施形態の細胞製剤は、例えば、上述した肝臓オルガノイドを生理食塩水や緩衝液（例えば、リン酸系緩衝液）等に懸濁することによって製造することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば１×１０^５個〜１×１０^１０個の細胞を含有させるとよい。 The cell preparation of the present embodiment can be produced, for example, by suspending the above-mentioned liver organoid in physiological saline, a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution), or the like. For example, 1×10 ⁵ to 1×10 ¹⁰ cells may be contained as a single dose so that a therapeutically effective amount of cells can be administered.

本実施形態の細胞製剤の投与量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態等を考慮して適宜調整することができる。また、本実施形態の細胞製剤の投与方法としては、肝臓への局所投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与等が挙げられる。 The dose of the cell preparation of the present embodiment can be appropriately adjusted in consideration of the purpose of use, the target disease, the sex of the application target (recipient), the age, the body weight, the state of the affected area, the state of cells and the like. Examples of the administration method of the cell preparation of the present embodiment include local administration to the liver, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.

［被験物質の評価方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した製造方法により製造された肝臓オルガノイドを培養する工程と、前記肝臓オルガノイドの代謝能を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法を提供する。また、別の実施態様において、本発明は、上述した製造方法により製造された肝臓オルガノイドに被験物質を作用させる工程と、前記肝臓オルガノイドの応答を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法を提供する。 [Test substance evaluation method]
In one embodiment, the present invention comprises the step of culturing the liver organoid produced by the above-mentioned production method in the presence of the test agent, and the step of evaluating the metabolic ability of the liver organoid. The evaluation method of is provided. Further, in another embodiment, the present invention comprises a step of causing a test substance to act on a liver organoid produced by the above-described production method, and a step of evaluating a response of the liver organoid, the evaluation of the test substance Provide a way.

本実施形態の評価方法により、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、トランスポーター活性等をインビトロで評価し、インビボにおける評価と一致した結果を得ることができる。 By the evaluation method of the present embodiment, the metabolism, drug interaction, hepatotoxicity, transporter activity, etc. of the test substance can be evaluated in vitro, and the results that are consistent with the evaluation in vivo can be obtained.

例えば、肝臓オルガノイドを用いて被験物質の代謝について試験することができる。被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）等が挙げられる。 For example, liver organoids can be used to test for test substance metabolism. The test substance is not particularly limited, and examples thereof include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, and a metabolite library. As the test substance, organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used. Examples of organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosyl glycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins ( B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) and the like.

医薬や栄養食品等の既存成分又は候補成分も好ましい被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清等を被験物質として用いてもよい。また、２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用等を調べることもできる。被験物質は天然物由来であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。後者の場合には、例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。 Existing or candidate ingredients such as medicines and nutritional foods are also preferable test substances. A plant extract, cell extract, culture supernatant, etc. may be used as the test substance. Further, by adding two or more kinds of test substances at the same time, the interaction, synergistic effect, etc. between the test substances can be examined. The test substance may be derived from a natural product or may be artificially synthesized. In the latter case, an efficient assay system can be constructed using, for example, a combinatorial synthesis technique.

本実施形態の評価方法において、被験物質と肝臓オルガノイドとを接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間〜３日間であってもよく、１時間〜１日間であってもよい。被験物質と肝臓オルガノイドとの接触を複数回に分けて行ってもよい。 In the evaluation method of the present embodiment, the period of contact between the test substance and the liver organoid can be set arbitrarily. The contact period may be, for example, 10 minutes to 3 days, or 1 hour to 1 day. The contact between the test substance and the organoid of the liver may be carried out in plural times.

肝臓オルガノイドの応答の評価は、適切な分析方法により実施することができる。例えば、産生される代謝産物に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法等を採用することができる。免疫学的手法としては、例えば、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）等が挙げられる。 Assessment of liver organoid response can be performed by any suitable analytical method. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological techniques, etc. can be adopted depending on the metabolite produced. Examples of the immunological method include a fluorescence immunoassay method (FIA method) and an enzyme immunoassay method (EIA method).

肝臓オルガノイドにおける薬物代謝酵素（例えば、シトクロム、ＵＧＴ等）の発現を指標として被験物質の代謝を測定することもできる。薬物代謝酵素の発現はｍＲＮＡレベルで評価してもよいし、タンパク質レベルで評価してもよい。 It is also possible to measure the metabolism of the test substance using the expression of a drug-metabolizing enzyme (eg, cytochrome, UGT, etc.) in the liver organoid as an index. Expression of the drug-metabolizing enzyme may be evaluated at the mRNA level or the protein level.

本実施形態の評価方法により被験物質の毒性を試験することもできる。例えば、被験物質を接触させた後の肝臓オルガノイドの状態を調べ、被験物質の毒性を評価する。肝臓オルガノイドの状態としては、生存率、細胞形態、培養液中の肝障害マーカー（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）の存在量等が挙げられる。 The toxicity of a test substance can also be tested by the evaluation method of this embodiment. For example, the state of the liver organoid after contact with the test substance is examined to evaluate the toxicity of the test substance. Examples of the liver organoid state include survival rate, cell morphology, abundance of liver damage markers (eg, GOT, GPT, etc.) in the culture medium, and the like.

［実施例１］
（マウス肝臓細胞凝集塊の形成）
摘出したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓をＰＢＳで洗浄後に手術用ハサミで細かくミンスした。ミンス後の肝臓を５０ｍＬチューブ中でコラゲナーゼとディスパーゼの混合溶液と３７℃で２時間振とうしながら反応させた。反応後の肝臓懸濁液はメッシュサイズが１００μｍのセルストレーナー（カタログ番号「３５２３６０」、セルストレーナー（メッシュ１００μｍ）、ＢＤファルコン社）で濾過し、未分散の肝臓断片を除去した。濾過後の肝臓懸濁液は、遠心後、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した。この洗浄操作を２回行った後、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から１０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの培地を重層して培養した。培養して得られたマウス肝臓細胞凝集塊は酵素的解離によって希釈し、継代した。 [Example 1]
(Formation of mouse liver cell aggregates)
The liver of the excised C57BL/6 mouse was washed with PBS and finely minced with surgical scissors. The liver after mince was reacted with a mixed solution of collagenase and dispase in a 50 mL tube while shaking at 37° C. for 2 hours. After the reaction, the liver suspension was filtered with a cell strainer having a mesh size of 100 μm (catalog number “352360”, cell strainer (mesh 100 μm), BD Falcon) to remove undispersed liver fragments. The liver suspension after filtration was centrifuged and washed with Advanced DMEM/F12. This washing operation was performed twice and then suspended in Advanced DMEM/F12 to prepare a hepatocyte suspension. From this suspension, 10,000 hepatocytes were mixed with 50 μL of Matrigel (BD Bioscience), seeded in a 24-well tissue culture plate and incubated at 37° C. for 5-10 minutes until Matrigel was completely polymerized. did. Then, after matrigel was polymerized, 500 μL of medium was overlaid and cultured. The mouse liver cell aggregate obtained by culturing was diluted by enzymatic dissociation and then passaged.

（マウス肝臓オルガノイドの分化誘導）
形成したマウス肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して４日間培養した。増殖用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。 (Induction of differentiation of mouse liver organoids)
After enzymatically dissociating the formed mouse liver cell aggregates, the obtained 1,000 cells were mixed with 50 μL of Matrigel (BD Bioscience) and seeded in a 24-well tissue culture plate to ensure that Matrigel was completely removed. Incubated at 37°C for 5-10 minutes until polymerized. Then, after matrigel was polymerized, 500 μL of a growth medium was overlaid and cultured for 4 days. As the growth medium, the medium having the composition shown in Table 1 was used.

続いて、増殖用培地を重層して４日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、１日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。 Subsequently, the growth medium was overlaid, and on the fourth day, the entire amount of the medium was replaced with the differentiation medium. Thereafter, the medium was replaced with a new medium for differentiation every other day. The medium having the composition shown in Table 1 was used as the medium for differentiation.

（タンパク質レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して９日後に新しい分化用培地に交換し、更に３日間培地を交換せずに培養を続けた。その後、培養上清を回収し、培地中のアルブミン産生値をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法は市販のキット（カタログ番号「Ｅ９９−１３４」、ベチルラボラトリーズ社）を用いて行った。 (Measurement of albumin expression level at protein level)
The medium was replaced with a new medium for differentiation 9 days after the replacement with the medium for differentiation, and the culture was continued for another 3 days without replacing the medium. Then, the culture supernatant was collected, and the albumin production value in the medium was measured by the ELISA method. The ELISA method was performed using a commercially available kit (catalog number "E99-134", Betyl Laboratories).

また、培養上清を回収した後の細胞について、市販のキット（商品名「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ」、プロメガ社）を用いてＡＴＰ活性の測定を行った。 Further, the ATP activity of the cells after collecting the culture supernatant was measured using a commercially available kit (trade name “CellTiter-Glo”, Promega).

続いて、上述したＥＬＩＳＡ法により測定された波長４５０ｎｍにおける吸光度を、上述したＡＴＰ活性の測定値で除し、細胞量を補正してアルブミン産生量とした。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。 Subsequently, the absorbance at a wavelength of 450 nm measured by the above-mentioned ELISA method was divided by the above-mentioned measured value of ATP activity, and the cell amount was corrected to obtain the albumin production amount. Table 1 shows the measurement results of albumin production.

（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
培養上清を回収した後の細胞について、更に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌｃＤＮＡＫｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴＭ）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。 (Measurement of albumin expression level at gene level)
With respect to the cells after collecting the culture supernatant, the total ribonucleic acid (RNA) was extracted from the cells using a commercially available kit (trade name “FastLane Cell cDNA Kit”, Qiagen) to synthesize cDNA, The expression level of mRNA of albumin gene was measured by real-time quantitative PCR. The real-time quantitative PCR was performed using a commercially available kit (trade name "SYBR(R) Premix Ex Taq(TM) (Perfect Real Time)", Takara Bio Inc.). Further, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to correct the measurement results. Table 1 shows the measurement results of albumin production.

［実施例２〜７］
増殖用培地及び分化用培地の組成を表１に示すものに変更した点以外は実施例１と同様にして肝臓細胞凝集塊を肝臓オルガノイドへと分化誘導し、アルブミン産生量の測定を行った。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。 [Examples 2 to 7]
Differentiation of the hepatocyte aggregates into liver organoids was induced in the same manner as in Example 1 except that the compositions of the growth medium and the differentiation medium were changed to those shown in Table 1, and the amount of albumin production was measured. Table 1 shows the measurement results of albumin production.

［実施例８］
（ヒト肝臓細胞凝集塊の形成）
ヒト凍結浮遊肝細胞ＨＭＣＳ１Ｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を融解し、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えて遠心した。上清を除いた後、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した。この洗浄操作を２回行った後、ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ／Ｆ１２で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から６０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層し培養した。増殖したヒト肝臓細胞凝集塊は酵素的解離によって希釈し、継代した。 [Example 8]
(Formation of human liver cell aggregates)
Human frozen floating hepatocytes HMCS1S (Thermo Fisher Scientific) was thawed, added to Advanced DMEM/F12 and centrifuged. After removing the supernatant, the cells were washed with Advanced DMEM/F12. This washing operation was performed twice and then suspended in Advanced DMEM/F12 to prepare a hepatocyte suspension. From this suspension, 60,000 hepatocytes were mixed with 50 μL of Matrigel (BD Bioscience), seeded in a 24-well tissue culture plate, and incubated at 37° C. for 5-10 minutes until Matrigel was completely polymerized. did. Subsequently, after Matrigel was polymerized, 500 μL of a growth medium was overlaid and cultured. Proliferated human liver cell aggregates were diluted by enzymatic dissociation and passaged.

（ヒト肝臓細胞凝集塊の分化誘導）
形成したヒト肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１０，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して１０日間培養し、ヒト肝臓オルガノイドを得た。増殖用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。 (Induction of differentiation of human liver cell aggregates)
After enzymatically dissociating the formed human liver cell aggregates, the 10,000 cells obtained were mixed with 50 μL of Matrigel (BD Bioscience) and seeded in a 24-well tissue culture plate to ensure that Matrigel was completely removed. Incubated at 37°C for 5-10 minutes until polymerized. Then, after matrigel was polymerized, 500 μL of a growth medium was overlaid and cultured for 10 days to obtain a human liver organoid. As the growth medium, the medium having the composition shown in Table 1 was used.

続いて、増殖用培地を重層して１０日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、２日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。 Subsequently, the growth medium was overlaid, and on the 10th day, the entire amount of the medium was replaced with the differentiation medium. Thereafter, the medium was replaced with a new medium for differentiation every two days. The medium having the composition shown in Table 1 was used as the medium for differentiation.

（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して１０日後に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌｃＤＮＡＫｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴＭ）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。 (Measurement of albumin expression level at gene level)
Ten days after the medium was changed to a differentiating medium, total ribonucleic acid (RNA) was extracted from the cells using a commercially available kit (trade name "FastLane Cell cDNA Kit", Qiagen) to synthesize cDNA, and real-time quantification was performed. The expression level of mRNA of albumin gene was measured by PCR. The real-time quantitative PCR was performed using a commercially available kit (trade name "SYBR(R) Premix Ex Taq(TM) (Perfect Real Time)", Takara Bio Inc.). Further, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to correct the measurement results. Table 1 shows the measurement results of albumin production.

［比較例１］
（マウス肝臓細胞凝集塊の形成）
実施例１と同様にして、マウス肝臓細胞凝集塊を形成した。 [Comparative Example 1]
(Formation of mouse liver cell aggregates)
Mouse liver cell aggregates were formed in the same manner as in Example 1.

（マウス肝臓オルガノイドの分化誘導）
形成したマウス肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して３日間培養した。増殖用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。 (Induction of differentiation of mouse liver organoids)
After enzymatically dissociating the formed mouse liver cell aggregates, the obtained 1,000 cells were mixed with 50 μL of Matrigel (BD Bioscience) and seeded in a 24-well tissue culture plate to ensure that Matrigel was completely removed. Incubated at 37°C for 5-10 minutes until polymerized. Then, after matrigel was polymerized, 500 μL of a growth medium was overlaid and cultured for 3 days. As the growth medium, the medium having the composition shown in Table 2 was used.

続いて、増殖用培地を重層して３日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、１日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。 Subsequently, the growth medium was overlaid, and on the third day, the entire amount of the medium was replaced with the differentiation medium. Thereafter, the medium was replaced with a new medium for differentiation every other day. As the medium for differentiation, the medium having the composition shown in Table 2 was used.

続いて、上述したＥＬＩＳＡ法により測定された波長４５０ｎｍにおける吸光度を、上述したＡＴＰ活性の測定値で除し、細胞量を補正してアルブミン産生量とした。 Subsequently, the absorbance at a wavelength of 450 nm measured by the above-mentioned ELISA method was divided by the above-mentioned measured value of ATP activity, and the cell amount was corrected to obtain the albumin production amount.

（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
培養上清を回収した後の細胞について、更に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌｃＤＮＡＫｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴＭ）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表２にアルブミン産生量の測定結果を示す。 (Measurement of albumin expression level at gene level)
With respect to the cells after collecting the culture supernatant, the total ribonucleic acid (RNA) was extracted from the cells using a commercially available kit (trade name “FastLane Cell cDNA Kit”, Qiagen) to synthesize cDNA, The expression level of mRNA of albumin gene was measured by real-time quantitative PCR. The real-time quantitative PCR was performed using a commercially available kit (trade name "SYBR(R) Premix Ex Taq(TM) (Perfect Real Time)", Takara Bio Inc.). Further, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to correct the measurement results. Table 2 shows the measurement results of albumin production.

［比較例２〜４］
増殖用培地及び分化用培地の組成を表２に示すものに変更した点以外は比較例１と同様にして肝臓細胞凝集塊を肝臓オルガノイドへと分化誘導し、アルブミン産生量の測定を行った。表２にアルブミン産生量の測定結果を示す。 [Comparative Examples 2 to 4]
Differentiation of liver cell aggregates into liver organoids was induced in the same manner as in Comparative Example 1 except that the compositions of the growth medium and the differentiation medium were changed to those shown in Table 2, and the amount of albumin production was measured. Table 2 shows the measurement results of albumin production.

［比較例５］
（ヒト肝臓細胞凝集塊の形成）
実施例８と同様にして、ヒト肝臓細胞凝集塊を形成した。 [Comparative Example 5]
(Formation of human liver cell aggregates)
Human liver cell aggregates were formed in the same manner as in Example 8.

（ヒト肝臓オルガノイドの分化誘導）
形成したヒト肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１０，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して１０日間培養した。増殖用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。 (Induction of human liver organoid differentiation)
After enzymatically dissociating the formed human liver cell aggregates, the 10,000 cells obtained were mixed with 50 μL of Matrigel (BD Bioscience) and seeded in a 24-well tissue culture plate to ensure that Matrigel was completely removed. Incubated at 37°C for 5-10 minutes until polymerized. Subsequently, after matrigel was polymerized, 500 μL of a growth medium was overlaid and cultured for 10 days. As the growth medium, the medium having the composition shown in Table 2 was used.

続いて、増殖用培地を重層して１０日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、２日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。 Subsequently, the growth medium was overlaid, and on the 10th day, the entire amount of the medium was replaced with the differentiation medium. Thereafter, the medium was replaced with a new medium for differentiation every two days. As the medium for differentiation, the medium having the composition shown in Table 2 was used.

（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して１０日後に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌｃＤＮＡＫｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴＭ）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表２にアルブミン産生量の測定結果を示す。 (Measurement of albumin expression level at gene level)
Ten days after the medium was changed to a differentiating medium, total ribonucleic acid (RNA) was extracted from the cells using a commercially available kit (trade name "FastLane Cell cDNA Kit", Qiagen) to synthesize cDNA, and real-time quantification was performed. The expression level of mRNA of albumin gene was measured by PCR. The real-time quantitative PCR was performed using a commercially available kit (trade name "SYBR(R) Premix Ex Taq(TM) (Perfect Real Time)", Takara Bio Inc.). Further, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to correct the measurement results. Table 2 shows the measurement results of albumin production.

（遺伝子レベルでの各ＣＹＰ発現量の測定）
実施例８および比較例５において、分化用培地に交換して１０日後に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌｃＤＮＡＫｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲにより各ＣＹＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴＭ）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表３に凍結肝細胞の各ＣＹＰ発現量に対して各ＣＹＰ発現量の測定結果を示す。表３中の値は、ＧＡＰＤＨ発現量を１００％とした場合の割合（％）である。 (Measurement of each CYP expression level at the gene level)
In Example 8 and Comparative Example 5, the total ribonucleic acid (RNA) was extracted from the cells using a commercially available kit (trade name “FastLane Cell cDNA Kit”, Qiagen) 10 days after the medium was exchanged with the medium for differentiation. Then, cDNA was synthesized, and the expression level of mRNA of each CYP gene was measured by real-time quantitative PCR. The real-time quantitative PCR was performed using a commercially available kit (trade name "SYBR(R) Premix Ex Taq(TM) (Perfect Real Time)", Takara Bio Inc.). Further, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to correct the measurement results. Table 3 shows the measurement results of each CYP expression level for each CYP expression level of frozen hepatocytes. The values in Table 3 are ratios (%) when the GAPDH expression level is 100%.

本発明によれば、アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドの製造方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of the liver organoid excellent in the expression level of albumin can be provided.

Claims

肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドを得る分化工程を含む、肝臓オルガノイドの製造方法。 A liver comprising a step of culturing the liver cell aggregate in a differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide to obtain a liver organoid; A method for producing an organoid.

前記分化工程において、前記肝臓細胞凝集塊と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、請求項１に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The method for producing a liver organoid according to claim 1, wherein in the differentiation step, the hepatic cell aggregate is brought into contact with the extracellular matrix and cultured.

前記分化用培地中に含まれる前記ジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、請求項１又は請求項２に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The method for producing a liver organoid according to claim 1 or 2, wherein a volume fraction of the dimethyl sulfoxide contained in the differentiation medium is 0.1% by volume or more.

前記分化用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The liver organoid according to any one of claims 1 to 3, wherein the differentiation medium further contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, HGF, and IGF. Manufacturing method.

前記分化用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The differentiation medium further contains at least one TGF-β inhibitor selected from the group consisting of A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY3644947, SD-208, and SJN2511. The method for producing a liver organoid according to any one of claims 1 to 4.

前記分化用培地が、さらに、ＤＡＰＴ、ジベンザゼピン、ベンゾジアゼピン、及びＬＹ−４１１５７５からなる群より選択される少なくとも１種のＮｏｔｃｈ阻害剤を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The differentiation medium further contains at least one Notch inhibitor selected from the group consisting of DAPT, dibenzazepine, benzodiazepine, and LY-411575. For producing liver organoids of.

前記分化用培地が、さらに、デキサメタゾンを含有する、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The method for producing a liver organoid according to any one of claims 1 to 6, wherein the differentiation medium further contains dexamethasone.

前記分化工程の前に、さらに、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地中で培養し、前記肝臓細胞凝集塊を得る増殖工程を有する、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 Prior to the differentiation step, epithelial hepatic stem cells are further cultured in a growth medium containing at least one selected from the group consisting of ROCK inhibitors and YAP inhibitors, and dimethyl sulfoxide, The method for producing a liver organoid according to any one of claims 1 to 7, which has a proliferation step of obtaining a cell aggregate.

前記増殖用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、請求項８に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The method for producing a liver organoid according to claim 8, wherein the volume fraction of dimethyl sulfoxide contained in the growth medium is 0.1% by volume or more.

前記増殖用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、請求項８又は請求項９に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The method for producing a liver organoid according to claim 8 or 9, wherein the growth medium further contains at least one growth factor selected from the group consisting of EGF, FGF, HGF, and IGF.

前記増殖用培地が、さらに、ニコチンアミドを含有する、請求項８〜請求項１０のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The method for producing a liver organoid according to any one of claims 8 to 10, wherein the growth medium further contains nicotinamide.

前記増殖用培地が、さらに、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ、及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種のＷｎｔアゴニストを含有する、請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The growth medium further contains at least one Wnt agonist selected from the group consisting of Wnt family members, R-spondins 1 to 4, Norrin, and a GSK inhibitor. The method for producing a liver organoid according to any one of claims.

前記増殖用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、請求項８〜請求項１２のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 The growth medium further contains at least one TGF-β inhibitor selected from the group consisting of A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY3644947, SD-208, and SJN2511. The method for producing a liver organoid according to any one of claims 8 to 12.

前記増殖用培地が、さらに、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質、からなる群より選択される少なくとも１種のＢＭＰ阻害剤を含有する、請求項８〜請求項１３のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。 14. The growth medium further contains at least one BMP inhibitor selected from the group consisting of Noggin, DAN, and a DAN-like protein containing Cerberug and Gremlin, 14. The method for producing a liver organoid according to one item.

ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイド製造用培地。 A medium for producing a liver organoid, which comprises at least one selected from the group consisting of a ROCK inhibitor and a YAP inhibitor, and dimethyl sulfoxide.

請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、肝臓オルガノイド。 A liver organoid produced by the production method according to any one of claims 1 to 14.

上皮肝幹細胞を培養して得られる肝臓オルガノイドであって、
アルブミンの発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のアルブミンの発現量に対して、２倍〜１０００倍である肝臓オルガノイド。 A liver organoid obtained by culturing epithelial hepatic stem cells,
A liver organoid in which the expression level of albumin is 2 to 1000 times the expression level of albumin in the tissue piece containing the epithelial hepatic stem cells.

ＣＹＰ２Ｃ１９の発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のＣＹＰ２Ｃ１９の発現量に対して、５０％〜２００％である、請求項１７に記載の肝臓オルガノイド。 The liver organoid according to claim 17, wherein the expression level of CYP2C19 is 50% to 200% with respect to the expression level of CYP2C19 in the tissue piece containing the epithelial hepatic stem cells.

請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドを含有する細胞製剤。 A cell preparation containing the liver organoid according to any one of claims 16 to 18.

請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドに被験物質を接触させる工程、前記被験物質に対する前記肝臓オルガノイドの代謝能を評価する工程、を含む前記被験物質の評価方法。 A method for evaluating a test substance, comprising: a step of bringing a test substance into contact with the liver organoid according to any one of claims 16 to 18, and a step of evaluating the metabolic ability of the liver organoid with respect to the test substance.