JP2020091175A - Thymus cancer biomarker and thymus tumor prognostic marker - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書には、胸腺癌バイオマーカーの検出方法、胸腺癌のバイオマーカー、胸腺癌のバイオマーカーを検出するための検査試薬、及び胸腺癌の検出装置が開示される。また、本明細書には、胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法、胸腺腫瘍の予後予測マーカー、胸腺腫瘍の予後予測マーカーを検出するための検査試薬、及び胸腺腫瘍の予後予測装置が開示される。 Disclosed herein are a thymic cancer biomarker detection method, a thymic cancer biomarker, a test reagent for detecting a thymic cancer biomarker, and a thymic cancer detection device. Also disclosed herein are a method for detecting a prognostic marker for thymic tumor, a prognostic marker for thymic tumor, a test reagent for detecting a prognostic marker for thymic tumor, and a prognostic device for thymic tumor. ..
胸腺癌は、病理組織診断において胸腺腫との鑑別が難しい癌である。胸腺癌と良性の胸腺腫との鑑別にはＣＤ５又はｃ−Ｋｉｔ（ＣＤｌ１７）などの発現が用いられている（非特許文献１）。 Thymic carcinoma is a cancer that is difficult to distinguish from thymoma in histopathological diagnosis. Expression of CD5 or c-Kit (CD117) is used to distinguish benign thymoma from benign thymoma (Non-Patent Document 1).
しかし、ＣＤ５又はｃ−ｋｉｔは胸腺癌の約２０％程度では発現せず、稀に胸腺腫でも発現する。また、ＣＤ５又はｃ−ｋｉｔは肥満細胞や造血幹細胞など正常組織にも発現が認められる。したがって、ＣＤ５及びｃ−ｋｉｔは検出率の高い胸腺癌のバイオマーカーであるとはいえない。 However, CD5 or c-kit is not expressed in about 20% of thymic carcinomas, and is rarely expressed in thymoma. Expression of CD5 or c-kit is also found in normal tissues such as mast cells and hematopoietic stem cells. Therefore, it cannot be said that CD5 and c-kit are thymic cancer biomarkers with high detection rates.
また、胸腺腫瘍では、胸腺癌と胸腺腫は共に悪性腫瘍である。胸腺癌と胸腺腫の病理組織学上の違いはｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃと呼ばれる胸腺本来の形態的特徴の有無とされている。胸腺腫は、ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃが認められ、腫瘍組織内に胸腺本来の形態を含む。これに対して、胸腺癌はｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃが認められないことが一般的である。しかし、胸腺癌と胸腺腫は、形態学的特徴による鑑別が困難な場合がある。 In thymic tumors, both thymic carcinoma and thymoma are malignant tumors. The difference in the histopathology between thymic carcinoma and thymoma is said to be the presence or absence of the original morphological characteristics of the thymus called organotypic. The thymoma is found to be organotypic and contains the original morphology of the thymus in the tumor tissue. On the other hand, thymic cancer generally does not have organotypic properties. However, thymic carcinoma and thymoma may be difficult to distinguish by their morphological characteristics.
そこで、本発明は胸腺癌を検出すること、及び胸腺癌のバイオマーカーを提供することを課題とする。また、本発明は胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測すること、及び胸腺腫瘍の予後予測マーカーを提供することを課題とする。 Therefore, it is an object of the present invention to detect thymic cancer and to provide a biomarker for thymic cancer. Another object of the present invention is to predict the prognosis of a subject having a thymic tumor and to provide a prognostic marker for the thymic tumor.
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、ＰＲＡＭＥが胸腺癌のバイオマーカー、並びに胸腺腫瘍の予後予測マーカーになり得ることを見出した。
本開示は、以下の態様を含む。
項１．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出する工程を含む、胸腺癌バイオマーカーの検出方法。
項２．ＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であると決定する工程をさらに含む、項１に記載の検出方法。
項３．ＰＲＡＭＥの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、項１又は２に記載の検出方法。
項４．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出する工程を含む、胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法。
項５．ＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記被検体の予後が不良であると決定する工程をさらに含む、項４に記載の検出方法。
項６．ＰＲＡＭＥの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、項４又は５に記載の検出方法。
項７．胸腺腫瘍の細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、胸腺癌のバイオマーカーとして使用する方法。
項８．胸腺腫瘍の細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用する方法。
項９．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、胸腺癌のバイオマーカーとして検出するため検査試薬であって、前記検査試薬は、ＰＲＡＭＥを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
項１０．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するためのバイオマーカーとして検出するため検査試薬であって、前記検査試薬は、ＰＲＡＭＥを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
項１１．ＰＲＡＭＥからなる、胸腺癌のバイオマーカー。
項１２．ＰＲＡＭＥからなる、胸腺腫瘍の予後予測マーカー。
項１３．処理部を備える、胸腺癌の検出装置であって、前記処理部は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではないことを示すラベルを出力する、
予後予測装置。
項１４．処理部を備える、胸腺腫瘍の予後予測装置であって、前記処理部は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記被検体の予後が不良であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記被検体の予後が良好であることを示すラベルを出力する、予後予測装置。
The inventors of the present invention have conducted extensive studies and found that PRAME can be a biomarker of thymic cancer and a prognostic marker of thymic tumor.
The present disclosure includes the following aspects.
Item 1. A method for detecting a thymic cancer biomarker, which comprises the step of detecting PRAME in thymic tumor cells collected from a subject.
Item 2. Item 2. The detection method according to Item 1, further comprising a step of determining that the thymic tumor is thymic cancer when PRAME is detected.
Item 3. Item 3. The detection method according to Item 1 or 2, wherein PRAME is detected by immunostaining of a tumor tissue.
Item 4. A method for detecting a prognostic marker for thymic tumor, comprising the step of detecting PRAME in thymic tumor cells collected from a subject.
Item 5. Item 5. The detection method according to Item 4, further comprising the step of determining that the prognosis of the subject is poor when PRAME is detected.
Item 6. Item 6. The detection method according to Item 4 or 5, wherein PRAME is detected by immunostaining of a tumor tissue.
Item 7. A method of using PRAME existing in cells of thymic tumor as a biomarker of thymic cancer.
Item 8. A method of using PRAME present in cells of a thymic tumor as a biomarker for predicting the prognosis of a subject having the thymic tumor.
Item 9. A test reagent for detecting PRAME present in a thymic tumor cell collected from a subject as a biomarker for thymic cancer, the test reagent containing an antibody or a nucleic acid for detecting PRAME. reagent.
Item 10. A test reagent for detecting PRAME present in thymic tumor cells collected from a subject as a biomarker for predicting the prognosis of a subject having the thymic tumor, wherein the test reagent detects PRAME A test reagent containing an antibody or a nucleic acid for
Item 11. A thymic cancer biomarker consisting of PRAME.
Item 12. A prognostic marker for thymic tumors consisting of PRAME.
Item 13. A detection apparatus for thymic cancer comprising a processing unit, wherein the processing unit acquires a measured value of PRAME in thymic tumor cells collected from a subject, and compares the acquired measured value with a reference value, When the obtained measurement value is higher than the reference value, the label indicating that the thymic tumor cells are thymic cancer cells is output, and/or the obtained measurement value is lower than the reference value. Outputting a label indicating that the thymic tumor cells are not thymic cancer cells,
Prognosis prediction device.
Item 14. A thymic tumor prognosis prediction apparatus comprising a processing unit, wherein the processing unit acquires a measured value of PRAME in thymic tumor cells collected from a subject, and compares the acquired measured value with a reference value. When the acquired measurement value is higher than the reference value, a label indicating that the prognosis of the subject is poor is output, and/or the acquired measurement value is lower than the reference value. A prognosis prediction device that outputs a label indicating that the subject has a good prognosis.
胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出することにより、胸腺癌を検出することができる。胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出することにより、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測することができる。 By detecting PRAME in thymic tumor cells, thymic cancer can be detected. By detecting PRAME in thymic tumor cells, it is possible to predict the prognosis of a subject having the thymic tumor.
１．用語の説明
ＰＲＡＭＥは、ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａと呼ばれる抗原の一種であり、精巣以外の正常組織での発現は認められないことが報告されている。ＰＲＡＭＥは、ＣＴ１３０、ＭＡＰＥ、ＯＩＰ−４、ＯＩＰ４とも呼ばれ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにＧｅｎｅ ＩＤ：２３５３２で登録されている遺伝子から発現される。ＰＲＡＭＥからなるバイオマーカーには、前記遺伝子から発現されるタンパク質、又はｍＲＮＡが含まれる。また、バイオマーカーには、前記遺伝子から発現されるタンパク質、又はｍＲＮＡの他、そのバリアントも含む。
1. Explanation of terms PRAME is a kind of antigen called preferentially expressed antigen in melanoma, and it has been reported that its expression is not observed in normal tissues other than testis. PRAME is also called CT130, MAPE, OIP-4, OIP4, and is expressed from a gene registered in National Center for Biotechnology Information under Gene ID: 23532. The biomarker composed of PRAME includes a protein expressed from the gene or mRNA. Further, the biomarkers include variants expressed in addition to the proteins or mRNA expressed from the above genes.
胸腺腫瘍は、胸腺に存在する細胞に由来する腫瘍である限り制限されない。胸腺腫瘍には、胸腺癌、胸腺腫、胸腺内分泌腫瘍等が含まれ得る。胸腺癌と胸腺腫は共に悪性腫瘍である。 The thymic tumor is not limited as long as it is a tumor derived from cells present in the thymus. Thymic tumors can include thymic carcinomas, thymoma, thymic endocrine tumors and the like. Both thymic carcinoma and thymoma are malignant tumors.
胸腺癌は、臨床的には胸腺癌は胸腺腫より悪性度が高く、予後も不良とされている。言い換えると、胸腺癌は他の癌と同様に遠隔転移を起こしやすい、成長も早い、及び／又は術後再発を起こしやすい等の臨床的特徴を有する。このため、胸腺癌の場合には、手術により腫瘍を切除した後、放射線治療や化学療法を行うことが必要となる。一方、胸腺腫はゆっくり成長する、遠隔転移を起こさない、及び／又は再発したとしても胸腔内の局所再発である等の臨床的特徴を有する。このため、胸腺腫の場合には、再発時、再度手術で切除することにより根治を望むことが可能とされている。 Thymic cancer is clinically considered to have a higher malignancy than thymoma and a poor prognosis. In other words, thymic cancer has clinical features such as distant metastasis, fast growth, and/or postoperative recurrence, like other cancers. Therefore, in the case of thymic cancer, it is necessary to perform radiation therapy or chemotherapy after excision of the tumor by surgery. On the other hand, thymoma has clinical features such as slow growth, no distant metastasis, and/or local recurrence within the thoracic cavity, if any. Therefore, in the case of thymoma, it is possible to hope for radical cure by re-surgery again at the time of recurrence.
胸腺癌には、扁平上皮癌、類基底細胞癌、粘液表皮癌、リンパ上皮癌、明細胞癌等が含まれ得る。好ましくは、扁平上皮癌である。胸腺腫には、胸腺腫タイプＡ、胸腺腫タイプＡＢ、胸腺腫タイプＢ１、胸腺腫タイプＢ２、及び胸腺腫タイプＢ３等が含まれ得る。 Thymic carcinoma can include squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, mucoepidermoid carcinoma, lymphoepithelial carcinoma, clear cell carcinoma and the like. Squamous cell carcinoma is preferred. Thymoma may include thymoma type A, thymoma type AB, thymoma type B1, thymoma type B2, thymoma type B3, and the like.
胸腺腫瘍は、胸腺に存在していても良いが、リンパ節、静脈、動脈、脳、副腎、肝臓、胸膜、肺、骨等に存在していてもよい。また、胸腺腫瘍は、初発であっても再発であってもよい。好ましくは、初発である。
被検体は、胸腺腫瘍を有する者である限り制限されない。
The thymic tumor may be present in the thymus, but may also be present in lymph nodes, veins, arteries, brain, adrenal gland, liver, pleura, lungs, bones and the like. Also, the thymic tumor may be initial or recurrent. It is preferably the first shot.
The subject is not limited as long as it has a thymic tumor.
本開示において、「予後」は、被検体の帰趨を意図する。被検体の帰趨は、その被検体が有する胸腺腫瘍の影響による帰趨である。予後が不良とは、腫瘍が遠隔転移を起こしやすい、及び／又は再発しやすく、結果的に前記胸腺腫瘍を有する被検体を腫瘍死させる可能性が高いことを意図する。この場合、腫瘍の外科的切除のみならず、放射線治療や化学療法を行う必要がある。予後が良好とは、腫瘍が遠隔転移や浸潤を起こさず、限局的であり、腫瘍の成長が遅く、前記胸腺腫瘍を有する被検体を腫瘍死させる可能性が低いことを意図する。 In the present disclosure, "prognosis" intends the outcome of the subject. The result of the subject is the result of the influence of the thymic tumor of the subject. A poor prognosis is intended to mean that the tumor is prone to distant metastasis and/or recurrence, resulting in a high risk of tumor death in a subject having the thymic tumor. In this case, not only surgical excision of the tumor, but also radiation therapy and chemotherapy must be performed. A good prognosis is intended to mean that the tumor does not undergo distant metastasis or invasion, is localized, has slow tumor growth, and is unlikely to cause death of a subject having the thymic tumor.
２．バイオマーカー及びその検出方法
本開示のある態様は、胸腺癌のバイオマーカー及びその検出方法に関する。前記検出方法は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出することを含む。すなわち、胸腺腫瘍の腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥタンパク質又はＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡは、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であるか否かを決定するためのバイオマーカーとして検出することができる。また、胸腺腫瘍の腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥタンパク質又はＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡは、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後が不良であるか否かを決定するためのバイオマーカー（胸腺腫瘍の予後予測マーカー）として検出することができる。
2. Biomarker and its detection method One aspect of this indication is related with a thymic cancer biomarker and its detection method. The detection method includes detecting PRAME in thymic tumor cells collected from a subject. That is, PRAME protein or PRAME mRNA in tumor cells of thymic tumor can be detected as a biomarker for determining whether the thymic tumor is thymic cancer. In addition, PRAME protein or PRAME mRNA in tumor cells of thymic tumors is detected as a biomarker (a prognostic marker for thymic tumor prognosis) for determining whether the subject having the thymic tumor has a poor prognosis. be able to.
胸腺腫瘍内のＰＲＡＭＥの検出は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織を用いて行う限り制限されない。胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織は、例えば、原発巣又は転移巣からの手術による切除又は生検、内視鏡下における切除又は生検、胸水からの分離等により採取することができる。腫瘍組織であるか、正常組織であるかの判定は、肉眼的所見、顕微鏡観察等で行うことができる。また、細胞増殖能を指標として腫瘍組織であるか否かを判定してもよい。細胞増殖能を指標として腫瘍組織であるか否かを判定する場合には、例えば検査対象組織のＢｒｄＵやＫｉ−６７タンパク質のラベリングインデックスが正常組織と比較して高い場合に、前記検査対象組織が腫瘍組織である可能性が高いと判定することができる。 Detection of PRAME in a thymic tumor is not limited as long as it is performed using thymic tumor cells or thymic tumor tissue collected from a subject. The thymic tumor cells or thymic tumor tissue can be collected by, for example, surgical excision or biopsy from a primary lesion or metastatic lesion, excision or biopsy under an endoscope, separation from pleural effusion, and the like. The determination as to whether it is a tumor tissue or a normal tissue can be made by macroscopic observation, microscopic observation, or the like. Further, it may be determined whether or not it is a tumor tissue using the cell proliferation ability as an index. When determining whether or not the tissue is a tumor tissue using the cell proliferation ability as an index, for example, when the labeling index of BrdU or Ki-67 protein of the tissue to be examined is higher than that of normal tissue, the tissue to be examined is It can be determined that there is a high possibility that it is a tumor tissue.
被検体から採取された胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織は、ＰＲＡＭＥの検出方法に応じて前処理される。 The thymic tumor cells or thymic tumor tissue collected from the subject are pretreated according to the detection method of PRAME.
胸腺腫瘍内のＰＲＡＭＥは、タンパク質として、又はｍＲＮＡとして検出することができる。 PRAME in thymic tumors can be detected as protein or as mRNA.
ＰＲＡＭＥをタンパク質として検出する方法として、免疫染色、ウエスタンブロッティング等の公知の方法を挙げることができる。また、ＰＲＡＭＥをｍＲＮＡとして検出する方法として、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ（定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む）、マイクロアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ等の公知の方法を挙げることができる。 Examples of the method for detecting PRAME as a protein include known methods such as immunostaining and Western blotting. As a method for detecting PRAME as mRNA, known methods such as in situ hybridization, RT-PCR (including quantitative RT-PCR), microarray, RNA-Seq, etc. can be mentioned.
胸腺腫瘍組織を使って、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、胸腺腫瘍組織をホルマリン、及びパラホルムアルデヒド等の公知の固定液で固定してから、パラフィン包埋ブロックを作製する。あるいは、胸腺腫瘍組織を固定してから、あるいは固定せずに、ＯＣＴコンパウンド（登録商標）等の凍結ブロック作製用の樹脂に包埋し、凍結ブロックを作製する。次に、作製したパラフィン包埋ブロック、又は凍結ブロックを薄切して組織切片を作製し、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに供する。ここで、ブロックに包埋されている胸腺腫瘍組織は、腫瘍部のみであっても良いが例えば正常部位等を含んでいてもよい。 When immunostaining or in situ hybridization is performed using a thymic tumor tissue, as a pretreatment, the thymic tumor tissue is fixed with a known fixative such as formalin and paraformaldehyde, and then the paraffin-embedded block is used. Create. Alternatively, the thymic tumor tissue is fixed or not fixed, and then embedded in a resin for producing a frozen block such as OCT Compound (registered trademark) to produce a frozen block. Next, the prepared paraffin-embedded block or frozen block is sliced to prepare a tissue section, and subjected to immunostaining or in situ hybridization. Here, the thymic tumor tissue embedded in the block may be only the tumor part, but may include, for example, a normal site.
胸腺腫瘍細胞を使って、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、細胞をスライドグラスに塗抹又は収集し、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、及びエタノール等で固定する。 When immunostaining or in situ hybridization is performed using thymic tumor cells, as a pretreatment, the cells are smeared or collected on a slide glass and fixed with formalin, paraformaldehyde, ethanol or the like.
ＰＲＡＭＥをタンパク質としてウエスタンブロッティング等で検出する場合には、前処理として、胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織を所定の溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーで溶解されたサンプルを検査サンプルとする。 When PRAME is detected as a protein by Western blotting or the like, as a pretreatment, thymic tumor cells or thymic tumor tissues are lysed with a predetermined lysis buffer. The sample dissolved in the lysis buffer is used as the test sample.
ＰＲＡＭＥをｍＲＮＡとしてＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ等で検出する場合には、前処理として、胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。また、必要に応じて、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として逆転写を行い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成しても良い。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡを検査サンプルとする。 When PRAME is detected as mRNA using RT-PCR, microarray, RNA-Seq, etc., total RNA or mRNA is extracted from thymic tumor cells or thymic tumor tissue as a pretreatment. If necessary, reverse transcription may be performed using the extracted total RNA or mRNA as a template to synthesize complementary DNA (cDNA). The test sample is total RNA, mRNA, or cDNA.
免疫染色又はウエスタンブロッティングによってＰＲＡＭＥを検出するための一次抗体は、ＰＲＡＭＥを検出できる限り制限されない。例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ 社製のＡｎｔｉ−ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＲ Ｐｏｗｅｒｅｄ ｂｙ Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＰＡ０４５１５３）、ＡＮＴＩ−ＭＡＰＥ（Ｃ−ＴＥＲＭＩＮＡＬ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＡＢ１３０６５１５）、Ａｎｔｉ−ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＡＢ１４０１５９０）、Ａｎｔｉ−ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＡＢ１４０７２２２）、Ａｎｔｉ−ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＡＢ２１０８３００）等を挙げることができる。ＰＲＡＭＥと結合した一次抗体は、一次抗体と結合する酵素標識二次抗体と、前記酵素と基質の反応により検出することができる。免疫染色を行う場合には、脱パラフィン及び浸水処理を行った後に、組織切片をトリプシン等のタンパク分解酵素で処理してから、免疫染色を行ってもよい。 The primary antibody for detecting PRAME by immunostaining or Western blotting is not limited as long as PRAME can be detected. For example, SIGMA-ALDRICH Corp. of Anti-PRAME antibody produced in rabbit Prestige AntibodiesR Powered by Atlas Antibodies, affinity isolated antibody, buffered aqueous glycerol solution (HPA045153), ANTI-MAPE (C-TERMINAL) antibody produced in rabbit purified immunoglobulin, buffered aqueous solution (SAB1306515), Anti-PRAME antibody produced in rabbit purified immunoglobulin, buffered aqueous solution (SAB1401590), Anti-PRAME antibody produced in mouse purified immunoglobulin, buffered aqueous solution (SAB1407222), Anti-PRAME antibody produced in rabbit affinity isolated Antibody (SAB2108300) and the like. The primary antibody bound to PRAME can be detected by the reaction of the enzyme-labeled secondary antibody binding to the primary antibody and the enzyme and the substrate. When immunostaining is performed, the tissue sections may be treated with a proteolytic enzyme such as trypsin after deparaffinization and water immersion treatment, and then immunostaining may be performed.
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに使用するプローブの作製方法は公知である。また、市販のプローブを使用してもよい。 A method for producing a probe used for in situ hybridization is known. Moreover, you may use a commercially available probe.
ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマー（定量的ＲＴ−ＰＣＲの場合にはプローブを含んでいても良い）は市販されているものを使用することができる。また、マイクロアレイも市販されているものを使用することができる。 As the primer used in RT-PCR (which may include a probe in the case of quantitative RT-PCR), a commercially available product can be used. In addition, a commercially available microarray can be used.
ＲＮＡ−Ｓｅｑは、次世代シーケンサー（例えば、イルミナ社製）等を使用して、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡのリード数を得ることができる。 For RNA-Seq, the number of reads of PRAME mRNA can be obtained using a next-generation sequencer (for example, Illumina).
免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによってＰＲＡＭＥを検出する場合、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションが施された組織標本を顕微鏡、又はスライドスキャナ等を使ってヒトが観察することにより、ＰＲＡＭＥの有無を検出することができる。組織標本内の腫瘍細胞内に免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションのシグナルが確認された場合に、ＰＲＡＭＥが検出されたと判定（決定）することができる。細胞内にＰＲＡＭＥを有する腫瘍細胞が組織標本内の腫瘍部に１つでも検出された場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定しても良い。あるいは、例えば、顕微鏡、又はスライドスキャナの所定の区画に存在している腫瘍細胞の個数を１００％とした時に、細胞内にＰＲＡＭＥを有する腫瘍細胞が１０％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１％以上存在している場合に「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。 When PRAME is detected by immunostaining or in situ hybridization, the presence or absence of PRAME is detected by observing a tissue sample subjected to immunostaining or in situ hybridization with a microscope or a slide scanner. be able to. When a signal of immunostaining or in situ hybridization is confirmed in the tumor cells in the tissue sample, it can be determined (determined) that PRAME has been detected. When even one tumor cell having PRAME in the cell is detected in the tumor part in the tissue sample, it may be determined that "PRAME is detected" or "expression of PRAME is positive". Alternatively, for example, when the number of tumor cells existing in a predetermined section of a microscope or a slide scanner is 100%, the number of tumor cells having PRAME in the cells is 10% or more, preferably 5% or more, more preferably May be determined to be “PRAME detected” or “PRAME expression is positive” when 1% or more is present.
ウエスタンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＴ、ＲＮＡ−Ｓｅｑによって、ＰＲＡＭＥを検出する場合、腫瘍細胞又は腫瘍組織から抽出されたサンプルにおいてＰＲＡＭＥが検出された場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。あるいは、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルと正常細胞又は正常組織由来するＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量を比較して、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルにおけるＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量よりも高値を示す場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。また、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルにおけるＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量と同程度である場合に、「ＰＲＡＭＥが検出されていない」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陰性である」と決定してもよい。ここで、「高値を示す」とは、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上高い値を示す場合を例示できる。「同程度」とは、０．８倍から１．１倍程度を例示できる。また、ＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量を比較する前に、各検査サンプル中のタンパク質量、又はＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、β−アクチン等のハウスキーピング遺伝子由来のタンパク質量又はｍＲＮＡ量で正規化してもよい。タンパク質量は質量、又は濃度で表されても良いが、基質の発光強度等で表されても良い。ｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡのコピー数又はリード数であっても良いが、蛍光強度等で表されてもよい。 When PRAME is detected by Western blotting, RT-PCT, RNA-Seq, “PRAME is detected” or “PRAME expression” is detected when PRAME is detected in a sample extracted from tumor cells or tumor tissues. Is positive.” Alternatively, the amount of PRAME protein in the test sample derived from tumor cells or tumor tissues is compared by comparing the amount of PRAME protein derived from tumor cells or tumor tissue with the amount of PRAME protein derived from normal cells or normal tissue, or the amount of PRAME mRNA. , Or when the amount of PRAME mRNA is higher than the amount of PRAME protein derived from normal cells or normal tissues or the amount of PRAME mRNA, "PRAME was detected" or "expression of PRAME is positive" You may decide. When the amount of PRAME protein or the amount of PRAME mRNA in a test sample derived from a tumor cell or tumor tissue is similar to the amount of PRAME protein derived from normal cells or normal tissue or the amount of PRAME mRNA, It may be determined that "PRAME is not detected" or "the expression of PRAME is negative". Here, “showing a high value” may be, for example, 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, further preferably 5 times or more. "Similar" can be exemplified by about 0.8 times to 1.1 times. In addition, before comparing the amount of PRAME protein or the amount of PRAME mRNA, the protein amount or RNA amount in each test sample was determined by using a protein derived from a housekeeping gene such as GAPDH, β 2 -microglobulin, or β-actin. The amount or mRNA amount may be used for normalization. The protein amount may be represented by mass or concentration, but may also be represented by the emission intensity of the substrate or the like. The amount of mRNA may be the number of copies of mRNA or the number of reads, but may be represented by fluorescence intensity or the like.
別の態様として、あらかじめＰＲＡＭＥタンパク質量又はＲＮＡ量の基準値をあらかじめ決定しておき、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプル中のＰＲＡＭＥタンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも高い場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。また、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプル中のＰＲＡＭＥタンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも低い場合に、「ＰＲＡＭＥが検出されない」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陰性である」と決定してもよい。基準値は、ＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値である限り制限されず、公知の方法により決定することができる。ＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値は、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）曲線、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等により決定することもできる。また、基準値として、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、第一四分位数等を例示できる。 In another embodiment, a reference value for the amount of PRAME protein or RNA is determined in advance, and when the amount of PRAME protein or RNA in a test sample derived from tumor cells or tumor tissues is higher than the reference value, PRAME was detected" or "expression of PRAME is positive" may be determined. Further, when the amount of PRAME protein or RNA in the test sample derived from tumor cells or tumor tissues is lower than the reference value, it is determined that "PRAME is not detected" or "expression of PRAME is negative". Good. The reference value is not limited as long as it can determine whether the amount of PRAME protein or the amount of PRAME mRNA is detected or the expression is positive, and can be determined by a known method. The value that can determine whether the amount of PRAME protein or the amount of PRAME mRNA is detected or whether the expression is positive is a ROC (receiver operating characteristic curve) curve, discriminant analysis method, modal method, Kittler method, 3σ method. , P-tile method or the like. Further, as the reference value, sensitivity, specificity, negative predictive value, positive predictive value, first quartile, etc. can be exemplified.
胸腺癌バイオマーカーの検出方法は、さらにＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であると決定する工程を含んでいてもよい。あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合に、胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではない決定する工程を含んでいてもよい。また、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であると決定することに変えて、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺腫細胞ではないと決定してもよい。また、胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではないと決定することに変えて、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺腫細胞であると決定してもよい。 The method for detecting a thymic cancer biomarker may further include the step of determining that the thymic tumor cells are thymic cancer cells when PRAME is detected. Alternatively, it may include the step of determining that the thymic tumor cells are not thymoma cells if PRAME was not detected. Further, instead of determining that the thymic tumor cells are thymoma cells, it may be determined that the thymoma cells are not thymoma cells. Further, instead of determining that the thymic tumor cells are not thymic cancer cells, the thymic tumor cells may be determined to be thymoma cells.
また、胸腺癌バイオマーカーの検出方法は、胸腺腫瘍細胞内にＰＲＡＭＥが検出されたか否かに応じて、必要な治療方法を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、腫瘍の外科的切除に加えて、放射線治療及び／又は化学療法の適用を行うことを決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、腫瘍の外科的切除後経過観察を行うと決定しても良い。さらに、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、術後５年間経過観察を行うと決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、術後１０年間経過観察を行うと決定してもよい。 In addition, the method for detecting a thymic cancer biomarker may include a step of determining a necessary treatment method depending on whether or not PRAME is detected in thymic tumor cells. For example, if PRAME is detected, it may be decided to apply radiation and/or chemotherapy in addition to surgical excision of the tumor. Further, when PRAME is not detected, it may be decided to carry out follow-up observation after surgical resection of the tumor. Furthermore, if PRAME is detected, it may be decided to carry out follow-up observation for 5 years after the operation. Further, if PRAME is not detected, it may be decided to carry out follow-up observation for 10 years after the operation.
胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法は、さらにＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後が不良であると決定する工程を含んでいてもよい。あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合に、胸腺腫瘍を有する被検体の予後が良好であると決定する工程を含んでいてもよい。 The method for detecting a prognostic marker for thymic tumor may further include the step of determining that the subject having the thymic tumor has a poor prognosis when PRAME is detected. Alternatively, the method may include a step of determining that a subject having a thymic tumor has a favorable prognosis when PRAME is not detected.
また、胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法は、胸腺腫瘍細胞内にＰＲＡＭＥが検出されたか否かに応じて、必要な治療方法を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、腫瘍の外科的切除に加えて、放射線治療及び／又は化学療法の適用を行うことを決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、腫瘍の外科的切除後経過観察を行うと決定しても良い。さらに、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、術後５年間経過観察を行うと決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、術後１０年間経過観察を行うと決定してもよい。 Further, the method for detecting a prognostic marker for thymic tumor may include a step of determining a necessary treatment method depending on whether or not PRAME is detected in the thymic tumor cells. For example, if PRAME is detected, it may be decided to apply radiation and/or chemotherapy in addition to surgical excision of the tumor. Further, when PRAME is not detected, it may be decided to carry out follow-up observation after surgical resection of the tumor. Furthermore, if PRAME is detected, it may be decided to carry out follow-up observation for 5 years after the operation. Further, if PRAME is not detected, it may be decided to carry out follow-up observation for 10 years after the operation.
３．検査試薬
本開示の別の態様は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺癌のバイオマーカーとして検出するため検査試薬に関する。また、前記検査試薬は、胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するために使用されうる。
3. Test Reagent Another aspect of the present disclosure relates to a test reagent for detecting PRAME present in thymic tumor cells collected from a subject as a biomarker for the thymic cancer. In addition, the test reagent can be used to predict the prognosis of a subject having a thymic tumor.
検査試薬は、ＰＲＡＭＥタンパク質検出用試薬及び／又はＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ検出用試薬を含み得る。 The test reagent may include a PRAME protein detection reagent and/or a PRAME mRNA detection reagent.
ＰＲＡＭＥタンパク質検出用試薬は、少なくともＰＲＡＭＥタンパク質の一部に結合可能な一種又は複数の抗体（例えば、一次抗体）を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、ｓｃＦｖ等であってもよい。
また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。
The PRAME protein detection reagent contains at least one antibody (eg, primary antibody) capable of binding to at least part of the PRAME protein. As the “antibody”, any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a fragment thereof (eg, Fab, F(ab′), F(ab) 2 etc.) can be used. The class and subclass of immunoglobulin is not particularly limited. The antibody may be one screened from an antibody library, or may be a chimeric antibody, scFv, or the like.
Further, the antibody does not necessarily have to be purified, and may be antiserum containing the antibody, ascites, immunoglobulin fraction fractionated from these, or the like.
検査試薬に含まれる抗体は、乾燥状態であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファーに溶解されていてもよい。さらに、検査試薬は、β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ等の安定化剤；アルブミン等の保護剤；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤等の少なくとも一つを含んでいてもよい。 The antibody contained in the test reagent may be in a dry state or may be dissolved in a buffer such as phosphate buffered saline. Further, the test reagents include stabilizers such as β-mercaptoethanol and DTT; protective agents such as albumin; surfactants such as polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate and polyoxyethylene (10) octylphenyl ether; It may contain at least one preservative such as sodium azide.
ＰＲＡＭＥと結合する抗体は、酵素や蛍光色素で標識されていてもよい。ＰＲＡＭＥと結合する抗体はマイクロプレート、磁気ビーズ等に固定されていてもよい。 The antibody that binds to PRAME may be labeled with an enzyme or a fluorescent dye. The antibody that binds to PRAME may be immobilized on a microplate, magnetic beads, or the like.
ＰＲＡＭＥタンパク質検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＰＲＡＭＥと結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに酵素又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。 The PRAME protein detection reagent may be provided as a test kit including a test reagent and a package insert describing a method of using the reagent or a URL of a web page describing the method of using the reagent. If the antibody that binds to PRAME is an unlabeled primary antibody, the test kit may include a secondary antibody labeled with an enzyme or a fluorescent dye. Furthermore, the test kit may contain a substrate that reacts with the enzyme.
ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ検出用試薬は、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡの全体又は一部とハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、プライマー、及び／又はプローブとしての機能を有する検出用の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であることが好ましい。検出用核酸の長さは、特に制限されない。 The PRAME mRNA detection reagent contains a nucleic acid that hybridizes with all or part of PRAME mRNA or PRAME cDNA. The nucleic acid is preferably a nucleic acid for detection (DNA or RNA) having a function as a primer and/or a probe. The length of the nucleic acid for detection is not particularly limited.
検出用核酸が、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーであれば、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは５０ ｍｅｒ以下であり、より好ましくは３０ ｍｅｒ以下であり、さらに好ましくは、１５〜２５ ｍｅｒ程度である。プライマーには、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。また、プライマーは、蛍光色素等で標識されていてもよい。 If the nucleic acid for detection is a primer used for PCR reaction, the sequence that hybridizes with PRAME mRNA or PRAME cDNA is preferably 50 mer or less, more preferably 30 mer or less, and further preferably 15 mer. It is about 25 mer. The primer may include a sequence that does not hybridize with PRAME mRNA or PRAME cDNA. Further, the primer may be labeled with a fluorescent dye or the like.
また、ＲＴ−ＰＣＲには、プライマーの他にＰＣＲ産物のリアルタイムの定量のために使用される、ＰＣＲ反応中に分解される定量用プローブを使用することもできる。定量用プローブもＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする限り、制限されない。定量用プローブは、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列を含む、５〜２０ ｍｅｒ程度の核酸であることが好ましい。さらに定量用プローブの一端には、蛍光色素が標識され、定量用プローブのもう一端には、当該蛍光色素のクエンチャーが標識されていることが好ましい。 Further, in RT-PCR, besides the primers, a quantification probe that is decomposed during the PCR reaction and used for real-time quantification of PCR products can be used. The quantitation probe is not limited as long as it hybridizes with PRAME mRNA or PRAME cDNA. The quantification probe is preferably a nucleic acid of about 5 to 20 mer containing a sequence that hybridizes with PRAME mRNA or PRAME cDNA. Further, it is preferable that one end of the quantification probe is labeled with a fluorescent dye, and the other end of the quantification probe is labeled with a quencher of the fluorescent dye.
検出用核酸が、マイクロアレイ等においてキャプチャープローブとして使用されるものであれば、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは１００ ｍｅｒ程度であり、より好ましくは６０ ｍｅｒ程度であり、さらに好ましくは、２０〜３０ ｍｅｒ程度である。キャプチャープローブには、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。さらにキャプチャープローブは、チップに固定化されていることが好ましい。 If the nucleic acid for detection is used as a capture probe in a microarray or the like, the sequence that hybridizes with PRAME mRNA or PRAME cDNA is preferably about 100 mer, more preferably about 60 mer, and further preferably Is about 20 to 30 mer. The capture probe may include a sequence that does not hybridize to PRAME mRNA or PRAME cDNA. Furthermore, the capture probe is preferably immobilized on the chip.
検出用核酸が、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブである場合、検出用核酸は、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡとハイブリダイズする配列が、１５〜１００ ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドであってもよく、１００ ｍｅｒを超えるポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブには、ジゴキシゲニン、蛍光色素等の標識物質が結合されうる。プローブには、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。 When the nucleic acid for detection is a probe for in situ hybridization, the nucleic acid for detection may be an oligonucleotide having a sequence that hybridizes with PRAME mRNA of about 15 to 100 mer, and is a polynucleotide exceeding 100 mer. May be The polynucleotide may be DNA or RNA. A labeling substance such as digoxigenin or a fluorescent dye can be bound to the probe for in situ hybridization. The probe may include a sequence that does not hybridize with PRAME mRNA.
ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＲＴ−ＰＣＲによりＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットに核酸増幅試薬（耐熱性ＤＮＡであってもポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ等を含む）、逆転写酵素等を含んでいてもよい。核酸増幅試薬には、必要に応じてＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）等の色素が含まれていてもよい。マイクロアレイによりＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットにハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡを検出する場合には、検査キットに、プロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。 The PRAME mRNA detection reagent may be provided as a test kit including a test reagent and a package insert describing a method of using the reagent or a URL of a web page describing the method of using the reagent. When detecting PRAME mRNA or PRAME cDNA by RT-PCR, the test kit contains a nucleic acid amplification reagent (including thermostable DNA, including polymerase, buffer, dNTP, etc.), reverse transcriptase, etc. Good. The nucleic acid amplification reagent may contain a dye such as SYBER GREEN (registered trademark) if necessary. When PRAME mRNA or PRAME cDNA is detected by a microarray, the test kit may include a hybridization buffer, a washing buffer, and the like. In the case of detecting PRAME mRNA by in situ hybridization, the test kit may contain a proteolytic enzyme such as proteinase K, a hybridization buffer, a washing buffer and the like.
４．胸腺癌の検出装置及び胸腺腫瘍の予後予測装置
４−１．胸腺癌の検出装置の構成
本開示の一実施形態は胸腺癌の検出システム１０００及び胸腺癌の検出装置１０に関する。
4. Thymic cancer detection device and thymic tumor prognosis prediction device 4-1. Configuration of Thymic Cancer Detection Device One embodiment of the present disclosure relates to a thymic cancer detection system 1000 and a thymic cancer detection device 10.
図１は、胸腺癌の検出システム１０００の概観図であり、胸腺癌の検出システム１０００は一態様として、胸腺癌の検出装置１０の他、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備えていてもよい。 FIG. 1 is a schematic view of a thymic cancer detection system 1000. As one mode, the thymic cancer detection system 1000 may include a thymic cancer detection device 10 and an analysis device 5a or an analysis device 5b. ..
図２に、胸腺癌の検出装置１０のブロック図を示す。胸腺癌の検出装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。 FIG. 2 shows a block diagram of the thymic cancer detection apparatus 10. The thymic cancer detection device 10 may be connected to the input unit 111, the output unit 112, and the storage medium 113.
胸腺癌の検出装置１０において、処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。主記憶部１０２と補助記憶部１０４とを合わせて、単に記憶部と呼ぶこともある。記憶部は、前記測定値や基準値を揮発性に、又は不揮発性に記憶する。 In the thymus cancer detection device 10, a processing unit 101, a main storage unit 102, a ROM (read only memory) 103, an auxiliary storage unit 104, a communication interface (I/F) 105, and an input interface (I/F). ) 106, an output interface (I/F) 107, and a media interface (I/F) 108 are connected to each other via a bus 109 so that data communication is possible. The main storage unit 102 and the auxiliary storage unit 104 may be collectively referred to as a storage unit. The storage unit stores the measured value and the reference value in a volatile or non-volatile manner.
処理部１０１は、胸腺癌の検出装置１０のＣＰＵである。処理部１０１は、ＧＰＵであってもよい。処理部１０１が、補助記憶部１０４又はＲＯＭ１０３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、胸腺癌の検出装置１０が機能する。 The processing unit 101 is the CPU of the thymic cancer detection device 10. The processing unit 101 may be a GPU. The processing unit 101 executes the computer program stored in the auxiliary storage unit 104 or the ROM 103 and processes the acquired data, so that the thymic cancer detection device 10 functions.
ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、処理部１０１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。処理部１０１はＭＰＵ１０１としてもよい。ＲＯＭ１０３は、胸腺癌の検出装置１０の起動時に、処理部１０１によって実行されるブートプログラムや胸腺癌の検出装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。 The ROM 103 is composed of a mask ROM, a PROM, an EPROM, an EEPROM, and the like, and stores a computer program executed by the processing unit 101 and data used for the computer program. The processing unit 101 may be the MPU 101. The ROM 103 stores a boot program executed by the processing unit 101 when the thymic cancer detection apparatus 10 is started up and programs and settings related to the operation of the hardware of the thymic cancer detection apparatus 10.
主記憶部１０２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、処理部１０１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。 The main storage unit 102 is configured by a RAM (Random access memory) such as SRAM or DRAM. The main storage unit 102 is used for reading the computer programs recorded in the ROM 103 and the auxiliary storage unit 104. Further, the main storage unit 102 is used as a work area when the processing unit 101 executes these computer programs.
補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、処理部１０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、基準値等を不揮発性に記憶する。 The auxiliary storage unit 104 includes a hard disk, a semiconductor memory device such as a flash memory, an optical disk, or the like. The auxiliary storage unit 104 stores various computer programs to be executed by the processing unit 101 such as an operating system and application programs, and various setting data used for executing the computer programs. Specifically, the reference value and the like are stored in a nonvolatile manner.
通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、処理部１０１の制御下で、分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて胸腺癌の検出装置１０が保存又は生成する情報を、分析装置５ａ，５ｂ又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介して分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器と通信を行ってもよい。 The communication I/F 105 includes a serial interface such as USB, IEEE1394, RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, and IEEE1284, an analog interface including a D/A converter and an A/D converter, a network interface controller ( A network interface controller (NIC) or the like. Under the control of the processing unit 101, the communication I/F 105 receives data from the analysis devices 5a and 5b or other external devices, and analyzes information stored or generated by the thymic cancer detection device 10 as necessary. It is transmitted or displayed on the device 5a, 5b or the outside. The communication I/F 105 may communicate with the analyzers 5a and 5b or other external devices via a network.
入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。 The input I/F 106 is composed of, for example, a serial interface such as USB, IEEE 1394, RS-232C, etc., a parallel interface such as SCSI, IDE, IEEE 1284, etc., and an analog interface such as a D/A converter, A/D converter, etc. It The input I/F 106 receives character input, click, voice input, and the like from the input unit 111. The received input content is stored in the main storage unit 102 or the auxiliary storage unit 104.
入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、胸腺癌の検出装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力部１１１は、胸腺癌の検出装置１０の外部から接続されても、胸腺癌の検出装置１０と一体となっていてもよい。 The input unit 111 includes a touch panel, a keyboard, a mouse, a pen tablet, a microphone, and the like, and performs character input or voice input to the thymic cancer detection device 10. The input unit 111 may be connected from the outside of the thymic cancer detection device 10 or may be integrated with the thymic cancer detection device 10.
出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。 The output I/F 107 is composed of, for example, the same interface as the input I/F 106. The output I/F 107 outputs the information generated by the processing unit 101 to the output unit 112. The output I/F 107 outputs the information generated by the processing unit 101 and stored in the auxiliary storage unit 104 to the output unit 112.
出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、分析装置５ａ，５ｂから送信される測定結果及び胸腺癌の検出装置１０における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。 The output unit 112 is composed of, for example, a display, a printer, and the like, and displays the measurement results transmitted from the analyzers 5a and 5b, various operation windows in the thymic cancer detection device 10, analysis results, and the like.
メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。 The media I/F 108 reads out, for example, application software stored in the storage medium 113. The read application software and the like are stored in the main storage unit 102 or the auxiliary storage unit 104. The media I/F 108 also writes the information generated by the processing unit 101 in the storage medium 113. The media I/F 108 writes the information generated by the processing unit 101 and stored in the auxiliary storage unit 104 into the storage medium 113.
記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。 The storage medium 113 is composed of a flexible disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, or the like. The storage medium 113 is connected to the media I/F 108 by a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DVD-ROM drive, or the like. The storage medium 113 may store an application program or the like for a computer to execute an operation.
処理部１０１は、胸腺癌の検出装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに胸腺癌の検出装置１０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４に記憶することも可能である。 The processing unit 101 may acquire application software and various settings necessary for controlling the thymic cancer detection device 10 via the network instead of reading from the ROM 103 or the auxiliary storage unit 104. The application program is stored in an auxiliary storage unit of a server computer on a network, the thymus cancer detection apparatus 10 accesses the server computer, downloads the computer program, and stores it in the ROM 103 or the auxiliary storage unit 104. It is also possible to do so.
また、ＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、胸腺癌の検出装置１０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。 Further, in the ROM 103 or the auxiliary storage unit 104, an operating system that provides a graphical user interface environment such as Windows (registered trademark) manufactured and sold by Microsoft Corporation in the United States is installed. The application program according to the second embodiment operates on the operating system. That is, the thymic cancer detection device 10 may be a personal computer or the like.
胸腺癌の検出システム１０００は一カ所に設置されている必要はなく、胸腺癌の検出装置１０と分析装置５ａ，５ｂが別所に配置され、これらがネットワークで接続されていてもよい。また、胸腺癌の検出装置１０は、入力部１１１や出力部１１２を省略した操作者を必要としない装置であってもよい。 The thymic cancer detection system 1000 does not need to be installed in one place, and the thymic cancer detection device 10 and the analysis devices 5a and 5b may be arranged in different places and may be connected by a network. Further, the thymic cancer detection device 10 may be a device that does not require an operator and omits the input unit 111 and the output unit 112.
分析装置５ａは、タンパク質の量又は濃度を測定するための装置であり、試料置き場５１と、反応部５２と、検出部５３とを備える。試料置き場５１にセットされた細胞溶解液は、反応部５２に設置された抗原捕捉用抗体が固相されたマイクロプレートに分注されインキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出抗体がマイクロプレートに分注され、インキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出用抗体を検出するための基質がマイクロプレートに分注され、マイクロプレートが検出部５３に移動され、基質が反応して発生したシグナルが測定される。 The analysis device 5a is a device for measuring the amount or concentration of protein, and includes a sample storage space 51, a reaction part 52, and a detection part 53. The cell lysate set in the sample storage 51 is dispensed and incubated in the microplate on which the antigen-capturing antibody is mounted in the reaction section 52. After removing unreacted antigen as needed, the detection antibody is dispensed to the microplate and incubated. After removing unreacted antigen as necessary, a substrate for detecting the detection antibody is dispensed to the microplate, the microplate is moved to the detection unit 53, and the signal generated by the reaction of the substrate is measured. To be done.
また、分析装置５ａの別態様は、マイクロアレイ解析によるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロアレイチップ上に分注し、ハイブリダイゼーションを行い、洗浄した後、検出部５３に移動させシグナルを検出する。 Another embodiment of the analysis device 5a is a device for measuring the expression level of mRNA by microarray analysis, in which the reverse transcription reaction product set in the sample storage space 51 is distributed on the microarray chip set in the reaction part 52. After pouring, hybridization and washing, the sample is moved to the detection unit 53 to detect a signal.
さらに、分析装置５ａの別態様は、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロチューブ内に分注し、続いて定量的ＰＣＲ用試薬をマイクロチューブ内に分注する。反応部５２でＰＣＲ反応を行いながら、検出部５３でチューブ内のシグナルを検出する。 Furthermore, another embodiment of the analyzer 5a is a device for measuring the expression level of mRNA by RT-PCR, in which the reverse transcription reaction product set in the sample storage space 51 is placed in the microtube set in the reaction part 52. Dispense, and then a quantitative PCR reagent is dispensed into a microtube. While performing the PCR reaction in the reaction section 52, the detection section 53 detects the signal in the tube.
分析装置５ｂは、ＲＮＡ−Ｓｅｑ法によってｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、配列解析部５４を備える。ＲＮＡ−Ｓｅｑ用の反応を行ったサンプルを配列解析部５４にセットし、配列解析部５４内で、塩基配列の解析を行う。 The analysis device 5b is a device for measuring the expression level of mRNA by the RNA-Seq method, and includes a sequence analysis unit 54. The sample subjected to the reaction for RNA-Seq is set in the sequence analysis unit 54, and the base sequence is analyzed in the sequence analysis unit 54.
分析装置５ｂは、ウエスタンブロッティングによりタンパク質量を測定するための全自動ウエスタンブロッティング装置であり、化学発光シグナル検出部５４を備える。溶解バッファーで溶解された胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織のサンプルを自動ウエスタンブロッティング装置の所定の位置にセットし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、メンブレンへのブロッティング、抗体反応、化学発光を行い、化学発光シグナル検出部５４にて解析を行いシグナル強度を定量化する。 The analyzer 5b is a fully automatic Western blotting apparatus for measuring the amount of protein by Western blotting, and includes a chemiluminescence signal detection unit 54. A sample of thymic tumor cells or thymic tumor tissue lysed with a lysis buffer is set at a predetermined position of an automatic western blotting device, SDS-PAGE, blotting on a membrane, antibody reaction, chemiluminescence, and chemiluminescence signal detection unit Analysis is performed at 54 to quantify the signal intensity.
分析装置５ａ、及び５ｂは、有線又は無線によって胸腺癌の検出装置１０に接続されている。分析装置５ａは、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして胸腺癌の検出装置１０に送信する。同様に、分析装置５ｂは、ｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして胸腺癌の検出装置１０に送信する。これにより、胸腺癌の検出装置１０は、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値を、演算処理可能なデジタルデータとして取得することができる。 The analysis devices 5a and 5b are connected to the thymic cancer detection device 10 by wire or wirelessly. The analyzer 5a A/D-converts the measured value of the protein or the measured value of the mRNA, and transmits it to the thymus cancer detection apparatus 10 as digital data. Similarly, the analyzer 5b A/D-converts the measured value of mRNA, and transmits it as digital data to the thymus cancer detection apparatus 10. Thereby, the thymic cancer detection apparatus 10 can acquire the measured value of protein or the measured value of mRNA as digital data that can be processed.
４−２．胸腺腫瘍の予後予測装置の構成
本開示の一実施形態は胸腺腫瘍の予後予測システム２０００及び胸腺腫瘍の予後予測装置２０に関する。
4-2. Configuration of Thymic Tumor Prognosis Prediction Apparatus One embodiment of the present disclosure relates to a thymic tumor prognosis prediction system 2000 and a thymic tumor prognosis prediction apparatus 20.
図１は、胸腺腫瘍の予後予測システム２０００の概観図であり、胸腺腫瘍の予後予測システム２０００は一態様として、胸腺腫瘍の予後予測装置２０の他、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備えていてもよい。 FIG. 1 is a schematic view of a thymic tumor prognosis prediction system 2000. The thymus tumor prognosis prediction system 2000 includes, as one aspect, a thymus tumor prognosis prediction device 20 and an analysis device 5a or an analysis device 5b. May be.
図２に、胸腺腫瘍の予後予測装置２０のブロック図を示す。胸腺腫瘍の予後予測装置２０の構成は胸腺癌の検出装置１０と同様である。したがって、上記４−１．の説明は、ここに援用できる。この場合、処理部１０１、主記憶部１０２、ＲＯＭ１０３、補助記憶部１０４、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８、バス１０９、入力部１１１、出力部１１２、記憶媒体１１３を、処理部２０１、主記憶部２０２、ＲＯＭ２０３、補助記憶部２０４、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０５、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０６、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０７、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）２０８、バス２０９、入力部２１１、出力部２１２、記憶媒体２１３と読み替えるものとする。分析装置５ａ，５ｂは、胸腺癌の検出装置１０と同様である。 FIG. 2 shows a block diagram of the thymic tumor prognosis prediction apparatus 20. The configuration of the thymus tumor prognosis prediction device 20 is the same as that of the thymus cancer detection device 10. Therefore, the above 4-1. Can be incorporated herein by reference. In this case, the processing unit 101, main storage unit 102, ROM 103, auxiliary storage unit 104, communication interface (I/F) 105, input interface (I/F) 106, output interface (I/F) 107, media interface (I /F) 108, bus 109, input unit 111, output unit 112, storage medium 113, processing unit 201, main storage unit 202, ROM 203, auxiliary storage unit 204, communication interface (I/F) 205, input interface (I /F) 206, output interface (I/F) 207, media interface (I/F) 208, bus 209, input unit 211, output unit 212, and storage medium 213. The analyzers 5a and 5b are similar to the thymus cancer detection device 10.
４−３．胸腺癌の検出装置の動作
図３に胸腺癌の検出装置１０の動作例のフローチャートの一例を示す。
胸腺癌の検出装置１０の処理部１０１は、オペレータが入力部１１１から処理開始の入力を行うことにより、胸腺癌を検出するための処理を開始する。ステップＳ１１において、処理部１０１は、分析装置５ａ又は分析装置５ｂから被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量若しくはこれらを反映する値をＰＲＡＭＥの測定値として取得する。あるいは、オペレータが免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＰＲＡＭＥの発現が陽性であるか陰性であるか（あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されたか否か）を入力部１１１から入力し、処理部１０１がこの入力をＰＲＡＭＥの測定値として取得してもよい。
4-3. Operation of Thymic Cancer Detection Device FIG. 3 shows an example of a flowchart of an operation example of the thymic cancer detection device 10.
The processing unit 101 of the thymic cancer detection apparatus 10 starts a process for detecting thymic cancer when the operator inputs a process start from the input unit 111. In step S11, the processing unit 101 sets the amount of PRAME protein in the thymic tumor cells collected from the subject from the analyzer 5a or the analyzer 5b, the amount of PRAME mRNA, or a value reflecting these as the measured value of PRAME. get. Alternatively, the operator inputs from the input unit 111 whether the expression of PRAME by immunostaining or in situ hybridization is positive or negative (or whether PRAME is detected), and the processing unit 101 inputs this input. You may acquire as a measured value of PRAME.
次に処理部１０１は、ステップＳ１２において、記憶部に記憶されているＰＲＡＭＥの基準値と、ステップＳ１１で取得した測定値とを比較する。 Next, in step S12, the processing section 101 compares the PRAME reference value stored in the storage section with the measurement value acquired in step S11.
処理部１０１は、ステップＳ１３において、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合には、ステップＳ１４（ＹＥＳ）に進み、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であると決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。また、ステップＳ１３において、取得した測定値が基準値よりも低い場合に、ステップＳ１５（ＮＯ）に進み、胸腺腫瘍が胸腺癌ではないと決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。胸腺癌である決定した場合には、ラベルには、「胸腺癌である」、又は「胸腺癌を示唆する」ことを示す情報が含まれる。「胸腺癌を示唆する」情報には、「胸腺腫ではないことを示唆する」ことが含まれ得る。胸腺癌ではないと決定した場合には、ラベルには、「胸腺癌ではない」、又は「胸腺癌ではないことを示唆する」ことを示す情報が含まれる。「胸腺癌ではないことを示唆する」情報には、「胸腺腫であることを示唆する」ことが含まれ得る。前記情報は、×、〇、感嘆符等のマークであってもよい。 In step S13, if the acquired measurement value is higher than the reference value, the processing unit 101 proceeds to step S14 (YES), determines that the thymic tumor is thymic cancer, and indicates the label indicating the determination result. Is output to the output unit 112 (step S16). Further, in step S13, when the acquired measurement value is lower than the reference value, the process proceeds to step S15 (NO), it is determined that the thymic tumor is not thymic cancer, and the label indicating the determination result is output to the output unit 112. (Step S16). If determined to be thymic cancer, the label includes information indicating "is thymic cancer" or "indicative of thymic cancer". The “suggest thymic cancer” information can include “suggest not a thymoma”. If it is determined not to be thymic cancer, the label includes information indicating "not thymic cancer" or "indicates not thymic cancer". Information that "is not a thymic cancer" can include "is a thymoma." The information may be a mark such as X, O, exclamation mark, or the like.
基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。 For details of the reference value, the comparison method, and the method of determining whether the measured value is higher or lower than the reference value, see 2. Is incorporated herein by reference.
４−４．胸腺腫瘍の予後予測装置の動作
図３に胸腺腫瘍の予後予測装置２０の動作例のフローチャートの一例を示す。
胸腺腫瘍の予後予測装置２０の処理部２０１は、オペレータが入力部２１１から処理開始の入力を行うことにより、胸腺癌を検出するための処理を開始する。ステップＳ２１において、処理部２０１は、分析装置５ａ又は分析装置５ｂから被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量若しくはこれらを反映する値をＰＲＡＭＥの測定値として取得する。あるいは、オペレータが免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＰＲＡＭＥの発現が陽性であるか陰性であるか（あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されたか否か）を入力部２１１から入力し、処理部２０１がこの入力をＰＲＡＭＥの測定値として取得してもよい。
4-4. Operation of Thymic Tumor Prognosis Prediction Device FIG. 3 shows an example of a flowchart of an operation example of the thymic tumor prognosis prediction device 20.
The processing unit 201 of the thymic tumor prognosis prediction apparatus 20 starts the process for detecting thymic cancer when the operator inputs the process start from the input unit 211. In step S21, the processing unit 201 sets the amount of PRAME protein in the thymic tumor cells collected from the subject from the analyzer 5a or the analyzer 5b, the amount of PRAME mRNA, or a value reflecting these as the measured value of PRAME. get. Alternatively, the operator inputs whether the expression of PRAME by immunostaining or in situ hybridization is positive or negative (or whether PRAME is detected) from the input unit 211, and the processing unit 201 inputs this input. You may acquire as a measured value of PRAME.
次に処理部２０１は、ステップＳ２２において、記憶部に記憶されているＰＲＡＭＥの基準値と、ステップＳ２１で取得した測定値とを比較する。 Next, in step S22, the processing unit 201 compares the reference value of PRAME stored in the storage unit with the measurement value acquired in step S21.
処理部２０１は、ステップＳ２３において、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合には、ステップＳ２４（ＹＥＳ）に進み、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後が不良である決定し、決定結果を示すラベルを出力部２１２に出力する（ステップＳ２６）。また、ステップＳ２３において、取得した測定値が基準値よりも低い場合に、ステップＳ２５（ＮＯ）に進み、胸腺腫瘍を有する被検体の予後が良好であると決定し、決定結果を示すラベルを出力部２１２に出力する（ステップＳ２６）。予後が不良であると決定した場合には、ラベルには、「予後不良」、又は「予後不良を示唆する」ことを示す情報が含まれる。予後が良好であると決定した場合には、ラベルには、「予後良好」、又は「予後良好を示唆する」ことを示す情報が含まれる。前記情報は、×、〇、感嘆符等のマークであってもよい。 In step S23, when the acquired measurement value is higher than the reference value, the processing unit 201 proceeds to step S24 (YES), determines that the subject having the thymic tumor has a poor prognosis, and determines the determination. A label indicating the result is output to the output unit 212 (step S26). In addition, in step S23, when the acquired measurement value is lower than the reference value, the process proceeds to step S25 (NO), it is determined that the prognosis of the subject having a thymic tumor is good, and a label indicating the determination result is output. The data is output to the unit 212 (step S26). If the prognosis is determined to be poor, the label includes information indicating "poor prognosis" or "indicative of poor prognosis." If the prognosis is determined to be good, the label includes information indicating "good prognosis" or "indicative of good prognosis." The information may be a mark such as X, O, exclamation mark, or the like.
基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。 For details of the reference value, the comparison method, and the method of determining whether the measured value is higher or lower than the reference value, see 2. Is incorporated herein by reference.
以下に実施例を示して本開示についてより詳細に説明するが、本開示は実施例に限定して解釈されるものではない。 Hereinafter, the present disclosure will be described in more detail with reference to examples, but the present disclosure is not limited to the examples.
今回の検討は、ヘルシンキ宣言に基づいて学校法人関西医科大学の倫理委員会の承認を得て行った。 This study was conducted with the approval of the Ethics Committee of Kansai Medical University, an educational institution based on the Declaration of Helsinki.
１．腫瘍組織
関西医科大学附属病院において切除された胸腺癌（扁平上皮癌）12例、胸腺腫と82例を検討に使用した。
1. Tumor tissue We used 12 cases of thymic carcinoma (squamous cell carcinoma) and 82 cases of thymoma resected at the Kansai Medical University Hospital.
２．nCounterによる胸腺癌バイオマーカーの網羅的解析
胸腺癌及び胸腺腫に発現しているmRNAの比較をデジタルカウント遺伝子発現解析nCounter（登録商標） Analysis system (NanoString Technologies, WA, USA)を使用して行った。解析はタカラバイオ株式会社に依頼した。
2. Comprehensive analysis of thymoma biomarkers by nCounter Comparison of mRNAs expressed in thymoma and thymoma was performed using Digital Count Gene Expression Analysis nCounter® Analysis system (NanoString Technologies, WA, USA) .. Analysis was requested to Takara Bio Inc.
３．免疫染色
外科的に切除された組織サンプルをホルマリン固定し、組織標本を作製した。組織標本は、固定した組織サンプルをすべてパラフィン包埋し、薄切切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色及び免疫染色に供した。
3. Immunostaining A surgically excised tissue sample was fixed with formalin to prepare a tissue specimen. As the tissue specimen, all fixed tissue samples were embedded in paraffin, thin sliced sections were prepared, and subjected to hematoxylin-eosin staining and immunostaining.
免疫染色は、自動染色装置(Discovery, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を使用し、装置添付のプロトコールにしたがって行った。PRAMEを染色するための一次抗体として、Anti-PRAME antibody produced in rabbit Prestige AntibodiesR Powered by Atlas Antibodies, affinity isolated antibody, buffered aqueous glycerol solution (HPA045153, SIGMA-ALDRICH )を使用した。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体を使用し、発色にはジアミノベンチジン（DAB）を使用した。 Immunostaining was performed using an automatic staining device (Discovery, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) according to the protocol attached to the device. Anti-PRAME antibody produced in rabbit Prestige AntibodiesR Powered by Atlas Antibodies, affinity isolated antibody, buffered aqueous glycerol solution (HPA045153, SIGMA-ALDRICH) was used as a primary antibody for staining PRAME. A peroxidase-labeled anti-rabbit immunoglobulin antibody was used as a secondary antibody, and diaminobenzidine (DAB) was used for color development.
４．統計解析
統計解析には、JMP Start Statistics version 14 (Statistical Discovery Software; SAS Institute, Cary, NC, USA)を使用した。有意差検定は、胸腺癌と胸腺腫との間で行った。
4. Statistical analysis For statistical analysis, JMP Start Statistics version 14 (Statistical Discovery Software; SAS Institute, Cary, NC, USA) was used. Significance test was performed between thymic carcinoma and thymoma.
５．結果
５−１．nCounter
図５に示すように、nCounterによる解析において、胸腺癌と胸腺腫の間で特に優位な発現差が認められたのは、KitとPRAMEであった。
5. Result 5-1. nCounter
As shown in FIG. 5, in the analysis by nCounter, it was Kit and PRAME that a particularly significant expression difference was observed between thymoma and thymoma.
５−２．免疫染色による評価
組織学的に胸腺癌、胸腺腫タイプA、胸腺腫タイプAB、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、胸腺腫タイプB3、他の胸腺腫、又は胸腺のう胞に分類された組織について、PRAMEの免疫染色を行い、PRAMEの陽性率を比較した。図６Aに結果を示す。また、図６Bに胸腺癌、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、及び胸腺腫タイプB3のPRAMEの免疫染色画像を示す。
5-2. Evaluation by immunostaining For tissues histologically classified as thymoma, thymoma type A, thymoma type AB, thymoma type B1, thymoma type B2, thymoma type B3, other thymoma, or thymic cyst , PRAME immunostaining was performed and the positive rate of PRAME was compared. The results are shown in FIG. 6A. Further, FIG. 6B shows immunostained images of thymoma, thymoma type B1, thymoma type B2, and thymoma type B3 PRAME.
図６Aに示すように、PRAMEは、胸腺癌では、検討を行った12例すべてにおいて陽性となり、陰性となった例は認められなかった。これに対して、胸腺腫では、全82例中、胸腺腫タイプABの3例、及び胸腺腫タイプB3の2例においてPRAMEが陽性となったのみで、他はすべて陰性であった。胸腺腫タイプB3と胸腺癌の間の陽性率の有意差検定ではp=0.000035となり有意差が認められた。また、図６Bに示すように、胸腺癌では、PRAMEが細胞内にびまん性に強く染色されるのに対して、胸腺腫タイプABの3例、及び胸腺腫タイプB3の2例では、染色強度は低く、染色性も限局的であった。このことから、PRAMEは、胸腺癌細胞に強発現することが示された。 As shown in FIG. 6A, PRAME was positive in all 12 cases examined in thymic carcinoma, and no case was negative. On the other hand, as for thymoma, PRAME was positive only in 3 cases of thymoma type AB and 2 cases of thymoma type B3 out of all 82 cases, and the others were all negative. In the significant difference test of the positive rate between the thymoma type B3 and the thymic cancer, p=0.000035, which was a significant difference. In addition, as shown in FIG. 6B, in thymic carcinoma, PRAME was strongly stained intracellularly, whereas in 3 cases of thymoma type AB and 2 cases of thymoma type B3, staining intensity was high. Was low and the dyeability was also localized. From this, it was shown that PRAME was strongly expressed in thymoma cells.
また、図７に胸腺癌のCD5、c-Kit及びPRAMEの免疫染色画像を示す。胸腺癌では、CD5、c-Kit及びPRAMEが強く染色されていた。また図８から図１１には、それぞれ胸腺腫タイプA、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、及び胸腺腫タイプB3のCD5、c-Kit及びPRAMEの免疫染色画像を示す。これまで胸腺癌のマーカーとして報告されていたCD5は、胸腺腫タイプA、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、及び胸腺腫タイプB3の腫瘍細胞にも陽性シグナルが検出された。c-Kit (CD117)は非特許文献１においても胸腺癌のマーカーであることが示されている。しかし、非特許文献１によれば、胸腺癌におけるc-Kitの陽性率は78％であり、すべての胸腺癌を検出できるマーカーではないことが知られている。これに対してPRAMEは、検討した胸腺癌すべてで陽性となり、好適な胸腺癌のバイオマーカーであることが示された。また、胸腺癌は、他の悪性腫瘍と同様に、遠隔転移を起こす、再発する等の性質を有するため、胸腺癌を有する被検体の予後は一般的に不良である。上記結果は、PRAMEが、胸腺腫瘍を有する被検体の予後予測メーカーとしても使用可能であることを示していると考えられる。 Further, FIG. 7 shows immunostained images of CD5, c-Kit and PRAME of thymic carcinoma. In thymic carcinoma, CD5, c-Kit and PRAME were strongly stained. 8 to 11 show immunostaining images of CD5, c-Kit, and PRAME of thymoma type A, thymoma type B1, thymoma type B2, and thymoma type B3, respectively. CD5, which was previously reported as a marker for thymoma, had a positive signal detected in tumor cells of thymoma type A, thymoma type B1, thymoma type B2, and thymoma type B3. Non-Patent Document 1 also shows that c-Kit (CD117) is a marker for thymic cancer. However, according to Non-Patent Document 1, the positive rate of c-Kit in thymic carcinoma is 78%, and it is known that it is not a marker that can detect all thymic carcinomas. On the other hand, PRAME became positive in all the thymic cancers examined, indicating that it is a suitable biomarker for thymic cancer. Moreover, since thymic cancer has the property of causing distant metastasis and recurring, like other malignant tumors, the prognosis of a subject having thymic cancer is generally poor. The above results are considered to indicate that PRAME can also be used as a prognostic maker for subjects with thymic tumors.
Claims (14)
前記処理部は、
被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、
取得した測定値を、基準値と比較し、
取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではないことを示すラベルを出力する、
予後予測装置。 A thymic cancer detection device comprising a processing unit,
The processing unit is
Obtaining the measurement value of PRAME in the thymic tumor cells collected from the subject,
Compare the acquired measurement value with the reference value,
When the obtained measurement value is higher than the reference value, the label indicating that the thymic tumor cell is a thymic cancer cell is output, and/or the obtained measurement value is lower than the reference value. Outputting a label indicating that the thymic tumor cells are not thymic cancer cells,
Prognosis prediction device.
前記処理部は、
被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、
取得した測定値を、基準値と比較し、
取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記被検体の予後が不良であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記被検体の予後が良好であることを示すラベルを出力する、
予後予測装置。 A prognosis prediction device for a thymic tumor, comprising a processing unit,
The processing unit is
Obtaining the measurement value of PRAME in the thymic tumor cells collected from the subject,
Compare the acquired measurement value with the reference value,
If the obtained measurement value is higher than the reference value, output a label indicating that the prognosis of the subject is poor, and/or the obtained measurement value is lower than the reference value, Output a label indicating that the prognosis of the subject is good,
Prognosis prediction device.
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