JP2020054271A - Dna authentication method capable of individual identification with decomposed dna - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分解されたDNAで個体識別可能なDNA鑑定方法に関するものである。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a DNA identification method that allows individual identification using degraded DNA.
警察で使用されているDNA鑑定では、反復回数に個体差のある短鎖縦列反復配列STR(short tandem repeat)を含む領域を選択してDNAマーカーとして個体識別に使用しており、複数のSTR領域(ローカス)を用いることにより、個体差の検出率を高めている。このために利用するローカスの領域と数は地域により異なり、現在日本では、AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit(Thermo Fisher Scientific)によって増幅される16か所のローカスが用いられている(非特許文献1)が、間もなく24カ所のローカスを用いるGlobalFiler PCR Amplification Kit(Thermo Fisher Scientific)に変更がなされるとのことである(非特許文献2)。 In the DNA test used by police, a region containing a short tandem repeat (STR) having individual differences in the number of repetitions is selected and used as a DNA marker for individual identification. By using (locus), the detection rate of individual differences is increased. The locus region and number used for this purpose vary depending on the region. Currently, in Japan, 16 loci amplified by the AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific) are used (Non-Patent Document 1). It is said that the GlobalFiler PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific) using 24 loci will be changed soon (Non-Patent Document 2).
具体的な鑑定作業としては、サンプルから抽出したDNAのDNAマーカーのローカス毎に固有のプライマーセットを用いてPCRによりDNA増幅を行い、その増幅産物の電気泳動を行う。その結果、増幅されたDNAフラグメントの種類数と相対的泳動距離を合わせたDNAマーカーのパターンをローカス毎に比較することにより、識別している。 As a specific test operation, DNA amplification is performed by PCR using a unique primer set for each locus of a DNA marker of DNA extracted from a sample, and electrophoresis of the amplified product is performed. As a result, the identification is performed by comparing the pattern of the DNA marker in which the number of types of the amplified DNA fragments and the relative migration distance are matched for each locus.
通常、ヒトのゲノムは二倍体で、1つのローカスは2つの対立遺伝子(アリル)を持ち、それらはそれぞれ父及び母から独立に由来する。同一ローカスにおいて、父母のそれぞれに由来するアリルのSTRの反復回数が異なる場合、STR解析では2種の鎖長のDNAフラグメントが検出される。同一ローカスにおいて、父母のそれぞれに由来するアリルのSTRの反復回数が同じ場合は、STR解析で1種の鎖長のみのDNAフラグメントが検出される。 Normally, the human genome is diploid, with one locus having two alleles (alleles), each of which is independently derived from the father and mother. In the same locus, when the number of repetitions of the STR of the allele derived from each of the parents is different, the STR analysis detects DNA fragments of two types of chain length. In the same locus, when the number of repetitions of the STR of the allele derived from each parent is the same, a DNA fragment having only one chain length is detected by the STR analysis.
上記の事実を考慮し、例えば、容疑者のDNAマーカーのパターンと犯人のDNAマーカーのパターンがすべてのローカスで同じであれば、容疑者が犯人と同一である確率が高いと鑑定する。 Considering the above facts, for example, if the pattern of the suspect's DNA marker and the pattern of the offender's DNA marker are the same in all loci, it is determined that the probability that the suspect is the same as the offender is high.
精度の高いDNA鑑定を行うためには、鑑定の検出感度と精度を確保するに足る種類と量のDNAマーカーを確保する必要があるが、犯罪捜査等の場面では、しばしば、現行の方法でDNA鑑定を行うために十分な量の検体を確保することが難しい場合や、環境条件によって劣化が進んだ状態の検体しか得られない場合がある。 In order to perform a highly accurate DNA test, it is necessary to secure a sufficient number and type of DNA markers to ensure the detection sensitivity and accuracy of the test. There is a case where it is difficult to secure a sufficient amount of a sample for performing a test, or a case where only a sample in a state of deterioration due to environmental conditions is obtained.
現行の電気泳動結果によるDNAマーカーのパターンの識別法には、図1のバンドのラダーパターンにより識別するゲル電気泳動法と、図2の波形のパターンにより識別するキャピラリー電気泳動法がある。いずれも、DNAフラグメントの鎖長の違いを利用して同一検体中のバンドや波形を分離し、生成したパターンを識別する方式で、検体毎にDNAフラグメントの塩基配列が異なっていても鎖長が同じであれば、同一のバンドや波形として識別されるため、相違が検出できないという問題がある。 Current methods for discriminating the pattern of the DNA marker based on the results of electrophoresis include a gel electrophoresis method which is identified by the ladder pattern of the band in FIG. 1 and a capillary electrophoresis method which is identified by the waveform pattern in FIG. Both methods use the difference in the chain length of DNA fragments to separate bands and waveforms in the same sample and identify the generated pattern. If they are the same, they are identified as the same band or waveform, so that there is a problem that the difference cannot be detected.
また、犯罪捜査の場面でしばしば発生するような劣悪な環境中では、DNAはランダムな位置で切断され、次第により短いDNAフラグメントへと分解される。このような状態のDNAを現行法でPCR増幅しても、DNAマーカーのパターンは検出できない。 Also, in poor environments, such as those often encountered in criminal investigations, DNA is cut at random locations and gradually decomposed into shorter DNA fragments. Even if the DNA in such a state is PCR-amplified by the current method, the pattern of the DNA marker cannot be detected.
この理由を以下に説明する。
まず図3(1)のような構造を持つDNAマーカーのローカス1の1つのアリルについて考える。
The reason will be described below.
First, one allele of locus 1 of a DNA marker having a structure as shown in FIG.
図3(2)のような分解されていないDNAを鋳型としてDNAマーカーのローカス1をPCR増幅すると、ローカス領域の両端に設定した2種のプライマー1及び2の塩基配列を両端に含むローカス領域全域の両方向のDNAストランド(フラグメント1a1及びフラグメント1b1)が対数増殖し、鋳型となる元のDNA量が十分存在すれば、電気泳動によりバンドや波形を検出できる量の二本鎖DNAフラグメントが生成される。もう一つのアリルや他の全てのローカスについても同様に、鋳型となる元のDNA量が十分存在すれば、電気泳動によりバンドや波形を検出できる量の二本鎖DNAフラグメントが生成され、全ローカスのDNAマーカーパターンが決定できる。 When the DNA marker loci 1 was amplified by PCR using undegraded DNA as a template as shown in FIG. 3 (2), the entire loci region containing the base sequences of the two primers 1 and 2 set at both ends of the loci region was obtained. The DNA strands in both directions (fragment 1a1 and fragment 1b1) are logarithmically grown, and if there is a sufficient amount of the original DNA serving as a template, an amount of double-stranded DNA fragment capable of detecting a band or waveform by electrophoresis is generated. . Similarly, for the other allele and all other loci, if the amount of the original DNA serving as the template is sufficient, an amount of double-stranded DNA fragment capable of detecting a band or a waveform by electrophoresis is generated, and all loci Can be determined.
しかし、図3(3)のように劣悪な環境等により分解されたDNAを鋳型としてPCRを行った場合、結果として生成する当該ローカスの当該アリルのDNAフラグメント群は、図4のローカス1の例に示すように、下記1)から3)の様々なDNAフラグメントの混合物となる。なお、図中の各フラグメントの太さは、PCR反応後の各々のフラグメント量をイメージとして表している。 However, when PCR is performed using DNA degraded in a poor environment or the like as a template as shown in FIG. 3 (3), the resulting allele DNA fragment group of the locus is an example of the locus 1 in FIG. As shown in the figure, a mixture of various DNA fragments of the following 1) to 3) is obtained. The thickness of each fragment in the figure represents the amount of each fragment after the PCR reaction as an image.
1)2種のプライマー配列を両端に持ちDNAが分解されていないローカス1のアリル1のDNAは、通常、劣化した検体から抽出されたDNAのうち極めて少数であり、それらが対数増殖しても、バンドや波形で明確に識別可能な量のDNAフラグメントは得られない。 1) The DNA of allele 1 of locus 1 which has two primer sequences at both ends and whose DNA is not degraded is usually a very small number of DNAs extracted from a deteriorated sample, and even if they are logarithmically grown, However, the amount of DNA fragments that can be clearly distinguished by bands or waveforms cannot be obtained.
2)DNAの分解による切断の位置は通常ランダムで、図4の分解されたDNA(1)及びDNA(2)で示すようにDNA分子ごとに異なる。これらのDNAフラグメントのうちで、2種のプライマーのうちいずれかの塩基配列を含む一本鎖DNAフラグメント(フラグメント1a1及びフラグメント1c2)については、それらの相補鎖を鋳型とするDNAの伸長反応が起こるため、PCRのサイクル数に比例してそれらの一本鎖DNAフラグメント数は増加する。この結果、2種のプライマーのうちいずれかの塩基配列を含む一本鎖DNAフラグメントのPCR産物としては、それぞれの鋳型となるDNAの切断位置により、PCRサイクル数分増加した異なる鎖長の一本鎖DNAフラグメント(フラグメント1a1及びフラグメント1c2)の混合物が得られる。しかし、それぞれの一本鎖フラグメント量は極めて少なく、また一本鎖は様々な立体構造を取るため同じ鎖長でも電気泳動距離が一定しない。この結果、いずれの一本鎖DNAフラグメントも、バンドや波形で明確に識別することはできない。 2) The positions of cleavage due to DNA degradation are usually random and differ for each DNA molecule as shown by the degraded DNA (1) and DNA (2) in FIG. Of these DNA fragments, single-stranded DNA fragments (fragment 1a1 and fragment 1c2) containing any one of the base sequences of the two primers undergo a DNA extension reaction using their complementary strands as templates. Therefore, the number of those single-stranded DNA fragments increases in proportion to the number of cycles of PCR. As a result, as a PCR product of a single-stranded DNA fragment containing any one of the base sequences of the two primers, a single-stranded DNA fragment having a different chain length increased by the number of PCR cycles depends on the cutting position of each template DNA. A mixture of strand DNA fragments (fragment 1a1 and fragment 1c2) is obtained. However, the amount of each single-stranded fragment is extremely small, and the single-stranded chain has various three-dimensional structures, so that the electrophoresis distance is not constant even with the same chain length. As a result, none of the single-stranded DNA fragments can be clearly identified by bands or waveforms.
3)DNAマーカーのローカスのプライマー配列より内側に両端をもつように切断されたDNAフラグメントは、プライマー結合配列を持たないため、フラグメント数は全く増加せず、バンドや波形としての検出はできない。 3) Since the DNA fragment cut so as to have both ends inside the primer sequence of the locus of the DNA marker has no primer binding sequence, the number of fragments does not increase at all and cannot be detected as a band or a waveform.
もう一つのアリルや他の全てのローカスについても同様に、様々なDNAフラグメントの混合物が生成する。 Similarly, a mixture of various DNA fragments is produced for another allele and all other loci.
1つの検体から抽出したDNAを鋳型として全ローカスのマルチプレックスPCRを行うと、上記の全てのローカスのPCR産物の混合物となる様々な鎖長のDNAフラグメント群が生成される。これを電気泳動すると、ゲル電気泳動で明確なバンドは認められず、DNA量に応じた濃さのスメア像が得られたり、キャピラリー電気泳動では多数の弱いシグナルの重なりが続く解析不能なパターンが得られたりする結果となり、DNA鑑定はできないという問題もある。 When multiplex PCR of all loci is performed using DNA extracted from one sample as a template, DNA fragment groups having various chain lengths, which are a mixture of the PCR products of all loci, are generated. When this was electrophoresed, no clear band was recognized in gel electrophoresis, and a smear image with a density corresponding to the amount of DNA was obtained, or in capillary electrophoresis, an unanalyzable pattern in which many weak signals overlapped was observed. This results in a problem in that DNA analysis cannot be performed.
本発明では、これらの問題を解決するため、DNAの塩基配列を読み取り、同じDNA鎖長で塩基配列が異なるDNAマーカーの識別、及び微量しかないDNAでのDNAマーカーの識別、並びに分解されたDNAを用いたDNAマーカーの識別で、DNA鑑定を行うために、ターゲットDNAとサンプルDNAに同じDNAが存在するか、求めることを特徴としている。 In the present invention, in order to solve these problems, a DNA base sequence of DNA is read, a DNA marker having the same DNA chain length and a different base sequence is identified, and a DNA marker having only a trace amount of DNA is identified, and degraded DNA is identified. In order to perform DNA identification by identifying a DNA marker by using a DNA marker, it is characterized by determining whether the same DNA exists in the target DNA and the sample DNA.
また、DNAシーケンサーは近年技術的進歩が著しく、極めて微量のDNAから大量の塩基配列データを取得することが可能なため、このような機材を使用してDNAマーカーの塩基配列データを取得することにより、DNAマーカーの識別ができる様になることを特徴としている。 In addition, since DNA sequencers have made remarkable technical progress in recent years and can acquire a large amount of nucleotide sequence data from a very small amount of DNA, using such equipment to acquire the nucleotide sequence data of DNA markers has And DNA markers can be identified.
本発明においては、上記分解されたDNAと、1回の実験で大量の塩基配列を読み取れるDNAシーケンサーを用いる。 In the present invention, the degraded DNA and a DNA sequencer capable of reading a large amount of base sequence in one experiment are used.
ここで得られたDNAマーカーの塩基配列を検体間で比較してDNA鑑定を行うことにより、同一鎖長のDNAマーカーのフラグメントでも塩基配列が異なるものを識別できる様になることを特徴としている。 By comparing the base sequences of the obtained DNA markers among the samples and performing DNA identification, it is possible to identify DNA marker fragments having the same chain length but different base sequences.
さらに、分解されたDNAを検体として用いる場合でも、ローカスの途中で切断されたDNAフラグメントの部分的なDNAについて、検体間で部分的なDNA鎖長及び/又は塩基配列を比較解析することにより、DNAマーカーの識別ができる様になることを特徴としている。 Further, even when the degraded DNA is used as a sample, the partial DNA of the DNA fragment cleaved in the middle of the locus is compared and analyzed by comparing the partial DNA chain length and / or the base sequence between the samples. It is characterized in that DNA markers can be identified.
そして上記のようにして得られた検体毎ローカス毎のDNAマーカーの一覧及びそれら相互の比較結果をまとめた一覧表を作成することにより、現状のDNA鑑定法では検出・識別ができないような、同一鎖長でも異なるDNAマーカー塩基配列を持つ個体の識別、極めて微量しかない検体のDNAマーカーによる個体の識別、分解されたDNAしか得られない検体のDNAマーカーによる個体の識別に有用なDNAマーカー解析の情報を提供できる様になることを特徴としている。 By preparing a list of DNA markers for each sample and each locus obtained as described above and a list summarizing the results of their mutual comparison, the same DNA that cannot be detected and identified by the current DNA identification method is used. DNA marker analysis that is useful for identifying individuals with DNA marker base sequences that differ in their chain lengths, for individuals with extremely small amounts of DNA markers, and for individuals with only degraded DNA with DNA markers It is characterized by being able to provide information.
また、上述のようにヒトは二倍体生物であるため、例えば犯人の検体で3種以上の塩基配列を含むDNAマーカーが検出されれば、その検体は複数個体由来の混合物である可能性が出てくる。 In addition, since a human is a diploid organism as described above, if a DNA marker containing three or more nucleotide sequences is detected in a criminal specimen, for example, the specimen may be a mixture derived from a plurality of individuals. Come out.
トリソミー個体のように一部のローカスに3つのアリルを持つヒト個体が存在することは否定できないが、ヒトのDNA鑑定用のDNAマーカーの複数のローカスが3倍体になることは通常ないため、複数のローカスで3つ以上のサブグループが検出された場合には、サンプル検体には複数個体由来のDNAが混在している可能性をより強く提示できる。 Although it cannot be denied that there are human individuals having three alleles in some loci such as trisomy individuals, since multiple loci of DNA markers for human DNA identification are not usually triploid, When three or more subgroups are detected in a plurality of loci, the possibility that DNAs from a plurality of individuals are mixed in the sample specimen can be more strongly indicated.
一方、特定のDNAマーカーについて2つのアリルの塩基配列が全く同じホモ接合体である個体の場合、当該DNAマーカーについては1種類の塩基配列しか検出されない。このため例えば、2個体由来のDNAが混在する検体中において、2個体のそれぞれが当該DNAマーカーについてホモ接合体で2個体の持つ塩基配列が異なっている場合や、3個体の混合検体のうち2個体が当該DNAマーカーについてそれぞれ異なるホモ接合体で、第3の個体がそれら2個体のそれぞれの塩基配列と一致する塩基配列を持つヘテロ接合体である場合等では、当該DNAマーカーのローカスに属するサブグループは2つになる場合もある。従って、サブグループが2つの場合であっても、検体に複数個体由来のDNAが混在していることもあり得る。 On the other hand, in the case of an individual in which the homologues of two bases of alleles are exactly the same for a specific DNA marker, only one base sequence is detected for the DNA marker. Therefore, for example, in a sample in which DNAs derived from two individuals are mixed, when two individuals are homozygous for the DNA marker and the two individuals have different base sequences, In the case where the individual is a homozygote different from the DNA marker, and the third individual is a heterozygote having a nucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of each of the two individuals, etc., the subordinate belonging to the locus of the DNA marker is used. There may be two groups. Therefore, even if there are two subgroups, the specimen may contain DNAs derived from a plurality of individuals.
このように当該DNAマーカーのサブグループが2つの場合、その検体が1個体に由来するDNAのみを含むのか、複数個体由来のDNAの混合物であるのかを区別することは困難である。しかし、鑑定用のDNAマーカーを複数用いることにより、他のDNAマーカーで3種以上の塩基配列を含むDNAマーカーが検出される可能性があり、その結果によって、複数個体由来のDNAが混在する可能性が提示できる。 Thus, when there are two subgroups of the DNA marker, it is difficult to distinguish whether the specimen contains only DNA from one individual or a mixture of DNAs from multiple individuals. However, by using a plurality of DNA markers for identification, a DNA marker containing three or more nucleotide sequences may be detected by other DNA markers, and depending on the result, DNAs derived from a plurality of individuals may be mixed. Sex can be presented.
そこでこの検体毎ローカス毎のDNAマーカーの一覧及びそれら相互の比較結果をまとめた一覧表を用いることにより、検体間のみならず同一検体中の個体の識別、すなわち、同一検体中に複数の個体由来のDNAが含まれているかどうか、及び2つの検体(例えば容疑者(群)の検体と犯人(群)の検体)に同一個体由来のDNAが含まれているかどうかを鑑定するための情報を提供できるようになることも、特徴としている。 Therefore, by using the list of DNA markers for each sample and each locus and the list summarizing the mutual comparison results, identification of individuals not only between samples but also in the same sample, that is, identification of individuals in the same sample from a plurality of individuals Provides information to determine whether or not two samples (eg, a suspect (group) sample and a criminal (group) sample) contain DNA from the same individual. It also features that it can be done.
本発明は、以下の〔1〕〜〔4〕を包含するものである。
〔1〕ターゲットDNAとサンプルDNAが同一個体に由来するDNAであるかどうか鑑定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするDNA鑑定方法、
(1)ターゲットDNAのDNAフラグメントの塩基配列を決定する工程、
(2)工程(1)で塩基配列を決定したDNAフラグメントから、DNAマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むDNAフラグメントを抽出する工程、
(3)工程(2)で抽出されたDNAフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ(ローカスグループ)に分ける工程、
(4)工程(3)で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するDNAフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のDNAフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
(5)サンプルDNAのDNAフラグメントの塩基配列を決定する工程、
(6)工程(5)で塩基配列を決定したDNAフラグメントから、DNAマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むDNAフラグメントを抽出する工程、
(7)工程(6)で抽出されたDNAフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ(ローカスグループ)に分ける工程、
(8)工程(7)で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するDNAフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のDNAフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
(9)工程(4)で選択されたターゲットDNAのサブグループ代表フラグメントと工程(8)で選択されたサンプルDNAのサブグループ代表フラグメントを、ローカス毎に比較する工程、
(10)工程(9)の比較の結果からターゲットDNAとサンプルDNAに同一DNAが存在するか、ローカス毎に求める工程。
The present invention includes the following [1] to [4].
[1] A method for determining whether a target DNA and a sample DNA are DNAs derived from the same individual, which comprises the following steps:
(1) determining the base sequence of the DNA fragment of the target DNA,
(2) extracting a DNA fragment containing a DNA marker or a partial base sequence thereof from the DNA fragment whose base sequence has been determined in step (1);
(3) a step of dividing the DNA fragments extracted in the step (2) into groups for each identical locus (locus groups) based on the nucleotide sequence;
(4) For each locus group divided in step (3), DNA fragments having the same base sequence in the locus group are divided into subgroups, and the longest DNA fragment among the subgroups is a subgroup representative fragment. The process of selecting as
(5) determining the base sequence of the DNA fragment of the sample DNA;
(6) a step of extracting a DNA fragment containing a DNA marker or a partial base sequence thereof from the DNA fragment whose base sequence has been determined in step (5),
(7) a step of dividing the DNA fragments extracted in the step (6) into groups (locus groups) for each same locus based on the nucleotide sequence;
(8) For each of the locus groups divided in step (7), DNA fragments having a common base sequence in the locus group are divided into subgroups, and the longest DNA fragment among the subgroups is a subgroup representative fragment. The process of selecting as
(9) comparing the subgroup representative fragment of the target DNA selected in step (4) with the subgroup representative fragment of the sample DNA selected in step (8) for each locus;
(10) A step of determining, for each locus, whether the same DNA exists in the target DNA and the sample DNA from the result of the comparison in the step (9).
〔2〕工程(9)において、工程(4)で選択されたターゲットDNAのサブグループ代表フラグメントと工程(8)で選択されたサンプルDNAのサブグループ代表フラグメントの塩基配列を、サブグループ総当たりでローカス毎に比較することを特徴とする〔1〕に記載のDNA鑑定方法。 [2] In the step (9), the base sequences of the subgroup representative fragment of the target DNA selected in the step (4) and the subgroup representative fragment of the sample DNA selected in the step (8) are calculated on a per subgroup basis. The DNA identification method according to [1], wherein the method is performed for each locus.
〔3〕工程(9)において、二つのサブグループ代表フラグメントの短い方のDNAフラグメントの鎖長全域の塩基配列に基づいて、サブグループ代表フラグメントを比較することを特徴とする〔2〕に記載のDNA鑑定方法。 [3] The subgroup representative fragment according to [2], wherein in step (9), the subgroup representative fragments are compared based on the base sequence of the entire length of the shorter DNA fragment of the two subgroup representative fragments. DNA identification method.
〔4〕工程(4)及び工程(8)において、ローカス中のDNAフラグメントを同一塩基配列ごとにサブグループにすることで、サブグループ数が2以上のとき、複数個体のDNAが混在している可能性があることを求めることができる〔1〕に記載のDNA鑑定方法。 [4] In steps (4) and (8), DNA fragments in the locus are divided into subgroups for each identical base sequence, so that when the number of subgroups is 2 or more, DNAs of a plurality of individuals are mixed. The DNA identification method according to [1], which can determine that there is a possibility.
上記のように構成された本発明の方法によれば、1)鎖長は等しくても塩基配列が異なるDNAマーカーの識別、2)微量DNAを用いたDNAマーカーの識別、3)分解されたDNAを用いたDNAマーカーの識別、4)同一検体中の複数個体の混在の検出用資料の提供、及び、5)2つの検体に同一個体由来のDNAが含まれているかどうかの鑑定用資料の提供が可能となる。 According to the method of the present invention configured as described above, 1) identification of DNA markers having the same base length but different base sequences, 2) identification of DNA markers using a small amount of DNA, and 3) degraded DNA 4) Provision of data for detection of the mixture of multiple individuals in the same sample, and 5) Provision of data for identification of whether two samples contain DNA from the same individual Becomes possible.
以下、図5に従って、本発明を詳細に説明する。
本発明のDNA鑑定方法は、DNAマーカー比較表に基づいて行うことができる。このDNAマーカー比較表は、ターゲットDNAとサンプルDNAに同一個体由来のDNAが含まれているかどうかを鑑定するために、両者のDNAマーカーのパターンの比較結果を表にするものであって、下記の工程(A)〜(L)を含む方法によって作成できる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to FIG.
The DNA identification method of the present invention can be performed based on a DNA marker comparison table. This DNA marker comparison table shows the results of comparison of the patterns of both DNA markers in order to determine whether the target DNA and the sample DNA contain DNA derived from the same individual. It can be prepared by a method including steps (A) to (L).
工程(A)では、DNAシーケンサーを用いて、ターゲットDNAのDNAマーカーのローカスを含めた塩基配列群を決定し、それら全てを登録したデータベースを作成する。なお、本工程の前の準備工程として、PCR反応による検体DNAの増幅工程や、Adaptaseテクノロジー(Swift Bioscience)等による1本鎖DNAへのアダプター付加工程など、DNAシーケンサーを用いてより大量の塩基配列データを精度高く得るための工程が追加される場合もある。 In the step (A), a base sequence group including a locus of a DNA marker of the target DNA is determined using a DNA sequencer, and a database in which all of them are registered is created. As a preparation step before this step, a larger amount of base sequence using a DNA sequencer, such as a step of amplifying a sample DNA by a PCR reaction or a step of adding an adapter to single-stranded DNA by Adaptase technology (Swift Bioscience), etc. In some cases, a step for obtaining data with high accuracy is added.
DNAマーカーは特に限定されず、例えば、STRを含むものであってもよく、STRのような反復配列を含まないものであってもよい。また、DNAマーカーは、個体間で塩基配列の違いがみられる配列を含むものであってもよい。STRを含むDNAマーカーのローカスとしては、例えば、AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit(Applied Biosystems社製)によって増幅される16か所のローカスを挙げることができる。 The DNA marker is not particularly limited. For example, the DNA marker may include STR, or may not include a repetitive sequence such as STR. Further, the DNA marker may include a sequence in which a difference in base sequence is observed between individuals. Examples of loci of the DNA marker containing STR include 16 loci amplified by AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit (manufactured by Applied Biosystems).
鑑定の対象とするDNAマーカーのローカスは一つだけであってもよいが、二つ以上であることが好ましい。DNAマーカーのローカスが二つ以上である場合、マルチプレックスPCRを行える設定が可能であることが好ましい。 The locus of the DNA marker to be assessed may be only one, but is preferably two or more. When the number of loci of the DNA marker is two or more, it is preferable that setting for performing multiplex PCR is possible.
塩基配列を決定する方法は特に限定されないが、1回の実験で大量の塩基配列データを取得できる次世代DNAシーケンサー又は次々世代DNAシーケンサーを用いて行うのが好ましい。 The method for determining the base sequence is not particularly limited, but it is preferable to use a next-generation DNA sequencer or a next-generation DNA sequencer capable of obtaining a large amount of base sequence data in one experiment.
工程(B)では、工程(A)で登録した塩基配列群から、DNAマーカー及び/又はその一部分の塩基配列を含むすべての塩基配列を抽出する。 In the step (B), all the nucleotide sequences including the DNA marker and / or a partial nucleotide sequence thereof are extracted from the nucleotide sequence group registered in the step (A).
工程(C)では、工程(B)で抽出された塩基配列を、ローカス毎のグループ(ローカスグループ)に分ける。 In the step (C), the base sequence extracted in the step (B) is divided into groups for each locus (locus groups).
工程(D)では、工程(C)で作成されたそれぞれのローカスグループ内で、共通部分の塩基配列が一致する塩基配列毎に、サブグループ(ローカスサブグループ)に分ける。 In the step (D), in each of the locus groups created in the step (C), a base group (locus subgroup) is divided for each base sequence having a common base sequence.
工程(E)では、工程(D)で作成されたそれぞれのローカスサブグループ内で最長の塩基配列(ローカスサブグループ代表塩基配列)を選択する。ローカスサブグループ内の最長の塩基配列の考え方は図6に示すとおりである。 In step (E), the longest nucleotide sequence (locus subgroup representative nucleotide sequence) in each of the locus subgroups created in step (D) is selected. The concept of the longest nucleotide sequence in the locus subgroup is as shown in FIG.
工程(F)では、DNAシーケンサーを用いて、サンプルDNAのDNAマーカーのローカスを含めた塩基配列を決定し、それら全てを登録したデータベースを作成する。 In the step (F), the base sequence including the locus of the DNA marker of the sample DNA is determined using a DNA sequencer, and a database in which all of them are registered is created.
工程(G)では、工程(F)で登録した塩基配列群から、DNAマーカー及び/又はその一部分の塩基配列を含むすべての塩基配列を抽出する。 In the step (G), all the nucleotide sequences including the DNA marker and / or a partial nucleotide sequence thereof are extracted from the nucleotide sequence group registered in the step (F).
工程(H)では、工程(G)で抽出されたDNAフラグメントを、ローカス毎のグループ(ローカスグループ)に分ける。 In the step (H), the DNA fragments extracted in the step (G) are divided into groups for each locus (locus groups).
工程(I)では、工程(H)で作成されたそれぞれのローカスグループ内で、共通部分の塩基配列が一致する塩基配列毎に、サブグループ(ローカスサブグループ)に分ける。 In the step (I), in each of the locus groups created in the step (H), each base sequence having a matching base sequence is divided into subgroups (locus subgroups).
工程(J)では、工程(I)で作成されたそれぞれのローカスサブグループ内で最長の塩基配列(ローカスサブグループ代表塩基配列)を選択する。ローカスサブグループ内の最長の塩基配列の考え方は図6に示すとおりである。 In step (J), the longest nucleotide sequence (locus subgroup representative nucleotide sequence) in each of the locus subgroups created in step (I) is selected. The concept of the longest nucleotide sequence in the locus subgroup is as shown in FIG.
工程(K)では、工程(E)で選択されたローカス代表塩基配列と工程(J)で選択されたローカスサブグループ代表塩基配列を、ターゲットDNAとサンプルDNAの対応するローカスグループ内のローカスサブグループ間で、それぞれ総当たりで比較する。 In the step (K), the locus representative base sequence selected in the step (E) and the locus subgroup representative base sequence selected in the step (J) are combined with the locus subgroup in the corresponding locus group of the target DNA and the sample DNA. Brute force comparison.
工程(L)では、工程(K)で行ったターゲットとサンプルの全てのローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果を一覧表(表2)にまとめる。 In the step (L), the comparison results of all the locus subgroup representative base sequences of the target and the sample performed in the step (K) are summarized in a list (Table 2).
比較の結果、ターゲットDNAとサンプルDNAの対応するローカスサブグループにおいて、ターゲットDNAのローカスサブグループ代表塩基配列とサンプルDNAのローカスサブグループ代表塩基配列の共通部分に不一致が存在する場合は、それらのローカスサブグループは不一致であると判定することができる。共通部分の考え方は図6で示した考え方と同様である。 As a result of the comparison, when there is a mismatch between the representative base sequence of the locus subgroup of the target DNA and the representative base sequence of the locus subgroup of the sample DNA in the corresponding locus subgroups of the target DNA and the sample DNA, those locus The subgroup can be determined to be mismatched. The concept of the common part is the same as the concept shown in FIG.
塩基配列の一致又は不一致の判定は、どのような方法でおこなってもよいが、DNAマーカーのローカスがSTRを含む場合は、後述する表1に示すように、DNAフラグメントの長さ及び塩基配列に基づいて行うことが好ましい。一方、DNAマーカーのローカスがSTRを含まない場合は、二つのDNAフラグメントの短い方のDNAフラグメントの鎖長全体の塩基配列に基づいて行うことが好ましい。 The determination of the nucleotide sequence match or mismatch may be performed by any method. However, when the locus of the DNA marker contains STR, as shown in Table 1 below, the length and the nucleotide sequence of the DNA fragment are determined. It is preferable to carry out based on this. On the other hand, when the locus of the DNA marker does not contain STR, it is preferable to perform the determination based on the base sequence of the entire chain length of the shorter DNA fragment of the two DNA fragments.
工程(A)〜(E)はターゲットDNAに関する工程であり、工程(F)〜(J)はサンプルDNAに関する工程である。工程(A)〜(E)と工程(F)〜(J)は、同時並行的に行ってもよく、また、一方を先に行い、他方を後に行ってもよい。 Steps (A) to (E) relate to a target DNA, and steps (F) to (J) relate to a sample DNA. Steps (A) to (E) and steps (F) to (J) may be performed simultaneously and in parallel, or one may be performed first and the other may be performed later.
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
犯罪捜査におけるDNA鑑定は、多くの場合、犯人のものと思われる検体から抽出されたDNA(ターゲットDNA)と、容疑者の検体から抽出されたDNA(サンプルDNA)の、複数のDNAマーカーの各々を、ターゲットDNAとサンプルDNAの間でDNAフラグメントの鎖長と数のパターン比較を実施することにより行う。 In many cases, DNA testing in criminal investigations involves a plurality of DNA markers each of DNA extracted from a suspected criminal sample (target DNA) and DNA extracted from a suspect sample (sample DNA). Is performed by comparing the pattern of the chain length and the number of DNA fragments between the target DNA and the sample DNA.
本発明は、図5に示すように、塩基配列比較によるDNAマーカー比較データの全体像作成を、1)DNAシーケンサーで読み取ったターゲットのDNAフラグメントの塩基配列群及びサンプルのDNAフラグメントの塩基配列群各々のデータベースを作成する塩基配列データベース作成工程、2)1)からのDNAマーカー及び/又はその一部の塩基配列を抽出するマーカー配列抽出行程、3)2)で選択した塩基配列のローカス毎のグループを作成するローカスグループ作成工程、4)3)で作成した各々のローカスグループ内で、共通部分が一致する塩基配列を持つローカスサブグループの作成工程、5)4)で作成した各々のローカスサブグループ内で最長のDNAフラグメントを選択するローカスサブグループ代表塩基配列選択工程、6)DNAマーカーのローカス毎に、ターゲットDNA及びサンプルDNAについて、5)で抽出したローカスサブグループ代表塩基配列同士を比較する比較工程、及び、7)ターゲットDNAとサンプルDNAのローカス毎の全てのローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果を一覧表にまとめる表作成工程という処理で構成する。 According to the present invention, as shown in FIG. 5, the whole image of DNA marker comparison data by base sequence comparison is prepared by: 1) the base sequence group of the target DNA fragment read by a DNA sequencer and the base sequence group of the sample DNA fragment; 2) a marker sequence extracting step of extracting the DNA marker and / or a part of the nucleotide sequence from 1), and 3) a group for each locus of the nucleotide sequence selected in 2) In the locus group creating step of creating the loci, and in the respective locus groups created in 3), the step of creating a locus subgroup having a base sequence having a common part, and 5) each of the locus subgroups created in 4) For selecting the longest DNA fragment in a locus subgroup , 6) a comparison step of comparing the loci of the loci subgroups extracted in 5) with respect to the target DNA and the sample DNA for each loci of the DNA marker, and 7) all the loci of the loci of the target DNA and the sample DNA for each loci It consists of a process called a table preparation step of compiling a comparison result of the locus subgroup representative base sequences into a list.
PCRによるDNAマーカーのDNA増幅を用いた場合の本発明の構成を図7で説明する。このPCR反応は、DNAマーカーの両端にそれぞれ位置する1ペア2種類のプライマー配列からの伸長反応であるため、指数関数的に、あるいはPCRサイクル数に比例して増加するDNAフラグメントは全て、その5‘端に、2種類のプライマー配列の内1種類の塩基配列又は少なくともその一部の塩基配列を有する。
〔実施例1〕 DNAシーケンサーで読み取ったターゲット検体及びサンプル検体のDNAフラグメントの塩基配列群からのDNAマーカー塩基配列群データベース作成(事前工程にPCRを含む場合)
The configuration of the present invention in the case of using DNA amplification of a DNA marker by PCR will be described with reference to FIG. Since this PCR reaction is an extension reaction from one pair of two types of primer sequences located at both ends of the DNA marker, all DNA fragments that increase exponentially or in proportion to the number of PCR cycles are all 5 of them. At the 'end, there is one kind of base sequence of the two kinds of primer sequences or at least a part thereof.
[Example 1] Creation of a DNA marker base sequence group database from base sequence groups of DNA fragments of a target sample and a sample sample read by a DNA sequencer (when PCR is included in the pre-process)
まず、準備工程として、DNA鑑定を行う2つの検体(ターゲット及びサンプル)から抽出したDNAそれぞれ(ターゲットDNA及びサンプルDNA)を鋳型として、DNAマーカーの全ローカスについてマルチプレックスPCRを行い、この結果生じる全てのローカスのPCR産物を含むDNAマーカーPCR産物群を、ターゲットDNAおよびサンプルDNAの各々について得る。なお、これらのフラグメント群には、PCRの鋳型として使用したターゲット又はサンプルのDNAのうちで、いずれのローカス部位でもないためPCR増幅の対象とならなかった部位のDNAも混入している(図7上段の図に相当)。これらターゲット及びサンプルの全てのDNAフラグメントについて、1回の実験で大量の塩基配列データを得られるDNAシーケンサーを用いて塩基配列を決定し、その情報のすべてを、図7の中段に示すように、検体DNA毎のDNAマーカーPCR産物の塩基配列群としてデータベースに登録する。 First, as a preparation step, multiplex PCR is performed on all loci of DNA markers using DNA (target DNA and sample DNA) extracted from two specimens (target and sample) to be subjected to DNA analysis as templates. A DNA marker PCR product group including the locus PCR product is obtained for each of the target DNA and the sample DNA. In addition, in these fragment groups, of the DNA of the target or the sample used as a template for PCR, DNA of a site which was not an object of PCR amplification because it was not any of the locus sites was mixed (FIG. 7). (Corresponds to the upper diagram). For all the DNA fragments of these targets and samples, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer capable of obtaining a large amount of nucleotide sequence data in one experiment, and all the information was obtained as shown in the middle part of FIG. It is registered in a database as a base sequence group of a DNA marker PCR product for each sample DNA.
次に、これらの塩基配列の全てを、DNA鑑定用のDNAマーカーの全ローカスの塩基配列と照合し、いずれかのローカスの全体又は一部に相当する塩基配列を抽出して、ターゲットDNA又はサンプルDNAの全マーカーフラグメント塩基配列群としてデータベースに登録する(図7下段の図に相当)。 Next, all of these base sequences are compared with the base sequences of all the loci of the DNA marker for DNA identification, and a base sequence corresponding to all or a part of any of the loci is extracted, and the target DNA or sample is extracted. The DNA is registered in the database as a group of all marker fragment base sequences (corresponding to the lower diagram in FIG. 7).
続いて、図8上段から中段の図のように、登録された塩基配列の中から、DNAマーカーのローカス毎に、2種のプライマー配列のいずれか又は両方を含む塩基配列のみを抽出し、それらをローカス毎及びプライマー毎にグループに分類して、ターゲット又はサンプルのローカス・プライマー別塩基配列群のデータベースを作成する。 Subsequently, as shown in the upper to middle diagrams of FIG. 8, from the registered base sequences, only the base sequences containing either or both of the two types of primer sequences were extracted for each locus of the DNA marker, and Are classified into groups for each locus and each primer, and a database of base sequences for each locus / primer of a target or sample is created.
さらに、検体毎に、同一ローカス、同一プライマーのグループ内で、当該グループに属する塩基配列を相互に比較し、共通部分の塩基配列が一致する塩基配列同士を集めてサブグループを作成する。この図8の処理を図9に沿って説明する。 Further, for each specimen, within the group of the same locus and the same primer, base sequences belonging to the group are compared with each other, and base sequences having the same base sequence are collected to form a subgroup. The processing in FIG. 8 will be described with reference to FIG.
(010)DNAマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN=1を設定する。 (010) In order to start the process from locus 1 of the DNA marker, N = 1 is set as the initial value of the locus number.
(020)プライマー番号1の塩基配列が含まれる塩基配列から処理するため、プライマー番号の初期値としてP=1を設定する。 (020) P = 1 is set as the initial value of the primer number in order to process from the base sequence containing the base sequence of the primer number 1.
(030)図8の全マーカーフラグメント塩基配列群からローカス番号1でプライマー番号1の塩基配列が存在する塩基配列を全て抽出する。 (030) From the group of all marker fragment base sequences shown in FIG. 8, all the base sequences in which the base sequence of primer No. 1 exists at locus No. 1 are extracted.
(040)抽出した塩基配列のグループにローカス番号Nとプライマー番号Pからなる名称を与える。(例えばN=1、P=2なら012など)ローカス番号N及びプライマー番号Pは、DNA鑑定用のDNAマーカーにローカスやプライマーの番号が設定されていればそれに従って、また、設定されていなければゲノム上の位置順に従うなどわかりやすい順番で与える。これにより、図8中段の図のように、検体毎のローカス・プライマー別塩基配列群のデータベースができる。 (040) A name consisting of the locus number N and the primer number P is assigned to the extracted base sequence group. (E.g., 012 if N = 1, P = 2, etc.) The locus number N and the primer number P are according to the locus and primer numbers set in the DNA marker for DNA identification, and if not set, Give them in an easy-to-understand order, such as following the order of positions on the genome. As a result, as shown in the middle diagram of FIG. 8, a database of the base sequence group for each locus / primer for each sample is created.
(050)(040)で作成した塩基配列のグループNP毎に、当該グループに属する全ての塩基配列を相互に比較し、共通部分が一致する塩基配列同士を集めてサブグループを形成する。検体に含まれる個体が単一であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、ヒト個体が通常は二倍体であることを反映して、通常2以下となる。検体に含まれる個体が複数であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、3以上となる場合がある。 (050) For each group NP of the base sequences created in (040), all base sequences belonging to the group are compared with each other, and base sequences having the same common part are collected to form a subgroup. If the specimen contains a single individual, the number of subgroups in the same primer group of the same locus is usually 2 or less, reflecting that human individuals are usually diploid. If the sample contains a plurality of individuals, the number of subgroups in the same primer group of the same locus may be 3 or more.
(060)サブグループを作成した検体がターゲットであるかサンプルであるかを、後の作業で区別する必要が出てくる。作業中の検体がターゲットであれば(070)に進み、ターゲットのサブグループであることが分かる名称を与える。作業中の検体がサンプルであれば(080)に進んでサンプルのサブグループであることが分かる名称を与える。 (060) It is necessary to distinguish whether the specimen for which the subgroup is created is a target or a sample in a later operation. If the sample being worked on is the target, the process proceeds to (070), and a name that indicates that the sample is a subgroup of the target is given. If the specimen in operation is a sample, the process proceeds to (080), and a name that indicates that the sample is a subgroup of the sample is given.
(070)作業対象がターゲット検体の塩基配列の場合は、(050)で作成した同一ローカスの同一プライマーのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Uを1から順番に与える。さらに、検体がターゲットであることを明示するため最初にTを加えたサブグループ名TNPU(例えばN=1、P=2、U=1ならT0121)を、それぞれのサブグループに与える。 (070) When the operation target is the base sequence of the target sample, the subgroup numbers U are assigned to all the subgroups included in the group of the same primers of the same locus created in (050) in order from 1 respectively. Further, a subgroup name TNPU to which T is added first (for example, T0121 if N = 1, P = 2, U = 1) to clearly indicate that the sample is the target is given to each subgroup.
(080)作業対象がサンプル検体の塩基配列の場合は、(050)で作成した同一ローカスの同一プライマーのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Vを1から順番に与える。さらに、検体がサンプルであることを明示するため最初にSを加えたサブグループ名SNPV(例えばN=1、P=2、V=1ならS0121)を、それぞれのサブグループに与える。 (080) When the work target is the base sequence of the sample specimen, the subgroup numbers V are assigned to all the subgroups included in the same primer group of the same locus created in (050) in order from 1 respectively. Further, a subgroup name SNPV to which S is first added to clearly indicate that the specimen is a sample (for example, S0121 if N = 1, P = 2, V = 1) is given to each subgroup.
(090)(070)および(080)で名称を与えられた塩基配列のサブグループを、グループ構造を維持したままで、対応する検体(ターゲット又はサンプル)のDNAマーカー塩基配列群データベースに移動する。 (090) The subgroups of the nucleotide sequences named in (070) and (080) are moved to the DNA marker nucleotide sequence group database of the corresponding specimen (target or sample) while maintaining the group structure.
(100)次に、同じローカスの異なるプライマー配列Pについて(030)〜(090)の作業を行う必要の有無を判断する必要がある。一つのローカスには2種のプライマー配列が存在するため、現状のプライマー番号が1または2のいずれかを判別する。1の場合は(120)へ行ってプライマー番号をP=2に設定換えし、(030)からの行程を繰り返す。2の場合は(110)へ行く。 (100) Next, it is necessary to determine whether or not it is necessary to perform the operations (030) to (090) for different primer sequences P of the same locus. Since there are two types of primer sequences in one locus, it is determined whether the current primer number is 1 or 2. In the case of 1, go to (120), change the primer number to P = 2, and repeat the process from (030). In the case of 2, go to (110).
(110)DNA鑑定用のDNAマーカーのローカスは通常複数あり、それら全てについて上記の作業を行うため、現在のローカス番号Nより大きいローカス番号の有無を判断する必要がある。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号が存在する場合は(130)へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、(020)に戻る。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号がなければ、作業を終了する。 (110) Usually, there are a plurality of loci of DNA markers for DNA identification, and the above operation is performed for all of them. Therefore, it is necessary to determine the presence or absence of a loci number larger than the current loci number N. If there is a locus number larger than the current locus number N, the flow goes to (130), the setting of the locus number N is changed to N + 1, and the flow returns to (020). If there is no locus number larger than the current locus number N, the operation ends.
ここまでの処理により、図8下段の図に示すように、DNAマーカーのプライマー塩基配列を含む塩基配列が、ローカス毎、及びプライマー配列毎、さらに共通部分が同一塩基配列のサブグループ毎にグループを作った状態で、検体毎のDNAマーカー塩基配列群のデータベースに登録されたことになる。 By the processing so far, as shown in the lower diagram of FIG. 8, the base sequence including the primer base sequence of the DNA marker is divided into groups for each locus and each primer sequence, and further, for each subgroup of the same base sequence having the same common part. In this state, it is registered in the database of the DNA marker base sequence group for each sample.
なお、上記の処理により、プライマー番号の小さい条件で抽出された塩基配列は、(040)の処理により元の塩基配列群のデータベースからは削除されるため、両端に2種のプライマーの塩基配列を持つ完全長のDNAマーカーの塩基配列は、プライマー番号1をもつグループに分類される。 In addition, the base sequence extracted under the condition of the smaller primer number by the above process is deleted from the database of the original base sequence group by the process of (040). The base sequence of the full-length DNA marker possessed is classified into a group having primer number 1.
この作業を、DNA鑑定を行う2つの検体のそれぞれについて行い、ターゲット検体のDNAマーカー塩基配列群及びサンプル検体のDNAマーカー塩基配列群の2つのデータベースを作成する。 This operation is performed for each of the two samples to be subjected to the DNA test, and two databases of the DNA marker base sequence group of the target sample and the DNA marker base sequence group of the sample sample are created.
本実施例では、ローカス毎のいずれかのプライマーの塩基配列を含むフラグメントの塩基配列を抽出したが、ターゲット検体又はサンプル検体のDNAマーカー塩基配列群のデータベースを作成する際の塩基配列の抽出方法としては、プライマーの塩基配列全体ではなくその一部の塩基配列を含むフラグメントの塩基配列を抽出する方法や、ローカス毎の塩基配列の全体又は一部の塩基配列を含むフラグメントの塩基配列を抽出する方法などの選択も可能であり、またこれらの方法に限られない。 In the present embodiment, the base sequence of the fragment containing the base sequence of any of the primers for each locus was extracted. However, as a method of extracting the base sequence when creating a database of DNA marker base sequence groups of the target specimen or the sample specimen, Is a method for extracting the base sequence of a fragment containing not the entire base sequence of the primer but a part of the base sequence, or a method for extracting the base sequence of a fragment containing the whole or a part of the base sequence for each locus Selection is also possible, and is not limited to these methods.
〔実施例2〕 STRをもつDNAマーカーの代表塩基配列の比較表作成のフロー(事前工程にPCRを含む場合)
この処理は、上記で作成したターゲット検体のDNAマーカー塩基配列群及びサンプル検体のDNAマーカー塩基配列群の2つのデータベースを用いて行う。ここで行う処理を、図10に沿って説明する。
[Example 2] Flow of creating a comparison table of representative base sequences of DNA markers having STR (when PCR is included in the pre-process)
This processing is performed using the two databases of the DNA marker base sequence group of the target specimen and the DNA marker base sequence group of the sample specimen created above. The processing performed here will be described with reference to FIG.
(100)DNAマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN=1を設定する。 (100) In order to start processing from the locus 1 of the DNA marker, N = 1 is set as an initial value of the locus number.
(200)プライマー1の塩基配列が存在する塩基配列から処理するため、プライマー番号の初期値としてP=1を設定する。 (200) P = 1 is set as the initial value of the primer number in order to process from the nucleotide sequence in which the nucleotide sequence of the primer 1 exists.
(300)ターゲットのサブグループ1から処理を開始するため、サブグループ番号の初期値としてU=1を設定する。 (300) In order to start processing from the target subgroup 1, U = 1 is set as an initial value of the subgroup number.
(400)ターゲットのDNAマーカー塩基配列群のデータベースの中から、サブグループ番号UのDNAマーカー塩基配列のグループを選択する。 (400) A group of DNA marker nucleotide sequences of subgroup number U is selected from a database of target DNA marker nucleotide sequence groups.
(500)選択したDNAマーカー塩基配列のサブグループは、5'端がプライマーの塩基配列Pで始まる同じ塩基配列を持ち、相互に共通な部分の塩基配列が等しい様々な鎖長のDNAマーカー塩基配列のグループである。このグループの中で相互にDNA鎖長を比較し、最長のDNAマーカー塩基配列をローカスサブグループ代表塩基配列TRNPUとする。(たとえばTR0112など) (500) The selected subgroups of DNA marker base sequences are DNA marker base sequences of various chain lengths having the same base sequence at the 5 ′ end beginning with the base sequence P of the primer and having the same base sequence at the common part. Group. DNA chain lengths are compared with each other in this group, and the longest DNA marker base sequence is defined as a locus subgroup representative base sequence TRNPU. (For example, TR0112)
(600)サンプルのサブグループ1から処理を開始するため、サブグループ番号の初期値としてV=1を設定する。 (600) In order to start processing from the subgroup 1 of the sample, V = 1 is set as an initial value of the subgroup number.
(700)サンプルのDNAマーカー塩基配列群のデータベースの中から、サブグループ番号VのDNAマーカー塩基配列のグループを選択する。 (700) A group of DNA marker nucleotide sequences of subgroup number V is selected from the database of DNA marker nucleotide sequence groups of the sample.
(800)選択したDNAマーカー塩基配列のサブグループは、5'端がプライマーの塩基配列Pで始まる同じ塩基配列を持ち、相互に共通な部分の塩基配列が等しい様々な鎖長のDNAマーカー塩基配列のグループである。このグループの中で相互にDNA鎖長を比較し、最長のDNAマーカー塩基配列をローカスサブグループ代表塩基配列SRNPVとする。(たとえばSR0212など) (800) The subgroups of the selected DNA marker nucleotide sequences include DNA marker nucleotide sequences having the same nucleotide sequence whose 5 ′ end starts with the nucleotide sequence P of the primer and having the same nucleotide sequence at a common portion. Group. DNA chain lengths are compared with each other in this group, and the longest DNA marker base sequence is defined as a locus subgroup representative base sequence SRNPV. (For example, SR0212)
(900)TRNPUとSRNPVの塩基配列を、下表の通り比較する。比較する塩基配列名称のNとPは、ターゲットとサンプルで常に一致している。
(1000)サンプルの同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対して(700)〜(900)の工程を行う必要があるため、同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は(1500)に行ってサンプルのサブグループ番号VをV+1に設定換えし、(700)〜(900)の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は(1200)に行く。 Since it is necessary to perform the steps (700) to (900) for all subgroups in the group of the same locus and the same primer sequence of the (1000) sample, other subgroups in the group of the same locus and the same primer sequence Determine if there are any subgroups. If there is another subgroup, the procedure goes to (1500) to change the subgroup number V of the sample to V + 1, and repeat the operations of (700) to (900). If there is no other subgroup, go to (1200).
(1100)ターゲットの同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対しても(400)〜(1000)の工程を行う必要があるため、同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は(1600)に行ってターゲットのサブグループ番号UをU+1に設定換えし、(400)〜(1000)の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は(1200)に行く。 (1100) It is necessary to perform the steps (400) to (1000) for all subgroups in the same target locus and the same primer sequence group. It is determined whether there is a subgroup. If there is another subgroup, go to (1600), change the subgroup number U of the target to U + 1, and repeat the operations of (400) to (1000). If there is no other subgroup, go to (1200).
(1200)次に、同じローカスの異なるプライマー配列Pについて(300)〜(1100)の作業を行う必要の有無を判断する必要がある。一つのローカスには2種のプライマー配列が存在するため、現状のプライマー番号が1または2のいずれかを判別する。1の場合は(1700)へ行ってプライマー番号をP=2に設定換えし、(300)からの行程を繰り返す。2の場合は(1300)へ行く。 (1200) Next, it is necessary to determine whether or not it is necessary to perform the operations (300) to (1100) for different primer sequences P of the same locus. Since there are two types of primer sequences in one locus, it is determined whether the current primer number is 1 or 2. In the case of 1, go to (1700), change the primer number to P = 2, and repeat the process from (300). In the case of 2, go to (1300).
(1300)全ローカスの処理が完了したかチェックする。完了していない場合は次のローカスの処理をするために(1800)へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、(200)からの行程を繰り返す。完了した場合は(1400)へ行く。 (1300) It is checked whether the processing of all the loci has been completed. If not completed, go to (1800) to process the next locus, change the setting of the locus number N to N + 1, and repeat the process from (200). If completed, go to (1400).
(1400)全てのローカスサブグループ毎に、TRNPUとSRNPVの塩基配列の比較結果の一覧表をたとえば下記のように作成し(表2)、完成したら終了とする。 (1400) A list of the comparison results of the nucleotide sequences of TRNPU and SRNPV is created for each of all the locus subgroups, for example, as follows (Table 2).
表2は、ターゲット及びサンプルがそれぞれ単一個体を含む検体である場合の例の一部を示している。この表の元となる模式図を図11に示す。
図11の例において、ターゲットは、ローカス1のDNAマーカーについては、プライマー番号1及び2にそれぞれ2種のサブグループ、ローカス2のDNAマーカーについてはプライマー番号1及び2にそれぞれ1種のサブグループを持つ検体である。一方で、サンプルは、ローカス1のDNAマーカーについてはプライマー番号1及び2にそれぞれ2種のサブグループ、ローカス2についてもプライマー番号1及び2にそれぞれ2種のサブグループを持つ検体である。図10の命名法に従って、ターゲットのローカス1、プライマー番号1のグループにおけるローカスサブグループ1の代表塩基配列1はTR0111、ローカスサブグループ2の代表塩基配列2はTR0112、サンプルのローカス1、プライマー番号1のグループにおけるローカスサブグループ1の代表塩基配列1はSR0111、ローカスサブグループ2の代表塩基配列2はSR0112であり、TR0121、TR0122、SR0121、SR0122が、ローカス番号1、プライマー番号2のターゲットおよびサンプルのローカスサブグループ毎の代表塩基配列となる。以下同様に、ローカス2のターゲットにはTR0211とTR0221、サンプルにはSR0211、SR0212、SR0221、SR0222がそれぞれ含まれる。 In the example of FIG. 11, for the locus 1 DNA marker, primers 1 and 2 each have two subgroups, and for the locus 2 DNA marker, primers 1 and 2 each have one subgroup. It is a specimen to have. On the other hand, the sample is a specimen having two types of subgroups for the primers 1 and 2 for the locus 1 DNA marker and two types of subgroups for the primers 1 and 2 for locus 2 respectively. According to the nomenclature of FIG. 10, the representative base sequence 1 of the locus subgroup 1 in the group of the target locus 1 and the primer number 1 is TR0111, the representative base sequence 2 of the locus subgroup 2 is TR0112, the sample locus 1 and the primer number 1 The representative nucleotide sequence 1 of the locus subgroup 1 in the group of No. is SR0111 and the representative nucleotide sequence 2 of the locus subgroup 2 is SR0112. A representative base sequence for each locus subgroup is obtained. Similarly, the targets of locus 2 include TR0211 and TR0221, and the samples include SR0211, SR0212, SR0221, and SR0222, respectively.
これに基づいてローカス番号とプライマー番号が一致するグループ内でターゲットとサンプルの比較を行う。たとえば、ローカス番号1、プライマー番号1のグループについては、TR0111とSR0111、TR0111とSR0112、TR0112とSR0111,TR0112とSR0112の4通りの比較を行い、表1に従って比較の結論を出し、表2右端のローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果の当て嵌まるそれぞれの欄に結論を記入する。この作業をすべてのローカスサブグループ代表塩基配列について行い、表2を完成する。 Based on this, the target and the sample are compared in a group where the locus number and the primer number match. For example, for the group of locus number 1 and primer number 1, four types of comparisons, TR0111 and SR0111, TR0111 and SR0112, TR0112 and SR0111, and TR0112 and SR0112, were performed. The conclusion is entered in each column where the comparison result of the locus subgroup representative base sequence applies. This operation is performed for all the loci subgroup representative nucleotide sequences, and Table 2 is completed.
表2は、ターゲット及びサンプルがどちらも1検体のみを含む場合の例であるため、各ローカスのプライマー毎のサブグループ数は通常1又は2のいずれかの場合しかない。しかし、一つの検体の同一ローカス、同一プライマーのグループに含まれるサブグループが3以上になる場合には、前述のように、複数個体由来のDNAが混在する検体である可能性がある。そのような検体について表2と同様の表を作成すれば、ターゲット及びサンプルのどちらかまたは両方の検体について、サブグループ数が3以上含まれるローカスはどれなのか、また同一ローカス、同一プライマーのサブグループ数が3以上となる頻度はどれくらいか、ということも、一目でわかるようになる。例を表3に示した。
表3においては、ターゲット検体のローカス番号1には、プライマー番号1,2共に2つのサブグループが存在する。プライマーは通常、1と2のペアで1つのアリルのDNAフラグメントを規定するものであり、2倍体生物であるヒトのアリルは通常2つであることを考慮すると、ターゲット検体に含まれる個体数は1であると考えて矛盾はない。一方、サンプル検体のローカス番号1には、プライマー番号1,2共、3つのサブグループが存在するため、上述のように、サンプル検体は複数個体の混合検体である可能性が考えられる。さらに当該一覧表の中で、複数のローカスで3つ以上のサブグループが検出された場合には、サンプル検体には複数個体由来のDNAが混在している可能性が、より強く示唆される。 In Table 3, at the locus number 1 of the target sample, there are two subgroups for both primer numbers 1 and 2. Primers usually define a DNA fragment of one allele in pairs of 1 and 2. Considering that there are usually two alleles of a diploid human, the number of individuals contained in the target sample is There is no contradiction, considering that is 1. On the other hand, since there are three subgroups in the locus number 1 of the sample specimen, both the primer numbers 1 and 2, there is a possibility that the sample specimen is a mixed specimen of a plurality of individuals as described above. Furthermore, when three or more subgroups are detected in a plurality of loci in the list, it is more strongly suggested that the sample specimen may contain DNAs from a plurality of individuals.
このように、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を提供することで、検体中に複数個体由来のDNAが混在する可能性があることが分る。 As described above, by providing the comparison result table of the locus subgroup representative base sequences, it is understood that there is a possibility that DNAs from a plurality of individuals are mixed in the sample.
さらに、複数個体由来のDNAが混在する検体と単一個体のDNAのみが含まれる検体、または複数個体由来のDNAが混在する検体同士について、表3のようなローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を作成すると、比較する検体の両方に共通する個体のDNAが含まれている可能性も提示できる。 Further, comparison results of loci subgroup representative nucleotide sequences as shown in Table 3 for a sample in which DNAs derived from a plurality of individuals are mixed and a sample containing only DNA of a single individual, or a sample in which DNAs derived from a plurality of individuals are mixed. When the table is created, it is possible to indicate the possibility that the DNA of an individual common to both of the samples to be compared is included.
従って、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表により、1)鎖長は等しくても塩基配列が異なるDNAマーカーの識別、2)微量DNAを用いたDNAマーカーの識別、3)分解されたDNAを用いたDNAマーカーの識別、4)同一検体中の複数個体の混在の検出用資料の提供、及び、5)2つの検体に同一個体由来のDNAが含まれているかどうか、DNA鑑定を行う判断材料となる。 Therefore, according to the comparison result table of the locus subgroup representative base sequences, 1) identification of DNA markers having the same base length but different base sequences, 2) identification of DNA markers using trace DNA, and 3) identification of degraded DNA Identification of the DNA marker used, 4) Provision of data for detection of the mixture of multiple individuals in the same sample, and 5) Determination of DNA judgment on whether two samples contain DNA derived from the same individual Becomes
次に、PCRによるDNAマーカーのDNA増幅を用いない場合の本発明の構成を図12および図13で説明する。 Next, the configuration of the present invention when the DNA amplification of the DNA marker by PCR is not used will be described with reference to FIGS.
〔実施例3〕 DNAシーケンサーで読み取ったターゲット検体及びサンプル検体のDNAフラグメントの塩基配列群からのDNAマーカー塩基配列群データベース作成(事前工程にPCRを含まない場合)
ターゲット検体及び/又はサンプル検体から抽出したDNAは、任意の部位で切断されて分解された様々な鎖長のDNAフラグメントの混合物である(図12上段の図に相当)。これら全てのDNAフラグメントについて、1回の実験で大量の塩基配列データを得られるDNAシーケンサーを用いて塩基配列を決定し、その情報のすべてを、図12の中段に示すように、検体毎のDNAの塩基配列群としてデータベースに登録する。
[Example 3] Creating a database of DNA marker base sequence groups from base sequence groups of DNA fragments of a target sample and a sample sample read by a DNA sequencer (when PCR is not included in the pre-process)
The DNA extracted from the target specimen and / or the sample specimen is a mixture of DNA fragments of various chain lengths that have been cleaved and decomposed at an arbitrary site (corresponding to the upper diagram in FIG. 12). With respect to all of these DNA fragments, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer capable of obtaining a large amount of nucleotide sequence data in a single experiment, and all of the information was obtained as shown in the middle part of FIG. Is registered in the database as a base sequence group.
次に、これらの塩基配列の全てを、DNA鑑定用のDNAマーカーの全ローカスの塩基配列と照合し、いずれかのローカスの全体又は一部に相当する塩基配列部分を含む塩基配列を抽出して、ターゲットDNA又はサンプルDNAのマーカー含有フラグメント塩基配列群としてデータベースに登録する(図12下段の図に相当)。 Next, all of these base sequences are compared with the base sequences of all the loci of the DNA marker for DNA identification, and a base sequence containing a base sequence portion corresponding to all or a part of any of the loci is extracted. Then, it is registered in the database as a marker-containing fragment base sequence group of the target DNA or sample DNA (corresponding to the lower diagram in FIG. 12).
続いて、図13上段から中上段の図のように、検体DNAのマーカー含有フラグメント塩基配列群に登録された塩基配列のそれぞれから、含有するDNAマーカーの塩基配列に相当する部分だけを抽出して、検体DNAの全マーカーフラグメント塩基配列群としてデータベースに登録する。(図13中上段の図) Subsequently, as shown in the upper to middle upper diagrams of FIG. 13, from each of the base sequences registered in the marker-containing fragment base sequence group of the sample DNA, only the portion corresponding to the base sequence of the contained DNA marker was extracted. Then, it is registered in the database as a base sequence group of all marker fragments of the sample DNA. (Figure in the upper middle of FIG. 13)
登録された全マーカーフラグメント塩基配列群をローカス毎のグループに分類して、検体毎に作成したローカス別塩基配列群のデータベースに、グループを保持したまま移動する。(図13中上段から中下段の図) All registered marker fragment base sequence groups are classified into groups for each locus, and the group is moved to a database of base sequence groups for each locus, which is created for each sample, while maintaining the groups. (Figures from upper middle to lower middle in FIG. 13)
続いて、移動されたローカス別塩基配列群の同一ローカスのグループに属するすべての塩基配列を相互比較し、共通部分の配列が一致するもの同士のサブグループを作成して、このサブグループ構成を保持したままで、検体毎に作成したターゲットまたはサンプルのDNAマーカー塩基配列群のデータベースに移動する。(図13中下段から下段の図)上記の図13の処理を、図14に沿って説明する。 Subsequently, all the base sequences belonging to the same locus group of the moved locus-specific base sequence group are compared with each other, and a subgroup having a common portion having the same sequence is created, and this subgroup configuration is maintained. As it is, the data is moved to the database of DNA marker base sequences of the target or sample created for each specimen. (Drawing from bottom to bottom in FIG. 13) The processing of FIG. 13 will be described with reference to FIG.
(010)図13最上段のターゲットDNAまたはサンプルDNAのマーカー含有フラグメント塩基配列群のデータベースに登録された塩基配列の全てについて、DNA鑑定用のDNAマーカー全てと塩基配列を比較し、いずれかのDNAマーカーの塩基配列の全域または一部分に相当する部分の塩基配列だけを全て抽出する。 (010) For all of the base sequences registered in the database of the marker-containing fragment base sequence group of the target DNA or sample DNA at the top of FIG. 13, the base sequences are compared with all the DNA markers for DNA identification, and any DNA The entire base sequence or only a part of the base sequence corresponding to a part of the base sequence of the marker is extracted.
(020)(010)で抽出した塩基配列の全てを、対応するターゲットDNAまたはサンプルDNAの全マーカーフラグメント塩基配列群のデータベースに移動する。 (020) All of the nucleotide sequences extracted in (010) are moved to the database of all marker fragment nucleotide sequences of the corresponding target DNA or sample DNA.
(030)移動した塩基配列群のそれぞれの塩基配列について、その配列が相当するDNA鑑定用のDNAマーカーのローカス毎にグループ化し、DNA鑑定用のDNAマーカーにローカス番号が設定されていればそれに従って、また、設定されていなければゲノム上の位置順に従うなどわかりやすい順番で、ローカス毎にローカス番号Nを名称として与える。全ての塩基配列がローカス毎にグループ化され、それぞれのローカスグループにローカス番号が与えられたら、グループ構造を保持したままで、全塩基配列を検体毎のローカス別塩基配列群のデータベースに移動する。 (030) For each base sequence of the transferred base sequence group, the sequence is grouped for each locus of the corresponding DNA marker for DNA identification, and if a locus number is set for the DNA marker for DNA identification, it is followed in accordance with that. In addition, if not set, the locus number N is given as a name for each locus in an easy-to-understand order such as following the order of positions on the genome. When all the base sequences are grouped for each locus, and a locus number is given to each locus group, all the base sequences are moved to the database of the locus-specific base sequence group for each sample while maintaining the group structure.
(040)DNAマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN=1を設定する。 (040) In order to start the processing from locus 1 of the DNA marker, N = 1 is set as the initial value of the locus number.
(050)(030)で作成したローカスグループ毎に、当該グループに属する全ての塩基配列を相互に比較し、共通部分が一致する塩基配列同士を集めてサブグループを形成する。前述のように、検体に含まれる個体が単一であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、ヒト個体が通常は二倍体であることを反映して、通常2以下となる。検体に含まれる個体が複数であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、3以上となる場合がある。 (050) For each locus group created in (030), all base sequences belonging to the group are compared with each other, and base sequences having the same common part are collected to form a subgroup. As described above, if a single individual is included in the sample, the number of subgroups in the same primer group of the same locus is usually 2 or less, reflecting that human individuals are usually diploid. Become. If the sample contains a plurality of individuals, the number of subgroups in the same primer group of the same locus may be 3 or more.
(060)サブグループを作成した検体がターゲットであるかサンプルであるかを、後の作業で区別する必要が出てくる。作業中の検体がターゲットであれば(070)に進み、ターゲットのサブグループであることが分かる名称を与える。作業中の検体がサンプルであれば(080)に進んでサンプルのサブグループであることが分かる名称を与える。 (060) It is necessary to distinguish whether the specimen for which the subgroup is created is a target or a sample in a later operation. If the sample being worked on is the target, the process proceeds to (070), and a name that indicates that the sample is a subgroup of the target is given. If the specimen in operation is a sample, the process proceeds to (080), and a name that indicates that the sample is a subgroup of the sample is given.
(070)作業対象がターゲット検体の塩基配列の場合は、(050)で作成した同一ローカスのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Uを1から順番に与える。さらに、検体がターゲットであることを明示するため最初にTを加えたサブグループ名TNU(例えばN=1、U=1ならT011)を、それぞれのサブグループに与える。 (070) When the work target is the base sequence of the target sample, the subgroup numbers U are assigned to all the subgroups included in the same locus group created in (050) in order from 1 respectively. Further, a subgroup name TNU (for example, T = 11 if N = 1 and U = 1) to which T is added first to specify that the sample is a target is given to each subgroup.
(080)作業対象がサンプル検体の塩基配列の場合は、(050)で作成した同一ローカスのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Vを1から順番に与える。さらに、検体がサンプルであることを明示するため最初にSを加えたサブグループ名SNV(例えばN=1、V=1ならS011)を、それぞれのサブグループに与える。 (080) When the operation target is the base sequence of the sample specimen, the subgroup numbers V are assigned to all the subgroups included in the same locus group created in (050) in order from 1 respectively. Further, a subgroup name SNV to which S is first added to clearly indicate that the sample is a sample (for example, N = 1, if V = 1, S011) is given to each subgroup.
(090)(070)および(080)で名称を与えられた塩基配列のサブグループを、グループ構造を維持したままで、対応する検体(ターゲット又はサンプル)のDNAマーカー塩基配列群データベースに移動する。 (090) The subgroups of the nucleotide sequences named in (070) and (080) are moved to the DNA marker nucleotide sequence group database of the corresponding specimen (target or sample) while maintaining the group structure.
(100)DNA鑑定用のDNAマーカーのローカスは通常複数あり、それら全てについて上記の作業を行うため、現在のローカス番号Nより大きいローカス番号の有無を判断する必要がある。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号が存在する場合は(110)へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、(050)に戻る。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号がなければ、作業を終了する。 (100) Usually, there are a plurality of loci of DNA markers for DNA identification, and it is necessary to judge the presence or absence of a loci number larger than the current loci number N in order to perform the above operation on all of them. If there is a locus number larger than the current locus number N, go to (110), change the setting of the locus number N to N + 1, and return to (050). If there is no locus number larger than the current locus number N, the operation ends.
ここまでの処理により、図8下段の図に示すように、DNAマーカーの塩基配列の全長又は一部分を含む塩基配列が、ローカス毎、及び共通部分が同一塩基配列のサブグループ毎にグループを作った状態で、検体毎のDNAマーカー塩基配列群のデータベースに登録されたことになる。 By the processing so far, the base sequence including the full length or a part of the base sequence of the DNA marker was grouped for each locus and for each subgroup having the same base sequence as shown in the lower diagram of FIG. In this state, it is registered in the database of the DNA marker base sequence group for each sample.
この作業を、DNA鑑定を行う2つの検体のそれぞれについて行い、ターゲット検体のDNAマーカー塩基配列群及びサンプル検体のDNAマーカー塩基配列群の2つのデータベースを作成する。 This operation is performed for each of the two samples to be subjected to the DNA test, and two databases of the DNA marker base sequence group of the target sample and the DNA marker base sequence group of the sample sample are created.
本実施例では、まずDNAマーカー鑑定用の全ローカスの塩基配列のいずれかを含む塩基配列を全て抽出した後にローカス毎のフラグメントの塩基配列またはその一部を抽出したが、最初からローカス毎の塩基配列のいずれか又はその一部の配列のみを抽出してもよく、またこれらの方法に限られない。 In this example, first, after extracting all the nucleotide sequences including any one of the nucleotide sequences of all the loci for DNA marker evaluation, the nucleotide sequence of the fragment for each locus or a part thereof was extracted. Any one of the sequences or only a part of the sequences may be extracted, and the method is not limited to these methods.
〔実施例4〕 DNAマーカーの代表塩基配列の比較によるDNA鑑定のフロー(PCRを行わない場合)
この処理は、上記で作成したターゲット検体のDNAマーカー塩基配列群及びサンプル検体のDNAマーカー塩基配列群の2つのデータベースを用いて行う。ここで行う処理を、図15に沿って説明する。
[Example 4] Flow of DNA identification by comparison of representative nucleotide sequences of DNA markers (when PCR is not performed)
This processing is performed using the two databases of the DNA marker base sequence group of the target specimen and the DNA marker base sequence group of the sample specimen created above. The processing performed here will be described with reference to FIG.
(100)DNAマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN=1を設定する。 (100) In order to start processing from the locus 1 of the DNA marker, N = 1 is set as an initial value of the locus number.
(200)ターゲット検体のサブグループ1から処理を開始するため、ターゲットのサブグループ番号の初期値としてU=1を設定する。 (200) In order to start processing from the subgroup 1 of the target sample, U = 1 is set as an initial value of the subgroup number of the target.
(300)ターゲット検体のDNAマーカー塩基配列群のローカス番号NのDNAマーカー塩基配列のグループの中からサブグループ番号UのDNAマーカー塩基配列のグループを選択する。 (300) A group of DNA marker base sequences of subgroup number U is selected from a group of DNA marker base sequences of locus number N in the DNA marker base sequence group of the target sample.
(400)選択したターゲット検体のDNAマーカー塩基配列のグループの中から最長の鎖長のDNAマーカー塩基配列を選択し、これをローカスサブグループ代表塩基配列TRNUとする。(例えばローカス番号1、サブグループ番号1のローカスサブグループ代表塩基配列はTR011など) (400) A DNA marker nucleotide sequence having the longest chain length is selected from the DNA marker nucleotide sequence group of the selected target sample, and this is defined as a locus subgroup representative nucleotide sequence TRNU. (For example, the locus subgroup representative base sequence of locus number 1 and subgroup number 1 is TR011, etc.)
(500)サンプル検体のサブグループ1から処理を開始するため、サンプルのサブグループ番号の初期値としてV=1を設定する。 (500) In order to start the process from the subgroup 1 of the sample, V = 1 is set as an initial value of the subgroup number of the sample.
(600)サンプル検体のDNAマーカー塩基配列群のローカス番号NのDNAマーカー塩基配列のグループの中からサブグループ番号VのDNAマーカー塩基配列のグループを選択する。 (600) A group of DNA marker base sequences of subgroup number V is selected from the group of DNA marker base sequences of locus number N in the DNA marker base sequence group of the sample specimen.
(700)選択したサンプル検体のDNAマーカー塩基配列のグループの中から最長の鎖長のDNAマーカー塩基配列を選択し、これをローカスサブグループ代表塩基配列SRNVとする。(例えばローカス番号1、サブグループ番号1のローカスサブグル−プ代表塩基配列はSR011など) (700) A DNA marker nucleotide sequence having the longest chain length is selected from the group of DNA marker nucleotide sequences of the selected sample specimen, and this is defined as a locus subgroup representative nucleotide sequence SRNV. (For example, the locus subgroup representative base sequence of locus number 1 and subgroup number 1 is SR011, etc.)
(800)上記で選択したローカス代表塩基配列TRNU及びSRNVを表4に基づいて比較する。
(900)サンプル検体の同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対して(600)〜(800)の工程を行う必要があるため、サンプル検体の同一ローカスのグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は(1300)に行ってサンプル検体のサブグループ番号VをV+1に設定換えし、(600)〜(800)の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は(1000)に行く。 (900) It is necessary to perform the steps (600) to (800) for all subgroups within the group of the same locus and the same primer sequence of the sample specimen, so that other subgroups within the same locus group of the sample specimen are required. Determine if there are any subgroups. If there is another subgroup, the procedure goes to (1300) to change the subgroup number V of the sample sample to V + 1 and repeat the operations (600) to (800). If there are no other subgroups, go to (1000).
(1000)ターゲット検体の同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対しても(300)〜(900)の工程を行う必要があるため、ターゲット検体の同一ローカスのグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は(1400)に行ってターゲットのサブグループ番号UをU+1に設定換えし、(300)〜(900)の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は(1100)に行く。 (1000) It is necessary to perform the steps (300) to (900) for all subgroups in the same locus and the same primer sequence group of the target sample. It is determined whether there is a subgroup. If there are other subgroups, go to (1400), change the subgroup number U of the target to U + 1, and repeat the operations of (300) to (900). If there are no other subgroups, go to (1100).
(1100)全ローカスの処理が完了したかチェックする。完了していない場合は次のローカスの処理をするために(1500)へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、(200)からの行程を繰り返す。完了した場合は(1200)へ行く。 (1100) It is checked whether the processing of all the loci has been completed. If not completed, go to (1500) to process the next loci, change the loci number N to N + 1, and repeat the process from (200). If completed, go to (1200).
(1200)全てのローカスサブグループ毎に、TRNUとSRNVの塩基配列の比較結果の一覧表をたとえば下記のように作成し(表5)、完成したら終了とする。
表5においては、ターゲット検体のローカス番号1には2つのサブグループが存在する。一方、サンプル検体のローカス番号1には、3つのサブグループが存在する。このため前述のように、サンプル検体には複数個体由来のDNAが混在している可能性が考えられる。さらに、複数のローカスで3つ以上のサブグループが検出された場合には、この可能性をより強く提示できる。 In Table 5, there are two subgroups for locus number 1 of the target sample. On the other hand, there are three subgroups in locus number 1 of the sample specimen. Therefore, as described above, it is conceivable that DNAs derived from a plurality of individuals are mixed in the sample specimen. Further, when three or more subgroups are detected in a plurality of loci, this possibility can be more strongly presented.
このように、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を提供することで、検体中に複数個体由来のDNAが混在する可能性があることがわかる。 As described above, by providing the comparison result table of the locus subgroup representative base sequences, it can be seen that there is a possibility that DNAs derived from a plurality of individuals are mixed in the sample.
さらに、複数個体由来のDNAが混在する検体と単一個体のDNAのみが含まれる検体、または複数個体由来のDNAが混在する検体同士について、表5のようなローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を作成すると、比較する検体の両方に共通する個体のDNAが含まれている可能性があることが分る。 Furthermore, a comparison result of loci subgroup representative base sequences as shown in Table 5 for a sample in which DNAs derived from a plurality of individuals are mixed and a sample in which only DNAs of a single individual are included, or a sample in which DNAs derived from a plurality of individuals are mixed. When the table is prepared, it is understood that there is a possibility that the DNA of an individual common to both of the samples to be compared is included.
従って、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表により、1)鎖長は等しくても塩基配列が異なるDNAマーカーの識別、2)微量DNAを用いたDNAマーカーの識別、3)分解されたDNAを用いたDNAマーカーの識別、4)同一検体中の複数個体の混在の検出用資料の提供、及び、5)2つの検体に同一個体由来のDNAが含まれているかどうか、DNA鑑定を行う判断材料となる。 Therefore, according to the comparison result table of the locus subgroup representative nucleotide sequences, 1) identification of DNA markers having the same nucleotide length but different nucleotide sequences, 2) identification of DNA markers using a small amount of DNA, and 3) identification of degraded DNA Identification of the DNA marker used, 4) Provision of data for detection of the mixture of multiple individuals in the same sample, and 5) Determination material for DNA identification as to whether two samples contain DNA from the same individual Becomes
本発明はDNA鑑定に資するデータ表を提供するものなので、犯罪関連のヒトを対象とする分野のみならず、動植物の品種判定等のDNA鑑定に関連する産業分野においても利用可能である。 Since the present invention provides a data table contributing to DNA testing, it can be used not only in fields related to crime-related humans but also in industrial fields related to DNA testing such as judging animal and plant varieties.
Claims (4)
(1)ターゲットDNAのDNAフラグメントの塩基配列を決定する工程、
(2)工程(1)で塩基配列を決定したDNAフラグメントから、DNAマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むDNAフラグメントを抽出する工程、
(3)工程(2)で抽出されたDNAフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ(ローカスグループ)に分ける工程、
(4)工程(3)で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するDNAフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のDNAフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
(5)サンプルDNAのDNAフラグメントの塩基配列を決定する工程、
(6)工程(5)で塩基配列を決定したDNAフラグメントから、DNAマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むDNAフラグメントを抽出する工程、
(7)工程(6)で抽出されたDNAフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ(ローカスグループ)に分ける工程、
(8)工程(7)で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するDNAフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のDNAフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
(9)工程(4)で選択されたターゲットDNAのサブグループ代表フラグメントと工程(8)で選択されたサンプルDNAのサブグループ代表フラグメントを、ローカス毎に比較する工程、
(10)工程(9)の比較の結果からターゲットDNAとサンプルDNAに同一DNAが存在するか、ローカス毎に求める工程。 A method for determining whether a target DNA and a sample DNA are DNAs derived from the same individual, comprising the following steps:
(1) determining the base sequence of the DNA fragment of the target DNA,
(2) extracting a DNA fragment containing a DNA marker or a partial base sequence thereof from the DNA fragment whose base sequence has been determined in step (1);
(3) a step of dividing the DNA fragments extracted in the step (2) into groups for each identical locus (locus groups) based on the nucleotide sequence;
(4) For each locus group divided in step (3), DNA fragments having the same base sequence in the locus group are divided into subgroups, and the longest DNA fragment among the subgroups is a subgroup representative fragment. The process of selecting as
(5) determining the base sequence of the DNA fragment of the sample DNA;
(6) a step of extracting a DNA fragment containing a DNA marker or a partial base sequence thereof from the DNA fragment whose base sequence has been determined in step (5),
(7) a step of dividing the DNA fragments extracted in the step (6) into groups (locus groups) for each same locus based on the nucleotide sequence;
(8) For each locus group divided in step (7), DNA fragments having a common base sequence in the locus group are divided into subgroups, and the longest DNA fragment among the subgroups is a subgroup representative fragment. The process of selecting as
(9) comparing the subgroup representative fragment of the target DNA selected in step (4) with the subgroup representative fragment of the sample DNA selected in step (8) for each locus;
(10) A step of determining, for each locus, whether the same DNA exists in the target DNA and the sample DNA from the result of the comparison in the step (9).
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05219932A (en) * | 1992-02-06 | 1993-08-31 | Fujitsu Ltd | Device for examining genetic information |
JP2014515926A (en) * | 2011-05-12 | 2014-07-07 | ネットバイオ・インコーポレーテッド | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of STR loci |
US20140278127A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Battelle Memorial Institute | Computer Files and Methods Supporting Forensic Analysis of Nucleotide Sequence Data |
KR20160024139A (en) * | 2014-08-25 | 2016-03-04 | 바이오코아 주식회사 | Method for analyzing genotype of human identifying markers based on next generation sequencing and personal identification method using the same |
CN105755129A (en) * | 2016-03-21 | 2016-07-13 | 北京市理化分析测试中心 | STR typing method for loca D8S1179 based on next generation sequencing |
JP2017509329A (en) * | 2014-02-18 | 2017-04-06 | イラミーナ インコーポレーテッド | Methods and compositions for DNA profiling |
-
2018
- 2018-10-01 JP JP2018186798A patent/JP6646120B1/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05219932A (en) * | 1992-02-06 | 1993-08-31 | Fujitsu Ltd | Device for examining genetic information |
JP2014515926A (en) * | 2011-05-12 | 2014-07-07 | ネットバイオ・インコーポレーテッド | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of STR loci |
US20140278127A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Battelle Memorial Institute | Computer Files and Methods Supporting Forensic Analysis of Nucleotide Sequence Data |
JP2017509329A (en) * | 2014-02-18 | 2017-04-06 | イラミーナ インコーポレーテッド | Methods and compositions for DNA profiling |
KR20160024139A (en) * | 2014-08-25 | 2016-03-04 | 바이오코아 주식회사 | Method for analyzing genotype of human identifying markers based on next generation sequencing and personal identification method using the same |
CN105755129A (en) * | 2016-03-21 | 2016-07-13 | 北京市理化分析测试中心 | STR typing method for loca D8S1179 based on next generation sequencing |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ELECTROPHORESIS, vol. 39, JPN6019028236, 2018, pages 2642 - 2654, ISSN: 0004135996 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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