JP2020051890A - Enhancement method of short chain nucleic acid molecule detection signal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、短鎖核酸分子の検出シグナルが増強された電気化学的核酸検出方法に関する。 The present invention relates to an electrochemical nucleic acid detection method in which a detection signal of a short nucleic acid molecule is enhanced.
近年、２０塩基程度のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が、様々な機能を有することから注目されている。特に、これらのｎｃＲＮＡレベルが疾患と相関する場合には、疾患マーカーとしての利用が可能である。核酸の検出方法として、種々の電気化学的な方法が報告されている。電気化学的方法では、電極に結合した核酸の負電荷による斥力や静電的相互作用、又は電極表面のプローブと形成した二本鎖へのインターカレートを利用して、プローブにハイブリダイズした標的核酸を検出する。このような電気化学的方法は、蛍光標識等を利用した生物学的方法と比較すると簡便で感度が高い。しかし、ｍｉＲＮＡなどの短鎖の核酸を検出する場合、プローブに結合した核酸の量が少ないことから、検出に限界がある。これまで、サンプル中の微量の短鎖核酸でも、高感度で検出可能な電気化学的核酸検出について検討されてきた。 In recent years, small non-coding RNAs (ncRNAs) including microRNAs (miRNAs) of about 20 bases have attracted attention because of their various functions. In particular, when these ncRNA levels correlate with a disease, it can be used as a disease marker. Various electrochemical methods have been reported as nucleic acid detection methods. In the electrochemical method, a target hybridized to a probe by using repulsion or electrostatic interaction due to negative charge of nucleic acid bound to an electrode, or intercalation into a double strand formed with the probe on the electrode surface. Detect nucleic acids. Such an electrochemical method is simpler and more sensitive than a biological method using a fluorescent label or the like. However, when detecting short-chain nucleic acids such as miRNAs, detection is limited because the amount of nucleic acids bound to the probe is small. Until now, electrochemical nucleic acid detection that can detect even a trace amount of short-chain nucleic acid in a sample with high sensitivity has been studied.
例えば、特許文献１（特許公開２００６−６７９１４号）は、ループ部分と、当該ループ部分を介して存在している核酸分子内でハイブリダイズ可能な相補的な配列部分と、当該相補的な部分の片方が伸長された部分とを有することにより、ヘアピン構造をとる第一の長鎖核酸分子と、当該第一の長鎖核酸分子の伸長された部分と相補的な第二の核酸分子とがハイブリダイズした核酸複合体を利用することにより、短鎖核酸の検出感度を高めている。第一の長鎖核酸分子におけるループ部分と相補的な配列部分の一部は、短鎖の標的配列と相補的である。このような核酸複合体に、標的核酸が結合すると、分子内ハイブリダイズが解離して相補的な配列部分の片方（末端側）が一本鎖となる。この一本鎖部分が当該配列相補的な電極表面のプローブと結合することにより、標的配列よりも長鎖の核酸が電極に結合し、核酸の性質に基づく電気信号を増強している。 For example, Patent Document 1 (Patent Publication No. 2006-67914) discloses a loop portion, a complementary sequence portion capable of hybridizing within a nucleic acid molecule existing through the loop portion, and a complementary portion of the complementary portion. By having an extended portion on one side, the first long-chain nucleic acid molecule having a hairpin structure and a second nucleic acid molecule complementary to the extended portion of the first long-chain nucleic acid molecule are hybridized. By using the soybean nucleic acid complex, the detection sensitivity of short-chain nucleic acids is increased. A portion of the sequence portion complementary to the loop portion in the first long nucleic acid molecule is complementary to the short target sequence. When a target nucleic acid binds to such a nucleic acid complex, intramolecular hybridization is dissociated, and one side (terminal side) of the complementary sequence portion becomes single-stranded. When this single-stranded portion binds to a probe on the electrode surface complementary to the sequence, a nucleic acid longer than the target sequence binds to the electrode, and an electric signal based on the properties of the nucleic acid is enhanced.
また、非特許文献１は、標的核酸の末端の一部と相補的な配列を有するＤＮＡプローブを結合させた電極と、標的核酸の反対側の末端と相補的な配列を有するレポーターＤＮＡプローブとを多数結合させた金ナノ微粒子を用いて、電極表面上に標的核酸を介して、プローブとレポータープローブを結合させるサンドイッチ法を開示している。この方法は、プローブ、標的核酸、及びレポータープローブを介して電極表面に結合した金ナノ粒子には、更に複数の第二のプローブが結合しているため、電極表面の核酸密度を高めることができる。酸化還元マーカーである［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋を、静電的相互作用により核酸に結合させて、その酸化還元電位により結合した標的核酸を検出する。 Non-Patent Document 1 discloses an electrode to which a DNA probe having a sequence complementary to a part of the end of a target nucleic acid is bound, and a reporter DNA probe having a sequence complementary to the opposite end of the target nucleic acid. A sandwich method is disclosed in which a probe and a reporter probe are bonded to a surface of an electrode via a target nucleic acid by using a large number of bonded gold nanoparticles. This method can increase the nucleic acid density on the electrode surface because a plurality of second probes are further bound to the probe, the target nucleic acid, and the gold nanoparticle bonded to the electrode surface via the reporter probe. . The redox marker [Ru (NH 3 ) 6 ] 3+ is bound to the nucleic acid by electrostatic interaction, and the bound target nucleic acid is detected by its redox potential.
非特許文献２では、核酸分子の中でもアデニンが最も金に吸着されやすい性質を利用することにより、金電極表面へのプローブの化学的結合の工程を省略しながら核酸を電気化学的に測定している。プローブが結合した磁気ビーズをサンプルと接触させ、標的核酸を磁気ビーズに結合させて単離精製した後に、得られた標的核酸の３’末端にｐｏｌｙＡを伸長させる。標的核酸３’末端ｐｏｌｙＡ伸長物を金電極に接触させて、化学反応を起こすことなく吸着反応により核酸を金に付加し、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−の酸化還元反応を検出している。 In Non-Patent Document 2, by utilizing the property that adenine is most easily adsorbed to gold among the nucleic acid molecules, the nucleic acid is electrochemically measured while omitting the step of chemically bonding the probe to the gold electrode surface. I have. The magnetic beads to which the probe is bound are brought into contact with the sample, and the target nucleic acid is bound to the magnetic beads for isolation and purification. Then, polyA is extended to the 3 ′ end of the obtained target nucleic acid. The target nucleic acid 3 ′ terminal polyA extension is brought into contact with a gold electrode, and the nucleic acid is added to gold by an adsorption reaction without causing a chemical reaction, and the redox reaction of [Fe (CN) 6 ] 3- / 4- is detected. doing.
また、特許文献２（国際公開ＷＯ２０１７／１５８８４０）は、短鎖核酸がプライマーと同程度の長さしか持たないため、ＰＣＲ法による増幅が困難であることから、短鎖核酸を伸長して長鎖にしてから増幅させ、それをサンプルとして用いて電気化学的に検出する方法を開示している。 Patent Document 2 (International Publication No. WO2017 / 158840) discloses that a short-chain nucleic acid is elongated by extending a short-chain nucleic acid because it is difficult to amplify by a PCR method since a short-chain nucleic acid has only a length similar to that of a primer. A method is disclosed in which amplification is carried out after that, and the resultant is used as a sample for electrochemical detection.
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡやＲＮＡにおける糖鎖の代わりに、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合した疑似ペプチド骨格を有する、ＤＮＡ又はＲＮＡアナログである。ＰＮＡはＤＮＡ又はＲＮＡと二本鎖を形成することができることから、新しいプローブとして利用されている（非特許文献３及び非特許文献４）。 Peptide nucleic acid (PNA) is a DNA or RNA analog having a pseudo-peptide skeleton in which N- (2-aminoethyl) glycine is bonded by an amide bond instead of a sugar chain in DNA or RNA. PNA has been used as a new probe because it can form a double strand with DNA or RNA (Non-Patent Documents 3 and 4).
ＰＮＡはＤＮＡと異なり電荷を持たない。この性質を利用してプローブに応用する電気化学的測定方法が知られている。例えば、ＰＮＡプローブと［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−を利用した測定方法が報告されている。本方法は、ＤＮＡ非結合では液中の負に帯電した［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が容易に電極に到達するが、負電荷を持つＤＮＡがＰＮＡに結合すると電荷同士の斥力により［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が電極に到達しないことを利用して標的ＤＮＡを検出する。 PNA has no charge unlike DNA. An electrochemical measurement method applied to a probe utilizing this property is known. For example, a measurement method using a PNA probe and [Fe (CN) 6 ] 4- / 3- has been reported. In this method, negatively charged [Fe (CN) 6 ] 4- / 3- in the liquid easily reaches the electrode when DNA is not bound, but when negatively charged DNA binds to PNA, the repulsive force between the charges is generated. By using the fact that [Fe (CN) 6 ] 4- / 3- does not reach the electrode, the target DNA is detected.
また、ＰＮＡプローブと共に金電極表面に８−アミノ−１−オクタンチオールを結合させることにより電極表面に陽電荷を与える方法が報告されている。本方法では、カチオンマーカー［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋を使用する。ＤＮＡ非結合状態では、８−アミノ−１−オクタンチオールによる陽電荷との斥力で［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋は電極に到達できないが、負電荷を持つＤＮＡが電極表面のＰＮＡと結合して、電荷が相殺されて失われると、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋が電極表面に到達して還元反応を起こすことを利用してＤＮＡを検出する（特許文献３、非特許文献５及び６）。 Further, a method has been reported in which 8-amino-1-octanethiol is bonded to the surface of a gold electrode together with a PNA probe to give a positive charge to the surface of the electrode. In this method, a cation marker [Ru (NH 3 ) 6 ] 3+ is used. In the DNA unbound state, [Ru (NH 3 ) 6 ] 3+ cannot reach the electrode due to the repulsive force of the positive charge due to 8-amino-1-octanethiol, but the negatively charged DNA binds to PNA on the electrode surface. Then, when the charge is offset and lost, DNA is detected by utilizing the fact that [Ru (NH 3 ) 6 ] 3+ reaches the electrode surface and causes a reduction reaction (Patent Document 3, Non-Patent Document 5 and 6).
また、金電極に標的配列と相補的なＰＮＡを結合することで、電極結合プローブへのカチオンの非特異的な結合を抑制し、検出感度を高めたとの報告もある。例えば、非特許文献７においては、金電極にＰＮＡプローブを結合し、プローブに結合したＤＮＡのリン酸基のアニオンと静電的相互作用により、金電極表面近傍に密集した［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋による電気信号を検出している。 In addition, it has been reported that by binding PNA complementary to a target sequence to a gold electrode, nonspecific binding of cations to an electrode-bound probe was suppressed, and detection sensitivity was improved. For example, in Non-Patent Document 7, a PNA probe is bound to a gold electrode, and the PNA probe is densely packed near the surface of the gold electrode by electrostatic interaction with an anion of a phosphate group of DNA bound to the probe [Ru (NH 3 )]. 6 ] An electrical signal due to 3+ is detected.
核酸の電気化学的検出に利用する酸化還元種として、上述の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋の他、核酸結合性を有するメチレンブルー（非特許文献８及び９）、Ｏｒａｃｅｔ Ｂｌｕｅ（非特許文献１０）の核酸単鎖と二本鎖への結合の違いを利用した方法になどが用いられている。 As redox species to be used for electrochemical detection of nucleic acid, the above-mentioned [Fe (CN) 6] 4- / 3-, [Ru (NH 3) 6] 3+ other, methylene blue (non-patent with nucleic acid binding properties Literatures 8 and 9) and methods using the difference in binding between single-stranded and double-stranded nucleic acids of Oracet Blue (Non-Patent Document 10) are used.
例えば、ｍｉＲＮＡは２０塩基前後の短い配列で構成されているため、負電荷量が少なく、これまでの電気化学的核酸検出方法では検出が困難であった。これまで、上述の通り、各種方法で電極表面の核酸量を増やす工夫がなされてきた。しかし、いずれの方法も特定の仲介プローブを別途作製する必要があるなど煩雑であった。 For example, since miRNA is composed of a short sequence of about 20 bases, the amount of negative charge is small, and it has been difficult to detect by the conventional electrochemical nucleic acid detection method. Until now, various methods have been devised to increase the amount of nucleic acid on the electrode surface as described above. However, each method is complicated, for example, it is necessary to separately prepare a specific mediating probe.
本発明者らは、短鎖の標的核酸の負の帯電（リン酸基）を増やすために、標的核酸を含む全ての核酸の３’末端にアデニンを付加する方法を採用した。更に、付加したアデニンの相補鎖であるポリチミン鎖を有する核酸を添加することにより、負の帯電（リン酸基）を更に増強することができることを見出した。 The present inventors have adopted a method of adding adenine to the 3 'end of all nucleic acids including the target nucleic acid in order to increase the negative charge (phosphate group) of the short-chain target nucleic acid. Furthermore, they have found that the addition of a nucleic acid having a polythymine chain, which is a complementary chain of the added adenine, can further enhance the negative charge (phosphate group).
更に、本発明者らは、より検出下限濃度が低く、ダイナミックレンジも広い検出方法について種々の検討を行った。その結果、プローブとしてＰＮＡなどの非帯電性核酸物質を使用し、酸化還元マーカーとしてリン酸骨格を有する核酸への結合性のある酸化還元マーカーを使用することで、標的核酸とのハイブリダイゼーション後の１回の測定で標的核酸を検出可能であることから、より簡便な検出方法を提供することに成功した。 Furthermore, the present inventors have conducted various studies on a detection method having a lower detection lower limit concentration and a wider dynamic range. As a result, by using an uncharged nucleic acid substance such as PNA as a probe, and using a redox marker capable of binding to a nucleic acid having a phosphate skeleton as a redox marker, Since the target nucleic acid can be detected by one measurement, a simpler detection method has been successfully provided.
すなわち、本発明の一態様は、被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
に関する。
That is, one embodiment of the present invention is a method for electrochemically detecting a short-chain target nucleic acid in a test sample,
A nucleic acid having an adenine continuous sequence is added to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA binding short target nucleic acid,
Contacting a polynucleobase-modified electrode formed by binding a polynucleobase probe and a nucleic acid non-binding substance to a conductor, and a liquid composition containing the polyA-binding short-chain target nucleic acid;
A redox marker is brought into contact with the polynucleobase-modified electrode,
A method for electrochemically detecting a short-chain target nucleic acid, comprising detecting the transfer of electrons to the polynucleobase-modified electrode by a redox reaction of the redox marker on the polynucleobase-modified electrode.
About.
本発明の別に態様は、被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的定量方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受レベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への前記電子の前記授受レベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸を算出する、短鎖標的核酸の電気化学的定量方法に関する。
Another aspect of the present invention is a method of electrochemically quantifying a short target nucleic acid in a test sample,
A nucleic acid having an adenine continuous sequence is added to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA binding short target nucleic acid,
Contacting a polynucleobase-modified electrode formed by binding a polynucleobase probe and a nucleic acid non-binding substance to a conductor, and a liquid composition containing the polyA-binding short-chain target nucleic acid;
A redox marker is brought into contact with the polynucleobase-modified electrode,
Measuring the level of electron transfer to the polynucleobase-modified electrode by a redox reaction of the redox marker on the polynucleobase-modified electrode,
The present invention relates to a method for electrochemically quantifying a short-chain target nucleic acid, wherein the target nucleic acid in the test sample is calculated from the level of the transfer of the electrons to the detected polynucleobase-modified electrode.
本発明の一態様における方法は、短鎖標的核酸であるｍｉＲＮＡにｐｏｌｙＡポリメラーゼでＡを付加することによりｍｉＲＮＡの長さを伸長し、負の帯電を増強した。さらにｐｏｌｙＡの相補鎖となるｐｏｌｙＴをハイブリダイズさせることによりさらに負電荷を増強した。これにより、増強した負帯電に結合した酸化還元マーカーから流れる電流値を上げることができ、検出シグナルが向上した。 In the method according to one embodiment of the present invention, the length of the miRNA, which is a short target nucleic acid, is extended by adding A to the miRNA using a polyA polymerase, and the negative charge is enhanced. The negative charge was further enhanced by hybridizing polyT, which is the complementary strand of polyA. Thereby, the current value flowing from the redox marker bound to the enhanced negative charge could be increased, and the detection signal was improved.
本出願において、「ヌクレオ塩基」とは、天然に存在するヌクレオチドの他、ヌクレオチドアナログを含む。天然に存在するヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。ヌクレオチドアナログとは、上述の天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドと同じ塩基を有するが、リボースの化学構造、及び／又はホスホジエステル結合の化学構造が人為的に改変された人工ヌクレオチドを意味する。例えば、グリコール核酸（Ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＧＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＢＮＡ）、２’，４’−架橋化核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）、トレオース核酸（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＴＮＡ）、及びモルホリノ核酸（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＭＮＡ）を挙げることができる。本出願において、ＧＮＡ，ＢＮＡ，ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びＭＮＡは、文脈によってモノマーと解釈してもよいし、ポリマーと解釈してもよい。 In the present application, “nucleobase” includes nucleotide analogs in addition to naturally occurring nucleotides. Naturally occurring nucleotides are deoxyribonucleotides or ribonucleotides having the bases adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T), and / or uracil (U). The nucleotide analog means an artificial nucleotide having the same base as the above-described naturally occurring deoxyribonucleotide or ribonucleotide, but having an artificially modified chemical structure of ribose and / or a phosphodiester bond. For example, a glycol nucleic acid (Glycol nucleic acid: GNA), a bridged nucleic acid (Bridged Nucleic Acid: BNA), a 2 ′, 4′-crosslinked nucleic acid (Locked nucleic acid: LNA), a peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid, PN: PN) Examples include threose nucleic acid (TNA) and morpholino nucleic acid (MNA). In the present application, GNA, BNA, LNA, PNA, TNA, and MNA may be interpreted as monomers or polymers depending on the context.
本出願において、「ポリヌクレオ塩基」とは、上述のヌクレオ塩基が直鎖状又は分岐状に重合した高分子化合物を意味する。ポリヌクレオ塩基は、１種類のヌクレオ塩基のみ（天然に存在するポリヌクレオチドのみ、又はＰＮＡの構成単位のみなど）からなるホモポリマーであってもよいし、２種類以上のヌクレオ塩基（天然に存在するポリヌクレオチドとＰＮＡ、又はＢＮＡとＬＮＡなど）のコポリマーであってもよい。よって、ＤＮＡ及びＲＮＡ等のポリヌクレオチド、並びに、ＧＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びＭＮＡのポリマーもポリヌクレオ塩基に含まれる。本出願において、「核酸」と「核酸分子」とは同義であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの総称を表す。 In the present application, “polynucleobase” means a polymer compound in which the above-mentioned nucleobase is polymerized in a linear or branched manner. The polynucleobase may be a homopolymer composed of only one type of nucleobase (eg, only a naturally occurring polynucleotide or only a PNA constituent unit), or may be a homopolymer composed of two or more types of nucleobases (naturally occurring polynucleotides). A copolymer of nucleotide and PNA or BNA and LNA). Therefore, polynucleotides such as DNA and RNA, and polymers of GNA, BNA, LNA, PNA, TNA, and MNA are also included in the polynucleobase. In the present application, “nucleic acid” and “nucleic acid molecule” are synonymous and represent a general term for DNA and RNA.
特に、本出願において、「ｐｏｌｙＡ」とは、連続してアデニン塩基を有する核酸が重合した高分子化合物又は当該高分子化合物との結合物を意味する。ｐｏｌｙＡの長さとしては、２０〜１４０塩基、３０〜１３０塩基、４０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、又は７０〜９０塩基、あるいは８０塩基であってもよい。「ｐｏｌｙＴ」とは、連続してチミン塩基を有する核酸が重合した高分子化合物又は当該高分子化合物との結合物を意味する。ｐｏｌｙＴの長さは、ｐｏｌｙＡの長さに準じて決定することができ、例えば、２０〜１４０塩基、３０〜１３０塩基、４０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、又は７０〜９０塩基、あるいは８０塩基であってもよい。 In particular, in the present application, “polyA” means a polymer compound obtained by continuously polymerizing a nucleic acid having an adenine base or a conjugate with the polymer compound. The length of polyA may be 20 to 140 bases, 30 to 130 bases, 40 to 120 bases, 50 to 110 bases, 60 to 100 bases, or 70 to 90 bases, or 80 bases. “PolyT” means a polymer compound in which nucleic acids having a thymine base are continuously polymerized, or a conjugate with the polymer compound. The length of polyT can be determined according to the length of polyA, for example, 20 to 140 bases, 30 to 130 bases, 40 to 120 bases, 50 to 110 bases, 60 to 100 bases, or 70 to 90 bases. It may be a base or 80 bases.
本出願において「プローブ」又は「ポリヌクレオ塩基プローブ」とは、特にそのように解することが不整合である場合を除き同義であり、標的配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するために用いられるポリヌクレオ塩基を意味する。プローブは、少なくともその一部に標的配列と相補的であり、標的配列と結合可能な配列を含む。プローブは、標識物質との結合や他の目的で標的配列と相補的でない配列を含んでいてもよい。 In the present application, the term "probe" or "polynucleobase probe" is synonymous, unless otherwise specifically interpreted, and is used to form a duplex by hybridization with a target sequence. Means the polynucleobase used. The probe includes a sequence that is at least partially complementary to the target sequence and is capable of binding to the target sequence. The probe may contain a sequence that is not complementary to the target sequence for binding to a labeling substance or for other purposes.
特に、ＤＮＡプローブを用いた場合には、メチレンブルー等がプローブに結合することによりバックグラウンドが上がるところ、本出願においては、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基をプローブとして用いることにより、標的核酸非存在時のバックグラウンドが低減されることを特徴とする。ハイブリダイズした核酸のみに核酸結合性酸化還元マーカーが結合することから、低濃度の標的核酸であっても検出が可能である。よって、核酸結合性酸化還元マーカーを用いた場合には、プローブを構成するポリヌクレオ塩基はメチレンブルー等の核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基が好ましく、例えば、ＰＮＡ及びＭＮＡである。プローブのポリヌクレオ塩基部分は、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基のみからなることが好ましいが、必要に応じて、低い割合（例えば、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０．５％以下）の核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基を含んでいてもよい。 In particular, when a DNA probe is used, the background is increased by the binding of methylene blue or the like to the probe.In the present application, by using a nucleic acid-binding redox marker low-binding nucleobase as a probe, The background in the absence of the target nucleic acid is reduced. Since the nucleic acid-binding redox marker binds only to the hybridized nucleic acid, it is possible to detect even a low concentration of the target nucleic acid. Therefore, when a nucleic acid-binding redox marker is used, the polynucleobase constituting the probe is preferably a low-binding nucleic acid-binding redox marker such as methylene blue, for example, PNA and MNA. The polynucleobase portion of the probe is preferably composed of only the nucleic acid-binding redox marker low-binding polynucleobase, but if necessary, a low ratio (for example, 10% or less, 5% or less, 3% or less, 1% or less). % Or less, 0.5% or less) nucleic acid-binding redox marker low-binding polynucleobase.
本出願において「酸化還元マーカー」とは、酸化還元状態の変化により電極表面への核酸の結合を検出可能な物質であれば特に制限されるものではないが、例えば、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋などのルテニウム錯体およびコバルト錯体などを用いることができる。酸化還元マーカーとして、好ましくは、核酸結合性酸化還元マーカーである。 In the present application, the “redox marker” is not particularly limited as long as it is a substance capable of detecting the binding of a nucleic acid to the electrode surface due to a change in the redox state. For example, [Fe (CN) 6 ] 3- / 4-, methylene blue, viologen analogues, and the like can be used ruthenium complexes and cobalt complexes such as [Ru (NH 3) 6] 3+. The redox marker is preferably a nucleic acid binding redox marker.
「核酸結合性酸化還元マーカー」は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸分子には結合するが、非核酸分子には結合しない酸化還元マーカーである。本出願において、核酸結合性酸化還元マーカーは、好ましくは単鎖の核酸に結合可能な化合物であり、当該化合物は、二本鎖の核酸にも結合してもよい。また、核酸結合性酸化還元マーカーは、好ましくは、核酸二本鎖のみに結合するインターカレーターは含まない。「酸化還元マーカー」とは、酸化状態と還元状態を有し、酸化還元反応により電子の受け渡しが可能な化合物を意味する。このような核酸結合性酸化還元マーカーとしては、例えば、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、ルテニウム錯体およびコバルト錯体を挙げることができる。 A “nucleic acid binding redox marker” is a redox marker that binds to nucleic acid molecules such as DNA and RNA, but does not bind to non-nucleic acid molecules. In the present application, the nucleic acid-binding redox marker is preferably a compound that can bind to a single-stranded nucleic acid, and the compound may also bind to a double-stranded nucleic acid. Further, the nucleic acid-binding redox marker preferably does not include an intercalator that binds only to a nucleic acid duplex. The “redox marker” refers to a compound that has an oxidized state and a reduced state and that can transfer electrons by a redox reaction. Examples of such a nucleic acid binding redox marker include methylene blue, viologen analogs, ruthenium complexes and cobalt complexes.
メチレンブルーは正に帯電した核酸結合性酸化還元マーカーであり、−２５０ｍＶ付近に酸化還元電位をもつ。また、メチレンブルーの核酸への結合メカニズムについてはいくつか報告があり、単鎖ＤＮＡのグアニン塩基を介して結合すること（Ｙａｎｇ、Ｗら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１４：１２９９−１３０２（２００２））や、負に帯電したリン酸基との静電的相互作用により結合すること（Ｚｈａｏ、Ｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ；３９４：３３７−３４４（１９９９））、及びＤＮＡ二本鎖中のグアニン−シトシンペアに直接インカレートすること（Ａｒｉａｓ，ＰらＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ；６３４：１２３−１２６（２００９））が報告されている。さらに、メチレンブルーの酸化還元反応は２電子の移動が生じることにより電流値が大きく出るため、１電子授受型の酸化還元種に比べて微量な核酸が検出可能であるほか、電位差も大きいため核酸レベルの差を検出しやすい。特に、メチレンブルーでハイブリダイゼーションによる核酸の電気化学検出を行う際には、ＤＮＡ等の核酸プローブではなく、ＰＮＡなどの非帯電プローブを使用することにより、バックグラウンドを小さく抑えてハイブリダイズした核酸のみを検出することができ、検出感度が更に良好になる。これは、一般的に使われるＤＮＡなどの核酸プローブにはメチレンブルーが結合することにより、バックグラウンドが上がるためである。ＰＮＡはペプチド結合で塩基を連結しているため、メチレンブルーの結合が少ないと考えられる。 Methylene blue is a positively charged nucleic acid binding redox marker and has a redox potential near -250 mV. There are several reports on the binding mechanism of methylene blue to nucleic acids, such as binding via guanine bases of single-stranded DNA (Yang, W et al., Electroanalysis; 14: 1299-1302 (2002)) and negatively. Binding by electrostatic interaction with charged phosphate groups (Zhao, G et al., Anal. Chim. Acta; 394: 337-344 (1999)), and directly to guanine-cytosine pairs in DNA duplexes. Incalating (Arias, P et al., J. Electronal. Chem; 634: 123-126 (2009)) has been reported. In addition, the redox reaction of methylene blue causes a large current value due to the transfer of two electrons, so that a small amount of nucleic acid can be detected as compared with a single-electron transfer type redox species. Difference is easy to detect. In particular, when performing electrochemical detection of nucleic acids by hybridization with methylene blue, non-charged probes such as PNAs are used instead of nucleic acid probes such as DNA, so that only hybridized nucleic acids with a reduced background are used. It can be detected, and the detection sensitivity is further improved. This is because the background is increased by the binding of methylene blue to nucleic acid probes such as commonly used DNA. Since PNA connects bases by peptide bonds, it is considered that methylene blue bonds are small.
本出願において「標的核酸」とは、本発明の方法により存在を検出し、又は定量しようとする目的の核酸を意味する。標的核酸は天然物由来である必要はなく、例えば、人工核酸なども含む。例えば、本発明の方法を疾患や障害の診断目的で利用する場合、標的核酸は生体由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本明細書において、短鎖標的核酸とは、短い鎖長を有する標的核酸を意味する。短鎖標的核酸の長さは、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、２５ｍｅｒ以下、２４ｍｅｒ以下、２３ｍｅｒ以下、２２ｍｅｒ以下、２１ｍｅｒ以下、例えば２０ｍｅｒ以下であってもよい。例えば、短鎖標的核酸の鎖長は、３ｍｅｒ以上、５ｍｅｒ以上、８ｍｅｒ以上、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。一例として、短鎖標的核酸の鎖長は、３〜５０ｍｅｒ、５〜４０ｍｅｒ、１０〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒである。また、短鎖標的核酸の代表例としては、ｍｉＲＮＡを挙げることができる。 In the present application, "target nucleic acid" means a nucleic acid of interest whose presence is to be detected or quantified by the method of the present invention. The target nucleic acid does not need to be derived from a natural product, and includes, for example, an artificial nucleic acid. For example, when the method of the present invention is used for the purpose of diagnosing a disease or disorder, the target nucleic acid means DNA or RNA derived from a living body. As used herein, a short target nucleic acid refers to a target nucleic acid having a short chain length. The length of the short target nucleic acid is 50mer or less, 45mer or less, 40mer or less, 35mer or less, 30mer or less, 29mer or less, 28mer or less, 27mer or less, 26mer or less, 25mer or less, 24mer or less, 23mer or less, 22mer or less, 21mer or less. For example, it may be 20 mer or less. For example, the length of the short target nucleic acid should be 3 mer or more, 5 mer or more, 8 mer or more, 10 mer or more, 11 mer or more, 12 mer or more, 13 mer or more, 14 mer or more, 16 mer or more, 17 mer or more, or 18 mer or more. Can be. As an example, the chain length of the short target nucleic acid is 3 to 50 mer, 5 to 40 mer, 10 to 30 mer, 15 to 28 mer, or 18 to 25 mer. As a typical example of the short target nucleic acid, miRNA can be mentioned.
本出願において「標的配列」とは、標的核酸に含まれる配列であって、検出の目的とする配列である。別の表現では、標的配列は、使用されるプローブと相補的な配列又は結合可能な配列を意味する。標的配列は、標的核酸の全長配列又は部分配列であってよい。標的配列の長さは、１０〜５０ｍｅｒである。例えば、標的配列の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。また、標的配列の鎖長は、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下とすることができる。標的配列の鎖長は、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒとすることができる。 In the present application, the “target sequence” is a sequence contained in a target nucleic acid and is a sequence to be detected. In another expression, the target sequence means a sequence complementary to or bindable to the probe used. The target sequence may be a full-length sequence or a partial sequence of the target nucleic acid. The length of the target sequence is 10 to 50 mer. For example, the chain length of the target sequence can be at least 10 mer, at least 11 mer, at least 12 mer, at least 13 mer, at least 14 mer, at least 15 mer, at least 16 mer, at least 17 mer, or at least 18 mer. In addition, the chain length of the target sequence can be 50 mer or less, 45 mer or less, 40 mer or less, 35 mer or less, 30 mer or less, 29 mer or less, 28 mer or less, 27 mer or less, 26 mer or less, or 25 mer or less. The chain length of the target sequence can be 10 to 40 mer, 13 to 30 mer, 15 to 28 mer, or 18 to 25 mer.
本出願において「非標的核酸」とは、本方法により検出することを目的としない核酸である。また、「非標的配列」とは、非標的核酸が有する配列を意味する。 In the present application, a “non-target nucleic acid” is a nucleic acid that is not intended to be detected by the present method. The “non-target sequence” means a sequence of a non-target nucleic acid.
「電極」は、ポリヌクレオ塩基プローブを結合させることができ、酸化還元マーカーによる酸化還元反応を検出可能な電極であれば、特に限定されるものではないが、例えば、好ましくは、貴金属電極であり、より好ましくは金電極である。金は、酸化還元プローブによる酸化還元反応の検出に適している。また、電極は、グラッシーカーボン、酸化グラフェンなどのカーボン電極表面に金が付着した構造をしていてもよい。また、ポリヌクレオ塩基プローブは金に直接結合している必要はなく、例えば、ポリヌクレオ塩基が結合したアクリル微粒子と金微粒子が共にカーボン電極表面に付着していてもよい。 The `` electrode '' is not particularly limited as long as it can bind a polynucleobase probe and can detect a redox reaction by a redox marker, but, for example, is preferably a noble metal electrode, More preferably, it is a gold electrode. Gold is suitable for detecting a redox reaction with a redox probe. Further, the electrode may have a structure in which gold is attached to the surface of a carbon electrode such as glassy carbon or graphene oxide. Further, the polynucleobase probe does not need to be directly bonded to gold. For example, both acrylic fine particles and gold fine particles having a polynucleobase bonded thereto may be attached to the carbon electrode surface.
「核酸非結合性物質」は、検出対象である核酸とは結合しない物質であって、プローブの構造を物理的に支える役割を果たす。核酸非結合性物質としては、例えば、短鎖アルカンチオールやジスルフィドであってもよく、より具体的には、６−メルカプト−１−ヘキサノール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（ＨＨＴ）を挙げることができる。 The “non-nucleic acid-binding substance” is a substance that does not bind to the nucleic acid to be detected and plays a role of physically supporting the structure of the probe. The nucleic acid non-binding substance may be, for example, a short-chain alkanethiol or disulfide, and more specifically, 6-mercapto-1-hexanol, 6-hydroxy-1-hexanethiol (HHT). Can be.
本発明の一態様は、
被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法に関する。
One embodiment of the present invention provides
A method for electrochemical detection of a short target nucleic acid in a test sample,
A nucleic acid having an adenine continuous sequence is added to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA binding short target nucleic acid,
Contacting a polynucleobase-modified electrode formed by binding a polynucleobase probe and a nucleic acid non-binding substance to a conductor, and a liquid composition containing the polyA-binding short-chain target nucleic acid;
A redox marker is brought into contact with the polynucleobase-modified electrode,
The present invention relates to a method for electrochemically detecting a short-chain target nucleic acid, which detects the transfer of electrons to the polynucleobase-modified electrode by a redox reaction of the redox marker on the polynucleobase-modified electrode.
ｐｏｌｙＡを付加しない場合の模式図を図１Ａに示す。左図は、ハイブリダイゼーション前の状態の模式図を示し、右図は、ハイブリダイゼーション後の模式図を示す。１は金電極上に修飾した捕捉ＰＮＡプローブ、２は核酸非結合性物質のＨＨＴ、３は標的となる核酸、４は酸化還元種としてメチレンブルーを示す。メチレンブルーは正に帯電した酸化還元マーカーであり、−２５０ｍＶ付近に酸化還元電位をもつ。また、核酸のリン酸基に結合あるいは２本鎖核酸にインターカレートする。捕捉ＰＮＡプローブにハイブリダイズした核酸のリン酸基に結合しているメチレンブルーに電位をかけ、酸化還元電流を検出する。短鎖標的核酸にｐｏｌｙＡを付加した場合の模式図を図１Ｂに示す。左図は、ｐｏｌｙＡを付加していない短鎖核酸をサンプルとして用いてメチレンブルーで測定した時の模式図を示し、右図は、ｐｏｌｙＡを付加した短鎖核酸をサンプルとして用いて、メチレンブルーで測定した時の模式図を示す。また、図１Ｃは、短鎖核酸にｐｏｌｙＡを付加し、更に付加したｐｏｌｙＡにさらにｐｏｌｙＴをハイブリダイズさせた模式図を示す。左から順に、ｐｏｌｙＡを付加しなかった場合、ｐｏｌｙＡを２０塩基、４０塩基、及び８０塩基付加した場合を示す。ｐｏｌｙＡを付加することにより、負電荷が付加され、更にｐｏｌｙＴがｐｏｌｙＡにハイブリダイズすることにより、負電荷が増大する。ｐｏｌｙＡ及びｐｏｌｙＴによる負電荷の増加は、理論的にはｐｏｌｙＡの配列長に依存すると考えられる。 FIG. 1A is a schematic diagram when polyA is not added. The left diagram shows a schematic diagram before the hybridization, and the right diagram shows a schematic diagram after the hybridization. 1 is a capture PNA probe modified on a gold electrode, 2 is HHT of a nucleic acid non-binding substance, 3 is a target nucleic acid, and 4 is methylene blue as a redox species. Methylene blue is a positively charged redox marker and has a redox potential near -250 mV. Further, it binds to a phosphate group of a nucleic acid or intercalates into a double-stranded nucleic acid. A potential is applied to methylene blue bound to the phosphate group of the nucleic acid hybridized to the capture PNA probe, and a redox current is detected. FIG. 1B is a schematic diagram when polyA is added to the short target nucleic acid. The left figure shows a schematic diagram when measurement was performed using methylene blue using a short nucleic acid to which polyA was not added as a sample, and the right figure was measured using methylene blue using a short nucleic acid to which polyA was added as a sample. FIG. FIG. 1C shows a schematic diagram in which polyA is added to a short-chain nucleic acid, and polyT is further hybridized to the added polyA. From left to right, the case where polyA was not added, the case where polyA was added at 20, 40, and 80 bases are shown. By adding polyA, a negative charge is added, and further, by hybridizing polyT to polyA, the negative charge increases. It is thought that the increase in negative charge due to polyA and polyT theoretically depends on the sequence length of polyA.
１．短鎖標的核酸へのアデニン連続配列の付加
本発明の実施形態における、短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を得るステップは、ポリメラーゼを用いて３’末端にアデニン残基を伸長させることにより付加してもよいし、制限酵素などを利用して予め調整しておいたｐｏｌｙＡを短鎖標的核酸に結合させてもよい。前者の場合、以下の手順により行うことができる。短鎖標的核酸、１０×ｐｏｌｙＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ、ＡＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｌｙＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び滅菌水を含む反応液を３７℃で５〜５０分間反応させる。アデニン付加後、６５℃で２０分間加温し、酵素を失活させる。得られた反応溶液は必要に応じて１×ＳＳＣ＋２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解して用いることができる。また、短鎖標的核酸へのアデニン連続配列の付加は、当該短鎖標的核酸のみに付加する必要はなく、サンプル中に含まれる全ての核酸についてアデニンが付加されてもよい。
1. Addition of adenine continuous sequence to short target nucleic acid In the embodiment of the present invention, the step of adding a nucleic acid having an adenine continuous sequence to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA-binding short target nucleic acid comprises using a polymerase The adenine residue may be added to the 3 ′ end by extension, or polyA prepared in advance using a restriction enzyme or the like may be bound to the short target nucleic acid. In the former case, the following procedure can be used. Short target nucleic acid, 10 × polyA polymerase buffer, ATP, E.C. A reaction solution containing E. coli polyA polymerase and sterilized water is reacted at 37 ° C. for 5 to 50 minutes. After the addition of adenine, the mixture is heated at 65 ° C. for 20 minutes to inactivate the enzyme. The obtained reaction solution can be used by dissolving it in 1 × SSC + 20% DMSO solution as needed. In addition, the addition of the continuous adenine sequence to the short target nucleic acid does not need to be added to only the short target nucleic acid, and adenine may be added to all the nucleic acids contained in the sample.
２．ポリヌクレオ塩基プローブの製造
本発明の実施形態において用いるポリヌクレオ塩基プローブは、標的配列と相補的に設計されたプローブ配列に基づき、本技術分野において周知の方法を利用して製造することができる。特に、ＤＮＡ又はＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ等のポリヌクレオ塩基は１塩基ずつ結合させる化学合成に方法が良く知られており、このような方法を採用することができる。また、必要に応じて、合成したポリヌクレオ塩基プローブを固相や標識などの修飾物質に結合することもできる。
2. Production of Polynucleobase Probe The polynucleobase probe used in the embodiment of the present invention can be produced by a method well-known in the art, based on a probe sequence designed to be complementary to a target sequence. In particular, a method is well known for chemical synthesis in which polynucleobases such as DNA or RNA, PNA, LNA and the like are linked one by one, and such a method can be employed. Further, if necessary, the synthesized polynucleobase probe can be bound to a modifying substance such as a solid phase or a label.
３．修飾電極の製造
本発明の実施形態において用いる修飾電極は、金電極、又は、酸化グラフェンやスクリーンプリント電極上の金ナノ微粒子上に前記ポリヌクレオ塩基プローブを結合させることにより得ることができる。
3. Production of Modified Electrode The modified electrode used in the embodiment of the present invention can be obtained by binding the polynucleobase probe to a gold electrode or a gold nanoparticle on graphene oxide or a screen print electrode.
４．短鎖標的核酸の電気化学的検出
本方法においては、電極表面に結合したプローブに相補的な配列を有する標的核酸が結合し、それにより酸化還元マーカーが結合するか又は接近できなくする。酸化還元マーカーの酸化還元反応による電子の放出又は獲得が電極における電流又は電圧の電気信号として現れる。すなわち、酸化還元マーカーから電極への電子の授受能増加又は減少により、結合した標的核酸を検出する。酸化還元マーカーを利用した電気化学的検出方法は広く知られている。例えば、メチレンブルーを用いた方法は本願実施例の他、上述の非特許文献に記載されている。
4. Electrochemical detection of short target nucleic acids In this method, a target nucleic acid having a sequence complementary to the probe bound to the electrode surface binds, thereby binding or making the redox marker inaccessible. The emission or acquisition of electrons by the redox reaction of the redox marker appears as a current or voltage electrical signal at the electrode. That is, the bound target nucleic acid is detected by increasing or decreasing the ability to transfer electrons from the redox marker to the electrode. Electrochemical detection methods using redox markers are widely known. For example, a method using methylene blue is described in the above-mentioned non-patent literature in addition to the examples of the present application.
よって、本方法は、電極表面への標的核酸の結合と、酸化還元マーカーの酸化還元反応の電気化学的検出を必須の構成として含む。これらの本方法を構成する各反応は、順次行うこともできるし、同時に行うこともできる。例えば、標的核酸の存在を確認したい被検サンプルと酸化還元マーカーの両方を含む液体組成物中に修飾電極を浸し、プローブと標的核酸を反応させながら酸化還元マーカーの測定を行うこともできる。あるいは、電極表面に標的核酸の存在を確認したい被検サンプルを接触させた後、標的核酸に酸化還元マーカーを含む溶液に浸し、その後、酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。あるいは、電極表面に標的核酸の存在を確認したい被検サンプルと酸化還元マーカーを共に含む溶液に接触させて、標的核酸を結合させながら酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。ステップワイズに行う場合、各ステップの間に洗浄する工程を含んでいてもよい。例えば、電極表面への標的核酸の存在を確認したい被検サンプルを結合させた後、サンプルを含有しない液体（緩衝液など）中で電極を洗浄してから、酸化還元マーカーを接触させてもよい。あるいは、酸化還元マーカーが核酸結合性である場合、酸化還元マーカーを接触させた後、酸化還元マーカーを含まない液体（緩衝液など）で電極を洗浄してから、標的核酸に結合した酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。特に、核酸結合性の酸化還元マーカーを使用する場合、検出前に洗浄操作を行うことにより、液中の酸化還元マーカーによる非特異的なバックグラウンド電気信号を抑制することができることから、好ましくは、検出前に洗浄操作を行う。 Therefore, the present method includes, as essential components, the binding of the target nucleic acid to the electrode surface and the electrochemical detection of the redox reaction of the redox marker. Each of the reactions constituting the present method can be performed sequentially or simultaneously. For example, the modified electrode can be immersed in a liquid composition containing both a test sample in which the presence of the target nucleic acid is to be confirmed and the redox marker, and the redox marker can be measured while reacting the probe with the target nucleic acid. Alternatively, after contacting a test sample for which the presence of the target nucleic acid is to be confirmed on the electrode surface, the target nucleic acid is immersed in a solution containing a redox marker, and then the redox reaction of the redox marker is electrochemically detected. Is also good. Alternatively, it is also possible to electrochemically detect the redox reaction of the redox marker while binding the target nucleic acid by contacting the test sample with which the presence of the target nucleic acid is desired to be confirmed on the electrode surface and a solution containing the redox marker. Good. In the case of performing stepwise, a step of cleaning between each step may be included. For example, after binding a test sample for which it is desired to confirm the presence of the target nucleic acid on the electrode surface, the electrode may be washed in a liquid containing no sample (such as a buffer solution), and then contacted with a redox marker. . Alternatively, when the redox marker is nucleic acid binding, after contacting the redox marker, the electrode is washed with a liquid (such as a buffer) containing no redox marker, and then the redox marker bound to the target nucleic acid. May be electrochemically detected. In particular, when a nucleic acid-binding redox marker is used, by performing a washing operation before detection, it is possible to suppress a non-specific background electric signal due to the redox marker in the liquid. Perform a washing operation before detection.
被検サンプルが含有する核酸濃度としては、特に制限されるものではないが、例えば、１０−４〜１０−１６Ｍとすることができる。本方法は、被検サンプル中の標的核酸の存在を決定するために行われることから、被検サンプルは必ずしも標的核酸を含んでいる必要はない。また、被検サンプルは、標的核酸以外の核酸分子を含んでいてもよい。更に、被検サンプルは精製レベルが高いものでも低いものでもよく、被検体由来の物質として核酸のみを含んでいてもよいし、核酸以外の夾雑物（糖鎖、タンパク質など）を含んでいてもよい。例えば、被検サンプルは、検出対象となる標的核酸の存在を調べようとする目的の試料を用いて調製することができる。例えば、診断目的の場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが検出されうる試料であれば特に制限されるものではなく、リンパ液、血液（血清、血漿）、尿、便、唾液、髄液、涙、バイオプシー、毛、皮膚、爪、浸出液、細胞（例えば、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血管内皮細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｍｕｓｅ細胞、又は多能性幹細胞から分化誘導された細胞）などの体液、細胞又は組織；エクソソーム；又はセルフリーＤＮＡを用いることができる。これらの試料は、適宜ＤＮＡ又はＲＮＡの検出に適したサンプルとして調製される。 The concentration of the nucleic acid contained in the test sample is not particularly limited, but may be, for example, 10 −4 to 10 −16 M. Since the method is performed to determine the presence of a target nucleic acid in a test sample, the test sample does not necessarily need to contain the target nucleic acid. Further, the test sample may contain a nucleic acid molecule other than the target nucleic acid. Furthermore, the test sample may have a high or low purification level, may contain only nucleic acids as a substance derived from the test sample, or may contain impurities (sugar chains, proteins, etc.) other than nucleic acids. Good. For example, a test sample can be prepared using a target sample for which the presence of a target nucleic acid to be detected is to be examined. For example, for the purpose of diagnosis, the sample is not particularly limited as long as it is a sample from which DNA or RNA can be detected. Lymph, blood (serum, plasma), urine, stool, saliva, cerebrospinal fluid, tears, biopsy, hair, Body fluids, cells, such as skin, nails, exudates, cells (e.g., cells derived from circulating tumor cells (CTC), vascular endothelial cells, ES cells, iPS cells, muse cells, or pluripotent stem cells); Tissues; exosomes; or cell-free DNA can be used. These samples are appropriately prepared as samples suitable for detection of DNA or RNA.
被検サンプルと電極との反応は液中で行われ、プローブと標的核酸が結合可能な条件下であれば特に制限されるものではない。例えば、ハイブリダイズの条件として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）又は，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ等に記載の方法により行うことができる。例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中、３８〜４２℃で１０分〜１時間ハイブリダイズさせることができる。 The reaction between the test sample and the electrode is performed in a liquid, and is not particularly limited as long as the condition allows the binding of the probe and the target nucleic acid. For example, as a condition for hybridization, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012), or a method described in Current Protocol, Molecular Biology, etc., which can be described in a method described in Current Protocol, Molecular Biology, etc. For example, in 6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate) or 6 × SSPE (3 M NaCl, 0.2 M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA · 2Na, pH 7.4) at 38-42 ° C. For 10 minutes to 1 hour.
酸化還元マーカーを含有する溶液中への電極の挿入は、例えば、上述の非特許文献の記載を参酌して行うことができる。特に、核酸結合性酸化還元マーカーを用いる場合、標的核酸への核酸結合性酸化還元マーカーの結合は、酸化還元マーカーの種類に応じて適宜決定することができる。例えば、ＮａＣｌＯ４含有リン酸バッファに酸化還元マーカーを添加して、標的核酸を結合させた電極に接触させ、１〜３０分整地することにより行うことができる。使用する酸化還元マーカーの濃度は、非特異的な結合を生じることなく核酸に効率的に結合する濃度であれば特に限定されるものではないが、例えば、メチレンブルーの場合、１〜１００μＭで行うことができる。検出測定時は酸化還元マーカーを測定溶液中に含有させないことが好ましい。すなわち、プローブにハイブリダイズした標的核酸に酸化還元マーカーを結合させた後、洗浄し、標的核酸に結合した酸化還元マーカーに電位をかけて起こる電子の授受を検出することが好ましい。測定液中に酸化還元マーカーが含まれていると液中の酸化還元マーカーから生じる電子の授受と標的核酸に結合している酸化還元マーカーからの電子の授受の区別が困難となり、検出感度が低下する可能性がある。 Insertion of an electrode into a solution containing a redox marker can be performed, for example, with reference to the above-mentioned non-patent document. In particular, when a nucleic acid-binding redox marker is used, the binding of the nucleic acid-binding redox marker to the target nucleic acid can be appropriately determined according to the type of the redox marker. For example, it can be carried out by adding an oxidation-reduction marker to a phosphate buffer containing NaClO 4 , bringing it into contact with an electrode to which a target nucleic acid is bound, and leveling for 1 to 30 minutes. The concentration of the redox marker to be used is not particularly limited as long as it is a concentration that efficiently binds to the nucleic acid without causing non-specific binding. For example, in the case of methylene blue, the concentration is 1 to 100 μM. Can be. At the time of detection measurement, it is preferable not to include a redox marker in the measurement solution. That is, it is preferable that after binding the redox marker to the target nucleic acid hybridized to the probe, washing is performed, and the transfer of electrons occurring when a potential is applied to the redox marker bound to the target nucleic acid is detected. If the measurement solution contains a redox marker, it becomes difficult to distinguish between the transfer of electrons generated from the redox marker in the solution and the transfer of electrons from the redox marker bound to the target nucleic acid, resulting in lower detection sensitivity. there's a possibility that.
酸化還元反応の電気化学的測定は、例えば、ポテンショスタット又はガルバノスタットなどの三電極系の装置を用いて行うことができる。酸化還元反応の測定は、ＣＶなどのボルタンメトリー法；交流インピーダンス法（ＥＩＳ）；ファラデーインピーダンス分光法；及びクーロメトリー法により行うことができる。 The electrochemical measurement of the oxidation-reduction reaction can be performed using, for example, a three-electrode system device such as a potentiostat or a galvanostat. The measurement of the oxidation-reduction reaction can be performed by voltammetry such as CV; AC impedance (EIS); Faraday impedance spectroscopy; and coulometry.
５．標的核酸の電気化学的定量方法
本発明の別の態様は、被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的定量方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記電極への電子の授受レベルを測定し、
検出された前記電極への前記電子の前記授受レベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸を算出する、短鎖標的核酸の電気化学的定量方法に関する。
5. Another aspect of the present invention is an electrochemical quantification method for a target nucleic acid, comprising:
A nucleic acid having an adenine continuous sequence is added to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA binding short target nucleic acid,
Contacting a polynucleobase-modified electrode formed by binding a polynucleobase probe and a nucleic acid non-binding substance to a conductor, and a liquid composition containing the polyA-binding short-chain target nucleic acid;
A redox marker is brought into contact with the polynucleobase-modified electrode,
Measure the level of electron transfer to the electrode by the redox reaction of the redox marker on the polynucleobase modified electrode,
The present invention relates to a method of electrochemically quantifying a short-chain target nucleic acid, wherein the target nucleic acid in the test sample is calculated from the level of the transfer of the electrons to the detected electrode.
この標的核酸の電気化学的定量方法の測定方法は、上述の標的核酸の電気化学的検出方法と同じ方法を用いて行うことができる。ただし、上述の方法において、結合した「標的核酸を検出」する代わりに「標的核酸のレベルを測定」することにより行う。本出願において、「レベル」とは、数値化された存在量に関する指標を意味し、例えば、標的核酸の濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる指標を含む。よって、レベルは電気信号等の測定値そのものであってもよいし、濃度等に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位面積・体積当たりの存在量など）であっても良いし、又は必要に応じて設定された比較対照と比較した相対的な数値であってもよい。例えば、標的核酸のレベルの測定は、測定値を予め決められた標準曲線に当てはめることにより行うことができる。あるいは、サンプルと同時に標準液を測定し、サンプルの測定値を標準液の測定値と比較して行うことができる。 The measurement method of the method for electrochemically quantifying a target nucleic acid can be performed using the same method as the above-described method for electrochemically detecting a target nucleic acid. However, in the above method, the measurement is performed by "measuring the level of the target nucleic acid" instead of "detecting the bound target nucleic acid". In the present application, “level” means an index relating to abundance quantified, and includes, for example, the concentration or amount of a target nucleic acid or an index that can be used as an alternative. Therefore, the level may be a measured value of an electric signal or the like, or a value converted into a concentration or the like. The level may be an absolute value (abundance, abundance per unit area / volume, etc.) or a relative value as compared with a comparative control set as necessary. Is also good. For example, measurement of the level of the target nucleic acid can be performed by fitting the measured value to a predetermined standard curve. Alternatively, the standard solution can be measured simultaneously with the sample, and the measured value of the sample can be compared with the measured value of the standard solution.
６．ｐｏｌｙＴの結合
本発明の別の態様に係る方法は、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸におけるアデニン連続配列と結合可能なチミンの連続配列を有する核酸を接触させてｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とハイブリダイズさせることを含む。短鎖標的核酸とｐｏｌｙＴとの結合は、電極表面に結合したプローブと短鎖標的核酸とのハイブリダイズ前、ハイブリダイズと同時、又はハイブリダイズ後のいずれであってもよいが、好ましくは、ハイブリダイズ後である。短鎖標的核酸とｐｏｌｙＴとのハイブリダイズの条件は、上述のプローブと標的核酸のハイブリダイズ法に準じて行うことができ、例えば、１×ＳＳＣに溶解したｐｏｌｙＴと短鎖結合核酸とを接触させて、２０〜３０℃で４０分間静置することにより行うことができる。
6. PolyT Binding The method according to another aspect of the present invention comprises contacting a nucleic acid having a thymine continuous sequence capable of binding to an adenine continuous sequence in the polyA binding short target nucleic acid to hybridize with the polyA binding short target nucleic acid. Including. The binding between the short target nucleic acid and polyT may be performed before hybridization of the probe bound to the electrode surface with the short target nucleic acid, at the same time as hybridization, or after hybridization. After soybean. Hybridization between the short target nucleic acid and polyT can be performed according to the above-described hybridization method between the probe and the target nucleic acid. For example, polyT dissolved in 1 × SSC and short-chain binding nucleic acid are brought into contact with each other. Then, it can be carried out by allowing to stand at 20 to 30 ° C. for 40 minutes.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. All documents cited throughout the application are incorporated herein by reference in their entirety.
（実施例１）
（１）電極の調製
裸金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、金電極表面を洗浄した。洗浄した金電極上に０．０５％ＴＦＡに溶解した１０μＭのＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ−ｏ−Ｃｙｓ：配列番号１）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水で洗浄し、１ｍＭのＨＨＴを１０μＬ金電極上に塗布し、２５℃で３０分間静置した。
(Example 1)
(1) Preparation of Electrode The bare gold electrode was subjected to plasma irradiation with an oxygen plasma apparatus at 10 mA for 2 minutes to wash the surface of the gold electrode. 10 μL of 10 μM PNA (TTCAGTTATCACAGACTCTGTA-o-Cys: SEQ ID NO: 1) dissolved in 0.05% TFA was applied onto the washed gold electrode, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the substrate was washed with ultrapure water, 1 mM HHT was applied on 10 μL of a gold electrode, and allowed to stand at 25 ° C. for 30 minutes.
（２）ｍｉＲＮＡへのｐｏｌｙＡ付加
標的核酸として用いたｍｉＲＮＡへのｐｏｌｙＡ付加は２０μＭの人工ｍｉＲＮＡ（ＵＡＣＡＧＵＡＣＵＧＵＧＡＵＡＡＣＵＧＡＡ：配列番号２）にＥ．ｃｏｌｉ ｐｏｌｙＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて付加した。反応条件は、１００μＭの人工ｍｉＲＮＡ ４μＬ、１０×ｐｏｌｙＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｌｙＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μＬ、及び滅菌水１１μＬ添加した反応液を３７℃で５〜５０分間反応させた。経験的に本反応によるアデニン付加量は、約１０から１００塩基であると計算された。アデニン付加後、６５℃で２０分間加温し、酵素を失活させた。得られた反応溶液を１×ＳＳＣ＋２０％ＤＭＳＯ溶液で希釈し、標的濃度１００ｐＭ〜１０μＭの反応溶液として使用した。
(2) Addition of polyA to miRNA PolyA was added to miRNA used as a target nucleic acid by adding E. coli to 20 μM artificial miRNA (UACAGUACUGUGGAUAACUGAA: SEQ ID NO: 2). E. coli polyA polymerase (New England Biolabs). The reaction conditions were as follows: 4 μL of 100 μM artificial miRNA, 2 μL of 10 × polyA polymerase buffer, 2 μL of 10 mM ATP, E. coli. A reaction solution containing 1 μL of E. coli polyA polymerase and 11 μL of sterilized water was reacted at 37 ° C. for 5 to 50 minutes. Empirically, the amount of adenine added by this reaction was calculated to be about 10 to 100 bases. After the addition of adenine, the mixture was heated at 65 ° C. for 20 minutes to inactivate the enzyme. The obtained reaction solution was diluted with a 1 × SSC + 20% DMSO solution and used as a reaction solution having a target concentration of 100 pM to 10 μM.
（３）ハイブリダイゼーション及び電気化学測定
上記（１）で得られた捕捉プローブを修飾した金電極上に（２）で得られた反応溶液１０μＬを滴下し、４０℃で４０分ハイブリダイゼーションを行った。５０℃の超純水１００ｍＬ中で２分間、電極を洗浄後、５０μＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ ＮａＣｌＯ４ １ｍＬ中に電極を浸し、５分静置した。その後、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ ＮａＣｌＯ４で洗浄し、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にハイブリダイゼーションを行った後の金電極と、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ ＢＡＳ社製 ＲＥ−１Ｂ）と、Ｐｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）とを浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから−５００ｍＶ、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。さらに、ＣＶの測定を初期電位０ｍＶ、高電位０ｍＶ、低電位−５００ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで負方向の掃引により測定した。
(3) Hybridization and electrochemical measurement 10 μL of the reaction solution obtained in (2) was dropped on a gold electrode modified with the capture probe obtained in (1) above, and hybridization was performed at 40 ° C. for 40 minutes. . After washing the electrode in 100 mL of ultrapure water at 50 ° C. for 2 minutes, the electrode was immersed in 1 mL of 50 μM methylene blue + 0.25 mM phosphate buffer (sodium, pH 7.0) +0.5 mM NaClO 4 and allowed to stand for 5 minutes. Thereafter, 0.25 mM phosphate buffer (sodium, pH 7.0) + 0.5 mM washed with NaClO 4, 0.25 mM phosphate buffer (sodium, pH 7.0) + Hybridization was performed in 0.5 mM NaClO 4 1 mL The gold electrode, the aqueous reference electrode (Ag / AgCl BAS Co., RE-1B) and the Pt counter electrode (BAS Co.) were immersed, and the SWV was measured using a potentiostat at an initial potential of 0 mV to -500 mV. , A step potential of 5 mV, a pulse amplitude of 50 mV, and a cycle of 20 Hz. Further, the CV was measured by sweeping in the negative direction at an initial potential of 0 mV, a high potential of 0 mV, a low potential of -500 mV, and a scan speed of 500 mV / sec.
（４）ｐｏｌｙＴ付加及び電気化学測定
ハイブリダイゼーション後の電極を洗浄後、１×ＳＳＣに溶解した５０μＭ ｐｏｌｙＴ核酸（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ：配列番号３）１０μＬに電極を浸し、２５℃で４０分間ハイブリダイゼーションを行った。２×ＳＳＣ常温で洗浄後、５０μＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ ＮａＣｌＯ４ １ｍＬ中に電極を浸し、５分静置した。その後、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ ＮａＣｌＯ４で洗浄し、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にハイブリダイゼーション後の金電極と、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ ＢＡＳ社製 ＲＥ−１Ｂ）と、Ｐｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）とを浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから−５００ｍＶ、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。さらにＣＶの測定を初期電位０ｍＶ、高電位０ｍＶ、低電位−５００ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで負方向の掃引を行った。
(4) Addition of polyT and electrochemical measurement After washing the electrode after hybridization, the electrode was immersed in 10 μL of 50 μM polyT nucleic acid (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT: SEQ ID NO: 3) dissolved in 1 × SSC and hybridization was performed at 25 ° C. for 40 minutes. . After washing at 2 × SSC room temperature, the electrode was immersed in 1 mL of 50 μM methylene blue + 0.25 mM phosphate buffer (sodium, pH 7.0) +0.5 mM NaClO 4 and allowed to stand for 5 minutes. Thereafter, 0.25 mM phosphate buffer (sodium, pH 7.0) + 0.5 mM washed with NaClO 4, 0.25 mM phosphate buffer (sodium, pH7.0) + 0.5mM NaClO 4 gold after hybridization in 1mL The electrode, the aqueous reference electrode (RE-1B, manufactured by Ag / AgCl BAS) and the Pt counter electrode (manufactured by BAS) were immersed, and the SWV was measured using a potentiostat at an initial potential of 0 mV to -500 mV, and a step potential. The test was performed under the conditions of 5 mV, pulse amplitude of 50 mV, and cycle of 20 Hz. Further, the CV was measured by sweeping in the negative direction at an initial potential of 0 mV, a high potential of 0 mV, a low potential of -500 mV, and a scan speed of 500 mV / sec.
（５）結果
メチレンブルーでの測定結果のＣＶ波形とピーク電流値を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図中の縦軸は電流［ｎＡ］、横軸は電位［Ｖ］を表す。ピーク電流値の差は、標的核酸のみの場合（図２Ａ上段）が１４．５ｎＡであるのに対し、ｐｏｌｙＡを付加した標的核酸（図２Ａ下段））では、２８．５ｎＡとシグナルが約２倍増強された。よって、ｐｏｌｙＡの付加により標的核酸への結合シグナルが増強されることが示された。また、ｐｏｌｙＴを接触させた場合、ピーク電流値の差は、標的核酸のみの場合（図２Ｂ上段）が１４．９ｎＡとＰｏｌｙＴ非接触の場合とあまり変わらなかったのに対し、ｐｏｌｙＡを付加した標的核酸（図２Ｂ下段）では、４０．８ｎＡと、ｐｏｌｙＴ非存在下と比較してシグナルが１．４倍増強されていた。よって、ｐｏｌｙＡの付加により標的核酸）への結合シグナルが増強されることが示された。すなわち、ｐｏｌｙＡ付加とｐｏｌｙＴの接触により、シグナルは２．８倍増強されていた。この結果から、ｐｏｌｙＡ付加とｐｏｌｙＴの接触が短鎖標的核酸の検出シグナルを増強することができ、検出下限濃度を下げることが示された。
(5) Results FIGS. 2A and 2B show CV waveforms and peak current values as a result of measurement with methylene blue. The vertical axis in the figure represents current [nA], and the horizontal axis represents potential [V]. The difference between the peak current values is 14.5 nA in the case of the target nucleic acid alone (upper part in FIG. 2A), whereas the difference in the peak current value is 28.5 nA in the target nucleic acid to which polyA is added (lower part in FIG. 2A), which is about twice that of the signal. Was strengthened. Therefore, it was shown that the binding signal to the target nucleic acid was enhanced by the addition of polyA. When polyT was brought into contact, the peak current difference was 14.9 nA in the case of the target nucleic acid alone (upper row in FIG. 2B), which was not much different from that in the case of not contacting with PolyT, whereas the difference in the peak current value was not so large. In the case of the nucleic acid (lower part in FIG. 2B), the signal was 40.8 nA, and the signal was enhanced by a factor of 1.4 compared to the absence of polyT. Accordingly, it was shown that the binding signal to the target nucleic acid) was enhanced by the addition of polyA. That is, the signal was enhanced 2.8 times by the addition of polyA and contact of polyT. The results showed that addition of polyA and contact of polyT can enhance the detection signal of the short target nucleic acid, and lower the lower detection limit concentration.
また、標的核酸が存在すれば電流が流れるという仕組みから、ダイナミックレンジも広がり、分解能も細かく見られるようになった。図３は、ｐｏｌｙＡ付加前、ｐｏｌｙＡ付加後、ｐｏｌｙＴハイブリダイゼーション後にメチレンブルーでＳＷＶ測定した結果を示す。図３において、縦軸はピーク電流［ｎＡ］、横軸は標的核酸濃度［Ｍ］を示し、四角は伸長しない標的核酸、黒丸はｐｏｌｙＡで伸長した標的核酸、三角はｐｏｌｙＡで伸長した標的核酸にｐｏｌｙＴを結合したものを表す。ｐｏｌｙＡ付加前には検出下限濃度が約２ｎＭなのに対し、ｐｏｌｙＡやｐｏｌｙＴで増強すると検出下限濃度が約２００ｐＭであり、検出下限濃度が１桁下がった。 In addition, the mechanism in which a current flows when a target nucleic acid is present has increased the dynamic range and the resolution has become finer. FIG. 3 shows the results of SWV measurement with methylene blue before addition of polyA, after addition of polyA, and after hybridization of polyT. In FIG. 3, the vertical axis indicates the peak current [nA], the horizontal axis indicates the target nucleic acid concentration [M], the square indicates the target nucleic acid that does not elongate, the black circle indicates the target nucleic acid elongated with polyA, and the triangle indicates the target nucleic acid elongated with polyA. It represents the result of binding polyT. Before the addition of polyA, the lower limit of detection was about 2 nM, but when polyA or polyT was used, the lower limit of detection was about 200 pM, and the lower limit of detection was reduced by one digit.
Claims (17)
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。 A method for electrochemical detection of a short target nucleic acid in a test sample,
A nucleic acid having an adenine continuous sequence is added to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA binding short target nucleic acid,
Contacting a polynucleobase-modified electrode formed by binding a polynucleobase probe and a nucleic acid non-binding substance to a conductor, and a liquid composition containing the polyA-binding short-chain target nucleic acid;
A redox marker is brought into contact with the polynucleobase-modified electrode,
A method for electrochemically detecting a short-chain target nucleic acid, comprising detecting the transfer of electrons to the polynucleobase-modified electrode by a redox reaction of the redox marker on the polynucleobase-modified electrode.
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受レベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への前記電子の前記授受レベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸を算出する、短鎖標的核酸の電気化学的定量方法。 A method for electrochemical quantification of a short target nucleic acid in a test sample, comprising:
A nucleic acid having an adenine continuous sequence is added to the end of the short target nucleic acid to obtain a polyA binding short target nucleic acid,
Contacting a polynucleobase-modified electrode formed by binding a polynucleobase probe and a nucleic acid non-binding substance to a conductor, and a liquid composition containing the polyA-binding short-chain target nucleic acid;
A redox marker is brought into contact with the polynucleobase-modified electrode,
Measuring the level of electron transfer to the polynucleobase-modified electrode by a redox reaction of the redox marker on the polynucleobase-modified electrode,
A method for electrochemically quantifying a short-chain target nucleic acid, wherein the target nucleic acid in the test sample is calculated from the level of the transfer of the electrons to the detected polynucleobase-modified electrode.
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2018
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