JP2020018221A

JP2020018221A - Sugar oxidation method, sugar oxidase enzyme agent, and sugar oxidase enzyme electrode

Info

Publication number: JP2020018221A
Application number: JP2018144528A
Authority: JP
Inventors: 真二榎原; Shinji Enohara
Original assignee: Aisin Seiki Co Ltd
Current assignee: Aisin Corp
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2020-02-06
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: JP7234528B2

Abstract

To provide sugar oxidation methods, sugar oxidase enzyme agent, and sugar oxidase enzyme electrodes for constructing an enzyme reaction system, which can generate electric energy efficiently by a minimum of specific enzyme group from sugars such as D-glucose, particularly sugar oxidation methods, sugar oxidase enzyme agent, and sugar oxidase enzyme electrodes using an enzyme reaction system including 2-keto-D-gluconate degrading enzyme.SOLUTION: Provided is a sugar oxidation method comprising decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconate degrading enzyme consisting of a specific amino acid sequence derived from Escherichia coli, and in the amino acid sequence, an amino acid sequence having a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition of one or several amino acids, or an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence; and a sugar oxidase enzyme agent; and a sugar oxidase enzyme electrode.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、及び、糖類酸化酵素電極に関する。詳細には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を利用する糖類酸化方法、及び、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として利用する糖類酸化酵素電極に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a saccharide oxidizing method, a saccharide oxidizing agent, and a saccharide oxidizing enzyme electrode. Specifically, a saccharide oxidizing method using 2-keto-D-gluconolytic enzyme, and a saccharide oxidizing agent containing the 2-keto-D-gluconolytic enzyme, the 2-keto-D-gluconic acid The present invention relates to a saccharide oxidase electrode using a decomposing enzyme as an electrode catalyst.

近年、酵素や微生物が持つエネルギー変換システムを利用したバイオ電池の開発が進められている。バイオプロセスを利用するバイオ電池は、緩和な条件かつ高い選択性を有し、燃料として糖やアルコール等の環境中に存在する多様な物質を利用できるという利点を有する。そのため、安全で環境負荷が小さいことから、携帯型機器や体内埋込型機器等の小型電子機器の電源等として更なる発展が期待されている。近年、バイオ電池の性能向上を目指し、安定性向上、電極素材の最適化、電極／酵素間の電子の移動の効率化等の観点から研究開発が進められている。 2. Description of the Related Art In recent years, biobatteries using an energy conversion system possessed by enzymes and microorganisms have been developed. A biobattery using a bioprocess has advantages that it has mild conditions and high selectivity, and can use various substances existing in the environment such as sugar and alcohol as a fuel. Therefore, since it is safe and has a small environmental load, further development is expected as a power supply for small electronic devices such as portable devices and implantable devices. In recent years, research and development have been promoted with a view to improving the performance of a biobattery from the viewpoint of improving stability, optimizing an electrode material, and increasing the efficiency of electron transfer between an electrode and an enzyme.

特に、燃料として糖類を用いるバイオ電池が着目されている。糖類は、極めて安定した物質であることから取扱いが容易であり、かつ生物由来であるため環境負荷が小さなクリーンなエネルギー源となり得る。そして、生命を維持する上で最も重要なエネルギー源であり、生体内の温和な条件下で多段階酸化を受けて二酸化炭素と水にまで分解され、最大限のエネルギー変換が行われる。この生体内でのエネルギー変換系は酵素の働きにより進行するが、これを如何にして生体外で模擬できるかがバイオ電池の開発における課題となり、様々な研究がなされてきている。特に、D-グルコース等の糖類から最大限かつ効率よく電気エネルギーを生成するためには、糖類から多電子を取り出す一連の多段階酸化反応に関与する酵素群が必要となり、種々の試みが報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１及び２を参照のこと）。 In particular, a biobattery using a saccharide as a fuel has attracted attention. Saccharides are very stable substances and are easy to handle. Since they are of biological origin, they can be a clean energy source with a small environmental load. And it is the most important energy source for sustaining life. Under mild conditions in the living body, it undergoes multi-step oxidation to be decomposed into carbon dioxide and water, and the maximum energy conversion is performed. This in-vivo energy conversion system proceeds by the action of enzymes. How to simulate this in vitro has become an issue in the development of bio-batteries, and various studies have been made. In particular, in order to generate electric energy from saccharides such as D-glucose as efficiently and maximally as possible, a group of enzymes involved in a series of multi-step oxidation reactions for extracting multiple electrons from the saccharide is required, and various attempts have been reported. (See, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 and 2).

例えば、特許文献１には、2-ヒドロキシカルボン酸生成酵素、2-オキソ酸生成酵素、及び、2-オキソカルボキシリアーゼを含有する酵素電極が、糖類等のポリオールを分解することにより電子を取り出すことができることが報告されている。かかる酵素電極を利用するバイオセンサー及びバイオ電池を構築できること、更に、糖類としてD-グルコースをCO₂まで多段階酸化し、D-グルコース１分子から24電子を抽出する酵素反応系が示されている。 For example, Patent Document 1 discloses that an enzyme electrode containing a 2-hydroxycarboxylic acid synthase, a 2-oxo acid synthase, and a 2-oxocarboxylyase extracts electrons by decomposing a polyol such as a saccharide. It is reported that can be. A biosensor and a biobattery using such an enzyme electrode can be constructed, and an enzyme reaction system that oxidizes D-glucose as a saccharide to CO _{2 in} multiple steps and extracts 24 electrons from one molecule of D-glucose is shown. .

しかしながら、特許文献１に記載の酵素反応系は、実際の使用に適した酵素群が特定されていないことから、効率的に糖類の多段階酸化反応を進行できる酵素反応系を構築するためには多大な労力が要求される。例えば、特許文献１のように実際に使用に適した酵素が特定されてない場合には、細胞破砕液等の細胞抽出液を用いて酵素を供給することが必要となるが、細胞抽出液には目的外の酵素が大量に存在することから、様々な副反応が起こる可能性が高い。そのため、酵素反応系の反応効率が著しく低下するとの問題点がある。 However, in the enzyme reaction system described in Patent Document 1, since an enzyme group suitable for actual use has not been specified, it is necessary to construct an enzyme reaction system capable of efficiently performing a multi-stage oxidation reaction of saccharides. A great deal of effort is required. For example, when an enzyme that is actually suitable for use is not specified as in Patent Document 1, it is necessary to supply the enzyme using a cell extract such as a cell lysate. Since there is a large amount of unintended enzymes, there is a high possibility that various side reactions will occur. Therefore, there is a problem that the reaction efficiency of the enzyme reaction system is significantly reduced.

非特許文献１には、Gluconobacter属細菌から抽出したピロロキノリンキノン依存性酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ、2-グルコン酸デヒドロゲナーゼ）、Sulfolobus solfataricus由来のアルドラーゼ、及び、オオムギ由来のシュウ酸オキシダーゼを含む6酵素反応系を利用した酵素電極が報告されている。かかる酵素電極を利用したバイオ電池を構築できること、更に、D-グルコースをCO₂まで多段階酸化し、D-グルコース１分子から20電子を抽出する酵素反応系が示されている。 Non-Patent Document 1 discloses a 6-enzyme reaction system including a pyrroloquinoline quinone-dependent enzyme (glucose dehydrogenase, 2-gluconate dehydrogenase) extracted from a bacterium belonging to the genus Gluconobacter, an aldolase derived from Sulfolobus solfataricus, and an oxalate oxidase derived from barley. There is a report of an enzyme electrode utilizing the same. It shows that a biobattery using such an enzyme electrode can be constructed, and furthermore, an enzyme reaction system that oxidizes D-glucose to CO _{2 in} multiple steps and extracts 20 electrons from one molecule of D-glucose.

しかしながら、非特許文献１に記載の酵素反応系は、特許文献１と同様に、実際の使用に適した酵素群が特定されていないことから、効率的に多段階酸化反応を進行できる酵素反応系を構築するためには多大な労力が要求される。また、細胞抽出液を用いるものであることから、特許文献１と同様に、様々な副反応が起こる可能性が高く、酵素反応系の反応効率が著しく低下するとの問題点がある。 However, in the enzyme reaction system described in Non-Patent Document 1, as in Patent Document 1, an enzyme group suitable for actual use has not been identified, so that an enzyme reaction system capable of efficiently proceeding with a multi-step oxidation reaction is disclosed. A great deal of effort is required to construct Further, since a cell extract is used, there is a high possibility that various side reactions occur as in Patent Document 1, and there is a problem that the reaction efficiency of the enzyme reaction system is significantly reduced.

非特許文献２には、具体的に特定された組換え合成された12酵素による酵素反応系を利用した酵素電極が報告されている。かかる酵素反応系は、ポリリン酸グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ等が含まれ、ポリリン酸グルコキナーゼによるグルコースリン酸化、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ及び6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼによるNADH生成、NADHからアノードへの電子移動、及び、非酸化型ペントースリン酸経路及び糖新生によるグルコース6-リン酸の再生から構成されている。かかる酵素電極を利用したバイオ電池は、D-グルコースをCO₂まで多段階酸化し、D-グルコース１分子から24電子を抽出できることが報告されている。 Non-Patent Document 2 reports an enzyme electrode using an enzyme reaction system of 12 specifically synthesized and recombinantly synthesized enzymes. Such enzyme reaction systems include polyphosphate glucokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, and the like, glucose phosphorylation by polyphosphate glucokinase, glucose 6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphoglucone. It consists of NADH generation by acid dehydrogenase, electron transfer from NADH to the anode, and regeneration of glucose 6-phosphate by non-oxidized pentose phosphate pathway and gluconeogenesis. It has been reported that a biobattery using such an enzyme electrode can oxidize D-glucose to CO _{2 in} multiple steps and extract 24 electrons from one molecule of D-glucose.

しかしながら、非特許文献２の酵素反応系は、多種類の酵素群で構成されることから、当該酵素反応系を構築するために、それぞれの酵素を別個に調製する必要があり、コスト高の要因になるとの問題がある。 However, since the enzyme reaction system of Non-Patent Document 2 is composed of various types of enzymes, it is necessary to separately prepare each enzyme in order to construct the enzyme reaction system, which is a factor of high cost. There is a problem of becoming.

D-グルコースのCO₂までの多段階酸化反応に関与する酵素反応系において、非特許文献１で示される酵素反応系のようなD-グルコース→D-グルコノラクトン→D-グルクロン酸→D-グリセルアルデヒド及びヒドロキシピルビン酸へと分解する酵素反応系や、同じくグルコースを酸化して得られるD-グルコン酸を経由する酵素反応系の構築が検討されている。D-グルコースから、D-グルコノラクトン、D-グルコン酸を経て、2-ケト-D-グルコン酸へと酸化する酵素反応系に関与する酵素は多数報告されている。しかしながら、2-ケト-D-グルコン酸からD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応に関与する特定の酵素に関しては報告がないのが現状である。唯一、D-グリセルアルデヒド及びヒドロキシピルビン酸を結合する種々の酵素（アルドラーゼ）が報告されている（例えば、非特許文献３を参照のこと）が、非特許文献３にも2-ケト-D-グルコン酸からD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する酵素に関しては報告がない。また、一般的に、酵素は特定の構造を有する基質に対してのみ特異的に作用する性質を有することから、立体選択的に特定の反応のみを触媒するといえる。非特許文献３においても、アルドラーゼに立体選択性があることが確認されていることからも、従来において2-ケト-D-グルコン酸に特異的に反応する酵素を見出すことは困難であった。 In an enzyme reaction system involved in a multi-step oxidation reaction of D-glucose to CO _2, D-glucose → D-gluconolactone → D-glucuronic acid → D-glucose as in the enzyme reaction system shown in Non-Patent Document 1. Construction of an enzymatic reaction system that decomposes into glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, and an enzymatic reaction system via D-gluconic acid, which is also obtained by oxidizing glucose, is being studied. A large number of enzymes involved in an enzyme reaction system that oxidizes D-glucose to 2-keto-D-gluconic acid via D-gluconolactone and D-gluconic acid have been reported. However, at present, there is no report on a specific enzyme involved in the reaction of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. Only various enzymes (aldolases) that bind D-glyceraldehyde and hydroxypyruvate have been reported (for example, see Non-Patent Document 3), but Non-Patent Document 3 also discloses 2-keto-D. There is no report on an enzyme that decomposes -gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. Generally, an enzyme has a property of specifically acting only on a substrate having a specific structure, and thus can be said to catalyze only a specific reaction in a stereoselective manner. Non-patent document 3 also confirms that aldolase has stereoselectivity, and thus it has been difficult to find an enzyme that specifically reacts with 2-keto-D-gluconic acid.

特開2009-139257号JP 2009-139257A

Shuai Xu及びShelley D. Minteer著、“Enzymatic Biofuel Cell for Oxidation of Glucose to CO2”、ACS Catalysis、第２巻（2012年）、第１号、p91-94Shuai Xu and Shelley D. Minteer, “Enzymatic Biofuel Cell for Oxidation of Glucose to CO2”, ACS Catalysis, Volume 2 (2012), Issue 1, p91-94 ZhiguangZhu及び、Y.-H. Percival Zhang著、“In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose”、Metabolic Engineering、第39巻（2017年）、p110-116Zhiguang Zhu and Y.-H. Percival Zhang, “In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose”, Metabolic Engineering, Vol. 39 (2017), p110-116 Veronique de Berardinis他著、“Expanding the reaction space of aldolases using hydroxypyruvate as a nucleophilic substrate”、Green Chemistry、第19巻（2017年）、第2号、p519-526Veronique de Berardinis et al., "Expanding the reaction space of aldolases using hydroxypyruvate as a nucleophilic substrate", Green Chemistry, Volume 19 (2017), Issue 2, p519-526

そこで、本発明は上記従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、D-グルコース等の糖類から最低限度の特定の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成できる酵素反応系の構築を目的とし、かかる酵素反応系構築のための糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、及び、糖類酸化酵素電極の提供を目的とする。特には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含めた酵素反応系による糖類酸化方法、及び、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤、当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒とする糖類酸化酵素電極の提供を目的とする。 Therefore, the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and has as its object to construct an enzyme reaction system that can efficiently generate electric energy from a minimum of specific enzymes from saccharides such as D-glucose. It is another object of the present invention to provide a saccharide oxidizing method, a saccharide oxidizing agent, and a saccharide oxidizing enzyme electrode for constructing the enzyme reaction system. In particular, a saccharide oxidation method using an enzyme reaction system including 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, and a saccharide oxidase containing the 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, the 2-keto-D -To provide a saccharide oxidase electrode using gluconate-degrading enzyme as an electrode catalyst.

そこで、発明者は上記課題を達成するべく、鋭意研究を行った結果、特定のアルドースが2-ケト-D-グルコン酸を分解してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解できることを見出した。かかる2-ケト-D-グルコン酸の分解反応を利用することで糖類の多段階酸化反応を触媒する酵素反応系を構築でき、糖類から効率的に電気エネルギーを生成することができることを見出した。本発明者は、かかる知見に基づいて本発明を完成するに至った。 Thus, the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, found that a specific aldose can decompose 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. Was. By utilizing the decomposition reaction of 2-keto-D-gluconic acid, an enzymatic reaction system that catalyzes a multi-step oxidation reaction of saccharides can be constructed, and electric energy can be efficiently generated from saccharides. The present inventors have completed the present invention based on such findings.

上記課題を解決するため、下記〔１〕〜〔５〕の構成の発明を提供する。 In order to solve the above-mentioned problems, the present invention has the following configurations [1] to [5].

〔１〕糖類を分解する糖類酸化方法であって、
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程を、含む糖類酸化方法。 [1] A saccharide oxidation method for decomposing saccharides,
An amino acid sequence according to any of the following (a) to (c):
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition;
(C) an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Consists of, 2-keto-D-gluconic acid by a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, A saccharide oxidation method comprising a step of decomposing into glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid.

上記〔１〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による糖類酸化方法を提供することができる。従来において、D-グルコース等の酸化分解産物である2-ケト-D-グルコン酸を分解する酵素が特定されていなかった。そのため、D-グルコース等の糖類からCO₂への多段階酸化反応を触媒する酵素反応系の構築には、多種類の酵素群を用いるか、細胞破砕液等の細胞抽出液を用いる必要があった。多種類の酵素群を用いる場合には、それぞれの酵素を別個調製する必要があり、コスト高の要因になるとの問題があり、また、細胞抽出液を用いる場合には、細胞抽出液には目的外の酵素が大量に存在することから、様々な副反応が起こる可能性が高く、酵素反応系の反応効率が著しく低下するとの問題点があった。本構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応系の構築が可能となる。これにより、D-グルコース１分子から24電子を取り出す酵素反応系を構築することが可能となる。2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を用いることで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。 According to the configuration of the above [1], there is provided a method for oxidizing a saccharide by a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. can do. Conventionally, an enzyme that degrades 2-keto-D-gluconic acid, which is an oxidative degradation product such as D-glucose, has not been identified. Therefore, the construction of saccharides such as D- glucose enzymatic reaction system catalyzes the multistage oxidation reaction to CO _2, or using a variety of enzymes, it is necessary to use a cell extract of the cell lysate or the like Was. In the case of using various enzyme groups, it is necessary to prepare each enzyme separately, which causes a problem that the cost is increased. Since a large amount of external enzyme is present, there is a high possibility that various side reactions will occur, and there has been a problem that the reaction efficiency of the enzyme reaction system is significantly reduced. According to this configuration, an enzyme capable of oxidatively decomposing 2-keto-D-gluconic acid can be provided for the first time, and a multi-stage oxidation reaction system for saccharides can be constructed. This makes it possible to construct an enzyme reaction system that extracts 24 electrons from one D-glucose molecule. By using 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, it is possible to efficiently generate electric energy from saccharides such as D-glucose with the minimum group of enzymes, It is possible to provide a highly practical technique such as application.

〔２〕以下の（Ａ）〜（Ｇ）の少なくとも１の工程を含む請求項１に記載の糖類酸化方法。
（Ａ）前記D-グリセルアルデヒドを、アルデヒド酸化酵素によりD-グリセリン酸に分解する工程、
（Ｂ）前記D-グリセリン酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりヒドロキシピルビン酸に分解する工程、
（Ｃ）前記ヒドロキシピルビン酸を、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素の組み合わせにより、グリコール酸に分解する工程、
（Ｄ）前記グリコール酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりグリオキシル酸に分解する工程、
（Ｅ）前記グリオキシル酸を、アルデヒド酸化酵素によりシュウ酸に分解する工程、
（Ｆ）前記シュウ酸を、シュウ酸脱炭酸酵素によりギ酸に分解する工程、
（Ｇ）前記ギ酸を、ギ酸酸化酵素によりCO₂に分解する工程、
を含む上記〔１〕の糖類酸化方法。 [2] The saccharide oxidation method according to claim 1, comprising at least one of the following steps (A) to (G).
(A) a step of decomposing the D-glyceraldehyde to D-glyceric acid by an aldehyde oxidase;
(B) a step of decomposing the D-glyceric acid into hydroxypyruvate by D-2-hydroxyacid oxidase;
(C) decomposing the hydroxypyruvate to glycolic acid by hydroxypyruvate oxidase or a combination of hydroxypyruvate decarboxylase and aldehyde oxidase;
(D) decomposing the glycolic acid into glyoxylic acid with a D-2-hydroxyacid oxidase;
(E) decomposing the glyoxylic acid into oxalic acid by an aldehyde oxidase;
(F) decomposing the oxalic acid into formic acid by oxalate decarboxylase;
(G) a step of decomposing the formic acid into CO ₂ by a formate oxidase;
The saccharide oxidation method according to the above [1], comprising:

上記〔２〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加え、D-グルコース等の糖類のCO₂への多段階酸化反応において、当該工程の下流側の酵素反応系を構成する酵素群を特定することにより、糖類の多段階酸化反応を安定的かつ円滑に進行できるようになり、より効率的に電気エネルギーを生成することができる。 According to the configuration of the above [2], in addition to the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, In the multi-stage oxidation reaction of saccharides such as to CO ₂ , by specifying the enzyme group that constitutes the enzyme reaction system downstream of the process, the multi-stage oxidation reaction of saccharides can proceed stably and smoothly Thus, electric energy can be generated more efficiently.

〔３〕以下の（Ｈ）及び（Ｉ）の少なくとも１の工程、
（Ｈ）D-グルコースを、グルコース-1-酸化酵素によりD-グルコン酸に分解する工程、
（Ｉ）前記D-グルコン酸を、グルコン酸-2-酸化酵素により前記2-ケト-D-グルコン酸に分解する工程、
を含む上記〔１〕又は〔２〕の糖類酸化方法。 [3] at least one of the following steps (H) and (I):
(H) a step of decomposing D-glucose into D-gluconic acid by glucose-1-oxidase;
(I) a step of decomposing the D-gluconic acid into the 2-keto-D-gluconic acid by gluconic acid-2-oxidase;
The saccharide oxidation method according to the above [1] or [2], comprising:

上記〔３〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加え、D-グルコース等の糖類のCO₂への多段階酸化反応において、当該工程の上流側の酵素反応系を構成する酵素群を特定することにより、糖類の多段階酸化反応を安定的かつ円滑に進行できるようになり、より効率的に電気エネルギーを生成することができる。 According to the configuration of the above [3], in addition to the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, in a multi-step oxidation reaction to sugars CO ₂ etc., by identifying an enzyme group constituting the upstream side of the enzymatic reaction system of the step, so that it can be stably and smoothly progress the multistep oxidation of sugars Thus, electric energy can be generated more efficiently.

〔４〕以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む、糖類を分解するための糖類酸化酵素剤。 [4] the amino acid sequence of any of the following (a) to (c):
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition;
(C) an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Comprising a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, a saccharide oxidase for decomposing saccharides Agent.

上記〔４〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤を提供することができる。従来において構築された糖類の多段酸化反応を触媒する酵素反応系は、コスト高を招くことや酵素反応系の反応効率の点で問題がある。本構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素剤を提供することが可能となる。本構成の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含むことで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。 According to the configuration of the above [4], a saccharide oxidizing agent comprising a 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. Can be provided. Conventionally constructed enzyme reaction systems that catalyze the multi-stage oxidation reaction of saccharides have problems in terms of cost increase and reaction efficiency of the enzyme reaction system. According to this configuration, an enzyme capable of oxidatively decomposing 2-keto-D-gluconic acid can be provided for the first time, and a saccharide oxidizing enzyme agent for constructing an enzyme reaction system for performing a multi-step oxidation reaction of saccharides is provided. It becomes possible. The saccharide oxidase agent of this configuration contains 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme, which enables efficient generation of electric energy from saccharides such as D-glucose by the minimum group of enzymes. Thus, it is possible to provide a highly practical technology such as application to a biosensor or a biobattery.

〔５〕以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として電極材上に固定した糖類酸化酵素電極。 [5] the amino acid sequence of any of the following (a) to (c):
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition;
(C) an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Composed of a 2-keto-D-gluconic acid, which has an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, and saccharide oxidation immobilized on an electrode material as an electrode catalyst. Enzyme electrode.

上記〔５〕の構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極材上に固定した糖類酸化酵素電極を提供することができる。従来において構築された糖類の多段酸化反応を触媒する酵素反応系は、コスト高を招くことや酵素反応系の反応効率の点で問題がある。本構成によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素電極を提供することが可能となる。本構成の糖類酸化酵素電極は2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として含むことで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。 According to the configuration [5], 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid is immobilized on the electrode material. A saccharide oxidase electrode can be provided. Conventionally constructed enzyme reaction systems that catalyze the multi-stage oxidation reaction of saccharides have problems in terms of cost increase and reaction efficiency of the enzyme reaction system. According to this configuration, an enzyme capable of oxidatively decomposing 2-keto-D-gluconic acid can be provided for the first time, and a saccharide oxidase electrode for constructing an enzyme reaction system for performing a multi-step oxidation reaction of saccharides is provided. It becomes possible. The saccharide oxidase electrode of this configuration contains 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme as an electrocatalyst, so that it is possible to efficiently generate electric energy from saccharides such as D-glucose using the minimum group of enzymes. This makes it possible to provide a highly practical technique such as application to a biosensor or a biobattery.

本実施形態の糖類酸化方法の一例を示すブロック図であり、D-グルコースからCO₂への多段階酸化反応による分解経路を示す。FIG. ₂ is a block diagram illustrating an example of a saccharide oxidation method according to the present embodiment, illustrating a decomposition pathway by a multi-step oxidation reaction from D-glucose to CO ₂ . 2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって生成した酵素反応物の解析を行った実施例３の結果を示すグラフであり、D-グリセルアルデヒドの検出結果を示す。It is a graph which shows the result of Example 3 which analyzed the enzyme reaction product produced | generated by 2-keto-D-gluconate degradation enzyme, and shows the detection result of D-glyceraldehyde. 2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって生成した酵素反応物の解析を行った実施例３の結果を示すグラフであり、ヒドロキシピルビン酸の検出結果を示す。It is a graph which shows the result of Example 3 which analyzed the enzyme reaction product produced | generated by 2-keto-D-gluconolytic enzyme, and shows the detection result of hydroxypyruvic acid. 酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４において検討を行った2-ケト-D-グルコン酸（2KG）の多段階酸化反応による分解経路を示すブロック図。FIG. 9 is a block diagram showing a decomposition pathway of 2-keto-D-gluconic acid (2KG) by a multi-step oxidation reaction studied in Example 4 in which the amount of electron extraction by an enzyme reaction was compared. 酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４において検討を行った2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸（KDG）の多段階酸化反応による分解経路を示すブロック図。FIG. 7 is a block diagram showing a decomposition pathway of 2-dehydro-3-deoxy-D-gluconic acid (KDG) by a multi-step oxidation reaction studied in Example 4 in which the amount of electron extraction by an enzyme reaction was compared. 酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４の結果を示すグラフであり、No.4の結果を示す。6 is a graph showing the result of Example 4 in which the amount of electron extraction by the enzyme reaction was compared, and shows the result of No. 4. 酵素反応による電子抽出量の比較を行った実施例４の結果を示すグラフであり、No.5の結果を示す。7 is a graph showing the results of Example 4 in which the amounts of electrons extracted by the enzyme reaction were compared, and shows the results of No. 5.

（糖類酸化方法）
本発明の実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸を、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を利用するものである。 (Saccharide oxidation method)
The saccharide oxidation method of the embodiment of the present invention utilizes 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, which catalyzes a reaction for decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. Is what you do.

本実施形態の糖類酸化方法で利用される2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、上記した通り、2-ケト-D-グルコン酸を、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する。当該2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、国際生化学・分子生物学連合による酵素番号（EC番号）においてEC 4.1.2.53に属する2-ケト-3-デオキシ-L-ラムノン酸アルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）として（2-ケト-3-デオキシ-L-ラムノン酸 ⇔ ピルビン酸 + (S)-ラクトアルデヒド）の反応を触媒することが知られている酵素であり、補因子としてMgイオンが要求される酵素である。 The 2-keto-D-gluconate degrading enzyme used in the saccharide oxidation method of the present embodiment degrades 2-keto-D-gluconate into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid as described above. Catalyze the reaction. The 2-keto-D-gluconate degrading enzyme is 2-keto-3-deoxy-L-rhamnoic acid aldolase (2) belonging to EC 4.1.2.53 in the enzyme number (EC number) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. An enzyme known to catalyze the reaction of (2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate ⇔ pyruvate + (S) -lactaldehyde) as -keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase Yes, it is an enzyme that requires Mg ion as a cofactor.

本実施形態の糖類酸化方法の対象となる糖類は、2-ケト-D-グルコン酸自体及び他の酵素又は酵素群の作用により2-ケト-D-グルコン酸を生成するものである限り特に制限ない。例えば、2-ケト-D-グルコン酸は、D-グルコースからの多段階酸化反応により、D-グルコノラクトン、D-グルコン酸を経て生成することから、D-グルコースも本実施形態の糖類酸化方法の好適な対象となる。また、糖類には、D-マンノース及びD-フルクトース等の六炭糖の単糖類が含まれる。更に、これらの単糖類が脱水縮合した二糖類やそれ以上の単糖類が脱水縮合した多糖類も含まれる。二糖類としては、マルトースやスクロース、セルビオース、ラクトース等が例示され、多糖類としては、デンプン、グルコマンナン、セルロース等が例示されるがこれらに限定されるものではない。 The saccharide to be subjected to the saccharide oxidation method of the present embodiment is not particularly limited as long as it produces 2-keto-D-gluconic acid by the action of 2-keto-D-gluconic acid itself and other enzymes or enzymes. Absent. For example, since 2-keto-D-gluconic acid is produced via D-gluconolactone and D-gluconic acid by a multi-step oxidation reaction from D-glucose, D-glucose is also a saccharide oxidant of the present embodiment. It is a suitable subject of the method. In addition, the saccharides include hexasaccharide monosaccharides such as D-mannose and D-fructose. Further, disaccharides obtained by dehydration-condensation of these monosaccharides and polysaccharides obtained by dehydration-condensation of more monosaccharides are also included. Examples of the disaccharide include maltose, sucrose, cellobiose, lactose, and the like, and examples of the polysaccharide include starch, glucomannan, and cellulose, but are not limited thereto.

2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるもの、及び、その改変体を包含する。好ましくは、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のアミノ酸配列からなり、2-ケト-D-グルコン酸に作用しD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するものである。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも一定割合の配列同一性を有するアミノ酸配列 The 2-keto-D-gluconate degrading enzymes include those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and variants thereof. Preferably, it has the amino acid sequence of the following (a), (b) or (c), and has an activity of acting on 2-keto-D-gluconic acid and decomposing it into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. It is.
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have a modification comprising at least one of deletion, substitution, insertion and addition (c) An amino acid sequence having at least a certain percentage of sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2

ここで、「１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする核酸分子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。例えば、このような改変は、配列番号２で示すアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで少なくとも一定割合の配列同一性を有するものとできる。 Here, “modification comprising at least one of deletion, substitution, insertion and addition of one or more amino acids” refers to a known DNA recombination technique for a nucleic acid molecule encoding a protein on which modification is based, point mutation, or the like. It means that the number of amino acids that can be deleted, substituted, inserted or added is deleted, substituted, inserted or added by an introduction method or the like, and also includes a combination thereof. For example, such modifications can have at least a certain percentage of sequence identity at the amino acid level to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

また、「少なくとも一定割合の配列同一性」とは、好ましくは70、75、80、又は85％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは95、96、97、98、又は99％以上の配列同一性を保持することを意味する。 The “at least a certain percentage of sequence identity” is preferably 70%, 75, 80, or 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95, 96, 97, 98, or 99% or more. It means retaining sequence identity.

アミノ酸配列の改変に際しては、当業者は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の理化学的物性を保持する改変を容易に予測することができる。具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。また、その後の精製、固相への固定等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にヒスチジンタグ（His-tag）、FLAGタグ（FLAG-tag）等を付加したものも好適に例示される。このようなタグペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、酵素活性の消失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。 When modifying the amino acid sequence, those skilled in the art can easily predict a modification that maintains the physicochemical properties of 2-keto-D-gluconate. Specifically, for example, in the case of amino acid substitution, it can be substituted with an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution in terms of polarity, charge, hydrophilicity, or hydrophobicity from the viewpoint of protein structure retention. . Such substitutions are well-known to those skilled in the art as conservative substitutions. Specifically, for example, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan are all classified as non-polar amino acids and therefore have similar properties. In addition, examples of the non-charged amino acid include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Examples of the acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Examples of the basic amino acid include lysine, arginine, and histidine. Amino acid substitutions within each of these groups are tolerated as maintaining protein function. Further, for convenience of subsequent purification, immobilization to a solid phase, etc., those in which a histidine tag (His-tag), FLAG tag (FLAG-tag), or the like is added to the N- or C-terminal of the amino acid sequence are also preferably exemplified. Is done. The introduction of such a tag peptide can be carried out by a conventional method. Also, a truncated form in which a C-terminal or N-terminal amino acid residue is cleaved within a range that does not cause loss of enzyme activity may be used. Further, chemical modification such as glucosylation may be added.

本実施形態の糖類酸化方法で利用される2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、そのアミノ酸配列及び理化学的物性が確認されたことから、自然界をスクリーニングすることにより取得することができる。しかしながら、公知の遺伝子工学的技術を用いて、本発明の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を取得し、得られた核酸分子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するタンパク質を採取することによって取得することが好ましい。2-ケト-D-グルコン酸を分解する活性の確認方法については下記で詳述する。 The 2-keto-D-gluconate degrading enzyme used in the saccharide oxidation method of the present embodiment can be obtained by screening the natural world because its amino acid sequence and physicochemical properties have been confirmed. However, using a known genetic engineering technique, a nucleic acid molecule encoding the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme of the present invention is obtained, and a host cell is transformed with the obtained nucleic acid molecule. It is preferable that the protein be obtained by collecting a protein having an activity of acting on 2-keto-D-gluconic acid to decompose into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid from a culture of the transformant. A method for confirming the activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid will be described in detail below.

改変体についても、自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。若しくは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子に対して公知の方法で改変を施すことによっても取得できる。 Regarding the variant, a protein having an activity of acting on 2-keto-D-gluconic acid to degrade into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid from mutants generated by natural or artificial mutation It can be obtained by screening. Alternatively, it can be obtained by modifying a nucleic acid molecule encoding the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by a known method.

例えば、改変の基礎とする配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子、好ましくは、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子に対して、下記で詳述するように改変を施し、得られた改変型核酸分子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。 For example, for a nucleic acid molecule encoding a 2-keto-D-gluconate degrading enzyme consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 based on the modification, preferably a nucleic acid molecule consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, Modified as described in detail below, transformed host cells using the resulting modified nucleic acid molecule, from the culture of such a transformant acting on 2-keto-D-gluconic acid D- It can be obtained by collecting a protein having an activity of decomposing into glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid.

ここで、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、2-ケト-D-グルコン酸に作用してD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有するすべての2ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードするものを包含する。つまり、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素及びその改変体をコードする全ての核酸分子である。 Here, the nucleic acid molecule encoding the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme has the activity of acting on 2-keto-D-gluconate to degrade into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvate. Includes those encoding 2-keto-D-gluconate. That is, all nucleic acid molecules encoding the 2-keto-D-gluconolytic enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and its variants.

好ましくは、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子、及び、その改変体を包含する。特に好ましくは、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列からなる核酸分子である。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有する塩基配列
（ｆ）配列番号１に示す塩基配列と少なくとも一定割合の配列同一性を有する塩基配列 Preferably, the nucleic acid molecule encoding the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme includes a nucleic acid molecule consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a variant thereof. Particularly preferred is a nucleic acid molecule consisting of any of the following base sequences (d) to (f).
(D) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (e) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which one or several bases have a modification comprising at least one of deletion, substitution, insertion and addition (f A) a nucleotide sequence having at least a certain percentage of sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1

ここで、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子にはDNA及びRNAの双方が含まれ、DNAである場合には、一本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。 Here, the nucleic acid molecule encoding the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme includes both DNA and RNA, and in the case of DNA, it is considered that the nucleic acid is single-stranded or double-stranded. It doesn't matter.

ここで、「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となる核酸分子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。配列番号１に示す塩基配列の３'、又は５'末端にタグペプチドをコードする塩基配列が付加したものや、エキソヌクレアーゼを作用させることによって塩基配列が欠失したものが好適に例示される。また、このような改変は、配列番号１で示す塩基配列に対して、塩基レベルで少なくとも一定割合の配列同一性を有するものとできる。 Here, "modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition of one or more bases" refers to a known DNA recombination technique for a nucleic acid molecule on which modification is based, a point mutation introduction method, or the like. Means that as many bases as can be deleted, substituted, inserted or added are deleted, substituted, inserted or added, and also includes combinations thereof. Preferable examples include those in which a nucleotide sequence encoding a tag peptide is added to the 3 ′ or 5 ′ end of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and those in which the nucleotide sequence has been deleted by the action of exonuclease. Such modifications can have at least a certain percentage of sequence identity at the base level to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.

更に、コードされるタンパク質が2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を保持している限り、配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子と相補的な核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子も本発明に含まれる。 Furthermore, as long as the encoded protein retains the activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, it is complementary to the nucleic acid molecule consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Nucleic acid molecules that hybridize to stringent nucleic acid molecules under stringent conditions are also included in the invention.

ここで、ストリンジェントな条件とは、塩基配列において、60 ％以上、好ましくは70 ％、より好ましくは80 ％以上、特に好ましくは90 ％、95 ％以上の同一性を有するDNA同士が優先的にハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの反応や洗浄の際の塩濃度及び温度を適宜変化させることによって調製することができる。例えば、Sambrook他著、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、New York等に記載のサザンハイブリダイゼーションのための条件等が挙げられる。 Here, the stringent condition means that DNAs having an identity of 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or 95% or more in a base sequence preferentially. This refers to the conditions under which hybridization is possible. Stringency can be adjusted by appropriately changing the salt concentration and the temperature during the hybridization reaction and washing. For example, the conditions for Southern hybridization described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, etc. may be mentioned.

より具体的には、50 ％（v/v）ホルムアミド、5×SSC中で、42 ℃にて16時間のハイブリダイゼーションが例示される。ここで、1×SSCは、0.15 M NaCl、0.015 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0である。また、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を0.1〜1.0 ％（v/v）、変性非特異的DNAを0〜200 μl含んでいてよい。そして、洗浄条件としては、2×SSC、0.1 ％ SDS中の5 ℃にて5分間の洗浄、及び0.1×SSC、0.1 ％ SDS中の65 ℃にて30分間〜4時間の洗浄が例示される。また、これらと同等の条件も当業者は容易に理解できるであろう。 More specifically, the hybridization is carried out in 50% (v / v) formamide, 5 × SSC at 42 ° C. for 16 hours. Here, 1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0. It may contain 0.1-1.0% (v / v) of sodium dodecyl sulfate (SDS) and 0-200 μl of denatured non-specific DNA. Examples of the washing conditions include washing for 5 minutes at 5 ° C. in 2 × SSC and 0.1% SDS, and washing for 30 minutes to 4 hours at 65 ° C. in 0.1 × SSC and 0.1% SDS. . Those skilled in the art can easily understand the conditions equivalent to these.

2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、本明細書において、その塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。 The nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme may be prepared by known genetic engineering techniques based on such sequence information, since the nucleotide sequence has been clarified herein. Can be.

例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子の塩基配列、好ましくは配列番号１に示す塩基配列を基にして作製したDNAをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、生物体由来のゲノムDNA、全RNAから逆転写反応によって合成したcDNA等から所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を調製することができる。ここで用いられるプローブは、所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸分子が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。このようなプローブとしては、所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子の塩基配列に基づき、この塩基配列の連続する10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。そして、プローブは必要に応じて適当な標識が付されていてよく、このような標識として放射線同位体、蛍光色素等が例示される。 For example, a nucleic acid molecule encoding a 2-keto-D-gluconate having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be obtained using a known gene cloning technique. For example, a DNA prepared based on the base sequence of a nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate degrading enzyme consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as a probe. By the hybridization method, a nucleic acid molecule encoding a desired 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme can be prepared from genomic DNA derived from an organism, cDNA synthesized from a total RNA by a reverse transcription reaction, or the like. The probe used here is an oligonucleotide containing a sequence complementary to a nucleic acid molecule encoding the desired 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, and can be prepared by a conventional method. For example, a chemical synthesis method based on the phosphoramidite method or the like, or a restriction enzyme fragment or the like when a target nucleic acid molecule has already been obtained, can be used. Such a probe, based on the base sequence of the nucleic acid molecule encoding the desired 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, 10 or more consecutive, preferably 15 or more of this base sequence, more preferably about 20 to An oligonucleotide consisting of 50 bases is exemplified. The probe may be appropriately labeled as necessary, and examples of such a label include a radioisotope, a fluorescent dye, and the like.

また、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子の塩基配列、好ましくは配列番号１に示す塩基配列を基にして作製したプライマーとして用いるPCRによっても同様に、生物体由来のゲノムDNA、cDNAを鋳型として所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を調製することができる。PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、所望の2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸分子が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいてプライマーの設計を行う。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、所望の増幅領域を挟んで設計され、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。 In addition, by using a base sequence of a nucleic acid molecule encoding a 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably by using PCR as a primer prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Similarly, a nucleic acid molecule encoding a desired 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme can be prepared using genomic DNA or cDNA derived from an organism as a template. Primers used in the case of utilizing PCR are oligonucleotides containing a sequence complementary to a nucleic acid molecule encoding a desired 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, and can be prepared based on a conventional method. . For example, a chemical synthesis method based on the phosphoramidite method or the like, or a restriction enzyme fragment or the like when a target nucleic acid molecule has already been obtained, can be used. When a primer is prepared based on a chemical synthesis method, the primer is designed based on the sequence information of the target nucleic acid prior to the synthesis. Primers can be designed to amplify a desired region using, for example, primer design support software. After synthesis, the primer is purified by means such as HPLC. When performing chemical synthesis, a commercially available automatic synthesizer can also be used. As such a primer, an oligonucleotide designed with a desired amplification region interposed therebetween and having 10 or more, preferably 15 or more, more preferably about 20 to 50 bases is exemplified.

ここで、相補的とは、プローブ又はプライマーと標的核酸分子とが塩基対合則にしたがって特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プローブ又はプライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸分子を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件等多くの因子に依存して決定される。 Here, "complementary" means that the probe or primer and the target nucleic acid molecule can specifically bind according to the base pairing rule and form a stable double-stranded structure. Here, not only perfect complementarity, but also some nucleobases are in accordance with base pairing rules, as long as the probe or primer and the target nucleic acid molecule are sufficient to form a stable duplex structure with each other. Even partial complementarity is acceptable. The number of bases must be long enough to specifically recognize the target nucleic acid molecule, but if it is too long, it will undesirably induce a non-specific reaction. Therefore, the appropriate length is determined depending on many factors such as the sequence information of the target nucleic acid such as the GC content and the hybridization reaction conditions such as the reaction temperature and the salt concentration in the reaction solution.

また、塩基配列情報に基づいて、常法のホスホアミダイト（phosphoramidite）法等の核酸合成法により合成することによっても取得することができる。 Further, it can also be obtained by synthesizing by a nucleic acid synthesizing method such as a conventional phosphoramidite method based on the base sequence information.

また、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の改変体をコードする核酸分子は、公知の変異導入技術を利用して取得することができる。具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子に変異部位を挿入することによって行うことができる。変異部位を挿入する方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の変異型タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、PCR法等を利用して変異を導入するPCR突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法等の公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。 In addition, a nucleic acid molecule encoding a variant of 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be obtained by using a known mutagenesis technique. Specifically, insertion of a mutation site into a nucleic acid molecule encoding a 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably a nucleic acid molecule having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 Can be done by The method for inserting the mutation site is not particularly limited, and a mutation introduction technique for producing a mutant protein known to those skilled in the art can be used. For example, a known mutagenesis technique such as a site-directed mutagenesis method, a PCR sudden induction method for introducing a mutation using a PCR method or the like, or a transposon insertion mutagenesis method can be used. Alternatively, a commercially available kit for introducing a mutation (for example, QuikChange (registered trademark) Site-directed Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene)) may be used.

特には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子（DNA）、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子（DNA）を鋳型として、所望の改変を施した配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことによって取得することが、好ましく例示される。ここで、改変体の調製において、PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子と相補的な配列を含み、かつ所望の変異が挿入できるように設計されたものであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。 In particular, a nucleic acid molecule (DNA) encoding the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably a nucleic acid molecule (DNA) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a template It is preferably exemplified that the oligonucleotide is obtained by performing PCR using an oligonucleotide containing a sequence with a desired modification as a primer. Here, in the preparation of the variant, the primer used when PCR is used is a nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably SEQ ID NO: 1. And is designed so that a desired mutation can be inserted therein, and can be prepared by a conventional method. For example, a chemical synthesis method based on the phosphoramidite method or the like can be used. When a primer is prepared based on a chemical synthesis method, it is designed based on sequence information of a target nucleic acid prior to synthesis. Primers can be designed to amplify a desired region using, for example, primer design support software. After synthesis, the primer is purified by means such as HPLC. When performing chemical synthesis, a commercially available automatic synthesizer can also be used. Examples of such primers include oligonucleotides consisting of 10 or more, preferably 15 or more, more preferably about 20 to 50 bases.

また、目的とする改変を有するアミノ酸配列が定めれば、それをコードする適当な塩基配列を決定でき、常法のホスホアミダイト法等の核酸合成技術を利用して、改変体を化学的に合成することができる。或いは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする塩基配列からなる核酸分子、好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなる核酸分子に対してエキソヌクレアーゼを作用させることによって取得することができる。 In addition, once the amino acid sequence having the desired modification is determined, an appropriate nucleotide sequence encoding the amino acid sequence can be determined, and the modified compound is chemically synthesized using a nucleic acid synthesis technique such as a conventional phosphoramidite method. can do. Alternatively, an exonuclease is applied to a nucleic acid molecule consisting of a base sequence encoding 2-keto-D-gluconate degrading enzyme consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably a nucleic acid molecule consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It can be obtained by acting.

そして、得られた核酸分子用いて、当業者に公知の遺伝子組換え技術により2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を製造することができる。 Then, using the obtained nucleic acid molecule, 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme can be produced by a gene recombination technique known to those skilled in the art.

具体的には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを宿主に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、利用可能なベクターとしては、外来DNAを組み込め、かつ宿主細胞内で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（pEX系、pUC系、及びpBR系等）、ファージベクター（λgt10、λgt11、及びλZAP等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。 Specifically, a transformant is prepared by inserting a nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme into an appropriate expression vector and introducing it into a host. Here, there is no particular limitation on the vector that can be used as long as it can incorporate foreign DNA and can replicate autonomously in host cells. Thus, a vector contains a sequence of at least one restriction enzyme site into which a nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate can be inserted. For example, plasmid vectors (such as pEX, pUC, and pBR), phage vectors (such as λgt10, λgt11, and λZAP), cosmid vectors, and viral vectors (such as vaccinia virus and baculovirus) are included.

ベクターには、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子がその機能を発現できるように組み込まれている。したがって、核酸分子の機能発現に必要な他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはlacプロモータ、trpプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく公知のプロモータ配列を利用できる。更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性等の遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。 A nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate is incorporated into the vector so that its function can be expressed. Therefore, other known base sequences necessary for functional expression of the nucleic acid molecule may be included. For example, a promoter sequence, a leader sequence, a signal sequence, a ribosome binding sequence and the like can be mentioned. Preferable examples of the promoter sequence include a lac promoter and a trp promoter when the host is Escherichia coli. However, the present invention is not limited to this, and a known promoter sequence can be used. Furthermore, the recombinant vector of the present invention can also contain a marking sequence capable of imparting phenotypic selection in a host. Examples of such a marking sequence include sequences encoding genes such as drug resistance and auxotrophy. Specific examples include a kanamycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene, an ampicillin resistance gene, and the like.

ベクターへの2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法等を用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、DNAリガーゼを用いる方法等、公知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（Takara-bio社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。 Insertion of a nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme into a vector can be performed, for example, by cleaving the gene of the present invention with an appropriate restriction enzyme, and then using an appropriate vector restriction enzyme site or multicloning site. Can be used, but the method is not limited to this. For the ligation, a known method such as a method using DNA ligase can be used. Alternatively, a commercially available ligation kit such as a DNA Ligation Kit (Takara-bio) can be used.

形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli JM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、Sf９細胞等の昆虫細胞、CHO細胞、COS-7細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。 The host cell for the production of the transformant is not particularly limited as long as it can express 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme efficiently. Prokaryotic cells can be suitably used, and in particular, Escherichia coli can be used. In addition, Bacillus subtilis, Bacillus bacteria, Pseudomonas bacteria and the like can also be used. As Escherichia coli, for example, E. coli DH5α, E. coli BL21, E. coli JM109 and the like can be used. Furthermore, it is possible to use eukaryotic cells without being limited to prokaryotes. For example, yeast such as Saccharomyces cerevisiae, insect cells such as Sf9 cells, animal cells such as CHO cells, COS-7 cells, and the like can be used. As the transformation method, known methods such as a calcium chloride method, an electroporation method, a liposome transfection method, and a microinjection method can be used.

続いて、得られた形質転換体を、導入された核酸分子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養し、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を製造する。培養は、常法に準じて行うことができ、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、LB培地、M9培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。 Subsequently, the obtained transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow the expression of the introduced nucleic acid molecule, to produce 2-keto-D-gluconolytic enzyme. The cultivation can be performed according to a conventional method, and the culturing conditions may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host cell. The medium used is not particularly limited as long as it contains nutrients that can be assimilated by the host cells and can efficiently express the protein in the transformant. Therefore, the medium is preferably a medium containing a carbon source, a nitrogen source and other essential nutrients necessary for the growth of the host cell, and it does not matter whether the medium is a natural medium or a synthetic medium. For example, glucose, dextran, starch and the like can be mentioned as carbon sources, and ammonium salts, nitrates, amino acids, peptone, casein and the like can be mentioned as nitrogen sources. Other nutrients can include inorganic salts, vitamins, antibiotics, and the like, if desired. When the host cell is Escherichia coli, LB medium, M9 medium and the like can be suitably used. The culture form is not particularly limited, but a liquid medium can be suitably used from the viewpoint of mass culture.

2-ケト-D-グルコン酸分解酵素をコードする核酸分子を含む組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。 Selection of a host cell holding a recombinant vector containing a nucleic acid molecule encoding 2-keto-D-gluconate can be performed, for example, based on the presence or absence of the expression of a marking sequence. For example, when a drug resistance gene is used as a marking sequence, it can be performed by culturing in a drug-containing medium corresponding to the drug resistance gene.

形質転換体の培養物から、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。精製は、上記形質転換体の培養物から、所望の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、所望の酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、単離精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、SDS-PAGE電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等の公知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合、所望の酵素をヒスチジンタグ（His Tag）等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、所望の酵素が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。 In order to isolate and purify 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme from the culture of the transformant, an ordinary protein isolation and purification method can be used. Purification may be performed by applying a method according to a general method for isolating and purifying a protein from a culture of the above-mentioned transformant according to the fraction in which the desired enzyme is present. Specifically, when the desired enzyme is produced outside the host cells, the culture solution is used as it is, or the host cells are removed by means such as centrifugation or filtration to obtain a culture supernatant. Subsequently, the culture supernatant can be isolated and purified by appropriately selecting a known protein purification method. For example, a known isolation and purification technique such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, SDS-PAGE electrophoresis, gel filtration, hydrophobicity, anion, cation, affinity chromatography, etc. may be used alone or in appropriate combination. Can be. In particular, when affinity chromatography is used, it is preferable to express a desired enzyme as a fusion protein with a tag peptide such as a histidine tag (His Tag) and use the affinity for the tag peptide. When the desired enzyme is produced in the host cell, the culture is recovered by centrifugation, filtration, or the like. Subsequently, the host cells are disrupted by an enzymatic disruption method such as lysozyme treatment, or a physical disruption method such as sonication, freeze-thawing, osmotic shock, or the like. After crushing, the solubilized fraction is collected by means such as centrifugation and filtration. The obtained solubilized fraction can be isolated and purified by treating it in the same manner as in the case where it can be produced extracellularly.

また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素は、アミノ酸配列が公知であることから、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、所望の酵素のアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより調製することもできる。 Also, 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme can be produced by a chemical synthesis technique since the amino acid sequence is known. For example, it can be prepared by synthesizing all or a part of the amino acid sequence of a desired enzyme using a peptide synthesizer and reconstructing the obtained polypeptide under appropriate conditions.

精製されたタンパク質が、本実施形態の糖類酸化方法で利用に適した2-ケト-D-グルコン酸分解酵素であるか否かの確認は、その理化学的物性や配列の分析によって行うことができる。理化学的物性の分析による場合、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を測定することにより確認することができる。 Whether or not the purified protein is a 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme suitable for use in the saccharide oxidation method of the present embodiment can be confirmed by analyzing its physicochemical properties and sequence. . In the case of analysis of physicochemical properties, it can be confirmed by measuring the activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid.

2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する分解活性の測定は、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法の何れも利用して行うことができる。好ましくは、D-グリセルアルデヒド又はヒドロキシピルビン酸の生成を測定することによって行うことができる。例えば、生成したD-グリセルアルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナーゼに作用させ、かかるアルデヒドデヒドロゲナーゼによるD-グリセルアルデヒドの脱水素反応に基づく、電子受容体の還元反応を追跡することにより行うことができる。電子受容体としては、ジクロロインドフェノール（以下、「DCIP」と称する場合がある）及びフェナジンメトサルフェイト（以下、「PMS」と称する場合がある）等を用いることができる。例えば、DCIPの還元反応の追跡は、DCIPの吸収波長である600nmでの吸光度変化を測定することにより行うことができ、吸光度の減少度によりDCIPの還元反応を追跡することができる。また、PMSの還元反応の追跡は、還元型PMSによるニトロテトラゾリウムブルー（以下、「NTB」と称する場合がある）の還元により生成するホルマザンの吸収波長である570nmでの吸光度変化を測定することにより行うことができる。吸光度変化の測定は公知の手法により行うことができ、例えば、マイクロプレートリーダー等を利用することができる。 The measurement of the decomposition activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid decomposes 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid The reaction can be carried out using any method known as a method for measuring the activity of an enzyme that catalyzes the reaction. Preferably, it can be performed by measuring the production of D-glyceraldehyde or hydroxypyruvic acid. For example, the reaction can be carried out by reacting the generated D-glyceraldehyde with aldehyde dehydrogenase and following the reduction reaction of the electron acceptor based on the dehydrogenation of D-glyceraldehyde by such aldehyde dehydrogenase. As the electron acceptor, dichloroindophenol (hereinafter, sometimes referred to as “DCIP”), phenazine methosulfate (hereinafter, sometimes referred to as “PMS”), or the like can be used. For example, the reduction reaction of DCIP can be tracked by measuring the change in absorbance at 600 nm, which is the absorption wavelength of DCIP, and the reduction reaction of DCIP can be tracked by the degree of decrease in absorbance. The reduction reaction of PMS can be tracked by measuring the change in absorbance at 570 nm, which is the absorption wavelength of formazan generated by reduction of nitrotetrazolium blue (hereinafter sometimes referred to as “NTB”) by reduced PMS. It can be carried out. The change in absorbance can be measured by a known method, for example, using a microplate reader or the like.

また、精製したタンパク質の確認を配列分析によって行う場合には、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法等を利用することができる。 When the purified protein is confirmed by sequence analysis, it can be performed by a known amino acid analysis method. For example, an automatic amino acid determination method based on the Edman degradation method or the like can be used.

本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、糖類及び糖類の酸化による生成物を分解する活性を有する酵素による反応を含めることができる。本実施形態の糖類酸化方法は、図１に例示するD-グルコースからCO₂への多段階酸化反応を行う酵素反応系の一部又は全部を含んで構成することができる。例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による分解産物であるD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸をCO₂まで分解する一連の多段階酸化反応を行う酵素反応系、つまり、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系を含んで構成してもよい。これにより、2-ケト-D-グルコン酸一分子から16電子を取り出すことができる。また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸を分解する工程の上流側の酵素反応系であるD-グルコース等から2-ケト-D-グルコン酸を生成する反応工程を含んで構成することができ、更には、二糖類等の多糖類からD-グルコースに加水分解する反応工程や、他の単糖類からD-グルコースに変換する反応工程等を含んで構成することもできる。 The saccharide oxidation method of the present embodiment can include, in addition to the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, a reaction with an enzyme having an activity of decomposing saccharides and products generated by oxidizing the saccharides. The saccharide oxidation method of the present embodiment can be configured to include part or all of an enzyme reaction system that performs a multi-step oxidation reaction of D-glucose to CO ₂ illustrated in FIG. For example, 2-keto -D- gluconic acid degrading enzyme according to some degradation products D- glyceraldehyde and hydroxy pyruvic acid enzymatic reaction system for performing a multi-stage oxidation reaction series of decomposed to CO _2, i.e., 2-keto - You may comprise the enzyme reaction system of the downstream of the process of decomposing | disassembling 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by D-gluconic acid decomposing enzyme. As a result, 16 electrons can be extracted from one molecule of 2-keto-D-gluconic acid. In addition, 2-keto-D-gluconic acid is produced from D-glucose or the like, which is an enzyme reaction system on the upstream side of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme. It can be configured to include a reaction step, and further includes a reaction step of hydrolyzing polysaccharides such as disaccharides to D-glucose, a reaction step of converting other monosaccharides to D-glucose, and the like. You can also.

ここで、図１に示すD-グルコースからCO₂への多段階酸化反応は、8種類の酵素群により触媒される酵素反応系で構成され、D-グルコース一分子から24電子を取り出す酵素反応系である。 Here, the multi-step oxidation reaction from D-glucose to CO ₂ shown in FIG. 1 is composed of an enzyme reaction system catalyzed by eight kinds of enzymes, and an enzyme reaction system that extracts 24 electrons from one molecule of D-glucose. It is.

詳細には、図１の酵素反応系には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系である、
（Ａ）前記D-グリセルアルデヒドを、アルデヒド酸化酵素によりD-グリセリン酸に分解する工程、
（Ｂ）前記D-グリセリン酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりヒドロキシピルビン酸に分解する工程、
（Ｃ）前記ヒドロキシピルビン酸を、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素の組み合わせにより、グリコール酸に分解する工程、
（Ｄ）前記グリコール酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりグリオキシル酸に分解する工程、
（Ｅ）前記グリオキシル酸を、アルデヒド酸化酵素によりシュウ酸に分解する工程、
（Ｆ）前記シュウ酸を、シュウ酸脱炭酸酵素によりギ酸に分解する工程、
（Ｇ）前記ギ酸を、ギ酸酸化酵素によりCO₂に分解する工程、が含まれる。本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加えて、上記工程の任意の少なくとも１の工程を含むことができ、また、上記工程の全てを含むこともできる。 In detail, the enzyme reaction system shown in FIG. 1 is provided downstream of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconic acid-decomposing enzyme. The enzyme reaction system on the side,
(A) decomposing the D-glyceraldehyde to D-glyceric acid by an aldehyde oxidase;
(B) a step of decomposing the D-glyceric acid into hydroxypyruvate by D-2-hydroxyacid oxidase;
(C) decomposing the hydroxypyruvate to glycolic acid with hydroxypyruvate oxidase or a combination of hydroxypyruvate decarboxylase and aldehyde oxidase;
(D) decomposing the glycolic acid into glyoxylic acid with a D-2-hydroxyacid oxidase;
(E) decomposing the glyoxylic acid into oxalic acid by an aldehyde oxidase;
(F) decomposing the oxalic acid into formic acid by oxalate decarboxylase;
(G) decomposing the formic acid into CO ₂ by a formate oxidase. The saccharide oxidation method of the present embodiment comprises, in addition to the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme, And at least one of the above steps may be included, and all of the above steps may be included.

更に、図１の酵素反応系には、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側の酵素反応系である、
（Ｈ）D-グルコースを、グルコース-1-酸化酵素によりD-グルコン酸に分解する工程、及び、
（Ｉ）前記D-グルコン酸を、グルコン酸-2-酸化酵素により2-ケト-D-グルコン酸に分解する工程、が含まれる。本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加えて、上記工程の任意の少なくとも１の工程を含むことができ、また、上記工程の全てを含むこともできる。 Further, the enzyme reaction system shown in FIG. 1 has a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme, which is located upstream of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. An enzyme reaction system,
(H) decomposing D-glucose into D-gluconic acid by glucose-1-oxidase; and
(I) a step of decomposing the D-gluconic acid into 2-keto-D-gluconic acid by gluconic acid-2-oxidase. The saccharide oxidation method of the present embodiment comprises, in addition to the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme, And at least one of the above steps may be included, and all of the above steps may be included.

更に、本実施形態の糖類酸化方法は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側又は下流側の任意又は全部の工程のみ、若しくは、双方の任意又は全部の工程、を含むものであってもよい。 Further, the saccharide oxidation method of the present embodiment, the 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, 2-keto-D-gluconic acid upstream of the step of decomposing into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvate or Any or all steps on the downstream side, or both arbitrary or all steps, may be included.

図１に示す酵素反応系において、D-グルコースは、グルコース-1-酸化酵素の作用により、D-グルコノラクトンに分解され、かかるD-グルコノラクトンが非酵素的に加水分解されることでD-グルコン酸に分解される。グルコース-1-酸化酵素としては、D-グルコース + NAD(P)⁺ ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + NAD(P)Hの反応を触媒することが報告されているNAD(P)⁺依存性グルコース1-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）、D-グルコース + O₂ ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + H₂O₂（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているグルコースオキシダーゼ（EC 1.1.3.4）、及び、D-グルコース + ユビキノン ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + ユビキノール（Caイオン、Mgイオン、PQQを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.5.2）、D-グルコース + キノン ⇔ D-グルコノ-1,5-ラクトン + キノール（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているFAD依存性グルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.5.9）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。 In the enzyme reaction system shown in FIG. 1, D-glucose is decomposed into D-gluconolactone by the action of glucose-1-oxidase, and the D-gluconolactone is non-enzymatically hydrolyzed. Decomposed to D-gluconic acid. Glucose-1 The oxidase, D- glucose ⁺ NAD (P) + ⇔ D- glucono-1,5-lactone + NAD (P) H NAD reaction has been reported to catalyze the (P) ⁺ Dependent glucose 1-dehydrogenase (EC 1.1.1.47), catalyzes the reaction of D-glucose + O ₂ ⇔ D-glucono-1,5-lactone + H ₂ O ₂ (requires FAD as a cofactor) Catalyzes the reaction of glucose oxidase (EC 1.1.3.4) and D-glucose + ubiquinone ⇔ D-glucono-1,5-lactone + ubiquinol (requires Ca ion, Mg ion, PQQ as a cofactor) It has been reported that PQQ-dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.5.2) can catalyze the reaction of D-glucose + quinone ⇔ D-glucono-1,5-lactone + quinol (requiring FAD as a cofactor) Examples include reported FAD-dependent glycol dehydrogenase (EC 1.1.5.9) It can be, but not limited to.

D-グルコン酸は、D-グルコン酸-2-酸化酵素の作用により、2-ケト-D-グルコン酸に分解される。D-グルコン酸-2-酸化酵素としては、D-グルコン酸 + NADP⁺ ⇔ 2-デヒドロ-D-グルコン酸 + NADPHの反応を触媒することが報告されているNADP⁺依存性グルコン酸 2-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.215）、D-グルコース + O₂ ⇔ 2-デヒドロ-D-グルコン酸 + H₂O₂（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているFAD依存性ピラノースオキシダーゼ（EC 1.1.3.10）、D-グルコン酸 + 受容体 ⇔ 2-デヒドロ-D-グルコン酸 + 還元型受容体（FADを補因子として要求）の反応を触媒するFAD依存性グルコン酸 2-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.3）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。 D-gluconic acid is decomposed into 2-keto-D-gluconic acid by the action of D-gluconic acid-2-oxidase. As D-gluconate-2-oxidase, NADP ⁺ -dependent gluconate 2-dehydrogenase has been reported to catalyze the reaction of D-gluconate + NADP ⁺ ⇔2-dehydro-D-gluconate + NADPH (EC 1.1.1.215), a FAD-dependent pyranose that has been reported to catalyze the reaction of D-glucose + O ₂ ⇔ 2-dehydro-D-gluconic acid + H ₂ O ₂ (requiring FAD as a cofactor) Oxidase (EC 1.1.3.10), D-gluconate + receptor ⇔ 2-dehydro-D-gluconate + reduced receptor (requires FAD as a cofactor) FAD-dependent gluconate 2-dehydrogenase (EC 1.1.99.3) and the like, but are not limited thereto.

2-ケト-D-グルコン酸は、上記した2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の作用により、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解される。 2-keto-D-gluconic acid is decomposed into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by the action of the above-mentioned 2-keto-D-gluconate degrading enzyme.

D-グリセルアルデヒドは、アルデヒド酸化酵素の作用によりD-グリセリン酸に分解され、生成したD-グリセリン酸はD-2-ヒドロキシ酸酸化酵素の作用によりヒドロキシピルビン酸に分解される。アルデヒド酸化酵素としては、アルデヒド類 + NAD⁺ ⇔ カルボン酸類 + NADHの反応を触媒することが報告されているNAD⁺依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.3）、アルデヒド+ NADP⁺ ⇔ カルボン酸類 + NADPHの反応を触媒することが報告されているNADP⁺依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.4）、アルデヒド類 + H₂O + O₂⇔ カルボン酸類+ H₂O₂（FAD、鉄-硫黄、Moカチオンを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているアルデヒドオキシダーゼ（EC 1.2.3.1）、アルデヒド類 + キノン+ H₂O ⇔ カルボン酸類 + キノール（ヘム及びピロロキノリンキノンを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.5.2）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Sphingomonas wittichii由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用することができる。D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素としては、(R)-乳酸+ NAD⁺ ⇔ ピルビン酸 + NADHの反応を触媒することが報告されているD-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.28）、(R)-乳酸 + 2ヘリシトクロムc ⇔ ピルビン酸 + 2フェロシトクロムc + 2H⁺（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているD-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.3.1）、(R)-2-ヒドロキシ酸 + キノン ⇔ オキソ酸 + キノール（FADを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているD-2-ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.5.10）、(R)-乳酸 + 受容体 ⇔ ピルビン酸 + 還元型受容体（FAD及びZnイオンを補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているD-乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.6）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Escherichia coli由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼを利用することができる。 D-glyceraldehyde is decomposed into D-glyceric acid by the action of aldehyde oxidase, and the generated D-glyceric acid is decomposed into hydroxypyruvic acid by the action of D-2-hydroxyacid oxidase. Aldehyde oxidases are reported to catalyze the reaction of aldehydes + NAD ⁺ ⇔ carboxylic acids + NADH NAD ⁺ dependent aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3), aldehydes + NADP ⁺カルボン carboxylic acids + NADPH NADP ⁺ -dependent aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.4), which has been reported to catalyze the reaction, aldehydes + H ₂ O + O ₂カルボン carboxylic acids + H ₂ O ₂ (FAD, iron-sulfur, Mo cation Aldehyde oxidase (EC 1.2.3.1), aldehydes + quinones + H ₂ O アルデヒド carboxylic acids + quinols (requires heme and pyrroloquinoline quinones as cofactors) which have been reported to catalyze the reaction of Aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.5.2) reported to catalyze the above reaction can be exemplified, but it is not limited thereto. Preferably, an aldehyde dehydrogenase derived from Sphingomonas wittichii can be used. As D-2-hydroxy acid oxidase, D-lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.28), which has been reported to catalyze the reaction of (R) -lactic acid + NAD ⁺ ⇔ pyruvate + NADH, (R)- D-lactate dehydrogenase (EC 1.2.3.1), which has been reported to catalyze the reaction of lactate + 2 helicytochrome c ⇔ pyruvate + 2 ferrocytochrome c + 2H ⁺ (requiring FAD as a cofactor), (R) D-2-hydroxy acid dehydrogenase (EC 1.1.5.10), which has been reported to catalyze the reaction of 2-hydroxy acid + quinone -2- oxo acid + quinol (requiring FAD as a cofactor), (R) -lactic acid + Receptor ⇔ pyruvate + D-lactate dehydrogenase (EC 1.1.99.6) which has been reported to catalyze the reaction of a reduced receptor (requiring FAD and Zn ions as cofactors). However, the present invention is not limited to these. Preferably, D-lactate dehydrogenase derived from Escherichia coli can be used.

ヒドロキシピルビン酸は、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素との組み合わせの作用により、グリコール酸に分解される。ヒドロキシピルビン酸酸化酵素として、ピルビン酸 + リン酸+ O₂ ⇔ アセチルリン酸 + CO₂ + H₂O₂（FAD及びチアミン二リン酸を補因子として要求）を触媒することが報告されているピルビン酸オキシダーゼ（EC 1.2.3.3）、ピルビン酸 + ユビキノン + H₂O ⇔ 酢酸 + CO_２ + ユビキノール（FADを補因子として要求する）の反応を触媒することが報告されているピルビン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.5.1）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素としては、2-オキソ酸 ⇔ アルデヒド + CO₂（チアミン二リン酸を補因子として要求）の反応を触媒することが報告されているピルビン酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.1）、及び、ヒドロキシピルビン酸 → グリコールアルデヒド+ CO₂の反応を触媒することが報告されているヒドロキシピルビン酸デヒドロゲナーゼ（EC 4.1.1.40）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素を利用することができる。アルデヒド酸化酵素としては、上記したものを例示することができるが、それらに限定するものではない。 Hydroxypyruvate is degraded to glycolic acid by the action of hydroxypyruvate oxidase or a combination of hydroxypyruvate decarboxylase and aldehyde oxidase. Pyruvine has been reported to catalyze pyruvate + phosphate + O ₂アセチル acetyl phosphate + CO ₂ + H ₂ O ₂ (requires FAD and thiamine diphosphate as cofactors) as hydroxypyruvate oxidase Pyruvate dehydrogenase (EC 1.2), which has been reported to catalyze the reaction of acid oxidase (EC 1.2.3.3), pyruvate + ubiquinone + H ₂ O 酢酸 acetic acid + CO ₂ + ubiquinol (requires FAD as a cofactor) .5.1), etc., but is not limited thereto. Hydroxypyruvate decarboxylase includes pyruvate decarboxylase (EC 4.1.1.1), which has been reported to catalyze the reaction of 2-oxoacid aldehyde + CO ₂ (requiring thiamine diphosphate as a cofactor). ) And hydroxypyruvate dehydrogenase (EC 4.1.1.40), which has been reported to catalyze the reaction of hydroxypyruvate → glycolaldehyde + CO ₂ , but is not limited thereto. . Preferably, pyruvate decarboxylase derived from Zymomonas mobilis can be used. Examples of the aldehyde oxidase include those described above, but are not limited thereto.

グリコール酸は、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素の作用によりグリオキシル酸に分解される。D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素としては、上記したものを例示することができるが、それらに限定するものではない。 Glycolic acid is decomposed into glyoxylic acid by the action of D-2-hydroxy acid oxidase. Examples of the D-2-hydroxy acid oxidase include those described above, but are not limited thereto.

グリオキシル酸は、アルデヒド酸化酵素の作用によりシュウ酸に分解される。アルデヒド酸化酵素としては、上記したものを例示することができるが、それらに限定するものではない。 Glyoxylic acid is decomposed into oxalic acid by the action of aldehyde oxidase. Examples of the aldehyde oxidase include those described above, but are not limited thereto.

シュウ酸は、シュウ酸脱炭酸酵素の作用によりギ酸に分解される。シュウ酸脱炭酸酵素としては、シュウ酸 ⇔ ギ酸 + CO₂（Mnイオンを補因子として要求）を触媒することが報告されているシュウ酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.2）等を例示することができるが、これらに限定するものではない。好ましくは、Bacillus subtilis由来のシュウ酸脱炭酸酵素を利用することができる。 Oxalic acid is decomposed into formic acid by the action of oxalate decarboxylase. Examples of oxalate decarboxylase include oxalate decarboxylase (EC 4.1.1.2), which has been reported to catalyze oxalate ギ formate + CO ₂ (requires Mn ion as a cofactor). Yes, but not limited to these. Preferably, oxalate decarboxylase derived from Bacillus subtilis can be used.

ギ酸は、ギ酸酸化酵素の作用によりCO₂に分解される。ギ酸酸化酵素としては、ギ酸 + NAD⁺ ⇔ CO₂ + NADH（フラビン、鉄-硫黄、Mo カチオン）の反応を触媒することが報告されているギ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.17.1.9）、及び、ギ酸オキシダーゼ等を例示することができるが、これらに限定するものではない。 Formic acid is decomposed into CO ₂ by the action of formate oxidase. Formate oxidases include formate dehydrogenase (EC 1.17.1.9), which has been reported to catalyze the reaction of formate + NAD ⁺ ⇔CO ₂ + NADH (flavin, iron-sulfur, Mo cation), and formate oxidase However, the present invention is not limited to these.

これらの酵素は、市販品を利用してもよいし、上記した遺伝子組み換え技術を利用して人工的に合成したものを用いても良い。上記した酵素群や同等の機能を有する酵素群のアミノ酸配列及びそれをコードする核酸分子の塩基配列情報は公知であり、GenBank、EMBI、DDBJ等の遺伝子配列データベースから取得することができる。 As these enzymes, commercially available products may be used, or those synthesized artificially using the above-described gene recombination technology may be used. The amino acid sequences of the above-mentioned enzymes and enzymes having the same function and the base sequence information of the nucleic acid molecule encoding the same are known and can be obtained from gene sequence databases such as GenBank, EMBI, and DDBJ.

本実施形態の糖類酸化方法によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって糖類を酸化する方法を提供することができる。本実施形態の糖類酸化方法によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応系の構築が可能となる。これにより、D-グルコース１分子から24電子を取り出す酵素反応系を構築することが可能となる。本実施形態の糖類酸化酵素において、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を用いることで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。 According to the saccharide oxidation method of the present embodiment, the saccharide is oxidized by a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. A method can be provided. According to the saccharide oxidation method of the present embodiment, an enzyme capable of oxidatively decomposing 2-keto-D-gluconic acid can be provided for the first time, and a multi-step oxidation reaction system for saccharides can be constructed. This makes it possible to construct an enzyme reaction system that extracts 24 electrons from one D-glucose molecule. In the saccharide oxidase of the present embodiment, by using 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, it is possible to efficiently generate electric energy from a saccharide such as D-glucose by a minimum group of enzymes. Thus, it is possible to provide a highly practical technology such as application to a biosensor or a biobattery.

本実施形態の糖類酸化方法によれば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程に加え、D-グルコース等の糖類のCO₂への多段階酸化反応において、当該工程の上流側及び下流側の酵素反応系を構成する酵素群を特定することにより、糖類の多段階酸化反応を安定的かつ円滑に進行できるようになり、より効率的に電気エネルギーを生成することができる。 According to the saccharide oxidation method of the present embodiment, in addition to the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, In the multi-stage oxidation reaction of saccharides such as glucose to CO ₂ , by identifying the enzyme group that constitutes the enzyme reaction system on the upstream and downstream sides of the process, the multi-stage oxidation reaction of saccharides can be performed stably and smoothly. It is possible to proceed, and electric energy can be generated more efficiently.

（糖類酸化酵素剤）
本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する反応を触媒する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含んで構成することができる。 (Saccharide oxidase agent)
The saccharide oxidizing agent of the present embodiment comprises a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme that catalyzes a reaction for decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. can do.

本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、糖類及び糖類の酸化による生成物を分解する活性を有する酵素を含めることができる。本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、図１に例示するD-グルコースからCO₂への多段階酸化反応系を構成する酵素の一部又は全部をも含んで構成することができる。例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による分解産物であるD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸をCO₂まで分解する一連の多段階酸化反応を行う酵素反応系、つまり、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系を構成する酵素の一部又は全部を含んでいてもよい。また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸を分解する工程の上流側の酵素反応系であるD-グルコース等から2-ケト-D-グルコン酸を生成する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を含んでいても良い。更には、二糖類等の多糖類からD-グルコースに加水分解する酵素反応系や、他の単糖類からD-グルコースに変換する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を含んでいてもよい。このとき、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側又は下流側の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素のみ、若しくは、双方の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素、を含むものであってもよい。 The saccharide oxidase agent of the present embodiment can include, in addition to 2-keto-D-gluconolytic enzyme, an enzyme having an activity of decomposing saccharides and products resulting from oxidation of saccharides. The saccharide oxidizing agent of the present embodiment may be a part of an enzyme constituting a multi-step oxidation reaction system from D-glucose to CO ₂ illustrated in FIG. 1 in addition to 2-keto-D-gluconate degrading enzyme. It can be configured to include all of them. For example, 2-keto -D- gluconic acid degrading enzyme according to some degradation products D- glyceraldehyde and hydroxy pyruvic acid enzymatic reaction system for performing a multi-stage oxidation reaction series of decomposed to CO _2, i.e., 2-keto - Including a part or all of an enzyme constituting an enzyme reaction system on the downstream side of a step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid by D-gluconate-degrading enzyme. May be. In addition, 2-keto-D-gluconic acid is produced from D-glucose or the like, which is an enzyme reaction system on the upstream side of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme. It may contain all or a part of the enzymes constituting the enzyme reaction system. Furthermore, it may include all or a part of an enzyme constituting an enzyme reaction system that hydrolyzes a polysaccharide such as a disaccharide into D-glucose or an enzyme reaction system that converts another monosaccharide into D-glucose. Good. At this time, the enzyme reaction system upstream or downstream of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid is constituted by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme. It may contain only or all of the enzymes, or any or all of the enzymes constituting both enzyme reaction systems.

例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加え、D-グルコース-1-酸化酵素、D-グルコン酸-2-酸化酵素、アルデヒド酸化酵素、D-２-ヒドロキシ酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素、シュウ酸脱水炭酸酵素、ギ酸酸化酵素の一部又は全部を含めることができる。 For example, in addition to 2-keto-D-gluconate degrading enzyme, D-glucose-1-oxidase, D-gluconate-2-oxidase, aldehyde oxidase, D-2-hydroxyacid oxidase, hydroxypyruvate Some or all of oxidase, hydroxypyruvate decarboxylase, oxalate decarboxylase, and formate oxidase can be included.

本実施形態の糖類酸化酵素剤は、液体形態の液剤、固形形態の錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の任意の剤形に形成することができる。更に、例えば、賦形剤、緩衝化剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤等の添加剤を有効成分である酵素の活性を損なわない限りにおいて含ませることができる。固形形態に製剤化する際には、例えば、酵素溶液に適当な賦形剤等の添加剤を配合し、噴霧乾燥処理又は凍結乾燥処理を施すことで固形形態の剤形に製剤化することができる。 The saccharide oxidase preparation of the present embodiment can be formed into any dosage form such as a liquid preparation in liquid form, a tablet in solid form, a powder preparation, a granule preparation, a capsule preparation and the like. Further, for example, additives such as excipients, buffering agents, surfactants, preservatives, and stabilizers can be included as long as the activity of the enzyme as the active ingredient is not impaired. When formulating into a solid form, for example, it is possible to formulate a solid form by adding an additive such as an excipient to the enzyme solution and performing spray drying or freeze drying. it can.

賦形剤としては、水や精製水、生理食塩水等の適当な水性媒体、結晶セルロース、トレハロース、デキストリン、微粒酸化ケイ素、ステアリン酸カルシウム等の適当な固形媒体を利用できる。緩衝化剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等を利用できる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチルやパラオキシ安息香酸エチルなどのパラオキシ安息香酸類、ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等が利用できる。安定化剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ポリソルベート80、ポビドン、デキストラン40等が利用できる。界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、ラウリル硫酸ナトリウム等が利用できる。しかしながら、これらに限定するものではなく、有効成分である酵素の活性を損なわない限り、公知の添加物を必要に応じて含ませることができる。 As the excipient, a suitable aqueous medium such as water, purified water, or physiological saline, or a suitable solid medium such as crystalline cellulose, trehalose, dextrin, finely divided silicon oxide, or calcium stearate can be used. As the buffering agent, sodium citrate, sodium acetate, sodium hydrogen carbonate, boric acid, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate and the like can be used. As the preservative, for example, paraoxybenzoic acids such as methyl paraoxybenzoate and ethyl paraoxybenzoate, benzyl alcohol, chlorobutanol, benzethonium chloride, benzalkonium chloride and the like can be used. As the stabilizer, for example, sodium citrate, sodium thiosulfate, sodium pyrosulfite, polysorbate 80, povidone, dextran 40 and the like can be used. As the surfactant, benzalkonium chloride, polyoxyethylene sorbitan monostearate, sorbitan sesquioleate, sodium lauryl sulfate and the like can be used. However, the present invention is not limited to these, and known additives can be included as needed as long as the activity of the enzyme as an active ingredient is not impaired.

また、本実施形態の糖類酸化酵素剤は、用時調製用として、例えば、有効成分である酵素を錠剤や粉末等の固体形態や濃縮形態として、用時調製時の溶解や希釈用の水や精製水、生理食塩水等の適当な水性溶媒と組み合わせることができる。 In addition, the saccharide oxidizing enzyme agent of the present embodiment is used for preparation at the time of use, for example, an enzyme as an active ingredient in a solid form or a concentrated form such as a tablet or powder, and water or water for dissolution or dilution at the time of use preparation. It can be combined with a suitable aqueous solvent such as purified water or physiological saline.

本実施形態の糖類酸化酵素剤のpHは、緩衝化剤等を用いて、例えば、酵素の機能上及び製剤学的に許容される範囲内であれば特に限定されないが、好ましくは4.0〜9.5、特に好ましくは、4.8〜8.5となる範囲に調整される。 The pH of the saccharide oxidase agent of the present embodiment is not particularly limited as long as it is within a range that is functionally and pharmaceutically acceptable for the enzyme using a buffering agent or the like, but is preferably 4.0 to 9.5. It is particularly preferably adjusted to a range of 4.8 to 8.5.

本実施形態の糖類酸化酵素剤において、補因子を要求する酵素は、補因子を含むホロ酵素の状態で酵素剤に含めることが好ましい。しかしながら、アポ酵素の形態で含め、補因子を同一製剤内に独立して、又は、別個の製剤として含めるように構成してもよい。また、その他の、酵素の触媒活性の発現のために必要な物質、例えば、Mgイオン等の金属イオン等に関しても同一製剤内に独立して、又は、別個の製剤として含めるように構成してもよい。 In the saccharide oxidizing enzyme preparation of the present embodiment, the enzyme requiring a cofactor is preferably included in the enzyme preparation in the form of a holoenzyme containing a cofactor. However, they may be included in the form of an apoenzyme, with the cofactors included independently in the same formulation or as separate formulations. In addition, other substances necessary for the expression of the catalytic activity of the enzyme, for example, metal ions such as Mg ions, etc. may also be included in the same preparation independently or as a separate preparation. Good.

本実施形態の糖類酸化酵素剤によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む糖類酸化酵素剤を提供することができる。本実施形態の糖類酸化酵素剤によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素剤を提供することが可能となる。本実施形態の糖類酸化酵素剤は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含むことから、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。 According to the saccharide oxidizing agent of the present embodiment, a saccharide oxidizing agent containing 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. An enzymatic agent can be provided. According to the saccharide oxidizing agent of the present embodiment, an enzyme capable of oxidatively decomposing 2-keto-D-gluconic acid can be provided for the first time, and a saccharide for constructing an enzyme reaction system for performing a multi-step oxidation reaction of saccharides An oxidase agent can be provided. Since the saccharide oxidizing agent of the present embodiment contains 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, it is possible to efficiently generate electric energy from saccharides such as D-glucose by the minimum group of enzymes. Thus, it is possible to provide a highly practical technique such as application to a biosensor or a biobattery.

（糖類酸化酵素電極）
本実施形態の糖類酸化酵素電極は、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として電極材上に固定している。 (Saccharide oxidase electrode)
The saccharide oxidase electrode of the present embodiment is a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. It is fixed on the material.

本実施形態の糖類酸化酵素電極は、電極触媒に固定された2-ケト-D-グルコン酸分解酵素が2-ケト-D-グルコン酸に作用し、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する。 In the saccharide oxidase electrode of the present embodiment, 2-keto-D-gluconate degrading enzyme immobilized on the electrocatalyst acts on 2-keto-D-gluconic acid to form D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. Decompose.

本実施形態の糖類酸化酵素電極は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、糖類及び糖類の酸化による生成物を分解する活性を有する酵素を電極触媒として含めることができる。本実施形態の糖類酸化酵素電極は、例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素に加えて、図１に例示するD-グルコースからCO₂への多段階酸化反応系を構成する酵素の一部又は全部をも電極触媒として含んで構成することができる。これにより、電極上でD-グルコース等からの多段階酸化反応が進行し、各段階の触媒反応によって発生する電子を電極に取り出すことができる。例えば、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による分解産物であるD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸をCO₂まで分解する一連の多段階酸化反応を行う酵素反応系、つまり、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の下流側の酵素反応系を構成する酵素の一部又は全部を電極触媒として含んでいてもよい。また、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素による2-ケト-D-グルコン酸を分解する工程の上流側の酵素反応系であるD-グルコース等から2-ケト-D-グルコン酸を生成する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を電極触媒として含んでいても良い。更には、二糖類等の多糖類からD-グルコースに加水分解する酵素反応系や、他の単糖類からD-グルコースに変換する酵素反応系を構成する酵素の全部又は一部を電極触媒として含んでいてもよい。このとき、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する工程の上流側又は下流側の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素のみ、若しくは、双方の酵素反応系を構成する任意又は全部の酵素、を電極触媒として含むものであってもよい。 The saccharide oxidase electrode of the present embodiment can include, as an electrocatalyst, an enzyme having an activity of decomposing saccharides and products obtained by oxidizing saccharides, in addition to 2-keto-D-gluconate degrading enzyme. The saccharide oxidase electrode of the present embodiment is, for example, one of the enzymes constituting the multi-step oxidation reaction system from D-glucose to CO ₂ illustrated in FIG. 1 in addition to 2-keto-D-gluconate degrading enzyme. Part or all can be configured to include the electrode catalyst. Thus, a multi-step oxidation reaction from D-glucose or the like proceeds on the electrode, and electrons generated by the catalytic reaction in each step can be extracted to the electrode. For example, 2-keto -D- gluconic acid degrading enzyme according to some degradation products D- glyceraldehyde and hydroxy pyruvic acid enzymatic reaction system for performing a multi-stage oxidation reaction series of decomposed to CO _2, i.e., 2-keto - With D-gluconate-degrading enzyme, part or all of the enzyme constituting the enzyme reaction system on the downstream side of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid is electrocatalyzed. May be included. In addition, 2-keto-D-gluconic acid is produced from D-glucose or the like, which is an enzyme reaction system on the upstream side of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme. All or a part of the enzyme constituting the enzyme reaction system may be included as an electrode catalyst. Furthermore, all or a part of an enzyme constituting an enzyme reaction system that hydrolyzes a polysaccharide such as a disaccharide into D-glucose or an enzyme reaction system that converts another monosaccharide into D-glucose is included as an electrode catalyst. You may go out. At this time, the enzyme reaction system upstream or downstream of the step of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid is constituted by 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme. Any or all of the enzymes, or any or all of the enzymes constituting both enzyme reaction systems, may be included as the electrode catalyst.

詳細には、D-グルコース-1-酸化酵素、D-グルコン酸-2-酸化酵素、アルデヒド酸化酵素、D-２-ヒドロキシ酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素、シュウ酸脱水炭酸酵素、ギ酸酸化酵素の一部又は全部を電極触媒として含めることができる。 Specifically, D-glucose-1-oxidase, D-gluconate-2-oxidase, aldehyde oxidase, D-2-hydroxyacid oxidase, hydroxypyruvate oxidase, hydroxypyruvate decarboxylase, shu Part or all of acid dehydration carbonic enzyme and formate oxidase can be included as an electrode catalyst.

電極材としては、外部回路に接続可能で電子を伝達できる導電性の基材であれば特に制限はない。例えば、カーボンクロス、カーボンフェルト、カーボンペーパー、グラファイト、グラッシーカーボン等のカーボン電極材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等、従来公知の材質の導電性の物質を使用することができる。特には、広い電位窓を有し安定した電極性能を発揮し得るカーボン電極材が好ましい。また、カーボン電極材は多孔性材料でもあることから電極表面積も広く、これを有効に利用することにより高効率の酵素電極を構築できる。そして、これらの基材を単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。更に大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。 The electrode material is not particularly limited as long as it is a conductive base material that can be connected to an external circuit and can transmit electrons. For example, carbon electrode materials such as carbon cloth, carbon felt, carbon paper, graphite, and glassy carbon, metals or alloys such as aluminum, copper, gold, platinum, silver, nickel, and palladium, and conductive materials such as SnO2, In2O3, WO3, and TiO2 A conventionally known conductive material such as a conductive oxide can be used. In particular, a carbon electrode material having a wide potential window and capable of exhibiting stable electrode performance is preferable. In addition, since the carbon electrode material is also a porous material, the electrode surface area is large, and a highly efficient enzyme electrode can be constructed by effectively utilizing the electrode surface area. And these base materials may be constituted by a single layer or a laminated structure of two or more kinds. Further, the size, shape, and the like are not particularly limited, and can be appropriately adjusted depending on the purpose of use.

また、これを単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。また、導電性向上のため、市販のケッチェンブラック等のカーボンブラック、活性炭粉末等の導電性カーボン微粒子を基材に塗布してもよい。その際に、PVDF等のバインダーを使用してもよい。電極材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。 Further, it may be constituted by a single layer or a laminated structure of two or more kinds. Further, in order to improve conductivity, conductive carbon fine particles such as carbon black such as commercially available Ketjen black or activated carbon powder may be applied to the substrate. At that time, a binder such as PVDF may be used. The size, shape, and the like of the electrode material are not particularly limited, and can be appropriately adjusted depending on the purpose of use. It can be configured as a microelectrode whose electrode area is reduced to the order of micrometers.

電極材上への酵素の固定は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ架橋試薬で架橋固定する架橋法をも利用できる。更には、アルギン酸、カラギーナン等の多糖類、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、光架橋性ポリマー等の網目構造をもつポリマー、透析膜等の半透性膜内に封入して固定する包括法等をも利用することができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。また、電極材上に形成した親水性ポリマー樹脂層に、酵素溶液、任意には電子メディエーターや補酵素等の電極触媒として機能を発現するために必要な物質を染み込ませる等の手段により固定するように構成してもよい。電極材上への2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の固定化量は、糖類酸化酵素電極の使用目的等に応じて適宜変更することができる。 The enzyme can be immobilized on the electrode material by a known method. For example, a carrier binding method in which immobilization is performed via physical adsorption, ionic bonding, or covalent bonding can be used. Further, a cross-linking method of cross-linking and fixing with a cross-linking reagent having a divalent functional group such as glutaraldehyde can also be used. Furthermore, a comprehensive method of encapsulating and fixing in polysaccharides such as alginic acid and carrageenan, conductive polymers, redox polymers, polymers having a network structure such as photocrosslinkable polymers, semipermeable membranes such as dialysis membranes, etc. Can also be used. Further, these may be used in combination. Further, the hydrophilic polymer resin layer formed on the electrode material may be immobilized by means such as impregnating an enzyme solution, optionally a substance necessary for developing a function as an electrode catalyst such as an electron mediator or a coenzyme, or the like. May be configured. The amount of 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme immobilized on the electrode material can be appropriately changed according to the intended use of the saccharide oxidase electrode.

そして、2種類以上の酵素群の固定に際して、好ましくは、固定を行う酵素群を予め混合して固定してもよく、また、何れかの酵素を先に固定した後、順次他の酵素を固定してもよい。好ましくは、酵素は、局在することなく電極材に均一に分散して固定することが好ましい。酵素の固定比率は、均等であっても、任意の比率であってよい。例えば、グルコースの多段階反応において律速段階となる反応を触媒する酵素の固定比率を大きくすることが好ましく、また、後段の反応を触媒する酵素の固定比率を大きくしてもよい。 In immobilizing two or more enzyme groups, preferably, the enzyme group to be immobilized may be mixed in advance and immobilized, or after immobilizing any one of the enzymes first, then immobilizing another enzyme sequentially. May be. Preferably, the enzyme is uniformly dispersed and fixed to the electrode material without being localized. The fixed ratio of the enzymes may be equal or any ratio. For example, it is preferable to increase the fixed ratio of the enzyme that catalyzes the reaction that becomes the rate-determining step in the multistage reaction of glucose, and it is also possible to increase the fixed ratio of the enzyme that catalyzes the subsequent reaction.

補因子を要求する酵素の固定に際しては、補因子を含むホロ酵素の状態で固定することが好ましい。しかしながら、アポ酵素の形態で固定し、補因子を別の層として、又は、使用に際して適当な緩衝液に補因子を溶解させた形態で供給してよい。また、その他の、酵素の触媒活性の発現のために必要な物質、例えばMgイオンの金属イオン等を、別の層として、又は、使用に際して適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。 When fixing an enzyme requiring a cofactor, it is preferable to fix the enzyme in the state of a holoenzyme containing a cofactor. However, the cofactor may be immobilized in the form of an apoenzyme and the cofactor may be supplied as a separate layer or, in use, dissolved in a suitable buffer. Further, other substances necessary for the expression of the catalytic activity of the enzyme, for example, metal ions of Mg ions, etc., may be supplied as a separate layer or in a form dissolved in an appropriate buffer solution at the time of use. .

また、必要に応じて、酵素反応と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエーターを電極材に固定することができる。電子メディエーターの固定は、酵素と混合して固定してもよいし、酵素の固定の前、若しくは後に固定してもよい。 If necessary, an electron mediator that mediates the enzymatic reaction and electron transfer between the electrodes can be fixed to the electrode material. The fixation of the electron mediator may be performed by mixing with an enzyme, or may be performed before or after the enzyme is fixed.

電子メディエーターは、酵素等の生体触媒の反応に応じて酸化又は還元される低分子の酸化還元物質であり、生体触媒と電極材間の電子移動を媒介する。したがって、電子メディエーターは、酵素等の生体触媒と電子を授受することができる共に、電極材とも電子を授受することができる物質である限り何れも使用することができる。そして、電子メディエーターは、一重結合と二重結合が交互に並んだπ共役系化合物であることが好ましい。例えば、電子メディエーターは、特に限定されるものではないが、例えば、5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンメトスルファート：PMS）、5-エチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンエトスルファート：PES）等、のフェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェリシアン化カリウム等のフェリシアン化物、フェロセンやジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン系化合物、ナフトキノン、アントラキノン、ハイロドキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物、シトクロム系化合物、ベンジルビオロゲンやメチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物、ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール系化合物等が挙げられる。フェナジン系化合物の1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（以下、「mPMS」と称する場合がある）が特に好ましく例示できる。 An electron mediator is a low-molecular redox substance that is oxidized or reduced in response to a reaction of a biocatalyst such as an enzyme, and mediates electron transfer between the biocatalyst and an electrode material. Accordingly, any electron mediator can be used as long as it can exchange electrons with a biocatalyst such as an enzyme and can exchange electrons with the electrode material. The electron mediator is preferably a π-conjugated compound in which single bonds and double bonds are alternately arranged. For example, the electron mediator is not particularly limited. For example, 5-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate: PMS), 5-ethylphenazinium methyl sulfate (phenazine ethosulfate: PES), etc., phenazine compounds, phenothiazine compounds, ferricyanides such as potassium ferricyanide, ferrocene and dimethyl ferrocene, ferrocene compounds such as ferrocene carboxylic acid, naphthoquinone, anthraquinone, hydrodoquinone, quinone compounds such as pyrroloquinoline quinone, Examples thereof include cytochrome compounds, viologen compounds such as benzyl viologen and methyl viologen, and indophenol compounds such as dichlorophenolindophenol. Phenazine-based compound 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (hereinafter sometimes referred to as “mPMS”) is particularly preferably exemplified.

本実施形態の糖類酸化酵素電極は、D-グルコース等の糖類を燃料とするバイオ電池のアノード側電極として、また、D-グルコース等の糖類を測定するためのバイオセンサーの作用極として利用することができる。 The saccharide oxidase electrode of the present embodiment is used as an anode electrode of a biocell using a saccharide such as D-glucose as a fuel, and also as a working electrode of a biosensor for measuring saccharides such as D-glucose. Can be.

本実施形態の糖類酸化酵素電極をバイオセンサーの作用極として利用する場合には、本実施形態の糖類酸化酵素電極を作用電極とし、及びその対向電極（対極）を設けて構成することができる。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。例えば、対極として白金電極、参照電極としてAg/AgCl電極を用いて構成することができる。 When the saccharide oxidase electrode of the present embodiment is used as a working electrode of a biosensor, the saccharide oxidase electrode of the present embodiment can be used as a working electrode and provided with a counter electrode (counter electrode). If necessary, a three-electrode system may be provided by providing a reference electrode. For example, it can be configured using a platinum electrode as a counter electrode and an Ag / AgCl electrode as a reference electrode.

本実施形態の糖類酸化酵素電極をバイオ電池のアノード側電極として利用する場合に、バイオ電池は、酸化反応を行うアノード側電極と還元反応を行うカソード側電極を含み、アノード側電極とカソード側電極が隔膜を挟んで対向するように配置され、アノード側電極とカソード側電極は外部回路によって接続される。燃料をアノード側電極側に供給することにより、本実施形態の糖類酸化酵素電極により燃料を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。そして、この電子は、直接、又は酵素反応と電極間の電子伝達を仲介するための電子メディエーターを通してアノード側電極に受け渡たされる。そして、アノード側電極から外部回路を通ってカソード側電極に電子が受け渡されることによって電流が発生する。一方、アノード側電極側で発生したプロトンが隔膜を通って、カソード側電極側に移動し、外部回路を通してアノード側から移動してきた電子と反応し水を生成するように構成される。カソード側電極側は、酸素や過酸化水素等の酸化剤を還元して電子を伝達することのできる触媒を固定して構成されることが好ましく、アノード側電極側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。また、カソード側電極としては、例えば、ピルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ等のマルチ銅酵素等の酵素が固定された電極を使用することもできる。 When the saccharide oxidase electrode of the present embodiment is used as an anode electrode of a bio battery, the bio battery includes an anode electrode performing an oxidation reaction and a cathode electrode performing a reduction reaction, and the anode electrode and the cathode electrode Are disposed so as to face each other with the diaphragm interposed therebetween, and the anode electrode and the cathode electrode are connected by an external circuit. By supplying the fuel to the anode electrode side, electrons generated by oxidizing the fuel by the saccharide oxidase electrode of the present embodiment are taken out to the electrode and protons are generated. Then, the electrons are transferred to the anode electrode directly or through an electron mediator for mediating electron transfer between the electrode and the enzymatic reaction. Then, current is generated when electrons are transferred from the anode electrode to the cathode electrode through an external circuit. On the other hand, protons generated on the anode side move through the diaphragm to the cathode side, and react with electrons moving from the anode through an external circuit to generate water. The cathode side is preferably configured by fixing a catalyst capable of transmitting electrons by reducing an oxidizing agent such as oxygen or hydrogen peroxide, and protons generated at the anode side react with oxygen. To produce water. Further, as the cathode-side electrode, for example, an electrode on which an enzyme such as a multi-copper enzyme such as pyruvate oxidase or laccase is immobilized can be used.

隔膜は、プロトン等を透過できるイオン伝導性を有すると共に、プロトン等のイオン以外の負極側の構成成分及び正極側の構成成分を透過させないという性質を有する限り、その素材及び形状等に制限はない。例えば、セルロース膜等を利用することができ、また、固体電解質膜を利用することができる。固体電解質膜としては、スルホン基、リン酸基、ホスホン基、及びホスフィン基等の強酸基、カルボキシル基等の弱酸基、及び極性基を有する有機高分子等のイオン交換機能を有する固体膜等が例示されるが、これらに限定するものではない。具体的にはセルロース膜、及びテトラフルオロエチレンとパーフルオロ〔２−（フルオロスルフォニルエトキシ）プロピルビニルエーテル〕：tetrafluoroethyleneとperfluoro[2-(fluorosulfonylethoxy)propylvinyl ether]の共重合体であるナフィオン（登録商標）等のパーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜を利用することができる。 The diaphragm is not limited in its material and shape, as long as it has ion conductivity capable of transmitting protons and the like, and has a property of not allowing the components on the negative electrode side and the components on the positive electrode side other than ions such as protons to pass therethrough. . For example, a cellulose membrane or the like can be used, and a solid electrolyte membrane can be used. Examples of the solid electrolyte membrane include a solid membrane having an ion exchange function such as an organic polymer having a strong acid group such as a sulfone group, a phosphate group, a phosphone group, and a phosphine group, a weak acid group such as a carboxyl group, and a polar group. It is exemplified, but not limited to these. Specifically, cellulose membrane, and Nafion (registered trademark) which is a copolymer of tetrafluoroethylene and perfluoro [2- (fluorosulfonylethoxy) propylvinyl ether]: tetrafluoroethylene and perfluoro [2- (fluorosulfonylethoxy) propylvinyl ether] Perfluorocarbon sulfonic acid (PFS) -based resin film can be used.

燃料は、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の基質である2-ケト-D-グルコン酸の他、酵素等による分解反応により2-ケト-D-グルコン酸に分解されるD-グルコース等の糖類等も燃料として好適に利用することができる。燃料は、好ましくは、適当な溶媒に溶解させた燃料溶液として供給されるが、ゲル等の形態で供給してもよい。溶媒は、水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝液成分としては、例えば、リン酸カリウム等のリン酸塩、イミダゾール、炭酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）−ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパンスルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせて使用することができる。燃料溶液中の糖類の量については、燃料の形態、電極系の種類や容量、発電方式等に応じて適宜変更することができる。 Fuel is 2-keto-D-gluconic acid, which is a substrate of 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme, and D-glucose, which is decomposed into 2-keto-D-gluconic acid by a decomposition reaction by an enzyme or the like. And the like can also be suitably used as fuel. The fuel is preferably supplied as a fuel solution dissolved in a suitable solvent, but may be supplied in the form of a gel or the like. The solvent is an aqueous medium, and may be a suitable buffer other than distilled water. Examples of the buffer component contained in the buffer include phosphate such as potassium phosphate, imidazole, carbonate, borate, tartrate, citrate, tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), 4 -(2-hydroxyethyl) -piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) and the like can be exemplified. These may be used alone or in combination of two or more. The amount of the saccharide in the fuel solution can be appropriately changed according to the form of the fuel, the type and capacity of the electrode system, the power generation method, and the like.

燃料溶液は、バイオ電池内部にアノード側として配置された本実施形態の糖類酸化酵素電極に供給される。燃料溶液の供給は、燃料溶液を本実施形態の糖類酸化酵素電極に供給できる限り、その形態に制限はない。 The fuel solution is supplied to the saccharide oxidase electrode of the present embodiment, which is disposed inside the biocell as the anode side. The supply of the fuel solution is not limited as long as the fuel solution can be supplied to the saccharide oxidase electrode of the present embodiment.

本実施形態の糖類酸化酵素電極に固定した酵素群が補因子を要求し、当該酵素が補因子を含まないアポ酵素の形態で固定した場合には、補因子を燃料溶液に含めて供給する他、補因子を別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。また、その他の、本実施形態の糖類酸化酵素電極に固定した酵素群の触媒活性の発現のために必要な物質、例えば、Mgイオン等の金属イオン等を、別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。更に、必要に応じて、電子メディエーターを等の酵素の触媒反応と電極反応と共役させるために必要な物質を供給することができる。電子メディエーターの供給形態も特に制限はなく、本実施形態の糖類酸化酵素電極に固定した酵素群がその触媒機能の発現し得るように適宜供給される。 When the group of enzymes immobilized on the saccharide oxidase electrode of the present embodiment requires a cofactor and the enzyme is immobilized in the form of an apoenzyme containing no cofactor, the cofactor is included in the fuel solution and supplied. The cofactor may be supplied as a separate layer or dissolved in a suitable buffer. Further, other substances necessary for the expression of the catalytic activity of the enzyme group immobilized on the saccharide oxidase electrode of the present embodiment, for example, metal ions such as Mg ions, as another layer, or an appropriate layer It may be supplied in a form dissolved in a buffer solution. Furthermore, if necessary, a substance necessary for coupling the electron mediator to the catalytic reaction of an enzyme such as an enzyme and the electrode reaction can be supplied. The supply form of the electron mediator is also not particularly limited, and is appropriately supplied so that the enzyme group fixed to the saccharide oxidase electrode of the present embodiment can exhibit its catalytic function.

本実施形態の糖類酸化酵素電極によれば、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極材上に固定した糖類酸化酵素電極を提供することができる。本実施形態の糖類酸化酵素電極によれば、2-ケト-D-グルコン酸を酸化分解できる酵素を初めて提供することができ、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築のための糖類酸化酵素電極を提供することが可能となる。本実施形態の糖類酸化酵素電極は2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として含むことで、D-グルコース等の糖類から、最低限度の酵素群により効率的に電気エネルギーを生成することが可能になり、バイオセンサーやバイオ電池への応用等の実用性の高い技術を提供することができる。 According to the saccharide oxidase electrode of the present embodiment, 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid is provided on the electrode material. Can be provided. According to the saccharide oxidase electrode of the present embodiment, an enzyme capable of oxidatively decomposing 2-keto-D-gluconic acid can be provided for the first time, and a saccharide for constructing an enzyme reaction system for performing a multi-step oxidation reaction of saccharides An oxidase electrode can be provided. The saccharide oxidase electrode of the present embodiment includes 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme as an electrocatalyst to efficiently generate electric energy from saccharides such as D-glucose by a minimum group of enzymes. This makes it possible to provide a highly practical technique such as application to a biosensor or a biobattery.

以下、実施例により、本願発明を更に詳細に説明する。しかしながら、本願発明は以下の実施例に限定されるものではなく、様々な実施形態が可能であることは明確に理解されるべきである。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, it should be clearly understood that the present invention is not limited to the following examples, and various embodiments are possible.

実施例１．2-ケト-D-グルコン酸分解酵素の取得
本実施例では、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を取得するための検討を行った。上記〔先行技術〕の項で説明した非特許文献３に、様々な酵素がD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルピン酸とを結合する活性を有すると報告している。しかしながら、先行技術においては、2-ケト-D-グルコン酸を、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルピン酸に分解する酵素の報告例はないことから、かかる反応を触媒できる2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を取得するための検討を行った。 Example 1 Acquisition of 2-Keto-D-Gluconate Degrading Enzyme In this example, a study was conducted to acquire 2-keto-D-gluconate degrading enzyme. Non-Patent Document 3 described in the section of [Prior Art] reports that various enzymes have an activity of binding D-glyceraldehyde to hydroxypyrupic acid. However, in the prior art, there is no report of an enzyme that decomposes 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid. A study was conducted to obtain a gluconate-degrading enzyme.

2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を取得するための検討するため、下記の表１及び表２に示すNo.1〜No.7の酵素を候補酵素として選択した。なお、配列には、下線で示した遺伝子挿入サイトとHis tagコード配列が含まれている。 To study for obtaining 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme, enzymes No. 1 to No. 7 shown in Tables 1 and 2 below were selected as candidate enzymes. The sequence includes the gene insertion site and the His tag coding sequence indicated by underlining.

各候補酵素をコードする核酸分子にHis tagコード配列を目的とする組換えタンパク質のN末端にHis tagが融合するように融合させ（Genscript社）、発現ベクターpET22b(+)（Novagen社）に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングした。なお、No.5の酵素は、His tagコード配列を目的とする組換えタンパク質のC末端にHis tagが融合するように融合させたと共に、遺伝子挿入サイトがNdeI-HindIIIであった。クローニング後、組換えベクターにより、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.1 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、28℃で1晩培養した。 The His tag is fused to the nucleic acid molecule encoding each candidate enzyme so that the His tag is fused to the N-terminus of the recombinant protein of interest (Genscript), and the gene is inserted into the expression vector pET22b (+) (Novagen). Cloning was performed at the insertion site NdeI-XhoI. The No. 5 enzyme was fused so that the His tag coding sequence was fused to the C-terminus of the target recombinant protein, and the gene insertion site was NdeI-HindIII. After cloning, Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the recombinant vector. The transformant, Escherichia coli, was cultured with shaking at 37 ° C. in LB medium until O.D.600 = 0.6. Subsequently, IPTG was added at a final concentration of 0.1 mM to induce the expression of the target recombinant protein, and then cultured at 28 ° C. overnight.

培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。 After the culture, Escherichia coli was recovered and suspended by adding a buffer (PBS). The suspension was subjected to an ultrasonic crushing treatment to obtain a crushed product of Escherichia coli. Subsequently, the disrupted E. coli was centrifuged to collect the supernatant containing the target protein as a water-soluble fraction.

水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行い、これを酵素サンプルとし、以下の実施例での実験に用いた。 The water-soluble fraction was subjected to metal ion affinity chromatography using TALON resin (Clontech) to elute the target protein. The eluate was subjected to a desalting treatment and used as an enzyme sample, which was used in experiments in the following examples.

実施例２．2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性の測定
本実施例では、実施例１で取得した酵素サンプルについて、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性を確認した。 Example 2.2 Measurement of 2-Keto-D-Gluconidase Activity In this example, the enzyme sample obtained in Example 1 was confirmed for 2-keto-D-gluconase activity.

（方法）
実施例１で取得した酵素サンプルNo.1〜No.7について、2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性を確認した。酵素活性の測定は、アルデヒドデヒドロゲナーゼによる色素還元を指標とした評価系を用いた。かかる評価系は、2-ケト-D-グルコン酸が分解されるとヒドロキシピルビン酸とD-グリセルアルデヒドが生成するが、生成したD-グリセルアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼにより酸化され、続いて、色素が還元されることを利用するものである。色素としてはジクロロインドフェノール（DCIP、和光純薬591-03541）、アルデヒドデヒドロゲナーゼとしてはSphingomonas wittichii由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下「SwALDH」と称する）を用いた。 (Method)
For the enzyme samples No. 1 to No. 7 obtained in Example 1, the activity of 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme was confirmed. For the measurement of the enzyme activity, an evaluation system using dye reduction by aldehyde dehydrogenase as an index was used. In such an evaluation system, hydroxypyruvic acid and D-glyceraldehyde are generated when 2-keto-D-gluconic acid is decomposed, and the generated D-glyceraldehyde is oxidized by aldehyde dehydrogenase, and subsequently, It utilizes the fact that the dye is reduced. Dichloroindophenol (DCIP, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 591-03541) was used as the pigment, and aldehyde dehydrogenase derived from Sphingomonas wittichii (hereinafter, referred to as "SwALDH") was used as the aldehyde dehydrogenase.

なお、SwALDHは、SwALDHをコードする核酸分子（配列番号１０：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、28℃で1晩培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを酵素活性測定のためのアルデヒドデヒドロゲナーゼとして用いた。 In addition, SwALDH is a nucleic acid molecule encoding SwALDH (SEQ ID NO: 10; CATATG-CTCGAG in the sequence is a gene insertion site NdeI-XhoI), and a gene insertion site NdeI-XhoI in an expression vector pET-22b (+). It was cloned and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). The transformant, Escherichia coli, was cultured with shaking at 37 ° C. in LB medium until O.D.600 = 0.6. Subsequently, IPTG was added at a final concentration of 0.4 mM to induce the expression of the target recombinant protein, followed by culturing at 28 ° C. overnight. After the culture, Escherichia coli was recovered and suspended by adding a buffer (PBS). The suspension was subjected to ultrasonic crushing to obtain a crushed product of Escherichia coli. Subsequently, the disrupted E. coli was centrifuged to collect the supernatant containing the target protein as a water-soluble fraction. The water-soluble fraction was subjected to metal ion affinity chromatography using TALON resin (Clontech) to elute the target protein. The solution obtained by subjecting the eluate to desalting was used as aldehyde dehydrogenase for enzyme activity measurement.

酵素反応は、酵素反応溶液（2 mM 2-ケト-D-グルコン酸、10mM MgCl₂、1μM SwALDH、50μM DCIPを含む100 mM HEPES pH 7.0）に適量の酵素サンプルNo.1〜No.7を加えて室温で行った。DCIPの還元は、600 nmの吸光度を測定することにより行った。 For the enzyme reaction, an appropriate amount of enzyme samples No. 1 to No. 7 are added to an enzyme reaction solution (100 mM HEPES pH 7.0 containing 2 mM 2-keto-D-gluconic acid, 10 mM MgCl ₂ , 1 μM SwALDH, and 50 μM DCIP). Performed at room temperature. Reduction of DCIP was performed by measuring the absorbance at 600 nm.

（結果）
その結果、No.4の酵素が0.0015 dA/分の吸光度を示した以外、他の酵素に関してはDCIPの還元は認められなかった。したがって、No.4の酵素のみが2-ケト-D-グルコン酸に対して分解活性を有することが判明した。 (result)
As a result, no reduction of DCIP was observed for the other enzymes, except that the No. 4 enzyme showed an absorbance of 0.0015 dA / min. Therefore, it was found that only No. 4 enzyme had a decomposing activity on 2-keto-D-gluconic acid.

実施例３．2-ケト-D-グルコン酸分解酵素によって生成した酵素反応物の解析
本実施例では、実施例２にて2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性が確認された酵素サンプルについて、当該酵素反応により生成した酵素反応物の解析を行った。 Example 3 Analysis of Enzyme Reactant Generated by 2-Keto-D-Gluconate Degrading Enzyme In this example, an enzyme sample in which 2-keto-D-gluconate degrading enzyme activity was confirmed in Example 2 Then, an enzyme reaction product generated by the enzyme reaction was analyzed.

（方法）
実施例１で取得し、実施例２にて2-ケト-D-グルコン酸分解酵素活性が確認された酵素サンプルNo.4について、当該酵素反応により生成した酵素反応物の解析を行った。酵素反応物の解析は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて行い、HPLC装置には日立ハイテクノロジーズ社製クロムマスターを用いた。反応生成物であるD-グリセルアルデヒドの検出は、TSKgel SCX（東ソー、0007158）カラムを使用して、移動相0.04 % リン酸水溶液、流速1 ml/分、カラム温度20℃の条件下、RI検出器にて行った。もう一つの反応生成物であるヒドロキシピルビン酸の検出は、TSKgel DEAE-2SW（東ソー、0007168）カラムを使用して、移動相10 mM リン酸ナトリウム水溶液（pH 7.1）、流速1 ml/分、カラム温度30℃の条件下、UV検出器にて行った。D-グリセルアルデヒド及びヒドロキシピルビン酸の標準品として、シグマアルドリッチ社製のD-(+)-グリセルアルデヒド（49800）及びシグマアルドリッチ社製のβ-ヒドロキシピルビン酸ナトリウム（06367）を使用し、それぞれの溶出時間である8.1分及び9.1分を求めた。 (Method)
With respect to the enzyme sample No. 4 obtained in Example 1 and confirmed to have 2-keto-D-gluconate-degrading enzyme activity in Example 2, an enzyme reaction product generated by the enzyme reaction was analyzed. The analysis of the enzyme reaction product was performed using high performance liquid chromatography (HPLC), and a chromium master manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation was used for the HPLC device. The reaction product, D-glyceraldehyde, was detected using a TSKgel SCX (Tosoh, 0007158) column, using a mobile phase 0.04% phosphoric acid aqueous solution, a flow rate of 1 ml / min, and a column temperature of 20 ° C. Performed with a detector. Hydroxypyruvic acid, another reaction product, was detected using a TSKgel DEAE-2SW (Tosoh, 0007168) column, mobile phase 10 mM sodium phosphate aqueous solution (pH 7.1), flow rate 1 ml / min, column The measurement was performed with a UV detector under the condition of a temperature of 30 ° C. Using D-(+)-glyceraldehyde (49800) manufactured by Sigma-Aldrich and sodium β-hydroxypyruvate (06367) manufactured by Sigma-Aldrich as standard products of D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, The respective elution times of 8.1 minutes and 9.1 minutes were determined.

酵素反応は、酵素反応溶液（2 mM 2-ケト-D-グルコン酸、10mM MgCl₂を含む100 mM HEPES pH 7.0）に適量の酵素サンプルNo.4を加えて室温で行い、反応後の酵素反応液10μlをHPLCに注入した。 The enzyme reaction is performed at room temperature by adding an appropriate amount of enzyme sample No. 4 to an enzyme reaction solution (100 mM HEPES pH 7.0 containing 2 mM 2-keto-D-gluconic acid and 10 mM MgCl ₂ ) at room temperature. 10 μl of the solution was injected into the HPLC.

（結果）
結果を図２及び図３に示す。図２は、D-グリセルアルデヒドの検出結果を示し、図３はヒドロキシピルビン酸の検出結果を示す。その結果、酵素サンプルNo.4は、2-ケト-D-グルコン酸を分解し、D-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解することが確認された。 (result)
The results are shown in FIGS. FIG. 2 shows the detection result of D-glyceraldehyde, and FIG. 3 shows the detection result of hydroxypyruvic acid. As a result, it was confirmed that the enzyme sample No. 4 decomposed 2-keto-D-gluconic acid and decomposed into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid.

実施例４．酵素反応による電子抽出量の比較
本実施例では、2種類の糖類からの多段階酵素反応系を構築し、両酵素反応系からの電子抽出量を比較した。 Embodiment 4. FIG. Comparison of Electron Extraction Amounts by Enzyme Reaction In this example, a multi-stage enzyme reaction system was constructed from two kinds of saccharides, and the amount of electron extraction from both enzyme reaction systems was compared.

（方法）
酵素反応による電子抽出を確認するために、フェリシアン化カリウムを電子受容体とした多段階酵素反応を行った。このとき、電子抽出量の比較のために、出発物質として、2-ケト-D-グルコン酸（以下、「2KG」と略する場合がある）、及び、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸（以下、「KDG」と略する場合がある）。酵素としては、No.4の酵素又はNo.5の酵素、実施例２で用いたSwALDH、Escherichia coli由来のD-乳酸脱水素酵素（以下、「EcDLD」と略する場合がある）、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素(以下、「ZmPDC」と略する場合がある）、及び、Bacillus subtilis由来シュウ酸脱炭酸酵素(以下「BsODC」と略する場合がある）を用いた。 (Method)
To confirm electron extraction by the enzymatic reaction, a multi-step enzymatic reaction using potassium ferricyanide as an electron acceptor was performed. At this time, for comparison of the amount of electron extraction, as starting materials, 2-keto-D-gluconic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “2KG”) and 2-dehydro-3-deoxy-D- Gluconic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “KDG”). Examples of enzymes include No. 4 enzyme or No. 5 enzyme, SwALDH used in Example 2, D-lactate dehydrogenase derived from Escherichia coli (hereinafter sometimes abbreviated as “EcDLD”), Zymomonas mobilis A pyruvate decarboxylase derived from (hereinafter sometimes abbreviated as "ZmPDC") and an oxalate decarboxylase derived from Bacillus subtilis (hereinafter sometimes abbreviated as "BsODC") were used.

なお、No.4の酵素及びNo.5の酵素は、上記実施例１に記載の通りに調製した酵素サンプルNo.4及びNo.5を用いた。SwALDHは、上記実施例２に記載の通りに調製したものを用いた。 The enzyme samples No. 4 and No. 5 prepared as described in Example 1 were used as the enzyme No. 4 and the enzyme No. 5 respectively. SwALDH used was prepared as described in Example 2 above.

EcDLDは、以下の通り調製した。EcDLDをコードする核酸分子（配列番号１１：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、20℃で1晩培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを用いた。 EcDLD was prepared as follows. A nucleic acid molecule encoding EcDLD (SEQ ID NO: 11 in the sequence, CATATG-CTCGAG is a gene insertion site NdeI-XhoI) was cloned into an expression vector pET-22b (+) at the gene insertion site NdeI-XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3). The transformant, Escherichia coli, was cultured with shaking at 37 ° C. in LB medium until O.D.600 = 0.6. Subsequently, IPTG was added at a final concentration of 0.4 mM to induce the expression of the target recombinant protein, followed by culturing at 20 ° C. overnight. After the culture, Escherichia coli was recovered and suspended by adding a buffer (PBS). The suspension was subjected to an ultrasonic crushing treatment to obtain a crushed product of Escherichia coli. Subsequently, the disrupted E. coli was centrifuged to collect the supernatant containing the target protein as a water-soluble fraction. The water-soluble fraction was subjected to metal ion affinity chromatography using TALON resin (Clontech) to elute the target protein. The eluate used was desalted.

ZmPDCは、以下の通り調製した。ZmPDCをコードする核酸分子（配列番号１２：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、28℃で1晩培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを用いた。 ZmPDC was prepared as follows. A nucleic acid molecule encoding ZmPDC (SEQ ID NO: 12; CATATG-CTCGAG in the sequence is the gene insertion site NdeI-XhoI) was cloned into the expression vector pET-22b (+) at the gene insertion site NdeI-XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3). The transformant, Escherichia coli, was cultured with shaking at 37 ° C. in LB medium until O.D.600 = 0.6. Subsequently, IPTG was added at a final concentration of 0.4 mM to induce the expression of the target recombinant protein, followed by culturing at 28 ° C. overnight. After the culture, Escherichia coli was recovered and suspended by adding a buffer (PBS). The suspension was subjected to ultrasonic crushing to obtain a crushed product of Escherichia coli. Subsequently, the disrupted E. coli was centrifuged to collect the supernatant containing the target protein as a water-soluble fraction. The water-soluble fraction was subjected to metal ion affinity chromatography using TALON resin (Clontech) to elute the target protein. The eluate used was desalted.

BsODCは、以下の通り調製した。BsODCをコードする核酸分子（配列番号１３：配列中CATATG-CTCGAGは遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIである）を、発現ベクターpET-22b(+)に遺伝子挿入サイトNdeI-XhoIにてクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体である大腸菌をLB培地中でO.D.600＝0.6になるまで37℃で振とう培養した。続いて、IPTGを終濃度0.4 mM、MnCl₂を終濃度5 mMで添加して目的組換えタンパク質の発現誘導を行った後、37℃で4時間培養した。培養後、大腸菌を回収し、緩衝液（PBS）を加えて懸濁した。懸濁液に対して超音波破砕処理を行って大腸菌の破砕物を得た。続いて、大腸菌の破砕物に対して遠心分離処理を行って目的タンパク質を含む上清を水溶性画分として回収した。水溶性画分を、TALON樹脂（Clontech社）を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を溶出した。溶出液に対して脱塩処理を行ったものを用いた。 BsODC was prepared as follows. A nucleic acid molecule encoding BsODC (SEQ ID NO: 13; CATATG-CTCGAG in the sequence is the gene insertion site NdeI-XhoI) was cloned into the expression vector pET-22b (+) at the gene insertion site NdeI-XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3). Escherichia coli as a transformant was cultured with shaking at 37 ° C. in an LB medium until OD600 = 0.6. Subsequently, IPTG was added at a final concentration of 0.4 mM and MnCl ₂ was added at a final concentration of 5 mM to induce the expression of the target recombinant protein, and then cultured at 37 ° C. for 4 hours. After the culture, Escherichia coli was recovered and suspended by adding a buffer (PBS). The suspension was subjected to an ultrasonic crushing treatment to obtain a crushed product of Escherichia coli. Subsequently, the disrupted E. coli was centrifuged to collect the supernatant containing the target protein as a water-soluble fraction. The water-soluble fraction was subjected to metal ion affinity chromatography using TALON resin (Clontech) to elute the target protein. The eluate used was desalted.

図４及び図５に、2KG及びKDGのそれぞれが受ける反応経路を示し、図４は2KG、図５はKDGの反応経路である。かかる経路に基づくと、2KGでは一分子当たり16電子、KDGでは一分子当たり12電子が、それぞれ抽出されることになる。 FIGS. 4 and 5 show the reaction pathways of 2KG and KDG, respectively. FIG. 4 shows the reaction pathway of 2KG and FIG. 5 shows the reaction pathway of KDG. Based on this route, 16 electrons per molecule for 2KG and 12 electrons per molecule for KDG are extracted.

酵素反応は、酵素反応溶液（100 mMリン酸緩衝液 pH 7.0中、0.5 mM 2-ケト-D-グルコン酸又は2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸、10mM フェリシアン化カリウム（和光純薬：167-03722）、1 mMチアミン2リン酸（以下、「ThDP」と略する場合がある、シグマアルドリッチ：C8754）、5 mM MgCl₂（和光純薬：135-00165）を含む）に適量の上記した酵素群を加えて37℃の条件下で行い、経時的にプレートリーダーにて420 nmでの吸光度を測定した。なお、コントロールとして、酵素の代わりにウシ血清アルブミン（BSA）を添加したものについても同様に実験を行った。 The enzymatic reaction was performed using an enzyme reaction solution (0.5 mM 2-keto-D-gluconic acid or 2-dehydro-3-deoxy-D-gluconic acid in 10 mM phosphate buffer pH 7.0, 10 mM potassium ferricyanide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: 167-03722), 1 mM thiamine diphosphate (hereinafter sometimes abbreviated as “ThDP”, Sigma-Aldrich: C8754), and 5 mM MgCl ₂ (including Wako Pure Chemicals: 135-00165) in an appropriate amount. The obtained enzyme group was added thereto, and the reaction was performed at 37 ° C., and the absorbance at 420 nm was measured over time using a plate reader. In addition, as a control, the same experiment was conducted using bovine serum albumin (BSA) instead of the enzyme.

（結果）
結果を、図６及び図７に示し、図６はNO.4の酵素の結果、図７はNo.5の酵素の結果である。図中、縦軸は、反応開始時の吸光度を1.0と定義して算出される変化率である。その結果、No.4の酵素は、KDGも分解できるため（データは図示せず）、図４及び図５の何れもの反応経路が進行する。その結果、KDGに比べて、2KGからの方が、多くの電子を抽出できることが示された。一方、No.5の酵素はKDGを分解できることは知られているが、実施例１で確認した通り2KGは分解できない。その結果、KDGからはNo.4の酵素と同じ量の電子の抽出が認められたが、2KGからはほとんど電子の抽出が認められなかった。これらの結果より、2KGからNo.4の酵素を用いて電子を抽出することが効率的であることが判明した。 (result)
The results are shown in FIGS. 6 and 7, where FIG. 6 shows the results for the No. 4 enzyme and FIG. 7 shows the results for the No. 5 enzyme. In the figure, the vertical axis represents the change rate calculated by defining the absorbance at the start of the reaction as 1.0. As a result, the No. 4 enzyme can also degrade KDG (data not shown), so that any of the reaction pathways in FIGS. 4 and 5 proceeds. As a result, it was shown that more electrons can be extracted from 2KG than from KDG. On the other hand, it is known that the No. 5 enzyme can degrade KDG, but cannot degrade 2KG as confirmed in Example 1. As a result, the same amount of electrons was extracted from KDG as the enzyme of No. 4, but almost no electrons were extracted from 2KG. From these results, it was found that it was efficient to extract electrons from 2KG using the No. 4 enzyme.

本発明は、糖類酸化方法、糖類酸化酵素剤、糖類酸化酵素電極に関するものであり、糖類の酸化反応、特には、糖類の多段階酸化反応を行う酵素反応系の構築が要求されるあらゆる分野、例えば、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。 The present invention relates to a saccharide oxidation method, a saccharide oxidase agent, and a saccharide oxidase electrode, and in any field where the construction of an enzyme reaction system for performing a saccharide oxidation reaction, particularly, a multi-stage oxidation reaction of a saccharide, is required. For example, it can be used in industrial fields such as electronic, medical, food, and environmental fields.

Claims

糖類を分解する糖類酸化方法であって、
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸に分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素により、前記2-ケト-D-グルコン酸を前記D-グリセルアルデヒドと前記ヒドロキシピルビン酸とに分解する工程を、含む糖類酸化方法。 A saccharide oxidation method for decomposing saccharides,
An amino acid sequence according to any of the following (a) to (c):
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition;
(C) an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Comprising 2-keto-D-gluconic acid, which has the activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, A saccharide oxidation method comprising a step of decomposing into D-glyceraldehyde and the hydroxypyruvic acid.

以下の（Ａ）〜（Ｇ）の少なくとも１の工程を含む請求項１に記載の糖類酸化方法。
（Ａ）前記D-グリセルアルデヒドを、アルデヒド酸化酵素によりD-グリセリン酸に分解する工程、
（Ｂ）前記D-グリセリン酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素により前記ヒドロキシピルビン酸に分解する工程、
（Ｃ）前記ヒドロキシピルビン酸を、ヒドロキシピルビン酸酸化酵素、又は、ヒドロキシピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド酸化酵素の組み合わせにより、グリコール酸に分解する工程、
（Ｄ）前記グリコール酸を、D-2-ヒドロキシ酸酸化酵素によりグリオキシル酸に分解する工程、
（Ｅ）前記グリオキシル酸を、アルデヒド酸化酵素によりシュウ酸に分解する工程、
（Ｆ）前記シュウ酸を、シュウ酸脱炭酸酵素によりギ酸に分解する工程、
（Ｇ）前記ギ酸を、ギ酸酸化酵素によりCO₂に分解する工程、
を含む請求項１に記載の糖類酸化方法。 The saccharide oxidation method according to claim 1, comprising at least one of the following steps (A) to (G).
(A) a step of decomposing the D-glyceraldehyde to D-glyceric acid by an aldehyde oxidase;
(B) a step of decomposing the D-glyceric acid into the hydroxypyruvic acid by D-2-hydroxyacid oxidase;
(C) decomposing the hydroxypyruvate to glycolic acid by hydroxypyruvate oxidase or a combination of hydroxypyruvate decarboxylase and aldehyde oxidase;
(D) decomposing the glycolic acid into glyoxylic acid with a D-2-hydroxyacid oxidase;
(E) decomposing the glyoxylic acid into oxalic acid by an aldehyde oxidase;
(F) decomposing the oxalic acid into formic acid by oxalate decarboxylase;
(G) a step of decomposing the formic acid into CO ₂ by a formate oxidase;
The saccharide oxidation method according to claim 1, comprising:

以下の（Ｈ）及び（Ｉ）の少なくとも１の工程、
（Ｈ）D-グルコースを、グルコース-1-酸化酵素によりD-グルコン酸に分解する工程、
（Ｉ）前記D-グルコン酸を、グルコン酸-2-酸化酵素により前記2-ケト-D-グルコン酸に分解する工程、
を含む請求項１又は２に記載の糖類酸化方法。 At least one step of the following (H) and (I):
(H) a step of decomposing D-glucose into D-gluconic acid by glucose-1-oxidase;
(I) a step of decomposing the D-gluconic acid into the 2-keto-D-gluconic acid by gluconic acid-2-oxidase;
The saccharide oxidation method according to claim 1, comprising:

以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を含む、糖類を分解するための糖類酸化酵素剤。 An amino acid sequence according to any of the following (a) to (c):
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition;
(C) an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Comprising a 2-keto-D-gluconic acid degrading enzyme having an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, a saccharide oxidase for decomposing saccharides Agent.

以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなり、2-ケト-D-グルコン酸をD-グリセルアルデヒドとヒドロキシピルビン酸とに分解する活性を有する2-ケト-D-グルコン酸分解酵素を電極触媒として電極材上に固定した糖類酸化酵素電極。 An amino acid sequence according to any of the following (a) to (c):
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have a modification consisting of at least one of deletion, substitution, insertion and addition;
(C) an amino acid sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Composed of a 2-keto-D-gluconic acid, which has an activity of decomposing 2-keto-D-gluconic acid into D-glyceraldehyde and hydroxypyruvic acid, and saccharide oxidation immobilized on an electrode material as an electrode catalyst. Enzyme electrode.