JP2020018201A - 培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすのに適した量の電荷を培地に供給することができる培養方法を提供する。【解決手段】本発明の培養方法は、表面電極と、前記表面電極の下方の下部電極と、前記下部電極と前記表面電極との間に配置された中間層とを備えた電子放出素子の前記下部電極と前記表面電極との間、及び前記電子放出素子と培地との間にそれぞれ電位差を生じさせることにより、前記電子放出素子から放出電子を気相に放出させ細胞を培養中の前記培地に前記気相を介して前記放出電子由来の電荷を照射する電気刺激ステップと、前記電気刺激ステップ後の前記培地において前記細胞を培養する培養ステップとを含み、前記電子放出素子からの前記放出電子に由来した前記培地中のイオン種及び前記電気刺激ステップにおいて副次的に生成された活性種が、前記細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすことを特徴とする。【選択図】図１

Description

本発明は、培養方法に関する。

培養液に直接浸した一対の刺激電極を用いて筋芽細胞にパルス波により電気刺激を与えて、自動収縮能を有する筋細胞に分化誘導させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、培養液に大気圧プラズマを照射してプラズマ照射培地を調製し、このプラズマ照射培地中で胚葉体を培養する分化誘導方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。この方法では、細胞の増殖を抑制することなく胚葉体を外胚葉（神経細胞）へ特異的に分化誘導できることが報告されている。
一方、下部電極と表面電極との間に電圧を印加することにより、電子を放出させる電子放出素子が知られている（例えば、特許文献３参照）。また、電子放出素子により放出させた電子により酸素の陰イオンを発生させ、この陰イオンを気体の流れにのせて生体に向けて噴出する陰イオン生成装置が知られている（例えば、特許文献４参照）。

特開２００５−２７５０１号公報 特開２０１７−９３３８７号公報 特開２０１６−１３６４８５号公報 特開２００６−３２５４９３号公報

一対の刺激電極を培養液に浸漬して細胞に電気刺激を与える方法では、一対の電極の最短距離に電流が流れる。このため、培養液中の複数の細胞に一様に電気刺激を与えることが難しい。また、大気圧プラズマを用いる方法では、プラズマジェットが細胞にダメージを与えることを回避するために、予め調製したプラズマ照射培地中で細胞を培養する必要がある。このため、有効時間が短い活性種により細胞を刺激することが難しい。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすのに適した量の電気刺激（放出電子に由来したイオン種及び副次的に生成された活性種）を培地に供給することができる培養方法を提供する。

本発明は、表面電極と、前記表面電極の下方の下部電極と、前記下部電極と前記表面電極との間に配置された中間層とを備えた電子放出素子の前記下部電極と前記表面電極との間、及び前記電子放出素子と培地との間にそれぞれ電位差を生じさせることにより、前記電子放出素子から放出電子を気相に放出させ細胞を培養中の前記培地に前記気相を介して前記放出電子由来の電荷を照射する電気刺激ステップと、前記電気刺激ステップ後の前記培地において前記細胞を培養する培養ステップとを含み、前記電子放出素子からの前記放出電子に由来した前記培地中のイオン種及び前記電気刺激ステップにおいて副次的に生成された活性種が、前記細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすことを特徴とする培養方法を提供する。

本発明の培養方法によれば、電子放出素子を用いて培地に電気刺激を供給するため、安定した量の電荷を培地に供給することができ、かつ、培地に供給する電荷の量を細かく調整することができる。このため、細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすのに適した量の電気刺激を培地に供給することが可能である。
本発明の培養方法では、電子放出素子により気相に生じさせた陰イオン（電荷）を電界を利用して培地に供給しこの電荷が電気刺激となるため、窒素ガスやアルゴンガスのガスフロー機構を必要としない。このため、培地への電気刺激時に、培地の乾燥や細胞浮遊を引き起こす心配がない上、培養雰囲気のガス組成に影響を与える事がない。
電子放出素子は、表面電極から電子を面放出させることができるため、培地の表面と表面電極との間の気相に一様に陰イオン（電荷）を発生させることができる。このため、表面電極の下部に位置する培地にも一様に陰イオンを供給することができ、表面電極の下部に位置する細胞に一様に電荷又は活性種による刺激を与えることができる。

本発明の一実施形態の培養方法に用いる細胞刺激装置の概略断面図である。 本発明の一実施形態の培養方法に用いる細胞刺激装置の概略回路図である。 本発明の一実施形態の培養方法に用いる電子放出ユニットの概略斜視図である。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示すグラフである。 培養分化実験の細胞数のカウント結果を示すグラフである。

本発明の培養方法は、表面電極と、前記表面電極の下方の下部電極と、前記下部電極と前記表面電極との間に配置された中間層とを備えた電子放出素子の前記下部電極と前記表面電極との間、及び前記電子放出素子と培地との間にそれぞれ電位差を生じさせることにより、前記電子放出素子から放出電子を気相に放出させ細胞を培養中の前記培地に前記気相を介して前記放出電子由来の電荷を照射する電気刺激ステップと、前記電気刺激ステップ後の前記培地において前記細胞を培養する培養ステップとを含み、前記電子放出素子からの前記放出電子に由来した前記培地中のイオン種及び前記電気刺激ステップにおいて副次的に生成された活性種が、前記細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすことを特徴とする。

前記電気刺激ステップは、培地に電気刺激を供給すると同時に電荷回収電極により電気刺激で与えられた培地の電荷を回収するステップであることが好ましい。このことにより、培地が帯電することを抑制することができ、電気刺激を効率よく培地に供給することができる。
前記電気刺激ステップは、電子放出素子から培地へ電荷を供給することにより気相に生じる電流と、電荷回収電極が培地から電荷を回収することにより培地に生じる電流とがループ電流として流れるステップであることが好ましい。このことにより、電気刺激を効率よく培地に供給することができ、適切に細胞を刺激することができる。
前記電気刺激ステップと前記培養ステップは、交互に繰り返し行われることが好ましい。このことにより、時間的間隔をおいて細胞に刺激を与えることができる。また、異なる分化ステージにおいて細胞に刺激を与えることができ、細胞の分化を進行させることができる。

前記電気刺激ステップは、培地に電荷を供給する時間が５秒間以上１分間以下であるステップであることが好ましい。この電気刺激ステップにより、細胞に適切に刺激を与えることができ、かつ、電荷により細胞が損傷することを抑制することができる。また、前記電気刺激ステップは、１日間に少なくとも１回行われることが好ましい。このことにより、時間的間隔をおいて細胞に刺激を与えることができる。
前記電気刺激ステップにおいて、下部電極と表面電極との間に印加する電圧は、１３．５Ｖ以上１５Ｖ以下であることが好ましい。このことにより、骨芽細胞又は骨芽細胞の前駆細胞の骨形成関連の遺伝子の発現量を多くすることができる。前記電気刺激ステップにおいて、電子放出素子から照射されるイオン照射密度は、２．４μＡ／ｃｍ²以上４．６μＡ／ｃｍ²以下であることが好ましい。このことにより、骨芽細胞又は骨芽細胞の前駆細胞の骨形成関連の遺伝子の発現量を多くすることができる。

前記培地で培養する細胞は、骨芽細胞又は骨芽細胞の前駆細胞であることが好ましく、前記電気刺激ステップは、細胞を播種してから前記前駆細胞が成熟型骨芽細胞に分化するまでの間に行われることが好ましい。この電気刺激ステップにより、細胞の骨形成関連の遺伝子の発現量を多くすることができる。
前記電気刺激ステップは、細胞の播種から２４時間以内に行われることが好ましい。前記電気刺激ステップにより、細胞がコンフルエント状態に達する前に細胞に刺激を与えることが可能である。
本発明の培養方法は、培地を新しい培地に交換するステップを備えることが好ましい。このことにより、細胞に十分な栄養を供給することができる。また、前記電気刺激ステップは、培地を交換するステップの後に行われることが好ましい。この電気刺激ステップにより新しい培地中に活性種を発生させることができ、この活性種により細胞を刺激することができる。

以下、図面を用いて本発明の一実施形態を説明する。図面や以下の記述中で示す構成は、例示であって、本発明の範囲は、図面や以下の記述中で示すものに限定されない。

図１は本実施形態の培養方法に用いる細胞刺激装置の概略断面図であり、図２は細胞刺激装置の概略回路図であり、図３は細胞刺激装置に含まれる電子放出ユニットの概略斜視図である。
本実施形態の培養方法は、表面電極４と、表面電極４の下方の下部電極２と、下部電極２と表面電極４との間に配置された中間層３とを備えた電子放出素子５の下部電極２と表面電極４との間、及び電子放出素子５と培地６との間にそれぞれ電位差を生じさせることにより、電子放出素子５から放出電子を気相８に放出させ細胞７を培養中の培地６に気相８を介して放出電子由来の電荷を照射する電気刺激ステップと、電気刺激ステップ後の培地６において細胞７を培養する培養ステップとを含み、電子放出素子５からの放出電子に由来した培地６中のイオン種及び電気刺激ステップにおいて副次的に生成された活性種が、細胞７の増殖活性化又は分化を引き起こすことを特徴とする。本実施形態の培養方法は、分化誘導方法であってもよい。

本実施形態の培養方法では、細胞刺激装置３０を用いて培地６に電気刺激を供給することができる。細胞刺激装置３０は、培地６及び細胞７を収容するための培養容器１２と、電子放出ユニット２５を備えることができる。
培地６で培養する細胞７は、例えば、成体幹細胞（組織幹細胞、体性幹細胞）、前駆細胞、ＥＳ細胞、iPS細胞などである。また、細胞７は、骨芽細胞又は骨芽細胞の前駆細胞であってもよい。
培地６で培養する細胞７は、培地６に10³〜10⁶cells/cm²で細胞７が含まれるように培地６に播種することができる。
培地６は、細胞７に生育環境を提供するものである。培地６は、通常用いられている細胞培養用培地であれば特に制限なく用いる事ができる。培地６は、液体培地であってもよく、寒天などのゲル化剤で液体培地を固めた固体培地であってもよい。また、培地６は、液体培地と固体培地とを組み合わせたものであってもよい。培地６は、例えばMEM培地（イーグル最小必須培地）、D-MEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、α-MEM培地（イーグル最小必須培地 α改変型）、GMEM（グラスゴー最小必須培地）、Ham‘s F-12（栄養混合物 F-12ハム）、IMDM（イスコフ改変ダルベッコ培地）、RPMI-1640培地、D-PBS（ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水）、HBSS（ハンクス平衡塩類溶液）等である。

培地６は、培養容器１２に収容される。培養容器１２は、例えば、複数のウェルを備えたマルチウェルプレート、培養ディッシュなどである。また、培養容器１２と電子放出ユニット２５とを組み合わせることにより、細胞刺激装置３０を形成することができる。培養容器１２の材質は、既存の材料であるガラス、プラスチック等が利用できる。培養容器１２は、容器底面に細胞７の定着に適した表面処理を付与したものが好ましい。表面処理は一般的に知られている、マトリックスタンパク質、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等を容器底面に施す処理とすることができる。
培養容器１２は、インキュベータ中に配置することができる。このことにより、培地６の温度、雰囲気ガスなどを制御することができ、細胞７を安定して培養することができる。培養雰囲気は、例えば、温度：３７℃、相対湿度：９５％以上、雰囲気ガス：５％炭酸ガスを含む空気である。

電子放出ユニット２５は、培地６に気相８を介して電気刺激を供給する電子放出素子５を備える。また、電子放出ユニット２５は、複数の電子放出素子５を備えることができる。培養容器１２が複数のウェルを有する場合、電子放出ユニット２５は、培養容器１２の各ウェルに対応する電子放出素子５を有することができる。また、電子放出ユニット２５は、例えば、図１、２に示したように、電子放出素子５の表面電極４がウェル内の培地６と気相８を介して対向するように設けることができる。
例えば、図３に示した電子放出ユニット２５は、６ウェルのマルチウェルプレートと組み合わせることができる電子放出ユニット２５であり、マルチウェルプレートの各ウェルに対応する電子放出素子５ａ〜５ｆを備える。

電子放出素子５は、平面形状を有し、電子を放出することが可能な素子である。電子放出素子５は、下部電極２と、表面電極４と、下部電極２と表面電極４との間に配置された中間層３とを備える。電子放出素子５は、例えば、図２に示したような構造を有することができる。
また、細胞刺激装置３０は、例えば、図１、２に示したような電気的構成により、電子放出素子５、培地６などに電圧を印加することができる。
駆動用電圧源により表面電極４と下部電極２との間に電圧Ｖ_dを印加し中間層３に電界を生じさせることができる。この電界により、中間層３に電子を流すことができ、電子放出素子５の表面電極４から気相８に電子を放出することができる。この電子は、酸素の陰イオンなどのイオン種を気相８中に生じさせる。また、この陰イオンは表面電極４と培地６との間の電界により培地６へと移動し培地６に供給される（イオン照射）。また、気相８に放出した電子はその運動エネルギーに応じて酸素、窒素、水分子等と反応し、種々の活性種を生じる。この活性種はイオン種の電界移動（イオン風）に引きずられて、あるいは自身の熱拡散によって培地６へと移動し、培地６に供給される（活性種照射）。
Ｖ_dは、例えば、１３．５Ｖ以上１５Ｖ以下とすることができる。

例えば、駆動用電圧源により、波高値１４Ｖ_0-p〜２４Ｖ_0-pで周波数５００〜１００００Ｈｚの矩形波交流電圧を表面電極４と下部電極２との間に印加することができる。また、on, offデューティー比は 1〜100%までの可変とすることができる。また、電子放出素子５からのイオン照射密度は、0.5〜5.0μA/cm²とすることができる。
駆動中のイオン照射密度はほぼ一定値（振れ幅は±10％以内、好ましくは±５%以内）とし、照射密度を満足するために、駆動電圧波高値あるいは矩形波デューティー比をパラメータとして制御を行うことができる。イオン照射密度はほぼ一定値にすることにより、培地６中の細胞７に一様に安定した刺激を与えることができる。

表面電極４は、電子放出素子５の表面に位置する電極である。表面電極４は、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下、好ましくは４０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の厚さを有することができる。また、表面電極４の材質は、例えば、金、白金である。このことにより、オートクレーブ滅菌などにより表面電極４が酸化されることを抑制することができる。また、表面電極４は、複数の金属層から構成されてもよい。
表面電極４は、４０ｎｍ以上の厚さを有する場合であっても、複数の開口、すき間、１０ｎｍ以下の厚さに薄くなった部分を有してもよい。中間層３を流れた電子がこの開口、すき間、薄くなった部分を通過又は透過することができ、表面電極４から電子を放出することができる。このような開口、すき間、薄くなった部分は、下部電極２と表面電極４との間に電圧を印加すること（フォーミング処理、初期電圧印加）により形成することができる。

下部電極２は、中間層３を介して表面電極４と対向する電極である。下部電極２は、金属板であってもよく、絶縁性基板上に形成した金属層又は導電体層であってもよい。また、下部電極２が金属板からなる場合、この金属板は電子放出素子５の基板であってもよい。下部電極２の材質は、例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、ニッケルなどである。下部電極の厚さは、例えば２００μｍ以上１ｍｍ以下である。

中間層３は、表面電極４と下部電極２とに電圧を印加することにより形成される電界により電子が流れる層である。中間層３は、半導電性を有することができる。中間層３は、絶縁性樹脂、導電性樹脂、絶縁性微粒子のうち少なくとも１つを含むことができる。また、中間層３は導電性微粒子を含むことが好ましい。中間層３の厚さは、例えば、１μｍ以上１．８μｍ以下とすることができる。中間層３を流れた電子が表面電極４から気相８に放出されるため、電子放出素子５は、表面電極４から電子を面放出することができる。このため、表面電極４上の気相８に電子を一様に放出することができ、この電子により酸素の陰イオンなどのイオン種を発生させることができる。

電子放出素子５は、表面電極４と下部電極２との間に絶縁層１０を有してもよい。この絶縁層１０は、開口を有することができる。絶縁層１０の開口は、表面電極４の電子を放出させたい領域に対応するように設けられる。絶縁層１０には電子が流れることができないため、絶縁層１０の開口に対応する中間層３に電子が流れ表面電極４から電子が放出される。従って、絶縁層１０を設けることにより、表面電極４に電子放出領域２２を形成することができる。

電子放出素子５は、絶縁性部材１３に取り外し可能に固定することができる。この絶縁性部材１３を培養容器１２のウェル内の上部に配置することにより、電子放出素子５の表面電極４が、ウェル内の培地６の表面に気相８を介して対向するように電子放出素子５を配置することができる。このように電子放出素子５を配置することにより、電子放出素子５の表面電極４側から放出させた電子から、電子放出素子５と培地６との間の気相８に酸素の陰イオンなどのイオン種を発生させることができる。また、電子放出素子５は、表面電極４と培地６の表面とが実質的に平行となるように配置することができる。
また、培養容器１２が複数のウェルを有する場合、電子放出ユニット２５は、各ウェルに対応する絶縁性部材１３を有することができる。

蓋部材１４は、電子放出ユニット２５を培養容器１２上に載せることができるように設けられる。また、蓋部材１４は、絶縁性を有することができる。
絶縁性部材１３又は蓋部材１４は、表面電極４と培地６の表面との間の距離が０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下となるように設けることができる。このことにより、気相８に発生させた陰イオンを培地６に容易に供給することができる。表面電極４と培地６の表面との間の距離は、好ましくは１ｍｍ以上２ｍｍ以下とすることができる。
このように電子放出素子５を気相８を介して培地６の表面と対向させることにより、気相８から培地６への酸素ガスの供給が阻害されることを抑制することができる。このため、培地６の溶存酸素量を保持することが可能になる。

電荷回収電極９は、細胞７を培養する培地６に接触することができるように設けられる。このため、培地６から電荷回収電極９へ電荷が流れることができ、電荷回収電極９と培地６との電位を等しくあるいはほぼ等しくすることができる。例えば、電荷回収電極９を接地接続すれば、培地６が帯電することを抑制することができる。
電荷回収電極９は、例えば、絶縁性部材１３又は蓋部材１４に固定することができる。電荷回収電極９は、絶縁性部材１３及び蓋部材１４を培養容器１２上に設置した際に電荷回収電極９が培地６と接触するように設けることができる。

ＤＣバイアス電圧源で電子放出素子５又は電荷回収電極９に電圧を印加することにより、電子放出素子５の表面電極４と培地６の表面との間の気相８に電界を生じさせることができる。この電界の中の電気力線（電界強度の勾配）に沿って、電子放出素子５が電子を放出することにより気相８中に発生させた陰イオンを培地６の表面に搬送することができ、培地６に陰イオン（ＯＨ^-、Ｃｌ^-、Ｏ₂ ^-など）を発生させることができる。また、この電子放出により培地６に活性種（ＯＨ、ＨＯ₂、ＮＯ、ＮＯ₂など）を搬送することあるいは培地６に活性種（Ｈ₂Ｏ₂など）を発生させることができる。このような培地６中の陰イオン又は活性種により細胞７を刺激することができ、細胞７の増殖活性化又は分化を引き起こすことができる。
また、培地６中の陰イオンは、電荷回収電極９へと流れ回収されるため、培地６が帯電することを抑制することができ、気相８中の陰イオンを効率よく培地６に供給することができる。
ＤＣバイアス電圧源及び駆動用電圧源は、電子放出素子５から培地６へ電荷を供給することにより気相８に生じる電流と、電荷回収電極９が培地６から電荷を回収することにより培地６に生じる電流とがループ電流となるように電子放出素子５及び電荷回収電極９と電気的に接続することができる。

例えば、電荷回収電極９を接地接続し、ＤＣバイアス電圧源により電子放出素子５と電荷回収電極９との間に−１０００Ｖ〜−５０Ｖの直流電圧を印加することができる。また、電子放出素子５の表面電極４と培地６の表面との間隔は０．５ｍｍ〜３ｍｍ（好ましくは１ｍｍ以上２ｍｍ以下）とすることができる。電荷回収電極９が接地接続しているため培地６の電位はほぼ０Ｖになり、表面電極４の電位は−１０００Ｖ〜−５０Ｖとなる。また、培地６と表面電極４との間隔は０．５ｍｍ〜３ｍｍであるため、培地６と表面電極４との間の気相８に強い電界強度の電界を生じさせることができる。この電界を利用して電子放出素子５が電子を放出することにより発生させた陰イオンを培地６に供給することができる。

電子放出素子５は、表面電極４から電子を面放出させることができるため、培地６の表面と表面電極４との間の気相８に一様に陰イオンを発生させることができる。この陰イオンを電界により培地６に供給することができるため、表面電極４の下部に位置する培地６にも一様に陰イオンなどを供給することができ、表面電極４の下部に位置する細胞７に一様に刺激を与えることができる。このため、刺激を与えたい細胞に一様に刺激を与えることができ、細胞７の増殖活性化又は分化を引き起こすことができる。

本実施形態の培養方法では、まず、培養容器１２中に培地６を入れ、この培地６中に細胞７を播種する。培養容器１２を蓋で覆い、５％ＣＯ₂インキュベータ内で細胞７を準備培養する（準備培養ステップ）。準備培養期間は、例えば１日間（２４時間以内）とすることができる。この準備培養により、培養容器１２のウェルの底に細胞を接着させることができ、細胞を固定することができる。
準備培養後、インキュベータ内において、培養容器１２の蓋を取り、培養容器１２に電子放出ユニット２５を取り付ける。そして、イオン照射時間の間、駆動用電圧源とＤＣバイアス電圧源を用いて電子放出素子５及び培地６に電圧を印加することにより、電子放出素子５により細胞７を培養中の培地６に気相８を介して電荷を供給し（イオン照射）、細胞７を刺激する（電気刺激ステップ）。また、電荷回収電極９により培地６から電荷を回収する。
この電気刺激ステップにより、細胞７の増殖の活性化又は細胞７の分化を引き起こすことができる。

電気刺激ステップにおいて、電子放出素子５から培地６へ電荷を供給することにより気相８に生じる電流と、電荷回収電極９が培地６から電荷を回収することにより培地６に生じる電流とがループ電流として流れる。例えば、図１、２に示したように、ＤＣバイアス電圧源を用いて表面電極４と電荷回収電極９との間に電圧Ｖ_eを印加することにより生じさせた電界により気相８をイオンＢ^-（イオンＢ^-は表面電極４から放出された電子により気相８中に生じる）が移動することにより気相８に電流が生じ、培地６に達したイオンＢ^-は培地６中に溶け込み、細胞の各種要素形成に関わるシグナル伝達系を刺激し、最終的にイオンＣ^-（イオンＣ^-はイオンＢ^-そのものand／orイオンＢ^-由来の別イオン種）として電荷回収電極９へと移動することにより培地６に電流が生じる。従って、ＤＣバイアス電圧源、表面電極４、気相８及び培地６を含む回路にループ電流を流すことができる。

電子放出素子５によるイオン照射時間は、例えば、５秒間以上１分間以内とすることができる。
電子放出素子５により培地６にイオン照射する際の駆動用電圧源により表面電極４と、下部電極２との間に印加する電圧は、例えば、１３．５Ｖ以上１５Ｖ以下とすることができる。
電子放出素子５による培地６へのイオン照射は、電子放出素子５からのイオン照射密度が２．４μＡ／ｃｍ²以上４．６μＡ／ｃｍ²となるように行うことができる。イオン照射密度は、培地６から電荷回収電極９に電荷が回収されることにより生じる電流Ｉ_eと、電子放出素子５の電子放出領域２２の面積とから算出することができる。
電気刺激ステップでは、気相８を介して培地６に電荷を供給するため、細胞７がコンフルエント状態に達する前に電気刺激ステップを行うことができる。

電気刺激ステップ後、インキュベータ内において培養容器１２から電子放出ユニット２５を取り外し、培養容器１２に蓋を取り付けた後、細胞７の培養を続ける（培養ステップ）。培養ステップの培養期間は例えば、２４時間とすることができる。
電気刺激ステップにより増殖が活性化された細胞７は、この培養ステップにおいて、細胞***が活性化し細胞７の増加数が大きくなる。電気刺激ステップにより細胞の増殖活性化が引き起こされたかどうかは、培養ステップ後に、細胞数をカウントすることにより確認することができる。
電気刺激ステップにより分化を引き起こされた細胞７は、この培養ステップにおいて、分化が進行し、成熟細胞へと分化する。このため、電気刺激ステップ及び培養ステップにより細胞７を分化誘導することができる。電気刺激ステップにより細胞の分化が引き起こされたかどうかは、培養ステップ後に、ＲＴ−ＰＣＲ測定を行うことにより確認することができる。
また、電気刺激ステップ及び培養ステップは、培養容器１２をインキュベータ内に入れた状態で蓋を取り替えるだけで行うことができるため、コンタミネーションが生じることを抑制することができる。

培養ステップの後、再び電気刺激ステップを行うことができ、その後、再び培養ステップを行うことができる。このように電気刺激ステップと培養ステップとを交互に繰り返し行うことにより、時間的間隔をおいて細胞７に刺激を与えることができる。また、異なる分化ステージにおいて細胞７に刺激を与えることができ、細胞７の分化を進行させることができる。また、電気刺激ステップと培養ステップとを繰り返し行う場合、電気刺激ステップは、１日間に少なくとも１回行うことができる。また、電気刺激ステップは、２４時間周期で行うことができる。
培養する細胞が前駆骨芽細胞又は骨芽細胞である場合、電気刺激ステップは、細胞を播種してから前駆細胞が成熟型骨芽細胞に分化するまでの間に行うことができる。

本実施形態の培養方法は、培地６を新しい培地に交換するステップを備えることができる（培地交換ステップ）。培地交換ステップは、準備培養ステップ後、電気刺激ステップ前に行うことができる。また、電気刺激ステップと培養ステップとを繰り返し行う場合、培地交換ステップは、培養ステップ後、電気刺激ステップ前に行うことができる。このことにより、培養ステップにおいて細胞７に栄養を十分に供給することができる。

培養分化実験
マウス由来の骨芽細胞前駆細胞であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて様々な実験条件（電気刺激ステップ）で培養分化実験を行った。
まず、α―ＭＥＭにウシ胎児血清を加えた培地をマルチウェルプレート（６ウェル）に入れ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス由来前駆骨芽細胞）を培地に播種した。その後、マルチウェルプレートに蓋を取り付けた後、３７℃、ＣＯ₂５％インキュベータ内にマルチウェルプレートを入れ、２４時間準備培養を行った（準備培養ステップ）。

次に、マルチウェルプレートをインキュベータから取り出し、各プレート底面に細胞が接着していることを確認した後、各ウェルの培地交換を行い、再びマルチウェルプレートをインキュベータへ戻し、静置した。その後、インキュベータ内でマルチウェルプレートの蓋を取り外し、図３に示したような電子放出ユニット２５をマルチウェルプレートに取り付けて、図１、２のような細胞刺激装置３０を形成した。そして、駆動用電圧源により電子放出素子５の表面電極４と下部電極２との間に駆動電圧Ｖ_d（１３．５Ｖ〜２２Ｖ）を印加し、ＤＣバイアス電圧源により電荷回収電極９と電子放出素子５との間に電圧Ｖ_e（６００Ｖ）を印加して（印加時間（照射時間）：１分間）、培地に対しイオン照射を行った（イオン照射密度：１〜４．６μＡ／ｃｍ²）（第１電気刺激ステップ）。
電子放出素子は、下部電極がアルミニウム基板であり、中間層が高分子―銀ナノ粒子複合層であり、表面電極が金電極であるものを用いた。また、用いた電子放出素子は、５ｍｍ×５ｍｍの電子放出領域２２を２つ有している。

次に、マルチウェルプレートから電子放出ユニットを取り外し、蓋をマルチウェルプレートに取り付け、インキュベータ内で細胞を２４時間培養した（第１培養ステップ）。
ここでは各ウェルの培地交換を行わずに、次のステップへと続けた。
次に、第１電気刺激ステップ同様にインキュベータ内において、マルチウェルプレートの蓋を取り外し電子放出ユニット２５をマルチウェルプレートに取り付けた。そして、駆動用電圧源により電子放出素子５の表面電極４と下部電極２との間に電圧Ｖ_dを印加し、ＤＣバイアス電圧源により電荷回収電極９と電子放出素子５との間に電圧Ｖ_eを印加した（第２電気刺激ステップ）。なお、第１及び第２電気刺激ステップの電圧印加条件は同じにした。

次に、マルチウェルプレートから電子放出ユニットを取り外し、蓋をマルチウェルプレートに取り付け、インキュベータ内で細胞を２４時間培養した（第２培養ステップ）。
その後、培養した細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲ実験（遺伝子：Ｃｏｌ１、ＳＰＰ１）を行い、細胞の分化を評価した。
また、培養した細胞の細胞数をカウントして、細胞の増殖を評価した。
また、比較のためのコントロールでは、第１及び第２電気刺激ステップを行わずに、準備培養ステップ、第１及び第２培養ステップを行った。

図４〜７に、様々なイオン照射密度で第１及び第２電気刺激ステップを行った実験（駆動電圧は１５Ｖ）のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。なお、ＲＴ−ＰＣＲ解析結果は、コントロールを１.０とする比較量として示している。駆動電圧を同じにした場合、第１及び第２電気刺激ステップのイオン照射密度が増加するに従い、Ｉ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１）の発現量は増加した。また、ＳＰＰ１遺伝子の発現量は、イオン照射密度を増加させても、顕著な増加は確認できなかった。このため、大きいイオン照射密度で電気刺激ステップを行うことにより、Ｉ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１）を発現させることができ、細胞の分化を引き起こす（分化のトリガーとなる）ことができることがわかった。また、電気刺激ステップによる細胞への刺激が前駆骨芽細胞の成熟型骨芽細胞への分化のトリガーとなるだけでなく、分化過程の後期まで誘導できることが示唆された。

図８〜１１に、様々な駆動電圧で第１及び第２電気刺激ステップを行った実験（イオン照射密度：１μＡ／ｃｍ²、２．４μＡ／ｃｍ²）のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。イオン照射密度を同じにした場合、Ｃｏｌ１遺伝子及びＳＰＰ１遺伝子の発現量は、第１及び第２電気刺激ステップの駆動電圧を約１５Ｖとしたときに大きくなることがわかった。

図１２に、様々な駆動電圧、イオン照射密度で第１及び第２電気刺激ステップを行った実験の細胞数カウント結果を示す。駆動電圧１３．５Ｖ、照射密度２．４μＡ／ｃｍ²で第１及び第２電気刺激ステップを行った場合、及び駆動電圧１５Ｖ、照射密度４．６μＡ／ｃｍ²で第１及び第２電気刺激ステップを行った場合、コントロールに比べ細胞数が多くなることがわかった。このため、適切な条件で細胞を刺激することにより、細胞の増殖の活性化を引き起こすことができることがわかった。
これらより分化させる細胞によって異なるが、駆動電圧が１３．５Ｖ以上１５Ｖ以下であることが好ましく、照射密度は、２．４μＡ／ｃｍ²以上４．６μＡ／ｃｍ²以下が好ましいことが判明した。

２： 下部電極 ３：中間層 ４：表面電極 ５、５ａ〜５ｆ：電子放出素子 ６：培地 ７：細胞 ８：気相 ９：電荷回収電極 １０：絶縁層 １２：培養容器 １３：絶縁性部材 １４：蓋部材 １６：表面電極用端子 １７：表面電極用リード線 ２０：下部電極用端子 ２２、２２ａ〜２２ｆ：電子放出領域 ２３：ネジ ２５：電子放出ユニット ３０：細胞刺激装置

Claims (9)

1. 表面電極と、前記表面電極の下方の下部電極と、前記下部電極と前記表面電極との間に配置された中間層とを備えた電子放出素子の前記下部電極と前記表面電極との間、及び前記電子放出素子と培地との間にそれぞれ電位差を生じさせることにより、前記電子放出素子から放出電子を気相に放出させ細胞を培養中の前記培地に前記気相を介して前記放出電子由来の電荷を照射する電気刺激ステップと、
   前記電気刺激ステップ後の前記培地において前記細胞を培養する培養ステップとを含み、
   前記電子放出素子からの前記放出電子に由来した前記培地中のイオン種及び前記電気刺激ステップにおいて副次的に生成された活性種が、前記細胞の増殖活性化又は分化を引き起こすことを特徴とする培養方法。
2. 前記電気刺激ステップは、前記培地に電荷を照射すると同時に電荷回収電極により前記培地の電荷を回収するステップである請求項１に記載の培養方法。
3. 前記電気刺激ステップは、前記電子放出素子から前記培地に電荷を照射することにより前記気相に生じる電流と、前記電荷回収電極が前記培地から電荷を回収することにより前記培地に生じる電流とがループ電流として流れるステップである請求項２に記載の培養方法。
4. 前記電気刺激ステップと前記培養ステップは、交互に繰り返し行われる請求項１〜３のいずれか１つに記載の培養方法。
5. 前記電気刺激ステップは、前記培地に電荷を照射する時間が５秒間以上１分間以下であるステップであり、１日間に少なくとも１回行われる請求項４に記載の培養方法。
6. 前記下部電極と前記表面電極との間に印加する電圧は、１３．５Ｖ以上１５Ｖ以下であり、
   前記電子放出素子から照射されるイオン照射密度は、２．４μＡ／ｃｍ²以上４．６μＡ／ｃｍ²以下である請求項１〜５のいずれか１つに記載の培養方法。
7. 前記細胞は、骨芽細胞又は骨芽細胞の前駆細胞であり、
   前記電気刺激ステップは、細胞を播種してから前記前駆細胞が成熟型骨芽細胞に分化するまでの間に行われる請求項１〜６のいずれか１つに記載の培養方法。
8. 前記電気刺激ステップは、細胞の播種から２４時間以内に行われる請求項１〜７のいずれか１つに記載の培養方法。
9. 培地を新しい培地に交換するステップをさらに備え、
   前記電気刺激ステップは、前記培地を交換するステップの後に行われる請求項１〜８のいずれか１つに記載の培養方法。