JP2019537576A - 神経変性疾患を処置するための遺伝子移入用組成物、遺伝子導入法、及び遺伝子導入の使用 - Google Patents

Abstract

哺乳動物におけるリソソーム蓄積障害を処置する方法であって、ポリペプチドをコードするＡＡＶ粒子を、哺乳動物の中枢神経系へと投与するステップを含む方法が提供される。ＡＡＶ粒子は、発現のために、直接的な注射により、脳、脊髄、脳脊髄液、又はこれらの部分へと送達することができる。【選択図】 図６

Description

[0002]遺伝子の移入は、細胞レベル及び分子レベルの両方において、生物学的イベント及び疾患過程を解析するための強力なツールとして今や広く認識されている。より近年では、遺伝子治療の、先天性のヒト疾患（例えば、ＡＤＡ欠損）又は後天性のヒト疾患（例えば、がん又は感染性疾患）の処置への適用が、多大な関心を集めている。

[0003]従来、遺伝子治療は、先天的な遺伝子エラーを修正するために、治療用遺伝子を、哺乳動物の細胞へと導入する手順として規定されてきた。４５００を超えるヒト疾患が、現在のところ、遺伝性疾患として分類されているが、これらの疾患のうちの比較的少数については、ヒトゲノム内の特異的突然変異が同定されている。近年までは、これらの希少な遺伝性疾患だけが、遺伝子治療の取組みの標的となっていた。したがって、現在までのところ、ＮＩＨに承認された遺伝子治療プロトコールの大半は、欠損した遺伝子の機能的なコピーの、公知の先天的な遺伝子エラーを有する個体の体細胞への導入へと方向づけられてきた。ごく近年になって、研究者及び臨床医は、大半のヒトがん、心血管疾患のある特定の形態、及び多くの変性疾患もまた、重要な遺伝子構成要素を有し、新規の遺伝子治療をデザインする目的で、「遺伝性障害」と考えるべきであることを理解し始めた。したがって、より近年では、遺伝子治療は、新たな遺伝情報の、罹患生物への導入を介する、疾患表現型の修正として、広く規定されている。

[0004]ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療では、移入される遺伝子を、ｉｎ ｓｉｔｕにおけるレシピエント生物の細胞、すなわち、レシピエントの体内の細胞へと導入する。ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療は、いくつかの動物モデルにおいて検討されている。近年のいくつかの刊行物は、ｉｎ ｓｉｔｕにおける、臓器並びに筋肉、造血幹細胞、動脈壁、神経系、及び肺などの組織への、直接的な遺伝子移入の実行可能性について報告している。骨格筋、心筋へのＤＮＡの直接的注射、及び血管系への、ＤＮＡ−脂質複合体の注射もまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、挿入された遺伝子産物（複数可）の、検出可能な発現レベルをもたらすことが報告されている。

[0005]中枢神経系の疾患、例えば、脳の先天性遺伝性疾患の処置は、依然として、解決の難しい問題であり続けている。このような疾患の例は、リソソーム蓄積症及びアルツハイマー病である。まとめると、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の発生数は、全世界で、出生１０，０００人中１人であり、症例のうちの６５％において、著明な中枢神経系（ＣＮＳ）の関与が見られる。これらの障害において欠損するタンパク質は、静脈内送達すると、血液脳関門を越えないか、脳へと直接送達する場合に広くは分布しない。したがって、ＣＮＳにおける欠陥のための治療を開発する必要がある。

[0006]本発明は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を有する霊長類動物を処置する方法及び使用を提供する。一実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶカプシドタンパク質と；ＡＡＶ ＩＴＲ（末端逆位配列、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）の対の間に挿入された核酸であり、リソソームヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸と；前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントとを含むＡＡＶ粒子を用意するステップであって、前記ＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の細胞に形質導入し、前記ポリペプチドの発現をもたらすことが可能であるステップと；ＡＡＶ粒子を、哺乳動物のＣＮＳへと投与又は送達するステップとを含む。

[0007]一実施形態では、ポリペプチドは、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）活性を有する。他の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＰＰ１、そのプロ酵素、又は酵素的に活性なその変異体を含む。さらなる実施形態では、核酸は、ＴＰＰ１活性を伴い、配列番号１として明示されたヒトＴＰＰ１に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする。なおさらなる実施形態では、核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト）ＴＰＰ１をコードする。

[0008]さらなる実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲのうちの１つ又は複数は、１つ又は複数のＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

[0009]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、ＣＭＶエンハンサーを含む。

[0010]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、ベータアクチンプロモーターを含む。

[0011]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、ニワトリベータアクチンプロモーターを含む。

[0012]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーターを含む。

[0013]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、配列番号３に明示されたＣＭＶエンハンサーに対して、８０％以上の同一性を有する配列、及び／又は配列番号３に明示されたニワトリベータアクチンプロモーターに対して、８０％以上の同一性を有する配列を含む。

[0014]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、配列番号３に対して、８０％以上の同一性を有する配列を含む。

[0015]ある特定の実施形態では、前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントは、配列番号３を含む。

投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 投与研究について、脳実質、ＣＳＦ、及び末梢組織における、ＴＰＰ１酵素レベルを示す図である。ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、ＣＬＮ２^＋／−動物の内因性レベル（赤線）と比較した組換えＴＰＰ１酵素である（統計学的解析：全ての群が、正規性検定に合格したわけではなかった。クルーカル−ワリス検定によるノンパラメトリック解析に続き、ダンの多重比較検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 吻側注射又は尾側注射の後における、脳脊髄液（ＣＳＦ）内のＴＰＰ１の発現の比較を示す図である。 吻側注射又は尾側注射の後における、線条体内のＴＰＰ１の発現を示す図である。 吻側注射又は尾側注射の後における、視床内のＴＰＰ１の発現を示す図である。 吻側注射又は尾側注射の後における、延髄内のＴＰＰ１の発現を示す図である。 吻側注射又は尾側注射の後における、小脳内のＴＰＰ１の発現を示す図である。 吻側注射又は尾側注射の後における、後頭皮質内のＴＰＰ１の発現を示す図である。 吻側注射又は尾側注射の後における、前頭前皮質内のＴＰＰ１の発現を示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量における注射の５週間後の、ＣＬＮ２^−／−の脳組織及び末梢組織における投与研究について、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１のゲノムコピーを示す図である。 ３つの用量におけるＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の５週間後の、１２週齢のＣＬＮ２^−／−マウスにおける投与研究について、振戦表現型の定量化を示す図である。Ａ）ヘルツ（Ｈｚ）単位の異なる振戦周波数における、デシベルボルト（ｄＢＶ）単位の振戦振幅のスペクトルパターンを示す図である。（Ｂ）振戦スペクトル（パネルＡによる）についての曲線下面積に続き、チューキーの多重比較検定を伴う、一元配置ＡＮＯＶＡを実施したことを示す図である（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ３つの用量におけるＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の５週間後の、１２週齢のＣＬＮ２^−／−マウスにおける投与研究について、振戦表現型の定量化を示す図である。Ａ）ヘルツ（Ｈｚ）単位の異なる振戦周波数における、デシベルボルト（ｄＢＶ）単位の振戦振幅のスペクトルパターンを示す図である。（Ｂ）振戦スペクトル（パネルＡによる）についての曲線下面積に続き、チューキーの多重比較検定を伴う、一元配置ＡＮＯＶＡを実施したことを示す図である（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＣＬＮ２^−／−マウスにおける、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１の注射の後の、安定性研究による、組換えＴＰＰ１の酵素活性を示す図である。 ＡＡＶ２ベクターの片側注射の後における、非ヒト霊長類動物のＣＳＦ中のＴＰＰ１レベル（タンパク質１ｍｇ当たりのピコモル単位のＴＰＰ１）を示す図である。脳室内のＣＡＧｈＴＰＰ１である。データは、時間経過にわたるＴＰＰ１レベルを表す。０日目とは、注射前における、ＴＰＰ１の内因性レベルを表す。Ｎ＝３匹の動物である。

[0028]本明細書では、本明細書で記載される方法を必要とする哺乳動物であって、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を有することが疑われるか、又はＬＳＤを有する哺乳動物へと投与するための方法及び使用が提示される。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法又は使用を使用して、ＬＳＤの１つ又は複数の症状の数、重症度、頻度、進行、又は発症を処置する、防止する、阻害する、低減する、減少させるか、又は遅延させる。

[0029]ＬＳＤの非限定例は、乳児リポフスチン症若しくは後期乳児神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ）、ゴーシェ病、若年性バッテン病、ファブリー病、ＭＬＤ、Ａ型サンフィリッポ病、後期乳児バッテン病、ハンター病、クラッベ病、モルキオ病、ポンペ病、Ｃ型ニーマン−ピック病、テイ−サックス病、ハーラー病（ＭＰＳ−Ｉ Ｈ）、Ｂ型サンフィリッポ病、マロトー−ラミー病、Ａ型ニーマン−ピック病、シスチン症、ハーラー−シャイエ病（ＭＰＳ−Ｉ Ｈ／Ｓ）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）、シャイエ病（ＭＰＳ−Ｉ Ｓ）、乳児バッテン病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＩＩ／ＩＩＩ型ムコ脂質症、又はサンドホフ病を含む。

[0030]ＬＳＤは、トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ１）酵素をコードする遺伝子内の遺伝子異常（例えば、突然変異、欠失、挿入）により引き起こされ、これにより、機能的なＴＰＰ１の酵素活性の欠損をもたらすことが多い。ヒトでは、ＴＰＰ１は、場合によって、ＴＰＰ１遺伝子とも呼ばれる、ＣＬＮ２遺伝子によりコードされる（例えば、配列番号２を参照されたい）。例えば、後期乳児神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ）は、大半は、ＣＬＮ２における突然変異に起因する、ＴＰＰ１活性の欠損により引き起こされることが多い、小児期の神経変性疾患である。発生は、２〜４歳まで正常であるが、その後、運動及び知能の低下、発作障害、並びに視覚における欠陥として、ＬＩＮＣＬの徴候が現れる。一般に、生後１０年以内に、死が訪れる。ＬＩＮＣＬの大半の場合は、可溶性リソソーム酵素トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ１）の欠損を誘導する、ＣＬＮ２内の突然変異に起因する。ＴＰＰ１は、マンノース−６−リン酸プロ酵素として合成され、他の可溶性リソソームヒドロラーゼと同様に、プロ酵素も、大部分は、リソソームへとターゲティングされるが、また、分泌経路を介して、細胞からも放出されうる。このようにして、同じ細胞又は近傍の細胞による、細胞への取込み、及び後続のリソソームへの送達、及びプロ酵素の、活性形態への活性化が生じうる。

[0031]本明細書では、ある特定の実施形態では、中枢神経系の組織又は体液へと、ＴＰＰ１活性を有するポリペプチドの発現を導くＡＡＶ粒子（本明細書では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子と称する）を、直接投与することにより、ＬＳＤを有するか、又はＬＳＤを有することが疑われる哺乳動物を処置する方法が提示される。本明細書では、リソソーム蓄積障害の動物モデルにおける、脳及び／又は脊髄への、ＡＡＶの送達／投与を示すデータが開示される。

[0032]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、前記哺乳動物の大槽、脳室内腔、脳室、くも膜下腔、髄内腔、及び／又は上衣へと投与する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）へと投与する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、脳室系へと投与する。なおさらなる実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、吻側側脳室へと投与する；及び／又は尾側側脳室へと投与する；及び／又は右側脳室へと投与する；及び／又は左側脳室へと投与する；及び／又は右吻側側脳室へと投与する；及び／又は左吻側側脳室へと投与する；及び／又は右尾側側脳室へと投与する；及び／又は左尾側側脳室へと投与する。

[0033]なおさらなる実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、ＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の上衣細胞に接触するように投与する。このような上衣は、コードされるポリペプチドを発現し、任意選択で、ポリペプチドを、これらの細胞は発現する。特定の実施形態では、ポリペプチドを、側脳室、ＣＳＦ、脳（例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、及び／又は前頭前皮質）、及び／又はＣＮＳにおいて、発現及び／又は分布させる。

[0034]本明細書で記載される方法又は使用により、任意の適切な哺乳動物を処置することができる。哺乳動物の非限定例は、ヒト、非ヒト霊長類動物（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクザルなど）、愛玩動物（例えば、イヌ及びネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、及び実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を含む。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、非齧歯類哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌなど）である。ある特定の実施形態では、非齧歯類哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢又は任意の発生段階（例えば、成体、若年体、小仔、乳仔、又は子宮内の哺乳動物）でありうる。哺乳動物は、雄の場合もあり、雌の場合もある。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、動物疾患モデル、例えば、ＬＩＮＣＬなど、ＬＳＤの研究のために使用される動物モデルでありうる。

[0035]本明細書で記載される方法又は組成物により処置される対象は、成体（１８歳以上）及び小児（１８歳未満）を含む。小児の年齢範囲は、１〜２歳、又は２〜４、４〜６、６〜１８、８〜１０、１０〜１２、１２〜１５、及び１５〜１８歳である。小児はまた、乳児も含む。乳児は典型的に、１〜１２カ月齢の範囲である。

[0036]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の、小型で非病原性のウイルスである。現在までのところ、多数の血清学的に区別されるＡＡＶが同定され、１ダースを超えるＡＡＶが、ヒト又は霊長類動物から分離されている。ＡＡＶは、複製のためのヘルパーウイルスに対するその依存性により、パルボウイルス科の他のメンバーから区別される。

[0037]ＡＡＶゲノムは、宿主細胞のゲノムへと、安定的に組み込まれ；広範な宿主範囲を有し；ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの、***細胞及び非***細胞の両方に形質導入し；形質導入された遺伝子の高レベルの発現を維持することが示されている。ＡＡＶウイルス粒子は、熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨ、温度の変化に対して耐性であり、ＣｓＣｌ勾配上で濃縮することもでき、他の手段により濃縮することもできる。ＡＡＶゲノムは、プラスセンス又はマイナスセンスの、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）を含む。ヘルパーウイルスの非存在下で、ＡＡＶは、遺伝子座特異的に、例えば、第１９染色体のｑアームへと組み込まれうる。ＡＡＶの約５ｋｂのゲノムは、極性がプラス又はマイナスである、一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造へとフォールディングすることが可能であり、ウイルスＤＮＡ複製の起点として用いられうる、短鎖ＩＴＲ（末端逆位配列、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）である。

[0038]ＡＡＶ「ゲノム」とは、ＡＡＶ粒子を形成するように、最終的にパッケージング又は封入される、組換え核酸配列を指す。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶゲノムを含むことが多い。組換えプラスミドを使用して、組換えベクターを構築又は製作する場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない、「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドの、この非ベクターゲノム部分を、「プラスミド骨格」と称するが、これは、繁殖及び組換えウイルスの作製に必要とされる工程である、プラスミドのクローニング及び増幅に重要であるが、それ自体は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子へと、パッケージングも封入もされない。したがって、ベクター「ゲノム」とは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によりパッケージング又は封入される核酸を指す。

[0039]ＡＡＶビリオン（粒子）は、直径約２５ｎｍ、非エンベロープ型の、正二十面体粒子である。ＡＡＶ粒子は、一緒に相互作用して、カプシドを形成する、３つの類縁のカプシドタンパク質である、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３から構成される、正二十面体対称のカプシドを含む。右側ＯＲＦは、カプシドタンパク質である、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードすることが多い。これらのタンパク質は、それぞれ、１：１：１０の比で見出されることが多いが、比は変動し、全ては、右側ＯＲＦに由来する。カプシドタンパク質は、代替的なスプライシング及び通常と異なる開始コドンの使用により、互いと異なる。欠失解析は、代替的にスプライシングされたメッセージから翻訳されたＶＰ１の除去又は変更が、感染性粒子の収量の低減を結果としてもたらすことを示した。ＶＰ３コード領域内の突然変異は、任意の一本鎖後代ＤＮＡ又は感染性粒子の産生の失敗を結果としてもたらす。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子のゲノムは、１つ、２つ、又は全てのＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド、及びＶＰ３ポリペプチドをコードする。

[0040]大半の天然ＡＡＶのゲノムは、場合によって、左側ＯＲＦ及び右側ＯＲＦと称する、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有することが多い。左ＯＲＦは、一本鎖後代ゲノムの産生に加えて、複製及び転写の調節に関与する非構造的Ｒｅｐタンパク質である、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、及びＲｅｐ７８をコードすることが多い。Ｒｅｐタンパク質のうちの２つは、ヒト第１９染色体のｑアームの領域への、ＡＡＶゲノムの優先的組込みと関連している。Ｒｅｐ６８／７８は、ＮＴＰ結合活性のほか、ＤＮＡヘリカーゼ活性及びＲＮＡヘリカーゼ活性を有することが示されている。一部のＲｅｐタンパク質は、核局在化シグナルのほか、いくつかの潜在的なリン酸化部位を有する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）のゲノムは、Ｒｅｐタンパク質の一部又は全部をコードする。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）のゲノムは、Ｒｅｐタンパク質をコードしない。ある特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質のうちの１つ又は複数は、トランスで送達することができ、したがって、ポリペプチドをコードする核酸を含むＡＡＶ粒子に含まれない。

[0041]ＡＡＶゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として用いられる、Ｔ字形ヘアピン構造へとフォールディングする潜在的可能性を有する、短鎖ＩＴＲ（末端逆位配列、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含む。したがって、ＡＡＶのゲノムは、その一本鎖ウイルスＤＮＡゲノムを挟む、１つ又は複数のＩＴＲ配列（例えば、ＩＴＲ配列の対）を含む。ＩＴＲ配列は、各々、約１４５塩基ずつを含むことが多い。ＩＴＲ領域内では、ＩＴＲの機能の中心であると考えられる、ＧＡＧＣリピートモチーフ及びｔｒｓ（末端分離部位、ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）という、２つのエレメントについて記載されている。リピートモチーフは、ＩＴＲが、直鎖状コンフォメーション又はヘアピンコンフォメーションである場合に、Ｒｅｐに結合することが示されている。この結合は、部位特異的及び鎖特異的に生じる、ｔｒｓにおける切断のために、Ｒｅｐ６８／７８を配置すると考えられる。それらの複製における役割に加えて、これらの２つのエレメントは、ウイルスの組込みにとって、中心的であると考えられる。Ｒｅｐ結合性部位は、隣接するｔｒｓと共に、第１９染色体の組込み遺伝子座に含有されている。これらのエレメントは、機能的であり、遺伝子座特異的組込みに必要であることが示されている。

[0042]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）は、２つのＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）は、ＩＴＲの対を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）は、ＴＰＰ１の酵素活性を有するポリペプチドを少なくともコードするポリヌクレオチドを挟む（すなわち、これらの各５’末端及び３’末端にある）ＩＴＲの対を含む。

[0043]「ベクター」という用語は、小型の担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入又は組込みにより操られうる他の媒体を指す。ＡＡＶなどのベクターを使用しポリヌクレオチドを細胞へと導入／移入して、その中のポリヌクレオチドが、細胞により、転写され、その後、翻訳されるようにすることができる。

[0044]「発現ベクター」とは、宿主細胞内の発現に必要とされる調節領域を伴う、遺伝子又は核酸配列を含有する、特化したベクターである。ベクターの核酸配列は、一般に、細胞内の繁殖のための、少なくとも複製起点を含有し、任意選択で、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、ポリアデニル化シグナルなど、さらなるエレメントも含有する。

[0045]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む、１つ又は複数の核酸エレメントに由来するか、又はこれに基づく。特定のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。また、ＴＰＰ１のポリペプチド、変異体、又は部分配列（例えば、ＴＰＰ１の酵素活性を有するポリペプチド断片）をコードする核酸配列を含むベクター（例えば、ＡＡＶ）も提供される。

[0046]組換えウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター又はパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターなど、ベクターの修飾語のほか、組換えポリヌクレオチド及び組換えポリペプチドなど、配列の修飾語としての「組換え」という用語は、組成物が、一般に、天然で生じない形で操られた（すなわち、操作された）ことを意味する。ＡＡＶベクターなど、組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムに通常存在しないポリヌクレオチドを、ウイルスゲノム内に挿入した場合であろう。組換えポリヌクレオチドの例は、ＴＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、遺伝子）を、５’領域、３’領域、及び／又は通常、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノム内で、遺伝子が、会合しないイントロン領域を伴うか、又は伴わずに、ベクターへとクローニングした場合であろう。本明細書では、「組換え」という用語は常に、ウイルスベクター及びＡＡＶベクターなどのベクターのほか、ポリヌクレオチドなどの配列にも言及して使用されるとは限らないが、ポリヌクレオチドを含む組換え形態は、任意のこのような省略にもかかわらず、明示的に含まれる。

[0047]組換えウイルス「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、分子的方法を使用して、野生型ゲノムをウイルス（例えば、ＡＡＶ）から取り出し、ＴＰＰ１をコードする核酸配列など、非天然核酸で置き換えることにより、ＡＡＶなど、ウイルスの野生型ゲノムから派生させる。ＡＡＶでは、ＡＡＶゲノムの一方又は両方のＩＴＲ（末端逆位配列、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列が、ＡＡＶベクターに保持されることが典型的である。ウイルスゲノムの全部又は一部は、ＴＰＰ１をコードする核酸配列など、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムの核酸に照らした、非天然配列で置き換えられているので、「組換え」ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムから識別される。したがって、非天然配列の組込みは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を、「組換え」ベクターと規定し、ＡＡＶの場合、これを、「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。

[0048]ＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、パッケージングすることができ、本明細書では、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏにおける、後続の細胞への感染（形質導入）のための、「ＡＡＶ粒子」と称する。組換えＡＡＶベクターを、ＡＡＶ粒子へと、封入又はパッケージングする場合、粒子はまた、「ｒＡＡＶ粒子」と称することもできる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子である。ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶベクター、又はその部分を含むことが多い。ｒＡＡＶ粒子は、１つ又は複数のＡＡＶ粒子（例えば、複数のＡＡＶ粒子）でありうる。ｒＡＡＶ粒子は、典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノム（例えば、カプシドタンパク質）を封入又はパッケージングするタンパク質を含む。

[0049]任意の適切なＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を、本明細書の方法又は使用のために使用することができる。ｒＡＡＶ粒子、及び／又はこれに含まれるゲノムは、ＡＡＶの、任意の適切な血清型又は株に由来しうる。ｒＡＡＶ粒子、及び／又はこれに含まれるゲノムは、ＡＡＶの、２つ以上の血清型又は株に由来しうる。したがって、ｒＡＡＶは、ＡＡＶの任意の血清型又は株の、タンパク質及び／若しくは核酸、又はこれらの部分を含むことが可能であり、この場合、ＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞への感染及び／又は形質導入に適する。ＡＡＶ血清型の非限定例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０、又はＡＡＶ−２ｉ８を含む。ある特定の実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、同じ株又は血清型（又は亜群若しくは変異体）の粒子を含むか、又はこれらに由来する。ある特定の実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、２つ以上の、異なるｒＡＡＶ粒子（例えば、異なる血清型及び／又は株）の混合物を含む。

[0050]本明細書で使用される「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型から、血清学的に区別されるカプシドを有するＡＡＶを指すのに使用される区別である。血清学的に区別されるものであることは、抗体間の、１つのＡＡＶに対する、別のＡＡＶと比較した交差反応性の欠如に基づき決定される。このような交差反応性の差違は、通例、カプシドタンパク質配列／抗原性決定基の差違に起因する（例えば、ＡＡＶ血清型の、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、及び／又はＶＰ３配列の差違に起因する）。基準のＡＡＶ血清型又は他のＡＡＶ血清型から、血清学的に区別されえない可能性にもかかわらず、カプシド変異体を含むＡＡＶ変異体は、基準のＡＡＶ血清型又は他のＡＡＶ血清型と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基だけ異なる。

[0051]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ある特定の血清型を除外する。一実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４粒子ではない。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４と、抗原的に、又は免疫学的に区別される。区別は、標準的な方法により決定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が、ＡＡＶ４と、抗原的に、又は免疫学的に区別されるのかどうかを決定することができる。さらに、ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ４と区別される組織指向性を保持する。

[0052]ある特定の実施形態では、第１の血清型ゲノムに基づくｒＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数の血清型と同一である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするＡＡＶカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数の血清型と区別されるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）の血清型ゲノムに基づきうる。例えば、ｒＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶ２由来の核酸（例えば、ＩＴＲ）を含みうるのに対し、３つのカプシドタンパク質のうちの、少なくとも１つ又は複数は、異なる血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、若しくはＡＡＶ−２ｉ８の血清型、又はこれらの変異体に由来する。

[0053]当技術分野で公知の（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）、適切な組換え法を使用して、ポリペプチドの発現を導くポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶベクターを作出することができる。組換えＡＡＶベクターは、典型的に、形質導入コンピテントのＡＡＶ粒子へとパッケージングし、ＡＡＶウイルスパッケージング系を使用して繁殖させる。形質導入コンピテントのＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞に結合し、これに進入し、その後、核酸カーゴ（例えば、異種遺伝子）を、細胞の核へと送達することが可能である。したがって、形質導入コンピテントである、無傷のＡＡＶ粒子を、哺乳動物細胞に形質導入するように構成する。哺乳動物細胞に形質導入するように構成されたＡＡＶ粒子は、複製コンピテントではないことが多く、自己複製するのに、さらなるタンパク質機構を要求する。したがって、哺乳動物細胞に形質導入するように構成されるＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞に結合し、これに進入し、核酸を、細胞へと送達するように操作するが、この場合、送達のための核酸は、ＡＡＶゲノム内の、ＡＡＶ ＩＴＲの対の間に配置されることが多い。

[0054]形質導入コンピテントのＡＡＶ粒子を作製するのに適する宿主細胞は、異種ｒＡＡＶベクターのレシピエントとして使用されうるか、又は使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない。安定性のヒト細胞株である２９３（例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを介して、たやすく入手可能）に由来する細胞を使用することができる。ある特定の実施形態では、５型アデノウイルスのＤＮＡ断片で形質転換され、アデノウイルスのＥ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子を発現する、改変ヒト胎児腎細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）を使用して、組換えＡＡＶ粒子を作出する。改変ＨＥＫ２９３細胞株は、たやすくトランスフェクトされ、ｒＡＡＶ粒子を作製するのに、特に簡便なプラットフォームを提供する。当技術分野では、哺乳動物細胞に形質導入することが可能な、高力価のＡＡＶ粒子を作出する方法が公知である。例えば、ＡＡＶ粒子は、Ｗｒｉｇｈｔ、２００８及びＷｒｉｇｈｔ、２００９において明示されている通りに作ることができる。

[0055]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターによるトランスフェクションの前に、又はこれと同時に、宿主細胞に、ＡＡＶヘルパー構築物をトランスフェクトすることにより、ＡＡＶヘルパー機能を、宿主細胞へと導入する。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、場合によって、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子及び／又はｃａｐ遺伝子の、少なくとも一過性の発現をもたらして、生産的なＡＡＶ形質導入に必要なＡＡＶ機能の逸失を補完するのに使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、それ自身を複製することも、パッケージングすることもできないことが多い。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態でありうる。Ｒｅｐ及びＣａｐ両方の発現産物をコードする、一般に使用されるプラスミドである、ｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５など、多数のＡＡＶヘルパー構築物について記載されている。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐの発現産物をコードする、他の多数のベクターが公知である。

[0056]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子、又は基準血清型と類縁である、そのベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８の粒子のポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は部分配列に対して、少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一な配列を含むか、又はこれからなるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はこれらの部分配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子、又は基準血清型と類縁である、そのベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８の血清型のカプシド配列又はＩＴＲ配列に対して、少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一な配列を含むか、又はこれからなるカプシド配列又はＩＴＲ配列を有する。

[0057]ある特定の実施形態では、本明細書の方法は、ＡＡＶ２粒子の使用を含む。特定の態様では、ＡＡＶ２粒子は、組換えＡＡＶ２粒子である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、天然ＡＡＶ２粒子又は野生型ＡＡＶ２粒子の、対応するカプシドタンパク質に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％以上同一な、例えば、８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大で１００％同一な、１つ又は複数のカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、天然ＡＡＶ２粒子又は野生型ＡＡＶ２粒子の、対応するカプシドタンパク質に対して少なくとも７５％以上同一な、例えば、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大で１００％同一な、ＶＰ１カプシドタンパク質、ＶＰ２カプシドタンパク質、及びＶＰ３カプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、天然ＡＡＶ２粒子又は野生型ＡＡＶ２粒子の変異体である。一部の態様では、ＡＡＶ２変異体の、１つ又は複数のカプシドタンパク質は、天然ＡＡＶ２粒子又は野生型ＡＡＶ２粒子のカプシドタンパク質（複数可）と比較して、１、２、３、４、５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０以上のアミノ酸置換を有する。

[0058]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子（例えば、ＡＡＶ２粒子のカプシド）は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、なお又は１００％の同一性を有するＶＰ１ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、約６３％以上同一（例えば、６３％の同一性）である、ＶＰ１ポリペプチドを含む。ＡＡＶ２カプシド配列と、ＡＡＶ４カプシド配列とは、約６０％同一である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドに対して、少なくとも６５％の同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドを含む。

[0059]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、それらが、１つ又は複数の、所望のＩＴＲ機能（例えば、ＤＮＡの複製を可能とする、ヘアピンを形成する能力；ＡＡＶ ＤＮＡの、宿主細胞ゲノムへの組込み；及び／又は所望の場合のパッケージング）を保持する限りにおいて、天然又は野生型のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０、又はＡＡＶ−２ｉ８の、対応するＩＴＲに対して、少なくとも７５％以上同一な、例えば、８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大で１００％同一な、１つ又は２つのＩＴＲ（例えば、ＩＴＲの対）を含む。

[0060]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、それらが、１つ又は複数の、所望のＩＴＲ機能（例えば、ＤＮＡの複製を可能とする、ヘアピンを形成する能力；ＡＡＶ ＤＮＡの、宿主細胞ゲノムへの組込み；及び／又は所望の場合のパッケージング）を保持する限りにおいて、天然ＡＡＶ２粒子又は野生型ＡＡＶ２粒子の、対応するＩＴＲに対して、少なくとも７５％以上同一な、例えば、８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大で１００％同一な、１つ又は２つのＩＴＲ（例えば、ＩＴＲの対）を含む。

[0061]ｒＡＡＶ粒子は、任意の適切な数の「ＧＡＧＣ」リピートを有するＩＴＲを含みうる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２粒子のＩＴＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０以上の「ＧＡＧＣ」リピートを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、３つの「ＧＡＧＣ」リピートを含むＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、４つ未満の「ＧＡＧＣ」リピートを有するＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、４つを超える「ＧＡＧＣ」リピートを有するＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子のＩＴＲは、Ｒｅｐ結合性部位を含み、この場合、最初の２つの「ＧＡＧＣ」リピート内の第４のヌクレオチドは、ＴではなくＣである。

[0062]任意の適切な長さのＤＮＡを、ＡＡＶ粒子へと組み込むことができる。ｒＡＡＶベクターにおける使用に適するＤＮＡ分子は、約５キロベース（ｋｂ）、約５ｋｂ未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、又は約２．５ｋｂ未満でありうる。

[0063]本明細書では、「トランス遺伝子」は、細胞若しくは生物へと導入されることが意図されるか、又は細胞若しくは生物へと導入された核酸を、簡便に指すように使用される。トランス遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、ＴＰＰ１）をコードし、一般に、天然のＡＡＶゲノム配列に照らして異種である遺伝子など、任意の核酸を含む。

[0064]トランス遺伝子を有する細胞には、トランス遺伝子を、ｒＡＡＶ粒子などのベクターにより、導入／移入することが多い。ｒＡＡＶ粒子による、トランス遺伝子の、細胞への導入は、細胞への「形質導入」と称することが多い。「形質導入する」という用語は、ベクター（例えば、ＡＡＶ粒子）による、核酸などの分子の、細胞又は宿主生物への導入を指す。トランス遺伝子は、形質導入された細胞のゲノム核酸へと、組み込まれる場合もあり、組み込まれない場合もある。レシピエントの細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）へと組み込まれる場合、導入された核酸は、この細胞又は生物において、安定的に維持され、レシピエントの細胞又は生物の、後代細胞又は後代生物へとさらに受け渡されるか、又は受け継がれる。最後に、導入された核酸は、レシピエントの細胞又は宿主生物の細胞外に存在する場合もあり、一過性に存在するに過ぎない場合もある。「形質導入された細胞」とは、形質導入により、トランス遺伝子が導入された細胞である。したがって、「形質導入された」細胞とは、核酸が導入された細胞、又は核酸が導入されたその後代である。形質導入された細胞は、繁殖させることができ、導入されたタンパク質を発現させることもでき、核酸を転写することもできる。遺伝子治療のための使用及び方法では、形質導入された細胞は、哺乳動物における細胞である。

[0065]ＴＰＰ１は、ＣＬＮ２遺伝子（ＴＰＰ１遺伝子）によりコードされる、リソソームセリンプロテアーゼである。ヒトＴＰＰ１のアミノ酸配列は、配列番号１として明示される。ヒトＴＰＰ１の核酸配列は、配列番号２として明示される。ヒトＴＰＰ１は、トリペプチジルペプチダーゼＩ活性（ＴＰＰ１の酵素活性）を含む。ＴＰＰ１活性は、リソソームプロテイナーゼにより産生される分解産物から、トリペプチドを発生させる、非特異的リソソームペプチダーゼ活性を含む。基質特異性研究は、ＴＰＰ１が、主に、トリペプチドを、ペプチド及びタンパク質の非置換アミノ末端から切断することを指し示す。内因的に発現するＴＰＰ１は、触媒的に不活性の酵素として合成される。リソソームへとターゲティングした後、酸性環境のために、ＴＰＰ１は、成熟の活性酵素へと、自己触媒的にプロセシングされる。ＴＰＰ１の活性は、公知の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、測定及び／又は定量化することができる。例えば、Ｊｕｎａｉｄら、１９９９を参照されたい。

[0066]ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドとは、適切なペプチド基質を使用してアッセイされる、例えば、Ｊｕｎａｉｄら、１９９９の方法、又は別の同等な方法によりアッセイされる、配列番号１のヒトＴＰＰ１のペプチダーゼ活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は約１００％を提示する、哺乳動物のＴＰＰ１タンパク質、又はその部分を指す。ある特定の実施形態では、ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドとは、配列番号１のヒトＴＰＰ１のペプチダーゼ活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は約１００％を提示する、哺乳動物のＴＰＰ１タンパク質、又はその部分配列若しくは変異体を指す。

[0067]ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドは、少なくとも部分的なＴＰＰ１活性を保持する、ＴＰＰ１ポリペプチドの切断形態、突然変異形態、キメラ形態、又は修飾形態を含みうる。ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドは、任意の適切な生物から（例えば、哺乳動物、ヒト、非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ブタ、ウシなどから）得られた、ＴＰＰ１タンパク質、又はその部分を含みうる。ある特定の実施形態では、ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドは、配列番号１に明示されたＴＰＰ１タンパク質に対して、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は１００％の同一性を有する。

[0068]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドをコードする核酸とを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＴＰＰ１活性を含むポリペプチドの発現及び／又は分泌を導く核酸とを含む。

[0069]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＴＰＰ１ポリペプチド、又はその酵素的活性部分をコードする核酸とを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＴＰＰ１ポリペプチド、又はその酵素的活性部分の発現及び／又は分泌を導く核酸とを含む。ある特定の実施形態では、投与される核酸は、野生型ＴＰＰ１、及び／又はＴＰＰ１の変異体、突然変異体、若しくは断片に対して、実質的な同一性を有するＴＰＰ１である、ＴＰＰ１をコードする。ある特定の実施形態では、ＴＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に明示されたタンパク質に対して、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は１００％の同一性を有する。

[0070]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２に明示された核酸に対して、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は１００％の同一性を有する核酸を含む。ある特定の実施形態では、ＴＰＰ１活性をコードするか、又はＴＰＰ１ポリペプチドをコードするか、若しくはＴＰＰ１ポリペプチドの発現を導く核酸は、配列番号２に明示された核酸に対して、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は１００％の同一性を有する核酸である。

[0071]代表的なヒトＴＰＰ１アミノ酸配列を、配列番号１に描示する。代表的なヒトＴＰＰ１核酸配列を、配列番号２に描示する。

[0072]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物へと投与又は送達するステップと、任意選択で、１種又は複数の免疫抑制剤を、哺乳動物へと投与するステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物へと投与又は送達するステップと、任意選択で、２種、３種、４種以上の免疫抑制剤を、哺乳動物へと投与するステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物へと投与又は送達するステップと、任意選択で、２種の免疫抑制剤を、哺乳動物へと投与するステップとを含む。代表的な一実施形態では、哺乳動物を処置する方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物へと投与又は送達するステップと、第１の免疫抑制剤及び第２の免疫抑制剤を、哺乳動物へと投与するステップとを含む。

[0073]２種以上の免疫抑制剤を投与する場合、各免疫抑制剤は、区別される、及び／又は異なる（例えば、各薬剤は、構造及び／又は作用機構が異なる）。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、抗炎症剤である。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、ミコフェノレート、又はその誘導体である。このようなミコフェノレートの誘導体の例は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）である。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリン又はその誘導体である。ある特定の実施形態では、第１の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含み、第２の免疫抑制剤は、ミコフェノレート、又はその誘導体（例えば、ＭＭＦ）を含む。ある特定の実施形態では、第１の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含み、第２の免疫抑制剤は、ＭＭＦを含む。

[0074]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の前に、投与時に、及び／又は投与の後で投与する。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与と同時に投与する。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の後で投与する。

[0075]ある特定の実施形態では、第１の免疫抑制剤を、哺乳動物へと、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の、少なくとも約１〜約７日間前に、又はこの約１、約２、約３、約４、若しくは約５週間前に投与し、第２の免疫抑制剤を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の、約１〜約７日間前、約１、約２、約３、約４、若しくは約５週間前に、投与時に、及び／又は投与後約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約３５０、約４００、若しくは約５００日以内に投与する。ある特定の実施形態では、シクロスポリンを、哺乳動物へと、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の、少なくとも約１〜約７日間前に、又はこの約１、約２、約３、約４、若しくは約５週間前に投与し、ミコフェノレート又はその誘導体（例えば、ＭＭＦ）を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の、約１〜約７日間前、約１、約２、約３、約４、若しくは約５週間前に、投与時に、及び／又は投与後約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約３５０、約４００、若しくは約５００日以内に投与する。ある特定の実施形態では、シクロスポリンを、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の投与の、約１〜約７日間前に、又は約１、約２、約３、約４、若しくは約５週間前に、及び処置後に定期的な間隔で投与し、ミコフェノレート又はその誘導体（例えば、ＭＭＦ）を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の、約１〜約７日間前、約１、約２、約３、約４、若しくは約５週間前に、投与時に、及び／又は投与後約１０〜約４０日以内に投与する。

[0076]免疫抑制剤は、任意の適切な用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、シクロスポリンを、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約５〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量、１日１回、２回、又は３回〜隔日１回の頻度で投与する。ある特定の実施形態では、シクロスポリンを、約１０ｍｇ／ｋｇで、１日２回投与する。ある特定の実施形態では、シクロスポリンを、１日２回、約１０ｍｇ／ｋｇで、少なくとも約１、約２、約３、約４、又は約５カ月間にわたり投与する。ある特定の実施形態では、シクロスポリンの投与量を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与又は使用の、約１〜約２カ月後に、約５ｍｇ／ｋｇ未満又は約２ｍｇ／ｋｇ未満の用量へと減らす。

[0077]ある特定の実施形態では、ミコフェノレート又はその誘導体（例えば、ＭＭＦ）を、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約５〜約２０ｍｇ／ｋｇの投与量、１日１回、２回、又は３回〜隔日１回の頻度で投与する。ある特定の実施形態では、ミコフェノレート又はその誘導体（例えば、ＭＭＦ）を、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇで、１日１回投与する。ある特定の実施形態では、ミコフェノレート又はその誘導体（例えば、ＭＭＦ）の投与量を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、哺乳動物への投与の、約１〜約２カ月後に、約５ｍｇ／ｋｇ未満又は約２ｍｇ／ｋｇ未満の用量へと低減する。

[0078]ｒＡＡＶ粒子及び／又は免疫抑制剤は、特定の投与経路に適する、任意の適する製剤に製剤化することができる。多様な薬学的に許容される製剤が市販されており、医療従事者に得ることができる。

[0079]ｒＡＡＶ粒子は、任意の適切な経路により投与することができる。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物（例えば、ＬＳＤを有する哺乳動物）の中枢神経系（ＣＮＳ）へと投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系は、脳、脊髄、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物の脳又は脊髄又はＣＳＦへと投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、脳又は脊髄の部分へと投与する。

[0080]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、前記哺乳動物の大槽、脳室内腔、脳室、くも膜下腔、髄内腔、及び／又は上衣のうちの１つ又は複数へと投与する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）へと投与する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、脳室系へと投与する。なおさらなる実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、吻側側脳室、尾側側脳室、右側脳室、左側脳室、右吻側側脳室、左吻側側脳室、右尾側側脳室、及び／又は左尾側側脳室のうちの１つ又は複数へと投与する。

[0081]免疫抑制剤は、任意の適切な経路により投与することができる。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤を、経口投与する。ある特定の実施形態では、ミコフェノレート、又はミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）など、その誘導体、を、経口投与する。ある特定の実施形態では、シクロスポリンを、経口投与する。免疫抑制剤はまた、非経口（例えば、筋内、静脈内、皮下）投与することもでき、脳、脊髄、又はこれらの部分への注射により投与する（例えば、ＣＳＦへと注射する）こともできる。

[0082]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子と、任意選択で、免疫抑制剤とを含む組成物を、哺乳動物の大槽、並びに／又は哺乳動物の脳室、くも膜下腔、及び／若しくは髄内腔、並びに／又は上衣のうちの１つ又は複数へと投与する。例えば、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子は、大槽、脳室内腔、脳室、くも膜下腔、髄内腔、及び／又は上衣へと、直接送達することができる。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物の上衣へと投与するステップを含む。

[0083]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、例えば、細胞を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子と接触させることにより、哺乳動物における、１つ又は複数のＣＳＦに接触する細胞へと投与する。ＣＳＦに接触する細胞の非限定例は、上衣細胞、軟膜細胞、内皮細胞、及び／又は髄膜細胞を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、上衣細胞へと投与する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、例えば、上衣細胞を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子と接触させることにより、上衣細胞へと送達する。

[0084]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、局所送達する。「局所送達」とは、哺乳動物の標的部位への、直接の（例えば、組織又は体液への、直接の）活性薬剤の送達を指す。例えば、薬剤は、直接的な注射により、臓器、組織、又は指定された解剖学的位置へと、局所送達することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、直接的な注射により、脳、脊髄、又はこれらの組織若しくは体液（例えば、上衣細胞、軟膜細胞、内皮細胞、及び／又は髄膜細胞などのＣＳＦ）へと送達又は投与する。例えば、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子は、直接的な注射により、ＣＳＦ、大槽、脳室内腔、脳室、くも膜下腔、及び／若しくは髄内腔、並びに／又は上衣へと直接送達することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、脳又は脊髄の組織又は体液への、直接的な注射により、脳又は脊髄の、組織、体液、又は細胞へと送達する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、例えば、静脈内、皮下、若しくは筋内注射、又は静脈内注入により、全身送達しない。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、定位注射により、脳又は脊髄の組織又は体液へと送達する。

[0085]ある特定の実施形態では、１つ又は複数のＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の直接的な注射により、脳、脊髄、又はこれらの組織若しくは体液（例えば、上衣などのＣＳＦ）へと送達又は投与する。特定の態様では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子は、上衣細胞、軟膜細胞、内皮細胞、及び／又は髄膜細胞に形質導入する。

[0086]ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子の有効量は、経験的に決定することができる。投与は、処置のコースを通して、１回又は複数回の投与により、連続的に行うこともでき、間欠的に行うこともできる。投与の有効用量は、当業者により決定されうるが、ＡＡＶ血清型、ウイルス力価、並びに処置される哺乳動物の体重、状態、及び種に従い変動しうる。単回投与及び複数回投与は、主治医により選択される、用量レベル、標的、及びタイミングで実行することができる。複数回投与は、例えば、十分な酵素活性を維持するのに要求される通りに投与することができる。

[0087]ある特定の実施形態では、複数のＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を投与する。本明細書で使用される、複数のＡＡＶ粒子とは、粒子約１×１０^５〜約１×１０^１８個を指す。

[0088]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子を、約１〜約５ｍｌにおいて、１ｍｌ当たり約１×１０^５〜約１×１０^１６ｖｇの用量で；１ｍｌ当たり１×１０^７〜約１×１０^１４ｖｇによる、約１〜約３ｍｌの用量で；又は１ｍｌ当たり約１×１０^８〜約１×１０^１３ｖｇによる、約１〜約２ｍｌの用量で投与する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子を、処置される哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約１×１０^８〜約１×１０^１５ｖｇの用量で投与する。例えば、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子は、処置される哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約１×１０^８ｖｇ、約５×１０^８ｖｇ、約１×１０^９ｖｇ、約５×１０^９ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇ、約５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇ、約５×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ、約５×１０^１２ｖｇ、約１×１０^１３ｖｇ、約５×１０^１３ｖｇ、約１×１０^１４ｖｇ、約５×１０^１４ｖｇ、又は約１×１０^１５ｖｇの用量で投与することができる。

[0089]ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子の注射又は注入に適する医薬形態は、任意選択で、リポソームに封入された、滅菌注射用溶液又は滅菌注入用溶液又は滅菌分散液の即席の調製に適合させた、滅菌水溶液又は滅菌分散液を含みうる。いずれの場合においても、最終形態は、滅菌流体であり、製造、使用、及び保管の条件下で、安定的であるものとする。液体担体又は媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性のグリセリルエステル、及びこれらの適切な混合物を含む、溶媒又は液体分散媒でありうる。適正な流体性は、例えば、リポソームの形成により維持することもでき、分散液の場合には、要求された粒子サイズの維持により維持することもでき、界面活性剤の使用により維持することもできる。等張剤、例えば、糖、緩衝液、又は塩（例えば、塩化ナトリウム）も、含めることができる。注射用組成物の遅延吸収は、組成物中の、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらすことができる。

[0090]ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子の溶液又は懸濁液は、任意選択で、以下の成分：注射用水、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）などの生理食塩液溶液、人工ＣＳＦ、固定油、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、グリセリン、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などの、抗菌剤及び抗真菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなど、張性を調整するための薬剤を含む。

[0091]ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子、及びそれらの組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化することができる。本明細書で使用される単位剤形とは、処置される個体のための単位用量として適する、物理的に個別の単位；要求される医薬担体と会合して、所望の治療的効果をもたらすように計算された、所定の数量の活性化合物を含有する各単位を指す。単位剤形は、所望の効果（複数可）をもたらすのに必要であると考えられる、ｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子）の量に依存する。必要な量は、単一の用量で製剤化することもでき、複数の投与量単位で製剤化することもできる。用量は、任意選択で、抗炎症剤と組み合わせて、適切なｒＡＡＶ粒子濃度に調整し、使用のためにパッケージングすることができる。

[0092]一実施形態では、医薬組成物は、治療有効量、すなわち、問題の疾患状態の症状を、低減若しくは改善するのに十分な量、又は所望の利益を付与するのに十分な量をもたらすのに十分な遺伝子素材（ｒＡＡＶ粒子）を含むであろう。医薬組成物は、典型的に、薬学的に許容される賦形剤を含有する。このような賦形剤は、それ自体は、組成物を施される個体に対して有害な抗体の産生を誘導せず、不要な毒性を伴わずに投与しうる、任意の医薬剤を含む。薬学的に許容される賦形剤は、ソルビトール、トゥイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、並びに水、生理食塩液、グリセロール、及びエタノールなどの液体を含むがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩もそれに含めることができる。加えて、このような媒体には、保湿剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質も存在しうる。薬学的に許容される賦形剤についての完全な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９１において、入手可能である。

[0093]ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子を含有する製剤は、媒体に、有効量のｒＡＡＶ粒子を含有し、有効量は、当業者によりたやすく決定されるであろう。ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子は、典型的に、組成物のうちの、約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲の場合もあり、適切であれば、さらにより高比率の場合もある。投与される数量は、処置について検討される哺乳動物対象又はヒト対象の、年齢、体重、及び身体状態などの因子に依存する。有効投与量は、用量反応曲線を確立する、常套的な試験を介して、当業者により確立されうる。

[0094]ある特定の実施形態では、方法は、複数のＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子などのｒＡＡＶ粒子を、本明細書で明示される哺乳動物（例えば、ＬＩＮＣＬなどのＬＳＤを有する哺乳動物）へと投与するステップを含み、ＬＳＤの１つ又は複数の症状の、重症度、頻度、進行、又は発症時を、減少させる、低減する、防止する、阻害するか、又は遅延させる。「発症時」という用語は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子の、初回の投与の後の時点であって、ＬＳＤの症状が、最初に観察又は検出される時点を指す。ＬＳＤの１つ又は複数の症状の重症度、頻度、進行、又は発症時を、減少させる、低減する、防止する、阻害するか、又は遅延させる場合の、ＬＳＤの非限定的な症状は、固有感覚反応、眼振、威嚇瞬目反応、瞳孔対光反射、小脳性運動失調、及び企図振戦を含む。ＬＳＤの１つ又は複数の症状の、重症度、頻度、進行、又は発症時は、標準化された臨床的神経学的検査（例えば、Ｌｏｒｅｎｚら、２０１１を参照されたい）により、主観的に決定することができる。

[0095]ＬＳＤと関連する症状の発症時の遅延は、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を伴って処置された哺乳動物について、症状の発症時を、ＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を伴わずに処置された、１つ又は複数の哺乳動物と比較することにより決定することができる。ある特定の実施形態では、方法は、複数のＡＡＶ−ＴＰＰ１粒子を、哺乳動物（例えば、ＬＳＤを有する哺乳動物）の中枢神経系、又はその部分へと投与するステップを含み、ＬＳＤの１つ又は複数の症状の、重症度、頻度、進行、又は発症時を、減少させる、低減する、防止する、阻害するか、又は少なくとも約５〜約１０、約１０〜約２５、約２５〜約５０、若しくは約５０〜約１００日間遅延させる。

[0096]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ粒子を、哺乳動物の脳若しくは脊髄、又はこれらの部分へと投与するステップを含み、ｒＡＡＶ粒子を、哺乳動物の細胞に形質導入し、哺乳動物における、ＴＰＰ１活性を有するポリペプチドの発現を導くように構成する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを、１つ又は複数の末梢臓器内で（例えば、脾臓内及び／又は心臓内で）発現させる、及び／又は検出する。

[0097]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ粒子を、哺乳動物の脳若しくは脊髄、又はこれらの部分へと投与するステップを含み、ｒＡＡＶ粒子を、哺乳動物の脳細胞又は脊髄細胞に形質導入し、哺乳動物の脳又は脊髄における、ＴＰＰ１活性を有するポリペプチドの発現を導くように構成する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを、投与部位に対して遠位である、中枢神経組織（例えば、脳、例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、前頭前皮質）内で発現させる、及び／又は検出する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、投与部位から離れた分布を反映する中枢神経組織（例えば、脳、例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、及び／又は前頭前皮質）内で、広く、存在するか、又は検出され、任意選択で、中枢神経組織（例えば、脳、例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、及び／又は前頭前皮質）内の全体で、存在するか、又は検出される。

[0098]本明細書では、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）、並びにこれらのポリマーを含む、核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指すように、互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライシングされているｍＲＮＡ又はスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び阻害性ＤＮＡ又は阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子ＲＮＡ若しくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ若しくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、天然のポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及び意図的に修飾又は変更されたポリヌクレオチド（例えば、変異体核酸）を含みうる。ポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、三重鎖の場合もあり、直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、任意の適切な長さでありうる。ポリヌクレオチドについて論じる場合、本明細書では、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造を、配列を、５’〜３’方向で提示する慣行に従い記載することができる。

[0099]ポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むことが多い。そうでないことが指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、縮重コドン置換も含む。

[0100]核酸は、オープンリーディングフレームに作動可能に連結された、１つ又は複数の発現制御エレメント又は調節エレメントを含むことが可能であり、この場合、１つ又は複数の調節エレメントは、哺乳動物細胞内のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドの転写及び翻訳を導くように構成される。発現制御／調節エレメントの非限定例は、転写開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックスなど）、翻訳開始配列、ｍＲＮＡ安定性配列、ポリＡ配列、分泌配列などを含む。発現制御／調節エレメントは、任意の適切な生物のゲノムから得ることができる。非限定例は、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ即初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）など、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、合成のプロモーター、ハイブリッドプロモーターなどを含む。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子など、非ウイルス遺伝子に由来する配列もまた、本明細書で使用されるであろう。例示的な構成的プロモーターは、ある特定の構成的機能又は「ハウスキーピング」機能をコードする、以下の遺伝子のためのプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、及び当業者に公知の他の構成的プロモーターを含む。加えて、多くのウイルスプロモーターは、真核細胞内でも構成的に機能する。これらは、中でも、ＳＶ４０の初期プロモーター及び後期プロモーター；モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）；並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。したがって、上記で言及した構成的プロモーターのうちのいずれかを使用して、異種遺伝子インサートの転写を制御することができる。

[0101]誘導可能なプロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤の存在下でだけ、又は誘導剤の存在下で、大きな程度発現する（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下における転写は、ある特定の金属イオンの存在下で、大幅に増大する）。誘導可能なプロモーターは、それらの誘導性因子が結合すると、転写を刺激する、応答性エレメント（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、及び環状ＡＭＰに対するＲＥが存在する。誘導可能な応答を得るために、特定のＲＥを含有するプロモーターを選び出すことができ、場合によって、ＲＥそれ自体を、異なるプロモーターへと接続させ、これにより、組換え遺伝子へと、誘導可能性を付与することもできる。したがって、適切なプロモーター（誘導可能なプロモーターと対比される構成的プロモーター；弱いプロモーターと対比される、強いプロモーター）を選択することにより、遺伝子改変細胞内のポリペプチドの存在及び発現レベルの両方を制御することが可能である。ポリペプチドをコードする遺伝子が、誘導可能なプロモーターの制御下にある場合、ｉｎ ｓｉｔｕにおけるポリペプチドの送達は、遺伝子改変細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、ポリペプチドの転写を可能とする条件へと曝露することにより、例えば、薬剤の転写を制御する誘導可能なプロモーターの特異的誘導剤を、腹腔内注射することにより誘発される。例えば、ｉｎ ｓｉｔｕにおける、メタロチオネインプロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされるポリペプチドの、遺伝子改変細胞による発現は、遺伝子改変細胞を、適切な（すなわち、誘導をもたらす）金属イオンを含有する溶液と、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて接触させることにより増強される。

[0102]核酸は、別の核酸配列との機能的な関係に置かれた場合、「作動可能に連結され」ている。ポリペプチドをコードする核酸、又はＴＰＰ１ポリペプチド（例えば、ＴＰＰ１活性を有するポリペプチド）の発現を導く核酸は、コードされるポリペプチドの転写を制御するための、誘導可能なプロモーター又は組織特異的プロモーターを含みうる。

[0103]ある特定の実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーター、ＣＮＳ特異的エンハンサー、又は誘導可能なプロモーター、エンハンサーなどを、本明細書で記載される方法において利用する。ＣＮＳ特異的プロモーターの非限定例は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来する遺伝子から単離されたプロモーターを含む。誘導可能なプロモーターの非限定例は、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素状態、及びＩＦＮに対するＤＮＡ応答性エレメントを含む。

[0104]ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、ＣＭＶエンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、ベータアクチンプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、ニワトリベータアクチンプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーターを含む。

[0105]ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、配列番号３に明示されたＣＭＶエンハンサーに対して、８０％以上の同一性を有する配列、及び／又は配列番号３に明示されたニワトリベータアクチンプロモーターに対して、８０％以上の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、配列番号３に対して、８０％以上の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、配列番号３を含む。

[0106]ポリペプチドは、送達のために、細胞外位置、細胞内位置、又は膜位置へとターゲティングすることができる。細胞から分泌される遺伝子産物は、典型的に、細胞から、細胞外環境への分泌のための、分泌「シグナル」を有する。発現ベクターはまた、分泌「シグナル」を含むようにも構築することができる。遺伝子産物はまた、細胞にも保持されうる。同様にして、遺伝子産物が、ポリペプチドを細胞膜にアンカリングするための、「保持」シグナル配列を含む場合もあり、これを含むように、発現ベクターを構築する場合もある。例えば、膜タンパク質は、タンパク質を、膜に維持する、疎水性の膜貫通領域を有する。

[0107]本明細書で使用される、「〜を修飾する」又は「変異体」及びこれらの文法的変化形は、核酸、ポリペプチド、又はこれらの部分配列が、基準配列から逸脱することを意味する。したがって、修飾配列及び変異体配列は、基準配列と実質的に同じであるか、これを超えるか、又はこれ未満の、発現、活性、又は機能を有しうるが、基準配列の、部分的な活性又は機能を、少なくとも保持する。変異体の特定の種類は、突然変異、例えば、ＴＰＰ１内のミスセンス突然変異又はナンセンス突然変異を有する遺伝子によりコードされるタンパク質を指す、突然変異体タンパク質である。

[0108]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」の変異体とは、野生型と比較して、遺伝子的に変更された、修飾配列を指す。配列は、コードされるタンパク質配列を変更せずに遺伝子改変することができる。代替的に、配列は、変異体タンパク質、例えば、変異体ＴＰＰ１タンパク質をコードするように遺伝子改変することができる。核酸又はポリヌクレオチドの変異体はまた、野生型タンパク質配列などの基準配列との、少なくとも部分的な配列同一性を依然として保持するタンパク質をコードするように修飾されたコドンを有し、また、変異体タンパク質をコードするようにもコドン修飾された組合せ配列も指す場合がある。例えば、このような核酸変異体の、一部のコドンを、これによりコードされるＴＰＰ１タンパク質のアミノ酸を変更せずに変化させ、また核酸変異体の、一部のコドンを変化させ、これによりコードされるＴＰＰ１タンパク質のアミノ酸を変化させる。

[0109]本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質及びその断片を含む。したがって、本明細書では、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは、互換的に使用されることが多い。本明細書で開示される「核酸」配列又は「ポリヌクレオチド」配列によりコードされる「ポリペプチド」は、ポリペプチドが、ある程度のＴＰＰ１の酵素活性を保持する限りにおいて、天然の野生型タンパク質及び機能的な多形タンパク質、これらの機能的な部分配列（断片）、並びにこれらの修飾形態又は配列変異体と同様に、部分的な天然ＴＰＰ１配列又は全長の天然ＴＰＰ１配列を含む。したがって、本発明の方法では、核酸配列によりコードされる、このようなポリペプチドは、欠如しているか、又は処置される哺乳動物における発現が、不十分であるか、若しくは欠損する、内因性タンパク質であるか、これと同一でありうるが、これと同一であることを要求されない。

[0110]ポリペプチド内のアミノ酸変化は、対応する核酸配列のコドンを変化させることにより達成することができる。このようなポリペプチドは、生物学的活性を修飾又は改善するために、ポリペプチド構造内の、ある特定のアミノ酸で、他のアミノ酸を置換することに基づき得ることができる。例えば、代替的なアミノ酸の置換を介して、小さなコンフォメーション変化をポリペプチドに付与する結果として、活性の増大をもたらすことができる。代替的に、ある特定のポリペプチドにおけるアミノ酸置換を使用して、残基をもたらし、次いで、他の分子へと連結して、他の目的に有用となるのに十分な、出発ポリペプチドの特性を保持する、ペプチド−分子コンジュゲートをもたらすことができる。

[0111]ポリペプチドに対する、相互作用性の生物学的機能を付与するのに、アミノ酸の疎水性親水性指数を使用することができ、この場合、同様な疎水性親水性指数を有し、同様な生物学的活性を依然として保持する、ある特定のアミノ酸で、他のアミノ酸を置換しうることが見出される。代替的に、特に、生物学的機能が、免疫学的実施形態において意図される使用のためにポリペプチド内において生じることが所望される場合、類似のアミノ酸による置換は、親水性に基づいても行うことができる。その隣接するアミノ酸の親水性により統御される、「タンパク質」の、最大の局所平均親水性は、その免疫原性と相関する。したがって、各アミノ酸へと割り当てられる親水性に基づき、置換を行いうることが分かる。

[0112]各アミノ酸へと、値を割り当てる、親水性指数又は疎水性親水性指数を使用する場合、これらの値が、±２である場合に、アミノ酸の置換を行うが、±１が典型的であり、±０．５以内の場合の置換が、最も典型的な置換である。

[0113]修飾の非限定例は、１つ又は複数の、ヌクレオチド置換又はアミノ酸置換（例えば、約１〜約３、約３〜約５、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、約２５〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約２５０、約２５０〜約５００、約５００〜約７５０、約７５０〜約１０００以上の、ヌクレオチド又は残基）を含む。核酸修飾の、１つの非限定例は、コドンの最適化である。

[0114]アミノ酸修飾の例は、保存的なアミノ酸の置換又は欠失である。特定の実施形態では、修飾配列又は変異体配列（例えば、ＴＰＰ１）は、非修飾配列（例えば、野生型ＴＰＰ１）の機能又は活性の少なくとも一部を保持する。

[0115]「核酸断片」とは、所与の核酸分子の部分である。生物の大部分におけるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が、遺伝子素材であるのに対し、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡに含有された情報の、タンパク質への移動に関与する。開示されるヌクレオチド配列、及びこれによりコードされるタンパク質又は部分長のタンパク質の断片及び変異体もまた、本発明に包含される。「断片」又は「部分」とは、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする、全長若しくは全長未満のヌクレオチド配列、又はポリペプチド若しくはタンパク質の、全長若しくは全長未満のアミノ酸配列を意味する。ある特定の実施形態では、断片又は部分は、生物学的に機能的（すなわち、野生型ＴＰＰ１の酵素活性のうちの、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％を保持する）である。

[0116]分子の「変異体」とは、天然分子の配列と実質的に同様な配列である。ヌクレオチド配列では、変異体は、遺伝子コードの縮重のために、天然タンパク質の、同一なアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらの変異体など、天然の対立遺伝子変異体は、分子生物学法の使用により、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション法により同定することができる。変異体のヌクレオチド配列はまた、例えば、天然タンパク質をコードする部位指向突然変異誘発のほか、アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする部位指向突然変異誘発を使用することにより作出されるヌクレオチド配列など、合成により導出されたヌクレオチド配列も含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、天然（内因性）ヌクレオチド配列に対する、少なくとも４０％、５０％、６０％〜７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％〜７９％、一般に、少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％〜９８％の配列同一性を有するであろう。ある特定の実施形態では、変異体は、生物学的に機能的（すなわち、野生型ＴＰＰ１の酵素活性のうちの、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％を保持する）である。

[0117]特定の核酸配列の、「保存的に修飾された変異」とは、同一なアミノ酸配列又は本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の、機能的に同一な核酸が、所与の任意のポリペプチドをコードする。例えば、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧという全てのコドンは、アミノ酸であるアルギニンをコードする。したがって、コドンによりアルギニンが指定される、あらゆる位置において、コドンを、コードされるタンパク質を変更せずに、記載される、対応するコドンのうちのいずれかへと変更することができる。このような核酸変異は、「保存的に修飾された変異」のうちの１種である、「サイレント変異」である。本明細書で記載される、あらゆる核酸配列であって、ポリペプチドをコードする核酸配列はまた、そうでないことに言及される場合を除き、あらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、標準的な技法により、機能的に同一な分子をもたらすように、核酸内の各コドン（通例、メチオニンの唯一のコドンである、ＡＴＧを除く）を修飾しうることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の、各「サイレント変異」は、記載される各配列に潜在する。

[0118]ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを使用して記載される、アライメントプログラムのうちの１つを使用して、基準配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、若しくは７９％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、若しくは８９％、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％、なお又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの配置などを考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の、対応する同一性を決定するように、これらの値を、適切に調整しうることを認識するであろう。これらを目的とする、アミノ酸配列の実質的な同一性とは、通常、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、なお又は少なくとも９５％の配列同一性を意味する。

[0119]ポリペプチドの文脈における、「実質的な同一性」という用語は、ポリペプチドが、基準配列に対して、指定された比較域にわたり、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、若しくは７９％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、若しくは８９％、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％、なお又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を伴う配列を含むことを指し示す。２つのポリペプチド配列が、実質的に同一であることの指標は、１つのポリペプチドが、第２のポリペプチドに対して惹起された抗体と、免疫学的に反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが、保存的置換だけで異なる場合に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。

[0120]本明細書で使用される「約」という用語は、基準値（±）１０％以内の値を指す。

[0121]「〜を処置する」及び「処置」という用語は、治療的処置、及び予防的又は防止的措置の両方を指し、目的は、がんの発症若しくは拡大など、所望されない生理学的変化若しくは障害を防止する若しくは減少させることである。本発明の目的で、有益な臨床的結果又は所望の臨床的結果は、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の症状又は状態の安定化（すなわち、増悪又は進行させないこと）、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は軽減、及び検出可能なものであれ、検出不能なものであれ、寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を施されない場合に予測される生存と比較した、生存の延長も意味しうる。処置を必要とする人は、状態若しくは障害を既に伴う人のほか、状態若しくは障害を有する傾向がある人、又は状態若しくは障害が防止される人を含む。

[0122]本明細書において、そうでないことが指し示されるか、又は文脈により、明らかに反対のことが述べられない限りにおいて、「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」及び「その」という用語、並びに同様な指示対象は、本発明について記載する文脈では、単数形及び複数形の両方を対象とすると解釈される。したがって、例えば、「ベクター」への言及は、複数のこのようなベクターを含み、「ウイルス」又は「粒子」への言及は、複数のこのようなビリオン／粒子を含み、「ＡＡＶ粒子又はｒＡＡＶ粒子」への言及は、複数のこのようなＡＡＶ粒子又はｒＡＡＶ粒子を含む。

[0123]「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を有すること」、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「〜を含有すること」という用語は、そうでないことが注記されない限りにおいて、オープンエンドの用語である（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で、そうでないことが指し示されない限りにおいて、範囲内に収まる、各個別の値に、個別に言及する簡便法として用いられることだけを意図するものであり、各個別の値は、本明細書で、個別に記載された場合と同様に、本明細書へと組み込まれる。

[0124]本明細書で引用される、全ての出願、刊行物、特許、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋへの言及、並びにＡＴＣＣへの言及は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。齟齬が生じた場合は、定義を含む本明細書により管理する。

[0125]本明細書において、そうでないことが指し示されるか、又は文脈により、明らかに反対のことが述べられない限りにおいて、本明細書で記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提示される、任意の例及び全ての例、又は例示的表現（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく例示することだけを意図するものであり、そうでないことが主張されるのでない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されない要素を、本発明の実施に不可欠なものとして指し示すものとして解釈されるべきではない。

[0126]そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施又は試行では、本明細書で記載される方法及び材料と同様又は同等な方法及び材料を使用しうるが、本明細書では、適切な方法及び材料について記載する。

[0127]本明細書で開示される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示される各特徴は、同じ目的、同等な目的、又は同様な目的を果たす、代替的な特徴で置き換えることができる。したがって、そうでないことが明示的に表されない限りにおいて、開示される特徴は、同等な特徴又は同様な特徴の属についての例である。

[0128]文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、全ての数値又は数値範囲は、このような範囲内の整数と、範囲内の値又は整数の分数とを含む。したがって、例示のために述べると、８０％以上の同一性に対する言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％などのほか、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％などを含む。

[0129]より多く（これを超える）、又はこれ未満を伴う整数に対する言及は、それぞれ、基準数を超えるか、又はこれ未満の、任意の数を含む。したがって、例えば、１００未満に対する言及は、９９、９８、９７など、数１までの全ての数を含み、１０未満に対する言及は、９、８、７など、数１までの全ての数を含む。
[0130]文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての数値又は範囲は、値の分数と、このような範囲内の整数と、このような範囲内の整数の分数とを含む。したがって、例示のために述べると、１〜１０などの数値範囲に対する言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のほか、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５などを含む。したがって、１〜５０の範囲に対する言及は、最大で５０であり、これを含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などのほか、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。

[0131]範囲の連鎖に対する言及は、連鎖内の異なる範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。したがって、例示のために述べると、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００の範囲の連鎖に対する言及は、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００などの範囲を含む。

[0132]本明細書では、多数の実施形態及び態様について記載する、肯定的な表現を使用して、本発明について、一般に開示する。本発明はまた、とりわけ、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順など、特定の対象物を、完全に、又は部分的に除外した実施形態も含む。例えば、本発明の、ある特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップを除外する。したがって、本明細書では一般に、本発明を、本発明が含まないものとの関係では表さないが、にもかかわらず、本明細書では、本発明において明示的に除外されるわけではない態様も、開示される。

[0133]本明細書では、本発明の実施形態について記載する。前出の記載を読んだ当業者には、これらの実施形態の変動が明らかとなりうる。本発明者らは、当業者が、このような変動を、適切なものとして利用することを予期し、本発明者らは、本発明が、本明細書で、特殊な形で記載されたのとは別の形で実施されることを意図する。したがって、本発明は、本明細書に付属の特許請求の範囲において記載される対象物の、全ての改変及び均等物を、関連法規により許容されるものとして含む。さらに、本明細書において、そうでないことが指し示されるか、又は文脈により、明らかに反対のことが述べられない限りにおいて、その全ての可能な変動における要素の任意の組合せも、本発明により包含される。したがって、以下の例は、特許請求される本発明の範囲を限定するのではなく、これを例示することを意図する。

実施例１
[0134]ヒトＴＰＰ１配列
ヒトＴＰＰ１タンパク質配列（配列番号１）：
MGLQACLLGLFALILSGKCSYSPEPDQRRTLPPGWVSLGRADPEEELSLTFALRQQNVERLSELVQAVSDPSSPQYGKYLTLENVADLVRPSPLTLHTVQKWLLAAGAQKCHSVITQDFLTCWLSIRQAELLLPGAEFHHYVGGPTETHVVRSPHPYQLPQALAPHVDFVGGLHHFPPTSSLRQRPEPQVTGTVGLHLGVTPSVIRKRYNLTSQDVGSGTSNNSQACAQFLEQYFHDSDLAQFMRLFGGNFAHQASVARVVGQQGRGRAGIEASLDVQYLMSAGANISTWVYSSPGRHEGQEPFLQWLMLLSNESALPHVHTVSYGDDEDSLSSAYIQRVNTELMKAAARGLTLLFASGDSGAGCWSVSGRHQFRPTFPASSPYVTTVGGTSFQEPFLITNEIVDYISGGGFSNVFPRPSYQEEAVTKFLSSSPHLPPSSYFNASGRAYPDVAALSDGYWVVSNRVPIPWVSGTSASTPVFGGILSLINEHRILSGRPPLGFLNPRLYQQHGAGLFDYTRGCHESCLDEEVEGQGFCSGPGWDPVTGWGTPNFPALLKTLLNP
ヒトＴＰＰ１核酸配列（配列番号２）：

[0135]ＡＡＶベクターの作製：ＣＭＶ早期エンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下で、ヒトＴＰＰ１を発現させる、組換えＡＡＶ４ベクターは、標準的な三重トランスフェクション法及びＣｓＣｌ勾配の遠心分離による精製を使用して作出した（Ｗｒｉｇｈｔ、２００８；Ｗｒｉｇｈｔ、２００９）。力価は、ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びＰＣＲの後における、銀染色により定量化した（Ｗｒｉｇｈｔ、２００８；Ｗｒｉｇｈｔ、２００９）。
ＣＡＧプロモーター配列（配列番号３）：

種類 始点 終点 記載
その他の特徴 １ １６７２ ／注＝ＣＡＧプロモーター
調節的 ２２ ３２７ ／注＝ＣＭＶエンハンサー
プロモーター ３２８ ６０５ ／注＝ニワトリベータ−アクチンプロモーター
イントロン ６０７ １６２４ ／注＝キメライントロン、／注＝ニワトリベータ−アクチンに由来するイントロンと、ウサギベータ−グロビンに由来するイントロンとの間のキメラ
調節的 １５２８ １６７２ ／注＝予測される転写因子部位
調節的 １５７５ １６７２ ／注＝アイオワ予測による転写因子結合性部位
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA

実施例２
[0136]組織試料中のＴＰＰＩ活性：ＴＰＰ１活性は、既に記載された改変法（Ｓｏｈａｒ，Ｉ．ら、２０００、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、４６：１００５〜８）を使用してアッセイした。略述すると、試料を、実験室用ホモジナイザー（Ｐ２００；Ｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＣＴ）により、２００μｌの氷冷ホモジナイゼーション緩衝液（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を伴う、通常の生理食塩液において、０．１％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））においてホモジナイズした。不溶性物質は、２１×１０^３ｒｃｆ、４℃で、１５分間にわたる遠心分離により、ホモジネートから除去し、上清中のタンパク質含量は、ＤＣプロテインアッセイ（ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により定量化した。タンパク質（１０μｌ）を、酵素基質と共に、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のトリトンＸ−１００（ｐＨ４．０）による９０μｌを含有する、９６ウェルブラックウォールプレートのウェルへと添加した（クエン酸ナトリウム緩衝液中の２５０μｍｏｌ／ｌのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ７−アミド−４−メチルクマリン、ｐｈ４．０）。プレートは、３７℃で、励起波長を３５５±９ｎｍとし、発光波長を４６０±１５ｎｍとし、スペクトラマックスＭ５（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量化した。精製された組換えヒトＴＰＰ１（Ｐ．Ｌｏｂｅｌ、Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＮＪからの恵与）を、標準物質として使用した。

[0137]脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＴＰＰＩ活性。ＴＰＰ１プロ酵素を、Ｔｉａｎ，Ｙ．ら、２００６、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８１：６５５９〜７２において記載されている通りに活性化させた。同じ研究群内の動物に由来するＣＳＦをプールし、１００ｍＭの酢酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のトリトンＸ−１００（ｐＨ４．０）による同じ容量と共に、室温で、一晩にわたりインキュベートした。活性化ＴＰＰ１は、組織試料中と同様に定量化した。

[0138]ＡＡＶベクターの脳室内投与。動物に、完全に麻酔をかけた。注射部位を剃毛し、マウスを、Ｋｏｐｆ製の定位具に載せ、ノーズコーンを介して、２％のイソフルラン／酸素混合物を、持続的に施した。切開前に、鎮痛剤（メロキシカム、１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。手術中の眼の乾燥を防止するために、眼科用軟膏を、局所適用した。０．４インチ３３ＧＡ Ｈａｍｉｌｔｏｎ）注射針を伴う、１０又は２５μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを、被験物質を２０回にわたり吸引及び駆出することによりプライミングし、被験物質を廃棄した。シリンジに、未使用の被験物質をロードし、次いで、注射器（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）へとロードした。切開部位を清浄化した。注射部位は、泉門から計算し（＋０．３ｍｍの前方、−１．０ｍｍの側方）、次いで、頭蓋に、穿頭孔を設けた。次いで、被験物質を伴う注射針を、脳の表面から、−２．０ｍｍの深さへと下ろし、被験物質を、２００ｎｌ／分の速度で注入し、注射針を、注入後５分間にわたり留置してから、引き上げた。切開部は、非吸収性結紮を使用して閉止させた。麻酔からの覚醒前に、鎮痛剤（ブピバカインＨＣｌ、０．５％）を局所適用して、手術後の疼痛及び不快感を軽減した。

[0139]振戦アッセイ。正常マウスと、ＣＬＮ２^−／−マウスとの間では、酵素置換療法により防止されうる、振戦振幅の差違が観察されている（Ｃｈａｎｇ，Ｍ．ら、２００８、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１６：６４９〜５６；Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈ．ら、２００９、 Ｎａｔ Ｍｅｄ、１５：１２１５〜８）。本研究のために、注射の５週間後の動物において、振戦アッセイを実施した。研究に組み入れられる、野生型マウス及び注射されないＣＬＮ２^−／−マウスは、対照として用いられた。振戦アッセイは、トレマーモニターシステム（Ｔｒｅｍｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により実行した。トレマーモニタリングシステムとは、音の減衰及び視覚的隔絶をもたらすキャビネットであって、圧電型センサーを伴うプラットフォームに設置された円筒型筐体を装備したキャビネットである。このセンサーは、動物の振戦を、電流へと変換する。シグナルは、トレマーモニターの装置ベイにおいて増幅され、記録のために、コンピュータへと送信される。記録は、１秒当たり、１２８例の試料でなされ、２００〜２０６ｍＶのゲインをもたらした。３分間にわたる馴化の後、５分後に、動物の振戦を記録した。振戦シグナルは、周波数（Ｈｚ）に対する振幅（ｄＢＶ）として定量化した。統計学的解析は、二元配置ＡＮＯＶＡに続く、事後検定としての、シダックの多重比較検定から構成された。

[0140]ＣＳＦの回収。動物を、イソフルラン誘導チャンバーに入れ、完全に麻酔がかかり、ペダルによる応答を呈さなくなるまで、２．５％のイソフルラン／酸素混合物へと曝露した。注射部位を剃毛し、マウスを、ＲＷＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）製の定位具に載せ、ノーズコーンを介して、２％のイソフルラン／酸素混合物を、持続的に施した。大槽上の膜を、頸部及び皮膚に沿った切開により露出させ、頸部の筋肉を分離した。ガラス製の毛細管を、大槽へと挿入し、ＣＳＦを、毛細管現象により、２０分間にわたり回収した。

[0141]ＣＳＦ回収の後、肝臓が、明るいコーヒー色となるまでの、２０ｍｌの氷冷ＰＢＳを伴う経心腔的灌流により安楽死させる前に、及び安楽死させる時に、動物を、５％のイソフルラン／酸素ミックスで沈静させた。解剖後解析のために、組織を採取した。回収の直後に、全ての組織試料を、瞬時凍結させ、−８０℃で保管した。

[0142]ＡＡＶベクターの生体内分布。キアゲンＤＮＡエクストラクター（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡを、瞬時凍結された脳組織及び末梢組織から回収した。ＤＮＡ １ｍｇ当たりのＡＡＶ４コピー数は、各試料について、ベクター特異的配列に対するＱ−ＰＣＲにより、三連で決定した。フォワードプライマーのプローブ配列（５’−ＦＡＭ／ＡＴＴＧＴＣＣＡＡ／ＺＥＮ／ＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＴ／３ＩＡＢｋＦＱ）、及びリバースプライマーのプローブ配列（ＣＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＡＧＧＣＴＣＴＡ）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成された。１０μｌの反応物（５．５μｌのマスターミックス＋４．５μｌの試料）を、９５℃で１０分間に続き、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の３９サイクルにわたり、ＣＦＸ３８４リアルタイムシステム（ＣＦＸ３８４ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にかけた。ＡＡＶ４ヒトＴＰＰ１プラスミドＤＮＡから作成された検量線を使用して、試料に由来するＡＡＶ４ゲノムコピー数を計算した（１ｍｌ当たりのコピー数１０×１０^３〜１０×１０^１０）。最終的なＡＡＶ４ゲノムコピー（ｖｇ）／試料中のｍｇ単位のＤＮＡを、式：
ＤＮＡ １ｍｇ当たりのＡＡＶ４ゲノムコピー数（ｖｇ）＝２×（１ｍｌ当たりのＡＡＶ４コピー数）_試料／（１ｍｌ当たりのｍｇ単位のＤＮＡ）_試料
により計算した。

[0143]前出の式中の補正係数である２は、検量線のために使用されたｄｓＤＮＡプラスミドから、ＡＡＶ４ベクター内のｓｓＤＮＡへの変換を補正するためのものである。

実施例３
[0144]ＴＰＰ１を発現しない、ＣＬＮ２ノックアウト（ＣＬＮ^−／−）マウスモデルを使用して、用量反応研究及び安定性研究を実施した。用量反応研究は、注射時において、５〜８週齢の間のマウス３０例（雌１６例、雄１４例）を組み入れた。安定性研究は、注射時において、６〜８週齢の間のマウス１４例（雌７例、雄７例）を組み入れた。

[0145]マウスに、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１を、１×１０^１０、５×１０^１０、又は１×１０^１１の用量で、上記の通り、右側脳室の吻側面へと注射した。マウス用の定位固定装置を使用して、注射を実施し、泉門点からの注射座標は、Ｇ．Ｐａｘｉｎｏｓ及びＫ．Ｂ．Ｊ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ（２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００１）によるマウス用の定位脳アトラスを使用して、軟膜から、＋０．３ｍｍの前方、−１ｍｍの側方、−２ｍｍの深さとして固定した。この注射点を、「吻側注射」と呼んだ（図１Ａ〜図１Ｈ及び図２Ａ〜図２Ｇ）。

[0146]投与研究のために、被験物質を、１０μｌにおいて１×１０^１０ｖｇ、１０μｌ（ＲＶＣ３０２）において５×１０^１０ｖｇ、及び１５μｌにおいて１×１０^１１ｖｇの漸増用量で注射し；マウスを、注射後５週間にわたり保持した。安定性研究のために、全ての動物に、５×１０^１０ｖｇを注射し、注射の３、９、又は１２週間後に安楽死させた。

[0147]被験物質を融解させ、脳室内注射の直前に、賦形剤で希釈した。賦形剤は、ＰＢＳ１８０−Ｆ６９ ｐＨ７．４（０．０１ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．１８ＭのＮａＣｌ、０．００１％のプルロニックＦ−６８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８））であった。

[0148]投与研究では、安楽死の前に、マウスを、振戦挙動についてアッセイした。いずれの研究でも、氷冷ＰＢＳによる心腔内灌流の前に、脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収し、群内でプールした。脳組織（線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、及び前頭前皮質）、心臓、脾臓、肝臓、及び腎臓を、分子的解析のために回収した。組織試料及びＣＳＦを、酵素活性定量化アッセイ及び／又は生体内分布アッセイのために使用した。

[0149]両方の研究のための注射の５週間後、動物に麻酔をかけ、脳脊髄液（ＣＳＦ）を、大槽から回収した。

[0150]安楽死の後、氷冷ＰＢＳを伴う心腔内灌流により、血液を除去し、両方の脳半球に由来する、異なる脳領域（ＣＳＦ、線条体、視床、延髄、小脳、後頭皮質、及び前頭前皮質、図１Ａ〜図１Ｈ及び図２Ａ〜図２Ｇ）を、ＴＰＰ１活性アッセイによるＴＰＰ１定量化、及びＱＰＣＲによるＡＡＶ４生体内分布解析のために回収した。

[0151]座標を変更することによる、上衣形質導入の改善について解析するため、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧ ｈＴＰＰ１を、側脳室の、より尾側の点（泉門から；−２．１８ｍｍの前方、−２．９ｍｍの側方、骨から−３．５ｍｍの深さ）へと注入した。これらの動物に由来する試料を、「尾側注射」と言及する。試料を、ＴＰＰ１活性アッセイによる、ＴＰＰ１定量化のために、上記の通りに回収した。

[0152]尾側注射及び吻側注射について、異なる脳領域（ＣＳＦ、線条体、視床、延髄、小脳、後頭皮質、及び前頭前皮質）内の、ＴＰＰ１の発現を、図２Ａ〜図２Ｇに示す。

実施例４
[0153]投与研究の概要。ヒトＴＰＰ１（ｈＴＰＰ１）酵素活性アッセイを、ＣＳＦ試料、脳試料、及び末梢試料に対して行った。ＣＳＦを、各処置群内の、全ての動物からプールした。結果は、内因性のマウスＴＰＰ１レベル（タンパク質１ｍｇ当たり０．３４ピコモル；図３）と比べて、明確な用量反応を示す。組換えＴＰＰ１レベルは、１×１０^１０、５×１０^１０、及び１×１０^１１ｖｇの用量それぞれについて、タンパク質１ｍｇ当たり０．８３、１２．６６、及び６３．７０ピコモルのＴＰＰ１であった。

[0154]解析した大半の脳領域において、組換えＴＰＰ１レベルは、内因性マウスのＴＰＰ１より高度であり、実質内濃度は、用量依存的に増大した。しかし、前頭前皮質は、用量依存的増大を提示しなかった。前頭前皮質は、注射部位から、最も遠い脳領域を表し、上衣細胞を欠く。前頭前皮質を例外として、高用量動物の全ては、内因性ＴＰＰ１レベルを有意に上回る、組換えＴＰＰ１レベルを有した。

[0155]死後生体内分布解析は、上衣細胞を含有する、実質パンチ内のＡＡＶ４ウイルスゲノムを明らかにした。高用量動物のうちの４例は、皮質領域に、ウイルスゲノムを有した。ウイルスゲノムはまた、第４脳室内の上衣細胞においても見出された。脳全体にわたる、ウイルスベクターの広範な分布は、注射体積の脳室体積に対する比が高いことに起因しうるであろう。この場合、マウス脳室系は、１５μｌの体積を有し（図１）、注射された体積は、低用量群及び中用量群では、１０μｌであり、高用量群では、１５μｌであった。

[0156]末梢組織内の、死後ウイルス生体内分布解析は、主に、低用量群及び高用量群の脾臓内で、ＡＡＶ４ゲノムを提示した（図４）。ウイルスゲノムは、両方の群の腎臓内、及び高用量群の心臓内では、より低レベルで見出された。中用量群の末梢組織内では、ＡＡＶ４ウイルスゲノムが見出されなかった。

[0157]ＣＬＮ２^−／−マウスは、１２週間後から、振戦活動の上昇と、疾患の進行とを提示する（Ｃｈａｎｇ，Ｍ．、Ｊ．Ｄ．Ｃｏｏｐｅｒ、Ｄ．Ｅ．Ｓｌｅａｔ、Ｓ．Ｈ．Ｃｈｅｎｇ、Ｊ．Ｃ．Ｄｏｄｇｅ、Ｍ．Ａ．Ｐａｓｓｉｎｉ、Ｐ．Ｌｏｂｅｌ、及びＢ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ、２００８、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１６：６４９〜５６）。ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１処置の５週間後（１０〜１３週齢）、この特徴的振戦活動は、減少し、高用量群では、完全に防止された（図５）。

[0158]安定性研究の概要。組換えＴＰＰ１の安定的発現は、サンプリングされた全ての脳領域内で、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１により、研究終了まで達成された（注射の１２週間後）。非処置ＣＬＮ２^−／−マウスの平均寿命が、１６週間であることに留意することは重要である。注射後１２週間群内のマウスの全ては、１９週齢で安楽死するまで、非処置ＣＬＮ２^−／−マウスより長く生存した。

実施例５
結論
[0159]投与研究。ＣＳＦ中の組換えＴＰＰ１レベルは、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１注射の５週間後における用量反応パターンを提示した。

[0160]成熟組換えＴＰＰ１は、脳全体にわたり検出された。脳室に沿った脳領域内では、内因性レベルを超えるレベルのｈＴＰＰ１が、３つの実験群間で、用量反応的に定量化された。全ての用量は、注入部位に対して、空間的に遠位の脳領域内で、内因性レベルを達成した。

[0161]ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１ベクターは主に、上衣細胞を含有する実質組織パンチへと局在化した。しかし、少数のウイルス粒子は、心臓及び脾臓に形質導入することが見出された。

[0162]行動学的測定値は、高用量を注射された動物における、振戦表現型の完全な防止と、低用量群及び中用量群における、振戦表現型の部分的なレスキューとを明らかにした。

[0163]安定性研究。５×１０^１０ｖｇを施されるＣＬＮ２^−／−マウスにおいて、内因性レベルを超えるレベルのｈＴＰＰ１プロ酵素が、注射の最大で１２週間後まで維持された。これらのマウスにおける、予測外であるが興味深い結果は、寿命の延長であった。

[0164]まとめると、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１は、ＣＬＮ２^−／−マウスの脳内で、広範にわたり、用量依存的に発現した。ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１は、忍容が良好であり、注射の１２週間後においても、安定的な発現レベルを維持し、さらに、ＣＬＮ２^−／−マウスの通常の寿命を延長した。

実施例６
死後解析
[0165]投与研究。全ての処置群は、ＣＳＦ中のｈＴＰＰ１プロ酵素レベルを、ＣＬＮ２^＋／−動物における内因性レベルより高レベルで発現した（図１）。３つの処置群について、有意な線形相関が見られた（ｒ^２＝０．９１）ことから、強い用量反応が指し示される。高用量のＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１（１×１０^１１ｖｇ）を注射されたＣＬＮ２^−／−マウスは、プロ酵素発現を、約１８７倍に増大させた。中用量（５×１０^１０ｖｇ）は、内因性レベルと比べて、約３７倍に増大させた。最も重要なことは、低用量（１×１０^１０ｖｇ）もまた、内因性レベルより高度な、ＴＰＰ１プロ酵素レベル（約２．４倍の増大）を達成したことである。

[0166]脳全体にわたる、異なる領域に由来する実質組織パンチを、ｈＴＰＰ１の発現についてアッセイした。一般に、脳室系（線条体、視床、小脳、延髄）に、直に隣接する組織に由来するパンチは、後頭皮質及び前頭前皮質に由来するパンチと比べて、より高レベルのｈＴＰＰ１を発現した。重要なことには、全ての処置群に由来する、アッセイされた全ての脳領域は、ＣＬＮ２^＋／−マウスにおける内因性レベルと、少なくとも同等なＴＰＰ１の発現を示した。これは、低用量である、１×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１が、脳実質内で、十分なレベルのＴＰＰ１をもたらすのに十分であること（図１）を指し示す。これらの領域の各々についての線形回帰は、用量反応を裏付ける、統計学的に正の傾きをもたらした。小脳及び延髄は、それぞれ、ｒ^２＝０．８２及び０．５８とする、最も注目すべき領域であった。これらのデータは、第ＩＶ脳室内の、ｈＴＰＰ１プロ酵素の蓄積を示し、小脳性実質では、透過が、延髄より良好であった。高用量（１×１０^１１ｖｇ）では、線条体、視床、小脳、延髄、及び後頭皮質におけるｈＴＰＰ１レベルの、内因性レベルと比べて、統計学的に有意な増大が見られた。中用量（５×１０^１０ｖｇ）もまた、線条体、小脳、及び延髄において、ｈＴＰＰ１レベルの、統計学的に有意な増大を示した。

[0167]心臓、肝臓、腎臓、及び脾臓を含む末梢組織を、組換えＴＰＰ１の存在について解析した。全ての処置群は、脾臓内で、低レベルであるが、検出可能なレベルのＴＰＰ１を有した（図１Ｈ）。解析は、実験群間で、統計学的な、正の線形回帰（ｒ^２＝０．５４）を結果としてもたらし、正の用量反応を反映した。高用量群の９例のマウスは、心臓に、組換え酵素を、低濃度（タンパク質１ｍｇ当たり０．０６ピコモル未満のＴＰＰ１）で有した。

[0168]安定性研究。組換えＴＰＰ１の安定的発現は、サンプリングされた全ての脳領域内で、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１により、研究終了まで達成された（注射の１２週間後；図５）。非処置ＣＬＮ２^−／−マウスの平均寿命が、１６週間であることに留意することは重要である。しかし、５×１０^１０ｖｇを施される、安定性研究におけるマウスの全ては、１９週齢における安楽死まで生存した。このデータは、ＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１処置がまた、ＬＩＮＣＬマウスの寿命も、明らかに延長することを示す。

生体内分布についての解析
[0169]投与研究。ウイルスの生体内分布について解析するように、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１特異的プローブを使用して、Ｑ−ＰＣＲを実施した。高濃度のＡＡＶ４ウイルスゲノムが、上衣細胞を含有する実質パンチに局在化した。動物間で、ばらつきが見出されたが、小脳及び延髄において、高レベルのウイルス粒子を発現する傾向が見られた。いずれの領域も、注射点から遠位に位置する第ＩＶ脳室に付随する。これらの結果は、急速なＣＳＦの流動により、ウイルスゲノム（ｖｇ）が、注射部位から、第ＩＶ脳室へと輸送されること（図３）を指し示す。

[0170]実験群間で比較する場合、脳内では、統計学的な用量反応が見出されなかった。驚くべきことに、中用量群と、高用量群との間で、差違が検出されなかった。これに対し、中用量群の末梢組織では、より少数のウイルスゲノムが、定量化されたことから、この用量では、大半のウイルス粒子が、脳に保持されたことが示唆される。脾臓は、末梢組織で、最大数のウイルスゲノムを有した。興味深いことに、高用量による全ての心臓試料は、同様の、検出可能なレベルのＡＡＶ４．ＣＡＧｈＴＰＰ１を有した。

振戦アッセイ
[0171]投与研究。１２週齢の非処置ＣＬＮ２^−／−マウスは、振戦活動の増強を呈した。週齢をマッチさせたＣＬＮ２^−／−マウスであって、ＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１ １×１０^１０又は５×１０^１０個を施されたマウスは、周波数を１４〜４８Ｈｚの間とする振戦振幅を、有意に減少させた（図４）。高用量群の振戦振幅には、対照ＣＬＮ２^＋／−マウスと比較して、差違が見られなかったので、高（５×１０^１０）用量のＡＡＶ４ＣＡＧｈＴＰＰ１は、疾患表現型を、完全に防止した。

実施例７
[0172]アカゲザルにおいて、研究を実施して、ｈＴＰＰ１を発現させるＡＡＶベクターの、脳室内単回投与後の時間経過にわたり、ＣＳＦ中のＴＰＰ１の発現プロファイルについて評価した。このために、３×１０^１３ｖｇのＡＡＶ２．ＣＡＧｈＴＰＰ１を含有する４ｍＬを、３例のアカゲザルの側脳室の右後角へと、片側注入した。ＣＳＦ試料を、注射の前（０日目）、及び７日ごとに回収した。動物は、注射の６週間後に屠殺した。

[0173]脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＴＰＰ１レベルを、酵素アッセイにより定量化し、ｍｇ単位の全タンパク質で正規化した。全ての動物において、ＴＰＰ１濃度は、徐々に増大して、試験の終了時までに、ベースラインレベルの９〜２０倍に到達した。これらの結果は、ＡＡＶ２．ＣＡＧｈＴＰＰ１の単回注射が、アカゲザルＣＳＦ中の、ＴＰＰ１レベルの頑健な上昇を引き起こすことを示す。

〔関連出願〕
[0001]本出願は、２０１６年１１月４日に出願された、米国特許仮出願第６４／４１８，０３３号に対する優先権を主張する。全ての本文、表、配列表、及び図面を含む、前出の出願の内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (67)

1. リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を有する哺乳動物を処置する方法であって、
   哺乳動物の脳又は脊柱へ、複数のＡＡＶ粒子を投与するステップ
   を含み、前記ＡＡＶ粒子が、
   （ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質と；
   （ｉｉ）ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間に挿入された核酸であり、リソソームヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸と；
   （ｉｉｉ）前記核酸の発現を駆動する発現制御エレメントと
   を含み、前記ＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の細胞に形質導入し、前記ポリペプチドの発現をもたらすことが可能である方法。
2. 前記ポリペプチドが、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）活性を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリペプチドが、ＴＰＰ１、そのプロ酵素、又は酵素的に活性なその変異体を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＡＡＶ ＩＴＲのうちの１つ又は複数が、１つ又は複数のＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記核酸が、哺乳動物ＴＰＰ１をコードする、請求項１に記載の方法。
6. 前記核酸が、ヒトＴＰＰ１をコードする、請求項１に記載の方法。
7. 前記核酸が、ＴＰＰ１活性を伴い、配列番号１として明示されたヒトＴＰＰ１に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
8. 前記発現制御エレメントが、ＣＭＶエンハンサーを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記発現制御エレメントが、ベータアクチンプロモーターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記発現制御エレメントが、ニワトリベータアクチンプロモーターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記発現制御エレメントが、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記発現制御エレメントが、配列番号３に明示されたＣＭＶエンハンサーに対して、８０％以上の同一性を有する配列、及び／又は配列番号３に明示されたニワトリベータアクチンプロモーターに対して、８０％以上の同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記発現制御エレメントが、配列番号３に対して、８０％以上の同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記発現制御エレメントが、配列番号３を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
15. カプシド配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１配列、ＶＰ２配列、及び／又はＶＰ３配列に対して、７０％以上の同一性を有するＶＰ１カプシド配列、ＶＰ２カプシド配列、及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. カプシド配列が、ＡＡＶ２に対して、８０％以上の同一性を有するＶＰ１カプシド配列を含み、この場合、カプシド配列は、４４４、５００、及び／又は７３０位におけるチロシンが、チロシンではないアミノ酸で置換されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
17. カプシド配列が、ＡＡＶ２に対して、９０％以上の同一性を有するＶＰ１カプシド配列を含み、この場合、カプシド配列は、４４４、５００、及び／又は７３０位におけるチロシンが、フェニルアラニンで置換されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
18. カプシド配列が、４４４、５００、及び／又は７３０位におけるチロシンが、フェニルアラニンで置換されたＡＡＶ２ ＶＰ１カプシド配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
19. カプシド配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のうちのいずれかから選択されるＶＰ１カプシド配列、ＶＰ２カプシド配列、又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記複数のＡＡＶ粒子を、前記哺乳動物の脳へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記複数のＡＡＶ粒子を、前記哺乳動物の大槽、脳室内腔、脳室、くも膜下腔、髄内腔、及び／又は上衣へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記複数のＡＡＶ粒子を、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記複数のＡＡＶ粒子を、脳室系へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記複数のＡＡＶ粒子を、吻側側脳室へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記複数のＡＡＶ粒子を、尾側側脳室へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記複数のＡＡＶ粒子を、右側脳室及び／又は左側脳室へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記複数のＡＡＶ粒子を、右吻側側脳室及び／又は左吻側側脳室へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記複数のＡＡＶ粒子を、右尾側側脳室及び／又は左尾側側脳室へと投与するステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記ＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の上衣細胞に接触する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記哺乳動物へと、第１の免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記哺乳動物へと、第２の免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記第１の免疫抑制剤及び前記第２の免疫抑制剤のうちの少なくとも１つを、前記ＡＡＶ粒子の投与の前に、前記哺乳動物へと投与する、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. 前記第１の免疫抑制剤を、前記ＡＡＶ粒子の投与の前に投与し、前記第２の免疫抑制剤を、前記ＡＡＶ粒子の投与の前に、投与と同時に、又は投与の後で投与する、請求項３０又は３１に記載の方法。
34. 前記第１の免疫抑制剤が、シクロスポリンを含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記シクロスポリンを、１日２回、約５〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で、少なくとも３カ月間にわたり投与する、請求項３４に記載の方法。
36. 投与される前記シクロスポリンの用量を、前記ＡＡＶ粒子の投与の１〜２カ月後に低減する、請求項３４に記載の方法。
37. 前記第２の免疫抑制剤が、ミコフェノレート又はその誘導体を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記ミコフェノレートの誘導体が、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）である、請求項３７に記載の方法。
39. （ｉ）前記第１の免疫抑制剤を、前記ＡＡＶ粒子の投与の、少なくとも約２週間前に投与し、（ｉｉ）前記第２の免疫抑制剤を、前記ＡＡＶ粒子の投与の約２週間前に、又は投与後６０日以内に投与する、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記ミコフェノレート又はその誘導体を、１日約５〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記ＡＡＶ粒子を、１ｋｇ当たり約１×１０^８〜約１×１０^１５ｖｇの用量で投与する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）を構成する細胞に、前記ＡＡＶ粒子により形質導入する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記ＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の上衣細胞に形質導入する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記ＡＡＶ粒子を形質導入された細胞が、前記ポリペプチドを発現し前記哺乳動物のＣＳＦへと分泌する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記哺乳動物の脳脊髄液中のトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）活性が、任意選択で、３５０日間を超える日数にわたり、タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも５ピコモルのＴＰＰ１のレベルで検出可能である、請求項２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記哺乳動物が、非齧歯類哺乳動物である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記非齧歯類哺乳動物が、霊長類動物である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記非齧歯類哺乳動物が、ヒトである、請求項４６に記載の方法。
49. 前記ヒトが、小児である、請求項４８に記載の方法。
50. 前記小児が、約１〜約４歳である、請求項４９に記載の方法。
51. 前記ＬＳＤが、乳児神経セロイドリポフスチン症若しくは後期乳児神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ）、神経障害性ゴーシェ病、若年性バッテン病、ファブリー病、ＭＬＤ、Ａ型サンフィリッポ病、ハンター病、クラッベ病、モルキオ病、ポンペ病、Ｃ型ニーマン−ピック病、テイ−サックス病、ハーラー病（ＭＰＳ−Ｉ Ｈ）、Ｂ型サンフィリッポ病、マロトー−ラミー病、Ａ型ニーマン−ピック病、シスチン症、ハーラー−シャイエ病（ＭＰＳ−Ｉ Ｈ／Ｓ）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）、シャイエ病（ＭＰＳ−Ｉ Ｓ）、乳児バッテン病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＩＩ／ＩＩＩ型ムコ脂質症、又はサンドホフ病である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記ＡＡＶ粒子の投与が、前記ＡＡＶ粒子の注射を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記ＬＳＤと関連する症状の発症を、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、又は５０〜１００日間遅延させる、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記症状が、固有感覚反応、眼振、威嚇瞬目反応、瞳孔対光反射、小脳性運動失調、及び企図振戦からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
55. 前記ＬＳＤと関連する、認知機能の測定可能な喪失を、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、又は５０〜１００日間遅延させる、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記ＬＳＤを有する哺乳動物の寿命を、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、又は５０〜１００日間延長する、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 中和抗体が、前記ＡＡＶ粒子の投与後、少なくとも３０、６０、９０、又は１２０日間以上の日数にわたり、前記哺乳動物のＣＳＦにおいて検出されない、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 中和抗体が、前記ＡＡＶ粒子の前記投与後、少なくとも２５０日間にわたり、前記哺乳動物のＣＳＦにおいて検出されない、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記ポリペプチドを、前記哺乳動物の脾臓又は心臓において発現させる、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記ポリペプチドを、前記哺乳動物の線条体、視床、髄質、小脳、大脳、後頭皮質、又は前頭前皮質において発現させる、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記発現制御エレメントが、前記哺乳動物の線条体、視床、髄質、小脳、大脳、後頭皮質、又は前頭前皮質のうちの１つ又は複数において、ＣＭＶプロモーターよりも高い、前記核酸又はポリペプチドの発現をもたらす、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記発現制御エレメントが、前記哺乳動物の線条体、視床、髄質、小脳、大脳、後頭皮質、又は前頭前皮質のうちの１つ又は複数において、ＣＭＶプロモーターよりも約１〜４倍高い、前記核酸又はポリペプチドの発現をもたらす、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記発現制御エレメントが、前記哺乳動物の線条体、視床、髄質、小脳、大脳、後頭皮質、又は前頭前皮質のうちの１つ又は複数において、ＣＭＶプロモーターよりも約１〜２倍高い、前記核酸又はポリペプチドの発現をもたらす、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０、及びＡＡＶ−２ｉ８の粒子からなる群から選択される、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記ＩＴＲのうちの１つ又は複数が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０、及びＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲからなる群から選択される、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
66. カプシド配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１配列、ＶＰ２配列、及び／又はＶＰ３配列に対して、９０％以上の同一性を有するＶＰ１カプシド配列、ＶＰ２カプシド配列、及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
67. カプシド配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のうちのいずれかから選択されるＶＰ１カプシド配列、ＶＰ２カプシド配列、又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。

Images