JP2019527838A - バリアントｓｈ２ドメインを用いたタンパク質チロシンリン酸化プロファイリングのための方法 - Google Patents

バリアントｓｈ２ドメインを用いたタンパク質チロシンリン酸化プロファイリングのための方法 Download PDF

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Abstract

以下の工程を含む、試料のタンパク質チロシンリン酸化をプロファイリングする方法を提供する：試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試料から単離する工程；および、単離されたpTyr包含ペプチドを特定する工程。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年6月10日に提出された米国特許仮出願第62/384,722号の恩典および優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に完全に組み入れられる。
分野
本開示は、概して、質量分析法の使用を含む、タンパク質キナーゼの活性および免疫機能に関連するチロシンリン酸化を含む、試料におけるタンパク質チロシンリン酸化を検出する方法に関する。
背景
種々のタンパク質キナーゼによるタンパク質リン酸化は、代謝、細胞成長、細胞周期進行、アポトーシス、細胞骨格構築、および分化を含む、多岐にわたる真核細胞のプロセスにおいて重要な役割を有している。タンパク質リン酸化は、特に、細胞シグナル伝達の中心となり、リン酸化は、他にもある効果の中でも、酵素活性、免疫応答、タンパク質の細胞内局在化、タンパク質分解、およびタンパク質-タンパク質相互作用を制御するように作用する。
真核生物において、タンパク質リン酸化は、ほぼ排他的に、チロシン（Tyr）残基、セリン（Ser）残基、およびスレオニン（Thr）残基上で起こる。ヒトゲノムによってコードされている約518種類のタンパク質キナーゼのうち、約90種類がTyrキナーゼ（TK）と分類されており、残りの大部分がSer/Thrキナーゼ（STK）と分類されており、より小さいサブセットが、TyrおよびSer/Thrをリン酸化する二重特異性キナーゼと分類されている（Manning, G. et al., "The protein kinase complement of the human genome", (2002) Science 298:1912（非特許文献1））。定義により、タンパク質キナーゼは、タンパク質をリン酸化する、保存された触媒ドメインを有するが、タンパク質-タンパク質相互作用ドメインなどの追加的なドメインも有することができる（Manning, G. et al., "The protein kinase complement of the human genome", (2002) Science 298:1912（非特許文献1））。
タンパク質キナーゼ活性は、多くの場合、キナーゼ自体のリン酸化を必要とする。概して、TKのキナーゼ活性は、いわゆる活性化ループ中の1個または複数個のTyr残基のリン酸化によって活性化される。活性化ループは、キナーゼの触媒コア中に位置する、短い保存されたペプチドである。大部分のTKにおいて、ならびに多数のSTKまたは二重特異性キナーゼ（例えば、MAPキナーゼ）および脂質キナーゼ（例えば、ホスファチジルイノシチド3-キナーゼ）において、活性化ループは、キナーゼ活性化の最中にリン酸化される第1のチロシンの間である、1〜3個のチロシン残基を保有する（Huse, M. and Kuriyan, J. "The conformational plasticity of protein kinases" (2002), Cell 109:275-282（非特許文献2）；Taylor, S. S., et al. "Evolution of the eukaryotic protein kinases as dynamic molecular switches" (2012) Phil. Trans. R. Soc. B. 367:2517-2528（非特許文献3）；Bayliss, R., et al. "On the molecular mechanisms of mitotic kinase activation", (2012) Open Biology 2:120136（非特許文献4））。構造研究により、活性化ループのリン酸は、キナーゼ基質とATPとの結合を可能にすることが明らかになっている（Hubbard, S. R. et al., "Crystal structure of the tyrosine kinase domain of the human insulin receptor", (1994) Nature 372:746-754（非特許文献5）；Lemmon, M. A., and Schlessinger, J. "Cell signaling by receptor tyrosine kinases", (2010) Cell 141:1117-1134（非特許文献6））。
加えて、多くのTKは、活性化ループの外側、またはさらにキナーゼドメイン自体の外側にもTyr残基を有する。これらの追加的なTyr残基のリン酸化は、他にもある効果の中でも、キナーゼドメインの活性を正もしくは負に自己調節するか、または他のタンパク質上の相互作用ドメインに結合することができる。
90種類のヒトTKのうちの半分よりも多くが、1種類または複数種類のがん、炎症性障害、および他の疾患に関係している（Drake et al., "Clinical targeting of mutated and wild-type protein tyrosine kinases in cancer" (2014) Mol. Cell. Biol. 34: 1722-1732（非特許文献7）；Melnikova, I. and Golden, J., "Targeting protein kinases" (2004) Nature Rev. Drug Discov. 3: 993-994（非特許文献8））。したがって、チロシンキナーゼは、薬物標的の最も重要な群の1つと考えられており、現在、TKを標的とする数多くの薬物が認可されており、さらに多くが、前臨床評価および臨床評価の種々の段階にある（Gross, S. et al., "Targeting cancer with kinase inhibitors" (2015) J. Clin. Invest. 125: 1780-1789（非特許文献9）；Patterson, H. et al., "Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases" (2013) Clin. Exp. Immunol. 176: 1-10（非特許文献10）；Vlahovic, G. and Crawford, J., "Activation of tyrosine kinases in cancer" (2003) Oncologist 8: 531-538（非特許文献11）；Cohen P., "Protein kinases - the major drug targets of the twenty-first century?" (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1: 309-315（非特許文献12））。
キナーゼ、特にチロシンキナーゼはまた、免疫受容体の細胞質ドメイン内に含有されている特異的なチロシン残基のリン酸化を通して、免疫機能の調節においても中心的な役割を果たす。具体的には、免疫シグナル伝達は、免疫受容体Tyrベース活性化モチーフ（Immunoreceptor Tyr-based Activating Motif）（ITAM）、免疫受容体Tyrベース阻害モチーフ（Immunoreceptor Tyr-based Inhibitory Motif）（ITIM）、および免疫受容体Tyrベーススイッチモチーフ（Immunoreceptor Tyr-based Switching Motif）（ITSM）を含む、免疫受容体Tyrベース調節モチーフ（Immunoreceptor Tyr-based Regulatory Motif）（ITRM）によって調節される（Liu, H. et al., "A comprehensive immunoreceptor phosphotyrosine-based signaling network revealed by reciprocal protein-peptide array screening" (2015) Mol. Cell. Proteomics 14: 1846-1858（非特許文献13））。
質量分析（MS）ベースのプロテオミクスにおける進歩により、ヒトゲノムによってコードされているすべてのタンパク質の約90％を特定することが可能になってきている。最近のプロテオミクス解析により、発現したヒトタンパク質の四分の三よりも多くがリン酸化され得ることが示唆されている（Sharma, K. et al., "Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of tyr and ser/thr-based signaling", (2014) Cell Rep. 8:1583-94（非特許文献14））。
リン酸化アミノ酸を特定する上で重大な工程は、MS解析の前のリンタンパク質またはリンペプチドの濃縮である。多くの場合TiO2またはTi4+の使用を含む、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（IMAC）を、リンペプチドを濃縮するために用いることができる。Sharma et al.においては、HeLa S3細胞由来のリンペプチドが、TiO2ビーズを用いて濃縮された。特定されたおよそ38,000個のリン酸化部位（phosphosite）のうち、84.1％がpSerであり、15.5％がpThrであり、0.4％がホスホチロシン（pTyr）であった。これらの相対的な割合は、放射性同位体標識を用いて数十年前に推定されたものと類似していた。
MSによる細胞内Tyrリン酸化部位の特定は、抗pTyr抗体（例えば、4G10、p-Tyr-100）での濃縮によって、およびタンパク質ホスファターゼの阻害物質であるペルバナダートでの細胞の前処理によって改善することができる。Sharma et al.においては、ペルバナダート前処理と抗pTyr抗体での濃縮とを組み合わせることによって、HeLa S3細胞中の約1,300種類のタンパク質から2,000種類よりも多いTyrリン酸化ペプチドの特定が可能になった。Sharma et al.によって特定されたTyrリン酸化部位のうちの約18％のみが、新規であるように見られた。その筆者らは、Ser/Thrリン酸化事象の適用範囲は、非常に包括的であるように見られたが、Tyrリン酸化プロテオーム（phosphoproteome）は完成には程遠いと結論付けた。
細胞内シグナル伝達は、多くの場合モジュラードメインによって媒介される、調節された動的なタンパク質-タンパク質相互作用に依拠している。1つの例は、pTyrを含有するペプチドに結合する、Src相同2（SH2）ドメインである。ヒトゲノムは、約120個のSH2ドメインをコードしている。すべての公知のSH2ドメイン構造は、保存されたドメインフォールドに従う。典型的に、SH2ドメインは、リガンドペプチド中のpTyrのC末端の残基に対する特異性を付与する、第2のポケットまたはサブサイトに沿ったpTyr結合ポケットを有する（Huang, H. et al., "Defining the specificity space of the human SRC homology 2 domain" (2008) Mol. Cell. Proteomics 7:768-784（非特許文献15））。
加えて、SH2ドメインは、ITRMに結合することが公知である（Liu, H. et al., "A comprehensive immunoreceptor phosphotyrosine-based signaling network revealed by reciprocal protein-peptide array screening" (2015) Mol. Cell. Proteomics 14: 1846-1858（非特許文献13））。
Manning, G. et al., "The protein kinase complement of the human genome", (2002) Science 298:1912 Huse, M. and Kuriyan, J. "The conformational plasticity of protein kinases" (2002), Cell 109:275-282 Taylor, S. S., et al. "Evolution of the eukaryotic protein kinases as dynamic molecular switches" (2012) Phil. Trans. R. Soc. B. 367:2517-2528 Bayliss, R., et al. "On the molecular mechanisms of mitotic kinase activation", (2012) Open Biology 2:120136 Hubbard, S. R. et al., "Crystal structure of the tyrosine kinase domain of the human insulin receptor", (1994) Nature 372:746-754 Lemmon, M. A., and Schlessinger, J. "Cell signaling by receptor tyrosine kinases", (2010) Cell 141:1117-1134 Drake et al., "Clinical targeting of mutated and wild-type protein tyrosine kinases in cancer" (2014) Mol. Cell. Biol. 34: 1722-1732 Melnikova, I. and Golden, J., "Targeting protein kinases" (2004) Nature Rev. Drug Discov. 3: 993-994 Gross, S. et al., "Targeting cancer with kinase inhibitors" (2015) J. Clin. Invest. 125: 1780-1789 Patterson, H. et al., "Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases" (2013) Clin. Exp. Immunol. 176: 1-10 Vlahovic, G. and Crawford, J., "Activation of tyrosine kinases in cancer" (2003) Oncologist 8: 531-538 Cohen P., "Protein kinases - the major drug targets of the twenty-first century?" (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1: 309-315 Liu, H. et al., "A comprehensive immunoreceptor phosphotyrosine-based signaling network revealed by reciprocal protein-peptide array screening" (2015) Mol. Cell. Proteomics 14: 1846-1858 Sharma, K. et al., "Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of tyr and ser/thr-based signaling", (2014) Cell Rep. 8:1583-94 Huang, H. et al., "Defining the specificity space of the human SRC homology 2 domain" (2008) Mol. Cell. Proteomics 7:768-784
概要
本開示は、生物学的試料内のタンパク質チロシンリン酸化をプロファイリングするための、スーパーバインダーと呼ばれるバリアントSH2ドメインの使用に関する。方法は、チロシンリン酸化ペプチドのスーパーバインダーベースの濃縮を質量分析と組み合わせることによる、タンパク質キナーゼの活性およびITRM媒介性免疫シグナル伝達を含む、細胞プロセスに関連するチロシンリン酸化の検出および任意の定量を提供する。
最近、pTyr残基を有するペプチドに対するSH2ドメインの親和性を、著しく増強できることが発見された。例えば、著しく増強された親和性は、pTyr結合ポケット中の1個、2個、または3個の特異的な残基を置換することによって取得することができる（Kaneko, T. et al., "SH2 Superbinders act as antagonists of cell signalling", (2012) Sci. Signal. 5: ra68；米国特許出願公開第14/388,592号）。これらの置換を、チロシンキナーゼSrc、チロシンキナーゼFyn、およびアダプタータンパク質Grb2の3種類のヒトタンパク質由来のSH2ドメインにおける相似の位置中に導入することにより、pTyr包含ペプチドに対するこれらのドメインの親和性が著しく増大する。
例として、そのような置換を有するバリアントSrc SH2ドメインは、生理学的かつ人工的なpTyr包含ペプチドに対して、増大した結合親和性を示す（表1；μM単位における平衡解離定数（Kd）値を示す）。
（表１）pTyrペプチドのパネルに対する野生型Src SH2ドメインおよびバリアントSrc SH2ドメインの結合親和性
Figure 2019527838
同様に、3個の特定のアミノ酸位置に3個の特定のアミノ酸置換を有するバリアントFyn SH2ドメイン（本明細書において言及される場合「三重変異体」または「TrM」）は、9.7ナノモル濃度（nM）の平衡解離定数（Kd）で、受容体チロシンキナーゼEGFRの配列中に見出されるpTyr包含ペプチドに結合する。野生型Fyn SH2ドメインは、3.7マイクロモル濃度（μm）のKdで同じペプチドに結合し、TrM Fyn SH2ドメインが約380倍強く結合することが示される。
驚くべきことに、pTyr包含ペプチドに対するSH2スーパーバインダーの増大した親和性は、疾患または薬物処理に対する曝露により生じ得るものなどの、細胞中のリン酸化状況における、小さな変化を含む変化の検出を可能にするのに十分感度を有することが、現在発見されている。
様々な試料間のリン酸化状況を比較することによって、疾患および処置、例えば、疾患状況、疾患予後、疾患進行、処置の適性もしくは有効性、薬物耐性、キナーゼ活性の状況、または免疫シグナル伝達の状況に関するようなものを含む、リン酸化に関連する細胞プロセスの様々な局面を査定するために、本開示の方法を用いることが可能であり得る。
したがって、本開示は、微量の細胞、組織、生検材料、または他の生物学的試料からを含んで、何百個ものTyrリン酸化部位を特定し、任意で、そのような部位でのリン酸化の発生率を同時に定量し、したがって、生物学的試料内のタンパク質チロシンリン酸化状況の体系的プロファイリングを可能にする方法を、初めて提供する。
そのようなプロファイリングは、タンパク質キナーゼ媒介性およびITRM媒介性のシグナル伝達を含む、pTyrシグナル伝達のパターンおよび任意で強度を示すことができ、それらは次に、免疫機能およびがんなどの疾患状態を含む、生物学的試料内の細胞の種々の状態の指標を提供することができる。いくつかの態様において、方法は、本質的にすべての公知のTKのキナーゼ活性レベルを反映する、pTyr状況の検出を可能にする。例えば、いくつかの態様において、方法は、公知のTKの89/90の活性の特定、および任意で定量を可能にする。適切な対照試料について取得されたプロファイルとの比較が方法に含まれる場合、様々な態様における方法は、疾患、または、特異的なTKの阻害を標的とする処置に関連し得る、細胞内の調節事象における変化を検出することができる。
本開示の局面にしたがって、以下の工程を含む、試験試料のタンパク質チロシンリン酸化をプロファイリングする方法が提供される：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離されたpTyr包含ペプチドを特定する工程。
方法は、単離されたpTyr包含ペプチドを定量する工程を、さらに含んでもよい。
特定する工程および／または定量する工程は、例えば、多重反応モニタリング（MRM）、選択反応モニタリング（SRM）、または並列反応モニタリング（PRM）の技法を含む、質量分析法を含んでもよい。
SH2スーパーバインダーは、哺乳動物SH2ドメインのバリアントであってもよく、Src、Grb2、またはFynのSH2ドメインのバリアントであってもよい。SH2スーパーバインダーは、三重変異体SH2バリアントであってもよく、または四重変異体SH2バリアントであってもよい。SH2スーパーバインダーは、SEQ ID NO: 5、７、9、11、12、13、14、または15の配列を含んでもよい。SH2スーパーバインダーは、1種類または複数種類の追加的なSH2スーパーバインダーを含む融合タンパク質内に含有されていてもよい。
SH2スーパーバインダーは、固体支持体上に固定化されていてもよい。
単離する工程は、高速液体クロマトグラフィー法または超高速クロマトグラフィー法を含んでもよい。
試料は、ヒト対象を含む、対象から取得されてもよく、対象は、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、または白血病を含むがんと診断される予定であってもよく、またはがんを有することが既知であってもよい。試料は、例えば、血清、血漿、尿、血液、組織、または組織抽出物であってもよい。
試料は、チロシンキナーゼ阻害物質、化学療法剤、PD-1阻害物質、またはCTLA-4阻害物質に曝露されていてもよい。
方法は、特異的なタンパク質チロシンキナーゼの基質に対応するpTyr包含ペプチド、特異的なタンパク質チロシンホスファターゼの基質に対応するpTyr包含ペプチド、タンパク質キナーゼの活性化ループ由来、もしくはタンパク質キナーゼの活性化ループの外側由来のものを含む、キナーゼ由来の包含ペプチド、ITIM、ITSM、もしくはITAMを含む免疫受容体のITRM、および／または、正の調節領域もしくは負の調節領域を含む、タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域を特定する工程を含んでもよい。キナーゼは、チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、二重特異性キナーゼ、MAPキナーゼ、または脂質キナーゼであってもよい。
方法は、対照試料の使用をさらに含んでもよい。したがって、方法は、以下の工程を含んでもよい：対照試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、対照試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、対照試料から単離する工程；単離されたpTyr包含ペプチドを特定する工程；および、試験試料について取得されたプロファイルを、対照試料について取得されたプロファイルと比較する工程。
対照試料は、例えば、試験試料と同じ供給源由来であるが試験試料とは異なる時点で取得された試料、試験試料と同じ供給源由来であるが試験試料と比較して薬物に対する曝露が異なる試料、疾患を有さないことが既知の供給源由来、または、疾患を有するかもしくは疾患に関与していることが既知の供給源由来であってもよい。
以下の図は、例としてのみ、本発明の態様を示す。
大腸菌（E. coli）細胞溶解物からの、ヘキサヒスチジン（His6）タグ付加組換えタンパク質またはHis6およびGSTの二重タグ付加組換えタンパク質、すなわち、野生型ヒトSrc SH2ドメイン（His6/GSTタグ付加；SEQ ID NO: 10）、TrMヒトSrc SH2スーパーバインダー（His6/GSTタグ付加；SEQ ID NO: 11）、および四重の変異を有する（QuadM）ヒトSrc SH2スーパーバインダー（His6タグ付加；SEQ ID NO: 13）の精製を示す、クマシー染色したアクリルアミドゲルの画像である。精製タンパク質のキロダルトン（kDa）でのおよその分子量を、マーカータンパク質の混合物によって示す。 図2Aは、ペルバナダート処理したJurkat細胞に由来するpTyr包含ペプチドを特定するために、様々なモル量の抗pTyr抗体（4G10、または4G10、PY99、およびP-TYR-100の抗体混合物）、His6/GSTタグ付加TrM Src SH2スーパーバインダー（SEQ ID NO: 11）、ならびにHis6タグ付加QuadM Src SH2スーパーバインダー（SEQ ID NO: 13）の相対能力を決定する、実験についての流れ図である。図2Bは、図2Aに記載した実験における、各々の量で、親和性試薬の各々によって特定されたpTyr部位の数を提示するグラフである。 3種類の異なる等モル量（すなわち、0.375 nmol、1.875 nmol、および11.25 nmol）での、4種類の親和性試薬（正方形の角、凡例を参照されたい）の各々によって特定されたpTyr包含ペプチド中の、pTyrに隣接するアミノ酸配列間のペアワイズ比較（線によって接続されたペア）におけるユークリッド距離（線の隣の値）を特に示す、図2Aおよび2Bにおける実験由来のデータの解析を提示する図である。線の相対的太さ（距離ではない）もまた、相対的ユークリッド距離を示す。4種類の親和性試薬の示されるペアワイズ比較（すなわち、各正方形の周上のペアワイズ比較）において、指定された位置で統計学的に異なり（P＜0.01、ボンフェローニ補正を伴わない二項検定）、かつ2種類のパターン間で0.08よりも長い距離を有する、pTyr（Y）のC末端の+1、+2、+3、および+4の位置のアミノ酸もまた、図3に図示する。 本開示の態様による、タンパク質キナーゼの活性化ループおよびITRM中のTyrリン酸化部位を含む、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングのための方法についてのフローチャートである。 部位が以前に知られていたか、または実験において最初に特定された（新規）かによって分類した、His6タグ付加／GSTタグ付加TrM Src SH2スーパーバインダー（SEQ ID NO: 11）を用いて9種類のヒト細胞株から特定した、pTyr部位のlog2 m/zピーク強度の箱髭図であり、太い黒線（および矢印を伴う数字）が中央値を示す。 図6Aは、図5のリン酸化プロテオミクス解析においてTyrリン酸化された、様々な機能的カテゴリーにおけるタンパク質のパーセンテージを図示する箱髭図であり、太線として図示した9種類の細胞株由来の中央パーセンテージを伴う。図6Bは、図6Aのものに似ているが、ペルバナダートで処理されず、抗体P-Tyr-1000での親和性精製に供されたMKN45細胞の公開されたリン酸化プロテオミクスデータに由来するような、各機能的カテゴリーにおけるpTyrリン酸化タンパク質についての単一のパーセンテージのみを示すプロットである。図6Cは、基質をリン酸化するチロシンキナーゼ（TK）、基質を脱リン酸化するタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）、およびTyrリン酸化によって調節されているTyrリン酸化タンパク質自体に結合するSH2ドメイン包含タンパク質での、ヒト細胞におけるTyrリン酸化（「P」の印をつけた丸）の見かけの一般的調節を示す模式図である。 図7Aは、3種類のカテゴリー（細胞質PTP、受容体D1 PTP、および受容体D2 PTP）に群分けされており、PTPN1中のPTPドメインに対して整列している、ヒト遺伝子（斜体）によってコードされているPTPドメインの代表的なリストの圧縮された配列アラインメントであり、整列したアミノ酸の上部に提供されたPTPN1残基番号を伴う。アラインメントの上部の棒グラフは、残基が、整列した際に、図5のリン酸化プロテオミクス研究においてTyrリン酸化されていると見出されたPTPの数を示す。pTyr部位を、その研究において特定された32個の新規pTyr部位を緑色で、67個の以前に特定されたpTyr部位を青色で、その研究においても特定された56個の以前に特定されたpTyr部位を灰色で、および機能的に注釈をつけて特定されているpTyr部位を赤色の四角形によって色分けしている。 図7Bは、PTPN1のPTPドメインの三次元構造（PDBコード1EEO）の表示であり、主要なTyr（Y）リン酸化部位のおよその位置が、標識された球として示され、球の色は、提供される青色から赤色への勾配により、PTPファミリー内のそのTyr残基についての保存の程度を示す。 図4のリン酸化プロテオミクス解析に供した9種類の細胞株の各々について、細胞質TK（CTK）および受容体TK（RTK）のファミリー、ならびにその種々のサブファミリー（例えば、CTK_FAK、RTK_EPHなど）中にそれ自体が組織化される、示された遺伝子によってコードされているTKにおける活性化ループpTyr部位についてのlog2 m/zピーク強度値のZスコア（所定の細胞株において検出されるすべてのpTyr部位に対して計算される）を示す、注釈をつけたチャートである。赤色の濃淡の程度は、正のZスコアの大きさを示す。青色の濃淡の程度は、負のZスコアの大きさを示す。細胞株のうちの5種類における3種類のTK（Ddr1、ErbB2、IGF-1R）の結果を用いて、下記の図11A〜11CにおいてどのTK阻害物質がこれらの細胞株のいくつかの成長を特異的に抑制するかを予測した（太線での長方形）。所定のTKについての細胞株間の分散の程度を、チャートの右側の数字および垂直方向の棒グラフによって示す。 図9Aおよび図9Bは、4種類の乳がん細胞株（MCF-7、BT-474、MDA-MD-231、SK-BR-3）についての、SDS-PAGEによって分離された、抗ErbB2抗体での免疫沈降物（IP）、抗IGF-1Rβ抗体でのIP、または全細胞溶解物（WCL）に由来するタンパク質のウエスタンブロットの画像である。ブロットは、示された一次抗体で免疫ブロット（IB）した。タンパク質のkDaにおけるおよその分子量（MW）を示す。 図10Aは、図6のリン酸化プロテオミクス解析由来の、9種類の細胞株のうちの6種類（BT-474、HepG2、Jurkat、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231）にわたる、示されたTKについての、mRNA存在量と活性化ループTyrリン酸化の強度との間の決定係数（R2）を示す棒グラフである。図10B〜10Dは、図10A由来の6種類の細胞株について、3種類のTK、すなわちERBB2（図10B）、IGF1R/INSR（図10C）、およびDDR1（図10D）の相対mRNA存在量（遺伝子発現）と活性化ループTyrリン酸化の強度との間の関係を示す散布図である（黒色点）。 図11Aは、特異的なTKを阻害する様々な濃度の低分子、すなわちラパチニブ（ErbB2阻害物質）、GSK1838705（IGF-1R阻害物質）、およびDDR1-IN-1（Ddr1阻害物質）に曝露した4種類の乳がん細胞株（MCF-7、BT-474、MDA-MD-231、SK-BR-3）の、非薬物曝露と比べた増殖を示す線グラフである。図11Bは、400 nM DDR-1N-1、400 nMラパチニブ、または400 nMの両方の阻害物質に曝露した時の、非薬物曝露と比べたMCF-7細胞の増殖を示す棒グラフであり、*は統計学的に有意な差（p＜0.001）を示し、各アッセイは三連で実施した。図11Cは、200 nM GSK1838705、400 nM DDR-1N-1、400 nMラパチニブ、またはその組み合わせに曝露した時の、非薬物曝露と比べた、図11Aと同じ細胞株および細胞株MCF-10Aの増殖を示す棒グラフであり、*および**は統計学的に有意な差（*、p＜0.001；**、p＜0.0001）を示し、各アッセイは四連で実施した。図11A〜11Cにおいて、エラーバーは1標準偏差を示す。 図12Aおよび12Bは、SK-BR-3細胞のトラスツズマブ感受性クローン（図12A）およびSK-BR-3細胞のトラスツズマブ耐性クローン（図12B）のスーパーバインダー-MRM解析由来の全イオンクロマトグラフィー（TIC）からの質量スペクトルを図示する線グラフであり、ピークは、特定されたErbB2（HER-2）RTKおよびc-KIT RTKの活性化ループ中のpTyr包含ペプチドに対応する。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Cは、pY877を含むErbB2（HER2）の活性化ループペプチドについて検出された、娘イオン（線グラフの上のパネル）および対応する娘イオンスペクトルを示す、MRM解析の代表的な例の質量スペクトルを図示する線グラフである。 図13Aは、トラスツズマブなし（青色の棒）または4μg/mlトラスツズマブ（橙色の棒）に対する48時間の曝露後の、図12A由来のSK-BR-3細胞のトラスツズマブ感受性クローン（元のクローン）、および図12B由来のSK-BR-3細胞のトラスツズマブ耐性クローンの相対的細胞増殖を示す棒グラフである。図13Bは、0 nM（水色）、200 nM（橙色）、400 nM（灰色）、800 nM（黄色）、1600 nM（紺青色）、または3200 nM（緑色）のイマチニブに対する48時間の曝露後の、図13A中と同じクローンの相対的細胞増殖を示す棒グラフである。図13Cは、薬物なし（Ctrl、青色）、4μg/mlトラスツズマブ（赤色）、2μMイマチニブ（緑色）、または4μg/mlトラスツズマブおよび2μMイマチニブの両方（紫色）に対する4日の曝露後の、図13A中と同じクローンの相対的細胞増殖を示す棒グラフである。図13Cにおいて、両方の薬物に対するトラスツズマブ耐性クローンの曝露は、各薬物単独と比較して、細胞増殖における統計学的に有意な減少を結果としてもたらす（P＜0.01）。図13A、13B、および13Cにおいて、エラーバーは、3回の独立した実験由来の標準偏差を表す。 図14A、14C、および14Dは、30μgのトリプシンタンパク質消化物のスーパーバインダー親和性精製（SAP）のスケジュール化PRM解析からの質量スペクトルを各々図示する線グラフである。3種類のタンパク質消化物は、3種類の急速凍結したトリプルネガティブ（ER-/PR-/HER2-）乳がん標本由来であった。内因性GSK3の活性化ループ中のpTyr包含ペプチドが、内部対照として働いた（GSK3αおよびGSK3βは、同じpTyr包含ペプチドを有する）。図14Bは、LMTK2およびGSK3ピークを除去し、y軸を低減させている（図14A中の四角で囲んだ区域にほぼ対応する）ため、図14A中と同じ質量スペクトルであるが、あまり活性化されていないTKを示す。 図15Aは、図14D由来のトリプルネガティブ（ER-/PR-/HER2-）乳がん標本の30μgのトリプシンタンパク質消化物のスーパーバインダー親和性精製（SAP）のスケジュール化PRM解析からの質量スペクトルを図示する線グラフである。図15Bは、図15A中のスペクトルを取得するために用いたのと同じ、6μgのトリプシンタンパク質消化物のSAP-PRM解析からの質量スペクトルを図示する線グラフである。 図16Aおよび16Bは、SK-BR-3細胞由来のトリプシンタンパク質消化物の様々な2μgアリコートのSAP-PRM解析からの質量スペクトルを各々図示する線グラフである。 図17Aは、90μgのトリプシンタンパク質消化物のスーパーバインダー親和性精製（SAP）のスケジュール化PRM解析からの質量スペクトルを図示する線グラフである。タンパク質を、急性骨髄性白血病（AML）患者の急速凍結した末梢血試料から単離した。図17Bは、図17Aを取得するために用いたのと同じ手順を用いて、正常個体由来の血液試料（約30μgのトリプシンタンパク質消化物）のSAP-PRM解析からの質量スペクトルである。 図18Aは、PD-1/PD-1相互作用をアッセイし、PD-1阻害物質またはPD-L1阻害物質の効果を特徴決定するための、BPS Bioscience（CA, USA）により開発された細胞システムを図示するグラフである。図18Bは、50μgのトリプシンタンパク質消化物のスーパーバインダー親和性精製（SAP）のスケジュール化MRM解析からの質量スペクトルを図示する線グラフである。タンパク質消化物は、PD-L1発現CHO細胞と共培養した、PD-1発現Jurkat T細胞由来であった。図18Cは、図18B中と同じであるが、抗PD-L1抗体（BPS Bioscience）で一晩処理した細胞由来のタンパク質消化物の質量スペクトルである。 図19Aおよび19Bは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腫瘍生検材料のスーパーバインダー親和性精製（SAP）のスケジュール化PRM解析からの質量スペクトルを各々図示する線グラフである。図19Aは、非小細胞肺がん生検材料由来であり、図19Bは、乳がん生検材料由来である。最も活性を有するキナーゼ（すなわち、FGFR1、GSK3、TXK）または浸潤T細胞（すなわち、CD3δ、CD3ζ）に対応するピークに標識をしている。 チロシンキナーゼEPHA8の活性化ループ由来のpTyr包含ペプチドについて検出された、娘イオンの質量スペクトルを図示する線グラフである。スペクトルを、スケジュール化PRMモードで作動するQ-Exactive質量分析計で記録した。TK活性化ループに由来する54種類の異なるpTyr包含ペプチドの混合物（各々10 pmole）（表9）の混合物を、野生型SH2ドメインまたはスーパーバインダーの親和性精製（SAP）に供し、その後、スケジュール化PRM解析に供した。等モル量（10 nmole）の野生型（wt）ヒトSrc SH2ドメイン、ならびにDMヒトSrc SH2スーパーバインダーおよびTrMヒトSrc SH2スーパーバインダー（それぞれ、SEQ ID NO: 14および5）を用いて、pTyr包含ペプチドをペプチド混合物から捕捉した。左、EPHA8 pTyr793ペプチドについていかなるシグナルも示さなかった、wt SH2ドメイン精製からのPRMスペクトル；中央、DMヒトSrcスーパーバインダー親和性精製から取得されたPRMスペクトル；右、TrMヒトSrcスーパーバインダー親和性精製から取得されたPRMスペクトル。異なる線は、EPHA8 pTyr793ペプチドによって産生された異なる娘イオンを表す。
詳細な説明
簡潔な概要において、健康なおよび罹患したヒトの細胞および組織を含む種々の生物学的試料における、タンパク質キナーゼ活性化および免疫受容体pTyrベースシグナル伝達に関係するチロシンリン酸化を含むタンパク質チロシンリン酸化を、特定のバリアントSH2ドメイン（本明細書に記載したように、本明細書においてスーパーバインダーと呼ばれる）を用いてpTyr包含ペプチドについて濃縮することによってプロファイリングできると、今や認識される。SH2スーパーバインダーはまた、試験試料および種々の対照について取得されたプロファイルの比較、ならびに試験試料内のキナーゼ活性の特異的状況の決定を可能にすることも見出されている。これにより、疾患の診断および予後判定、免疫シグナル伝達に関するようなものを含む疾患経路におけるキナーゼ活性化、およびTK阻害療法に対する耐性または感受性の解明を含む、種々の異なる適用におけるこれらの方法の使用が可能になる。
タンパク質キナーゼの活性化ループ中のもの、またはITRM上のものなどのTyrリン酸化部位に由来するpTyr包含ペプチドは、接触時にスーパーバインダーに結合することができ、結合したペプチドは、試料における大部分の他のペプチドから除去し、特定し、任意で定量し、それにより、試料におけるTK（およびそれらの活性化ループ中にpTyr包含ペプチドを有する他のキナーゼ）ならびにITRMに関連する免疫受容体の活性を含む、ホスホチロシンシグナル伝達活性のプロファイルを提供することができる。
様々な態様における本開示の方法は、微量の細胞、組織、生検材料、または他の生物学的試料からの、何百個ものpTyr部位の特定、および任意で、同時に、そのような部位でのリン酸化の発生率の定量を可能にし、したがって、試料内のタンパク質チロシンリン酸化の体系的プロファイリングを可能にする。そのようなプロファイリングは、試料におけるpTyr包含ペプチドの特定および任意の定量に基づいて、特定されたTyrリン酸化部位のリン酸化状況を提供し、したがって、試料内のタンパク質キナーゼの活性に関連するチロシンリン酸化、および試料内のITRM媒介性シグナル伝達に関連するチロシンリン酸化を含む、試料内のpTyrシグナル伝達のパターンおよび強度の指標として用いられてもよい。そのようなプロファイリングは、pTyr含有ペプチドのセットを試料から単離するための、1種類または複数種類のSH2スーパーバインダーの使用に依拠し、それは、親SH2ドメインと比較して増強された、pTyr含有ペプチドに対するSH2スーパーバインダーの親和性のために、他の単離法と比較した場合に増強されている可能性がある。試料における1種類または小さなセットのリンタンパク質を個々に査定する既存の方法と比較して、記載した方法は、単一アッセイに基づいて、任意の所定の試料中に存在するタンパク質チロシンリン酸化のより包括的な査定を提供する。
したがって、本明細書においてより詳細に説明するように、ヒト組織試料中を含む、タンパク質チロシンリン酸は、生物学的試料における細胞または組織に由来するpTyr包含ペプチドについて濃縮するために、下記に示す実施例に記載したものなどを含む、1種類または複数種類のSH2スーパーバインダーを用いることによって、および、ターゲットMS法により（例えば、TK活性化ループまたはITRM由来の）pTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量することによって、最も良好にプロファイリングされ得ることが、現在企図されている。捕捉することができるpTyr部位の濃縮と、質量分析法によりもたらされる特定および任意の定量とを合わせたこの有利な組み合わせによって、本明細書に記載したこれらの方法の種々の異なる用途および適用が可能になり得る。
本明細書において用いられる場合、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングとは、試料におけるpTyr包含ペプチドのセットの特定および任意の定量を指す。
同様に、本明細書において言及される場合、プロファイルとは、試料のプロファイリングから得られた結果を指す。したがって、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイルは、そのようなプロファイリングから得られた結果を指す。
プロファイリングによって特定されるpTyr包含ペプチドのセットは、スーパーバインダーとの結合、ならびにその後の特定および任意の定量によって試料において検出可能であるpTyr包含ペプチドをすべて含んでもよく、または、すべてのそのような検出可能なpTyr包含ペプチドのいくつかのサブセットであってもよい。プロファイリングからの望ましい情報に依存して、1個または複数個のpTyr部位に由来する1種類または複数種類の特異的なpTyr包含ペプチド、例えば、タンパク質キナーゼの活性化ループ中、免疫受容体のITRM中、またはタンパク質チロシンホスファターゼの調節領域中の、pTyr部位由来の1種類または複数種類の特定のpTyr包含ペプチドが、特定および任意の定量の焦点であり得る。
タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングは、特定されたpTyr包含ペプチドのセット、ならびに、特異的なタンパク質キナーゼ活性化ループおよびリン酸化標的、または免疫受容体のITRM内の特異的な公知のpTyr包含ペプチドとの相関に基づく、タンパク質キナーゼ活性のプロファイリングまたは免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達のプロファイリングを含んでよい。本開示の方法に従うタンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングの様々な態様もまた、本明細書にさらに記載する。
タンパク質チロシンリン酸化プロファイルは、したがって、試料中に存在するTKまたは免疫受容体の活性を含む、キナーゼまたは他のpTyrシグナル伝達の活性の指標として用いられてもよく、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングは、例えば、特異的なTK、ホスファターゼ、もしくは免疫受容体、またはTK、ホスファターゼ、もしくは免疫受容体のセットについて、特定の薬物もしくは薬物の組み合わせでの処置などの特異的な条件について、または、処置レジメンの経過にわたって処置をモニタリングするために行われてもよい。
したがって、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングは、タンパク質キナーゼ活性のプロファイリングを含んでもよい。本明細書において用いられる場合、タンパク質キナーゼ活性のプロファイリングとは、キナーゼの活性化ループ内またはその外側由来のものを含む、タンパク質キナーゼに由来するpTyr包含ペプチドの特定および任意の定量を通して、1種類または複数種類のタンパク質キナーゼの活性を試料において特定することを指す。そのようなタンパク質キナーゼには、TK、STK、または他の二重特異性キナーゼ、MAPキナーセ、または脂質キナーゼが含まれる。
同じように、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングは、したがって、免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達のプロファイリングを含んでもよい。本明細書において用いられる場合、免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達活性のプロファイリングまたは免疫プロファイリングとは、ITRMまたは他の免疫機能の調節物質に由来するpTyr包含ペプチドの特定および任意の定量を通して、1種類または複数種類の免疫受容体または他の免疫機能の調節物質の活性を試料において特定することを指す。免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達のプロファイリングは、ITAM配列、ITIM配列、およびITSM配列に対応するpTyr包含ペプチド（例えば、表2に示すもの）を特定すること、および任意で定量することによって実施されてもよい。免疫受容体中に存在するITAM配列、ITIM配列、またはITSM配列におけるチロシン残基のリン酸化は、ITAM配列を介する正の免疫調節またはITIM配列を介する負の免疫調節のいずれかに関与する免疫受容体を含む、対応する免疫受容体の活性化を示す。ITAM配列、ITIM配列、およびITSM配列は、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージを含む、様々な免疫細胞において見出すことができる。
（表２）ヒト免疫受容体に関連するITIM/ITAM/ITSM
Figure 2019527838
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本明細書において用いられる「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接続され、定義された配列を通常有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書において用いられる場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、いかなるN末端アミノ酸残基および／またはC末端アミノ酸残基も伴わないアミノ酸残基の鎖を指してもよいが、必ずしもそれを指す必要はない。すなわち、本明細書において用いられる「ペプチド」または「ポリペプチド」は、より長いアミノ酸の鎖内に埋め込まれたアミノ酸の鎖を指してもよい。本明細書において用いられる場合、「ペプチド」という用語は、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語を含んでいる。
「pTyr包含ペプチド」とは、アミノ酸残基のうちの1個がリン酸化チロシンである、上記で定義されたペプチドを指す。「Tyrリン酸化部位」とは、キナーゼ活性の標的であり、したがってリン酸化されることができる、チロシンキナーゼ中の活性化ループTyr残基およびITRMを含む、チロシンキナーゼの基質などの、ペプチド内のチロシン残基を指す。タンパク質は、1個または複数個のTyrリン酸化部位を有してもよい。当技術分野において理解されるように、Tyrリン酸化部位の特定、およびしたがって、試料におけるそのようなTyrリン酸化部位に対応するpTyr包含ペプチドの特定は、Tyrリン酸化部位に隣接するアミノ酸配列によって与えられる。用語が本明細書において用いられる場合、pTyr包含ペプチドを特定する工程は、ターゲットMS法を用いることを含み得る、pTyr包含ペプチドのセットが対応する特有のTyrリン酸化部位を特定する工程を指す。
SH2ドメインは、pTyr包含ペプチドを認識してそれに結合することが当技術分野において理解されている、タンパク質ドメインのファミリーであり、公知のSH2構造フォールドを有する。用語が本明細書において用いられる場合、SH2ドメインとは、公知のSH2ドメインと高度の配列類似性または配列同一性を有するポリペプチドを含む、当業者によってSH2ドメインと特定されるかまたは理解される、任意の天然に存在するかまたは操作されたポリペプチドを指す。公知のSH2ドメインとの高度の配列同一性は、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上であってもよい。
本明細書において定義される場合、バリアントSH2ドメインとは、公知のSH2ドメイン（特定のバリアントSH2ドメインについての参照SH2ドメインまたは親SH2ドメインとも呼ばれる）の公知の配列に基づいているが、公知のSH2ドメインの公知の配列と比較して置換されたSH2ドメイン内の特異的な位置を有する、SH2ドメインである。したがって、バリアントSH2ドメインは、バリアントSH2ドメインがそれから変わっている公知のSH2ドメインと比較した場合に、アミノ酸が異なるアミノ酸に置換されている、その配列内の1個または複数個の位置を有する。よって、任意の特定のバリアントSH2ドメインは、特異的な公知のSH2ドメインと比べて定義され、1つのバリアントSH2ドメインは、必ずしも、異なるバリアントSH2ドメインと同じ公知のSH2ドメインと比べていない。
親SH2ドメインは、行われる置換の前にバリアントのための出発配列として用いられる、生物医学的文献においてSH2ドメインとして特定された任意のポリペプチドであってもよい。いくつかの態様において、親SH2ドメインは、天然に存在する野生型SH2ドメインを含む、天然に存在するSH2ドメインであってもよい。いくつかの態様において、親SH2ドメインは、天然に存在することが知られていない設計された配列を有する、操作されたSH2ドメインであってもよい。
バリアントSH2ドメインは、親SH2ドメインと比較した場合に変わっている、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個、または1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、もしくは10個以上の位置を有してもよい。アミノ酸置換の位置は、pTyr結合ポケット、特異性結合ポケット、またはSH2ドメインの別の領域内で起こってもよい。バリアントSH2ドメインは、それから変わっている公知のSH2ドメインと少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を保有していてもよい。
バリアントSH2ドメインは、本明細書において定義されるような三重変異体、四重変異体、およびSH2スーパーバインダーを含む。
pTyr結合ポケット中の3個の特定のアミノ酸位置に3個の特定のアミノ酸置換を有するバリアントSH2ドメインを、本明細書において三重変異体（TrM）SH2ドメインバリアントと呼ぶ。pTyr結合ポケット内の3個の置換に加えて、特異性結合ポケット内に4個目のアミノ酸置換を有するバリアントSH2ドメインを、四重変異体（QuadM）と呼ぶ。例えば、その特異性結合ポケット中に追加的な変異（Thr218Trp）を有するヒトSrcタンパク質由来のTrM SH2ドメインバリアントを、本明細書においてQuadM Src SH2ドメインと呼ぶ。
バリアントSH2ドメインは、いくつかの態様において、その親ドメインと比べてアミノ酸置換の特異的なセットを有するように設計され、かつ、例えば、遺伝子操作法を用いて産生される、組換えドメインであってもよい。
したがって、方法において、試料内の、タンパク質キナーゼ活性または免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達を含むタンパク質チロシンリン酸化をプロファイリングするために、試料を、SH2スーパーバインダーであるバリアントSH2ドメインと接触させる。
試料は、タンパク質キナーゼ活性または免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達のプロファイルを含む、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイルがそれについて取得されることが望ましい、任意の試料であってもよい。したがって、試料は、生物学的材料を含有し、かつ、キナーゼ活性化ループなどのキナーゼ内、ホスファターゼ調節領域内、ITRM内、ならびにキナーゼおよびホスファターゼの下流標的内を含む、pTyr包含ペプチドなどの活性タンパク質キナーゼによって修飾された活性タンパク質キナーゼまたはペプチドを含有するか、または含有する疑いがある任意の試料であってもよい。
試料は、確立された細胞株；初代細胞培養物を含む、細胞培養物；血清、血漿、尿、または血液などの生体液；組織試料；または組織抽出物を含んでもよいが、それらに限定されない。試料は、起源がヒトもしくは非ヒトであってもよく、または、ヒトもしくは非ヒトのタンパク質キナーゼ活性、またはヒトもしくは非ヒトのpTyr包含ペプチドを含有してもよい。
試料は、ヒトであってもよく、またはヒトでなくてもよい対象から、侵襲的技法または非侵襲的技法によって取得することができる、任意の試料であってもよい。そのような試料は、当技術分野において公知の任意の標準的な方法によって取得されてもよく、例えば、指先穿刺血液試料、頬側スワブ、腫瘍由来を含む生検材料、テープストリップなどである。試料は、正常試料（例えば、健常もしくは非罹患）、または罹患試料（例えば、腫瘍から、または、がん、アルツハイマー病を含む脳疾患、ウイルス感染症、もしくは任意の他の疾患などの疾患を患っている対象、またはそのような疾患を患っている疑いがある対象から採取された試料）であってもよい。試料は、生検部位とは異なる位置から転移してきた疑いがあり得る腫瘍を含む、腫瘍の生検材料由来であってもよい。
試料は、1種類または複数種類のキナーゼ阻害物質またはホスファターゼ阻害物質に曝露されていることを含む、併用薬物処置を含む疾患のための薬物処置に曝露された試料であってもよく、または、そのような処置に対する曝露がされていなくてもよい。
試料は、接触させる工程の前に、試料内の任意のpTyr包含ペプチドに対するSH2スーパーバインダーの結合を増大させるために処理されてもよい。試料は、試料中に含有されている細胞を溶解するように、および、方法の最中にpTyr包含ペプチドを別のやり方で保存するように処理されてもよい。試料は、例えば、PDL1、CD28、またはTCR刺激を含む、シグナル伝達分子での活性化または阻害によって撹乱されてもよい。
例えば、試料は、より短いpTyr包含ペプチドを生じるように完全長タンパク質を消化するために、1種類または複数種類のプロテアーゼで処理されてもよく、例えば、トリプシンなどのエンドペプチダーゼで処理されてもよい。必要な場合、プロテアーゼは、処理された試料をSH2スーパーバインダーと接触させる前に、阻害または不活性化されてもよい。
別の例において、試料は、SH2スーパーバインダーと接触させる前に、pTyr包含ペプチド内のpTyrの分解を阻止するために、ホスファターゼ阻害物質で処理されてもよい。
プロファイリングを行うために、試料を、SH2スーパーバインダーと接触させる。
本明細書において、SH2スーパーバインダー、またはスーパーバインダーという用語は、pTyr結合ポケット中に1個または複数個のアミノ酸置換を含み、該置換が、SH2スーパーバインダーがそれから変わっており、かつそのような置換を有さない親SH2ドメインと比較した場合に、pTyr残基、またはpTyr包含ペプチド内に位置するpTyr残基に対して増大した親和性を有するSH2スーパーバインダーを結果としてもたらす、バリアントSH2ドメインを指す。概して、SH2スーパーバインダーの親和性は、親SH2ドメインと比べて、約20倍以上、約30倍以上、約40倍以上、約50倍以上、約100倍以上、約200倍以上、約300倍以上、または約500倍以上を含み、約10倍以上増大している。
SH2スーパーバインダーを含む、バリアントSH2ドメインの相対親和性は、Kaneko, T. et al., "SH2 Superbinders act as antagonists of cell signaling", (2012) Sci. Signal. 5: ra68および米国特許出願公開第14/388,592号に記載されている通りを含む、当技術分野において公知の結合アッセイを用いて、関連する親SH2ドメインの親和性と比較して容易に査定することができる。
SH2スーパーバインダーは、ヒトタンパク質Src、Grb2、およびFyn由来の、単一、二重、三重、または四重の変異体SH2ドメインを含む。例えば、以下がSH2スーパーバインダーである：（i）Thr183Val（位置1）、Cys188Ala（位置2）、および／またはLys206Leu（位置3）に置換を有するTrMヒトSrc SH2ドメインバリアント（アミノ酸番号は、SEQ ID NO: 1として提供される完全長野生型ヒトSrcタンパク質と比べている）；（ii）上記の位置の3個すべてに置換を有するTrMヒトSrc SH2ドメインバリアント；（iii）Ala91Val（位置1）、Ser96Ala（位置2）、および／またはLys109Leu（位置3）に置換を有するヒトGrb2 SH2ドメインバリアント（アミノ酸番号は、SEQ ID NO: 2として提供される完全長野生型ヒトGrb2タンパク質と比べている）；（iv）上記の位置の3個すべてに置換を有するTrMヒトGrb2 SH2ドメインバリアント；（v）Thr181Val（位置1）、Ser186Ala（位置2）、および／またはLys204Leu（位置3）に置換を有するヒトFyn SH2ドメインバリアント（アミノ酸番号は、SEQ ID NO: 3として提供される完全長野生型ヒトFynタンパク質と比べている）；ならびに（vi）上記の位置の3個すべてに置換を有するヒトFyn SH2ドメインバリアント。これらのバリアントSH2ドメインのすべては、親SH2ドメインと比べて、pTyr包含ペプチドに対する大いに増大した親和性を有することが、以前に実証されている。
SH2スーパーバインダーはまた、任意の他の親SH2ドメインのTrMバリアントを含んでもよく、それは、位置1から3のTrM SH2ドメインが、位置1から3のTrMヒトSrc SH2ドメインにおいて見出されるものと同じアミノ酸を有し、位置1から3が、親SH2ドメインおよび野生型ヒトSrc SH2ドメインの配列を整列させることによって発見可能であることを意味する。SH2ドメインファミリーの構造は保存されているため、他のSH2ドメインにおいて相同な位置に同じ3個の置換を行うことは、pTyr包含ペプチドに対するその親和性を著しく増大させるであろうと、期待することができる。
特に、SH2スーパーバインダーは、親SH2ドメインが、ヒトゲノムによってコードされているペプチドなどの、天然に存在するペプチドであるTrMバリアントを含んでもよく、結果として生じたSH2スーパーバインダーは、その天然に存在するペプチドに対して高度の配列類似性または配列同一性を有する。天然に存在する親ペプチドに対する高度の配列類似性または配列同一性は、50％以上、60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上であってもよい。
SH2スーパーバインダーは、TrMバリアントを含む、pTyr結合ポケット内の単一、二重、三重の置換に基づいてもよいが、pTyr結合ポケットの外側を含む、1個または複数個の追加的な置換をさらに含んでもよく、該追加的な置換は、そのような追加的な置換を有さないSH2スーパーバインダーバリアントの増大した親和性と比較した場合に、pTyr包含ペプチドに対する結合親和性にいずれかの効果を有してもよく、または有さなくてもよい。SH2スーパーバインダーを定義する置換、例えば、pTyr結合ポケット中のサブステーション（substation）、およびQuadMの場合には、特異性結合ポケット中の追加的な置換に加えて、スーパーバインダーは、SH2スーパーバインダーを定義する置換に加えて親SH2ドメインと比べて、追加的な1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、または10個以上のアミノ酸置換を有してもよい。
すなわち、例えば、SH2スーパーバインダーは、TrM SH2スーパーバインダーについて定義された3個の置換を有するバリアントSH2ドメインであってもよく、親と比較した場合にTrM SH2スーパーバインダーと少なくとも同じ、pTyr包含ペプチドに対する増大した親和性を有してもよく、TrMバリアントSH2スーパーバインダーを定義する3個の置換に加えて親SH2ドメインと比べて、追加的な1個または複数個のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、そのような追加的な置換は、そのような置換を有さないTrMバリアントと比較した場合に、TrMバリアントSH2スーパーバインダーの親和性を低減させる可能性があるが、それでもやはり、本明細書において定義されるような親SH2ドメインと比較した場合に、増大したpTyr結合親和性を有するSH2スーパーバインダーを生じる。
したがって、SH2スーパーバインダーは、（すなわち、TrMの）pTyr結合ポケット中の3個の定義された置換を含むか、それからなるか、もしくはそれから本質的になってもよく、または、（すなわち、QuadMの）pTyr結合ポケット中の3個の定義された置換および特異性結合ポケット中の1個の定義された置換を含むか、それからなるか、もしくはそれから本質的になってもよい。本明細書において用いられる場合、から本質的になるとは、スーパーバインダーが、定義された3個または4個の置換に加えて、1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、または1〜10個、または1〜5個の、親SH2ドメインと比べて追加的なアミノ酸置換を有してもよく、該追加的な置換のいずれかは、追加的なアミノ酸置換が、親SH2ドメインと比較して増大したスーパーバインダーの親和性に影響を与えず、かつ親と比べたパーセント配列同一性が少なくとも30％であるという条件で、pTyr結合ポケット、特異性結合ポケット、またはSH2ドメインの別の領域内であってもよいことを意味する。
SH2スーパーバインダーは、SEQ ID NO: 5、7、9、12、または14に示すような配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
SH2スーパーバインダーは、参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許出願公開第14/388,592号において特定された、他のバリアントSH2ドメインを含んでもよい。
対応するSH2スーパーバインダーを結果としてもたらす親SH2ドメイン中の置換はまた、米国特許出願公開第14/388,592号に記載されているような、親SH2ドメインにおいてpTyr結合ポケットを形成する15アミノ酸残基のうちの1個または複数個を、20種類の天然に存在するアミノ酸のうちの1種類で無作為に置換することによって創出された、バリアントSH2ドメインのライブラリーのファージディスプレイスクリーニングによることを含む、当業者に公知の手段によっても発見することができる。
ペプチド間の配列同一性は、比較の目的で整列させたアミノ酸残基の各配列における位置を比較することによって決定することができる。配列間の配列同一性は、アラインメントにおける配列によって共有される、一致する位置の割合である。当業者によって理解されるであろうように、2種類以上のアミノ酸配列を、アミノ酸同一性および／または類似性の局面を最大化するように探して最適なまたは好ましいアラインメントを達成する、周知の標準的なアルゴリズムによって整列させることができる。
認識されるであろうように、SH2スーパーバインダーのための親SH2ドメインは、哺乳動物を含むヒト以外の真核生物由来、ウイルス由来のSH2ドメイン、および人工的に作られた配列であってもよい。
他の真核生物由来の親SH2ドメインの例として、親SH2ドメインは、ヒトSrcタンパク質（SEQ ID NO: 1）、ヒトGrb2タンパク質（SEQ ID NO: 2）、ヒトFynタンパク質（SEQ ID NO: 3）、または、生物医学的文献において特定されているようなSH2ドメインを含む任意の他のヒトタンパク質のホモログであるタンパク質の一部であってもよく、該ホモログは、任意の真核生物、動物、または哺乳動物の遺伝子またはゲノムによってコードされている。親SH2ドメインは、天然に存在する遺伝子またはゲノムによってコードされているものである必要はないが、pTyr包含ペプチドに対する親和性に影響を及ぼさないアミノ酸置換を有するSH2ドメインを含むことができると、認識および理解されるであろう。
ウイルス由来の親SH2ドメインの例として、親SH2ドメインは、ヒトSrcのウイルスホモログである、ラウス肉腫ウイルスによってコードされているv-Srcであってもよい。
人工的に作られた配列である親SH2ドメインの例として、当業者によって認識されるであろうように、1種類または複数種類の哺乳動物SH2ドメイン配列の配列を組み合わせることによって、SH2ドメイン配列を設計することができ、それは、コンセンサスSH2ドメイン配列または典型的SH2ドメイン配列を表し得るが、いかなる哺乳動物SH2とも同一ではないと考えられる。
SH2スーパーバインダーは、ヘキサヒスチジン（His6）タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タグ、FLAGタグなどのような親和性タグを形成するアミノ酸を含む、より大きなポリペプチドの一部であることができるとも、認識および理解されるであろう。例えば、SH2スーパーバインダーは、SEQ ID NO: 11または13に示すような配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
1種類よりも多いSH2スーパーバインダーを、試料を接触させ、したがってプロファイリングを行うために用いることができる。当業者によって認識されるであろうように、pTyr包含ペプチドに対する親和性試薬として方法において1種類よりも多いSH2スーパーバインダーを用いることにより、個々のSH2スーパーバインダーの配列特異性に起因し得る、濃縮されたpTyr包含ペプチドの集団における任意のバイアスを低減させるかまたは削除することによって、Tyrリン酸化プロテオームのより良好な適用範囲が可能になり得る。
同様に、SH2スーパーバインダーは、リガンドペプチドにおいてC末端残基に対する配列特異性を低減させるか、削除するか、または変更する可能性がある、特異性ポケットにおけるアミノ酸の置換を有することができる。例は、実施例においてさらに考察するような、前述のQuadM Src SH2ドメインバリアントである。
あるいは、タンパク質は、複数のSH2ドメインを含有するように設計されてもよく、その中でそれらのうちの少なくとも1つは、SH2スーパーバインダーである。例えば、複数のSH2スーパーバインダーを含み、その各々が異なるpTyr包含ペプチドを標的とするタンパク質が、設計および創出されてもよい。マルチSH2ドメイン構築物におけるSH2スーパーバインダーの使用は、単一ポリペプチド分子中に複数のpTyr残基を含有するものを含む、特定の標的タンパク質に対する結合親和性をさらに増大させ得る。そのような構築物において、SH2ドメインは、好ましくはグリシンを含有するポリペプチドである、可撓性リンカーによって接続することができる。リンカーの長さおよび組成の変動は、マルチSH2ドメインタンパク質の結合親和性を調整し得る。マルチSH2ドメインタンパク質は、単一タンパク質の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ITAM）モチーフなどのマルチpTyr領域に対する増大した親和性を有し得る。マルチSH2ドメインタンパク質はまた、標的タンパク質中のpTyr部位を通して複数のタンパク質を架橋するようにも働き得る。本開示の方法は、したがって、複数のSH2ドメインを含み、そのうちの少なくとも1種類はスーパーバインダーである、すべてのそのような新規タンパク質を含む。
タンパク質はまた、1種類または複数種類のSH2スーパーバインダーおよび他のモジュラータンパク質ドメイン、例えば、他のpTyr結合ドメイン（例えば、PTBドメイン）、pSer/pThr結合ドメイン（例えば、ある特定の14-3-3ドメインおよびWD40ドメイン）、およびユビキチン結合ドメインを含むように設計されてもよい。本開示の方法は、したがって、すべてのそのような新規タンパク質を含む。
SH2スーパーバインダーは、したがって、SEQ ID NO: 15に示すような配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
本開示のSH2スーパーバインダーは、合成ペプチドを生成するための、固相合成（Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 65:2149 (1964)；J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963)；およびInt. J. Peptide Protein Res. 35:161-214 (1990)）または均質溶液中の合成（Methods of Organic Chemistry, E. Wansch (Ed.), Vol. 15, pts. I and II, Thieme, Stuttgart (1987)）を含む、ペプチド合成の技術分野における任意の公知の方法によって合成されてもよい。
あるいは、およびより単純に、本開示のバリアントSH2ドメインは、標準的な組換えDNA法で作製することができる。例として、大腸菌を、親和性タグ付加SH2スーパーバインダーをコードするプラスミドで形質転換することができ、高レベルのSH2スーパーバインダーの発現を誘導することができ、SH2スーパーバインダーを、親和性タグに対応する親和性試薬で大腸菌細胞溶解物から精製することができる。
方法において、プロファイルを取得するために、SH2スーパーバインダーを試料と接触させる。
SH2スーパーバインダーは、飽和量または飽和濃度以下で試料と接触させてもよい。
当業者によって理解されるであろうように、SH2スーパーバインダーの飽和量または飽和濃度とは、pTyr包含ペプチドとの結合反応が起こる溶液の体積内の、pTyr包含ペプチドの最大数またはほぼ最大数が濃縮される、それらのペプチドの特定および定量によって後で決定されるような、SH2スーパーバインダーの最低量を指す。すなわち、結合反応中のSH2スーパーバインダーの量が増大するにつれて、そのSH2スーパーバインダーが結合した（ならびに後で特定および定量された）pTyr包含ペプチドの数が、そのSH2スーパーバインダーが結合することができるpTyr包含ペプチドのすべてまたはほぼすべてがそのように結合している点まで、増大することが期待されるであろう。この点で、SH2スーパーバインダーの量は、飽和していると言われる。飽和量または飽和濃度よりも高いSH2スーパーバインダーの任意の量もまた、飽和量または飽和濃度であることが、さらに認識されるであろう。
所定のアッセイについての飽和量または飽和濃度は、既知量のある特定の試料タイプについてSH2スーパーバインダーの濃度を増大させることを用いた標準的な結合曲線の使用を含む、日常的な実験法を用いて、当業者が容易に決定することができる。
方法は、試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程に続いて、SH2スーパーバインダーに目下結合している任意のpTyr包含ペプチドを試料から除去または単離する工程、およびその後の、このように試料から除去されたpTyr包含ペプチドを特定する工程を含む。
したがって、方法において、精製SH2スーパーバインダーを、試料内に含有されているpTyr包含ペプチドを特定のために単離し、したがってpTyr包含ペプチド画分を濃縮するために用いることができる。単離は、例えば、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーを含む液体クロマトグラフィー法、免疫沈降法、サイズ排除法、および質量分析を含む、当業者に周知の技法を用いて行われてもよい。
残りの試料内容物からの分離を容易にする目的で、SH2スーパーバインダーは、pTyr包含ペプチドの試料からの単離および特定を助けるために固体支持体上に固定化されてもよい。
本明細書において用いられる場合、「固体支持体」、「マトリクス」、および「樹脂」という用語は、本明細書において開示される親和性試薬に結合することができる任意の支持体を指し、かつそれを含む。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ならびに磁鉄鉱が含まれる。支持体材料は、カップリングした親和性試薬がペプチドおよび／またはタンパク質に結合することができる限り、実質的には任意の可能な構造的形状を有してもよい。したがって、支持体形状は、ビーズにおけるように球形であってもよく、または、試験管の内側表面もしくはロッドの外表面におけるように円柱形であってもよい。あるいは、表面は、シート、試験紙などのように平坦であってもよい。固体支持体は、セファロースビーズまたはポリスチレンビーズであってもよい。当業者は、結合親和性試薬に適している多くの他の担体を知っているか、または、日常的な実験法の使用によってそれを確認することができるであろう。
例として、共有結合性（例えば、架橋もしくは直接カップリングを介して）または非共有結合性（例えば、親和性タグを介して）のいずれかで固体支持体に結合したSH2スーパーバインダーを、生物学的試料から取得され、適している緩衝溶液中に溶解されているペプチドの混合物と接触させることができる。SH2スーパーバインダーは、完全長タンパク質に結合することが期待できるが、スーパーバインダー濃縮の前に、生物学的試料由来のタンパク質をエンドペプチダーゼ（例えば、トリプシン）で消化することが望ましい場合がある。pTyr包含ペプチドがひとたびSH2スーパーバインダーに結合したら、固体支持体を、ペプチド溶液から除去し、適切な洗浄溶液で1回または複数回洗浄する。SH2スーパーバインダーに結合したままであるpTyr包含ペプチドを、次いで溶出し、スーパーバインダーから分離して、任意で別の親和性試薬（例えば、IMAC）を用いてさらに濃縮する。認識されるであろうように、結合、洗浄、および溶出の工程について、固体支持体に結合したSH2スーパーバインダーは、カラム中にあることができる。あるいは、固体支持体は、種々の溶液中に遊離していることができ、例えば、洗浄工程および溶出工程の最中に遠心分離によって単離することができる。
pTyr包含ペプチドは、SH2スーパーバインダーとの結合を介して残りの試料からひとたび単離すると、当技術分野において公知の任意の方法で特定し、任意で定量することができ、該方法は、適切なタイプの質量分析を含んでもよく、それはまた、一次元（1D）または二次元（2D）の液体クロマトグラフィー（LC）が先行してもよい。
特定法は、部分的には、特定され、任意で定量されるべきpTyr結合ペプチドのセットに依存して、選択されてもよい。
例えば、プロファイリング質量分析法は、試料由来のすべてのまたは本質的にすべての検出可能なpTyr結合ペプチドを含有するセットを含む、pTyr結合ペプチドの広いセットを特定し、任意で定量するために用いられてもよい。
別の例において、ターゲット質量分析法が、試料由来のすべての検出可能なpTyr結合ペプチドの定義されたサブセットを含有するセット、例えば、正の調節領域または負の調節領域を含む、活性化ループ内または活性化ループの外側を含む1種類または複数種類の特異的なキナーゼ由来のpTyr結合ペプチドを標的とするセットを含む、pTyr結合ペプチドの特異的なセットを特定し、任意で定量するために用いられてもよい。セットは、1種類または複数種類のITRMを含む1種類または複数種類の免疫受容体由来、例えば、ITIM、およびITAMまたはITSM由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。セットは、正の調節領域または負の調節領域を含む、調節領域由来を含む、1種類または複数種類の特定のタンパク質チロシンホスファターゼ由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。セットは、キナーゼの1種類もしくは複数種類の下流標的基質、またはタンパク質チロシンホスファターゼの1種類もしくは複数種類の下流標的基質由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。
セットは、所定の薬物処置に対する正もしくは負の応答に関連する、または薬物処置によって阻害されることが公知のキナーゼ内の、pTyr包含ペプチドを含んでもよい。セットは、シグナル伝達経路に関連するpTyr包含ペプチドを含んでもよい。
セットは、試料中の細胞がそれ起源である特定の細胞タイプまたは組織タイプの特定を可能にする、細胞マーカーまたは組織マーカー由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。例えば、pTyr包含ペプチドは、生検材料の部位に対応する細胞タイプもしくは組織タイプ由来であってもよく、または、転移性がん、例えば、***組織、脳組織、もしくは肺組織に関連する細胞タイプもしくは組織タイプ由来であってもよい。pTyr包含ペプチドは、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージを含む、1種類または複数種類の免疫細胞タイプに関連してもよい。
したがって、下記のように、記載した方法は、種々の記載したパラメータの選択に関してを含み、さらに仕立てられるかまたはカスタマイズされてもよい。
多種多様の質量分析（MS）法が、当技術分野において公知である。例えば、Mann et al., Ann. Rev. Biochem., (2001) 70:437-473；Wissing et al., Mol. Cell. Proteomics, (2007) 6:537-547を参照されたい。MS法の例には、以下が含まれる：タンデムMS（MS/MS）（Gerber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (2003) 100: 6940-6945；WO 2006/134056）；多重反応モニタリング（MRM）（Hardt et al., 2008 Thermo Scientific Application note: 451, (2008)；Kuhn et al., Proteomics, (2004) 4:11751186）；並列反応モニタリング（Peterson et al., Mol. Cell. Proteomics, (2012) 11:1475-1488）；細胞培養におけるアミノ酸での安定同位体標識（SILAC）（US 2010/0279891；Daub et al., Mol. Cell, (2008) 31:438-448；Ong et al., Mol. Cell. Proteomics, (2002) 1:376-386）；スーパーSILAC、SILACのためのスパイクインミックス（spike-in mix）（Geiger et al., Nat. Meth., (2010) 7:383-387；Geiger et al., Nat. Prot. (2011) 6:147-157）；およびリンペプチドの二酸化チタン濃縮（Thingholm et al., Nat. Prot. (2006) 1: 1929-1935）。
MSを用いて、リン酸化の相対的定量が、ピーク体積を決定することによる個々のpTyr包含ペプチドの無標識定量によって得られ得る。そのような定量は、さらに、GSK-3βの活性化ループ内の部位Tyr216などの、構成的にリン酸化されたpTyr包含ペプチドに対する比較を含んでもよい（Cole, A. et al., "Further evidence that the tyrosine phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 (GSK3) in mammalian cells is an autophosphorylation event", (2004) Biochem. J. 377:249-255；Hughes, K. et al., "Modulation of the glycogen synthase kinase-3 family by tyrosine phosphorylation", (1993) EMBO J. 12:803-808）。加えて、絶対的定量は、関心対象のリンペプチドを表す安定同位体標識ペプチドのあらかじめ決定された量をMS試料中にスパイクすることによって達成され得る（Gillette, M. A. and Carr, S. A., "Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry" (2013) Nat. Methods 10, 28-34）。
特に、MRM、SRM、または並列反応モニタリング（PRM）などのターゲットMS法を用いることができる（Liebler, D. C. and Zimmerman, L. J., "Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry" (2013) Biochemistry 52:3797-3806）。MRMは、親ペプチドを検出するために、娘イオンのあらかじめ決定されたリストを用いる。MRMは、ショットガンLC-MS/MSアプローチよりも1〜2桁感度が高い（Picotti P. and Aebersold R., "Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions", (2012) Nat. Methods 9:555-566；Liu H. et al., "A method for systematic mapping of protein lysine methylation identifies functions for HP1beta in DNA damage response", (2013) Mol. Cell 50:723-735）。
方法は、プロファイリングされるべき試料に加えて、対照試料または比較試料を用いて行われてもよく、試験試料について取得されたプロファイルを、対照試料または比較試料について取得されたプロファイルと比較することができる。対照試料または比較試料は、標準的な実験法に合わせて、所定の試験試料についての任意の適切な陽性対照または陰性対照として設計されてもよい。
例えば、対照試料または比較試料は、検出されるべき疾患を有さないことが既知の健常な個体または細胞試料から、あるいは、特異的な疾患を有するか、または特異的な疾患もしくは障害に関連する表現型を提示することが既知の供給源から取得された試料であってもよい。対照試料は、特定の細胞タイプまたは組織タイプ由来であってもよい。対照試料または比較試料は、薬物もしくは処置レジメン、またはキナーゼもしくはホスファターゼの阻害物質に曝露されたか、または曝露されていない試料であってもよいのに対して、試験試料は、対照と同じ処置状況または反対の処置状況を有していてもよい。比較試料または対照試料は、処置レジメンの最中の異なる時に、試験試料と同じ供給源または対象から取得されてもよい。比較試料または対照試料は、1種類または複数種類の特異的なキナーゼまたはタンパク質チロシンホスファターゼについて、既知のキナーゼ上方制御または下方制御を有してもよく、例えば、特異的なキナーゼについて変異を有することが既知であるか、または特異的なキナーゼを遺伝子導入で発現していることが既知である細胞由来の試料であってもよい。
SH2スーパーバインダーの結合親和性は、様々な異なる適用または解析における、本明細書において開示される方法の使用を可能にするように、選択された特定法および特異的な試料タイプと組み合わされてもよい。例えば、および本明細書に記載したように、プロファイリングは、試験試料および／または対照試料が方法における使用の前に曝露されている条件を含む、用いられる試験試料および／または対照試料のタイプ、用いられる特異的な特定法および任意の定量法、ならびに特定されるべきpTyr包含ペプチドの特異的なセットを具体的に選択することによって変動し得る。これらのパラメータの変動は、様々な適用または解析に適している、様々なプロファイルを結果としてもたらすことができる。すべてのそのような変動および態様は、本開示の範囲内である。
したがって、本明細書に記載した方法を用いた、試料内のホスホチロシンシグナル伝達活性のプロファイリングは、任意の疾患状態を含む、任意の細胞状態への洞察を提供するために用いることができる。ヒトがん、ならびに、TK標的療法および免疫療法を含む、治療法に対する腫瘍応答におけるTKの重要性を考慮すると、本開示の方法は、ヒトがんの研究、診断、予後判定、および治療法において特に有用であり得る。
開示する方法の以下に記載する変動は、例証となる。
方法は、以下の工程を含む、試験試料のタンパク質チロシンリン酸化をプロファイリングする方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料を飽和量のSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；ならびに、単離された画分において検出可能であるpTyr結合ペプチドのすべてまたは本質的にすべてを特定し、任意で定量するために、プロファイリングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。
方法は、以下の工程を含む、試験試料のタンパク質チロシンリン酸化のサブセットをプロファイリングする方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定し、任意で定量するために、ターゲティングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。サブセットは、例えば、1種類もしくは複数種類のキナーゼ活性化ループ、1種類もしくは複数種類のITRM、またはタンパク質チロシンホスファターゼの1種類もしくは複数種類の調節領域由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。接触させる工程は、飽和量、または飽和量よりも少ない量のSH2スーパーバインダーを用いることを含んでもよい。MS法は、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよい。試験試料は、健常な細胞もしくは組織の供給源、または、がん、アルツハイマー病を有するかもしくはそれに関与している、またはウイルスに感染していることが既知の細胞もしくは組織を含む、罹患した細胞もしくは組織の供給源由来であってもよい。
特定され、任意で定量されたpTyr包含ペプチドのセットを、TK、STS、二重特異性キナーゼ、MAPキナーゼ、および脂質キナーゼを含むキナーゼの活性化ループ内に位置するものに焦点を合わせることによって、試料内のキナーゼ活性をこのようにプロファイリングすることが可能である。
例として、TK活性のプロファイリングは、がん性細胞の増殖、広がり、または薬物耐性を駆動するTKを特定することができる。そのようながんドライバーは、次に、薬理学的介入のための有効な標的であることが判明する場合がある。そのようなプロファイリングは、がん療法に対する耐性を低減させるかまたは回避する手段として、特定の利点を提供し得る。TK標的療法は、多くの場合、患者に対して短期の恩恵を呈するが、耐性が急速に生じる可能性がある。耐性の機序は、いろいろであるが、非標的チロシンキナーゼの活性化が、従来療法およびTK標的療法の両方に対する耐性の共通の原因である（Holohan, C. et al., "Cancer drug resistance: an evolving paradigm", (2013) Nature Reviews Cancer 13:714-726）。概して、異常なチロシンキナーゼが、すべてではないが、多くのがん細胞の鍵となる特徴である、MAPKシグナル伝達経路およびPI3Kシグナル伝達経路を介して、細胞増殖および不死を刺激する。
代謝拮抗物質およびトポイソメラーゼ阻害物質などの従来のがん療法については、ErbB2受容体チロシンキナーゼの活性化の増大が、耐性の原因であり得る（Hurwitz, J. L. et al., "Vorinostat/SAHA-induced apoptosis in malignant mesothelioma is FLIP/caspase 8-dependent and HR23B-independent" (2012) Eur. J. Cancer 48:1096-1107；Wilson, T. R. et al., "Procaspase 8 overexpression in non-small-cell lung cancer promotes apoptosis induced by FLIP silencing" (2009) Cell Death Differ. 16:1352-1361）。
TKを特異的にターゲティングする場合、薬物耐性は、チロシンキナーゼの間の機能的重複および交差活性化のために、より一般的である。1つの例として、ErbB2過剰活性化として診断されるHER2オンコジーンは、すべての乳がんのうち最大で30％に相当する（Slamon, D. J. et al., "Human breast cancer: Correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene", (1987) Science 235:182-191）。トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））は、このがんタイプについて最初に認可された標的治療薬である。しかし、HER2陽性乳がんを有する約70％の患者は、内因性耐性を有し、トラスツズマブに応答しない（Vogel, C. L. et al., "Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer", (2002) Journal of Clinical Oncology 20:719-726）。加えて、最初にトラスツズマブに応答する患者の最大で70％が、処置の1年以内に疾患再発に苦しみ（Gajria, D. and Chandarlapaty, S., "HER2-amplified breast cancer: mechanisms of trastuzumab resistance and novel targeted therapies", (2011) Expert Rev. Anticancer Ther. 11:263-275）、急速に発生する獲得耐性が示唆される。
獲得耐性の問題を考慮すると、TK活性の体系的評価は、耐性機序を理解するため、および耐性を克服する併用療法を設計するために重要である。そのようなアプローチは、がんの予後を判定し、処置レジメンの有効性を改善するために、腫瘍の再発の前に耐性を十分に予測する能力を有する。
タンパク質キナーゼ活性または免疫シグナル伝達活性のプロファイリングは、免疫細胞機能を測定し、かつそれについての新規アッセイの潜在的な開発を可能にする上で有用であり得る。
そのようなプロファイリングはまた、標的療法または免疫療法のための患者の層別化についての有用な情報も提供し得る。例えば、活性化TKの存在は、そのTKをターゲティングする治療法の利用のためにバイオマーカーとして用いることができ；SAP-MRM法またはSAP-PRM法を用いて、T細胞受容体のCD3サブユニットまたはT細胞シグナル伝達の他の調節物質のリン酸化を特定することによって検出することができる、浸潤T細胞の存在は、T細胞活性を増大させるように設計されている免疫療法に対する好都合の応答を示すと考えられる。
1つの例として、本開示の態様は、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）およびそのリガンドPD-L1に向けられた治療法に対する応答を予測し、かつモニタリングする上で有用であり得る。PD-1に対するリガンド結合（PD-L1）は、ITIMおよびITSMのTyr残基上でのPD-1のリン酸化につながり、それが次に、SH2ドメイン含有ホスファターゼ2（SHP2）を動員して、TK ZAP-70を脱リン酸化し、T細胞の不活性化を結果としてもたらす。モノクローナル抗体でのPD-1の遮断は、このプロセスを逆転させることになり、PD-1中のITIMおよびITSMのTyrのリン酸化の減少、ならびにZAP-70およびTCR共受容体の活性化ループのリン酸化の増大を顕在化する。腫瘍針生検による、または循環T細胞の収集による、PD-1のITIMおよびITSM、TCR共受容体中のITAM配列、ならびにZAP-70の活性化ループのTyrリン酸化のモニタリングは、（i）抗PD-1抗体療法の効力（例えば、PD-1 ITSM/ITIMリン酸化の減少およびTCR/ZAP-70リン酸化の増大）を評価する；（ii）表現型応答が観察されるずっと前に、抗PD-1抗体療法に対する患者応答を予測し、患者をできる限り層別化するために用いることができる。これらのアプローチおよび関連したアプローチはまた、例えば、JAK1/2/3、TYK1/2、およびSTAT1/2/3のTyrリン酸化を定量することによる、JAK1/STAT経路を通したサイトカインシグナル伝達のモニタリングを含んでもよい。
したがって、上述のように、プロファイリングは、タンパク質キナーゼ活性のプロファイリングを含んでもよい。そのような態様は、がんなどの疾患の発生または進行に関与することが公知の1種類または複数種類のキナーゼ由来を含む、1種類または複数種類のキナーゼのキナーゼ活性化ループから、またはキナーゼ活性化ループの外側からを含む、1種類または複数種類のキナーゼ由来のpTyr包含ペプチドの特定および任意の定量を含んでもよい。いくつかの態様において、用いられる試料は、例えばがんを含む、特異的な疾患のための薬物処置レジメンに曝露された供給源もしくは試料由来であってもよく、または、がんを含む特異的な疾患もしくは障害を有するかもしくはそれに関与している疑いがあるか、またはがんを含む特異的な疾患もしくは障害を有するかもしくはそれに関与していることが既知の供給源もしくは試料由来であってもよい。がんは、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、または白血病を含む、任意のタイプのがんであってもよい。薬物での処置の前後に採取された試料が、プロファイリングされてもよく、プロファイルは、用いられた薬物に対する試料内のキナーゼの感受性または耐性を決定するために比較されてもよい。
したがって、方法は、以下の工程を含む、試験試料のチロシンキナーゼ活性をプロファイリングする方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、チロシンキナーゼのキナーゼ活性化ループ内のpTyr包含ペプチドを特定するために、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよいターゲティングMS法を用いて、試験試料から単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。方法は、以下の工程をさらに含んでもよい：対照試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、対照試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、対照試料から単離する工程；および、チロシンキナーゼのキナーゼ活性化ループ内のpTyr包含ペプチドを特定するために、ターゲティングMS法を用いて、対照試料から単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程、ならびに、試験試料について取得されたプロファイルを、対照試料について取得されたプロファイルと比較する工程。試験試料は、疾患を患っているか、または疾患を患っている疑いがあるヒト対象由来を含む、罹患した細胞または組織のものであってもよい。そのような罹患した細胞または組織は、がん、アルツハイマー病を有するかもしくはそれに関与している、またはウイルスに感染していることが既知の細胞または組織を含んでもよい。対照試料は、健常な細胞もしくは組織から取得されてもよく、または、試験試料と同じ供給源由来であってもよい。例えば、非アルツハイマー病試料、またはウイルスに感染していない試料と比較する工程は、この疾患の診断または予後判定にとって適切であり得る。
方法は、したがって、特異的なチロシンキナーゼの活性化の増大または減少を含む、チロシンリン酸化における変化に関連する任意の疾患の診断または予後判定のためであってもよい。
様々な態様において、試験試料は、キナーゼ阻害物質で、または、がんなどの疾患の処置について公知であるかもしくは試験されるべき薬物で処置されてもよく、対照試料は、そのような処置がないことにおいてのみ試験試料と異なっていてもよい。経時的を含むそのような比較は、例えば、試験試料におけるチロシンリン酸化の減少によって査定された場合に、経時的を含む処置の効力を示し得る。
方法は、したがって、以下の工程を含む、試験試料の薬物に対する細胞応答を検出する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定するために、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよいターゲティングMS法を用いて、試験試料から単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。サブセットは、1種類もしくは複数種類のキナーゼ活性化ループ、または、キナーゼの1種類もしくは複数種類の下流標的基質由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。試験試料は、罹患した細胞または組織の供給源から取得されてもよい。そのような罹患した細胞または組織は、がん、アルツハイマー病を有するかもしくはそれに関与している、またはウイルスに感染していることが既知の細胞または組織を含んでもよく、生検試料であってもよい。試験試料は、キナーゼ阻害物質もしくは他の調節性阻害物質で、または、疾患の処置について公知であるかもしくは試験されるべき薬物で処置されてもよい。このように、方法は、疾患に適している処置選択肢を検出するため、または処置に対する耐性の発生を検出するために用いられてもよい。
したがって、方法はまた、以下の工程を含む、耐性を含む薬物処置レジメンに対する応答性を決定する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、薬物処置に対する正または負の応答に関連するか、または薬物処置によって阻害されることが公知であるキナーゼ内の包含ペプチドを特定するために、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよいターゲティングMS法を用いて、試験試料から単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。試験試料は、罹患した細胞または組織の供給源から取得されてもよい。そのような罹患した細胞または組織は、生検試料を含む、がん、アルツハイマー病を有するかもしくはそれに関与している、またはウイルスに感染していることが既知の細胞または組織を含んでもよい。試験試料は、1種類もしくは複数種類のキナーゼ阻害物質、または、疾患の処置について公知であるかもしくは試験されるべき1種類もしくは複数種類の薬物で処置されてもよい。このように、処置レジメンに対する対象の予測された応答を査定することが可能であり、かつ、処置に適している薬物または薬物の組み合わせを特定することが可能であり得る。したがって、方法は、薬物療法または併用薬物療法を含む、処置レジメンを決定するための方法であってもよい。薬物処置に対して耐性であるかまたは耐性になる細胞におけるキナーゼ活性化を経時的に検出すること、および、最初の処置レジメンに応答して活性化されるキナーゼを標的とするさらなる処置を設計することもまた、可能である。
特定され、任意で定量されたpTyr包含ペプチドのセットを、ITIM、ITAM、またはITSMを含む免疫受容体のITRM内に位置するものに焦点を合わせることによって、試料内の免疫応答の調節をこのようにプロファイリングすることが可能である。
したがって、別の例として、本開示の態様は、罹患率を緩和し、かつ、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）の治療的遮断に起因する治療の中断を低減させるための個別化されたアプローチを提供する上で有用であり得る。CTLA-4の遮断は、免疫関連有害事象（irAE）の高い発生率を結果としてもたらし、これは、CTLA-4阻害によって影響を受ける、ITAM/ITIM/ITSMを有する免疫受容体または関連するキナーゼのTyrリン酸化に関連し得ると予期することができる。
免疫療法の前、その最中、およびその後の、本開示の方法での対象のインサイチュ免疫細胞応答の特徴決定はまた、新たな診断および予後判定の洞察も提供し得る。ITAM/ITIM/ITSM Tyrリン酸化を介したその免疫シグナル伝達パターンに基づく、レスポンダーおよびノンレスポンダーの特徴決定は、免疫療法処置を最適化するための、より正確な個別化アプローチを可能にし得る。
したがって、プロファイリングは、免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達のプロファイリングを含んでもよい。そのような態様は、その各々が、1種類または複数種類の免疫受容体のITIM、およびITSM、またはITAMであり得る、1種類または複数種類のITRM由来を含む、1種類または複数種類の免疫受容体由来のpTyr包含ペプチドの特定および任意の定量を含んでもよい。いくつかの態様において、用いられる試料は、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージを含む免疫細胞由来であるか、またはそれを含んでもよい。いくつかの態様において、ITRMは、がんなどの疾患の発生または進行に関連する免疫シグナル伝達に関与することが公知である。いくつかの態様において、用いられる試料は、例えばがんを含む、特異的な疾患のための薬物処置レジメンに曝露された供給源もしくは試料由来であってもよく、または、がんを含む特異的な疾患もしくは障害を有するかもしくはそれに関与している疑いがあるか、またはがんを含む特異的な疾患もしくは障害を有するかもしくはそれに関与していることが既知の供給源もしくは試料由来であってもよい。がんは、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、または白血病を含む、任意のタイプのがんであってもよい。薬物での処置の前後に採取された試料が、プロファイリングされてもよく、プロファイルは、用いられた薬物に対する試料内の免疫シグナル伝達経路の感受性または耐性を決定するために比較されてもよい。
いくつかの態様において、タンパク質キナーゼ活性のプロファイリングは、1種類または複数種類のタンパク質キナーゼ由来のpTyr包含ペプチドおよび1種類または複数種類のITRM由来のpTyr包含ペプチドの両方を含むように、特定され任意で定量されるpTyr包含ペプチドのセットを選択することによって、免疫受容体ホスホチロシンシグナル伝達のプロファイリングと組み合わされてもよい。
さらなる態様において、タンパク質キナーゼ活性は、1種類または複数種類のTK、STK、または他の二重特異性キナーゼ、MAPキナーゼ、または脂質キナーゼを含む、特異的なキナーゼの基質に対応する、試料中のpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量することによって、生物学的試料においてプロファイリングされる。特異的なキナーゼの基質のうちのいくつかは、公知であり、生物医学的文献から特定されてもよい。
特異的なキナーゼ、例えばTKの基質はまた、特異的なTKまたは関連するTKの特異的なファミリーの活性が、薬理学的および／または遺伝学的のいずれかで撹乱されている生物学的材料に由来する試料におけるpTyr包含ペプチドのプロファイルを、そのような撹乱に供されなかった生物学的材料由来の試料（すなわち、健常な個体もしくは細胞供給源、または無処置の個体もしくは細胞供給源由来などの、対照試料）におけるpTyr包含ペプチドのプロファイルと比較することによって、本開示のさらなる改変された態様により特定されてもよい。
特異的なTKの活性を薬理学的におよび／または遺伝学的に撹乱する手段は、当業者に公知であり、以下の実施例は、例証となることを意味するだけである。特異的なTKの活性は、細胞を、その特異的なTKの活性化部位に優先的に結合することが公知である細胞透過性低分子などの阻害物質に曝露することによって、薬理学的に低減させることができる。多くのそのような低分子が、患者における使用についてFDAにより認可されている多くのものを含み、文献において特定されている。特異的な受容体TKの活性は、受容体TKの細胞外領域に結合するように選択された抗体によって低減させることができる。多くのヒト化抗体が、患者における使用についてFDAにより認可されている。特異的なTKの活性は、RNAiでを含む、そのTKの発現を抑制するか、低減させるか、もしくは阻害することによって、その特異的なTKのドミナントネガティブバージョンを発現させることによって、または、（例えば、CRISPR/Cas9技術を用いて）その特異的なTKをコードする遺伝子のすべてもしくは一部分をノックアウトすることによって、遺伝学的に低減させることができる。特に、特異的なTKの活性は、細胞または生物におけるそのTKをコードするアレルを、感受性が変更されたアレル（アズアレル（as-allele））で置き換える化学遺伝学的戦略によって、高度に特異的な様式で低減させることができる。アズアレルは、細胞透過性低分子によって高度に特異的な様式で阻害されるTKのバージョンをコードする（Bishop, A.C. et al., "A chemical switch for inhibitor-sensitive alleles of any protein kinase", (2000) Nature 407:395-401）。
正の調節領域または負の調節領域を含む、タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域内に含有されているもののように、特定され、任意で定量されたpTyr包含ペプチドのセットを選択することによって、方法は、試料におけるタンパク質チロシンホスファターゼ活性をプロファイリングする方法を含んでもよい。
したがって、さらなる態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）活性は、PTPの1種類または複数種類の調節領域に対応する試料中のpTyr包含ペプチドを特定し、定量することによって、試料においてプロファイリングされる。実施例においてさらに考察するように、PTPは、数多くの調節性pTyr残基を含むように見られる。当業者によって認識されるであろうように、ターゲットプロテオミクスアプローチにおいて、スーパーバインダーベースの精製と、MRMまたはPRMとを組み合わせることなどの、上記のTKで採用された一般的アプローチを、PTPに拡張することができる。
さらなる態様において、PTP活性は、特異的なPTPの基質に対応する試料中のpTyr包含ペプチドを特定し、定量することによって、試料においてプロファイリングされる。当業者によって認識されるであろうように、そのような基質を、特異的なPTPまたは関連するPTPのファミリーの活性を薬理学的および／または遺伝学的に撹乱する効果のリン酸化プロテオミクスベースの解析で最初に特定することを含む、上記の特異的なTKの基質のプロファイリングに対する一般的アプローチを、特異的なPTPの基質のプロファイリングに拡張することができる。
したがって、方法は、以下の工程を含む、試験試料のタンパク質チロシンホスファターゼ活性をプロファイリングする方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、正または負の調節領域を含む、タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域内のpTyr包含ペプチドを特定するために、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよいターゲティングMS法を用いて、試験試料から単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。方法は、以下の工程をさらに含んでもよい：対照試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、対照試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、対照試料から単離する工程；および、タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域内のpTyr包含ペプチドを特定するために、ターゲティングMS法を用いて、対照試料から単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程、ならびに、試験試料について取得されたプロファイルを、対照試料について取得されたプロファイルと比較する工程。試験試料は、罹患した細胞または組織の供給源から取得されてもよい。そのような罹患した細胞または組織は、がん、アルツハイマー病を有するかもしくはそれに関与している、またはウイルスに感染していることが既知の細胞または組織を含んでもよい。対照試料は、健常な細胞もしくは組織から取得されてもよく、または、試験試料と同じ供給源由来であってもよい。試験試料は、疾患の処置について公知であるかまたは試験されるべき薬物で処置されてもよく、対照試料は、そのような処置を受けていなくてもよい。
プロファイリング法は、さらに、pTyr包含ペプチドのセットを、例えばチロシンキナーゼの、キナーゼ活性化ループ由来のもの、ならびに、タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域由来のもの、および任意で、キナーゼまたはホスファターゼの下流標的由来のものを含むように選択することによって、標的化またはカスタマイズされてもよい。pTyr包含ペプチドのセットをこのように選択することによって、細胞内の様々な調節経路をマッピングするよう試みることが可能である。
したがって、方法は、以下の工程を含む、細胞におけるシグナル伝達経路を特徴決定する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定し、任意で定量するために、ターゲティングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。サブセットは、1種類または複数種類のキナーゼ活性化ループ、タンパク質チロシンホスファターゼの1種類または複数種類の調節領域、ならびに、キナーゼおよび／またはタンパク質チロシンホスファターゼの1種類または複数種類の下流標的基質由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。接触させる工程は、飽和量、または飽和量よりも少ない量のSH2スーパーバインダーを用いることを含んでもよい。MS法は、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよい。
さらなる態様において、pTyr包含ペプチド中に存在するpTyrに加えて、翻訳後アミノ酸修飾（PTM）が、特定および定量される。そのようなPTMは、さらに、Tyrリン酸化キナーゼの活性状態を示し得る。当業者によって認識されるであろうように、そのようなPTMを特定する工程は、1種類または複数種類のスーパーバインダーで、タンパク質消化に供されていないpTyr包含ペプチド（例えば、完全長タンパク質）を濃縮することを含んでもよい。濃縮後に、これらの未消化pTyr包含ペプチドを、次いで、MS解析の前にタンパク質消化（例えば、トリプシン消化）に供することができる。MS解析は、当業者によって理解されるであろうように、結果として生じたペプチド混合物において種々のPTMを検出するように調整することができる。
さらなる態様において、pTyr包含ペプチドに共有結合性または非共有結合性に結合しているペプチドが、特定および定量される。そのような結合は、さらに、Tyrリン酸化キナーゼの活性化状態を示し得る。当業者によって認識されるであろうように、そのような結合したペプチドを特定する工程は、タンパク質-タンパク質相互作用を破壊しない条件において、1種類または複数種類のスーパーバインダーで、タンパク質消化に供されていないpTyr包含ペプチド（例えば、完全長タンパク質）を濃縮することを含んでもよい。濃縮後に、結合したペプチドを、次いで、MS解析の前にタンパク質消化（例えば、トリプシン消化）に供することができる。
方法はまた、以下の工程を含む、試験試料においてがんについての起源の組織を決定する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定し、任意で定量するために、ターゲティングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。試験試料は、例えば腫瘍由来の、生検試料であってもよい。サブセットは、生検材料がそこから抽出された組織タイプ、および／または、***組織もしくは肺組織などの、一般的に転移性がんに関連する細胞タイプまたは組織タイプを含む、特定の細胞タイプまたは組織タイプ由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。接触させる工程は、飽和量、または飽和量よりも少ない量のSH2スーパーバインダーを用いることを含んでもよい。MS法は、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよい。このように、方法は、腫瘍が生検部位とは異なる部位から転移しているかどうかを判定するために、腫瘍の組織起源を検出するために有用であり得る。
方法は、以下の工程を含む、試験試料においてがん細胞を検出および／または定量する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定し、任意で定量するために、ターゲティングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。試験試料は、例えば腫瘍由来の、生検試料であってもよい。サブセットは、生検材料がそこから抽出された組織タイプを含む、特定の細胞タイプもしくは組織タイプの健常細胞、および／または、特定の細胞タイプもしくは組織タイプのがん細胞由来のpTyr包含ペプチドを含んでもよい。接触させる工程は、飽和量、または飽和量よりも少ない量のSH2スーパーバインダーを用いることを含んでもよい。MS法は、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよい。このように、方法は、生検試料においてがん細胞および非がん細胞のパーセンテージを決定するために有用であり得る。
方法は、以下の工程を含む、試験試料において1種類または複数種類の免疫細胞タイプを検出および／または定量する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定し、任意で定量するために、ターゲティングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。サブセットは、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージを含む、1種類または複数種類の免疫細胞タイプの1つまたは各々に独自に関連するpTyr包含ペプチドを含んでもよい。MS法は、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよい。このように、方法は、試料において特異的な免疫細胞のパーセンテージを決定するために有用であり得る。
方法は、以下の工程を含む、1種類または複数種類のシグナル伝達経路の活性化を決定する方法であってもよい：試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および、単離された画分において検出可能であるpTyr包含ペプチドのサブセットを特定し、任意で定量するために、ターゲティングMS法を用いて、単離されたpTyr包含ペプチドを特定し、任意で定量する工程。サブセットは、1種類または複数種類のシグナル伝達経路の1つまたは各々に独自に関連するpTyr包含ペプチドを含んでもよい。pTyr包含ペプチドは、キナーゼ、ITRM、またはキナーゼの下流標的由来であってもよい。MS法は、PRM、SRM、および／またはMRM MS法を含んでもよい。試料は、例えばPDL1、CD28、またはTCR刺激を含む、シグナル伝達分子での活性化または阻害によって撹乱されてもよい。このように、方法は、種々のシグナル伝達経路の活性化の間を区別するために有用であり得る。
実施例1‐野生型Src SH2ドメインおよびバリアントSrc SH2ドメインの発現および精製
His6/GSTタグ付加ヒトSrc SH2（残基Asp144-Lys252、SEQ ID NO: 10）、His6/GSTタグ付加TrMヒトSrc SH2（SEQ ID NO: 11）、またはHis6タグ付加QuadMヒトSrc SH2（SEQ ID NO: 13）をコードするDNA配列を、当技術分野において標準的な技法を用いて、細菌発現ベクターにおいて調製した。
野生型SH2ドメインおよびバリアントSH2ドメインを、大腸菌BL21(DE3)において発現させた。タンパク質発現を、0.5 mM IPTGで一晩、18℃で誘導した。細胞ペレットを、リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液（pH 7.0）中に2％ Triton X-100、1 mg/mLリゾチーム、3μL benzonase、および20 mMイミダゾールを含有する溶解緩衝液中に再懸濁して、400 Wで180秒間、音波処理した。細菌溶解物を、25,000 gで30分間の遠心分離によって透明化し、結果として生じた上清を、直ちに用いるか、または、将来の使用のためにアリコートにして-80℃で保存した。GE Healthcareから入手可能であるNi2+-ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）ビーズを用いて、野生型SH2ドメインタンパク質およびバリアントSH2ドメインタンパク質を精製した。各々の精製タンパク質の濃度を、Bradfordアッセイによって決定した。
図1は、3種類のタンパク質の精製を示す、クマシー染色したSDS-PAGEゲルの画像である。
実施例2‐バリアントSH2ドメインは、Jurkat細胞由来のpTyr包含ペプチドに対して、モル対モルベースで抗pTyr抗体よりも良好な親和性試薬であった
生物学的試料由来のpTyr包含ペプチドに対する親和性試薬としての、バリアントSrc SH2ドメインおよび一般的に用いられる抗pTyr抗体の相対効力を決定するために、実験を実施した。His6/GSTタグ付加TrM Src SH2ドメイン（SEQ ID NO: 11）およびHis6タグ付加QuadM Src SH2ドメイン（SEQ ID NO: 13）、ならびに抗pTyr抗体を、各抗体分子がその抗原に対して2個の結合部位を有することを考慮して、SH2ドメインバリアントと比べて半分のモル量の抗体を用いることにより、機能的に等価のモル量で調製した。
最初の実験は、Jurkat細胞より調製したペプチド混合物からpTyr包含ペプチドを抽出するための、以下の親和性試薬の相対能力を試験した：His6/GSTタグ付加TrM Src SH2（SEQ ID NO: 11）、His6タグ付加QuadM Src SH2（SEQ ID NO: 13）、抗pTyr抗体4G10（アガロースコンジュゲート、Milliporeから入手）、および市販されている抗pTyr抗体の混合物。親和性試薬の各々を、表3に示すように、1×量および5×量で試験した。2種類のSH2親和性試薬は、30×量でも試験し；抗体は、そのようにする費用が非常に高いために30×量では試験しなかった。精製SH2親和性試薬は、実施例1に記載したように調製した。抗体混合物は、4G10（上記の通り）、PY99（Santa Cruz Biotechnologyから入手）、およびP-Tyr-100（PTMScan（登録商標） Phospho-Tyrosine Mouse mAbのスラリー、Cell Signaling Technologyから入手）を含有していた。P-Tyr-100の濃度は未知であるため、量は、供給業者によって推奨されるように（すなわち、1 mgペプチド消化物に対して4μL）用いた。
（表３）実施例2において用いた親和性試薬の組成および量
Figure 2019527838
図2Aは、実験設計の模式図を提示する。各量のHis6タグ付加SH2ドメインバリアントまたは抗体を、ペルバナダート処理したJurkat細胞から調製したペプチド混合物の3 mgとの結合実験に供した。
Jurkat細胞（ATCCから入手）を、10％ウシ血清、ならびに100 U/mLのストレプトマイシンおよびペニシリンを補給したRoswell Park Memorial Institute 1640培地（RPMI-1640）中で、5％ CO2の加湿雰囲気において37℃で培養した。Boersema, P. et al., "In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling", (2009) Molecular & Cellular Proteomics 9:84-99の通りに、細胞を、遠心分離によって収集し、PBS中で3回洗浄して、1 mMの新しく調製した過バナジン酸ナトリウムで15分間、37℃で処理した。
細胞を、再び遠心分離によって収集した。細胞ペレットを、8M尿素、50 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（Tris）-HCl（pH 7.4）、2％プロテアーゼインヒビターカクテル（v/v、Sigma-Aldrichから入手）、1％ Triton X-100（v/v）、1 mM NaF、および1 mM Na3VO4を含有する氷***解緩衝液において穏やかに均質化し、その後、400 Wで120秒間の音波処理を行った。25,000 gで1時間の遠心分離の後、タンパク質を、氷冷アセトン／エタノール／酢酸（50/50/0.1、V/V/V）溶液において沈殿させた。続いて、タンパク質を、100 mM重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）緩衝液（pH 8.2）および8M尿素を含有する還元緩衝液において希釈し、最終タンパク質濃度を、Bradfordアッセイによって決定した。タンパク質懸濁液を、10 mMジチオスレイトール（DTT）において37℃で2時間還元し、次いで、20 mMヨードアセトアミド（IAA）において暗所、室温でさらに30分間アルキル化した。トリプシン消化を、1/25（w/w）の酵素対タンパク質比で、37℃で一晩行った。結果として生じたペプチド混合物を、さらなる解析のために-80℃で保存した。
脱塩したJurkatペプチド（30 mg）を、氷冷免疫親和性精製（IAP）緩衝液中に溶解し、次いで、3 mgのJurkatペプチドを各々有する10アリコートに分けた。結合実験を、表1および図2Aに示す抗体の量（1×、5×）またはSH2ドメインバリアントの量（1×、5×、30×）で行った。
抗体ベースの濃縮のためには、4G10または抗体混合物を、試料と4℃で一晩、回転させながらインキュベートした。ビーズを、氷冷IAP緩衝液で3回洗浄し、氷冷水で2回洗浄した。結合したペプチドを放出させるために、ビーズを、200μL 0.15％トリフルオロ酢酸（TFA）で15分間、室温で2回溶出した。
SH2ベースの濃縮のためには、精製SH2タンパク質を含有するNi-NTAビーズを、20カラム体積の、20 mMイミダゾールを含有するPBS緩衝液（pH 7.0）において大々的に洗浄した。使用の直前に、SH2-Ni-NTAビーズを、2カラム体積の、50 mM Tris-HCl（pH 7.2）、50 mM NaCl、および10 mM Na2HPO4を含有する氷冷免疫親和性精製（IAP）緩衝液で洗浄した。洗浄したビーズを、ペプチド混合物と4℃で一晩、回転させながらインキュベートした。ビーズを、次の朝に、少なくとも10カラムの、氷冷IAP緩衝液で洗浄し、次いで、500 mMイミダゾールを含有するPBS緩衝液（pH 7.0）で溶出した。溶出液を、OASIS HLBカラム上で脱塩した。ペプチドを、80％アセトニトリル（ACN）および0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の溶液で溶出した。溶出したペプチドを、Zhou, H. et al., "Specific phosphopeptide enrichment with immobilized titanium ion affinity chromatography adsorbent for phosphoproteome analysis", (2008) Journal of Proteome Research 7: 3957-3967；およびZhou, H. et al., "Robust phosphoproteome enrichment using monodisperse microsphere-based immobilized titanium (IV) ion affinity chromatography" (2013) Nature Protocols 8: 461-480によって以前に記載されているように、リンペプチドのための固定化チタン(IV)イオン親和性クロマトグラフィー（Ti4+-IMAC）に供した。簡潔に言うと、ペプチド混合物を、最初に、ローディング緩衝液（80％アセトニトリルすなわちACNおよび6％ TFA）中のTi4+-IMACビーズと30分間、室温でインキュベートした。遠心分離の後、上清を除去した。Ti4+-IMACビーズを、次いで、非特異的に吸着したペプチドを除去するために2種類の洗浄緩衝液中で逐次的に洗浄した。洗浄緩衝液1は、50％ ACN、6％ TFA、および200 mM NaClを含有しており；洗浄緩衝液2は、30％ ACNおよび0.1％ TFAを含有していた。結合したペプチドを、次いで、アンモニア（10％、v/v）によって溶出した。20,000 gで5分間の遠心分離の後、上清を収集して凍結乾燥した。
ペプチドを、典型的には、quaternary surveyor MS pumpを装備したLTQ Orbitrap Velos（Thermo Fischerから入手）上で実施した、一次元（1D）LC-MS/MSによって検出した。1D LC-MS/MS解析のために、試料を、0.1％ギ酸（FA）中に溶解し、C18トラッピングカラム（3 cm×200μm i.d.）上に、5μL/分の流速で、100％移動相Aで自動的にロードした。分析カラム（i.d. 75μm）に、15 cmの長さまで、Daisogel C18 AQ粒子（5μm、12 nm）をインハウスで充填した。移動相Aは、H2O中0.1％ギ酸（v/v）であり、移動相Bは、ACN中0.1％ FAであった。逆相（RP）分離勾配は、86分で2％の移動相Bから25％の移動相Bであり、スプリット後は流速を200 nL/分に調整した。試料を、各々20μLで3回分析した。
LTQ-Orbitrap Velos質量分析計は、データ依存的MS/MS獲得モードで稼働させた。スプレー電圧は2.0 kVに設定し、正規化衝突エネルギーは35.0％として設定した。サーベイフルスキャン質量分析（MS）を、Orbitrapによってm/z 400から2000まで獲得し（解像度＝m/z 400で60000）、標的イオン設定は、Orbitrapについて5e5であり、250msの最大インジェクション時間であった。MS/MSスキャンを、3e4の標的イオン設定および50 msの最大インジェクション時間で、LTQによって獲得した。ダイナミックエクスクルージョン設定は、以下の通りであった：リピートカウント1、繰り返し時間30秒、および除外時間60秒。
未加工のMSスペクトルを、MaxQuantバージョン1.3.0.5で加工処理した。MS/MSスペクトルを、頻繁に観察される混入物によって補われ、すべての配列の逆バージョンで連結されたUniProtヒトデータベース（2013年12月11日にリリースされ、88473種類のタンパク質配列を含有する）に対して検索した。酵素特異性は、トリプシンに設定し、最大で2個の失敗切断部位を許容した。ホスホ（S、T、Y）、酸化（M）、アンモニアおよび水の喪失を、可変修飾に選択し；カルバミドメチルを、固定修飾に選択した。最大偽発見率（FDR）は、ペプチドおよびタンパク質の両方について1％に設定した。最小必要ペプチド長は、6アミノ酸に設定した。本研究において報告したリン酸化部位はすべて、タンパク質FDR＜1％、ペプチドFDR＜1％、局在可能性＞0.75、およびΔPTMスコア≧5の組み合わされたカットオフ値によって定義されるクラスI部位であった。これらのパラメータは、リン酸化プロテオミクス研究において一般的に用いられている（例えば、Sharma et al.；Olsen, J. V., et al., "Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks" (2006) Cell 127:635-48；Lundby, A., et al., "Quantitative maps of protein phosphorylation sites across 14 different rat organs and tissues", (2012) Nature Communications 3: 876を参照されたい）。
モル対モルベースで（pTyr結合部位における差について調整後に；すなわち、分子あたり、抗体は2個のpTyr結合部位を含有するのに対して、SH2ドメインバリアントは1個のpTyr結合部位を含有する）、TrM SrcドメインバリアントおよびQuadM Srcドメインバリアントは両方とも、1×量（すなわち、0.375 nmolのpTyr結合部位）または5×量（すなわち、1.875 nmolのpTyr結合部位）のいずれかで比較した場合、4G10または抗体混合物のいずれかよりも多い、Jurkat細胞由来のpTyr部位を特定した。各結合実験において特定されたpTyr部位の数を、表4に提示し、同じデータを図2Bに図化する。
（表４）ペルバナダート処理したJurkat細胞から様々な親和性試薬によって特定されたpTyr部位の数
Figure 2019527838
実施例3‐TrM Src SH2ドメインバリアントおよびQuadM Src SH2ドメインバリアントがより高い濃度で存在する場合、それらの配列選択性はより有意でなくなる
実施例2において特定されたpTyr包含ペプチドを解析して、pTyr包含ペプチドについての、異なる親和性試薬間の選択性における距離を計算した。選択性は、特定されたリンペプチドにおけるpTyr残基の周囲のアミノ酸残基の分布パターンによって測定した。2種類の親和性試薬間の選択性における距離を、対応するパターンのユークリッド距離によって測定した。
図3は、1×量（すなわち、0.375 nmolのpTyr結合部位）、5×量（すなわち、1.875 nmolのpTyr結合部位）、および30×量（すなわち、11.25 nmolのpTyr結合部位）での、4G10（角#1）、抗体混合物（角#2）、TrM Src SH2（角#3）、およびQuadM Src SH2（角#4）の間の選択性距離を示す。各組み合わせにおける親和性試薬によって特定された配列間のユークリッド距離を、2種類の親和性試薬を接続する線に沿って示し、4種類の親和性試薬を接続する線の相対的太さ（距離ではない）もまた、相対的ユークリッド距離を示す。
指定された位置で統計学的に異なり（P＜0.01、ボンフェローニ補正を伴わない二項検定）、かつ2種類のパターン間で0.08よりも長い距離を有する、pTyr（Y）のC末端の+1、+2、+3、および+4の位置のアミノ酸もまた、図3に図示する。
相対的に少量（すなわち、0.375 nmol SH2ドメインと等価の能力）で適用した場合、異なる親和性試薬は、別個の特異性を提示した（図3）。モチーフ選択における有意な差が、TrM Src SH2ドメインとQuadM Src SH2ドメインとの間、および各SH2ドメインと抗体調製物（4G10または抗体混合物）との間で観察された。
しかし、モチーフ選択性における差は、適用した親和性試薬の量が増大した場合（すなわち、1.875 nmolへ5倍、または11.25 nmolへ30倍；図3）、有意でなくなるか、または無意味になった。
図3は、結合反応におけるSH2ドメインバリアントの量が増大するにつれて、TrM Src SH2およびQuadM Src SH2の配列特異性が減少したことを示す。
実施例4‐スーパーバインダー親和性試薬は、今までで最も広範囲にわたるチロシンリン酸化プロテオームの視野を提供する
9種類の一般的に用いられるヒト細胞株におけるTyrリン酸化プロテオームを、親和性試薬としてSH2スーパーバインダーを用いて決定した。実験の模式図を、図4に示す。
細胞株は、HeLa（子宮頚がん）；Bel7402およびHepG2（肝がん）；MDA-MB-231、BT-474、SK-BR-3、およびMCF-7（乳がん）；MCF-10A（乳腺上皮）；ならびにJurkat細胞（T細胞）であった。すべての細胞株は（the Institute of Blood, Chinese Academy of Medical Sciencesから入手したヒト肝細胞がんBel7402細胞を除いて）、ATCCから購入した。HeLa、Jurkat、Bel7402、Hep-G2、およびMCF-7細胞は、10％ウシ血清を補給したRPMI-1640培地中で培養した。BT-474細胞は、15％胎児ウシ血清、2.5 g/Lグルコース、および0.11 g/Lピルビン酸ナトリウムを補給したRPMI-1640中で成長させた。SK-BR-3細胞は、15％胎児ウシ血清を補給したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で成長させた。MBA-MD-231細胞は、10％ウシ胎児血清を補給したRPMI-1640中で培養した。MCF-10A細胞は、5％ウマ血清、20 ng/mL上皮成長因子（EGF）、10μg/mLインスリン、0.5lμg/mLヒドロコルチゾン、および100 ng/mLコレラ毒素を補給したDMEM/F12（ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物F-12）中で成長させた（Debnath, J. et al., "Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures", (2003) Methods 30:256-268）。すべての細胞は、5％ CO2の加湿雰囲気において37℃で培養し、すべての培地に、100 U/mLのストレプトマイシンおよびペニシリンを補給した。
pTyr特定を最大化するために、各細胞株を、過バナジン酸ナトリウム処理に供し（実施例2における通り）、各細胞株由来の10 mgタンパク質を、トリプシン消化、ならびに、37.5 nmol（1.5 mg）のHis6/GSTタグ付加TrM Src SH2（SEQ ID NO: 11）およびTi4+-IMACによる逐次的濃縮に供した。細胞株の各々からのpTyr包含ペプチドの精製は、さもなければ実施例2における通りであった。
溶出したペプチドを、24時間のSCX-RPLC-MS/MS解析ランによって特定した。14 cm RP-SCX（逆相強陽イオン交換）二相性カラム（i.d. 200μm）を、Wang, F., et al., "A fully automated system with online sample loading, isotope dimethyl labeling and multidimensional separation for high-through put quantitative proteome analysis", (2010) Anal. Chem. 82:3007-3015によって以前に記載されているように調製した。ペプチドを、0.1％ FA中に再溶解し、RP-SCX二相性トラッピングカラムのRPセグメント上に自動的にロードした。RPセグメント上に保持されたペプチドを、RP勾配によってSCX一体型カラム上に溶出した。続いて、10、20、30、50、75、100、200、1000、または10、30、50、100、1000 mM酢酸アンモニウムでの一連の段階的溶出を用いて、ペプチドを、SCX一体型カラムから二次元C18分析カラムへ溶出した。各溶出は、10分持続し、その後、0.1％ FAでの10分の平衡が続いた。最後に、RP分離を行った。MS/MS解析は、さもなければ実施例2に記載したように行った。
9種類の細胞株のこのリン酸化プロテオミクスプロファイリングは、19,570種類の別個のpTyr包含ペプチド、および10,030個の独自のpTyr部位の特定につながった（表5）。pTyr包含ペプチドは、4,773種類のタンパク質に由来した。これは、今までで最も多い数の、単一研究において得られたpTyr部位のようである。特定されたpTyr部位の約36％は、PhosphoSitePlus、dbPTM、およびUniProtKBを含む複数の他のデータベースにおいて収集されたリン酸化部位を含有するProteomeScoutデータベース（バージョン：2015/10/11）中に掲載されていなかったため、新規であった（Matlock, M.K., et al., "ProteomeScout: a repository and analysis resource for post-translational modifications and proteins." (2015) Nucleic Acids Res. 43:D521-30）。実際に、この仕事は、ProteomeScoutデータベースを約10％拡張した。
細胞株あたりで特定された総pTyr部位および新規pTyr部位の点で、本研究と以前の研究との間の対比は、さらにより顕著である（表5）。例えば、乳がん細胞株SK-BR-3の単一研究において以前に特定されたpTyr部位の最大数は158個であり；スーパーバインダーベースのアプローチは、SK-BR-3において3,187個のpTyr部位を特定し、そのうち692個が新規である（表5）。したがって、スーパーバインダーベースの親和性精製（AP）-MS/MSアプローチにより、以前の方法よりもずっと広くかつ深い、Tyrリン酸化プロテオームの適用範囲が可能になった。
（表５）スーパーバインダーベースのAP-MS/MS法を用いて特定されたpTyr部位
Figure 2019527838
*抗体P-Tyr-100（Cell Signaling Technology, Inc.、すなわちCST）を介して濃縮されたpTyrペプチド；対応する研究のPubMed IDを括弧中に示したMDA-MB-231を除いて、CSTキュレーションセットIDを、参照として含めた。
実施例5‐SH2スーパーバインダーによってカバーされなかったチロシンリン酸化プロテオームの解析
実施例4において取得されたリン酸化プロテオミクス情報を、様々な解析に供した。
9種類の細胞株は、著しく異なるTyrリン酸化プロファイルを有していた。11種類のヒト細胞株の以前の解析では、特定されたタンパク質の約73％は、すべての細胞に共通していたことが明らかになった（Geiger, T. et al. "Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins" (2012) Mol. Cell. Proteomics 11:M111.014050）。
2種類以上の細胞タイプ間で共有されたpTyr部位の数は、同様の傾向に従い、pTyr部位の約5.8％（584/10,030）のみが、9種類の細胞株すべてにおいて検出された（表6）。さらに、本研究において特定された新規pTyr部位のおよそ50％は、単一の細胞タイプに特異的であった（表6）。概して、pTyr部位が細胞タイプ特異的であればあるほど、それが新規である可能性がより高かった（すなわち、本研究において最初に特定された、表6）。
（表６）細胞タイプ特異的であったかまたは2〜9種類の細胞株に共通であった、実施例4のリン酸化プロテオミクス解析において見出されたpTyr部位の数
Figure 2019527838
9種類の細胞株すべてにおいて見出されたpTyr部位の相対的に高い存在量は、この群内でスーパーバインダーによって特定された新規部位が相対的に少ない（約7.5％）理由を説明し得る（表6）。すなわち、これらの高い存在量のpTyrペプチドは、限定された量の親和性試薬が以前のAP-MS/MS解析（すなわち、親和性試薬として抗pTyr抗体を用いる）において用いられた場合、優先的に単離されてきた可能性がある。この原理によって、飽和量のスーパーバインダーを用いて特定された新規pTyr部位は、概して、今までに報告されたものと比べて低い存在量であると予測されるであろう。この予測と一致して、公知のpTyr部位に対応するペプチドの平均m/zピーク強度は、新規pTyr部位のものの約2.5倍であった（図5）。新規pTyr部位は、公知のものよりも有意に存在量が低い（P＜2.2×10-16、スチューデントのt検定）。
Tyrリン酸化されていると見出された、KEGGデータベース（http://www.genome.jp/kegg/）によって定義されるような、タンパク質の様々な機能的カテゴリーの割合を、図6Aに提示する。少ない画分（約5％）のみがリン酸化された代謝に関与するタンパク質とは対照的に、すべてのTKの約43％、SH2ドメイン包含タンパク質の約47％、およびPTPの約54％が、すべての細胞株にわたってTyrリン酸化されていることが見出された。
Tyrリン酸化に供されたタンパク質機能的カテゴリーにおける同様の傾向は、ペルバナダートで処理されず、その消化されたペプチドがp-Tyr-100での親和性精製に供されたMKN45細胞由来の公開されたリン酸化プロテオミクスデータを用いて観察され（図6B）、ペルバナダート処理もスーパーバインダーベースの親和性精製も、pTyrシグナル伝達のこの一般特性を変更しなかったことが示唆された。図6Bに提示した解析は、キナーゼ阻害物質のSU11274もしくはスタウロスポリン、またはビヒクルDMSOで処理された細胞由来のリン酸化プロテオミクスデータを組み合わせている（Stokes, M.P. et al., "Complementary PTM Profiling of Drug Response in Human Gastric Carcinoma by Immunoaffinity and IMAC Methods with Total Proteome Analysis" (2015) Proteomes 3:160-183）。
これらの知見により、pTyrシグナル伝達におけるコア機構‐TK、PTP、およびSH2包含タンパク質‐は、それ自体がTyrリン酸化による大々的な調節に供されることが示唆される（図6C）。
図6Cは、基質をリン酸化するチロシンキナーゼ（TK）、基質を脱リン酸化するタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）、およびTyrリン酸化によって調節されているTyrリン酸化タンパク質自体に結合するSH2ドメイン包含タンパク質での、ヒト細胞におけるTyrリン酸化（「P」の印をつけた丸）の見かけの一般的調節を示す模式図である。
実施例6‐PTP上のチロシンリン酸化は調節部位を示す可能性が高い
TKのTyrリン酸化が、それらの活性を調節できること、および、SH2ドメイン包含タンパク質のTyrリン酸化が、それらの結合特異性または親和性を改変できることは、公知であった（例えば、Hubbard, S.R. et al., "Autoregulatory mechanisms in protein-tyrosine kinases", (1998) J. Biol. Chem. 273:11987-90；Qian, X. et al., "The Tensin-3 protein, including its SH2 domain, is phosphorylated by Src and contributes to tumorigenesis and metastasis" (2009) Cancer Cell 16:246-58；Jin, L.L. et al., "Tyrosine phosphorylation of the Lyn Src homology 2 (SH2) domain modulates its binding affinity and specificity" (2015) Mol. Cell. Proteomics 14: 695-706）。しかし、実施例4および5に記載したリン酸化プロテオミクスデータにおいて、PTPが、そのように全面的にTyrリン酸化されていたことは驚きであった。
PTPにおいて特定されたpTyr部位の過半数（56％）は、PTPドメイン内に位置していた。PTPにおいて特定されたpTyr部位の約36％は新規であったため、この仕事は、特定されたPTPドメイン内Tyrリン酸化部位を約27％拡張した。さらに、PTPドメイン中の保存されたモチーフ内の多くの保存されたTyr残基は、様々な細胞株にわたってリン酸化されていることが見出された（例えば、図7Aおよび7Bにおいて、PTPN1に基づく残基ナンバリングのTyr46、Tyr52、Tyr66、Tyr267を参照されたい）。特に、Tyr46、Tyr52、およびTyr66（PTPN1に基づくナンバリング）は、最も保存されており（約70％）、最も頻繁にTyrリン酸化される残基である（図7A）。Tyr46、Tyr52、およびTyr66は、PTPN1の三次元構造においてクラスター化している（図7B）。
文献により、さらに、これらの保存された残基（例えば、Tyr46、Tyr66、Tyr267）の多くのリン酸化は、ホスファターゼ活性を調整することによって、および／または他のシグナル伝達タンパク質のためのドッキング部位を創出することによって、PTP機能に影響を及ぼすと予測できることが示唆されている。
例えば、モチーフ1内のTyr46（PTPN1に基づくナンバリング）は、基質のpTyr残基との疎水性パッキングを通してPTP基質特異性を規定する上で鍵となる役割を果たすことが公知である（Andersen, J.N. et al., "Structural and evolutionary relationships among protein tyrosine phosphatase domains", (2001) Mol. Cell. Biol. 21:7117-36）。Tyr46のリン酸化は、したがって、基質認識に対して負の影響を有すると期待されている。実際に、PTPN1中のTyr46と等価であるPTPN11（SHP-2）上のTyr279のリン酸化は、PTPN11活性を低減させることが示されている（Mitra, S. et al., "SHP-2 is a novel target of Abl kinases during cell proliferation" (2008), J. Cell Sci. 121:3335-46）。
別の例として、モチーフ3内のTyr66（PTPN1に基づくナンバリング）は、PTPドメインの疎水性コアの形成に寄与することが公知である（Andersen et al.）。PTPN1中のTyr66またはPTPN11中の等価残基のリン酸化は、対応するPTPのGrb2 SH2ドメインに対する結合を媒介すること、およびホスファターゼ活性を増強することが以前に示された（Mitra et al.; Liu, F. and Chernoff, J., "Protein tyrosine phosphatase 1B interacts with and is tyrosine phosphorylated by the epidermal growth factor receptor" (1997) Biochem. J. 327(Pt 1):139-45）。
また別の例として、Q-ループ（モチーフ10）内のTyr267（PTPN1に基づくナンバリング）のリン酸化は、PTP活性を変更する可能性がある（Andersen, J.N. et al., "Structural and evolutionary relationships among protein tyrosine phosphatase domains" (2001) Mol. Cell. Biol. 21:7117-36；Mitra, S. et al.）。
実施例7‐TK活性化ループ上のpTyrはTK活性を示した
実施例4において取得されたリン酸化プロテオミクスデータを用いて、TK活性化ループに由来するpTyr包含ペプチドを特定し、定量することによって、9種類の異なる細胞株におけるTKの相対活性を決定した。
TK活性化ループにおける潜在的なpTyr部位を、文献検索によって、およびバイオインフォマティクスによって決定した。例として、データベースPhosphoSitePlus（www.phosphosite.org）から収集したデータは、そのリン酸化がキナーゼ活性を増大させることが記録されているTKの活性化ループ中の35例のTyrを提供する（表7）。
（表７）そのリン酸化がキナーゼ活性を増大させることが記録されているTK活性化ループ中の35例のpTyr
Figure 2019527838
さらなる配列解析により、90種類のヒトチロシンキナーゼのうちの86種類について、活性化ループ内の86個を含む、126個の潜在的な調節性pTyr部位が特定された（表8）。いくつかのTK（すなわち、EPHA6/7、EPHA3/4/5、ABL1/2、IGF1R/INSR、VGFR2/3、NTRK2/3）は、同一の活性化ループ配列を有する。
（表８）ヒトTK活性化ループ由来のTyr残基を含む79種類のトリプシンペプチド
Figure 2019527838
Figure 2019527838
Figure 2019527838
質量スペクトルの無標識定量を用いて、9種類の異なる細胞株の各々について、31種類のTKにおける活性化ループTyrリン酸化のプロファイルを創出した（図8）。異なる細胞株は別個のプロファイルを有することが明らかであり、TK活性化は細胞タイプ特異的であることが示唆された。例として、Jurkat細胞は、概して、相対的に活性のCTKおよび相対的に不活性のRTKを有するように見られた。これにより、ホスホチロシンシグナル伝達は、Jurkat T細胞において、および恐らくまた他の造血細胞タイプにおいても、CTKによって支配されていること、ならびに、RTKは、反対に、本明細書において検討した上皮がん細胞においてより重要な役割を果たし得ることが示唆される。
リン酸化プロテオミクスデータが、インビボでのタンパク質リン酸化を忠実に要約したかどうかを判定するために、免疫沈降（IP）およびその後の免疫ブロッティング（IB、ウェスタンブロッティングとしても公知）を、実施例4の4種類の乳がん細胞株（MDA-MB-231、BT-474、SK-BR-3、およびMCF-7）由来の溶解物に対して実施した。
総細胞溶解物を、15分のペルバナダート処理後のMCF-7、BT-474、MDA-MB-231 、およびSK-BR-3について採集した。IPのために、1 mgの細胞溶解物を、2μgの抗ErbB2抗体または抗IGF-1Rβ抗体と4時間、4℃でインキュベートした。次いで、プロテインGビーズを、抗体沈降のために用いた。試料を、SDS-PAGEによって分離し、次いで、それぞれ、抗ErbB2、抗pY877-ErbB2、抗IGF1Rβ、抗pY1161/1165/1166IGF-1Rβ、抗Grb2、および抗IRS-1で免疫ブロットした。対照として、全細胞溶解物を、それぞれ、Grb2、IRS-1、およびβ-チューブリンについて免疫ブロットした。
図9Aおよび9Bに提示した、IP/IB解析からの結果は、概して、図8に提示した活性化ループリン酸化プロファイルと整合していた。特に、ErbB2は、BT-474細胞およびSK-BR-3細胞においてTyr877上で高度にリン酸化されており（図9A）；IGF-1R中の活性化ループTyr残基は、MCF-7細胞において高度にリン酸化され、BT-474細胞およびMDA-MB-231細胞において中等度にリン酸化されていたが、SK-BR-3細胞においては検出可能なようにリン酸化されていなかった（図9B）。
リン酸化プロテオミクスによって決定されたTK活性化ループリン酸化レベルが、キナーゼ活性を予測するかどうかを判定するために、下流タンパク質のGrb2からErbB2へ、およびIRS-1からIGF-1Rへの活性化依存的動員を、同じIP/IB実験において検討した（Xie, Y.M. et al., "Dominant-negative mutants of Grb2 induced reversal of the transformed phenotypes caused by the point mutation-activated rat HER-2/Neu", (1995) J. Biol. Chem. 270:30717-30724；SeppLorenzino, L. et al., "Signal transduction pathways induced by heregulin in MDA-MB-453 breast cancer cells", (1996) Oncogene 12:1679-1687；Dey, B.R. et al., "Evidence for the direct interaction of the insulin-like growth factor I receptor with IRS-1, Shc, and Grb10", (1996) Molecular Endocrinology 10:631-641；Tartare-Deckert, S. et al., "Evidence for a differential interaction of SHC and the insulin receptor substrate-1 (IRS-1) with the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor in the yeast two-hybrid system", (1995) J. Biol. Chem. 270, 23456-60）。そのような予測と一致して、リン酸化ErbB2は、より多くのGrb2を動員し、活性化IGF-1Rは、より多くのIRS-1を動員した（図9Aおよび9B）。
図9Aおよび9Bにおいて、ErbB2およびIGF-1Rの活性化ループ残基上の検出可能なTyrリン酸化と、IPにおけるErbB2およびIGF-1Rの全体存在量との間に、相関があるように見られた。しかし、概して、9種類の細胞株のうちの6種類（BT-474、HepG2、Jurkat、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231）におけるmRNA存在量についての公開されたデータ（Barretina, J. et al., "The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modeling of anticancer drug sensitivity" (2012) Nature 483:603-607）から決定されたような、TKの遺伝子発現の相対レベルは、実施例4のリン酸化プロテオミクス解析によって決定されたような、TKの活性化ループリン酸化の相対レベルの信頼できる指標ではなかった（図10A〜10D）。
ErbB2の場合には、リン酸化および増強されたタンパク質発現の寄与を識別することが困難であるが、IGF-1Rの場合には、タンパク質発現ではなく、活性化ループリン酸化が、BT-474細胞におけるキナーゼ活性化と相関することが明白に見える。
任意の事象において、pTyr包含ペプチドを特定し、定量する工程は、所定のTKにおける特定の部位でのTyrリン酸化の化学量論（すなわち、リン酸化されている所定のTKにおける所定のTyr残基の割合）およびそのTKの総存在量の両方において、細胞タイプ間の差を明らかにし得る。より高いリン酸化化学量論およびより高い存在量は両方とも、TK活性を増大させ得る。
実施例8‐活性化ループTyrリン酸化プロファイルは、特異的なTK阻害物質およびその組み合わせに対する感受性を予測することができる
分子標的療法における有効な戦略は、腫瘍形成を駆動するチロシンキナーゼを選択的に阻害することである（例えば、Barretina et al.；Takeuchi, K. and Ito, F, "Receptor tyrosine kinases and targeted cancer therapeutics", (2011) Biol. Pharm. Bull. 34:1774-80；Levitzki, A., "Tyrosine kinase inhibitors: views of selectivity, sensitivity, and clinical performance", (2013) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 53:161-85；Zaman, N. et al., "Signaling network assessment of mutations and copy number variations predict breast cancer subtype-specific drug targets", (2013) Cell Rep. 5:216-23を参照されたい）。この治療原理を、TKの活性化ループにおけるpTyrリン酸化の別個のプロファイル、したがってTK活性化の別個のプロファイルを示した、実施例4の4種類の乳がん株（MCF-7、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-231）について試験した（図8）。
細胞成長阻害アッセイを、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega）で、製造業者の推奨にしたがって行った。
4種類の乳がん株由来の細胞を、最初に、ErbB2阻害物質ラパチニブで処理した（Esteva, F.J., et al., "Molecular predictors of response to trastuzumab and lapatinib in breast cancer", (2010) Nat. Rev. Clin. Oncol. 7:98-107）。ErbB2が高い活性を有していたBT-474およびSK-BR-3は感受性であったのに対して、ErbB2活性がより低い活性を有していたMCF-7およびMDA-MB-231は、ラパチニブに対して非感受性であった（図11A）。
IGF-1R/INSRおよびDDR1は、MCF-7において選択的に活性化されたため（図8）、4種類の乳がん細胞株を、IGF-1R/INSRに対する特異的な阻害物質であるGSK1838705、およびDDR1に対する阻害物質であるDDR1-IN-1で処理した（Sabbatini, P. et al., "GSK1838705A inhibits the insulin-like growth factor-1 receptor and anaplastic lymphoma kinase and shows antitumor activity in experimental models of human cancers", (2009) Mol. Cancer Ther. 8:2811-20；Kim, H.G. et al., "Discovery of a potent and selective DDR1 receptor tyrosine kinase inhibitor" (2013) ACS Chem. Biol. 8: 2145-50）。GSK1838705は、MCF-7の増殖を用量依存様式で阻害したが、DDR1-IN-1は阻害せず、いずれの阻害物質も、残りの乳がん細胞株に対して影響を有さなかった（図11A）。この結果は、IGF-1R/INSRが、MCF-7細胞増殖の促進においてDDR1よりも重要な役割を果たすことを示す。
DDR1が他の活性化TKと協働して、MCF-7細胞に対して成長優位を与えるかどうかを判定するために、MCF-7細胞を、ラパチニブおよび／またはGSK1838705とともにDDR1-IN-1とインキュベートした。DDR1またはErbB2の単独阻害に対するMCF-7細胞の非感受性とは対照的に、2種類のキナーゼの組み合わされた阻害は、増殖を有意に低減させた（図11B）。際立って、DDR1、ErbB2、およびIGF-1R/INSRの三重阻害は、MCF-7細胞の増殖をさらに減少させたが、MCF-10A細胞に対してはいかなる影響も有さなかった（図11C）。
これらのデータにより、スーパーバインダーベースのリン酸化プロテオミクスによって可能である定量的キナーゼ活性プロファイリングは、活性化キナーゼまたはその組み合わせを特異的に標的とするがん処置の情報を与えるために用いられてもよいことが示唆される。
実施例9‐薬物耐性の獲得中のTK活性プロファイリング
pTyr包含ペプチドのスーパーバインダーベースの濃縮を、図4におけるワークフローに図示したように、スケジュール化MRMまたはPRM質量分析と組み合わせて、培養細胞における薬物耐性の獲得中のTK活性をプロファイリングした。
SK-BR-3細胞を、10％ FBS、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを補給したRPMI 1640培地中で成長させた。細胞を、37℃で、5％二酸化炭素を含有する加湿雰囲気においてインキュベートした。
トラスツズマブ耐性を促進するために、SK-BR3細胞を、細胞増殖をMTTアッセイによってモニタリングしながら、4μg/ml（群1）または8μg/ml（群2）のトラスツズマブを含有する培地中で3〜6か月間、連続的に培養した。次いで、2つの群由来の耐性クローンをプールし、4μg/mlトラスツズマブにおいて維持した。
培養細胞を、冷たい溶解緩衝液（8 M尿素、50 mM Tris-HCl pH7.4、2％プロテアーゼカクテル（v/v、Sigma P8340）、1％ Triton X-100、1 mM C3H7Na2PO6、1 mM Na4O7P2、1 mM NaF）において均質化し、溶解した。細胞破片を遠心分離によって除去し、上清を新しいチューブに移した。次いで、5×体積の氷冷沈降溶液（アセトン／エタノール／酢酸＝50:50:1、v/v/v）を、透明化した細胞溶解物と混合し、直ちにボルテックスした。混合物を、少なくとも60分間、-20℃でインキュベートし、続いて、15,000 gで30分間、4℃で遠心分離して、沈降したタンパク質を単離した。タンパク質ペレットを、75％氷冷エタノールで洗浄し、次いで、5分間風乾して、エタノールを蒸発させた。
タンパク質を、最初に、質量分析（MS）グレードの水において調製した8M尿素中に溶解した。ジチオスレイトール（DTT）による還元およびヨードアセトアミド（IAA）によるアルキル化の後、タンパク質を、製造業者のプロトコールにしたがってトリプシンによって消化した。消化産物を、C18カラムにおいて脱塩し、50 mM Tris-HCl（pH 7.2）、50 mM NaCl、および10 mM Na2HPO4を含有する氷冷免疫親和性精製（IAP）緩衝液中に溶解した。pTyr包含ペプチドの濃縮のために、Sulfolink Sepharoseビーズ（ThermoFisher）上に固定化されたSH2スーパーバインダー（His6/GSTタグ付加TrM Src SH2、SEQ ID NO:11）を、IAP緩衝液中のペプチドとインキュベートし、4時間、4℃で穏やかに回転させた。IPA緩衝液中での3回の洗浄後に、結合したペプチドをアガロースビーズから放出させるために、2.5％トリフルオロ酢酸（TFA）を添加した。溶出液を、C18カラム上で脱塩し、0.1％ギ酸中に再溶解した。ペプチドを、MS解析に供した。
実施例7において特定された126個の潜在的なTK調節部位から、67種類のペプチドを、MRMによる解析のために、8アミノ酸よりも長い、表8に列挙したTyr包含TK活性化ループペプチドから選択した。これらのペプチドのTyrリン酸化バージョンを、インビトロで合成し、保持時間を決定するため、および、QTRAP-4000ハイブリッドトリプル四重極／リニアイオントラップLC/MSシステムにおいてMS検出パラメータを最適化するために用いた。これから、保持時間スケジュール化多重反応モニタリング（sMRM）法を確立した。
すべてのMS実験は、Waters nanoACQUITY UPLCを装備したAB SCIEX 4000 QTRAPシステム上でのsMRMによって行った。スケジュールおよび衝突条件は、対応する合成ペプチドを用いて活性化ループペプチドのために最適化した。活性化ループペプチドの絶対的定量のために、対応する安定同位体標識形態もまた、合成した。これらのペプチドの規定された量を、消化産物と混合して、Srcスーパーバインダーによって同時精製した。同位体標識ペプチドは、MS解析において内部標準として働いた。活性化ループペプチドの相対量を、MRMクロマトグラム（またはTIC） における対応するピーク面積に基づいて、Skylineソフトウェアによって決定した。
ErbB2（HER2）活性化ループは、SK-BR-3細胞において高度にTyrリン酸化されていた（図12A）。しかし、プールされたトラスツズマブ耐性クローンにおいて、ErbB2（HER2）活性化ループは、もはや高度にTyrリン酸化されておらず、RTK c-KITの活性化ループが高度にリン酸化されていた（図12B）。ErbB2-pY877
Figure 2019527838
について検出されたトランジションを、MRMによるペプチド特定の例として図12Cに示す。
実施例10‐TK活性プロファイリングは薬物感受性を予測することができる
実施例9由来のTK活性プロファイルは、薬物感受性を予測する。
元のSK-BR-3クローンは、高いErbB2（HER2）活性を有しており（図12A）、トラスツズマブに対して感受性であったが（図13A）、トラスツズマブ耐性クローン（本明細書において単数形の「クローン」と呼ばれる）のプールは、より低いErbB2（HER2）活性を有しており（図12B）、トラスツズマブに対する感受性がより低かった（図13A）。
同様に、トラスツズマブ耐性クローンにおける高いc-KIT活性（図12B）は、c-KITが高い活性を有さない元のSK-BR-3クローン（図12A）と比べて、c-KIT/Ablキナーゼ阻害物質であるイマチニブに対するより高い感受性と相関していた（図13B）。トラスツズマブ耐性クローンはまた、トラスツズマブおよびイマチニブのカクテルによる、ErbB2（HER2）およびc-KITの組み合わされた阻害に対して有意により感受性であった（図13C）。
薬物感受性は、MTT細胞増殖アッセイによって測定した。
実施例11‐スーパーバインダー親和性精製およびその後のスケジュール化PRM（SAP-PRM）での、急速凍結固形腫瘍標本におけるTK活性のプロファイリング
TK活性を、SAP-PRMを用いて、急速凍結した（外科的切除の30分以内に液体窒素中で凍結した）トリプルネガティブ乳がん（TNBC）生検材料の3種類の試料においてプロファイリングした。トリプルネガティブ乳がん（ER-/PR-/HER2-）は、エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）の発現の欠損、ならびにHER2遺伝子の増幅の欠如を特徴とする。LMTK2は、対応する活性化ループペプチドのピーク面積に基づいて、内部対照GSK3以外の最も活性化されたTKとして検出され（図14A）、3種類の試料すべてにおいて観察することができる（図14A、C、およびD）。これらの2つのピークを1つの試料から除去して、目盛りを低減させると（図14B）、あまり活性化されていないTKを観察することができる（例えば、EPHA5/7、BMX、BTK）。
SAP-PRM解析は、高感度であることができる。図14A〜DにおけるTK活性プロファイルは、乳がん生検材料由来の30μgのトリプシンタンパク質消化物のSAP-PRM解析によって各々取得した。しかし、生検材料のうちの1つ由来の6μgのトリプシンタンパク質消化物のSAP-PRM解析（図15B）により、元のプロファイルにおける主要なピーク（例えば、LMTK2、GSK3、TXK）が特定された（図15A）。さらに、SK-BR-3細胞由来の2μgのみのトリプシンタンパク質消化物のSAP-PRM解析により、3種類の活性化TKが特定された（図16A〜B）。
図14〜16におけるTK活性プロファイルは、以下のようにSAP-PRM解析によって取得した。
組織および細胞：トリプルネガティブ乳がんを有する3人の患者由来の腫瘍生検材料を、液体窒素中で迅速に凍結し、液体窒素中に保存した。新しい培養SK-BR-3細胞を用いた。
各々の生検材料および細胞試料由来の透明化溶解物：凍結生検材料について、適当なサイズの試料を、液体窒素中で予冷した乳鉢において凍結生検材料から切り出した。生検試料を、次いで、300μLの4℃の新しく調製した溶解緩衝液（8 M尿素、2％プロテアーゼインヒビターカクテル（v/v、Sigma P8340）、50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、1 mM Na3VO4）で、微小組織粉砕機においてすりつぶした。SK-BR-3細胞を、実施例9に記載したのと同じやり方で加工処理した。
組織溶解物および細胞溶解物を、新しい1.7 mL微小遠心チューブ中に移し、10分間、4℃で回転させることによって混合した。チューブを、次いで、氷を含む水浴中で音波処理し、その後、20,000相対遠心力（rcf）で15分間、4℃での遠心分離を行った。上清（透明化溶解物）を、新しい1.7 mL微小遠心チューブに移した。
透明化溶解物からのタンパク質の収集：5×体積の冷たい沈降溶液（50/50/0.1、v/v/vのアセトン／エタノール／酢酸）を、各透明化溶解物に添加して、チューブを直ちにボルテックスした。チューブを少なくとも2時間、-20℃でインキュベートし、続いて、20,000 rcfで15分間、4℃で遠心分離して、タンパク質を沈殿させた。上清を除去して、1 mLの冷たい75％エタノールを各チューブに添加し、その後、ボルテックスした。チューブを再び、20,000 rcfで15分間、4℃で遠心分離した。上清を除去して、タンパク質ペレットを、1分間風乾した。タンパク質溶液を取得するために、100μLの8 M尿素または6 M塩酸グアニジン（GuHCl）を各チューブに添加し、その後、回転または音波処理を行って、タンパク質ペレットを再溶解した。
トリプシンタンパク質消化物の調製：各タンパク質溶液に対して、DTTを、5 mM最終濃度になるように添加し、チューブを1時間、室温で回転させた。次に、新しい1 Mヨード酢酸を、14 mMの最終濃度になるように各タンパク質溶液に添加し、チューブを暗所で１時間、室温で回転させた。次いで、反応していないヨード酢酸を消すために、より多くのDTTを各タンパク質溶液に添加して最終DTT濃度をさらに5 mM増大させ、チューブを1時間、室温で回転させた。各タンパク質溶液におけるタンパク質濃度を、次いで決定した。
各タンパク質溶液を、最終尿素濃度が2 M未満であるか、または最終GuHCl濃度が1 M未満であるように、50 mM Tris（pH 7.6）および5 mM CaCl2の溶液で希釈した。次に、トリプシンを、各希釈タンパク質溶液に添加して、1:20のモル比のトリプシン：タンパク質を達成し、チューブを16時間、37℃で回転／振盪させた。次いで、TFAを、1％（v/v）の最終濃度になるように各トリプシン／タンパク質溶液に添加し、チューブを、20,000 rcfで15分間、4℃で遠心分離して、トリプシンを沈殿させた。上清を、各々、調整したC18脱塩カラム上にロードして、流した。次いで、各カラムを0.1％ TFAで洗浄し、ペプチドを、80％ ACNで溶出して、各試料についてトリプシンタンパク質消化物を取得した。
スーパーバインダー親和性精製：スーパーバインダータンパク質（His6/GSTタグ付加TrM Src SH2、SEQ ID NO:11）を、1μLのビーズあたり10μgタンパク質の濃度で、Sulfolink Sepharoseビーズ（Thermo Fisher）上に固定化した。
各トリプシンタンパク質消化物を、1.7 mL微小遠心チューブにおいて実施例9におけるような500μLのIAP緩衝液中に溶解した。トリプシン消化の前に500μgよりも少なかったタンパク質試料については、200μgのスーパーバインダータンパク質（20μLビーズ）を添加した。トリプシン消化の前に500μgよりも多かった（最大で数ミリグラム）タンパク質試料については、400μgのスーパーバインダータンパク質（40μLビーズ）を添加した。チューブを、4時間、4℃で回転させ、次いで、遠心分離してビーズをスピンダウンした。上清を、各チューブから除去した。各チューブ中のビーズを、ビーズを上下に数回ピペッティングすることによって、500μLのIAP緩衝液中で4回洗浄し、その後、ビーズをスピンダウンして、上清を除去した。次に、各チューブにおけるビーズを、5％ TFA中に再懸濁して、室温で10分間インキュベートし、次いでスピンダウンした。上清を、新しいチューブに各々移し、次いで真空乾燥した。乾燥したペプチド試料を、水中に各々溶解し、20,000 rcfで15分間、4℃で遠心分離して、いかなる粒子も除去した。上清を、質量分析試料バイアルに各々移した。
標的pTyr包含ペプチドの検出：Easy-nLC1000液体クロマトグラフィーシステムを装備したQ-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific）を、PRM解析に用いた。SAPにより濃縮されたペプチドを、溶媒A（水中0.1％ギ酸）からB（アセトニトリル中0.1％ギ酸）への直線勾配での液体クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドを、最初に、nanoViperトラップカラム（C18、3μm、100Å、75μm×20 mm、Thermo Fisher）中にロードし、次いで、あらかじめ建造されたエレクトロスプレーエミッタ―を有するEASY-Spray分析カラム（C18、2μm、100Å、75μm×500 mm、Thermo Fisher）において分離した。ペプチドを、45分における3％ Bから35％ Bへの、およびその後の8分における35％ Bから95％ Bへの直線勾配を用いて、300 nL/分の流速で溶出した。最後に、カラムを、95％ Bで7分間洗浄した。データを、Q-Exactiveにおけるスケジュール化並列反応モニタリング（PRM）法において獲得し、標的化ペプチドを、Xcaliburソフトウェアにおいてデフォルトチャージ+2を有する包含リストに列挙した。MS2スキャニングは、17,500の解像度（m/z 200）、AGC標的2×105、最大インジェクション時間250 ms、単離ウィンドウ2.5 m/z、および27の正規化衝突エネルギーで設定した。
実施例12‐スーパーバインダー親和性精製およびその後のスケジュール化PRM（SAP-PRM）での、液体腫瘍標本におけるTK活性のプロファイリング
急性骨髄性白血病（AML）患者および正常個体の末梢血由来の単核細胞が、SAP-PRM法を用いたキノームプロファイリング解析のために、Victoria Hospital（London, Ontario, Canada）により提供された。AML試料由来の90μgのタンパク質消化物の解析により、特定されたHCK/Lyn、Src、FES、BTK、およびEPHB2が高度に活性化されていると示された（図17A）。健常個体由来の対照試料（20μgタンパク質消化物）の解析により、HCK/LynおよびSrcのみが活性化TKとして特定された（図17B）。
実施例13‐スーパーバインダー親和性精製およびその後のスケジュール化PRM（SAP-PRM）での、チェックポイント阻害物質の効果のプロファイリング
本開示の適用は、PD-1阻害物質またはPD-L1阻害物質などの免疫調節性薬物の作用または薬力学の機序を決定するためである。そのような阻害物質のいくつかは、がん患者における使用についてFDAにより認可されている。免疫チェックポイント阻害物質ベースの治療法の限界は、そのような治療法についての作用機序が十分に理解されていないことであり、それが、所定の免疫チェックポイント療法に対する患者応答を予測する難しさの基礎となっている。
BPS Bioscienceが含まれるいくつかの会社が、PD-1阻害物質またはPD-L1阻害物質（すなわち、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する抗体）の評価のためのインビトロ細胞システムを開発してきている（図18A）。このシステムにおいては、PD-1発現Jurkat細胞を、阻害抗体の非存在下または存在下で、PD-L1発現CHO細胞と共培養して、Jurkat T細胞の活性化に対する阻害物質の効果を判定することができる。PD-1発現Jurkat T細胞のSAP-PRM解析により、抗PD-L1抗体（BPS Bioscience）の存在下で（図18C）、抗体を伴わない細胞におけるものと比較した際に（図18B）、TCR共受容体CD3δおよびCD3ζにおけるITAMペプチドのTyrリン酸化の増大が検出された。
この知見により、本開示にしたがって、免疫プロファイリングの適用が他の細胞または組織試料に拡張される。免疫受容体の解析により、SAP-PRM法またはSAP-MRM法によって検出することができる195種類のITRM（ITAM、ITIM、およびITSMを含む）配列（表2）が特定される。SAP-PRM/MRM法を用いたITRMリン酸化の体系的特定に基づく免疫プロファイリングは、免疫系の全体的視野を提供するであろうと期待することができる。さらに、疾患組織と正常対照との間、または処置前に取得した標本と処置後に取得した標本との間の、ITRMリン酸化における定量的変化は、疾患機序、および免疫調節性薬物の作用機序についての価値ある情報を提供するであろう。
実施例14‐ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腫瘍標本におけるTK活性および浸潤T細胞の同時プロファイリング
SAP-PRM解析により、FFPE非小細胞肺がん生検材料（図19A）およびFFPE乳がん生検材料（図19B）において、活性化TKおよび浸潤T細胞をプロファイリングすることができた。
この知見により、本開示にしたがって、TKおよび免疫プロファイリングの適用が拡張される。1つの例として、FFPE生検材料においてTK活性をプロファイリングする能力により、処置（例えば、放射線、薬物）および処置転帰（例えば、寛解、死）が、ある範囲の様々ながんおよび他の疾病においてTK活性といかに相関するかの遡及研究が可能になり得る。生検材料由来の試料は、組織学的解析のために、日常的にホルマリンで固定され、パラフィンに包埋される。そのような試料は、多くの場合、医療施設によって保管されており、TKファイリングに利用可能であり得る。TKおよび浸潤T細胞の両方をプロファイリングする能力により、活性化TKおよび免疫チェックポイントの両方を標的とするコンボ療法の設計が可能になり得る。
図19AおよびBにおけるTK活性プロファイルは、以下のようにSAP-PRM解析によって取得した。
FFPE試料の収集：FFPE生検試料を、顕微鏡スライド上にマウントした5μmの厚さのパラフィンのスラブ中に各々包埋した。スライドを、3つの新しいキシレンのジャーおよびその後の3つの新しいエタノールのジャーに連続的に浸すことによって脱ろうした。脱ろうにより生検試料が曝露され、それを収集して、別々の1.7 mL微小遠心チューブに移した。
FFPE試料由来の透明化溶解物：200μLの新しく調製した溶解緩衝液（6 M GuHCl、50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、50 mM DTT）を、各チューブに添加した。チューブを、沸騰水中に20分間置き、その後、80℃で2時間加熱した。次に、チューブを、20,000 rcfで15分間、4℃で遠心分離して、いかなる溶解されていない破片も除去し、次いで、上清（透明化溶解物）を、新しい1.7 mL微小遠心チューブに各々移した。
FFPE試料のSAP-PRM解析における残りの工程を、1つを例外として、透明化溶解物からのタンパク質の収集の段階から始めて、実施例12におけるように実施した。例外は、トリプシンタンパク質消化物の調製の段階中であり、再溶解したタンパク質にDTTを5 mMになるように添加し、チューブを1時間回転させる最初の工程を、FFPE試料については省いた。
実施例15‐TK活性化ループに由来するpTyr包含ペプチドの混合物の解析
等モル量（10 nmole）の、His6タグおよびGSTタグとともに発現させた野生型（wt）ヒトSrc SH2ドメイン、ならびにDMヒトSrc SH2スーパーバインダーおよびTrMヒトSrc SH2スーパーバインダー（それぞれ、SEQ ID NO: 14および5）を用いて、54種類のTK活性化ループに由来する54種類の異なるpTyr包含ペプチド（各々10 pmole）の混合物から、pTyr包含ペプチドを捕捉した。単離されたペプチドを、PRMによって特定し、対応するMSピーク面積に基づいて定量した。溶出されたペプチドの1.8％を、ナノLCシステムが先行するQ-Exactive（Thermo Fisher）中にインジェクションした。
TrMヒトSrc SH2スーパーバインダーは、混合物中の54種類のpTyr包含ペプチドすべてを捕捉し、それらは、PRMによって同時に検出された（表9）。対照的に、DMヒトSrc SH2スーパーバインダーは、54種類のpTyr包含ペプチドのうち32種類を検出したのに対して、wt SH2ドメインは、54種類のpTyr包含ペプチドのうち22種類のみを検出した（表9）。1種類のpTyr包含ペプチドを除いて、TrMヒトSrc SH2スーパーバインダーは、wtヒトSrc SH2ドメインよりも多くのpTyr包含ペプチドを捕捉し、大抵の場合、wtヒトSrc SH2ドメインよりもはるかに多くのpTyr包含ペプチドを捕捉した（表9）。概して、DMヒトSrc SH2スーパーバインダーは、wtヒトSrc SH2ドメインよりも多くのpTyr包含ペプチドを捕捉した（表9）。
54種類のpTyr包含ペプチドの混合物においてプロファイリングされたpTyr包含ペプチドのうちの1種類である、EPHA8（pTyr793）ペプチドについて、図20は、wtヒトSrc SH2ドメインを用いた場合に何も検出されなかったこととは対照的に、DMヒトSrc SH2スーパーバインダーおよびTrMヒトSrc SH2スーパーバインダーの両方によってEPHA8（pTyr793）について検出された娘イオンの質量スペクトルを示す。これは、タンパク質チロシンリン酸化のプロファイリングにおいて、DMヒトSrc SH2スーパーバインダーまたはTrMヒトSrc SH2スーパーバインダーのいずれかの親和性精製（SAP）およびその後のスケジュール化PRM解析を用いる有用性を実証する1つの例であり、それは、親SH2ドメインと比べて増強されたスーパーバインダーの結合親和性に基づいて期待される。
（表９）二重変異体（DM）ヒトSrc SH2スーパーバインダーおよび三重変異体（TrM）ヒトSrc SH2スーパーバインダーは、親ヒトSrc SH2ドメイン（wt）よりも多くのpTyr包含ペプチドを捕捉する
Figure 2019527838
Figure 2019527838
Figure 2019527838
PRMシグナルの対応するピーク面積に基づく、親ヒトSrc SH2ドメイン、ならびにDMヒトSrc SH2スーパーバインダーおよびTrMヒトSrc SH2スーパーバインダーの各々によって捕捉されたpTyr包含ペプチドの量を示す。
実施例16‐QuadM-TrMタンデムスーパーバインダーは、TrMヒトSrcスーパーバインダーよりも多くのpTyr包含ペプチドを捕捉する
QuadM-TrMタンデムスーパーバインダー（SEQ ID NO: 15）を、QuadMヒトSrcスーパーバインダー（SEQ ID NO: 12）をコードする遺伝子を、TrMヒトSrcスーパーバインダー（SEQ ID NO: 5）をコードする遺伝子とタンデムに含有する組換えDNAを発現させることによって、大腸菌において産生させた。等モル量（200 pmole）のQuadM-TrMタンデムスーパーバインダーおよびTrMヒトSrc SH2スーパーバインダーを用いて、ITRMに由来する40種類の異なるpTyr包含ペプチド（各々200 fmole）の混合物から、pTyr包含ペプチドを捕捉した。単離されたペプチドを、スケジュール化PRMによって特定し、対応するMSピーク面積に基づいて定量した。
表10は、pTyr包含ペプチドの改善された捕捉が、2種類の異なるSH2スーパーバインダーを組み合わせて、タンデムドメインを有する単一のスーパーバインダーにすることによって達成されたことを示す。加えて、QuadM-TrMタンデムスーパーバインダーによって好ましく捕捉された上位10種類のpTyr包含ペプチドのうち、8種類は、pTyr+3の位置で疎水性残基が欠如していた。疎水性pTyr+3残基は、Src SH2 TrMによって好まれるが、QuardMによっては好まれない。QuardMスーパーバインダーは、pTyr+2の位置のAsn残基を好むが、pTyr+3の位置については明らかな好みを有さないGrb2 SH2ドメインと、特異性が類似している。2種類のスーパーバインダーのタンデムの組み合わせにより、両方のスーパーバインダーが好ましく結合するペプチドを捕捉することが可能になる。2種類のスーパーバインダーを組み合わせて単一タンパク質にする結果として、QuadM-TrMタンデムスーパーバインダーは、TrMヒトSrcスーパーバインダーの場合よりも多くの、pTyr+3に親水性残基を有するpTyr包含ペプチドに結合することができた。
（表１０）QuadM-TrMタンデムスーパーバインダーは、TrMヒトSrcスーパーバインダーよりも多くのpTyr包含ペプチドを捕捉する
Figure 2019527838
Figure 2019527838
「（QT-TrM）／平均」の値（式中、「QT」は、QuadM-TrMタンデムスーパーバインダーによって捕捉されたpTyr包含ペプチドの量を表し、「TrM」は、TrMヒトSrc SH2スーパーバインダーによって捕捉されたpTyr包含ペプチドの量を表し、「平均」は、QuadM-TrMタンデムスーパーバインダーおよびTrMヒトSrc SH2スーパーバインダーの両方によって捕捉されたpTyr包含ペプチドの平均量を表す）によって定義されるような、QuadM-TrMタンデムスーパーバインダー対TrMヒトSrc SH2スーパーバインダーについての各pTyr包含ペプチドの相対的好みを示す。黄色および青色の網掛けの四角は、pTyr包含ペプチドの配列におけるpTyr+3の位置の、それぞれ、疎水性残基および親水性残基を示す。
結びの言葉
本明細書において参照されるすべての文書は、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願が、参照により組み入れられるように具体的におよび個々に示されるかのように、参照により完全に組み入れられる。
本明細書においては明確に考察されていない変化および改変が、明らかである場合があり、本開示に基づいて当業者によって作製され得る。
本明細書における値の任意の範囲は、所定の範囲内の任意の中間値または部分範囲を具体的に含むように意図され、そのような中間値および部分範囲はすべて、個々におよび具体的に開示されることが、理解されるであろう。
「1つの（a）」または「ある（an）」という単語は、「1つまたは複数」または「少なくとも1つ」を意味するように意図され、任意の単数形は、文脈が明らかに別の方法で指図しない限り、本明細書において複数形を含むように意図されることもまた、理解されるであろう。
さらに、任意のその変形物を含む、「含む」という用語は、開放型であるように意図され、別の方法で具体的にそれと反対に示されない限り、「含むが、それに限定されない」、すなわち、任意の他の要素または構成成分を排除することなく特定の挙げられた要素または構成成分を含むように意味することが、理解されるであろう。
アイテムのリストが、最後のアイテムの前に「または」を伴って、本明細書において与えられる場合、列挙されたアイテムのうちの任意の1つ、または列挙されたアイテムのうちの2つ以上の任意の適している組み合わせが、選択され、用いられてもよい。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、与えられるようなすべての範囲またはリストは、その中に含有される任意の中間値もしくは範囲、または任意の部分リストを伝えるように意図される。
アミノ酸残基について、以下の標準的な一文字略語および三文字略語が、本明細書を通して用いられ得る：A、Ala‐アラニン；R、Arg‐アルギニン；N、Asn‐アスパラギン；D、Asp‐アスパラギン酸；C、Cys‐システイン；Q、Gln‐グルタミン；E、Glu‐グルタミン酸；G、Gly‐グリシン；H、His‐ヒスチジン；I、Ile‐イソロイシン；L、Leu‐ロイシン；K、Lys‐リジン；M、Met‐メチオニン；F、Phe‐フェニルアラニン；P、Pro‐プロリン；S、Ser‐セリン；T、Thr‐スレオニン；W、Trp‐トリプトファン；Y、Tyr‐チロシン；およびV、Val‐バリン。
「リガンド」という用語は、別の分子または標的に結合する分子を意味する。
このように、様々な態様における本開示の方法は、キナーゼ中、例えば、活性化ループ中、またはキナーゼ中の他のTyrリン酸化部位に存在し得るpTyr包含ペプチドを特定し、定量することによる、キナーゼ活性をプロファイリングする方法を提供することが、認識されるであろう。
SH2スーパーバインダーへの結合後に試料から除去されたpTyr包含ペプチドを、質量分析によって特定し、多重反応モニタリング、選択反応モニタリング、または並列反応モニタリング質量分析などの質量分析によって定量することができる。
様々な態様において、方法は、ヒト細胞、組織、または生検材料におけるチロシンキナーゼ活性をプロファイリングすることによって、その中でチロシンキナーゼ活性が調節不全である、がんなどの任意のヒト疾患の診断または予後判定のために有利に使用され得る。具体的には、乳がん、肺がん、前立腺がん、および白血病の診断または予後判定が、本明細書において企図される。
ヒトがんの薬物耐性、またはヒトがんの成長、またはヒトがんの転移を促進するチロシンキナーゼを特定するために、チロシンキナーゼ活性をプロファイリングする方法もまた、企図される。理解されるであろうように、チロシンキナーゼからのpTyr包含ペプチドの特定および定量により、例えば、参照非がん試料由来のチロシンキナーゼ活性プロファイルと比較することによる、または、所定のがんタイプの試料由来のプロファイルの実質的な割合において、チロシンキナーゼが活性化されているという知見からの、そのような特定が可能になる。
様々な態様において、チロシンキナーゼまたは他のリン酸化チロシン含有タンパク質が、例えば、チロシンキナーゼの阻害、化学療法、PD-1の阻害、およびCTLA-4の阻害を含み得る処置の最中または後に、そのリン酸化が変化している（例えば、大きさまたは頻度において）チロシンキナーゼまたは他のリン酸化チロシン含有タンパク質を特定することによって、薬理学的介入のための標的として特定され得ることもまた、認識されるであろう。
当然、本発明の上記の態様は、例証となるだけであり、決して限定的ではないように意図される。本発明の記載した態様は、形態、部分の配置、詳細、および操作の順序の、多くの改変の余地がある。本発明は、むしろ、添付の特許請求の範囲によって定義されるような、その範囲内のすべてのそのような改変を包含するように意図される。
配列
SEQ ID NO: 1、ヒト（Homo sapiens）、完全長Srcタンパク質
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 2、ヒト、完全長Grb2タンパク質
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 3、ヒト、完全長Fynタンパク質
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 4、人工配列、野生型ヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 5、人工配列、TrMヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 6、人工配列、野生型ヒトGrb2 SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 7、人工配列、TrMヒトGrb2 SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 8、人工配列、野生型ヒトFyn SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 9、人工配列、TrMヒトFyn SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 10、人工配列、ヘキサヒスチジンタグおよびGSTタグを有する野生型ヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 11、人工配列、ヘキサヒスチジンタグおよびGSTタグを有するTrMヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 12、人工配列、QuadMヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 13、人工配列、ヘキサヒスチジンタグを有するQuadMヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 14、人工配列、二重変異体ヒトSrc SH2ドメイン
Figure 2019527838
SEQ ID NO: 15、人工配列、QuadM-TrMヒトSrc SH2タンデムドメイン
Figure 2019527838

Claims (28)

  1. 以下の工程を含む、試験試料のタンパク質チロシンリン酸化をプロファイリングする方法：
    試験試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、試験試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；
    結合したpTyr包含ペプチドを、試験試料から単離する工程；および
    単離されたpTyr包含ペプチドを特定する工程。
  2. 単離されたpTyr包含ペプチドを定量する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記特定する工程または前記定量する工程が、質量分析法を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  4. 多重反応モニタリング、選択反応モニタリング、または並列反応モニタリングの技法を含む、請求項3に記載の方法。
  5. 前記SH2スーパーバインダーが、哺乳動物SH2ドメインのバリアントである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記SH2スーパーバインダーが、Src、Grb2、またはFynのSH2ドメインのバリアントである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記SH2スーパーバインダーが、三重変異体SH2バリアントである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記SH2スーパーバインダーが、四重変異体SH2バリアントである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記SH2スーパーバインダーが、SEQ ID NO: 5、7、9、11、12、13、14、または15の配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記SH2スーパーバインダーが、1種類または複数種類の追加的なSH2スーパーバインダーを含む融合タンパク質内に含有されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記SH2スーパーバインダーが、固体支持体上に固定化されている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記単離する工程が、高速液体クロマトグラフィー法または超高速クロマトグラフィー法を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記試料が、対象から取得される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記対象がヒト対象である、請求項13に記載の方法。
  15. 前記試料が、血清、血漿、尿、血液、組織、または組織抽出物である、請求項13または14に記載の方法。
  16. 前記対象が、がんと診断される予定であるか、またはがんを有することが既知である、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記がんが、乳がん、肺がん、前立腺がん、または白血病である、請求項16に記載の方法。
  18. 前記試料が、チロシンキナーゼ阻害物質、化学療法剤、PD-1阻害物質、またはCTLA-4阻害物質に曝露されたものである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記特定する工程が、特異的なタンパク質チロシンキナーゼの基質に対応する特異的なpTyr包含ペプチドを特定する工程を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記特定する工程が、特異的なタンパク質チロシンホスファターゼの基質に対応する特異的なpTyr包含ペプチドを特定する工程を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記特定する工程が、タンパク質キナーゼの活性化ループ由来、またはタンパク質キナーゼの活性化ループの外側由来のpTyr包含ペプチドを特定する工程を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記タンパク質チロシンキナーゼが、チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、二重特異性キナーゼ、MAPキナーゼ、または脂質キナーゼである、請求項21に記載の方法。
  23. 前記特定する工程が、免疫受容体のITRM由来のpTyr包含ペプチドを特定することを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ITRMが、ITIM、ITSM、またはITAMである、請求項23に記載の方法。
  25. 前記特定する工程が、タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域由来のpTyr包含ペプチドを特定することを含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記タンパク質チロシンホスファターゼの調節領域が、正の調節領域または負の調節領域である、請求項25に記載の方法。
  27. 以下の工程をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法：
    対照試料中に含有されているpTyr包含ペプチドをSH2スーパーバインダーと結合させるために、対照試料をSH2スーパーバインダーと接触させる工程；
    結合したpTyr包含ペプチドを、対照試料から単離する工程；
    単離されたpTyr包含ペプチドを特定する工程；および
    試験試料について取得されたプロファイルを、対照試料について取得されたプロファイルと比較する工程。
  28. 前記対照試料が、試験試料と同じ供給源由来であるが試験試料とは異なる時点で取得された試料、試験試料と同じ供給源由来であるが試験試料と比較して薬物に対する曝露が異なる試料、疾患を有さないことが既知の供給源由来、または、疾患を有するかもしくは疾患に関与していることが既知の供給源由来である、請求項27に記載の方法。
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