JP2019525774A - Ｒｎａ結合ポリペプチドの標的を同定するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、RNA修飾酵素（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）に機能的に連結されたRNA結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む組成物、およびその使用方法を特徴とする。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年7月19日に提出された以下の米国仮出願第62/364,170号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。

連邦支援の研究の下で行われた発明に対する権利についての声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号RO1 DA-037721の下で政府援助により行われた。政府は、本発明においてある程度の権利を有する。

発明の背景
遺伝子発現の転写後調節は、プレmRNAおよびmRNAに結合するタンパク質の宿主によって媒介される。それらの活性は、細胞構成要素の正しいスプライシング、局在、および翻訳に重要であり、それらの調節異常は数々のヒト疾患に関係している。任意のRNA結合ポリペプチド（RBP）の機能を完全に理解するには、そのRNA標的の同定が必要である。しかし、生物学的に関連するRBPの標的の同定は困難である。インビトロ標的を明らかにする非常に良い手法はあるものの、インビボ標的同定はより複雑な課題である。一見したところ均質な組織でさえ、遺伝子発現、プロテオーム、および表現型アウトプットの際立った差異を呈し得る種々の細胞タイプから構成されるという高まりつつある認識がある。細胞タイプはさらに亜集団に分けられ得、単細胞転写調査により、同じ見かけのタイプの個々の細胞の間でさえ、実質的な遺伝子発現の差異が明らかになっている。それゆえ、多くのRBPの標的も、組織および細胞タイプの間で異なる可能性があるため、細胞特異的標的を同定することが重大である。

RBPの標的を同定する伝統的な方法である、典型的には、RBPに結合した標的RNAの免疫沈降は、一般的に混合組織に対して実施され、そのため、溶解後のRBPと疑似標的とのインビトロでの相互作用などの問題に悩まされている。さらには、実験条件の一見したところわずかな差異で、結果は劇的に変化し得る。研究室間で重複がほとんどないFMRP（脆弱X症候群と関連するRBP）の標的候補の長いリストは、この事実の証である。同様に、ALSに関連するRBPであるTDP-43について実施された複数の調査も、際立って重複しない標的のセットをもたらしている。

より洗練された方法には、インビボでのRNA結合ポリペプチド（RBP）標的の同定のための現在のゴールドスタンダードであるCLIP（架橋および免疫沈降）およびその変法が含まれる。これらの方法は免疫沈降をベースとし、細胞および組織内でのRBPとその標的との間の共有結合性相互作用を創出する工程、保護されていないRNAを消化する工程、ならびに残りの「結合している」RNAをシーケンシングする工程を伴う。その無数の利点にもかかわらず、CLIPはいくつかの欠点を有する。その中でも顕著なものは、高アフィニティーの特異的抗体が必要であること、および架橋の非効率性（一般的に1％〜5％）である。それゆえ、CLIPは、かなり大量の材料（現在のところ、数百万個の細胞）を必要とし、そのため、特定の細胞における標的よりもむしろ組織全体における標的の検討に最も適している。

CLIP（細胞特異的に発現したエピトープタグ付けされたRBPを用いる）を用いて細胞特異的なRBPの標的を同定することが可能なはずであるが、これは依然として技術的に困難である。架橋は、一部の組織におけるUV透過の制限によって、およびより重要なことには、限定された細胞集団における材料が少量であることによって、損なわれている。CLIPは2005年に最初に記載されたが、そのような細胞特異的な実験はまだ公表されていない。したがって、RBPの標的を同定するための改善された方法が必要とされている。

以下に記載されているように、本発明は、RNA修飾酵素（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）に機能的に連結されたRNA結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、およびその使用方法を特徴とする。

一局面において、本発明は、RNA編集酵素またはその断片に融合したRNA結合ポリペプチドまたはその断片を含有する、融合ポリペプチドを提供する。一態様において、当該RNA編集酵素は、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。別の態様において、当該RNA結合ポリペプチドは、Zipcode binding polypeptide 1（ZBP1）、Fus、Tdp43、EIF4EBP1、およびHuRからなる群より選択される。別の態様において、当該RNA編集酵素は、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼの触媒ドメインである。別の態様において、当該融合ポリペプチドは、精製のための配列タグまたは検出可能な部分をさらに含有する。

別の局面において、本発明は、任意の先行請求項のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターを提供する。一態様において、当該ベクターは、当該核酸配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含有する。別の態様において、当該プロモーターは、細胞における発現のために配置されている。別の態様において、当該プロモーターは、昆虫または哺乳動物プロモーターである。

別の局面において、本発明は、任意の先行請求項の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。一態様において、当該細胞は真核細胞である。別の態様において、当該細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される。

別の局面において、本発明は、任意の先行請求項の融合ポリペプチドを含有する哺乳動物宿主細胞を提供する。一態様において、当該細胞は、ヒトまたは動物対象に由来する哺乳動物細胞である。別の態様において、当該細胞は新生細胞である。別の態様において、当該細胞は、脂肪細胞、骨髄由来細胞、表皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、肝細胞、筋細胞、ニューロン、膵臓細胞、およびそれらの前駆細胞または幹細胞からなる群より選択される。

別の局面において、本発明は、任意の先行請求項の融合ポリペプチドを生産するための方法を提供し、当該方法は、細胞における発現のために配置された任意の先行請求項の発現ベクターで形質転換された細胞を用意する工程；および当該融合ポリペプチドを発現させるための条件下で当該細胞を培養する工程を伴う。

別の局面において、本発明は、任意の先行請求項の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを提供する。

別の局面において、本発明は、任意の先行請求項の融合ポリペプチドを含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを提供し、当該ポリペプチドは、哺乳動物細胞における発現のために配置されたプロモーターに機能的に連結されている。

別の局面において、本発明は、RNA結合ポリペプチドの標的を同定するための方法を提供し、当該方法は、RNA編集酵素の触媒ドメインに融合しているRNA結合ポリペプチドまたはその断片を含有する融合ポリペプチドに細胞のトランスクリプトームを接触させる工程；および該トランスクリプトームにおける新規のRNA編集事象を検出する工程を伴う。一態様において、当該RNA編集酵素は、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。別の態様において、当該RNA結合ポリペプチドは、Zipcode binding polypeptide 1（ZBP1）、Fus、Tdp43、EIF4EBP1、およびHuRからなる群より選択される。別の態様において、当該RNA編集酵素は、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼの触媒ドメインである。別の態様において、当該検出する工程は、RNAのシーケンシングによるものである。別の態様において、当該融合ポリペプチドは、インビトロまたはインビボで細胞において発現する。

本発明によって規定される組成物および物品は、単離されたかまたは別様に製造されたものである。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明白であろう。

定義
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる用語の多くについての一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用する場合、以下の用語は、別様に指定されていない限り、以下にそれらに帰する意味を有する。

「RNA結合ポリペプチド-RNA編集酵素融合ポリペプチド」は、RNA結合ポリペプチドに由来するタンパク質ドメイン、およびポリ核酸デアミナーゼ活性を有するタンパク質ドメインを含む融合ポリペプチドを意味する。一態様において、ポリ核酸デアミナーゼ活性を有するタンパク質ドメインは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼの触媒ドメインである。

「RNA結合タンパク質」または「RNA結合ポリペプチド」は、配列特異的にRNAに結合することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。

「DNA結合タンパク質」または「DNA結合ポリペプチド」は、配列特異的にDNAに結合することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。

「RNA編集酵素」は、デアミナーゼ活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。一態様において、RNA修飾酵素は、RNA分子に存在するヌクレオチドに個別の不可逆的変化をもたらす。デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼおよび/またはシチジンデアミナーゼであり得る。一態様において、RNA修飾酵素は、Adenosine Deaminases Acting on RNA（ADAR）のショウジョウバエ（Drosophila）ホモログの触媒ドメインである。別の態様において、デアミナーゼは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるBass et al., PNAS Vol. 109, number 48, E3295-E3304に記載されている哺乳動物のデアミナーゼである。特定の態様において、RNA修飾酵素は、ヒトADAR1、2、3、または4である。例示的なADARの配列が以下に提供されている。

キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）＝「Adenosine Deaminases Acting on RNA、アイソフォームP」

ADAR1 AA配列
NCBI参照配列：XP_016855526.1

特定の態様において、ヒトADARは変異を含む。例示的な変異には、以下の表1において提供されるものが含まれる。

（表１）ADARの変異およびアミノ酸置換

^*WT残基は太字である。各アミノ酸置換の横の数字は、単離されたクローンの数を表す。

一態様において、RNA編集酵素は、E488Q、V493A、および/またはT490Aを含む。一態様において、RNA編集酵素は、E488QおよびV493A；E488QおよびT490A；またはE488Q、V493A、およびT490Aを含む。

「RNA編集酵素ポリヌクレオチド」は、RNA修飾酵素をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。

「eIF4EBP1ポリペプチド」は、NCBI参照配列NP_004086.1で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。真核生物翻訳開始因子4E結合ポリペプチドすなわち「eIF4EBP1」は、mRNAの5'末端にリボソーム40Sサブユニットを導くマルチサブユニット複合体の限定構成要素である真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）と直接相互作用し得るタンパク質である。このタンパク質とeIF4Eとの相互作用は、複合体会合を阻害して翻訳を抑制する。eIF4EBP1タンパク質は、UV照射およびインスリンシグナル伝達を含めた様々なシグナルに応答してリン酸化され、eIF4Eからのその解離およびキャップ依存性mRNA翻訳の活性化をもたらす。例示的なeIF4EBP1アミノ酸配列が以下に提供されている。

真核生物翻訳開始因子4E結合ポリペプチド1（eIF4EBP1）［ホモ・サピエンス（Homo sapiens）］

「eIF4EBP1ポリヌクレオチド」は、eIF4EBP1（例えば、真核生物翻訳開始因子4E結合ポリペプチド1）をコードする核酸分子を意味する。例示的なeIF4EBP1 Sポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：NM_004095.3で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「FMRPポリペプチド」は、NCBI参照配列Q06787.1で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において使用する場合、FMRP（脆弱X精神遅滞タンパク質）のショウジョウバエオルソログであるdFMR1をADARcdに融合させて、TRIBE融合ポリペプチドを創出した。FMRPおよびdFMR1は、ニューロンにおけるmRNA局在および翻訳調節において役割を担うと考えられている。例示的なFMRPのアミノ酸配列が以下に提供されている。

脆弱X精神遅滞タンパク質1（FMRP1）［ホモ・サピエンス］

「FMRPポリヌクレオチド」は、FMRP（例えば、脆弱X精神遅滞タンパク質）をコードする核酸分子を意味する。例示的なFRMPポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：AB209188.1で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「FUSポリペプチド」は、NCBI参照配列P35637.1で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。FUS RNA結合ポリペプチドまたは「Fus」は、RNA、一本鎖DNA、およびより低いアフィニティーで二本鎖DNAに結合し得るタンパク質である。FUS遺伝子は、疾患、例えば、粘液型脂肪肉腫、低悪性線維粘液性肉腫、前頭側頭葉型認知症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および前頭側頭型認知症（FTD）の発症に関係している。例示的なFUSアミノ酸配列が以下に提供されている。

RNA結合ポリペプチドFUS［ホモ・サピエンス］

「FUSポリヌクレオチド」は、FUSまたはRNA結合ポリペプチドFUSポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なFUSポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：NM_004960.3で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「ヘテロ核リボ核タンパク質A/B（hnRNP A/B）ポリペプチド」は、NCBI参照配列NP_112556.2で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有し、かつ生物学的ポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において使用する場合、Hrp48（Hrb27Cとも呼ばれる）は、哺乳動物hnRNP A/Bファミリーのホモログであり、スプライシング調節、mRNA局在、および翻訳に関係している。例示的なhnRNP A/Bのアミノ酸配列が以下に提供されている。

ヘテロ核リボ核タンパク質A/B（hnRNP A/B）アイソフォームa［ホモ・サピエンス］

「hnRNP A/Bポリヌクレオチド」は、hnRNP A/B（例えば、ヘテロ核リボ核タンパク質A/Bアイソフォームa）をコードする核酸分子を意味する。例示的なhnRNP A/Bポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：NM_031266.2で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「HuRポリペプチド」は、NCBI参照配列NP_001410.2で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。HuRまたは「ELAV様タンパク質1」は、3つのRNA結合ドメインを含有し得かつシス作用性AUリッチエレメントに結合するタンパク質である。HuRの機能の1つは、mRNAを安定させて遺伝子発現を調節することである。例示的なHuRアミノ酸配列が以下に提供されている。

ELAV様タンパク質1（HuR）［ホモ・サピエンス］

「HuRポリヌクレオチド」は、HuR（例えば、ELAV様RNA結合ポリペプチド1（ELAVL1））をコードする核酸分子を意味する。例示的なHuRポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：NM_001419.2で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「NonOポリペプチド」は、NCBI参照配列CAG33042.1で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において使用する場合、哺乳動物NonOのショウジョウバエオルソログであるNonAが、TRIBE融合ポリペプチドを作成するのに用いられ、NonOおよびNonAは、核パラスペックルの機能、ならびにスプライシング、mRNA核外輸送、および転写の調節のような他の核事象に関与する、多機能タンパク質である。例示的なNonOアミノ酸配列が以下に提供されている。

NonO［ホモ・サピエンス］

「NonOポリヌクレオチド」は、NonOポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なNonOポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：KU178235.1で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「ポリ(A)結合タンパク質（PABP）」は、NCBI参照配列NP_002559.2で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。例示的なPABPアミノ酸配列が以下に提供されている。

PABP［ホモ・サピエンス］

「PABPポリヌクレオチド」は、PABPポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なPABPポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：NM_002568.3で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

PABP［ホモ・サピエンス］

「40Sリボソームタンパク質S2（Rps2ポリペプチド）」は、NCBI参照配列NP_002943.2で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。例示的なRps2アミノ酸配列が以下に提供されている。

Rps2［ホモ・サピエンス］

「Rps2ポリヌクレオチド（例えば、40Sリボソームタンパク質S2）」は、PABPポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なRps2ポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：NM_002952.3で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

Rps2［ホモ・サピエンス］

「TAR-DNA結合タンパク質43kDa（Tdp43）ポリペプチド」は、NCBI参照配列Q13148.1で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。Tdp43または「TAR DNA結合ポリペプチド43」は、染色体に組み込まれたTAR DNAに結合しかつHIV-1転写を抑制する転写リプレッサーとして作用し得るタンパク質である。TDP-43は、DNAおよびRNAの両方に結合し、転写抑制、プレmRNAスプライシング、および翻訳調節における複数の機能を有することが示されている。例示的なTdp43アミノ酸配列が以下に提供されている。

TAR DNA結合ポリペプチド43（TDP-43）［ホモ・サピエンス］

「TDP-43ポリヌクレオチド」は、TDP-43（例えば、TAR DNA結合ポリペプチド43）をコードする核酸分子を意味する。例示的なTDP-43ポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：EF434181.1で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「Zipcode binding polypeptide 1（ZBP1）ポリペプチド」は、NCBI参照配列Q9NZI8.2で提供される配列またはその断片と少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有しかつポリヌクレオチド結合活性を有するタンパク質を意味する。ZBP1は、mRNA輸送に関与するタンパク質（RNA結合タンパク質、RBP）であるヒトインスリン様成長因子2 mRNA結合ポリペプチド1（IMP-1）およびマウスCRD-BPのホモログである。例示的なZBP1（IMP-1）アミノ酸配列が以下に提供されている。

Zipcode binding polypeptide 1（ZBP1）ポリペプチド［ホモ・サピエンス］

「ZBP1ポリヌクレオチド」は、ZBP1またはインスリン様成長因子2 mRNA結合ポリペプチド1ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なZBP1ポリヌクレオチド配列がNCBI参照配列：AF198254.1で提供されており、本明細書において以下に転載されている。

「変更」は、本明細書において記載されているものなど、技術分野において公知の標準的な方法によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書において使用する場合、変更には、発現レベルの10％の変化、発現レベルの好ましくは25％の変化、より好ましくは40％の変化、および最も好ましくは50％またはそれより大きな変化が含まれる。

本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、および「有する（having）」等は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し得、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得る；「から本質的になる」または「本質的になる」は、同じように米国特許法において帰する意味を有し、該用語は制約がなく、列挙されているものの基本的なまたは新規な特徴が、列挙されているもの以外の存在によって変化せず、先行技術の態様を除外する限りにおいて、列挙されているもの以外の存在を可能にする。

「検出する」は、検出される対象となる分析物の存在、非存在、または量を同定することを指す。

「検出可能な標識」は、関心対象の分子に連結された場合に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段によって当該関心対象の分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属性ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。

「発現ベクター」または「組換え発現ベクター」は、構築物が、mRNA、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ該mRNA、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを細胞内で発現させるのに十分な条件下で、ベクターと細胞とを接触させた場合に、宿主細胞によるmRNA、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。例示的な発現ベクターおよび構築の方法は、米国特許出願第8,993,531号、第6,136,599号、第6,020,164号、第5,962,226号、第5,858,675号、米国特許出願第20070066521号、および国際出願WO 2012033382号、WO 2010075303号に記載されており、それらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

本発明の発現ベクターは、全体としては天然に存在しない。しかしながら、ベクターの一部は天然に存在し得る。発現ベクターは、DNAおよびRNAを含むがそれらに限定されない任意のタイプのポリヌクレオチドを含み得、それは、一本鎖または二本鎖で、合成され得または天然供給源から部分的に獲得され得、およびそれは、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、または改変ヌクレオチドを含有し得る。発現ベクターは、天然もしくは非天然のヌクレオチド間連結、または両方のタイプの連結を含み得る。好ましくは、非天然のまたは改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写または複製を妨害しない。

本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な発現ベクターであり得、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために用いられ得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなど、複製および拡張のためもしくは発現のためまたはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターには、例えばpUCシリーズ（Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD）、pBluescriptシリーズ（Stratagene, LaJolla, CA）、pETシリーズ（Novagen, Madison, WI）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、およびpEXシリーズ（Clontech, Palo Alto, CA）であり得る。λGTIO、λGTl 1、λZapII（Stratagene）、λEMBL4、およびλNMl 149などのバクテリオファージベクターも用いられ得る。動物発現ベクターの例には、pEUK-Cl、pMAM、およびpMAMneo（Clontech）が含まれる。

本発明の発現ベクターは、例えば上記Sambrook et al.および上記Ausubel et al.に記載されている標準的な組換えDNA技法を用いて調製され得る。環状または線状の発現ベクターの構築物は、原核または真核宿主細胞において機能的な複製システムを含有するように調製され得る。複製システムは、例えばCoIEl、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルス等に由来し得る。

発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする1種または複数種のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属等に対する耐性）、原栄養性を提供する栄養要求性宿主における相補性等が含まれる。発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン/G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。

発現ベクターは、必要に応じておよび該ベクターがDNAベースであるかRNAベースであるかを考慮して、該ベクターが導入される対象となる宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または哺乳動物および非哺乳動物）に特異的である転写および翻訳の開始および終止コドンなど、調節配列を含み得る。

発現ベクターは、融合ポリペプチド（機能的部分およびその機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、または融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的であるもしくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に、機能的に連結された天然または非天然のプロモーターを含み得る。例えば強力な、弱い、誘導性の、組織特異的な、および発生特異的なプロモーターの選択は、当業者の通常の技能の範囲内にある。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとを組み合わせることも、当業者の技能の範囲内にある。本発明のプロモーターは、構成的なまたは調節性の様式で制御され得る。そのような調節性プロモーターは、ポリヌクレオチドの発現が増強され得るまたは抑制され得るような誘導性または抑制性であり得る。例示的なものには、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えばSV40初期プロモーター、RSVプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ステロイド誘導性マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）プロモーター、マウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見い出されるプロモーター、または当技術分野において公知の他の適切なシステムが含まれ得る。

発現ベクターは、一過性発現のために、安定した発現のために、またはその両方のために設計され得る。さらには、組換え発現ベクターは、構成的発現のためにまたは誘導性発現のために作製され得る。誘導性発現システムは、作用物質、例えば抗生物質の投与に応答性であり得、テトラサイクリン調節性発現システムまたは当技術分野において公知の任意の誘導性発現システムなどのシステムを含み得る。

「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含有する。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。

「融合ポリペプチド」は、天然では連続していない少なくとも2つのアミノ酸配列を結合させるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

「機能的に連結されている」は、2つ以上のポリペプチドが、各ポリペプチドがその意図される機能を果たし得るような様式で接続されていることを意味する。2つ以上のポリペプチドは、典型的にはペプチド結合により共有結合されている。融合ポリペプチドは、好ましくは標準的な組換えDNA技法によって生産される。例えば、第一のポリペプチドをコードするDNA分子は、第二のポリペプチドをコードする別のDNA分子にライゲーションされ、結果として生じたハイブリッドDNA分子は宿主細胞において発現して融合ポリペプチドを産生する。DNA分子は、ライゲーション後に、コードするポリペプチドの翻訳フレームが変更しないように、5'から3'への方向に互いにライゲーションされる（例えば、DNA分子はインフレームで互いにライゲーションされる）。

本発明は、本明細書において記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。

「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意のタイプの細胞を意味する。宿主細胞は、真核細胞（例えば、植物、動物、真菌、または藻類）であり得る、または原核細胞（例えば、細菌または原生動物）であり得る。宿主細胞は、例えば生物、例えばヒトから直接単離された、培養細胞または初代細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞、または浮遊細胞、すなわち浮遊状態で成長する細胞であり得る。本発明の方法に従って有用な宿主細胞は、当技術分野において周知である。適切な宿主生物には、例えばショウジョウバエ・シュナイダー2（S2）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、肝臓細胞、CV-1細胞、P19細胞、NT2/D1細胞、マウスL細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、COS-7細胞または他のCOS細胞）、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、HEK 293；DG44細胞）、ltk-細胞、マウスNIH 3T3細胞、および酵母細胞が含まれ得る。宿主細胞は、一過性にトランスフェクトされたまたは安定して形質転換された細胞株であり得る。付加的な宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば脂肪細胞、骨髄由来細胞、表皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、肝細胞、筋細胞、ニューロン、膵臓細胞、およびそれらの前駆細胞または幹細胞であり得る。

「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオ塩基間の水素結合を意味し、それはワトソン-クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成により対合する相補的なヌクレオ塩基である。

「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見い出される、通常ではそれに付随する構成要素を様々な程度に含んでいない材料を指す。「単離する」は、元の供給源または周辺からの分離の程度を表す。「純度」は、単離よりも高い分離の程度を表す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も該タンパク質の生物学的特性に大いに影響を及ぼさないまたは他の悪影響を引き起こさないように、他の材料を十分に含んでいない。つまり、本発明の核酸またはペプチドは、それが、細胞材料、ウイルス材料、または組換えDNA技法によって生産された場合には培養培地、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含んでいない場合、精製されている。純度および均質性は、典型的に、分析化学的技法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて判定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じさせることを表し得る。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質に関して、異なる修飾は、異なる単離されたタンパク質を生じさせ得、それは別個に精製され得る。

「単離されたポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて該遺伝子に隣接する遺伝子を含んでいない核酸（例えば、DNA）を意味する。それゆえ、該用語には、例えば、ベクター内に、自律複製するプラスミドもしくはウイルス内に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA内に組み入れられる；あるいは他の配列から独立した別個の分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生される、cDNAまたはゲノム断片もしくはcDNA断片）として存在する、組換えDNAが含まれる。加えて、該用語には、DNA分子から転写されるRNA分子、ならびに付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAが含まれる。

「単離されたポリペプチド」は、天然ではそれに付随する構成要素から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドは、それが天然では結び付いているタンパク質および天然に存在する有機分子を、それが重量で少なくとも60％含んでいない場合、単離されている。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％の本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば天然供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学的に合成することによって獲得され得る。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはHPLC解析によって測定され得る。

「機能的に連結されている」は、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が第二のポリヌクレオチドに結合している場合に、第一のポリヌクレオチドが、該第一のポリヌクレオチドの転写を指示する第二のポリヌクレオチドに近接して配置されていることを意味する。

「プラスミド」は、プラスミドベクター、例えば複製の起点（「ORI」）に起因して適切な宿主細胞内での自律複製の能力がある環状ポリヌクレオチド配列を意味する。さらには、プラスミドは、形質転換、または細胞内におよびインサートの挿入を可能にする多数の制限酵素コンセンサス部位を含むマルチクローニングサイト内に外来DNAを導入することを企図される他の手順の成功を表す選択可能なマーカーを含み得る。プラスミドベクターは、クローニングまたはドナーベクターと称され得、クローニングを容易にするためにおよび関心対象の配列を増幅するために用いられる。発現またはアクセプターベクターと呼ばれるプラスミドベクターは、具体的には、既定の標的細胞における関心対象の遺伝子の発現のためのものである。そうしたプラスミドベクターは、一般的に、プロモーター、導入遺伝子、および終結配列からなる発現カセットを示す。発現プラスミドは、種々の宿主細胞における複製および選択を可能にするエレメントを含有するシャトルプラスミドであり得る。

「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。

「発現のために配置されている」は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、DNA分子）が、配列の転写および翻訳を指示する（例えば、例えば本発明の組換えポリペプチドまたはRNA分子の産生を促す）DNA配列に近接して配置されていることを意味する。

「プロモーター」は、転写を指示するのに十分なポリヌクレオチドを意味する。本明細書において使用する場合、プロモーターは、それが機能的に連結されているポリヌクレオチドのセグメントの転写を指示するポリヌクレオチドを指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼの認識、結合、および転写開始に十分な特定の配列を含み得る。加えて、プロモーター領域は、トランス作用性因子に応答性であり得るシス作用性エレメントなど、転写の開始を調節する配列を含む。例示的なプロモーターは、翻訳開始部位の上流（例えば、すぐ上流）にある100、250、300、400、500、750、900、1000、1250、および1500ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。

「低下させる」は、少なくとも10％、25％、50％、75％、または100％の負の変更を意味する。

「参照」は、標準または対照条件を意味する。

「参照配列」は、配列比較のための基準として用いられる定義された配列である。参照配列は、指定された配列のサブセットまたは全体、例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全cDNAもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、およびさらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、一般的に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、およびさらにより好ましくは約100ヌクレオチドもしくは約300ヌクレオチド、またはそれらの周辺もしくはそれらの間の任意の整数である。

「特異的に結合する」は、サンプル、例えば生物学的サンプルにおける、関心対象のポリヌクレオチドを認識しかつ結合するが、他の分子を実質的に認識せずかつ結合しないタンパク質を意味する。

本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的に実質的な同一性を呈する。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズし得る。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的に実質的な同一性を呈する。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズし得る。「ハイブリダイズする」は、ストリンジェントな様々な条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載される遺伝子）またはその一部分の間で二本鎖分子を形成する対合を意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。

例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、およびより好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で獲得され得、一方で高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％のホルムアミド、およびより好ましくは少なくとも約50％のホルムアミドの存在下で獲得され得る。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、および最も好ましくは少なくとも約42℃の温度が含まれる。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、およびキャリアDNAの内包または除外など、色々な付加的パラメーターが当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって実現される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDS中30℃で生じる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ***DNA（ssDNA）中37℃で生じる。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μ/ml ssDNA中42℃で生じる。これらの条件の有用な変動は、当業者に容易に明白であろう。

ほとんどの適用に関して、ハイブリダイゼーションの後に続く洗浄工程もストリンジェンシーの点で変動する。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によっておよび温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることによってまたは温度を増加させることによって増加し得る。例えば、洗浄工程に対するストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、および最も好ましくは約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程に対するストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、およびさらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度が含まれる。好ましい態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDS中25℃で生じる。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDS中42Cで生じる。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDS中68℃で生じる。これらの条件の付加的な変動は、当業者に容易に明白であろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知であり、例えばBenton and Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。

「実質的に同一な」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書において記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書において記載される核酸配列のいずれか1つ）と少なくとも50％の同一性を呈するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために用いられる配列と、アミノ酸レベルまたは核酸で、少なくとも60％、より好ましくは80％または85％、およびより好ましくは90％、95％、またはさらに99％同一である。

配列同一性は、典型的に、配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および/または他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的に、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を判定するための例示的な手法では、密接に関連している配列を表すe^-3〜e^-100の確率スコアを有するBLASTプログラムが用いられ得る。

「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコ）を含むがそれらに限定されない哺乳動物を意味する。

本明細書において提供される範囲は、当該範囲内の値のすべてに対する略記であると理解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。

具体的に明記されていないまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用する場合、「または」という用語は、内包的であると理解される。具体的に明記されていないまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用する場合、「a」、「an」、および「the」という用語は、単数形または複数形であると理解される。

具体的に明記されていないまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用する場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の標準偏差2の範囲内として理解される。約は、明記された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％の範囲内として理解され得る。文脈から別様にはっきりしない限り、本明細書において提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。

本明細書における変数の任意の規定における化学基のリストの記述は、任意の単一の基またはリストに挙げられた基の組み合わせとしてのその変数の規定を含む。本明細書における変数または局面に対する態様の記述は、任意の単一の態様としてのまたは任意の他の態様もしくはその一部分との組み合わせでのその態様を含む。

本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のいずれかのうちの1つまたは複数と組み合わされ得る。

図1A〜1Dは、RNA結合ポリペプチド（RBP）と、RNA結合タンパク質の標的転写産物を編集し得るAdenosine Deaminases Acting on RNA（ADAR）の触媒ドメインとの融合ポリペプチドである、TRIBEの概略図を示す。図1Aは、特定のRNA結合タンパク質（RBP）の標的結合転写産物を同定する、TRIBE技法を示す略図を提供する。 図1Bは、その標的特異性を媒介する2つの二本鎖RNA結合ドメイン（dsRBD）と、アデノシンからイノシンへの変換を触媒するデアミナーゼドメインとから構成される、天然ショウジョウバエADARを示す略図を提供する。 図1Cは、ADARのdsRBDが関心対象のRBPで置き換えられたことを示す略図を提供する。融合ポリペプチドの編集特異性をRBPのRNA認識特性によって決定し、標的転写産物を新規編集事象によって永久的に印付けした。 図1Dは、インビボでの細胞の個別の集団における標的の同定を可能にするであろう、融合ポリペプチドの細胞特異的発現を示す略図を提供する。蛍光タンパク質の共発現は、関心対象の細胞由来のRNAのエンリッチメントを可能にする。ここで検討されたショウジョウバエニューロンサブセットの例は、コア概日ペースメーカーニューロン（pdf（pdf-Gal4）を発現する、約16個の細胞/脳）およびドーパミン作動性ニューロン（チロシンヒドロキシラーゼ（TH-Gal4）を発現する、約1,000個の細胞/脳）であった。 図2A〜2Dは、特定の部位を再現性よく編集し得るTRIBE融合ポリペプチドの能力を示す。図2Aは、S2細胞において融合ポリペプチドが誘導されるとAからGへの編集事象の増加が観察されたことを表すグラフを提供する。ADAR触媒ドメインのみを発現した場合、またはHrp48mut-ADARcd（Hrp48が変異RNA結合ドメインを有する）を発現した場合、編集部位の増加は観察されなかった。 図2B〜2Dは、同じ遺伝子および同じ部位が、同程度の効率で生物学的反復にわたって再現性よく編集されたことを示す（図2B挿入図、および図2C）。図2Bは、ほとんどの遺伝子は1つのみの編集部位を有するが、TRIBEタンパク質は特定の部位に対する強力な特異性を有することを表す、標的遺伝子あたりの編集の数についての頻度ヒストグラムを提供する。 図2Cは、生物学的反復間で同程度に編集されたTRIBEタンパク質部位（Hrp48 ADARcd反復1および反復2）の間の相関を表すグラフを提供する（R²＝0.859）。 図2Dは、内因性ポリペプチドおよび融合ポリペプチドが同様の結合パターンを有し、TRIBE編集がCLIPシグナルのパターンを反映することを表す編集事象マップを提供する。例示的遺伝子Lamについて、mRNA発現およびCLIPシグナル（上の3つのパネル）、ならびに融合ポリペプチドの発現の誘導の有無での、野生型細胞、安定細胞株（Hrp48-TRIBE）に関する編集の跡を示している。編集事象は黒いバーで表され、バーの高さはその部位における編集率（％）を表す。 明確にされているHrp48の標的Hsp83が正しい位置でHrp48-TRIBEによって編集されたことを表す編集事象マップを提供する。Hsp83分解エレメント（HDE）はHrp48によって結合されることが知られており（Bashirullahら；Nelsonら）、Hrp48-TRIBEは、HDE内のコンセンサスHrp48結合モチーフ（Blanchetteら；図5も参照されたい）内で編集を引き起こす。データはS2細胞から得られ、総リード数についての編集率（％）が編集部位に示されている。 図4A〜4Dは、Hrp48が、転写産物の3'UTRに優先的に結合することを表すTRIBEデータを示す。図4Aは、CLIPシグナルおよび編集部位の両方が、3'UTRにおいてエンリッチされたことを表すグラフを提供する。CLIPピークまたはTRIBE編集のいずれかの位置についてのメタ遺伝子定量化。バックグラウンドは、表示されている領域から構成されるハエトランスクリプトームの割合を表す。 図4Bは、TRIBE編集部位の大多数が、CLIPピーク付近にあったことを表すグラフを提供する。CLIPピークの特定の距離内にある編集部位の比率を、内因性Hrp48およびHrp48-TRIBEの両方に対して定量化した。距離 0bpは、編集部位がCLIPピークの境界内にあったことを表す。 図4Cは、TRIBE標的がCLIP標的のサブセットであったことを表すベン図を提供する。ベン図は、すべての発現遺伝子、すべてのTRIBE標的遺伝子、および少なくとも1つの統計的に有意なCLIPピークを有するすべての遺伝子の間での遺伝子の重複を示す。 図4Dは、TRIBE標的がより多くCLIPにエンリッチされたことを表すグラフを提供する。すべてのCLIP標的遺伝子、およびCLIPシグナルを有するTRIBE遺伝子の、遺伝子あたりのCLIPエンリッチメントの頻度分布。上位25％にランク付けされたCLIP標的とTRIBE標的との間の重複（挿入図）が示されている。 図5A〜5Eは、Hrp48、Hrp48-ADARcd CLIP、およびHrp48-TRIBE編集事象に関するモチーフ解析の略図を提供する。図5A〜5Cは、MEME解析によって見い出された有意なモチーフを表す略図を提供する。インビトロ選択（SELEX；Blanchette et al.）またはCLIP（内因性Hrp48およびHrp48-ADARcd）によって見い出されたモチーフ。 図5Aの説明を参照。 図5Aの説明を参照。 図5Dおよび5Eは、Hrp-ADARcd TRIBE編集部位周辺の領域において見い出されたモチーフを表す略図を提供する。S2細胞におけるHrp48-ADARcd TRIBE編集事象に関して、編集された塩基を取り囲むエリア±20および100bpを解析に用いた（FDR＜0.001）。 図5Dの説明を参照。 図6A〜6Bは、TRIBE編集部位を取り囲むRNA構造予測を示す。図6Aは、TRIBE編集部位（ライトグレー、丸）、またはTRIBE編集部位を欠くCLIP結合部位（ダークグレー、四角）を取り囲む予測二本鎖性（double-strandedness）を表すグラフを提供する。CLIPデータに対してCIMS解析（架橋誘導性変異部位）を実施することによって、Hrp48結合位置に対する単一ヌクレオチド分解能を達成した。該部位の50および30両方の250ntの隣接領域（合計で501nt）を、UNAFoldを用いて折り畳み、予測最小自由エネルギー（MFE）かつ準最適構造（MFEのDDG＝5Kcal/モル以内）において塩基対合をカウントし、プロファイルはそれごとに平均化されている。次いで、すべての部位を平均化してこのプロットをもたらした（平均±SEM、n＝17個のTRIBE編集部位）。データは、Hrp48 TRIBEから獲得された。図6Bは、ADAR2が局所的dsRNAを変形させ、かつ編集されたアデノシンに隣接する配列がデアミナーゼドメイン結合に最適である場合に形成される中間複合体に似ている、酵母においてヒトADAR2の触媒ドメインによって編集された部位を取り囲むRNA構造を示した略図を提供する。 図7A〜7Eは、dFMR1が、転写産物のコード配列に優先的に結合することを実証したTRIBEデータを示す。図7Aは、dFMR1-TRIBEタンパク質がデアミナーゼ活性を保持し、S2細胞において融合ポリペプチドの誘導があると、AからGへの編集事象の増加が観察されたことを表すグラフを提供する。 図7Bおよび7Cは、同じ遺伝子および同じ部位が、同程度の効率で生物学的反復にわたって再現性よく編集されることを示す。図7Bは、ほとんどの遺伝子は1つのみの編集部位を有するが、TRIBEタンパク質はある特定の部位に対する強力な特異性を有することを表す、標的遺伝子あたりの編集の数についての頻度ヒストグラムを提供する。 図7Cは、TRIBE部位が生物学的反復間で同程度に編集されることを表すグラフを提供する（R²＝0.86）。 図7Dは、mRNA発現（上）、および融合ポリペプチドの発現の誘導の有無での安定細胞株（dFMR1-TRIBE）に関する編集追跡を示した例示的遺伝子poeを表す編集事象マップを提供する。編集事象は黒いバーで表され、バーの高さはその部位における編集率（％）を表す。 図7Eは、CLIPピークまたはTRIBE編集のいずれかの位置についてのメタ遺伝子定量化のグラフを提供する。バックグラウンドは、表示されている領域から構成されるハエトランスクリプトームの割合を表す。Darnell et al. (2011)からの公知のマウスFMRP CLIPデータとの直接比較を可能にするために、イントロン部位は解析から除外された。 図8A〜8Cは、ハエdFMR1-TRIBE標的のマウスホモログが、より高いCLIPランクに対してエンリッチされたことを表すデータを示す。図8Aは、S2細胞におけるdFMR1-TRIBE標的のマウスホモログが、FMRPのCLIPランクがより高い標的に対してエンリッチされたことを表すグラフを提供する。 図8Bは、ニューロンdFMR1 TRIBE標的のマウスホモログが、より高いCLIPランクに対してエンリッチされたことを表すグラフを提供する。 図8Cは、堅牢なマウス脳FMRP CLIP標的のハエホモログのおよそ50％が、興奮性ハエニューロン（Cha）におけるTRIBE標的でもあったことを示したベン図を提供する。マウスFMRP CLIPデータは、Darnell et al., 2011から獲得された。 図9A〜9Eは、NonAが、転写産物のイントロンに優先的に結合することを実証したTRIBEデータを示す。図9Aは、NonA-TRIBEタンパク質がデアミナーゼ活性を保持することを表すグラフを提供する。S2細胞において融合ポリペプチドの誘導があると、AからGへの編集事象の増加が観察された。NonA TRIBEは、mRNAにおいて少しばかりの部位を誘導するが、多くの部位は、新生転写されたRNAに存在した。 図9Bおよび9Cは、ほとんどの遺伝子はmRNAにおいて1つのみの編集部位を有する（図9B）が、新生RNAにおいて（図9C）多くの遺伝子ははるかに多くの編集を有する（中央値＝2、75thパーセンタイル＝6、遺伝子あたり最大＝181個の編集）ことを示した、標的遺伝子あたりの編集の数についての頻度ヒストグラムを提供する。 図9Bの説明を参照。 図9Dは、mRNA（上）および新生RNA（中）発現、ならびに融合ポリペプチドの発現の誘導の有無での編集追跡を表す例示的遺伝子Dscamに関する編集事象マップを提供する。編集事象は黒いバーで表され、バーの高さはその部位における編集率（％）を表す。Dscamの十分なアノテーションは、これらS2細胞においておそらく発現される2種の例示的スプライスバリアントの上に示されている（下）。 図9Eは、mRNAおよび新生RNAの両方におけるTRIBE編集（NonA-TRIBEおよびHrp48-TRIBE）の位置についてのメタ遺伝子定量化を表すグラフを提供する。編集部位の総数をバーの隣に印付けした。バックグラウンドは、表示されている領域から構成されるハエトランスクリプトームの割合を表す。 図10A〜10Bは、シーケンシング深度および検出されたTRIBE編集部位の数を表すグラフを提供する。図10Aは、編集部位の同定のために種々の被覆度閾値を採用した、種々のシーケンシング深度（×100万個のマッピングされたリード）での、Hrp48 TRIBEを発現するS2細胞において検出された編集部位の数を表すグラフを提供する。20回の読み取りというよりストリンジェントな閾値が、この調査を通して用いられた。 図10Bは、種々のRBP TRIBE構築物を発現するS2細胞において検出された編集部位の数を表すグラフを提供する。所定のシーケンシング深度に対する部位の数は、RBPによって異なる（20回の読み取り閾値での編集部位に関するデータが示されている）。 図11A〜11Dは、mRNAにおけるイントロン標的を同定し得るNonA TRIBEの能力を示す。図11Aは、S2細胞において融合ポリペプチドの誘導があると、AからGへの編集事象の軽度の増加がmRNAにおいて観察されたことを表すグラフを提供する（図13Aにおいて新生RNAとともにデータも示されている）。 図11Bは、生物学的反復間で、編集率（％）が所定の部位において相関することを表すグラフを提供する（R²＝0.88）。 図11Cは、RefSeqアノテーションに基づく編集部位の分類を表すベン図を提供する。ほとんどの「イントロン」部位はエクソンとしてもアノテーションされず、例えばほとんどのmRNA NonAイントロン部位はカテゴリー化ミスではなく、該部位は、mRNA画分に見い出されるイントロンに実際にある。 図11Dは、イントロン領域に多くのNonA-TRIBE編集事象を有する例示的遺伝子ppnのTRIBE編集マップを提供する。該イントロン領域は、mRNAならびに新生RNA画分において明瞭に発現し、両方における結合標的として同定された。 図12A〜12Eは、Hrp48-TRIBEが、細胞の特定のサブセットにおいてRBPの標的を同定し得ることを示す。図12Aは、Hrp48-TRIBEタンパク質を発現するニューロンの特定のサブセットから単離されたRNAにおいて検出された編集部位の数（TRIBEとラベルされたバー）が、内因性編集部位のバックグラウンド数（対照とラベルされたバー）よりも有意に大きかったことを表すグラフを提供する。コア概日pdf神経ペプチド発現細胞（pdf-Gal4）、ドーパミン作動性ニューロン（TH-Gal4）、および汎ニューロン（elav-Gal4）が、検討された細胞タイプであった。 図12Bは、種々の細胞タイプにおいてTRIBEによってHrp48標的として同定される遺伝子のベン図を提供する。 図12C〜12Eは、標的遺伝子の3つのカテゴリーからの例示的遺伝子の略図を示す。図12Cは、多くの共通の発現遺伝子が、3種の細胞タイプのそれぞれにおいて標的として同定されることを表すマップである。図12Dおよび12Eは、一部の遺伝子が、1種（または2種の組み合わせ）の細胞タイプにおいてのみ標的として同定されることを表すデータを示す。ある特定の細胞タイプにおいてのみ発現する遺伝子が標的として同定され（図12E）、共通の発現遺伝子は、1種の細胞タイプにおいて標的として同定され得るが、他のものにおいてはそうでない（図12Bにおける破線の挿入図）ことを表すデータを示す。ここで留意すべきは、「発現」は、編集部位位置における十分なシーケンシング深度として分類され、そのため、細胞特異的に発現した遺伝子の数はおそらく過大評価であったということである。図12C〜12Eは、追跡には、ハエ頭部全体からのRNA-SeqおよびHrp48 CLIP、GFP発現対照（pdf、TH、およびelavとラベルされた）またはHrp48-TRIBE発現細胞（pdf、TH、およびelav-TRIBEとラベルされた）のいずれかの、表された単離されたニューロンサブタイプからのRNA-SeqおよびHrp48-TRIBE編集追跡が含まれることを示す。編集事象は黒いバーで表され、バーの高さはその部位における編集率（％）を表す。mRNA-Seqに対する尺度は各遺伝子に対して一定であり、pdf細胞におけるpdfのシグナルの切り取りをもたらした。 図12Cの説明を参照。 図12Cの説明を参照。 図13A〜13Fは、興奮性ニューロンおよび抑制性ニューロンにおいてdFMR1標的を同定したデータを示す。図13Aは、dFMR1-TRIBEタンパク質を発現するニューロンの特定のサブセットから単離されたRNAにおいて検出された編集部位の数（TRIBEとラベルされたバー）が、内因性編集部位のバックグラウンド数（対照とラベルされたバー）よりも大きかったことを表すグラフを提供する。興奮性ニューロン（コリン作動性；Cha-Gal4）および抑制性ニューロン（GABA作動性；GAD-Gal4）が、検討された細胞タイプであった。 図13Bは、標的遺伝子あたりの編集の数についての頻度ヒストグラムを提供する（左のグラフ；Cha、右のグラフ；GAD）。 図13Cは、種々の細胞タイプにおいてTRIBEによってdFMR1標的として同定された遺伝子のベン図を提供する。両細胞タイプにおいて十分なシーケンシング深度を有する標的編集部位が、破線で輪郭を描かれている。 図13D〜13Fは、例示的遺伝子の結合マップを示す。図13Eは、多くの共通の発現遺伝子が、両細胞タイプのそれぞれにおいて標的として同定され、図13Dおよび13Fに示されている一部の遺伝子は、両方において発現しているにもかかわらず、一方または他方の細胞タイプのいずれかにおいて標的として同定されることを示す。追跡は、GFP発現対照またはdFMR1-ADARcd発現細胞のいずれかの、表された単離されたニューロンサブタイプからのRNA-SeqおよびdFMR1-ADARcd TRIBE編集追跡である。編集事象は黒いバーで表され、バーの高さはその部位における編集率（％）を表す。 図13Dの説明を参照。 図13Dの説明を参照。 図14A〜14Bは、編集部位の近位にあるヌクレオチド同一性の最近隣選好性を表すデータを示す。図14Aは、（S2細胞における）3種のTRIBEタンパク質に関する最近隣選好性を表すグラフを提供する。 図14Bは、（S2細胞における）Hrp48-ADARcdに対する種々の編集率（％）についての編集部位に対する最近隣選好性を表すグラフを提供する。「n」は、用いた部位の数を表す。 図14Cは、アミノ酸480〜493（左のパネル）および596〜615（右のパネル）の間のhADAR2触媒ドメインのアミノ酸配列アライメントを示した略図を提供する。触媒ドメインにおける変異は、黒い矢印によって表されている。 図15Aは、Thor-ADARおよびThor-リンカー-ADAR融合ポリペプチドに関する編集部位の数を表すグラフを提供する。 図15Bは、Thor-E488Q変異体融合ポリペプチドに関する編集部位の数を表すグラフ（左のパネル）、ならびにp-thor-リンカーおよびV5に対するブロット（右のパネル）を提供する。 図15Cは、ラパマイシンおよびトリン1処理条件におけるThor-E488Q変異体融合ポリペプチドに関する編集部位の数を表すグラフを提供し（上のパネル）、チャートは、グラフにおいて表されたデータを提供する（下のパネル）。 図15Dは、ラパマイシンおよびトリン1処理条件におけるThor-LLAA-E488Q変異体融合ポリペプチドに関する編集部位の数を表すグラフを提供する。 図15Eは、より多くの編集部位が5'UTRおよび3'UTR領域に分布していることを表すグラフを提供する。 図15Fは、種々の複製物からの、ラパマイシンおよびトリン1処理条件下での4E-BPの共通のRNA結合標的についての頻度分布を表すベン図を提供する。 図15Gは、種々のラパマイシンおよびトリン薬物処理からの、4E-BPの共通の標的についての頻度分布を表すベン図を提供する。 図15Hは、PABP-E488Q変異体融合ポリペプチド（左のパネル）およびRps2-E488Q変異体融合ポリペプチド（右のパネル）に関する編集部位の数を表すグラフを提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、RNA結合タンパク質（RBP）の機能的標的を同定するために有用である組成物および方法を特徴とする。RNA転写産物は、RNA結合タンパク質（RBP）によって結合されかつ調節される。RBPのインビボ標的を同定するための現在の方法は不完全であり、少数の細胞を検討することに適していない。

これらの問題に対処するために、本発明は、ショウジョウバエRNA編集酵素であるAdenosine Deaminases Acting on RNA（ADAR）の触媒ドメインにRBPを連結させかつインビボで融合ポリペプチドを発現させる方法であるTRIBE（編集によって同定されたRNA結合タンパク質の標的（targets of RNA-binding proteins identified by editing））システムを用いる。RBPの標的は、新規のRNA編集事象で印付けされ、RNAをシーケンシングすることによって同定される。3種のRBP（Hrp48、dFMR1、およびNonA）の標的を同定するためにTRIBEを用いた。TRIBEは、CLIPを含めた他の方法に匹敵し、TRIBEは、わずか150個の特定のハエニューロンからRBPの標的を同定した。TRIBEは、抗体なしでかつ少数の特定の細胞において実施され得る。

本発明は、典型的にはそのようなタンパク質を発現しない細胞、組織、または臓器において、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドを発現させるための方法をさらに提供する。所望の場合には、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いて、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドを発現させる。所望の場合には、そのようなウイルスベクターは、本発明の融合ポリペプチドと組み合わせて投与され得る。有利なことには、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドは、細胞に一過性にのみ存在するが、とはいえアデノ随伴ウイルスベクターにおいて発現されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドは持続的に発現される。所望の場合には、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドの発現は、構成的発現のために持続し得る。

組換えポリペプチド発現
本発明は、概して、RNA修飾酵素に機能的に連結されたRNA結合ポリペプチドを提供し、該RNA結合ポリペプチドは、RBPの標的に特異的に結合し得かつ編集し得る。標的は、この編集によって不可逆的に印付けされる。その後、関心対象の細胞のトランスクリプトームがシーケンシングされ、それによってRBPの標的が同定される。

以下により詳細に記載されているように、関心対象の事実上任意のRNA結合ポリペプチドをRNA修飾酵素に融合させて、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドを形成させ得る。有利なことには、そのような融合ポリペプチドは、インビトロまたはインビボで細胞に送達され得る。一態様において、本発明の融合ポリペプチドを用いて、細胞が該融合ポリペプチドを取り込むように、インビトロで細胞に接触させる。あるいは、本発明の融合ポリペプチドを、細胞、組織、または臓器が該融合ポリペプチドを取り込むように、インサイチューで細胞、組織、または臓器に送達する。

本発明の態様において、関心対象の様々なRNA結合タンパク質をRNA修飾酵素に融合させて、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドを形成させ得る。RNA結合タンパク質には、例えば真核生物翻訳開始因子4E結合ポリペプチド1（eIF4EBP1）、脆弱X精神遅滞タンパク質1（FMRP1）、dFMR1（脆弱X精神遅滞タンパク質のキイロショウジョウバエホモログ）、RNA結合ポリペプチドFUS、ELAV様タンパク質1（HuR）、Hrp48（Hrb27Cとも呼ばれる）、hnRNP A/B、NonA、NonO、TAR DNA結合ポリペプチド43（TDP-43）、およびZipcode binding polypeptide 1（ZBP1）が含まれ得る。

本発明の態様において、様々なRNA修飾酵素をRNA結合タンパク質に機能的に連結させて、RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドを形成させ得る。RNA修飾酵素には、例えばAdenosine Deaminases Acting on RNA（ADAR）などのアデノシンデアミナーゼ、および任意のシチジンデアミナーゼ酵素が含まれ得る。

Adenosine Deaminases Acting on RNA（ADAR）は、dsRNAにおけるアデノシンを脱アミノ化してイノシンを産生する。ADARは哺乳動物において重要であり、神経系において特に重要である。

本発明の組換え融合ポリペプチドは、当業者に公知の事実上任意の方法を用いて生産される。典型的に、組換えポリペプチドは、適切な発現ビヒクルにおけるポリペプチドをコードする核酸分子またはその断片のすべてまたは一部での、適切な宿主細胞の形質転換によって生産される。分子生物学の分野における当業者であれば、多種多様の発現システムのいずれかを用いて組換えタンパク質を提供し得ることを理解するであろう。用いられる正確な宿主細胞は、本発明にとって重大ではない。本発明のポリペプチドは、原核生物宿主（例えば、大腸菌（E.coli））において、または真核生物宿主（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、昆虫細胞、例えばSf21細胞、または哺乳動物細胞、例えばNIH 3T3、HeLa、もしくは好ましくはCOS細胞）において産生され得る。そのような細胞は、広範な供給源（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）, Rockland, Md.；例えば、Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1997も参照されたい）から入手可能である。形質転換またはトランスフェクションの方法および発現ビヒクルの選定は、選択された宿主システムに依存する。形質転換およびトランスフェクション法は、例えばAusubel et al. (上記)に記載されており；発現ビヒクルは、例えばCloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987)において提供されるものから選定され得る。

本発明のポリペプチドの生産のための多様な発現システムが存在する。そのようなポリペプチドを生産するために有用な発現ベクターには、限定されることなく、染色体ベクター、エピソーマルベクター、およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、パポバウイルスなど、SV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクターが含まれる。

ポリペプチド生産のための1つの特定の細菌発現システムは、大腸菌pET発現システム（例えば、pET-28）（Novagen, Inc., Madison, Wisc.）である。この発現システムによると、ポリペプチドをコードするDNAは、発現を可能にするように設計された方向でpETベクター内に挿入される。そのようなポリペプチドをコードする遺伝子は、T7調節シグナルの制御下にあるため、該ポリペプチドの発現は、宿主細胞においてT7 RNAポリメラーゼの発現を誘導することによって達成される。これは、典型的に、IPTG誘導に応答してT7 RNAポリメラーゼを発現する宿主系統を用いて達成される。いったん産生されると、組換えポリペプチドは、次いで、当技術分野において公知の標準的方法、例えば本明細書において記載されるものに従って単離される。

ポリペプチド生産のための別の細菌発現システムは、pGEX発現システム（Pharmacia）である。このシステムは、機能的遺伝子産物の迅速な精製および回収を有する、融合ポリペプチドとしての遺伝子または遺伝子断片の高レベル発現のために設計されるGST遺伝子融合システムを採用する。関心対象のタンパク質は、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）由来グルタチオンS-トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシル末端に融合され、Glutathione Sepharose 4Bを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって細菌溶解物から容易に精製される。融合ポリペプチドは、グルタチオンを用いた溶出による穏やかな条件下で回収され得る。融合ポリペプチドからのグルタチオンS-トランスフェラーゼドメインの切断は、このドメインの上流にある部位特異的プロテアーゼに対する認識部位の存在によって促される。例えば、pGEX-2Tプラスミドにおいて発現したタンパク質はトロンビンで切断され得る；pGEX-3Xにおいて発現したものはファクターXaで切断され得る。

あるいは、本発明の組換えポリペプチドは、メチロトローフ酵母であるピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現される。ピキアは、唯一の炭素源としてメタノールを代謝し得る。メタノールの代謝における第一の工程は、アルコールオキシダーゼ酵素による、ホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。AOX1遺伝子によってコードされるこの酵素の発現は、メタノールによって誘導される。AOX1プロモーターが、誘導性ポリペプチド発現のために用いられ得る、またはGAPプロモーターが、関心対象の遺伝子の構成的発現のために用いられ得る。

いったん本発明の組換えポリペプチドが発現されると、それは、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離される。選択された宿主細胞において発現した組換えポリペプチドは、従来の生化学的技法を用いて分離され得、単離され得、および精製され得、高純度タンパク質を分離するために一般に用いられる様々なタイプのクロマトグラフィーおよびその組み合わせなど、例えばタンパク質沈殿剤での処理（塩析法）、遠心分離、超音波破砕、限外濾過、透析、分子篩クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が用いられ得る。

1つの例において、本発明のポリペプチドに対して作られた抗体をカラムに付着させ得、それを用いて組換えポリペプチドを単離し得る。抗体は、当技術分野において一般的に公知の任意の抗体生産法によって生産され得る。例えば、抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株などの哺乳動物によって産生されたB細胞ハイブリドーマ細胞株から産生され得る。当業者であれば理解するであろうように、重鎖C末リジンは、CHO細胞によって産生された型には不在であり得る（Dick Jr. et al., Biotechnol. Bioeng. 2008;100:1132-1143）。抗体生成のさらなる例示的な方法は、米国特許第6,794,500号、第7,432,367号、米国特許出願第20150266975号、および国際特許出願第WO 1998023744号、第WO 2010075303号、第WO 2015085003号によって記載されており、それらは参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。アフィニティークロマトグラフィーの前に、ポリペプチド担持細胞の溶解および分画が標準的方法（例えば、上記Ausubel et al.を参照されたい）によって実施され得る。あるいは、ポリペプチドは、ニッケルカラムに結合するヘキサヒスチジンタグなど、配列タグを用いて単離される。

いったん単離されると、組換えタンパク質は、所望の場合には、例えば高速液体クロマトグラフィー（例えば、Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980を参照されたい）によってさらに精製され得る。本発明のポリペプチド、特に短いペプチド断片は、化学合成によって（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載されている方法によって）も生産され得る。ポリペプチド発現および精製のこれらの一般的技法を用いて、（本明細書において記載される）有用なペプチド断片または類似体も生産し得および単離し得る。

RNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドおよび類似体
標的を同定し得るそれらの能力を増強するように修飾されたRNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドまたはその断片も、本発明に含まれる。本発明は、配列に変更をもたらすことによってRNA結合タンパク質-RNA修飾酵素融合ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸配列を最適化するための方法を提供する。そのような変更には、ある特定の変異、欠失、挿入、または翻訳後修飾が含まれ得る。本発明は、本発明の任意の天然に存在するポリペプチドの類似体をさらに含む。類似体は、アミノ酸配列の差異によって、翻訳後修飾によって、またはその両方によって、本発明の天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。本発明の類似体は、概して、本発明の天然に存在するアミノ酸配列のすべてまたは一部と少なくとも85％、より好ましくは90％、および最も好ましくは95％またはさらに99％の同一性を呈する。配列比較の長さは、少なくとも5、10、15、または20アミノ酸残基、好ましくは少なくとも25、50、または75アミノ酸残基、およびより好ましくは100アミノ酸残基を上回る数である。再度、同一性の程度を判定するための例示的な手法では、密接に関連している配列を表すe^-3〜e^-100の確率スコアを有するBLASTプログラムが用いられ得る。

本発明の核酸およびタンパク質配列を「クエリー配列」としてさらに用いて、公開データベースに対して検索を実施して、例えば関連配列を同定し得る。そのような検索は、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて実施され得る。NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12でBLASTヌクレオチド検索を実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を獲得し得る。XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3でBLASTタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を獲得し得る。比較目的のためのギャップありアライメントを獲得するために、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)に記載されているようにGapped BLASTが利用され得る。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）の初期設定パラメーターが用いられ得る（www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）。

修飾には、ポリペプチドのインビボおよびインビトロでの化学的誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化が含まれ；そのような修飾は、ポリペプチド合成もしくはプロセシングの間に、または単離された修飾酵素での処理の後に生じ得る。類似体は、一次配列における変更によっても、本発明の天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。これらには、天然のおよび誘導された（例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989、または上記Ausubel et al.に記載されているように、エタンメチル硫酸（ethanemethylsulfate）への照射もしくは曝露によるランダム変異誘発により、または部位特異的変異誘発により生じる）ものの両方の遺伝的バリアントが含まれる。L-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸または天然に存在しないもしくは合成のアミノ酸（例えば、βまたはγアミノ酸）を含有する、環化ペプチド、分子、および類似体も含まれる。

全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか1つの断片も提供する。本明細書において使用する場合、「断片」という用語は、少なくとも5、10、13、または15アミノ酸を意味する。他の態様において、断片は、少なくとも20個の連続アミノ酸、少なくとも30個の連続アミノ酸、または少なくとも50個の連続アミノ酸であり、他の態様において、少なくとも60〜80、100、200、300個、またはそれを上回る数の連続アミノ酸である。本発明の断片は、当業者に公知の方法によって生成され得る、または通常のタンパク質プロセシング（例えば、生物学的活性に要されない、新生ポリペプチドからのアミノ酸の除去、または選択的mRNAスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）により生じ得る。

本発明の実施は、別様に示されていない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来的技法を採用し、それは十分に当業者の理解の範囲内にある。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, second edition (Sambrook, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(Gait, 1984)；「Animal Cell Culture」(Freshney, 1987)；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir, 1996)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel, 1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullis, 1994)；「Current Protocols in Immunology」(Coligan, 1991)などの文献において十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に適用可能であり、そのようなものとして、本発明の実行および実施において考慮され得る。特定の態様に対する特に有用な技法は、後に続く節において述べられる。

以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法をどのように行いおよび用いるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図されない。

TRIBEは、RNA編集酵素の触媒ドメイン（ADARcd）へのRBPの融合を伴う。ADARの二本鎖RNA結合（dsRBD）領域は融合タンパク質から失われているため、その編集特異性をRBPのRNA認識特性によって決定した；標的転写産物をインビボで編集し、次いでRNAシーケンシングによって同定する（図1）。TRIBEは細胞培養に適合するが、細胞特異的なRBPの標的の同定にも適用可能である。例えば、蛍光タンパク質の共発現および蛍光活性化細胞選別または手動での細胞選別によって達成される、特定の細胞からのRNAの精製およびシーケンシングは、ごく少数のニューロンにおける標的の同定を可能にする（下記を参照されたい）。

実施例1−Hrp48-TRIBE融合ポリペプチドは、編集活性およびHrp48によって決定される特異性を有する
Hrp48（Hrb27Cとも呼ばれる）は、哺乳動物hnRNP A/Bファミリーのホモログであり、スプライシング調節、mRNA局在、および翻訳に関係している。Hrp48には十分に特徴付けされた標的がありかつ優れた抗体が存在し、またHrp48が概日調節に関与することが予備データによって示されたため、Hrp48を最初のRBPとして選定した。

誘導制御下でHrp48-ADARcd融合ポリペプチド（これ以降、Hrp48-TRIBEと称される）を発現するショウジョウバエS2安定細胞株を作製することによって、最初の実験を実施した。極めて低いレベルの内因性編集を有するS2細胞におけるこのタンパク質の発現は、検出された編集事象の数の劇的な増加につながる（およそ20倍；図2A）。それらは、AからGへの正しい塩基変換に限られ、当該融合ポリペプチドが適切な脱アミノ化反応を触媒していたことを示す。ADAR触媒ドメインのみの誘導は、安定したタンパク質発現にもかかわらず編集部位の増加をもたらさない（図2A）。同様に、変異したHrp48 RNA結合ドメインを有するHrp48-TRIBEは、安定して発現され、また編集部位の増加を引き起こさず、Hrp48のRNA結合能が必要であることを示している（図2A）。

標的遺伝子の大多数は単一の編集部位によって印付けされ、これらの事象は、それらの箇所および頻度（編集率（％））の両方において再現性があり、Hrp48-TRIBEが特異性を呈することを示している（図2Bおよび2C）。両方の生物学的反復において編集部位によって印付けされる遺伝子は、高信頼度TRIBE標的として定められる（図2Bおよび2D）。Hrp48に関して、これら1,401種の標的は、すべての発現遺伝子のおよそ20％に相当し（図2B）かつ広範な発現レベルを有し、TRIBEが選択的であったことを示している。

実施例2−CLIPおよびTRIBEは、Hrp48が転写産物の3'UTRに優先的に結合することで合致する
編集部位が本当のHrp48標的遺伝子を反映するかどうかを査定するために、一連のCLIP-Seq実験を実施して、このより伝統的な方法によって標的選択性に取り組んだ。まず、内因性Hrp48のCLIPは、Hrp48-TRIBE融合ポリペプチドのCLIPと同じ結合パターンを示す。両タンパク質は、例示的遺伝子Lamに見られるように、3'UTRにおいて強くエンリッチされる（図2D）。Hrp48の十分に特徴付けされた標的において、Hrp48 CLIPおよびHrp48-ADARcd CLIPの両方とも、Hrp48によって結合されることが以前に示された特定のエレメント周辺の3'UTRにわたる結合を示している（図3）（Bashirullah et al., EMBO J., 1999 18, 2610-2620；Nelson et al., J. Biol. Chem. 2007, 282, 34031-34038）。この3'UTR結合パターンは、トランスクリプトーム全域を占め（図4A）、さらに、ADARcdへの融合は、RBPのその通常の標的を認識しかつ結合し得る能力を著しく妨げないことを示す。同様に、Hrp48へのADARcdの融合は、（免疫細胞化学および細胞内分画によってアッセイした）その主な細胞質内局在パターンを変更しなかった。

CLIPによって同定されたHrp48の3'UTR結合選択性は、Hrp48-TRIBE編集部位のパターンによって忠実に反映される。トランスクリプトーム全域に対し、Hrp48-TRIBE編集部位のおよそ50％およびHrp48 CLIPの50％が、3'UTRに見い出される（図4A）。このデータは、TRIBE編集が、RBP結合部位の領域に非常に近い内因性標的を印付けすることを示している。

実際、Hrp48-TRIBEは、Hsp83の以前に特徴付けされた結合エレメント内で編集し（図3A）、TRIBEがRBP結合部位を印付けし得ることを示している。全体として、TRIBE編集部位の約10％はCLIPピーク内に位置し（Hsp83の例にあるように）、約80％は、CLIPピークから500bp未満である（図4B）。Hrp48 CLIPのモチーフ解析は、インビトロ選択を用いて以前に公表されたもの（Blanchette et al., Molecular cell. 2009, 33:438-449）に類似したTAリッチ結合モチーフを同定するが、編集部位周辺にはTAリッチモチーフが見い出されなかった（図5）。データは、TRIBEが、通常、結合部位ではなくその付近を編集することを示し、Hrp48のC末端に編集部分が融合されていることと一致している。しかしながら、いくらかより遠い編集は、RNAの柔軟性および/またはADARcdのdsRNA選好性に起因し得る（後で述べられる）。

Hrp48-TRIBEは、Hrp48 CLIPよりも少ない標的を明らかにする。ほとんどの発現遺伝子は、内因性Hrp48およびHrp48-TRIBE融合ポリペプチドから同様の結果を有し、少なくとも1つの統計的に有意なCLIPピークを有する（図4C）。これは、より限定された、発現遺伝子のわずか約20％を含むTRIBE標的とは対照的である（図4C）。これらの結果は高度ディープシーケンシング（約200Mのリード）からの結果であり、そのことは、より限定された標的セットが単に感度の不足に起因するわけではないことを示している。単一の統計的に有意なCLIPピークは、標的を明らかにするためのストリンジェントな閾値ではなかったため、（発現と比べた）総CLIPエンリッチメントを遺伝子ごとに算出した。CLIPによって同定された遺伝子の集団全体と比較して、Hrp48-TRIBE標的遺伝子は、より高いCLIPエンリッチメントに偏り（右にシフトした分布；図4D）；実際、上位4分の1にランク付けされたCLIP標的の45％はTRIBE標的でもあり、それは、Hrp48-TRIBEがより強力なHrp48 CLIP標的を優先的に検出することを示した（図4D、挿入図）。TRIBE編集事象周辺の領域の構造予測モデリングは、サッカロミセス・セレビシエにおいて発現させた場合にヒトADAR2cdによって編集されるRNA構造（図6B）（Yi-Brunozzi et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 37827-378332001；Gupta et al., RNA Biol. 2012, 9, 187-199；Eifler et al., Biochemistry. 2013, 52, 7857-7869）に類似した、dsRNA内に埋め込まれたバルジにおいて優先的に編集が生じることを示した（図6A）。この構造は、編集部位を欠くCLIP結合領域には存在しない（図6A）。まとめると、Hrp48-TRIBEに関する細胞培養データは、TRIBEが多くの内因性Hrp48標的を正しいメタ遺伝子位置で標識することを示している。

実施例3−dFMR1-TRIBEはコード配列を優先的に編集し、先のCLIPデータを反映する
FMRP（脆弱X精神遅滞タンパク質）のショウジョウバエオルソログであるdFMR1をADARcdに融合させることによって、第二のTRIBEタンパク質を創出した。dFMR1は、ニューロンにおけるmRNA局在および翻訳調節において役割を担う。

Hrp48-TRIBEに対して観察されたように、ショウジョウバエS2細胞におけるdFMR1-TRIBE発現の誘導は、編集事象の堅牢な増加につながった（図7A）。標的の大多数は1つのみの編集部位によって印付けされ、これらの個々の編集事象は、それらの箇所および頻度（編集率(％)）の両方において再現性があり、dFMR1-TRIBEが特異性を表すことを示した（図4Bおよび4C）。2つの生物学的反復において編集部位によって印付けされた遺伝子は、高信頼度TRIBE標的として分類された（図7B）。dFMR1の場合、これら315種の標的は、すべての発現遺伝子のおよそ5％に相当する。

Hrp48-TRIBE編集事象の分布とは全く対照的に、dFMR1-TRIBE編集事象は、転写産物のコード領域にわたって分布する（図7Dおよび7E）。これと同じパターンが、哺乳動物細胞におけるFMRPのCLIPによって観察されており（Darnell et al., Cell, 2011 146, 247-261；Ascano et al., Nature. 2012, 492, 382-386）、翻訳調節因子としてのdFMR1の役割と一致している。マウス脳FMRP CLIP標的のさらなる検討により、dFMR1-TRIBE標的遺伝子のマウスホモログはより高いCLIPランクに偏ることが明らかになり、dFMR1-TRIBEが、FMRPの保存された標的を同定することを示唆した（図8A）（Darnell et al.）。

実施例4−TRIBEは、NonAがイントロンに優先的に結合することを示す
第三のショウジョウバエRBPであるNonAは、哺乳動物タンパク質NonOのオルソログであり、上記と同様の様式でアッセイされた。NonOは、核パラスペックルの機能、ならびにスプライシング、mRNA核外輸送、および転写の調節のような他の核事象に関与する多機能タンパク質である。

S2細胞におけるNonA-TRIBE融合ポリペプチドの発現は、dFMR1およびHpr48融合ポリペプチドに関して上記で観察されたものよりはるかに少ない、わずかなmRNA編集の増加（およそ3倍；図9A、上）につながった。NonAの公知の核機能が理由で、NonAは、新たに転写された核RNAに優先的に結合し得ると見なされた。この目的のために、S2細胞由来のクロマチン結合RNAの単離およびシーケンシングが行われた（Wuarin and Schibler. Mol. Cell. Biol. 1994, 14, 7219-7225；Khodor et al., Genes Dev., 2011, 25, 2502-2512）。実際、NonA-TRIBEを発現する細胞由来の新生RNAは、より低いシーケンシング深度でさえ、mRNAよりも30倍多くの編集部位を有した（mRNA、約300部位、約90Mのマッピングされたリード；新生RNA、約9,000部位、約60Mのマッピングされたリード）（図9Aおよび10B）。

NonA-TRIBEによって編集された新生RNAは、Hrp48-TRIBE（図2B）、dFMR1-TRIBE（図7B）、またはそれどころかNonA-TRIBE（図9B）によるmRNAにおける編集事象とは対照的に、1遺伝子あたり多数の編集部位を含む遺伝子を多く有する（図9C）。新生RNAにおける1遺伝子あたりの部位の数の中央値は2であり、遺伝子の25％は、1遺伝子あたり6個を上回る数の部位を有する。これらの部位は、発現遺伝子のおよそ20％である1,561種の標的遺伝子にある。最大数は（Shabにおける）181部位である。

驚くことではないが、NonA-TRIBE編集部位は、新生転写産物のイントロン領域にエンリッチされている（豊富である）（図9Dおよび9E）。おそらく残留イントロンが理由で、mRNAにおけるいくつかのNonA-TRIBE編集事象の半分（40）も、イントロン領域にある（図11）。Hrp48-TRIBEを発現する細胞からシーケンシングされた新生RNAは、編集部位のこのイントロン濃縮を示さない（図9E）。それどころか、Hrp48-TRIBEは、新生RNAにおいてさえ3'UTRへの選好性を維持する。これは、新生RNAの5'エンリッチメントに起因して、新生転写産物がより少ない3'UTRリードを含有するという事実にもかかわらずである。それゆえ、それが一般的なRBP特性であるというよりもむしろ、NonA部分はイントロンRNAに対するNonA-TRIBEの選好性を決定付ける。

遺伝子オントロジー（GO）解析は、各RBPの標的が相違した機能を有するように、3種のRBPの異なる役割を補強する。細胞培養実験をまとめると、TRIBEは、3種のRBPのRNA標的、ならびに転写産物上のどこにそれらが結合するのかを決定し得ることが示される。

実施例5−Hrp48-TRIBEは、特定の細胞におけるRBPの標的を同定し得る
多くのRBPの標的は、組織および細胞タイプ間で異なる可能性があるため、TRIBEがハエ脳内の細胞特異的なRBPの標的を同定し得るかどうかを判定するための検査を行った。TRIBEタンパク質の細胞特異的発現を達成するために、ショウジョウバエUAS/Gal4システムを採用した。UASプロモーターの制御下にHrp48-TRIBE導入遺伝子を有するトランスジェニックハエ株を作出した。ニューロンの特定のサブセットにおいてのみUAS転写活性化因子Gal4を発現する広範なGal4ドライバー株を用いて、細胞特異的発現を達成した。検討されたニューロン群は、コア概日PDF神経ペプチド発現細胞（pdf-Gal4、約16個の細胞/脳）、ドーパミン作動性ニューロン（チロシンヒドロキシラーゼ、TH-Gal4、約1,000個の細胞/脳）、およびすべてのニューロン（全ニューロンドライバー、elav-Gal4、約100,000個の細胞/脳）であった。蛍光タンパク質（UAS-eGFP）を共発現させて、分離したショウジョウバエ脳からのTRIBEタンパク質発現ニューロンおよび対照ニューロンの手動による細胞選別を可能にした。

細胞培養の結果と同様に、ニューロンでのHrp48-TRIBEタンパク質の発現は、内因性編集のレベルよりはるかに多い、編集部位の数の大きな増加を引き起こした（内因性編集部位の範囲、約300〜2,000個；TRIBE編集部位の範囲、約8,000〜11,000個；図12A）。ニューロンでのADARcdのみの発現は、付加的な編集を生じさせなかった。任意の細胞タイプにおいて検出されたすべての内因性編集事象は、TRIBE発現ニューロンの下流解析から除外された。S2細胞におけるように、Hrp48-TRIBEによる編集事象は、ニューロン転写産物の3'UTRにおいてエンリッチされ、それは、培養S2細胞において典型的であるというよりも、1遺伝子あたりさらに多くの編集を有した。これは、部分的に、他の細胞タイプと比較してニューロンにおいてしばしば観察される3'UTRの延長された長さの結果であり得る。

3種の細胞タイプのそれぞれにおいて同程度の数のHrp48標的遺伝子が同定され（約1743〜2798種）；標的遺伝子セットは、重複しているが同一ではなかった（図12B）。驚くことではないが、3種すべての細胞タイプにおいて共通の発現遺伝子が標的として同定された（図12Bおよび12C）。例えば、「ニューロンにおいて見い出される（found in neurons）」（FNE）と名付けられたニューロンRBPは、すべてのニューロンサブセットにおいてHrp48の標的として同定され、この分類における他の標的には、bru-3、mamo、およびpumが含まれる。

しかしながら、一部の遺伝子は、3種すべてにおいて発現しているにもかかわらず、1種または2種の細胞タイプにおいてのみ標的として同定された。例えば、ガレクチン、aret、およびSppという遺伝子は、3種すべての細胞タイプにおいて発現したが、aretはTH細胞においてのみ標的として同定されている。ガレクチンはpdf細胞およびTH細胞において標的として同定され、Sppはpdf細胞およびelav細胞における標的である（図12E）。これらの「共通の発現遺伝子」は、ほぼ同等の頻度の編集事象を検出するために、3種すべての細胞タイプにおいて所定の塩基箇所で十分なシーケンシング深度（最低20回の読み取り）を有し、編集が実際に細胞タイプ特異的であることを示している。

真の細胞特異的遺伝子発現の差異により、別の標的セットが、1種または2種の細胞タイプにおいてのみ同定される：例えば、pdfは、pdfニューロンでのみ発現するため、pdfニューロンにおける標的としてのみ同定され；同様に、転写因子Dllは、ドーパミン作動性（TH）ニューロンにおいてのみ発現し、当該ニューロンにおいてHrp48標的として同定される（図12D）。細胞特異的に発現するものとして不適切に割り当てられたいくつかの遺伝子がおそらく存在するということに留意すべきである（図12B）。これは、許容される全体的な遺伝子発現にもかかわらず、（シーケンシング被覆度が不均一であるために）特定の編集部位の被覆度が不十分な場合に生じる。

これらのHrp48標的遺伝子を、遺伝子オントロジー用語（GO term）によっても解析した。共通の標的遺伝子は、驚くべきことに一般的なニューロン機能に対してエンリッチされておらず、軸索誘導および分岐におけるHrp48の新たに記載された役割と一致し、一方で細胞特異的標的遺伝子の機能ははっきりと異なった。これはおそらく、Hrp48の細胞特異的遺伝子発現パターンおよび共通の発現遺伝子へのHrp48の細胞特異的結合を反映している。

実施例6−dFMR1-TRIBEは、特定の細胞におけるRBPの標的を同定し得る
dFMR1-TRIBEも特定のニューロンにおいて発現させた。FMRPが変更された場合に興奮と抑制との間のバランスが影響を受ける哺乳動物システムからの証拠に基づいて（例えば、ヒト脆弱X症候群）、興奮性細胞（コリン作動性；Cha-Gal4）および抑制性細胞（GABA作動性；GAD-Gal4）におけるdFMR1の標的を、実験のために選択した。それらを上記のように精製し、得られた単離されたmRNAをシーケンシングした。

dFMR1-TRIBE編集部位は、ニューロンにおけるコード領域にわたって見い出され、上記の細胞培養の結果を反映している。おそらくGABA作動性ニューロンにおけるTRIBEタンパク質の発現レベルの方が低いために、GABA作動性ニューロンにおいて同定された標的遺伝子はコリン作動性ニューロンよりもはるかに少なかった（図13A〜13C）。これらの差異に起因して、Cha標的は本当は細胞特異的ではない可能性があるが、より少数のGAD-Gal4特異的なdFMR1の標的は、細胞特異的な標的を示している（図13Cおよび13F）。

遺伝子オントロジー（GO）解析は、微小管ネットワークの調節因子としてのFMRPの公知の役割と関連する遺伝子を含めた共通の標的が、一般的なニューロン機能に対してエンリッチされていることを示した。全体として、明瞭なハエホモログを有する堅牢なマウス脳CLIP標的（Darnell et al.）の45％が、ハエ興奮性ニューロンにおけるdFMR1 TRIBEの標的でもあった（図8Bおよび8C）。これらの遺伝子のうちの1つである、MAP1Bのハエホモログであるfutschは、遺伝学的手段によってFRMPの標的として同定されており、Darnell et al.において3位にランク付けされたCLIP標的でもあった。GAD特異的なdFMR1の標的は、転写を含む核プロセスに対してエンリッチされている（図13F）。対照的に、Cha特異的な標的は、細胞質機能、シグナル伝達、およびGTPase活性の調節に対してエンリッチされている（図13E）。Hrp48の細胞特異的な標的に関して上に記載されているのと同様に、dFMR1の細胞特異的な標的は、dFMR1の細胞特異的な遺伝子発現および/または共通の発現遺伝子へのdFMR1の細胞特異的な結合を反映し得る。

実施例7−TRIBEは4E-BPの標的を同定する
真核生物開始因子eIF4F複合体は、mRNAの5'キャップに結合するサブユニットであり、該複合体をmRNAまで連れていく、eIF4E；他の構成要素が結合する足場タンパク質であるeIF4G；***促進因子活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ1（Mnk1）であるeIF4Eキナーゼ；およびRNAヘリカーゼであるeIF4Aを含む多くの構成要素からなる。eIF4F複合体の機能性は、eIF4EとeIF4Gとの間の相互作用に依存する。しかしながら、eIF4Eへの4E-BPの結合は、eIF4Gおよび複合体の残りからeIF4Eを外し、ゆえに、キャップ依存性翻訳を阻害する。mTOR複合体1（mTORC1）は、4E-BPのリン酸化を制御することによって、4E-BPがeIF4Eに結合するか否かを制御する。

正の成長条件下でmTORC1が活性である場合、mTORC1は4E-BPをリン酸化し、その後、4E-BPはeIF4Eに結合することができない。ゆえに、eIF4Eは自由にeIF4Gに結合し、それは5'キャップ上でのeIF4F複合体を完成させて翻訳を進行させる。負の成長条件下、例えば、ストレス、またはラパマイシンもしくはトリン1によるmTORC1の薬理学的阻害の間、mTORC1は不活性であり、それゆえ4E-BPは低リン酸化になる。低リン酸化の結果として、4E-BPはeIF4Eに効率的に結合し、それによってeIF4EをeIF4F複合体から取り外し、キャップ依存性翻訳を阻害する。

哺乳動物タンパク質eIF4E-BPのオルソログであるショウジョウバエRBPであるThorの結合パートナーを同定するために、追加の実験を上記のように行った。ADARの触媒ドメインをThorに機能的に連結するように2種の融合ポリペプチドを作出し、一方の融合ポリペプチドは、ThorとADARとの間に空間的リンカー領域を含有した。4E-BPに関する文献から予測されたように、血清を与えないことまたはラパマイシンを添加することにより、標的mRNAの標識化が増強された（図15A、右のパネル）。

次に、Thorに機能的に連結されたADARに変異を導入することによって、融合ポリペプチドを作出した。ADAR変異（E488Q）は、とりわけ血清枯渇またはラパマイシン処理によるThorの活性化の後、標的mRNA標識化の劇的な増加をもたらし（図15B）、ゆえにこの方法をThor-E488Q「ハイパーTRIBE」と呼ぶ。変異型Thor-ADARは、ラパマイシン処理後よりもトリン1処理後に、さらにより多くの標的RNAを標識した（図15C）。

Thor-ADAR-E488Q変異体に加えて、Thorの構成的活性型（ThorLLAA）を用いてRNA標的を標識した。ThorLLAAは、ラパマイシンの存在下および非存在下における通常の誘導条件下で、RNA標的を十分に標識し得る（図15D）。Thor-リンカー-E488QおよびThorLLAA-E488Q変異体融合ポリペプチドを用いた解析により、より多くの部位が5'UTRおよび3'UTR領域に分布していることが明らかになった（図15E）。

種々の複製物からの、ラパマイシン（RAPA_1、RAPA_2）およびトリン（トリン_1、トリン_2）処理条件下での4E-BPの共通のRNA結合標的についての頻度分布が図15Fの左のパネルに示されており、一方で5'編集部位についての重複標的解析が図15の右のパネルに示されている。種々のラパマイシンおよびトリン薬物処理からの4E-BPの共通の標的を、さらなる解析のために選択した（図15G）。Thor TRIBE mRNA編集データを表2に提供する。E488Q変異体を用いて得たThor TRIBE mRNA編集を表3に提供する。

（表２）Thor TRIBE mRNAデータ

（表３）Thor TRIBE mRNAデータ

さらには、TOPおよびTOP様mRNAなど、mTOR経路によって調節されるeIF4Eの公知の結合パートナーを、Thor解析によって同定した。関心対象の配列を表4に提供する。TOP mRNAは、5'mRNAキャップの直後のシチジンから始まり、ピリミジンの4〜14bpの途切れないセグメント（下線が引かれた領域）が後に続く。

（表４）Thor標的におけるTOP様mRNA配列

ラパマイシンおよびトリン1処理条件における4E-BPの共通の標的についての遺伝子オントロジー（GO）解析により、4E-BPは、翻訳関連経路においてエンリッチされていることが示された。GO用語解析によって同定された関心対象の遺伝子の例を表5に提供する。

（表５）ラパマイシンおよびトリン1処理条件における4E-BPの共通の標的についての遺伝子オントロジー（GO）解析

実施例8−翻訳RNAのTRIBE同定
ポリ(A)結合ポリペプチド（PABP）およびリボソームタンパク質S2（RPS2）は、タンパク質合成を可能にする細胞機構の重要な構成要素である。翻訳中のmRNAを編集および同定するために、上記のように、ADARの触媒サブユニットに機能的に連結された融合ポリペプチドを形成するように、PABPおよびRPS2と併せてTRIBE法を用いた。

PABPは、mRNAの3'末端に位置するポリ(A)テールに結合するRNA結合ポリペプチドである。PABPは、翻訳前に、ポリアデニル酸ポリメラーゼがプレmRNAにポリ(A)ヌクレオチドテールを付加するのを助けることによって、mRNA前駆体にも関与する。PABPは、ナンセンス変異依存分解機構および核-細胞質輸送を含むmRNA代謝の段階の間にも存在する。PABPはまた、ポリ(A)テールを分解から保護し得かつmRNA産生を調節し得る。翻訳に関わるポリアデニル化mRNAを編集および同定するように、PABP結合を設計する。

RPS2は、リボソームの40Sサブユニットの構成要素である。翻訳の間、40Sサブユニットは70Sサブユニットに結合して、mRNAの翻訳に関与するリボソーム機構を形成して、ポリペプチドを形成する。40Sおよび70SリボソームサブユニットはmRNAの鎖上でともに会合し、そこでtRNAなどの付加的な細胞構成要素が翻訳のために導かれる。翻訳に関わるmRNAを編集および同定するように、RPS2結合を設計する。

上記のものと同様の様式で、PABP-E488Q TRIBE融合ポリペプチドおよびRPS2-E488Q TRIBE融合ポリペプチドを作出してアッセイした。PABP-E488Q融合ポリペプチドは、誘導群において堅牢な応答をもたらし、それは、編集された部位の量を増加させた（図15H、左のパネル）。RPS2-E488Q融合ポリペプチドは、誘導群において編集された部位の量を増加させるのに有効であった（図15H、右のパネル）。RPS2-E488Q融合タンパク質と比べて、PABP-E488Q TRIBE融合ポリペプチドは、編集された部位の数のより大きな増加をもたらした。

インビボでの少数の特定の細胞におけるRBPの標的の同定を可能にするように、TRIBEを開発した。TRIBEが種々のタイプのRBPに適用可能であることを示すために、3種のショウジョウバエRBP（Hrp48、dFMR1、およびNonA）にTRIBEを適用した。融合ポリペプチドは触媒活性を維持し、3種すべてのTRIBE融合ポリペプチドの発現は、新たな編集部位の堅牢でかつ再現性がある導入をもたらす。3種のRBP融合体は、劇的に異なる編集パターンを有し、編集特異性の決定においてRBPが主な役割を果たすことを示している。融合タンパク質および内因性タンパク質の両方のCLIPシグナルと同様に、Hrp48-TRIBE編集部位は3'UTRにおいてエンリッチされており、TRIBEがHrp48の内因性結合パターンを正しく反映することを実証している。dFMR1-TRIBE編集部位は、転写産物のコード配列にわたって分散しており、それはDarnellらによって報告された観察された哺乳動物FMRPの結合パターンであり、翻訳調節因子としてのその役割と一致している。第三のRPB融合タンパク質であるNonA-TRIBEは、イントロンにおいて優先的にRNAを編集し、スプライシング因子としてのその公表された役割と一致している（Kozlova et al., Exp. Cell Res. 2006, 312, 2619-2630；Kaneko et al., Genes Dev. 2007, 21, 1779-1789）。

陰性対照（切り取られたADAR触媒ドメインのみ、および変異が誘発されたRNA結合ドメインを有するHrp48-TRIBE）は、いかなる付加的な編集部位をももたらさず、編集がRBPによって指定されることをさらに示している。データは、TRIBE編集部位が、RBPの転写産物標的を忠実に印付けすることを確信をもって示している。特定のニューロンにおいてHrp48-TRIBEおよびdFMR1-TRIBEを発現させる追加の実験は、細胞特異的なRBPの標的を同定し得る能力を実証している。ニューロンサブタイプ間でこれらの標的を比較することにより、細胞タイプ特異的なRBPの標的の多様性、ひいては個々の細胞タイプにおけるRBP-標的相互作用を明らかにするための方法の重要性が示される。

TRIBEとCLIPとの比較
RBPの標的を同定するための現在の標準は、CLIPおよびその変法である。ほとんどのTRIBE部位はCLIP部位の500bp以内にあるものの、CLIPは、正確なRBP結合箇所を決定するために重要である。それにもかかわらず、インビボ結合を測定するための代替的な高分解能の方法がないことにより、系統的バイアスに対するCLIPデータ、または偽陽性および偽陰性の供給源を批判的に査定することが難しくなっている。

RBPのノックダウンによって機能的に影響を受けない転写産物が標的としてしばしば同定されるため、CLIP偽陽性は特に懸念事項である（Lambert et al., Mol. Cell, 2014, 54, 887-900）。バイアスには、ウリジンの優先的架橋；RNaseおよび断片化条件の選定が含まれ、そのすべては、検出される標的に重大な影響を有する。おそらく最も重要なことには、CLIPプロトコールの低効率な工程は、多数の細胞を必要とし、そのため個別の少数の細胞についての調査に適していない。

これらの難点の多くはTRIBEによって回避される。それは生化学的な技法ではなく、抗体を要しない。あるいは、「RNAタグ付け」は、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）ポリ(U)ポリメラーゼに融合したRBPを用いて、RBPによって結合されるポリUテールを付着させることによって標的RNAをタグ付けし、それを用いて、結合されていないもの（the bound not）の正体を同定することによって、標的RNAを同定する方法である（Lapointe et al., Nat. Methods 12, 1163-1170）。2つの方法を比較するのは時期尚早であるものの、RNAタグ付けは、RBPによって結合されるmRNAの領域を同定せず、標的同定は特別なライブラリープロトコールを要するため、RNAタグ付けはTRIBEとは根本的に異なる。さらには、RNAタグ付けとは対照的に、本発明の方法は、標準的なライブラリー法を用い、それゆえ必要なRNAはごく少数である。実際、TRIBEは、ハエ脳由来のごく少数の特定のニューロンにおいてRBPの標的を同定するために用いられた。この調査において用いられたニューロンの最も小さな群は、主要な概日ペースメーカーニューロンであるpdf細胞であり、そのうち16個が単一のハエ脳に存在する。TRIBEシーケンシングライブラリーを作出するために必要な細胞の最小数は、約150個のニューロンである。RNAシーケンシング（RNA-Seq）の最近の進歩および開発の軌跡を考慮すると、TRIBEは個々の細胞に適用可能であり得、RBPの標的に関する前例のないレベルの分解能を提供し得るであろう。

TRIBEは、特定の細胞のトランスクリプトームをシーケンシングする工程を伴い、それゆえそれらの特異的遺伝子発現特性、例えば選択的スプライシングおよび3'UTRパターンも捉え、それゆえ転写事象、転写後事象、およびRBP結合事象を関連付けすることが可能であり得る。しかしながら、TRIBE融合ポリペプチドの発現は遺伝子発現に影響を及ぼし得、一過性発現、およびTRIBE発現なしの並行サンプルの遺伝子発現解析が望ましい。対照的に、CLIPは、典型的には混合組織から行われ、結合データと特異的遺伝子発現状態とを関連付けするのを難しくしている。例えば、RBPが普遍的に発現されない（例えば、FMRPはニューロンにおいて発現するが、グリアまたは血管ではそうでない）脳に対してCLIPが実施される場合、対応するトランスクリプトーム、発現レベル、ならびにアイソフォームの特性は、すべての細胞タイプの平均である。Darnellらによって指摘されているように、これも正規化を不可能ではないにしても難しくする。結果として、CLIP標的は、高度に発現しかつ長い遺伝子に偏る。TRIBEは、その閾値を上回る最小発現レベルの標的を必要とするものの、高度に発現した遺伝子への偏りはない。

CLIPの最適化は困難である（例えば、最適な架橋パラメーターはタンパク質間で異なり、RNaseによる架橋複合体の過剰消化は結果に影響を及ぼし得る）が、TRIBEは実施するのが比較的簡単であり、哺乳動物システムに適してもいるはずである。それはクローニングおよび発現を必要とするのみであり、次いでRNAが精製およびシーケンシングされ、新規の編集事象がバイオインフォマティクスパイプラインを介して検出される。

TRIBEの潜在的短所
ADARの機能を奪い取るリスクは、それ自体の編集選択性の一部が残り得ることである。明らかに、ADARcd-TRIBEタンパク質は、RBP結合部位の近位にある編集可能な基質（アデノシン）を絶対的に必要とし、それがないことは、一部の標的の編集を不可能にし得かつ偽陰性をもたらし得る。加えて、内因性ADARは、編集部位の近位にある塩基に対する選好性を有し、すべてのTRIBEタンパク質はこれらの公表された選好性を維持する（例えば、5'ではUがエンリッチ、3'ではGがエンリッチ；図14）（Eggington et al., Nat. Commun., 2011, 2, 319；Kuttan and Bass, Proc. Natl. Acad. Sci., 2012, 109, E3295-E3304；Porath et al., Nat. Commun., 2014, 5, 4726）。このデータは、編集特異性が、デアミナーゼドメインによって少なくとも部分的に決定されることを示している。

しかしながら、偽陰性の最も顕著な原因は、おそらく、ADAR触媒ドメインの、そのdsRBDなしでさえの二本鎖RNAに対する強力な選好性である（Macbeth et al., Science. 2005, 309, 1534-1539；Eggington et al.；Montiel-Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2013, 110, 18285-18290；Vogel et al., Chem. Int. Ed. Engl. 2014, 53, 6267-6271；Vogel and Stafforst. ChemMedChem. 2014, 9, 2021-2025；Phelps et al., Nucleic Acids Res. 2015, 43, 1123-1132）。内因性ADARは相当な可塑性を呈する、例えばそれは高度に複雑な構造の領域ならびに長く続く二本鎖RNAを編集するが、RBP-ADARcdタンパク質は、それらの結合している標的を、それらが一本鎖RNAだけから構成される場合は標識しないであろうと推測された。実際、編集された領域と編集を有しないそれらのCLIP標的との比較（図6）は、dsRNA領域内の突出したAの必要性（Eifler et al., 2013）により、なぜTRIBEが有する標的はCLIPよりも少ないのかが説明されることを示している。

けれどもデータは、標的mRNAの40％〜50％が、TRIBE ADARcdによって編集される対象となる、RBP結合部位付近に十分な二本鎖特徴を有することを示している（図4Dおよび6）。それゆえデータは、RBPによるADARcdのRBPの標的への拘束が、とりわけ数時間の期間にわたって、インビボでの動的構造形成を上手く利用して（Mortimer et al., Nat. Rev. Genet. 2014, 15, 469-479；Kwok et al., Trends Biochem. Sci. 2015, 40, 221-232）、検出可能な頻度で多くの基質を編集し得かつ永久的に印付けし得ることを示している。実際、TRIBE ADARcdが、動的である二本鎖RNA特徴を上手く利用し得る場合、TRIBEは、RBPとその標的RNAとの間の長く続く相互作用の標的化を好む。それに反してCLIPは、偽陽性である多くのより弱くかつ一過性の相互作用を含むスナップショットを撮り得る。この解釈は、Hrp48に対するはるかにより多くの数のCLIP標的を説明するものの、TRIBE標的は最良のCLIP標的とはるかに良好な重複を有し、それらのうちの高い比率が、より安定した、それゆえ意味のあるインビボ相互作用も反映することを示している。

改善および拡張
本明細書に提示されている調査は、TRIBEについての最初の実証である。考え得る改変が行われ得る。例えば、付加的な編集部分が用いられ得る。一本鎖RNAを編集しかつシチジンおよびウリジンの変換を触媒するシチジンデアミナーゼを用いてTRIBEを実施しようと実験を行った。7種の特徴付けされたおよび推定上のシチジンデアミナーゼを試し、マウスAPOBEC1 ADARを選択した。一態様において、増強した触媒活性を有し、かつ野生型ADARほど最近隣選好性を有しない特徴付けされたADAR変異体（Kuttan and Bass, 2012）が用いられ得る。別の態様において、内因性レベルのRBP-TRIBE発現を達成するために、内因性遺伝子座ノックインが用いられ得る。別の態様において、ADARcdを他のタンパク質、例えばトランスクリプトーム同定のためのポリA結合ポリペプチドまたは翻訳プロファイリングのためのリボソームに融合させ、かつ細胞タイプ特異的な様式でそれらを発現させることによってTRIBEを拡張し得、そのすべてはいかなる生化学もなしに行われ得る。別の態様において、TRIBE編集に空間的および時間的制御を提供する、光により活性化可能な、生化学的に活性化可能な、または化学的に活性化可能なドメインが用いられ得る。

細胞特異性
ニューロンの特定のサブセットにおいてHrp48-TRIBEおよびdFMR1-TRIBEを発現させる実験により、細胞特異的な標的が同定された。ニューロンサブタイプ間でそれらを比較することにより、細胞タイプ特異的なRBPの標的の多様性、ひいては特定の細胞タイプにおけるRBP-標的相互作用を明らかにするためのTRIBEの重要性が示される。シーケンシング技術の最近の進歩により、転写レベルおよび転写後レベルでの個々の細胞タイプのはっきりと異なる調節が明らかになっているものの、個々のRBPの細胞タイプ特異的な役割および標的を明らかにすることは極めて難しいままである。TRIBEはこの問題を和らげ、それゆえ、より広く発現するタンパク質がどのように細胞特異的な効果を有するかについての長年にわたる問いに対処することに寄与するはずである。この問題は、ヒト疾患と関連するいくつかのRNA結合タンパク質、例えばFMRP、FUS、およびTDP43と特に関連している。

本明細書における上記の結果は、以下の方法および材料を用いて得られた。

分子生物学
関心対象のRBPを、pMT-Aベクター（Invitrogen、V4120-20、ブラストサイジン耐性遺伝子も担持する）内に、最小リンカー領域とともに、ショウジョウバエADAR触媒ドメイン（AHN59262.1のY268から始まり末端のE669まで、第二のdsRBDの下流にあるC末全体を用いた）の上流にクローニングした。pMT-RBP-ADARcd-V5-ブラストサイジンプラスミドをトランスフェクトし、後続のブラストサイジン耐性選択が続くことによって、安定したS2細胞株を作製した。タンパク質およびRNAを収穫する前に、24時間の硫酸銅の導入によって融合ポリペプチド発現を誘導した。すべての融合ポリペプチドのS2細胞発現を、V5タグ（Invitrogen、46-1157）に対するウェスタンブロットによってアッセイした。Khodor et al.に従って新生RNAをS2細胞から抽出し、Pennington et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 2013, 110, 7678-7683)に従ってリボソームRNA、およびmRNA（メーカーのプロトコールに従った、InvitrogenのDynabeads Oligo dTを用いた2ラウンドのpA枯渇）を枯渇させた。

Abruzzi et al. (Methods Enzymol. 2015, 551, 369-386)に記載されているように、蛍光標識されたニューロンを、ガラス製マイクロピペットを用いた手動による選別によって、解剖され粉砕されたハエ脳から単離した。S2細胞由来のRNA-Seqライブラリーを、標準的なIllumina Truseq Kitプロトコールを用いて構築した。手動により選別されたニューロン由来のRNA-Seqライブラリーを、Abruzzi et al.に記載されているように作製した。

RNA編集解析
RNA編集事象を、ゲノムDNAにおいてA＞80％かつゼロG、およびRNAにおいてG＞0％が存在する遺伝子座として規定する（逆の鎖では、逆の相補体を評価した）。また、S2細胞またはywハエのいずれかからゲノムDNAをシーケンシングして、SNPを含有する参照を提供した。RNA-Seqデータの解析を、以下に詳細に記載されている一部の改変を有して、以前に公表されたように（Rodriguez et al., Mol. Cell 2012, 47, 27-37）実施した。

ニューロンでは、解析からの内因性編集事象の除去を必要とした。より低い閾値（10回の読み取り、10％編集）を用いて、内因性編集事象を明らかにした。所定の実験において用いられたすべての株におけるすべての非TRIBE発現陰性対照からの部位を含めた、同定されたすべての内因性事象を、TRIBE発現ニューロンからのデータから除去した。遺伝子オントロジー（GO）解析を、DAVID（Huang da et al, Nat. Protoc. 2009, 4, 44-57）を用いて実施した。

CLIP
Hrp48およびHrp48-ADARcdのCLIPライブラリーを、以下に記載されている一部の改変を有して、Cho et al. (Cell. 2012, 151:765-777)に記載されているように構築した。結合の有意な領域を、CLIPperアルゴリズム（Lovci et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2013, 20, 1434-1442）を用いておよびMoore et al., Nat. Protoc. 2014, 9, 263-293に記載されているように決定した。

ハエ株
改変pJFRC7-20x UAS構築物内にRBP-ADARcd-V5導入遺伝子をクローニングし（除去されたmCD8-GFPの遺伝子座におけるRBP、Addgene #26220）、それがBestGeneによってインジェクションされることによって、TRIBEハエを作出した。UAS-RBP-ADARcd-V5；UAS-eGFPハエ（Bloomingtonストックセンター#1522）を幅広いドライバー株（pdf-Gal4、TH-Gal4、elav-gsg-Gal4、Cha-Gal4、およびGAD-Gal4）と交配させて、融合ポリペプチドの細胞タイプ特異的な発現を達成した。Hrp48-TRIBE（elav-Gal4およびUAS-Hrp48-ADARcd）の構成的全ニューロン発現は致死性であり、そのため成体特異的な発現を、遺伝子スイッチシステム（Osterwalder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98, 12596-12601）、elav-gsg-Gal4を用いて達成した。若齢ハエ（約3日齢）を、解剖および細胞選別の前に5〜8日間、RU486（0.2mg/ml、Sigma #8046）を含有する食糧で維持した。付加的な詳細は以下に記載されている。

クローニング
TRIBE構成要素のcDNAクローンを様々な供給源から入手した：Donald RioからのHrp48（P48809）；Tom Jongensによって提供されたdFMR1（AF305881）；Robert Reenan（Palladino et al., 2000）によって提供されたdADAR；NonA（クローンRE58280、Drosophila Genomics Resource Centre, Bloomington, IN）。アッセイされたシチジンデアミナーゼは、マウスAPOBEC1（BC003792）、酵母CDD1（Gene ID 850946）、推定ショウジョウバエシチジンデアミナーゼCG5292（FBgn0038491）およびCG6951（FBgn0036959）、ヒトAPOBEC3A（Sharma et al., 2015）、ならびに植物QED1およびRARE1（Wagoner et al., 2015）であった。hnRNP A1に対してMayeda et al. (1994)によって実施された変異の後に、Hrp48の2つのRNA認識モチーフの変異（P48809、F50V、F52VおよびF139V、F141V）をモデル化した。

細胞選別
細胞選別およびRNA-Seqライブラリー作出プロトコールについての詳細な説明は、Abruzzi et al.に提供されている。簡潔には、20〜50匹のハエ脳を、テトロドトキシンのみ（0.1uM）の存在下で解剖し、火で仕上げたピペットチップを用いた手動での解離の前に、L-システインにより活性化されたパパイン（Worthington）中で20分間消化した。解離した細胞を、大容量の選別培地中Sylgardコーティングされたプレート上に落ち着かせる。解剖顕微鏡を用いて、蛍光標識されたニューロンを、次いで毛細管（World Precision Glass Capillaries #1B100-4、Sutter Instrument Company）から引き出されたマイクロピペットを用いて手動で吸引する。およそ150〜400個の蛍光細胞が50ulのLysis/Bindingバッファー（Invitrogen；Dynabeads mRNA direct kit）中に選別されるまで、3ラウンドの選別を実施し、-80℃で凍結する。

手動で選別されたニューロンからのシーケンシングライブラリーの作出
シーケンシングライブラリーの作出を、Abruzzi et al.に記載されているように実施した。200〜500pgの全体または約5pgのmRNAが、約100個の手動で選別されたニューロンから集められると概算される。mRNAを、メーカーのプロトコールの縮小版を用いて、poly dTビーズ（Dynabeads mRNA direct kit；Invitrogen）で単離し、真空遠心分離（SpeedVac RC1010、Jouan, Winchester, VA）によって濃縮する。次いで、改変した線形増幅法を用いてこのRNAを増幅し；ランダムヘキサマー、およびT7プロモーターを含有するdTプライマーを用いた逆転写により、1ラウンドのインビトロ転写に用いられるcDNA鋳型が生成される（MEGAscript kit、Ambion）。cRNAを単離し（RNA MinElute column、Qiagen）、真空遠心分離によって濃縮し、およびRNA Tru-Seq library generation kit（Illumina）に対するインプットとして用いる。結果として生じたライブラリーは、やや3'に偏りがあり、リードのおよそ20〜60％はハエゲノムにマッピングされる（Abruzzi et al.において論じられるように）。すべてのシーケンシングを、Illumina HiSeqまたはMiSeqのいずれかで実施した。

RNA編集に関するシーケンシングデータの解析
RNAシーケンシングデータの解析を、一部の改変を有して、以前に公表されたRodriguez et al.のように実施した。すべての生のシーケンシングデータおよび同定されたRNA編集部位は、NCBI Gene Expression Omnibus（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、アクセッション番号（GSE78065）からダウンロード可能である。（Series GSE37232にあるyw gDNA、サンプルGSM914095を除く。）

簡潔には、シーケンシングリードを、Trimmomatics（Bolger et al., Bioinformatics. 2014, 30:2114-2120）を用いて各末端で6bp切り落とし、いずれかの末端由来の付加的な低品質の塩基を除去し、30またはそれを上回る平均品質スコアを有するリードを留める。ゲノムDNAリードを、bowtie2（パラメーター：--sensitive）を用いて参照ゲノム（Release 5/dm3）に対してアライメントし、RNAシーケンシングリードを、tophat2（Trapnell et al., Bioinformatics. 2009, 25:1105-1111）（パラメーター：-m 1 -p 5 -g 2 -I 50000 --microexon- search --no-coverage-search）を用いてアライメントする。

編集解析に対して、PCR二つ組は除去されなかった。選択数のデータセットの再解析の後、編集部位の数または同一性のごくわずかな変化があり、CLIPデータとの重複の変化は本質的になかった。解析にわたって用いられたgtfファイルを、iGenomes（Illuminaを介して、dm3 build）からダウンロードした。編集解析パイプラインは、UCSC genome browserからダウンロードされた、遺伝子のRefSeqアノテーションを用いた。一意的にマッピングされたリードのみが、編集解析に考慮される。検出される編集事象の数はシーケンシング深度とともに変化すると考えられるため、各実験内で、各サンプルをほぼ同じ深度までシーケンシングした。S2細胞におけるHrp48 TRIBEを用いた最初の実験は例外であり、実験サンプルを約2億個のリードまでシーケンシングして、多くの事象が低い被覆度で検出されていないかどうかを判定した。野生型細胞およびdADARcdのみを発現する細胞において、ならびにGEOで、70〜90個の編集部位が検出された（これらは、おそらく、SNP、PCRエラー、内因性の編集部位を表し、dADARcdのみによって編集された部位を含み得る）。

最低20回の読み取りおよび10％の編集を有する事象のみを、編集事象であると見なし、単一ヌクレオチド多型の内包を回避するために、gDNA被覆度およびヌクレオチド同一性の統一も要された。RNA編集データは、表示のためのbedgraphファイル形式に変換され、そこで編集率（％）（編集塩基数/総塩基数）は、表示された黒いバーの高さである。RNA編集データは、bedtoolを用いてbed/bedgraph形式として操作される。

HITS-CLIP
Hrp48のCLIPライブラリーを、わずかな改変を有して、以前に記載された（Cho et al.）ように構築した。S2細胞またはCSハエの頭部粉末に、254nmで300mJ/cm²を2回照射した（CL-1600紫外線架橋剤）。RNaseA処理に関して、40μlの40ng/ml RNaseAを1mlの溶解物に添加した。Hrp48の免疫沈降に関して、dynabeads protein A（Invitrogen）およびウサギ抗Hrp48抗体（Donald Rioからの贈与、Hammond et al., Molecular and cellular biology. 1997, 17:7260-7267）を用いた。Hrp48-ADAR-V5の免疫沈降に関して、dynabeads protein A（Invitrogen）、ウサギ抗マウスIgG抗体（Millipore、06-371）、およびマウスモノクローナル抗V5抗体（Invitrogen、46-1157）を用いた。ライブラリーを作製するために、以下のリンカーおよびプライマーを用いた。3'リンカー（RA3）、

；5'リンカー（RA5-N4）、

；RNA RTプライマー（RTP）、

；RNA PCRプライマー（RP1、順方向プライマー）、

；RNA PCRプライマー-インデックス7（RPI7、逆方向プライマー）、

；RNA PCRプライマー-インデックス8（RPI8、逆方向プライマー）、

；RNA PCRプライマー-インデックス9（RPI9、逆方向プライマー）、

CLIP、モチーフ解析、および遺伝子オントロジー
CLIP配列リードを、Novoalign（novoalign -t 85 -l 23 -s 1 -r None）を用いてアライメントした。CLIPデータについての後続のバイオインフォマティクス解析を、Moore et al. (2014)に記載されているように、および初期設定を有するCLIPperアルゴリズム（https://github.com/YeoLab/clipperで入手可能）を用いて実施した。遺伝子あたりのCLIPエンリッチメント値を算出するために、各CLIP領域のピーク高を、その領域に対して抽出されたmRNA-Seqリードに対して局所的に正規化し、各遺伝子にわたるこれらの値を合計した（CLIPperピークを用いる）。Darnellパイプライン（Moore et al, 2014）によって画定される有意なCLIP部位を取り囲んで、MEMEを用いたモチーフ解析を行った（Bailey et al., Nucleic acids research. 2009, 37:W202-208）、（バージョン4.10.0）（パラメーター：meme -minw 6 -maxw 10 -maxsize 1000000 -dna -nmotifs 5 -mod zoops）。編集部位を取り囲む領域をインプットすることによって、TRIBEデータに対するMEME解析を実施した。遺伝子オントロジー解析を、DAVID（Huang da et al.）を用いて実施し、TRIBE標的遺伝子（FBgn形式の）を、ハエ脳において発現されるすべての遺伝子のバックグラウンドに対して解析した（＞2fpkm、約8000遺伝子）。遺伝子発現レベルを、Cufflinks2を用いて定量化した。

RNA構造解析
UNAFOLDによるRNA構造折り畳みを、TRIBE編集部位付近、およびTRIBEによる編集を欠く、CIMS解析（架橋誘導性変異部位）によって同定されたCLIP結合部位付近の隣接配列に対して行った。該部位の5'および3'両方の250ntの隣接領域（合計で501nt）を、UNAFoldパラメーター（hybrid-ss-min--suffix DAT -- mfold=5,8,200 --noisolate）を用いて折り畳み、予測最小自由エネルギー（MFE）、かつ各部位に対するおよび該部位のいずれかの側の5個のヌクレオチドに対するMFE [1]のΔΔG＝5Kcal/モル以内にある予測準最適構造において、塩基対合をカウントして、二本鎖性についてのプロファイルを作成した。各部位に対するすべてのプロファイルを平均化して、TRIBE部位およびCIMS CLIP部位に対してプロット（平均±SEM、n＝17個のTRIBE編集部位）を作成する。

RNA編集データの解析に関する注記
ここで実施されたTRIBEデータのすべての解析はバイナリであり；いずれかの遺伝子は、TRIBE編集部位を有するまたは有しない、例えばmRNAは標的であるまたは標的でない。あるいは、RBPの標的の「強度」、遺伝子における編集部位の数、およびそれらが編集される程度（編集率（％））をランク付けする2つの考え得る測定基準が用いられ得た。しかしながら、そのような測定基準は、注意して解釈されるべきである。第一に、より長い遺伝子は、明らかに、より多くの編集部位を担持するより大きな収容能力を有する。第二に、編集率（％）は、二本鎖構造に参加する標的領域の傾向（上述される）によって、ならびにRBPとその標的との間の相互作用の強度によって影響を受け得る。

特定のRBP-TRIBEタンパク質によってもたらされた部位の数は、おそらくかなり広く変動し、そのため特定のシーケンシング深度を推奨することは難しい。編集事象の数に影響を及ぼし得る因子には、検出される部位の数に対するシーケンシング深度効果に加えて、内因性RBPの結合の強度、TRIBE-RBPの結合の強度、RBPの構造選好性、TRIBE-RBPの発現レベルが含まれる。シーケンシング深度が深ければ深いほど、より多くの編集部位が検出されると考えられる。しかしながら、最も深いシーケンシングが約2億個のマッピングされたリードである実験（Hrp48-TRIBE、s2細胞）に関して、データは、2〜3千万個のマッピングされたリードで十分であり得ることを示している（図10）。実験内で、各サンプルはほぼ同じ深度までシーケンシングされることが推奨される。

他の態様
前述の記載から、本明細書において記載される本発明に変動および改変を行って、それを様々な使用法および条件に採用し得ることは明白であろう。そのような態様も、以下の特許請求の範囲の内にある。

本明細書における変数の任意の規定における要素のリストの記述は、任意の単一の要素またはリストに挙げられた要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としてのその変数の規定を含む。本明細書における態様の記述は、任意の単一の態様としてのまたは任意の他の態様もしくはその一部分との組み合わせでのその態様を含む。

本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、あたかもそれぞれ独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられることを具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (26)

1. RNA編集酵素またはその断片に融合しているRNA結合ポリペプチドまたはその断片を含む、融合ポリペプチド。
2. 前記RNA編集酵素が、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項1記載の融合ポリペプチド。
3. 前記RNA結合ポリペプチドが、Zipcode binding polypeptide 1（ZBP1）、Fus、Tdp43、EIF4EBP1、およびHuRからなる群より選択される、請求項1記載の融合ポリペプチド。
4. 前記RNA編集酵素が、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼの触媒ドメインである、請求項1記載の融合ポリペプチド。
5. 前記RNA編集酵素が、E488Q、V493A、および/またはT490Aを含むヒトADAR2である、請求項1記載の融合ポリペプチド。
6. 請求項1〜5のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、発現ベクター。
7. 前記核酸配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項6記載の発現ベクター。
8. 前記プロモーターが、細胞における発現のために配置されている、請求項7記載の発現ベクター。
9. 前記プロモーターが、昆虫プロモーターまたは哺乳動物プロモーターである、請求項7記載の発現ベクター。
10. 請求項6〜9のいずれか一項記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
11. 真核細胞である、請求項10記載の宿主細胞。
12. 細菌細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項11記載の宿主細胞。
13. 請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを含む、哺乳動物宿主細胞。
14. ヒトまたは動物対象に由来する哺乳動物細胞である、請求項13記載の宿主細胞。
15. 新生細胞である、請求項13記載の宿主細胞。
16. 脂肪細胞、骨髄由来細胞、表皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、肝細胞、筋細胞、ニューロン、膵臓細胞、およびそれらの前駆細胞または幹細胞からなる群より選択される、請求項13記載の宿主細胞。
17. 請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを生産するための方法であって、
    （a）細胞における発現のために配置された請求項6〜9のいずれか一項記載の発現ベクターで形質転換された細胞を用意する工程；および
    （b）該融合ポリペプチドを発現させるための条件下で該細胞を培養する工程
    を含む、前記方法。
18. 請求項1〜6のいずれか一項記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。
19. 請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターであって、該ポリペプチドが、哺乳動物細胞における発現のために配置されたプロモーターに機能的に連結されている、前記アデノ随伴ウイルスベクター。
20. RNA結合ポリペプチドの標的を同定するための方法であって、
    （a）RNA編集酵素の触媒ドメインに融合しているRNA結合ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドに細胞のトランスクリプトームを接触させる工程；および
    （b）該トランスクリプトームにおける新規のRNA編集事象を検出する工程
    を含む、前記方法。
21. 前記RNA編集酵素が、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項20記載の方法。
22. 前記RNA結合ポリペプチドが、Zipcode binding polypeptide 1（ZBP1）、Fus、Tdp43、EIF4EBP1、およびHuRからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
23. 前記RNA編集酵素が、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼの触媒ドメインである、請求項20記載の方法。
24. 前記検出する工程が、RNAのシーケンシングによるものである、請求項20記載の方法。
25. 前記融合ポリペプチドが、インビトロまたはインビボで細胞において発現される、請求項20記載の方法。
26. 前記RNA編集酵素が、E488Q、V493A、および/またはT490Aを含むヒトADAR2である、請求項20記載の方法。

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