JP2019524137A - Metabolite production in endophytic fungi - Google Patents
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Abstract
本願発明は、ジャンチトレム生産内生菌におけるジャンチトレムの生合成のためのアミノ酸配列をコードする核酸に関する。本願発明はまた、そのような核酸を含む構築物及びベクター、並びに関連のポリペプチド、制御エレメント、及び方法に関する。The present invention relates to a nucleic acid that encodes an amino acid sequence for biosynthesis of gentitrem in a gentiantrum-producing endophytic fungus. The present invention also relates to constructs and vectors containing such nucleic acids, and related polypeptides, regulatory elements, and methods.
Description
本願発明は、ジャンチトレム化合物の生合成に関する。具体的には、本発明は、ジャンチトレムの合成を担う酵素をコードする遺伝子、並びに関連の構築物、ベクター、及び方法に関する。 The present invention relates to biosynthesis of gentitrem compounds. Specifically, the present invention relates to genes encoding enzymes responsible for the synthesis of gentitrem, and related constructs, vectors, and methods.
内生菌は、生きた植物の組織中に常在し、重大な恩恵を社会に、具体的には農業に与え得る、新規の化合物及び遺伝子の特に多様な供給源をもたらす。内生菌は多くの場合、その宿主と相利共生の関係を形成するが、それは、内生菌が宿主との適応度の増加を与えるのに伴うものであり、多くの場合、防御化合物の生産を介する。同時に、宿主植物は、内生菌に、保護された環境と栄養分という恩恵をもたらす。植物は、内生菌のための栄養分と、種子を介した散布の手段とを与える。内生菌は、宿主を生物(例えば昆虫及び哺乳動物の食害)及び非生物的ストレス(例えば渇水)から保護する。 Endogenous bacteria reside in living plant tissues and provide a particularly diverse source of new compounds and genes that can provide significant benefits to society, specifically to agriculture. Endogenous bacteria often form a symbiotic relationship with their host, which is associated with the endophytic bacteria providing increased fitness with the host, often with protective compounds. Through production. At the same time, the host plant provides endophytic benefits of a protected environment and nutrients. The plant provides nutrients for endophytic fungi and means for spreading through the seeds. Endogenous bacteria protect the host from living organisms (eg insect and mammalian feeding damage) and abiotic stress (eg drought).
重要な飼料草であるペレニアルライグラス及びトールフェスクは、一般に真菌内生菌を伴って見出される。有益及び有害の両方の農業特性が、共生の結果として生じるが、そのような特性には、水及び栄養分のストレスに対する耐性の向上と害虫に対する抵抗性とが含まれる。昆虫抵抗性は、内生菌の生産する特異的な代謝産物、具体的にはロリンアルカロイド類及びペラミンによってもたらされる。内生菌の生産する他の代謝産物、すなわちロリトレム類及びエルゴットアルカロイドは、草食動物に対し毒性を有し、草食性の摂食を減少させる。これらの化合物は、植物内で高いレベルに蓄積する可能性があり、植物内で、様々な害虫に対する潜在的な摂食抑止力として作用する。 Important forage grasses, perennial ryegrass and tall fescue, are commonly found with fungal endophytic fungi. Both beneficial and harmful agricultural characteristics arise as a result of symbiosis, such characteristics include increased resistance to water and nutrient stress and resistance to pests. Insect resistance is brought about by specific metabolites produced by endophytes, specifically lorin alkaloids and peramines. Other metabolites produced by endophytic fungi, namely Lolitrems and ergot alkaloids, are toxic to herbivores and reduce herbivorous feeding. These compounds can accumulate at high levels in plants and act as potential feeding deterrents against various pests in plants.
ジャンチトレムは、インドールジテルペンのクラスの1つであり、内生菌のサブグループによって生産される。1980年代に、ライグラススタッガー症候群の大発生によって、ジャンチトレムアルカロイド類の最初の特定に至った(Gallagherら、1980)。最近の発見は、ジャンチトレム類の多様性を浮き彫りにしている。すなわち、オーストラリア及びニュージーランド由来のＰ．ジャンチネラム(P. janthinellum)分離株は、広範なジャンチトレム類(ジャンチトレムB、C、D、E、F、及びG)を生産する。 Gentitrem is a class of indole diterpenes and is produced by a subgroup of endophytic fungi. In the 1980s, a major outbreak of Ryegrass-Stagger syndrome led to the first identification of gentitrem alkaloids (Gallagher et al., 1980). Recent discoveries highlight the diversity of gentile trems. That is, P. aeruginosa derived from Australia and New Zealand. P. janthinellum isolates produce a wide range of gentian trems (Janchytrems B, C, D, E, F, and G).
ジャンチトレムは、ロリトレムBと構造的な類似性を有するインドールジテルペンのクラスの1つである(図1)。エポキシ-ジャンチトレム類は、5つの化合物の群である。そして、エポキシ-ジャンチトレムIに平行して単離された3つの更に別の構造は、エポキシ-ジャンチトレムII[10-デアセチル-10,34-(3-メチルブタ-2-エニルアセタール)]、エポキシ-ジャンチトレムIII[10-デアセチル-34-O-(3-メチルブタ-2-エニル)]、及びエポキシ-ジャンチトレムIV[34-O-(3-メチルブタ-2-エニル)]と割り振られ、それらはそれぞれ、LC-MS分析に基づくエポキシ-ジャンチトレムIの誘導体である。エポキシ-ジャンチトレムIは、ペレニアルライグラス内生菌によって生産される、主要なジャンチトレムアルカロイドである。 Gantitrem is one of the classes of indole diterpenes that have structural similarities to Lolitrem B (Figure 1). Epoxy-gentitrems are a group of five compounds. And three additional structures isolated in parallel with Epoxy-Janchytrem I are Epoxy-Janchitrem II [10-deacetyl-10,34- (3-methylbut-2-enylacetal)], Epoxy-Janchitrem III [10-deacetyl-34-O- (3-methylbut-2-enyl)], and epoxy-juncitrem IV [34-O- (3-methylbut-2-enyl)], which are respectively LC -Derivatives of epoxy-juncitrem I based on MS analysis. Epoxy-gentitrem I is the major gentitrem alkaloid produced by perennial ryegrass endophytic fungi.
ペレニアルライグラス牧草中にジャンチトレム類が存在することによって、幅広い重要な牧草害虫に対する優れた保護がもたらされる。最近の発見では、ジャンチトレム類が、ロリトレムBと同様に、天然で振戦性を有する可能性があることが示されている。ロリトレムBは、ライグラススタッガーにおける主要な原因物質であることが知られている。これが、内生菌に感染した牧草の上で草を食む動物が運動失調、振戦、及び外的刺激に対する過敏性を発達させる条件である。ロリトレムBと同じように、ジャンチトレムBは、振戦性応答を誘導する可能性がある。最近のＰ．ジャンチネラム由来のジャンチトレムA及びBの生物活性の研究では、これらの2つの化合物が、マウスに対し振戦性を有し、コウモリガ[ワイセアナ・セルビナータ(Wiseana cervinata)]の幼虫に対し抗昆虫活性を有することが見出された(Babu、2009)。更に、エピクロエ属(Epichloe)内生菌由来のジャンチトレムは、精製されると、放牧に利点をもたらす生体保護特性を示すことが観察されている。 The presence of genitrems in perennial ryegrass grass provides excellent protection against a wide range of important grass pests. Recent discoveries indicate that, like Lolitrem B, juntremlems may have tremors in nature. Lolitrem B is known to be a major causative agent in ryegrass stagger. This is a condition where animals that graze on grass infected with endophytic fungi develop ataxia, tremor, and hypersensitivity to external stimuli. Like Lolitrem B, Juntrelem B can induce a tremor response. Recent P.I. In the study of the biological activity of gentian rams, gentiotrems A and B, these two compounds have tremor properties in mice and anti-insect activity in bat larvae [Wiseana cervinata] It was found (Babu, 2009). In addition, it has been observed that genitrelems derived from epiphyllous endophytic fungi exhibit bioprotective properties that, when purified, provide benefits for grazing.
これらの有用な特性があるにも関わらず、ジャンチトレムアルカロイド類は、内生菌の合成する他のアルカロイド群に比べると、あまり理解されていない。ジャンチトレムの生産を操作する際に有用な情報を提供するものとなることから、ジャンチトレム類とそれらの生合成を更に理解する必要性が高まりつつある。 Despite these useful properties, gentitrem alkaloids are less well understood than other alkaloids synthesized by endophytic fungi. As it provides useful information in manipulating gentitrem production, there is a growing need to further understand gentitrems and their biosynthesis.
本願発明の目的の1つは、先行技術に付随する1つ又は複数の難題又は不備を克服するか、又は少なくとも軽減することである。 One of the objects of the present invention is to overcome or at least reduce one or more of the difficulties or deficiencies associated with the prior art.
一態様では、本願発明は、内生菌におけるジャンチトレムの生合成に関与する遺伝子をコードする、実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供する。 In one aspect, the present invention provides a substantially purified or isolated nucleic acid or nucleic acid fragment encoding a gene involved in the biosynthesis of gentitrem in endophytes.
「核酸」とは、遺伝子の伝達を可能にするヌクレオチド鎖を意味する。この用語は、一般に、遺伝子若しくはそれらの機能的に活性な断片又はバリアント、及び又はその表現型に影響を与える生物のゲノムの他の配列を指す。用語「核酸」は、単鎖又は二重鎖のDNA(例えばcDNA又はゲノムDNA等)及びRNA(例えばmRNA又はマイクロRNA)を含み、それらは任意選択で合成の、非天然の、又は変更されたヌクレオチド塩基、合成核酸、及びそれらの組合せを含有する。 "Nucleic acid" means a nucleotide chain that allows for gene transfer. The term generally refers to genes or functionally active fragments or variants thereof and / or other sequences of the genome of an organism that affect its phenotype. The term `` nucleic acid '' includes single-stranded or double-stranded DNA (such as cDNA or genomic DNA) and RNA (such as mRNA or microRNA), which are optionally synthetic, non-natural, or modified. Contains nucleotide bases, synthetic nucleic acids, and combinations thereof.
本発明による核酸は、全長遺伝子又はその一部としてもよく、また、この明細書では「核酸断片」及び「ヌクレオチド配列」とも称する。便宜上、「核酸」又は「核酸断片」という表現は、これら全てをカバーするために使用される。 The nucleic acids according to the present invention may be full-length genes or parts thereof and are also referred to herein as “nucleic acid fragments” and “nucleotide sequences”. For convenience, the expression “nucleic acid” or “nucleic acid fragment” is used to cover all of these.
「実質的に精製された」とは、核酸が、本発明の核酸の由来する生物の天然に生じたゲノム中で、その核酸に隣接する遺伝子を含まないことを意味する。そのため、この用語は、例えば、ベクター内に、自律複製するプラスミド若しくはウイルス内に、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA内に組み込まれるか、又は他の配列と独立した別々の分子(例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じるcDNA又はゲノム若しくはcDNAの断片)として存在する、核酸を含む。それはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である核酸を含む。好ましくは、実質的に精製された核酸は、90%、更に好ましくは95%、更にいっそう好ましくは98%純粋である。 “Substantially purified” means that the nucleic acid is free of genes adjacent to the nucleic acid in the naturally occurring genome of the organism from which the nucleic acid of the invention is derived. As such, the term is incorporated into, for example, vectors, autonomously replicating plasmids or viruses, or prokaryotic or eukaryotic genomic DNA, or separate molecules independent of other sequences (e.g., Nucleic acids present as cDNA or genomic or cDNA fragments generated by PCR or restriction endonuclease digestion. It also includes a nucleic acid that is part of a hybrid gene that encodes additional polypeptide sequences. Preferably, the substantially purified nucleic acid is 90%, more preferably 95%, even more preferably 98% pure.
用語「単離された」とは、物質が、その元来の環境(例えば、それが天然に発生していれば天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きた植物中に存在する天然に発生した核酸は、単離されていないが、天然の系の中で共存する物質のいくつか又は全てから分離された同じ核酸は、単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部となり得る、並びに/又はそのような核酸は、組成物の一部となり得る、及びそのようなベクター若しくは組成物がその天然の環境の一部ではないという点で、やはり単離されたものであり得る。 The term “isolated” means that the material is removed from its original environment (eg, the natural environment if it is naturally occurring). For example, a naturally occurring nucleic acid present in a living plant is not isolated, but the same nucleic acid isolated from some or all of the coexisting materials in a natural system is isolated . Such nucleic acids can be part of a vector, and / or such nucleic acids can be part of a composition, and such a vector or composition is not part of its natural environment. Also, it can be isolated.
本発明のこの態様の好適な一実施形態では、ジャンチトレム生産内生菌とは、エピクロエ属内生菌であり、更に好適な実施形態では、内生菌は、分類群LpTG-3又はLpTG-4由来であり、更にいっそう好適な実施形態では、内生菌は、NEA12、AR37、15310、15311、及びE1からなる群から選択される。 In a preferred embodiment of this aspect of the present invention, the genitolem producing endophytic fungus is an Epichloe endophytic fungus, and in a more preferred embodiment the endophytic fungus is taxon LpTG-3 or LpTG-4. In an even more preferred embodiment, the endophytic fungus is selected from the group consisting of NEA12, AR37, 15310, 15311, and E1.
本願発明の第2の態様では、ジャンチトレム生合成ポリペプチドをコードするか、又はジャンチトレム生合成ポリペプチドをコードする配列に対し相補的若しくはアンチセンスである、実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片が提供され、前記核酸又は核酸断片は、(a)本明細書付属の図7、10、13、及び16(配列番号1、2、5、6、9、10、13、及び14)に示される配列;(b)(a)に記載された前記配列の相補体;(c)(a)及び(b)に記載された配列に対しアンチセンスである配列;並びに(d)(a)、(b)、及び(c)に記載された配列の関連部分と少なくともおよそ80%の同一性を有し、少なくとも20ヌクレオチドのサイズを有する、(a)、(b)、及び(c)に記載された配列の機能的に活性な断片及びバリアントからなる群から選択される、ヌクレオチド配列を含む。 In a second aspect of the present invention, a substantially purified or isolated nucleic acid that encodes a gentitrem biosynthetic polypeptide or that is complementary or antisense to a sequence encoding a gentitrem biosynthetic polypeptide, or Nucleic acid fragments are provided, wherein the nucleic acid or nucleic acid fragment is (a) Figures 7, 10, 13, and 16 (SEQ ID NOS: 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, and 14) attached hereto. (B) the complement of the sequence described in (a); (c) a sequence that is antisense to the sequences described in (a) and (b); and (d) (a ), (B), and (c) having at least about 80% identity with the relevant portion of the sequence described in (c) and having a size of at least 20 nucleotides, (a), (b), and (c) A nucleotide sequence selected from the group consisting of functionally active fragments and variants of the sequence described in.
本願発明は、本願発明の核酸の機能的に活性な断片及びバリアントを包含する。核酸に関連して「機能的に活性な」とは、断片又はバリアント(類似体、誘導体又は変異体等)が、ジャンチトレム生合成を調節することが可能であることを意味する。そのようなバリアントとしては、天然に発生した対立遺伝子バリアント、非天然に発生したバリアントが挙げられる。改変が結果として断片又はバリアントの機能的な活性の喪失を生じない限り、ヌクレオチドのうち1つ又は複数の追加、欠失、置換、及び誘導体化が想定される。好ましくは、機能的に活性な断片又はバリアントは、その断片又はバリアントの対応する上述の配列の関連部分と、少なくともおよそ80%の同一性、更に好ましくは少なくともおよそ90%の同一性、さらいっそうに好ましくは少なくともおよそ95%の同一性、最も好ましくは少なくともおよそ98%の同一性を有する。そのような機能的に活性なバリアント及び断片としては、例えば、保存された核酸変化を有するものが挙げられる。 The present invention includes functionally active fragments and variants of the nucleic acids of the present invention. “Functionally active” in the context of a nucleic acid means that a fragment or variant (such as an analog, derivative or variant) is capable of regulating gantitrem biosynthesis. Such variants include naturally occurring allelic variants and non-naturally occurring variants. As long as the modification does not result in a loss of functional activity of the fragment or variant, one or more additions, deletions, substitutions and derivatizations of one or more of the nucleotides are envisaged. Preferably, the functionally active fragment or variant has at least about 80% identity, more preferably at least about 90% identity, even more, with the relevant portion of the corresponding sequence described above of that fragment or variant. Preferably it has at least about 95% identity, most preferably at least about 98% identity. Such functionally active variants and fragments include, for example, those with conserved nucleic acid changes.
好ましくは、断片は、少なくとも20ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも200ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも500ヌクレオチドのサイズを有する。 Preferably, the fragment has a size of at least 20 nucleotides, more preferably at least 50 nucleotides, more preferably at least 100 nucleotides, more preferably at least 200 nucleotides, more preferably at least 500 nucleotides.
「保存された核酸変化」とは、遺伝子コードの冗長性に起因するコードされたタンパク質中のアミノ酸の保存を結果として生じる、核酸の置換を意味する。そのような機能的に活性なバリアント及び断片としてはまた、例えば、対応のアミノ酸配列中に1つ又は複数の残基の保存されたアミノ酸置換を結果として生じる、核酸変化を有するものが挙げられる。 By “conserved nucleic acid change” is meant a nucleic acid substitution that results in the conservation of amino acids in the encoded protein due to the redundancy of the genetic code. Such functionally active variants and fragments also include, for example, those with nucleic acid changes that result in conserved amino acid substitutions of one or more residues in the corresponding amino acid sequence.
「保存されたアミノ酸置換」は、同じクラスのうちの別の1つによるアミノ酸の置換を意味し、そのクラスとは以下の通りである。
非極性: Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
無電荷の極性: Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性: Asp、Glu
塩基性: Lys、Arg、His
A “conserved amino acid substitution” means a substitution of an amino acid by another one of the same class, the class is as follows:
Nonpolar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Uncharged polarity: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Acidity: Asp, Glu
Basic: Lys, Arg, His
他の保存されたアミノ酸置換も以下のようになされることがある。
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトン供与体:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトン受容体:Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
Other conserved amino acid substitutions may also be made as follows.
Aromatic: Phe, Tyr, His
Proton donor: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp
Proton receptor: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln
本願発明の更に別の態様では、本願発明による核酸を含む遺伝子構築物が提供される。好適な実施形態では、遺伝子構築物は、本願発明による核酸と、ジャンチトレム生合成のメディエーター又はモジュレーターをコードする遺伝子とを含む、キメラ配列を含むことがある。好ましくは、ジャンチトレム生合成のメディエーター又はモジュレーターをコードする遺伝子は、外因性であり、すなわち、本願発明による核酸との組合せで天然に発生しない。 In yet another aspect of the present invention, a genetic construct comprising a nucleic acid according to the present invention is provided. In a preferred embodiment, the genetic construct may comprise a chimeric sequence comprising a nucleic acid according to the present invention and a gene encoding a mediator or modulator of gentitrem biosynthesis. Preferably, the gene encoding the mediator or modulator of gentitrem biosynthesis is exogenous, ie not naturally occurring in combination with a nucleic acid according to the present invention.
本明細書に使用される際の用語「遺伝子構築物」とは、目的の遺伝子を含む、人工的に組み立てられたか又は単離された核酸分子を指す。好ましくは、遺伝子構築物は、組換え核酸分子である。一般に、構築物は、目的とする1つ又は複数の遺伝子、場合によっては目的の遺伝子ともすることができるマーカー遺伝子、及び適切な制御配列を含むことがある。好ましくは、マーカー遺伝子は、外因性であり、すなわち本願発明による核酸との組合せで天然に発生しない。 The term “gene construct” as used herein refers to an artificially assembled or isolated nucleic acid molecule containing a gene of interest. Preferably, the genetic construct is a recombinant nucleic acid molecule. In general, a construct may include one or more genes of interest, a marker gene that may also be the gene of interest, and appropriate regulatory sequences. Preferably, the marker gene is exogenous, ie does not occur naturally in combination with the nucleic acid according to the present invention.
構築物に制御配列を含むことは任意選択的であって、例えば、そのような配列は、宿主細胞の制御配列が使用される状況では必要とされないことがあることを認識するべきである。構築物という用語は、ベクターを含むが、それに限定されるものと解されるべきではない。 It should be appreciated that inclusion of control sequences in the construct is optional, eg, such sequences may not be required in situations where host cell control sequences are used. The term construct includes a vector, but should not be construed as limited thereto.
「キメラ配列」とは、別々のタンパク質、又はそれらの機能的に活性な断片又はバリアントを本来コードした、2つ以上の連結された核酸を含む融合遺伝子の発現を通じた、組換え手段によって生産されるハイブリッドを意味する。 A “chimeric sequence” is produced by recombinant means through expression of a fusion gene comprising two or more linked nucleic acids that originally encoded separate proteins, or functionally active fragments or variants thereof. Means a hybrid.
「融合遺伝子」とは、融合タンパク質の発現を可能にするような方式で、好ましくは翻訳融合物として、2つ以上の核酸が連結されていることを意味する。これは、典型的には、第1のタンパク質をコードする核酸配列から終止コドンを除去し、次いで、第2のタンパク質の核酸配列をインフレームで添加することを含む。融合遺伝子は、次いで、単一のタンパク質として細胞によって発現される。タンパク質は、両方の本来のタンパク質の全配列、又はどちらか若しくは両方の機能的に活性な断片若しくはバリアントを含むように、遺伝子操作されてもよい。 “Fusion gene” means that two or more nucleic acids are linked in a manner that allows expression of the fusion protein, preferably as a translational fusion. This typically involves removing the stop codon from the nucleic acid sequence encoding the first protein and then adding the nucleic acid sequence of the second protein in frame. The fusion gene is then expressed by the cell as a single protein. The protein may be genetically engineered to include the entire sequence of both native proteins, or either or both functionally active fragments or variants.
好適な一実施形態では、本願発明による遺伝子構築物は、ベクターであり得る。 In a preferred embodiment, the genetic construct according to the present invention may be a vector.
ベクターは、任意の適したタイプのものとしてもよく、ウイルス性としても非ウイルス性としてもよい。ベクターは、発現ベクターとしてもよい。そのようなベクターとしては、染色体の、非染色体の、及び合成の核酸配列、例えば、植物ウイルスの誘導体;細菌プラスミド;アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のTiプラスミドの誘導体;アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)由来のRiプラスミドの誘導体;ファージDNA;酵母人工染色体;細菌人工染色体;バイナリー細菌人工染色体;プラスミドとファージDNAとの組合せに由来するベクターが挙げられる。しかし、標的細胞中で複製可能又は組込み可能又は生存可能である限り、任意の他のベクターを使用してもよい。 The vector may be of any suitable type and may be viral or non-viral. The vector may be an expression vector. Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic nucleic acid sequences, such as plant virus derivatives; bacterial plasmids; Ti plasmid derivatives from Agrobacterium tumefaciens; Agrobacterium Derivatives of Ri plasmid derived from Agrobacterium rhizogenes; phage DNA; yeast artificial chromosome; bacterial artificial chromosome; binary bacterial artificial chromosome; vector derived from a combination of plasmid and phage DNA. However, any other vector may be used as long as it is replicable or integrable or viable in the target cell.
本発明のこの態様の好適な一実施形態では、遺伝子構築物は、プロモーター及びターミネーターを更に含むことがあり、前記プロモーター、遺伝子及びターミネーターは、作動可能に連結されている。 In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the gene construct may further comprise a promoter and a terminator, and the promoter, gene and terminator are operably linked.
「プロモーター」とは、作動可能に連結された核酸配列の転写を指示するのに充分な核酸配列を意味する。 By “promoter” is meant a nucleic acid sequence sufficient to direct transcription of an operably linked nucleic acid sequence.
「作動可能に連結された」とは、核酸と制御配列、例えばプロモーター等が、適切な条件下で前記核酸の発現が可能になるような方式で連結されていること、例えば、転写活性化因子タンパク質等の適切な分子が制御配列に結合されている場合等を意味する。好ましくは、作動可能に連結されたプロモーターとは、付随する核酸の上流である。 “Operably linked” means that a nucleic acid and a regulatory sequence, such as a promoter, are linked in a manner that allows expression of the nucleic acid under appropriate conditions, eg, a transcriptional activator It means when an appropriate molecule such as a protein is bound to a control sequence. Preferably, the operably linked promoter is upstream of the associated nucleic acid.
「上流」とは、核酸に沿って3'→5'の方向にあることを意味する。 “Upstream” means in the 3 ′ → 5 ′ direction along the nucleic acid.
プロモーター及びターミネーターは、標的細胞で機能的であれば、任意の適したタイプとしてよく、標的細胞にとって内因性としても外因性としてもよい。好ましくは、プロモーター及び/又はターミネーターは、外因性であり、すなわち本願発明による核酸との組合せで天然に発生しない。 The promoter and terminator may be of any suitable type as long as they are functional in the target cell and may be endogenous or exogenous to the target cell. Preferably, the promoter and / or terminator is exogenous, ie does not occur naturally in combination with the nucleic acid according to the present invention.
本願発明の遺伝子構築物に採用され得る種々のターミネーターはまた、当業者に周知である。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子由来としてもよいし、異なる遺伝子としてもよい。特に適したターミネーターは、(CaMV)35SポリA等のポリアデニル化シグナル、及びノパリンシンターゼ(nos)遺伝子及びオクトピンシンターゼ(ocs)遺伝子由来の他のターミネーターである。 Various terminators that can be employed in the gene construct of the present invention are also well known to those skilled in the art. The terminator may be derived from the same gene as the promoter sequence or may be a different gene. Particularly suitable terminators are polyadenylation signals such as (CaMV) 35S polyA and other terminators derived from nopaline synthase (nos) and octopine synthase (ocs) genes.
遺伝子構築物は、プロモーター、遺伝子及びターミネーターに加えて、核酸の発現に必要な更に別のエレメントを、例えば、ベクター骨格、複製起点(ori)、マルチクローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン(トウモロコシユビキチンUbiイントロン等)、抗生物質耐性遺伝子、及び他の選択マーカー遺伝子[ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nptII)遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hph)遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(bar又はpat)遺伝子等]、及びレポーター遺伝子[ベータ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(gusA)及び緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子(gfp)等]を、異なる組合せで含むことがある。遺伝子構築物はまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有することがある。遺伝子構築物はまた、発現を増幅させるための適切な配列を含むことがある。 In addition to promoters, genes and terminators, gene constructs contain additional elements necessary for nucleic acid expression, e.g., vector backbone, origin of replication (ori), multiple cloning site, spacer sequence, enhancer, intron (corn ubiquitin Ubi Introns, etc.), antibiotic resistance genes, and other selectable marker genes [neomycin phosphotransferase (nptII) gene, hygromycin phosphotransferase (hph) gene, phosphinotricin acetyltransferase (bar or pat) gene, etc.], and reporter genes [Beta-glucuronidase (GUS) gene (gusA) and green fluorescent protein (GFP) gene (gfp) etc.] may be included in different combinations. The gene construct may also contain a ribosome binding site for translation initiation. The genetic construct may also include appropriate sequences for amplifying expression.
前記核酸の発現を結果としてもたらすように、遺伝子構築物の様々な構成成分が作動可能に連結されることを、当業者は認識するであろう。本願発明の遺伝子構築物の構成成分を作動可能に連結するための手法は、当業者に周知である。そのような手法としては、リンカー、例えば合成リンカー等の使用が挙げられ、そのような合成リンカーとしては、例えば1つ又は複数の制限酵素部位が挙げられる。 One skilled in the art will recognize that the various components of the genetic construct are operably linked to result in expression of the nucleic acid. Techniques for operably linking the components of the gene construct of the present invention are well known to those skilled in the art. Such techniques include the use of linkers, such as synthetic linkers, and such synthetic linkers include, for example, one or more restriction enzyme sites.
好ましくは、遺伝子構築物は、実質的に精製又は単離されている。 Preferably, the genetic construct is substantially purified or isolated.
「実質的に精製された」とは、遺伝子構築物が、本発明の核酸又はプロモーターの由来する生物の天然に生じたゲノム中で、その核酸又はプロモーターに隣接する遺伝子を含まないことを意味する。そのため、この用語は、例えば、ベクター内に、自律複製するプラスミド若しくはウイルス内に、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA内に組み込まれるか、又は他の配列と独立した別々の分子(例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じるcDNA又はゲノム若しくはcDNAの断片)として存在する、遺伝子構築物を含む。それはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である遺伝子構築物を含む。 By “substantially purified” is meant that the genetic construct does not include genes adjacent to the nucleic acid or promoter in the naturally occurring genome of the organism from which the nucleic acid or promoter of the invention is derived. As such, the term is incorporated into, for example, vectors, autonomously replicating plasmids or viruses, or prokaryotic or eukaryotic genomic DNA, or separate molecules independent of other sequences (e.g., Gene constructs present as cDNA or genomic or cDNA fragments generated by PCR or restriction endonuclease digestion. It also includes genetic constructs that are part of a hybrid gene that encodes additional polypeptide sequences.
好ましくは、実質的に精製された遺伝子構築物は、少なくともおよそ90%純粋であり、更に好ましくは少なくともおよそ95%純粋であり、更にいっそう好ましくは少なくともおよそ98%純粋である。 Preferably, the substantially purified genetic construct is at least about 90% pure, more preferably at least about 95% pure, and even more preferably at least about 98% pure.
用語「単離された」とは、物質が、その元来の環境(例えば、それが天然に発生していれば天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きた植物中に存在する天然に発生した核酸は、単離されていないが、天然の系の中で共存する物質のいくつか又は全てから分離された同じ核酸は、単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部となり得る、並びに/又はそのような核酸は、組成物の一部となり得る、及びそのようなベクター若しくは組成物がその天然の環境の一部ではないという点で、やはり単離されたものであり得る。 The term “isolated” means that the material is removed from its original environment (eg, the natural environment if it is naturally occurring). For example, a naturally occurring nucleic acid present in a living plant is not isolated, but the same nucleic acid isolated from some or all of the coexisting materials in a natural system is isolated . Such nucleic acids can be part of a vector, and / or such nucleic acids can be part of a composition, and such a vector or composition is not part of its natural environment. Also, it can be isolated.
形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質をもたらす選択マーカー遺伝子の使用の代替として、形質転換された細胞中の遺伝子構築物の存在を、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、組織化学アッセイ(例えばGUSアッセイ)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ノーザン及びウェスタンブロットハイブリダイゼーション分析等、当技術分野に周知の他の手法によって決定してもよい。 As an alternative to using a selectable marker gene that provides a phenotypic trait to select for transformed host cells, the presence of the gene construct in the transformed cells is determined by PCR (polymerase chain reaction), Southern blot hybridization analysis May be determined by other techniques well known in the art, such as histochemical assays (eg, GUS assays), thin layer chromatography (TLC), Northern and Western blot hybridization analyses.
本願発明の遺伝子構築物は、任意の適した手法によって、植物又は真菌内に導入されてもよい。本願発明の遺伝子構築物を植物細胞又は真菌細胞内に組み込むための手法(例えば、形質導入、形質移入、形質転換、又は遺伝子ターゲティングによる)は、当業者に周知である。そのような手法としては、組織、細胞、及びプロトプラストへのAgrobacterium媒介性導入、Rhizobium媒介性導入、エレクトロポレーション;プロトプラストの融合;生殖器官への注入;未成熟胚内への注入並びに細胞、組織、カルス、未成熟胚及び成熟胚への高速噴出導入;微粒子銃による形質転換;ウィスカー形質転換、並びにそれらの組合せが挙げられる。手法の選択は、形質転換される植物又は真菌のタイプに大きく依存するものとなり、適切に熟練した者によって容易に決定され得る。プロトプラストの形質転換には、PEG媒介性形質転換が特に好適である。真菌の形質転換には、PEG媒介性形質転換、及びプロトプラストのエレクトロポレーション、及び菌糸の外移植片のAgrobacterium媒介性導入が、特に好適である。 The gene construct of the present invention may be introduced into plants or fungi by any suitable technique. Techniques for incorporating the gene constructs of the present invention into plant cells or fungal cells (eg, by transduction, transfection, transformation, or gene targeting) are well known to those skilled in the art. Such techniques include Agrobacterium-mediated introduction into tissues, cells, and protoplasts, Rhizobium-mediated introduction, electroporation; fusion of protoplasts; injection into reproductive organs; injection into immature embryos and cells, tissues , Rapid injection into callus, immature embryos and mature embryos; transformation with microparticle guns; whisker transformation, and combinations thereof. The choice of approach will depend largely on the type of plant or fungus to be transformed and can be readily determined by an appropriately skilled person. PEG-mediated transformation is particularly suitable for protoplast transformation. Particularly suitable for fungal transformation are PEG-mediated transformation and electroporation of protoplasts and Agrobacterium-mediated introduction of mycelial explants.
本願発明の遺伝子構築物を組み込む細胞は、下記に記載されるように選択され、次いで、当技術分野に周知の手法を用いて、形質転換された植物又は真菌を再生するための適切な培地中で培養されてもよい。培養条件、例えば温度、pH等は、当業者に明らかとなる。結果として得られる植物は、当技術分野に周知の方法を使用して、有性又は無性のどちらかで繁殖させて、形質転換された植物又は真菌の後続の世代を生産してもよい Cells that incorporate the genetic construct of the present invention are selected as described below, and then are used in a suitable medium to regenerate transformed plants or fungi using techniques well known in the art. It may be cultured. Culture conditions such as temperature, pH, etc. will be apparent to those skilled in the art. The resulting plant may be propagated either sexually or asexually using methods well known in the art to produce subsequent generations of transformed plants or fungi.
したがって、本願発明の更に別の態様では、非形質転換対照の植物細胞、植物、植物種子、若しくは他の植物の部分、又は非形質転換の真菌、真菌細胞、若しくは他の真菌の部分よりも大量のジャンチトレムを生産することが可能な、遺伝子導入された植物細胞、植物、植物種子、若しくは他の植物の部分、又は遺伝子導入された真菌、真菌細胞若しくは他の真菌の部分が提供される。 Accordingly, in yet another aspect of the present invention, a greater amount than a non-transformed control plant cell, plant, plant seed, or other plant part, or a non-transformed fungal, fungal cell, or other fungal part. Transgenic plant cells, plants, plant seeds, or other plant parts, or transgenic fungi, fungal cells or other fungal parts capable of producing the present gentitrem are provided.
好適な実施形態では、遺伝子導入された植物細胞、植物、植物種子、若しくは他の植物の部分又は遺伝子導入された真菌、真菌細胞、若しくは他の真菌の部分は、生産されるジャンチトレムの量が非形質転換対照に比べて、少なくともおよそ10%、更に好ましくは少なくともおよそ20%、更に好ましくは少なくともおよそ30%、更に好ましくは少なくともおよそ40%増加している。 In a preferred embodiment, a transgenic plant cell, plant, plant seed, or other plant part or transgenic fungus, fungal cell, or other fungal part has a non-antigenic amount of gentitrem produced. There is an increase of at least about 10%, more preferably at least about 20%, more preferably at least about 30%, more preferably at least about 40% compared to the transformation control.
例えば、ジャンチトレムの量は、非形質転換対照に比べておよそ10%と300%の間、更に好ましくはおよそ20%と200%の間、更に好ましくはおよそ30%と100%の間、更に好ましくはおよそ40%と80%の間で増加することがある。 For example, the amount of gentitrem is between about 10% and 300%, more preferably between about 20% and 200%, more preferably between about 30% and 100%, more preferably compared to a non-transformed control. May increase between approximately 40% and 80%.
好ましくは、遺伝子導入された植物細胞、植物、植物種子、若しくは他の植物の部分、又は遺伝子導入された真菌、真菌細胞、若しくは他の真菌の部分は、本願発明による核酸、遺伝子構築物、又はベクターを含む。好ましくは、遺伝子導入された植物細胞、植物、植物種子、若しくは他の植物の部分、又は遺伝子導入された真菌、真菌細胞、若しくは他の真菌の部分は、本願発明による方法によって生産される。 Preferably, the transgenic plant cell, plant, plant seed, or other plant part, or the transgenic fungus, fungal cell, or other fungal part is a nucleic acid, genetic construct, or vector according to the invention. including. Preferably, transgenic plant cells, plants, plant seeds, or other plant parts, or transgenic fungi, fungal cells, or other fungal parts are produced by the method according to the invention.
本願発明はまた、本願発明の植物細胞又は真菌細胞に由来し、本願発明の核酸、遺伝子構築物、又はベクターを含む、遺伝子導入された植物、植物種子、若しくは他の植物の部分、又は遺伝子導入された真菌、真菌細胞、若しくは他の真菌の部分を提供する。 The invention of the present application is also derived from a plant cell or fungal cell of the invention of the present invention, and contains a transgenic plant, plant seed, or other plant part, or a gene introduced, comprising the nucleic acid, gene construct, or vector of the present invention. A fungus, fungal cell, or other fungal part.
本願発明はまた、本願発明の植物又は真菌に由来し、本願発明の核酸、遺伝子構築物、又はベクターを含む、遺伝子導入された植物、植物種子、若しくは他の植物の部分、又は遺伝子導入された真菌、真菌細胞、若しくは他の真菌の部分を提供する。 The invention of the present application is also derived from a plant or fungus of the present invention and includes a transgenic plant, plant seed, or other plant part, or a transgenic fungus comprising the nucleic acid, gene construct, or vector of the present invention. A fungal cell, or other fungal part.
「植物細胞」とは、半透膜によって結合されており、プラスチドを含有する、任意の自己増殖細胞を意味する。よりいっそうの増殖が望ましい場合、そのような細胞はまた、細胞壁を必要とする。植物細胞としては、本明細書に使用される際には、限定はないが、藻類、藍藻類、種子、懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子が挙げられる。 By “plant cell” is meant any self-proliferating cell that is bound by a semipermeable membrane and contains a plastid. If more growth is desired, such cells also require a cell wall. As used herein, plant cells include, but are not limited to, algae, cyanobacteria, seeds, suspension cultures, embryos, growth point regions, callus tissues, leaves, roots, shoots, gametophytes , Spores, pollen, and microspores.
「真菌細胞」とは、任意の真菌の細胞を意味する。用語「真菌」とは、真菌全体、真菌の器官及び組織(例えば子嚢、菌糸、仮性菌糸、仮根、菌核、梗子、胞子、分生子座、胞子嚢、分生子束柄、分生子、子嚢子座、閉鎖子嚢果、菌糸体、子嚢殻、担子器等)、胞子、真菌細胞、並びにそれらの子孫を指す。真菌は、単一の細胞として存在しても、菌糸として知られる繊維からなる菌糸体と呼ばれる多細胞体を作り上げても、どちらでもよい。殆どの真菌細胞は、多核性であり、主にキチンから構成される細胞壁を有する。 By “fungal cell” is meant any fungal cell. The term `` fungus '' refers to whole fungi, fungal organs and tissues (e.g., ascending, hyphae, pseudohyphae, pseudoroots, mycorrhiza, insuffix, spores, conidia, sporangia, conidial bundles, conidia, (Ascomycetes, closed ascending cone, mycelium, ascolic shell, basidiomycetes, etc.), spores, fungal cells, and their progeny. The fungus may exist as a single cell or may form a multicellular body called a mycelium composed of fibers known as mycelia. Most fungal cells are polynuclear and have a cell wall composed primarily of chitin.
「遺伝子導入」とは、細胞内に技巧によって挿入されており、その細胞から発生した生物のゲノムの一部となってゆくDNA配列を含む、任意の細胞を意味する。 “Gene transfer” means any cell that has been skillfully inserted into a cell and contains a DNA sequence that becomes part of the genome of the organism that arises from that cell.
更に別の態様では、本願発明は、内生菌におけるジャンチトレム生合成を改変する方法を提供し、前記方法は、本明細書で前に記載されたような有効量の核酸又は核酸断片又は構築物を前記内生菌中に導入する工程を含む。本願発明はまた、本明細書で前に記載されたような核酸又は核酸断片又は構築物を含む(例えばそれらを用いて形質転換された)内生菌を提供する。この核酸、核酸断片又は構築物は、本明細書で前に記載されたような任意の適した方法によって、内生菌内に導入されることがある。 In yet another aspect, the present invention provides a method of altering gentitrem biosynthesis in an endophyte, said method comprising an effective amount of a nucleic acid or nucleic acid fragment or construct as previously described herein. A step of introducing into the endophytic fungus. The present invention also provides endophytes comprising (eg, transformed with) a nucleic acid or nucleic acid fragment or construct as previously described herein. The nucleic acid, nucleic acid fragment or construct may be introduced into the endophytic fungus by any suitable method as previously described herein.
更に別の態様では、本願発明は、本明細書で前に記載されたような内生菌を接種された植物を提供し、前記植物は、前記内生菌に安定的に感染している内生菌不含の宿主植物を含む。好ましくは、この植物は、その中で内生菌が天然に発生しないものである。 In yet another aspect, the present invention provides a plant inoculated with an endophytic fungus as previously described herein, wherein said plant is stably infected with said endophytic fungus. Includes host plants free of viable bacteria. Preferably, the plant is one in which endophytic fungi do not naturally occur.
好ましくは、植物は、接種、育種、交配、交雑、及びそれらの組合せからなる群から選択される方法によって内生菌に感染している。 Preferably, the plant is infected with endophytes by a method selected from the group consisting of inoculation, breeding, mating, crossing, and combinations thereof.
好適な一実施形態では、植物は、同質遺伝子接種によって感染していることがある。これは、宿主特異的な遺伝子効果がない場合に、内生菌の表現型の効果を評価し得るという利点がある。更に具体的には、複数回の内生菌の接種が、植物の生殖質で、及び土壌に移す前に培養にて再生された小植物でなされることがある。 In one preferred embodiment, the plant may have been infected by isogenic inoculation. This has the advantage that the phenotypic effects of endophytic bacteria can be assessed in the absence of host-specific gene effects. More specifically, multiple inoculations of endophytes may be made with plant germplasm and plantlets regenerated in culture before being transferred to the soil.
植物内で高度に適合し、安定な反対の交配型の内生菌を特定することによって、ペレニアルライグラスのための内生菌の分子育種に用いる手段が提供される。好ましくは、植物は、大容量接種(hyper inoculation)によって感染していることがある。 Identifying endophytic fungi that are highly compatible and stable in mating within plants provides a means to use for endophytic molecular breeding for perennial ryegrass. Preferably, the plant may be infected by hyper inoculation.
反対の交配型のタイプの内生菌株間での菌糸の融合によって、好ましい形質を宿主植物内に送達するための手段が、好ましくは大容量接種を介してもたらされる。そのような株は、高い接種頻度と幅広い生殖質、好ましくはエリートのペレニアルライグラス及び/又はトールフェスク宿主の生殖質への高い適合性という好ましい特徴を示す内生菌株と、低い接種頻度及び低い適合性を示すものの非常に好ましいアルカロイド毒素プロファイルを有する内生菌とを含む群から、好ましくは選択される。 Mycelial fusion between opposite mating types of endophytic strains provides a means for delivering favorable traits into the host plant, preferably via large-volume inoculation. Such strains are endocrine strains exhibiting favorable characteristics of high inoculation frequency and broad reproductive quality, preferably high suitability to the germplasm of elite perennial ryegrass and / or tall fescue hosts, and low inoculation frequency and low compatibility. But preferably selected from the group comprising endophytic bacteria with a highly preferred alkaloid toxin profile.
内生菌分類群と宿主草本との間の相互作用は種特異的となるものと、一般に想定されている。出願人は、驚くべきことに、トールフェスク由来の内生菌を使用して、好ましい形質をライグラス、例えばペレニアルライグラス等に送達し得ることを見出している。 It is generally assumed that the interaction between endophytic taxa and host herbs is species-specific. Applicants have surprisingly found that endophytes from tall fescue can be used to deliver favorable traits to ryegrass, such as perennial ryegrass.
更に別の態様では、本願発明は、本願発明の植物に由来し、本願発明の内生菌に安定的に感染している植物、植物種子、又は他の植物の部分を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a plant, plant seed, or other plant part derived from the plant of the present invention and stably infected with the endophytic fungus of the present invention.
好ましくは、植物細胞、植物、植物種子、若しくは他の植物の部分は、イネ科草本であり、更に好ましくは、飼料、芝生、又はバイオエネルギー用のイネ科草本、例えばドクムギ属(Lolium)及びウシノケグサ属(Festuca)であり、そのようなものとしては、ホソムギ(L. perenne)及びオニウシノケグサ(L. arundinaceum)が挙げられる。 Preferably, the plant cell, plant, plant seed, or other plant part is a grass, and more preferably a grass, grass, or bioenergy herb for feed, lawn, for example, Lolium and Bossa The genus (Festuca), such as barley (L. perenne) and L. arundinaceum.
「植物細胞」とは、半透膜によって結合されており、プラスチドを含有する、任意の自己増殖細胞を意味する。よりいっそうの増殖が望ましい場合、そのような細胞はまた、細胞壁を必要とする。植物細胞としては、本明細書に使用される際には、限定はないが、種子、懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子が挙げられる。 By “plant cell” is meant any self-proliferating cell that is bound by a semipermeable membrane and contains a plastid. If more growth is desired, such cells also require a cell wall. Plant cells as used herein include, but are not limited to, seeds, suspension cultures, embryos, growth point regions, callus tissues, leaves, roots, shoots, gametes, spores, pollen And microspores.
更に別の態様では、本願発明は、前記内生菌に安定的に感染している植物を生産するための、本明細書に前に記載されたような内生菌の使用を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides the use of an endophyte as previously described herein for producing a plant that is stably infected with said endophyte.
更にいっそう別の態様では、本願発明は、内生菌におけるジャンチトレム生合成に関与する、実質的に精製又は単離されたポリペプチドを提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a substantially purified or isolated polypeptide involved in gentitrem biosynthesis in endophytic fungi.
好適な一実施形態では、本願発明は、(a)図8、11、14、及び17(配列番号3、4、7、8、11、12、15、及び16)に示される配列;並びに(b)(a)に記載された配列の関連部分と少なくともおよそ80%の同一性を有し、少なくとも20アミノ酸のサイズを有する、(a)に記載された配列の機能的に活性な断片及びバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたジャンチトレム生合成ポリペプチドを提供する。 In one preferred embodiment, the present invention provides: (a) the sequences shown in FIGS. 8, 11, 14, and 17 (SEQ ID NOs: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, and 16); and ( b) Functionally active fragments and variants of the sequence described in (a) having at least about 80% identity with the relevant part of the sequence described in (a) and having a size of at least 20 amino acids A substantially purified or isolated gentitrem biosynthetic polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
本願発明は、本願発明のポリペプチドの機能的に活性な断片及びバリアントを包含する。この文脈での「機能的に活性な」とは、断片又はバリアントが、その断片又はバリアントの由来とする対応のタンパク質の生物学的特性のうち1つ又は複数を有することを意味する。改変が結果として断片又はバリアントの機能的な活性の喪失を生じない限り、アミノ酸のうち1つ又は複数の追加、欠失、置換、及び誘導体化が想定される。好ましくは、断片又はバリアントは、その断片又はバリアントの対応する上述の配列の関連部分と、少なくともおよそ80%の同一性、更に好ましくは少なくともおよそ90%の同一性、更に好ましくは少なくともおよそ95%の同一性、最も好ましくは少なくともおよそ98%の同一性を有する。そのような機能的に活性なバリアント及び断片としては、例えば、対応のアミノ酸配列に1つ又は複数の残基の保存されたアミノ酸置換を有するものが挙げられる。 The present invention includes functionally active fragments and variants of the polypeptides of the present invention. “Functionally active” in this context means that the fragment or variant has one or more of the biological properties of the corresponding protein from which the fragment or variant is derived. As long as the modification does not result in a loss of functional activity of the fragment or variant, addition, deletion, substitution and derivatization of one or more of the amino acids are envisaged. Preferably, a fragment or variant has at least about 80% identity, more preferably at least about 90% identity, more preferably at least about 95%, with the relevant portion of the corresponding sequence described above of that fragment or variant. Have identity, most preferably at least about 98% identity. Such functionally active variants and fragments include, for example, those having a conserved amino acid substitution of one or more residues in the corresponding amino acid sequence.
「保存されたアミノ酸置換」は、同じクラスのうちの別の1つによるアミノ酸の置換を意味し、そのクラスとは以下の通りである。
非極性: Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
無電荷の極性: Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性: Asp、Glu
塩基性: Lys、Arg、His
A “conserved amino acid substitution” means a substitution of an amino acid by another one of the same class, the class is as follows:
Nonpolar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Uncharged polarity: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Acidity: Asp, Glu
Basic: Lys, Arg, His
他の保存されたアミノ酸置換も以下のようになされることがある。
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトン供与体:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトン受容体:Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
Other conserved amino acid substitutions may also be made as follows.
Aromatic: Phe, Tyr, His
Proton donor: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp
Proton receptor: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln
好ましくは、断片は、少なくとも10アミノ酸、更に好ましくは少なくとも20アミノ酸、更に好ましくは少なくとも50アミノ酸、更に好ましくは少なくとも100アミノ酸、更に好ましくは少なくとも200アミノ酸のサイズを有する。 Preferably, the fragment has a size of at least 10 amino acids, more preferably at least 20 amino acids, more preferably at least 50 amino acids, more preferably at least 100 amino acids, more preferably at least 200 amino acids.
本発明のこの態様の更に別の実施形態では、本願発明による核酸又は核酸断片から組換えにより生産されるポリペプチドが提供される。ポリペプチドを組換えにより生産するための手法は、当業者に公知である。 In yet another embodiment of this aspect of the invention there is provided a polypeptide produced recombinantly from a nucleic acid or nucleic acid fragment according to the present invention. Techniques for recombinant production of polypeptides are known to those skilled in the art.
本願発明のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列の利用可能性によって、cDNA発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングが容易になる。当座のアミノ酸配列の部分を代表する合成ペプチドが合成されてもよい。これらのペプチドを使用し動物を免疫して、そのアミノ酸配列を含むペプチド及び/又はタンパク質に特異性を有するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を生産することがある。次いで、これらの抗体を使用しcDNA発現ライブラリーをスクリーニングして、目的の全長cDNAクローンを単離してもよい。 The availability of the nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of the present invention facilitates immunological screening of cDNA expression libraries. Synthetic peptides representing portions of the current amino acid sequence may be synthesized. Animals may be immunized with these peptides to produce polyclonal or monoclonal antibodies having specificity for peptides and / or proteins containing the amino acid sequence. These antibodies may then be used to screen a cDNA expression library to isolate the desired full-length cDNA clone.
本願発明をこれより、添付の実施例及び図面を参照して、更に充分に記載するものとする。しかし、以下の記載は説明的なものに過ぎないことが理解されるべきであり、形はどうあれ、上記に記載された本発明の一般性を制限するものと解されるべきではない。 The present invention will now be described more fully with reference to the accompanying examples and drawings. However, it should be understood that the following description is illustrative only and should not be construed as limiting the generality of the invention described above in any way.
LpTG-3内生菌株NEA12におけるジャンチトレム生合成のための遺伝子の特定
全ゲノム配列解析を使用して、NEA12ゲノム中のジャンチトレム生合成のための候補遺伝子を特定した。標準的な内生菌(SE)株由来のタンパク質配列LtmE及びLtmJをクエリ配列として使用して、NEA12ゲノムを由来とする予測タンパク質データベースを探索した。このアプローチを使用すると、BLASTpサーチは、予測NEA12タンパク質のライブラリーに、13個の推定LtmEタンパク質ホモログと26個の推定LtmJタンパク質ホモログを生じた。
Identification of genes for gentitrem biosynthesis in LpTG-3 endophytic strain NEA12 Whole genome sequence analysis was used to identify candidate genes for gentitrem biosynthesis in the NEA12 genome. The protein sequences LtmE and LtmJ from standard endophytic (SE) strains were used as query sequences to search the predicted protein database derived from the NEA12 genome. Using this approach, the BLASTp search yielded 13 putative LtmE protein homologs and 26 putative LtmJ protein homologues in a library of predicted NEA12 proteins.
NEA12のゲノムは、SE株と共通して、LtmE及びltmJの予測タンパク質ホモログを有することが予想される。しかし、ジャンチトレム生産のための候補は、LpTG-3及びLpTG-4のゲノムにユニークであるものと思われた。SEはジャンチトレムを生産しないことから、候補の数をLpTG-3及びLpTG-4の内生菌にのみ存在するものに減少させるために、更に別の解析を実施した。13個の推定LtmEタンパク質ホモログ及び26個の推定LtmJタンパク質ホモログのそれぞれを、予測SEタンパク質データベースのBLASTxクエリとして用いた。単一のltmEのNEA12ホモログ(g30.t1)が、この解析で特定され(Table 1(表2))、それゆえ更に別の検討のための最も可能性のある候補となった。遺伝子g30.t1の予測タンパク質配列は、Ｐ．ジャンチネラム(JanD;49%)及びＰ．パキシリ(PaxD;46%)由来の芳香族プレニルトランスフェラーゼと相同性を有する(Table 2(表3))。これらの遺伝子はそれぞれ、インドールジテルペンであるシェアリニンK及びパキシリンの合成に関連する。そのため、遺伝子g30.t1を、今後はjtmDと称する。 The NEA12 genome is expected to have predicted protein homologues of LtmE and ltmJ in common with the SE strain. However, the candidates for gentitrem production appeared to be unique to the LpTG-3 and LpTG-4 genomes. Since SE does not produce gentitrem, further analysis was performed to reduce the number of candidates to be present only in endophytic LpTG-3 and LpTG-4. Each of the 13 putative LtmE protein homologues and 26 putative LtmJ protein homologues were used as BLASTx queries of the predicted SE protein database. A single ltmE NEA12 homolog (g30.t1) was identified in this analysis (Table 1) and was therefore the most likely candidate for further investigation. The predicted protein sequence of gene g30.t1 is P. a. Giantinelam (JanD; 49%) and P.I. It has homology with aromatic prenyltransferase derived from paxili (PaxD; 46%) (Table 2). Each of these genes is associated with the synthesis of the indole diterpenes shearrinin K and paxillin. Therefore, the gene g30.t1 is hereinafter referred to as jtmD.
LpTG-3ゲノムにおけるジャンチトレム生合成遺伝子クラスターの特定
NEA12ゲノムを、PacBio Sequelシークエンシングプラットフォーム(PacBio)を用いてシークエンシングした。jtmD遺伝子配列をクエリとして用いて、LpTG-3の推定ジャンチトレム生合成遺伝子クラスターを含有するコンティグを特定した。次いで、jtmDを含有するNEA12のPacBioコンティグ3(247475kb)の遺伝子の内容を、Augustus(Stanke及びMorgenstern、2005)遺伝子予測と、LTM遺伝子の公知の遺伝子配列(Youngら、2005、2006)及びjtmDを用いた手動アノテーションとの両方の組合せを使用して、アノテーションした(Table 2(表3))。
Identification of gentitrem biosynthetic gene cluster in LpTG-3 genome
The NEA12 genome was sequenced using the PacBio Sequel sequencing platform (PacBio). The jtmD gene sequence was used as a query to identify contigs containing the putative gentitrem biosynthesis gene cluster of LpTG-3. Next, the content of the gene of NEA12 PacBio Contig 3 (247475 kb) containing jtmD, Augustus (Stanke and Morgenstern, 2005) gene prediction, known gene sequence of LTM gene (Young et al., 2005, 2006) and jtmD. Annotations were made using a combination of both manual annotations used (Table 2).
NEA12のPacBioコンティグ3は、13個の予測及び公知の遺伝子を含有する(図4)。クラスター1(ltmG、ltmS、ltmM、ltmK)及びクラスター2(ltmP、ltmQ、ltmF、ltmC、ltmB)は、それぞれc.57243〜67332bp及びc.6838bp〜16951bpに位置する(Table 2(表3))。クラスター1及びクラスター2内の遺伝子の順番及び起点は、エピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種及びエピクロエ・フェスツカエのLTM遺伝子座(Younら、2006;Saikiaら、2008)と比較して維持されている。ltmKの下流、すなわちポリケタイドシンターゼ(pks)偽遺伝子(Youngら、2005によりこのようにも記載される)は、追加のATリッチ配列が右側に隣接するいくつかのフレームシフト変異を含有することが観察された。部分的なLpTG-3(NEA12)のLTM遺伝子座のトポロジーは、ltmKとpks偽遺伝子との間に2つのレトロトランスポゾン跡が挿入されたエピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種(Lp19)(Saikiaら、2008)よりも、エピクロエ・フェスツカエ(Fl1)のLTM遺伝子座の方に類似する。 NEA12 PacBio Contig 3 contains 13 predicted and known genes (FIG. 4). Cluster 1 (ltmG, ltmS, ltmM, ltmK) and Cluster 2 (ltmP, ltmQ, ltmF, ltmC, ltmB) are located at c.57243-67332bp and c.6838bp-16951bp, respectively (Table 2) . The order and origin of the genes in cluster 1 and cluster 2 is maintained as compared to the LTM loci of Epichloe / Festukae / Lorley and Epichloe / Festukae (Youn et al., 2006; Saikia et al., 2008). Observed that downstream of ltmK, the polyketide synthase (pks) pseudogene (also described by Young et al., 2005) contains several frameshift mutations with additional AT-rich sequences flanked on the right It was done. The topology of the partial LpTG-3 (NEA12) LTM locus is the Epichloe-Festukae-Lorry variant (Lp19) with two retrotransposon traces inserted between the ltmK and pks pseudogenes (Lp19) (Saikia et al., 2008). It is more similar to the LTM locus of Epichloe festukae (Fl1).
pks偽遺伝子は、LpTG-3及びエピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種に共通の配列(PacBioコンティグ3:1bp〜c.70039bp)と、分類群LpTG-3及びLpTG-4由来のジャンチトレム生産株にユニークなこれまで記載されていないゲノム配列(PacBioコンティグ3:c.70039bp〜247475bp)との間の、左側の境界を画定する(図4)。この領域に対する右側の境界は、PacBioコンティグ3(247475bp)の端によって画定される。NEA12ゲノムのこの領域は、4つの遺伝子、すなわちMULEドメインを有するトランスポザーゼ(159248bp〜163900bp)、ヘリトロンヘリカーゼ様転位因子(170950bp〜175054bp)、及び3つのATリッチ領域によって特徴付けられる(図5)。2つの遺伝子をそれぞれ含有するクラスター3及びクラスター4と称する2つの新規の遺伝子クラスターは、NEA12のPacBioコンティグ3上に特定された(Table 2(表3);図4)。 The pks pseudogene is a sequence common to LpTG-3 and Epichloe festukae lorii varieties (PacBio contig 3: 1 bp to c.70039 bp) and unique to genitolem producing strains derived from taxon LpTG-3 and LpTG-4. A left boundary is defined between genomic sequences not described until (PacBio contig 3: c.70039 bp to 247475 bp) (FIG. 4). The right boundary for this region is defined by the edge of PacBio Contig 3 (247475 bp). This region of the NEA12 genome is characterized by four genes: a transposase with a MULE domain (159248bp-163900bp), a helictron helicase-like transposable element (170950bp-175054bp), and three AT-rich regions (Figure 5). Two new gene clusters, named Cluster 3 and Cluster 4, containing the two genes, respectively, were identified on PacBio contig 3 of NEA12 (Table 2; FIG. 4).
4つの分類群-エピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種(SE、NEA2、NEA6、NEA10)、LpTG-2(NEA11)、LpTG-3(NEA12、AR37、15310、15311)、LpTG-4(E1)、及びFaTG-3(NEA23)由来のエピクロエ属の内生菌の代表的な株のゲノムを、NEA12のPacBioコンティグ3にマッピングした。ジャンチトレム生産分類群LpTG-3及びLpTG-4にユニークな領域が特定された(PacBioコンティグ3:c.70039bp〜247475bp)のに対し、エピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種、LpTG-2、及びFaTG-3領域由来の内生菌については、この領域は存在しなかった(図5)。この領域には、エピクロエ属内生菌でこれまで記載されていた遺伝子はなかった。 Four taxa-Epichloe / Festukae / Lorry varieties (SE, NEA2, NEA6, NEA10), LpTG-2 (NEA11), LpTG-3 (NEA12, AR37, 15310, 15311), LpTG-4 (E1), and FaTG -3 (NEA23) derived epigenetic endophytic representative genomes were mapped to PacBio contig 3 of NEA12. A unique region was identified in the Gentiantrem production taxa LpTG-3 and LpTG-4 (PacBio Contig 3: c.70039bp to 247475bp), whereas the Epichloe-Festukae-Lorry variant, LpTG-2, and FaTG-3 region This region was not present for endophytic bacteria from origin (FIG. 5). In this region, there was no gene previously described for Epichloroe endophytic bacteria.
PacBioコンティグ3内に位置する遺伝子の転写物の発現
LpTG-3(NEA12)、LpTG-4(E1)、及びエピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種(SE)におけるジャンチトレム生合成のための候補遺伝子の植物内での発現を、ペレニアルライグラス-内生菌共生トランスクリプトームデータのRNA-seq解析を用いて、2つのペレニアルライグラス-内生菌トランスクリプトーム研究から生成されたリードをNEA12のPacBioコンティグ3にマッピングすることによって決定した(図6)。1つめの研究では、トランスクリプトーム解析は、吸収膨潤後(0時間)から10日齢の実生(10日目)まで、6つの時点で、実生の成長及び成熟の間に、宿主及び内生菌のトランスクリプトームに起こる主要な変化を研究するために実施された。(Sawbridge、2016)。ペレニアルライグラス品種Alto-SE及びAlto-NEA12における2つの時点(0時間及び10日目)でのNEA12のPacBioコンティグ3内の遺伝子についての転写物の発現をここに示す。2つめの研究では、別個の組織タイプのペレニアルライグラス-内生菌共生の影響-E1に由来するトランスクリプトームの図譜を発展させた(Coganら、2012)。2つの組織タイプ、すなわち葉及び柱頭における、NEA12のPacBioコンティグ3内の遺伝子の転写物の発現をここに示す。
Expression of transcripts of genes located within PacBio contig 3
Perennial ryegrass endophytic symbiotic transcripts were expressed in plants for candidate genes for gentitrem biosynthesis in LpTG-3 (NEA12), LpTG-4 (E1), and Epichloe festukae laurie varieties (SE). RNA-seq analysis of tome data was used to determine reads generated from two perennial ryegrass-endophytic transcriptome studies by mapping to PacBio contig 3 of NEA12 (Figure 6). In the first study, transcriptome analysis was performed between host and endothelium during seedling growth and maturation at six time points, from post-absorption swelling (0 hour) to 10-day-old seedlings (day 10). This was done to study the major changes that occur in the fungal transcriptome. (Sawbridge, 2016). Shown here is the expression of transcripts for genes in PacBio contig 3 of NEA12 at two time points (time 0 and day 10) in perennial ryegrass varieties Alto-SE and Alto-NEA12. In the second study, we developed a transcriptome chart derived from a distinct tissue type of perennial ryegrass-the effects of endophytic symbiosis-E1 (Cogan et al., 2012). Shown here is the expression of transcripts of genes within PacBio contig 3 of NEA12 in two tissue types: leaves and stigmas.
以前画定されたクラスター1遺伝子及びクラスター2遺伝子に加えて、ジャンチトレム生合成に関与するものと提案される遺伝子PP01、PP02、jtmD、及びjtmOも発現している。クラスター3遺伝子及びクラスター4遺伝子はエピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種(SE)のゲノムに存在しないことから、これらの遺伝子の発現は、植物内でSEには観察されなかった。 In addition to the previously defined cluster 1 and cluster 2 genes, genes PP01, PP02, jtmD, and jtmO, which are proposed to be involved in gentitrem biosynthesis, are also expressed. Since the cluster 3 gene and the cluster 4 gene are not present in the genome of the Epichloe, Festukae and Laurie varieties (SE), expression of these genes was not observed by SE in the plant.
NEA12のPacBioコンティグ3上の4つの遺伝子クラスターに関する詳細な説明
クラスター1(LTM1)及びクラスター2(LTM2)
エピクロエ属のインドール-ジテルペン生合成の初発の段階のためのコア遺伝子が、LpTG-3内生菌NEA12に存在する。遺伝子ltmG、ltmC、及びltmMは、ゲネラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、プレニルトランスフェラーゼ、及びFAD依存性モノオキシゲナーゼを、エピクロエ・フェスツカエ・ローリー変種におけるそれらのそれぞれのLtmホモログに比して99%、100%、99%のアミノ酸配列同一性でコードすることが予測されている。内在性膜タンパク質であるltmBの予測タンパク質産物(100%)は、ltmMと併せて、パスパリン生合成のためのジテルペン骨格のエポキシ化及び環化を触媒することが提案されている。遺伝子ltmP(100%)及びltmQ(100%)は、チトクロムP450モノオキシゲナーゼをコードし、エピクロエ属におけるパキシリン生合成に必要とされる6つの遺伝子のコレクションを完結させる。
Detailed description of the four gene clusters on NEA12 PacBio Contig 3 Cluster 1 (LTM1) and Cluster 2 (LTM2)
The core gene for the initial stage of epidroe indole-diterpene biosynthesis is present in LpTG-3 endophytic fungus NEA12. Genes ltmG, ltmC, and ltmM represent 99%, 100% of genelanylgeranyl diphosphate synthase, prenyltransferase, and FAD-dependent monooxygenase compared to their respective Ltm homologues in Epichloe festukae laurie varieties. It is predicted to encode with%, 99% amino acid sequence identity. It has been proposed that the predicted protein product (100%) of the integral membrane protein ltmB, in conjunction with ltmM, catalyzes the epoxidation and cyclization of the diterpene backbone for paspaline biosynthesis. The genes ltmP (100%) and ltmQ (100%) encode cytochrome P450 monooxygenase and complete a collection of six genes required for paxillin biosynthesis in Epichloe.
クラスター3遺伝子
クラスター3(116033bp〜119536bp)は、2つの遺伝子、すなわち推定チトクロムP450モノオキシゲナーゼである予測遺伝子PP01(予測タンパク質1)と、膜結合型O-アシルトランスフェラーゼ(MBOAT)タンパク質であることが予測されているPP02とを含有する(Table 2(表3))。
Cluster 3 gene Cluster 3 (116033 bp to 119536 bp) is predicted to be two genes, a predicted gene PP01 (predicted protein 1), a putative cytochrome P450 monooxygenase, and a membrane-bound O-acyltransferase (MBOAT) protein Containing PP02 (Table 2).
PP01
PP01遺伝子のヌクレオチド配列を図7に示す。PP01は、ダイズ嚢胞線虫[ヘテロデラ・グリシンス(Heterodera glycines)]の内部寄生性真菌であるヒルステラ・ミネソテンシス由来の推定チトクロムP450モノオキシゲナーゼと相同性を示す(図8;KJZ77225.1)。PP01は、ジャンチトレム生合成における役割を有することがあるが、PP01は、これまで特徴を明らかにされた任意の他のインドール-ジテルペン遺伝子クラスターには、ホモログを持たない。例えば、PP01は、インドール-ジテルペン生合成に関与する既に記載されたチトクロムP450モノオキシゲナーゼ(例えばLtmP、LtmQ/PaxQ/AtmQ、LtmK)とは配列類似性を共有しない(図9)。E1(LpTG-4)由来のPP01の予測タンパク質配列は、NEA12(LpTG-3)のものに対し1アミノ酸の違い(アミノ酸42位でD>G)を有する。
PP01
The nucleotide sequence of the PP01 gene is shown in FIG. PP01 shows homology with a putative cytochrome P450 monooxygenase derived from Hilstera minnesotensis, an endophytic fungus of soybean cyst nematode [Heterodera glycines] (FIG. 8; KJZ77225.1). Although PP01 may have a role in gentitrem biosynthesis, PP01 does not have a homolog in any other indole-diterpene gene cluster that has been characterized so far. For example, PP01 does not share sequence similarity with previously described cytochrome P450 monooxygenases (eg, LtmP, LtmQ / PaxQ / AtmQ, LtmK) involved in indole-diterpene biosynthesis (FIG. 9). The predicted protein sequence of PP01 derived from E1 (LpTG-4) has one amino acid difference (D> G at amino acid position 42) relative to that of NEA12 (LpTG-3).
PP02
PP02遺伝子のヌクレオチド配列を図10に示す。PP02は、膜結合型O-アシルトランスフェラーゼ(MBOAT)タンパク質であることが予測されている(図11;図12)。E1(LpTG-4)由来のPP02の予測タンパク質配列は、NEA12(LpTG-3)のものに一致する。膜に会合するとはいえ、PP02は、TMHMMによる予測解析に基づけば、膜貫通タンパク質ではない。
PP02
The nucleotide sequence of the PP02 gene is shown in FIG. PP02 is predicted to be a membrane-bound O-acyltransferase (MBOAT) protein (FIG. 11; FIG. 12). The predicted protein sequence of PP02 from E1 (LpTG-4) matches that of NEA12 (LpTG-3). Although associated with the membrane, PP02 is not a transmembrane protein based on predictive analysis by TMHMM.
クラスター4
クラスター4(150720bp〜175051bp)は、2つの遺伝子、すなわち芳香族プレニルトランスフェラーゼであるJtmDと、FAD結合オキシドレダクターゼをコードすることが予測されるJtmOとを含有する。
Cluster 4
Cluster 4 (150720bp-175051bp) contains two genes, namely JtmD, an aromatic prenyltransferase, and JtmO, which is predicted to encode FAD-linked oxidoreductase.
JtmD
jtmD遺伝子のヌクレオチド配列を図13に示す。芳香族プレニルトランスフェラーゼであることが予測されているJtmDは、オフィオコルディセプス・ユニアテラリス由来の予測タンパク質と最も高い相同性を示す(63%;図14)。JtmDの予測タンパク質配列はまた、Ｐ．ジャンチネラム(JanD;49%)及びＰ．パキシリ(PaxD;46%)由来のもの等の芳香族プレニルトランスフェラーゼとの相同性を有する(図15;Nicholsonら、2015)。これらの遺伝子はそれぞれ、インドールジテルペンであるシェアリニンK及びパキシリンの合成に関連する。NEA12(LpTG-3)由来のJtmDの予測タンパク質配列は、E1(LpTG-4)にものに一致する。
JtmD
The nucleotide sequence of the jtmD gene is shown in FIG. JtmD, which is predicted to be an aromatic prenyl transferase, shows the highest homology with the predicted protein from Ophiocordisces uniateralis (63%; FIG. 14). The predicted protein sequence of JtmD is also described in P. Gentineram (JanD; 49%) and It has homology with aromatic prenyltransferases such as those derived from paxili (PaxD; 46%) (Figure 15; Nicholson et al., 2015). Each of these genes is associated with the synthesis of the indole diterpenes shearrinin K and paxillin. The predicted protein sequence of JtmD from NEA12 (LpTG-3) matches that of E1 (LpTG-4).
JtmO
jtmO遺伝子のヌクレオチド配列を図16に示す。JtmOは、エスコボプシス・ウェベリ由来の予測タンパク質(6-ヒドロキシ-D-ニコチンオキシダーゼ)と最も高い相同性を示す(59%;図17)。JtmOはまた、Ｐ．ジャンチネラムにおけるシェアリニンの合成に関連するFAD結合オキシドレダクターゼであることが予測されている、JanOとの相同性を有する(52%;Nicholsonら、2015)。同様の機能が予測される遺伝子が、他のインドール-ジテルペン遺伝子クラスターに特定されている(図18)。JtmOタンパク質産物は、インドール-ジテルペンコアの引き続き起こる修飾の際の役割を有する可能性がある。NEA12(LpTG-3)及びE1(LpTG-4)におけるJtmOの予測タンパク質配列は、97.9%同一である。E1のJtmOの予測タンパク質は、NEA12のものに比べて、9アミノ酸の欠失(aa12〜20)及び1アミノ酸変換(アミノ酸326位のT>A)を有する。
JtmO
The nucleotide sequence of the jtmO gene is shown in FIG. JtmO shows the highest homology with a predicted protein (6-hydroxy-D-nicotine oxidase) from Escobopsis weberi (59%; FIG. 17). JtmO is also described in P.O. It has homology to JanO, which is predicted to be a FAD-linked oxidoreductase associated with the synthesis of shearrinin in gentinelam (52%; Nicholson et al., 2015). Genes predicted to have similar functions have been identified in other indole-diterpene gene clusters (FIG. 18). The JtmO protein product may have a role in the subsequent modification of the indole-diterpene core. The predicted protein sequence of JtmO in NEA12 (LpTG-3) and E1 (LpTG-4) is 97.9% identical. The predicted protein of E1 JtmO has a 9 amino acid deletion (aa12-20) and a 1 amino acid conversion (T> A at amino acid position 326) compared to that of NEA12.
JtmO
jtmO遺伝子のヌクレオチド配列を図16に示す。JtmOは、エスコボプシス・ウェベリ由来の予測タンパク質(6-ヒドロキシ-D-ニコチンオキシダーゼ)と最も高い相同性を示す(59%;図17)。JtmOはまた、Ｐ．ジャンチネラムにおけるシェアリニンの合成に関連するFAD結合オキシドレダクターゼであることが予測されている、JanOとの相同性を有する(52%;Nicholsonら、2015)。同様の機能が予測される遺伝子が、他のインドール-ジテルペン遺伝子クラスターに特定されている(図18)。JtmOタンパク質産物は、インドール-ジテルペンコアの続いて起こる修飾の際の役割を有する可能性がある。NEA12(LpTG-3)及びE1(LpTG-4)におけるJtmOの予測タンパク質配列は、97.9%同一である。E1のJtmOの予測タンパク質は、NEA12のものに比べて、9アミノ酸の欠失(aa12〜20)及び1アミノ酸変換(アミノ酸326位のT>A)を有する。
JtmO
The nucleotide sequence of the jtmO gene is shown in FIG. JtmO shows the highest homology with a predicted protein (6-hydroxy-D-nicotine oxidase) from Escobopsis weberi (59%; FIG. 17). JtmO is also described in P.O. It has homology to JanO, which is predicted to be a FAD-linked oxidoreductase associated with the synthesis of shearrinin in gentinelam (52%; Nicholson et al., 2015). Genes predicted to have similar functions have been identified in other indole-diterpene gene clusters (FIG. 18). The JtmO protein product may have a role in the subsequent modification of the indole-diterpene core. The predicted protein sequence of JtmO in NEA12 (LpTG-3) and E1 (LpTG-4) is 97.9% identical. The predicted protein of E1 JtmO has a 9 amino acid deletion (aa12-20) and a 1 amino acid conversion (T> A at amino acid position 326) compared to that of NEA12.
JtmD及びJtmOは、エピクロエ属内生菌ではこれまで記載されていなかった。この2つの遺伝子のホモログは、複数のペニシリウム(Penicillium)種(例えばＰ．ジャンチネラム、Ｐ．パキシリ、P.クルストサム)に特定されており、多くの場合、隣り合って位置することが見出される。興味深いことに、エスコボプシス・ウェベリのゲノム(GenBank:LGSR01000002.1)でも、この研究で特定された2つの遺伝子ホモログ(JtmD:KOS22745.1;JtmO:KOS22754.1)が互いに隣接することが見出されている。エスコボプシス属は、その宿主となる他の真菌に依存する寄生性の微小真菌である。 JtmD and JtmO have not been described so far in epichloroe endophytic bacteria. Homologs of the two genes have been identified in multiple Penicillium species (eg, P. gentineum, P. paxili, P. crustosum) and are often found to be located next to each other. Interestingly, the escobopsis weberi genome (GenBank: LGSR01000002.1) also found that the two gene homologs identified in this study (JtmD: KOS22745.1; JtmO: KOS22754.1) are adjacent to each other. ing. The genus Escobopsis is a parasitic microfungus that depends on other fungi hosting it.
ジャンチトレム生産のための提案される生合成経路
ここに記載される作業は、エピクロエ属内生菌、具体的にはLpTG-3及びLpTG-4におけるジャンチトレム生合成のための遺伝子的な基盤を提供する。出願人は、理論に制限されることを望まないが、これらの2つの無性の分類群に加えて、ジャンチトレムを合成する少なくとも1つの祖先由来の有性のエピクロエ種がある(又はかつてはあった)可能性がある。
Proposed biosynthetic pathway for gentitrem production The work described here provides a genetic basis for gentitrem biosynthesis in epichloroe endophytic bacteria, specifically LpTG-3 and LpTG-4 . Applicant does not wish to be limited by theory, but in addition to these two asexual taxa, there is a sex epichloroe species from at least one ancestor that synthesizes gentitrem (or once There is a possibility.
これまで特定されたインドール-ジテルペン遺伝子クラスターの全てが、パスパリンの合成のための遺伝子のコアセットと、分子骨格上の様々な位置特異的及び立体特異的な酸化を触媒してインドール-ジテルペン産物の多様性を生じる多機能のチトクロムP450モノオキシゲナーゼ、FAD依存性モノオキシゲナーゼ、及びプレニルトランスフェラーゼをコードする追加の一連の遺伝子とを有する。 All of the indole-diterpene gene clusters identified to date catalyze the core set of genes for the synthesis of pasparin and various regiospecific and stereospecific oxidations on the molecular backbone of the indole-diterpene product. It has a versatile cytochrome P450 monooxygenase that produces diversity, an FAD-dependent monooxygenase, and an additional series of genes that encode prenyltransferases.
堅牢な液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)アプローチを、インドール-ジテルペンアルカロイドの生合成に関連する標的の主要な代謝産物に利用した。ペレニアルライグラス-LpTG-3の共生から植物内に単離されたこれらの代謝産物の、抽出されたイオンクロマトグラムを図19に図示する。観察された正確な質量及び断片化のパターン(LC-MS/MS解析を介した)をTable 3(表4)に表示する。 A robust liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) approach was utilized for the target major metabolites involved in the biosynthesis of indole-diterpene alkaloids. Extracted ion chromatograms of these metabolites isolated in plants from the perennial ryegrass-LpTG-3 symbiosis are illustrated in FIG. The exact mass and fragmentation patterns observed (via LC-MS / MS analysis) are displayed in Table 3.
出願人は、理論に制限されることを望まないが、これらの代謝産物の特定及び断片化に基づき、エポキシ-ジャンチトレムの生合成についてのフレームワークを提案している(図20)。ここでは、出願人は、ジャンチトレム生合成がLtmP及びLtmQによるパスパリンからβ-パキシトリオールへの合成から起こる可能性があることを提案する。JtmD及びJtmOは、ジャンチトレムの初発の生合成に必要とされ、続いてPP01及びPP02が必要となる。LtmF及びLtmKは、エポキシ-ジャンチトレムII及びIVの合成に必要とされる。 Although not wishing to be limited by theory, applicants have proposed a framework for the biosynthesis of epoxy-juncitrem based on the identification and fragmentation of these metabolites (FIG. 20). Here, the applicant proposes that gentitrem biosynthesis can occur from the synthesis of pasparin to β-paxitriol by LtmP and LtmQ. JtmD and JtmO are required for the initial biosynthesis of jantitrem, followed by PP01 and PP02. LtmF and LtmK are required for the synthesis of epoxy-juncitrem II and IV.
エポキシ-ジャンチトレムIの生合成に必要とされる候補遺伝子の機能解析
jtmD遺伝子のRNAiサイレンシング
ベクターの構築
RNAiサイレンシングベクターを設計するために、jtmD内の3つの候補遺伝子配列(95bp、129bp、及び432bp)を選択した(図21)。エントリークローンを生成するために、遺伝子カセットをpDONR221ベクター内にクローニングした。RNAサイレンシングベクター(図22)を、エントリークローンとGateway(商標)の可能なデスティネーションベクター(pEND0002)との間で、LRクロナーゼ反応によって生産した(Hettiarachchige、2014)。
Functional analysis of candidate genes required for the biosynthesis of epoxy-juncitrem I
Construction of RNAi silencing vector of jtmD gene
In order to design the RNAi silencing vector, three candidate gene sequences (95 bp, 129 bp, and 432 bp) within jtmD were selected (FIG. 21). In order to generate entry clones, the gene cassette was cloned into the pDONR221 vector. An RNA silencing vector (Figure 22) was produced by the LR clonase reaction between an entry clone and a Gateway ™ possible destination vector (pEND0002) (Hettiarachchige, 2014).
真菌プロトプラストの単離
菌糸体を、滅菌条件下で、漏斗を覆うミラクロスの層を通して濾過することによって採取し、30mLの滅菌ddH2Oで3回洗浄した。菌糸体を10mLのOM緩衝液(1.2M MgSO4.7H2O、10mM Na2HPO4、100mM NaH2PO4.2H2O、pH5.8)で洗浄し、滅菌250mLプラスチックベッセルに移し入れた。新たに調製したOM中の10mg/mL Glucanex(30mL)(Sigma Aldrich社)を添加し、30℃で緩やかに振盪しながら(80〜100rpm)18時間インキュベーションした。glucanex/プロトプラスト溶液(30〜50μL)を顕微鏡下で調べて、消化に成功したことを確かめた。プロトプラストを、漏斗中で、ミラクロスを通して15mL滅菌ガラス遠心分離チューブ(Gentaur社、ベルギー)内に濾過し、氷上に置いた。各チューブを注意深く2mLのST緩衝液で(0.6Mソルビトール、100mM Tris-HCl、pH8.0)で覆い、遠心分離した[Beckman coulter社、Avanti(登録商標)J-25I](4℃、5000rpmで5分間)。遠心分離後、プロトプラストは、glucanex溶液とST緩衝液との間に白い層を形成し、この層を注意深く取り出した。STC緩衝液(1Mソルビトール、50mM CaCl2.2H2O、50mM Tris-HCl、pH8.0)(5mL)を、新しい滅菌ガラスチューブ中のプロトプラスト溶液に添加した。試料を緩やかに1回反転させ、遠心分離した(4℃、5000rpmで5分間)。プロトプラストのペレットを5mLのSTC緩衝液に貯え、1つのみのペレットが残るまで遠心分離を繰り返した(4℃、5000rpmで5分間)。過剰量のSTC緩衝液を除去し、最終的なプロトプラストのペレットを500μLのSTC緩衝液に再懸濁した。プロトプラスト濃度は、プロトプラストを希釈し(STC緩衝液を用いて1/100及び/又は1/1000)、血球計算盤及び顕微鏡を用いてカウントすることによって見積もった。プロトプラストを、STCを用いて1.25×108個プロトプラスト/mLに希釈した。
Isolation of Fungal Protoplasts Mycelium was harvested by filtration through a layer of Miracloth covering the funnel under sterile conditions and washed 3 times with 30 mL of sterile ddH 2 O. OM buffer mycelium 10mL (1.2M MgSO 4 .7H 2 O , 10mM Na 2 HPO 4, 100mM NaH 2 PO 4 .2H 2 O, pH5.8) and washed with, was transferred to a sterile 250mL plastic vessel . 10 mg / mL Glucanex (30 mL) in freshly prepared OM (Sigma Aldrich) was added and incubated for 18 hours at 30 ° C. with gentle shaking (80-100 rpm). The glucanex / protoplast solution (30-50 μL) was examined under a microscope to confirm that digestion was successful. Protoplasts were filtered in a funnel through Miracloth into a 15 mL sterile glass centrifuge tube (Gentaur, Belgium) and placed on ice. Each tube was carefully covered with 2 mL ST buffer (0.6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0) and centrifuged [Beckman coulter, Avanti® J-25I] (4 ° C., 5000 rpm 5 minutes). After centrifugation, the protoplast formed a white layer between the glucanex solution and the ST buffer, and this layer was carefully removed. STC buffer (1 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 .2H 2 O, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) (5 mL) was added to the protoplast solution in a new sterile glass tube. The sample was gently inverted once and centrifuged (4 ° C., 5000 rpm for 5 minutes). Protoplast pellets were stored in 5 mL of STC buffer and centrifugation was repeated until only one pellet remained (4 ° C., 5000 rpm for 5 minutes). Excess STC buffer was removed and the final protoplast pellet was resuspended in 500 μL STC buffer. Protoplast concentrations were estimated by diluting protoplasts (1/100 and / or 1/1000 using STC buffer) and counting using a hemocytometer and microscope. Protoplasts were diluted to 1.25 × 10 8 protoplasts / mL using STC.
PEG媒介性の真菌プロトプラストの形質転換
真菌プロトプラスト内に送達する前に、3つのRNAサイレンシングベクター(図22)を、制限酵素消化及びサンガーシークエンシング(データ示さず)によって確認した。PureYield(商標)Plasmid Midiprep System(Promega社)を用いて、製造業者の指示に従って、真菌プロトプラスト内への形質転換に適した高品質のプラスミドDNAを生産した。希釈したプロトプラスト(1.25×108個プロトプラスト/mL)のアリコート(80μL)を、氷上に準備した。各アリコートに、2μLの50mMスペルミジン、5μLの5mg/mLヘパリン(STC緩衝液中に調製)、10μgのプラスミドDNA(1μg/μL、20μLを超えない)、及び20μLの70%(w/v)PEG溶液[70%(w/v)PEG4000、10mM Tris-HCl pH8.0、10mM CaCl2]を添加した。エッペンドルフチューブを緩やかに混合し、氷上で30分間インキュベーションした。1.5mLのSTC緩衝液を添加した後、プロトプラストを混合して遠心分離した(Eppendorf社、Centrifuge 5424R)(4℃、5000rpmで5分間)。上清を除去して、プロトプラストを再生培地II(RGII、500μL)(304g/Lスクロース、1g/L KH2PO4、1g/L NH4NO3、1g/L NaCl、0.25g/L無水MgSO4、0.13g/L CaCl2.2H2O、1g/L酵母抽出物、12g/L脱水ジャガイモデキストロース、1g/Lペプトン、1g/Lカゼインの酸加水分解物)に再懸濁して、一晩インキュベーションした(22℃、暗所45rpm)。
PEG-mediated fungal protoplast transformation Prior to delivery into fungal protoplasts, three RNA silencing vectors (Figure 22) were confirmed by restriction enzyme digestion and Sanger sequencing (data not shown). High quality plasmid DNA suitable for transformation into fungal protoplasts was produced using the PureYield ™ Plasmid Midiprep System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Aliquots (80 μL) of diluted protoplasts (1.25 × 10 8 protoplasts / mL) were prepared on ice. Each aliquot contains 2 μL of 50 mM spermidine, 5 μL of 5 mg / mL heparin (prepared in STC buffer), 10 μg of plasmid DNA (1 μg / μL, not exceeding 20 μL), and 20 μL of 70% (w / v) PEG The solution [70% (w / v) PEG 4000, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM CaCl 2 ] was added. The Eppendorf tube was gently mixed and incubated on ice for 30 minutes. After adding 1.5 mL of STC buffer, protoplasts were mixed and centrifuged (Eppendorf, Centrifuge 5424R) (4 ° C., 5000 rpm for 5 minutes). The supernatant was removed and the protoplasts were regenerated medium II (RGII, 500 μL) (304 g / L sucrose, 1 g / L KH 2 PO 4 , 1 g / L NH 4 NO 3 , 1 g / L NaCl, 0.25 g / L anhydrous MgSO 4 , 0.13 g / L CaCl 2 .2H 2 O, 1 g / L yeast extract, 12 g / L dehydrated potato dextrose, 1 g / L peptone, 1 g / L casein acid hydrolyzate) overnight. Incubated (22 ° C., 45 rpm in dark).
真菌のプロトプラストの再生
一晩を経たプロトプラスト溶液(200μL)を、800μLの40%(w/v)PEG溶液[40%(w/v)PEG4000、1Mソルビトール、50mM Tris-HCl pH8.0、50mM CaCl2]を用いて、室温で15分間インキュベーションした。100μLのプロトプラスト/PEG混合物を含有する溶融(50℃)の0.4%RGII(5mL)(304g/Lスクロース、1g/L KH2PO4、1g/L NH4NO3、1g/L NaCl、0.25g/L無水MgSO4、0.13g/L CaCl2.2H2O、1g/L酵母抽出物、12g/L脱水ジャガイモデキストロースブロス、1g/Lペプトン、1g/Lカゼイン酸加水分解物、4g/Lアガロース)を、100μg/mLハイグロマイシンBを含有する0.6%RGIIアガロースのペトリ皿(304g/Lスクロース、1g/L KH2PO4、1g/L NH4NO3、1g/L NaCl、0.25g/L無水MgSO4、0.13g/L CaCl2.2H2O、1g/L酵母抽出物、12g/L脱水ジャガイモデキストロースブロス、1g/Lペプトン、1g/Lカゼイン酸加水分解物、6g/Lアガロース)中にわたって均等に広げた。代表的なRGIIペトリ皿を、内生菌の生存性を評価するための対照として、ハイグロマイシンを重ねずに保持した。再生が観察されるまで(図23)、全てのペトリ皿を、暗所、22℃で4〜6週間インキュベーションした。
Regeneration of fungal protoplasts Overnight protoplast solution (200 μL) was added to 800 μL of 40% (w / v) PEG solution (40% (w / v) PEG4000, 1 M sorbitol, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM CaCl 2 ] and incubated at room temperature for 15 minutes. Melted (50 ° C) 0.4% RGII (5 mL) (304 g / L sucrose, 1 g / L KH 2 PO 4 , 1 g / L NH 4 NO 3 , 1 g / L NaCl, 0.25 g containing 100 μL protoplast / PEG mixture / L anhydrous MgSO 4 , 0.13 g / L CaCl 2 .2H 2 O, 1 g / L yeast extract, 12 g / L dehydrated potato dextrose broth, 1 g / L peptone, 1 g / L caseinate hydrolyzate, 4 g / L agarose ), 0.6% RGII agarose Petri dish (304 g / L sucrose, 1 g / L KH 2 PO 4 , 1 g / L NH 4 NO 3 , 1 g / L NaCl, 0.25 g / L containing 100 μg / mL hygromycin B) Anhydrous MgSO 4 , 0.13 g / L CaCl 2 .2H 2 O, 1 g / L yeast extract, 12 g / L dehydrated potato dextrose broth, 1 g / L peptone, 1 g / L caseinate hydrolyzate, 6 g / L agarose) Spread evenly over. A representative RGII Petri dish was kept without overlaying hygromycin as a control to assess endophytic viability. All petri dishes were incubated in the dark at 22 ° C. for 4-6 weeks until regeneration was observed (FIG. 23).
形質転換された真菌プロトプラストの特定
100μg/mLハイグロマイシン選抜を含む15%(w/v)ジャガイモデキストロース寒天(PDA)を含有するペトリ皿の上に、個々の再生コロニーを移し入れ、インキュベーションした。(22℃、暗所、10〜21日間)。ハイグロマイシン耐性コロニーを、250mLの滅菌培養ベッセルにて、100μg/mLハイグロマイシンを含むPDブロス(50mL)中で成長させ(22℃、暗所、150rpm、10〜21日間)、菌糸体を、滅菌条件下で、漏斗を覆うミラクロスの層を通して濾過することによって採取し、30mLの滅菌M9リン酸緩衝液(1g/L NH4Cl、11g/L Na2HPO4.7H2O、3g/L KH2PO4、5g/L NaCl)で洗浄した。洗浄した菌糸体をエッペンドルフチューブに移し入れ、凍結し(24〜48時間)、DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen社、ドイツ)を用いて、製造業者の指示に従って、DNAを抽出した。形質転換された個体を、RNAサイレンシングベクターによって持ち込まれるハイグロマイシン遺伝子[hph;フォワード5'-tgtcgtccatcacagtttgc-3'(配列番号21)、リバース5'-gcgccgatggtttctacaaa-3'(配列番号22)]、及び/又は候補jtmD遺伝子断片[jtmD(95bp)フォワード5'-gcctttcttcttgcctgtca-3'(配列番号23)、リバース5'-gaccgcctgtgtgttttgaa-3'(配列番号24);jtmD(129bp)フォワード5'-cacacagcccaagattgcat-3'(配列番号25)、リバース5'-tggaagtctatcgccactgg-3'(配列番号26);jtmD(432bp)フォワード5'-ggagttcagtgcatgctcag-3'(配列番号27)、リバース5'-ggcaagaagaaaggctcacc-3'(配列番号28)について、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって特定した。CFX Connect(商標)リアルタイムPCR検出システム(BioRad社)[2×FastStart SYBR Green master mix(Roche社)、10uMフォワードプライマー及びリバースプライマー、2μL鋳型DNA、滅菌ddH2O(VT 10μL);95℃10分、(95℃ 30秒、60℃ 60秒、72℃ 30秒)×40、60〜95℃(増分0.5℃)5分]を使用したPCRの構成成分及びサイクル条件。アッセイは、適切な陽性及び陰性の対照DNAを含んでいた。
Identification of transformed fungal protoplasts
Individual regenerative colonies were transferred and incubated onto Petri dishes containing 15% (w / v) potato dextrose agar (PDA) containing 100 μg / mL hygromycin selection. (22 ° C, dark, 10-21 days). Hygromycin-resistant colonies are grown in PD broth (50 mL) containing 100 μg / mL hygromycin in a 250 mL sterile culture vessel (22 ° C., dark, 150 rpm, 10-21 days) and mycelium is sterilized under conditions, harvested by filtration through a layer of miracloth covering the funnel, sterile M9 phosphate buffer 30mL (1g / L NH 4 Cl , 11g / L Na 2 HPO 4 .7H 2 O, 3g / L KH 2 PO 4 , 5 g / L NaCl). The washed mycelium was transferred to an Eppendorf tube, frozen (24-48 hours), and DNA was extracted using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany) according to the manufacturer's instructions. Transformed individuals are hygromycin genes carried by RNA silencing vectors [hph; forward 5'-tgtcgtccatcacagtttgc-3 '(SEQ ID NO: 21), reverse 5'-gcgccgatggtttctacaaa-3' (SEQ ID NO: 22)], and / Or candidate jtmD gene fragment (jtmD (95bp) forward 5'-gcctttcttcttgcctgtca-3 '(SEQ ID NO: 23), reverse 5'-gaccgcctgtgtgttttgaa-3' (SEQ ID NO: 24); jtmD (129bp) forward 5'-cacacagcccaagattgcat-3 '(SEQ ID NO: 25), reverse 5'-tggaagtctatcgccactgg-3' (SEQ ID NO: 26); jtmD (432bp) forward 5'-ggagttcagtgcatgctcag-3 '(SEQ ID NO: 27), reverse 5'-ggcaagaagaaaggctcacc-3' (SEQ ID NO: 28) was identified by polymerase chain reaction (PCR). CFX ConnectTM real-time PCR detection system (BioRad) [2 × FastStart SYBR Green master mix (Roche), 10 uM forward primer and reverse primer, 2 μL template DNA, sterile ddH 2 O (V T 10 μL); 95 ° C. 10 Min, (95 ° C. 30 seconds, 60 ° C. 60 seconds, 72 ° C. 30 seconds) × 40, 60-95 ° C. (incremental 0.5 ° C. 5 minutes)]. The assay included appropriate positive and negative control DNA.
最後に、本明細書で概説された本願発明の趣旨を逸脱することなく様々な変更、改変、及び/又は追加がなされ得ることが理解されよう。 Finally, it will be understood that various changes, modifications and / or additions may be made without departing from the spirit of the invention as outlined herein.
参考文献
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