JP2019516981A - 方法、アレイ、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)試験される個体からの試料を提供するステップと、
(b)表Aに定義される群から選択される1つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および/または量を測定することによって、試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、を含むか、またはそれからなり、
表Aに定義される群から選択される1つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および/または量が、個体における膵臓癌に関連した病態を示す。
(i)早期膵臓癌の診断および/もしくは病期分類、ならびに/または
(ii)膵臓癌の診断および/もしくは病期分類(すなわち、早期または後期)、を可能にする。
-Tは、主(原発)腫瘍の大きさ、およびそれが膵臓の外側および隣接器官内へと成長したかどうかを記述する。
-Nは、隣接(所属)リンパ節への広がりを記述する。
-Mは、癌が身体の他の器官に転移した(広がった)かどうかを記述する。(膵臓癌が広がる最も一般的な部位は、肝臓、肺、および腹膜(消化器官の周囲の空間)である。)
T、N、Mの後ろに数字または文字が表示されて、これらの要因の各々に関するさらなる詳細を提供する。
T分類
TX:主腫瘍は、評価できない。
T0:原発腫瘍の兆候なし。
Tis:上皮内癌(その腫瘍は膵管細胞の最上層に限定される)。(この病期で見られる膵臓腫瘍はごくわずかである。)
T1:癌は、膵臓内にまだあり、直径2センチメートル(cm)(約3/4インチ)以下である。
T2:癌は、膵臓内にまだあるが、直径2cmよりも大きい。
T3:癌は、膵臓の外側で隣接する周囲組織内へと成長したが、主要な血管または神経内へは成長していない。
T4:癌は、膵臓を越えて隣接する大きい血管または神経内へと成長している。
N分類
NX:隣接(所属)リンパ節は、評価できない。
N0:癌は、隣接リンパ節に広がっていない。
N1:癌は、隣接リンパ節に広がっている。
M分類
M0:癌は、離れたリンパ節(膵臓に近いもの以外)または肝臓、肺、脳などの離れた器官に広がっていない。
M1:癌は、離れたリンパ節または離れた器官に広がっている。
膵臓癌の病期グループ化
いったんT、N、およびM分類が判断されると、この情報は組み合わされて、全体的な病期0、I、II、III、またはIV期(時に文字が後に続く)を割り当てる。このプロセスは、病期グループ化と呼ばれる。
病期0(TIS、N0、M0):腫瘍は、膵管細胞の最上層に限定され、より深い組織に浸潤していない。腫瘍は、膵臓の外側に広がっていない。これらの腫瘍はしばしば、膵上皮内癌または膵上皮内腫瘍性病変III(PanIn III)と称される。
病期IA期(T1、N0、M0):腫瘍は、膵臓に限定され、直径2cm以下である(T1)。腫瘍は、隣接リンパ節(N0)または離れた部位(M0)に広がっていない。
病期IB(T2、N0、M0):腫瘍は、膵臓に限定され、直径2cmよりも大きい(T2)。腫瘍は、隣接リンパ節(N0)または離れた部位(M0)に広がっていない。
病期IIA期(T3、N0、M0):腫瘍は、膵臓の外側で成長しているが、主要な血管または神経内へは成長していない(T3)。腫瘍は、隣接リンパ節(N0)または離れた部位(M0)に広がっていない。
病期IIB期(T1〜3、N1、M0):腫瘍は、膵臓に限定されているか、または膵臓の外側で成長しているかのいずれかであるが、主要な血管または神経内へは成長していない(T1〜T3)。腫瘍は、隣接リンパ節(N1)に広がっているが、離れた部位(M0)には広がっていない。
病期III(T4、任意のN、M0):腫瘍は、膵臓の外側で隣接する主要な血管または神経内へと成長している(T4)。腫瘍は、隣接リンパ節に広がっている可能性があるか、または広がっている可能性がない(任意のN)。腫瘍は、離れた部位に広がっていない(M0)。
病期IV期(任意のT、任意のN、M1):癌は、離れた部位に広がっている(M1)。
https://annonc.oxfordjournals.org/content/26/suppl_5/v56.full.pdf+html。
コンピュータ断層撮影(好ましくは、2相性ヘリカルコンピュータ断層撮影)、経腹超音波検査、超音波内視鏡下穿刺吸引、内視鏡的逆行性胆道膵管造影、陽電子放出断層撮影、磁気共鳴画映像、身体検査、および生検からなる群から選択される1つ以上の方法を使用して診断され得る。
表A(I)、例えば、表A(I)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、または5個、
表A(III)、例えば、表A(III)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
表A(V)、例えば、表A(V)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、および
表A(XI)、例えば、表A(XI)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2または3個、に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
表A(II)、例えば、表A(II)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個、
表A(IV)、例えば、表A(IV)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個、
表A(VI)、例えば、表A(VI)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個、および
表A(XII)、例えば、表A(XII)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
表A(I)、例えば、表A(I)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、または5個、
表A(III)、例えば、表A(III)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
表A(VII)、に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
表A(II)、例えば、表A(II)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個、
表A(IV)、例えば、表A(IV)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個、および
表A(VIII)、例えば、表A(VIII)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
表A(I)、例えば、表A(I)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、または5個、
表A(V)、例えば、表A(V)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
表A(IX)、に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
表A(II)、例えば、表A(II)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個、
表A(VI)、例えば、表A(VI)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個、および
表A(X)、例えば、表A(X)に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、または4個、に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
(c)
(i)膵臓癌に罹患していない個体、および/または
(ii)膵臓癌に罹患している個体から、1つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料とは異なる病期のものであった、ステップと、
(d)ステップ(b)で測定された1つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および/または量を測定することによって、1つ以上の対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ(b)で測定された1つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および/または量が、ステップ(d)で測定された1つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および/または量と異なる場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される。
(e)膵臓癌に罹患している個体(すなわち、陽性対照)、および/または
(f)膵臓癌に罹患している個体から、1つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料と同じ病期のものであった、ステップと、
ステップ(b)で測定された1つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および/または量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ(b)で測定された1つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および/または量が、ステップ(f)で測定された1つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および/または量に対応する場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される。
(i)プロリンは、その側鎖が、α炭素ならびに窒素の両方に結合しているため、ペプチド構造を安定化し得る。
(ii)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは、芳香族側鎖を有し、高度に疎水性であり、一方でロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、同様に疎水性である。
(iii)リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、塩基性側鎖を有し、中性pHで正に帯電し、一方でアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩は、酸性側鎖を有し、中性pHで負に帯電する。
(iv)アスパラギンおよびグルタミンは、中性pHで中性であるが、水素結合に関与し得るアミド基を含有する。
(v)セリン、スレオニン、およびチロシン側鎖は、ヒドロキシル基を含有し、これは、水素結合に関与し得る。
−高速ペアワイズアライメントパラメータ:Kタプル(ワード)サイズ;1、ウィンドウサイズ;5、ギャップペナルティ;3、トップダイアゴナル数;5。スコアリング方法:xパーセント。
−複数のアライメントパラメータ:ギャップオープンペナルティ;10、ギャップ伸長ペナルティ;0.05。
スコアリングマトリクス:BLOSUM。
(i)試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識することと、
(ii)ビオチン標識タンパク質を、その表面上の別々の位置に固定化された複数のscFvを含むアレイと接触させることであって、scFvが、表Aのタンパク質のうちの1つ以上に対する特異性を有する、接触させることと、
(iii)固定化されたscFvを、蛍光色素を含むストレプトアビジン抱合体と接触させることと、
(iv)アレイ表面上の別々の位置における色素の存在を検出することと、を含み、
アレイ表面上の色素の発現は、試料中の表IIIからのバイオマーカーの発現を示す。
(g)個体に膵臓癌療法を提供するステップを含む。
(a)本発明の第1の態様に従った方法を使用して、個体を、膵臓癌を有するものとして診断するステップ、および
(b)そのように診断された個体を、膵臓癌療法で治療するステップ(例えば、Thota et al.,2014,Oncology 28(1):70−4その開示は参照により本明細に組み込まれる)を参照されたい)。
-FOL−フォリン酸(ロイコボリン)、
-F−フルオロウラシル(5−FU)、
-IRIN−イリノテカン(Camptosar)、および
-OX−オキサリプラチン(Eloxatin)。
(a)本発明の第1の態様に定義される1つ以上の結合剤、または本発明の第2の態様に従ったアレイと、
(b)上記に(例えば、本発明の第1の態様に)定義される方法を実施するための説明書と、を備える。
(a)本発明の第1の態様のいずれかに定義される方法に従って、膵臓癌に関連した病態を判断するステップと、
(b)個体に膵臓癌療法を提供するステップと、を含む。
この研究では、組み換え抗体マイクロアレイプラットフォームを使用して、膵臓癌患者および正常対照個体からの213個の血漿試料を分析した。コホートを、病期、すなわち切除可能な疾病(病期I/II期)、局所進行(病期III期)、および転移性疾患(病期IV期)に従って階層化した。SVM分析は、全てのPDAC病期が対照と区別され得ることを示した。血漿タンパク質シグネチャーに基づき、病期I/II期PDAC腫瘍を有する患者を高精度で対照と区別することができるのは初めてであり、これは、早期診断の可能性および外科的切除可能な腫瘍の割合の増加を示す。
膵管腺癌(PDAC)は、3〜4%の5年生存率を有する最も致命的な癌の1つである。この予後不良の背後にある主な要因は、早期に患者を診断することが現在できないことである。データは、腫瘍の開始から転移能の取得まで5年以上かかることを裏付けて(Yachida et al.,2010)、それは、正確なマーカーが利用可能な場合に、早期検出のための絶好の機会を明確に実証している。診断時に、患者はしばしば後期疾患を発症しており、患者のわずか約15%が切除可能な腫瘍を有する(Conlon et al.,1996、Sohn et al.,2000)。大きな切除腫瘍を呈するこれらの患者の5年生存率は、わずか10〜20%である(Conlon et al.,1996、Sohn et al.,2000)。しかしながら、20mm以下の腫瘍(病期I〜II期)が切除され得る場合、5年生存率は、30〜60%まで増加する(Furukawa et al.,1996、Shimizu et al.,2005)。後期診断(病期III〜IV期)は、早期診断のためのマーカーの欠如と組み合わせた非特異的な臨床症状によるものであり、これは、本研究で対処されるものである。興味深いことに、研究は、膵臓腫瘍が、無症候期において臨床診断の早ければ6ヶ月も前に切除可能であり得ることを示唆する(Gangi et al.,2004、Pelaez−Luna et al.,2007)。
血症試料
この後向き研究は、Ethics Committee of Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital(TMUCIH)によって承認された。インフォームドコンセントの後、TMUCIHで血液を採取し、血漿を分離し、−80℃で保存した。2012年1月1日から2013年12月13日に採取した合計213個の血漿試料を使用した(表1)。登録されたPDAC患者(n=118)は全て中国の漢民族であり、TMUCIHで治療された。採血時に化学療法または放射線療法を受けた患者はいなかった。全てのPDAC試料を、経験豊富な病理学者によって細胞診で確認した。患者を、以下:悪性漿液性嚢腺腫(n=1)、膵臓肉腫(n=2)、管状乳頭状膵臓腺癌(n=1)を例外として、膵管腺癌と診断した。5人の患者を、肝転移を伴うPDACと診断した。診断時の腫瘍病期およびサイズ、ならびに膵臓内の腫瘍位置に関するデータは、臨床病理に基づいた。病期分類をAmerican Cancer Societyのガイドライン(表1)に従って実施し、切除範囲をR0と分類した。正常対照(NC)試料(n=95)は、天津の健康な住人から、TMUCIHでの彼らの日常的な身体検査において採取され、PDAC患者とは遺伝的に無関係であった(表1)。試料IDを、標識化時に記録および無作為化し、試料の注釈および臨床データを、全ての下流の実験手順において操作者に対して盲検化した。以前に最適化されたプロトコル(Wingren et al.,2012)を使用して、全ての試料を一度に標識化した。
抗体マイクロアレイは、社内設計のファージディスプレイ抗体ライブラリから選択および生成され、以前に記載されたように(Pauly et al.,2014)、E.coli中で産生され、14個のアレイ/スライドおよび3個の複製スポット/アレイでスライド上に印刷された、350個のヒト組み換えscFv抗体を含んだ。この研究のために使用した全てのスライドを一度に印刷し、中国のTMUCIHに出荷し、印刷後4週間以内に分析のために使用した。
無作為化された試料の順序で、1日あたり10個のスライド(140の個々のサブアレイ)を処理した。簡潔に、アレイをPBSMTで遮断し、PBSTで洗浄し、室温で2時間、ビオチン化血漿試料と共にインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流し、結合したタンパク質を、1μg/mLのAlexa Fluor647−ストレプトアビジンを使用して検出した(室温で1時間)。過剰な試薬を洗い流し、スライドを乾燥させ、635nmおよび532nmの励起レーザーを使用して、10μmの分解能のLuxScan 10Kマイクロアレイスキャナ(CapitalBio)において直ちに走査した。
シグナル強度を、定円オプションを有するScanArray Expressソフトウェアバージョン4.0(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)を使用して、患者IDおよび臨床データを盲検化された、2人の訓練された分析者(ASGおよびMN)によって定量化した。各マイクロアレイに対して、マイクロアレイ印刷からのAlexa Fluor555シグナルを使用してグリッドを位置付け、結合タンパク質の相対レベルに対応するAlexa Fluor647シグナルを定量するために使用した。高いバックグラウンドシグナルおよび/または低い全体的なシグナルに起因する低品質画像のため、11個の試料(10PDAC、1NC)を定量化しなかった。定量化されたアレイに対して、各スポットのスポット飽和度、平均強度、およびシグナル対ノイズ比を評価した。(i)平均シグナル強度が、バックグラウンド(平均PBSシグナル)+2標準偏差として定義されるカットオフ限界を下回っていたこと(n=8)、(ii)50%を超える試料中、最低スキャナ強度設定における飽和シグナル(n=1)、および(iii)不十分な抗体印刷(n=5)のため、14個の抗体を除外した。残りの202個の試料および336個の抗体に基づき、ローカルバックグラウンド除去後の平均スポット強度を使用して、データセットを組み立てた。任意の複製CVが平均値から15%を超えた場合(その場合、それを廃棄し、残りの2つの複製の平均を代わりに使用した)を除き、各データポイントは、3個の複製スポットの平均を表した。複製の平均CVは、7.9%(±4.1%)であった。15%のカットオフCVを適用して、データ値の79%を3つ全ての複製から、かつ残りの21%を2つの複製から計算した。さらに、黄疸患者(n=27)を、黄疸のない患者(n=81)と比較して、ビリルビンレベルが抗体マイクロアレイ分析における交絡因子であったかどうかを分析した。同様に、性別調整データセットを生成して、性別が交絡因子であったかどうかを評価した。技術的変動を調整するために、記録されたデータを、経験的BayesアルゴリズムComBat(Johnson et al.,2007)を使用して正規化し、続いて各アレイからのデータの線形スケーリングによって、試料バックグラウンドレベルの変動を調整した。スケーリング係数は、全ての試料にわたって最低の標準偏差を有する抗体の20%に基づき、全てのアレイにわたる平均合計で、各アレイ上のこれらの抗体の強度合計を割ることによって計算した(Carlsson et al.,2008、Ingvarsson et al.,2008)。
主成分分析に基づくプログラム(Qlucore,Lund,Sweden)を使用して、試料および変数分布を分析および視覚化した。ANOVAをデータの初期フィルタリングに適用した。ウィルコクソンまたはスチューデントのt検定、偽発見率制御のためのベンジャミーニ−ホッホベルク手順、および倍率変化を使用して、個々のマーカーの性能を評価した。制約のコストを1に設定した線形カーネルを適用するサポートベクターマシン(SVM)を使用して、異なるサブグループの分離を評価した。2つの群を区別するためのモデルを、一個抜き交差検証手順を使用して作成した。
症例と対照との間の区別、および膵臓癌に関連する血漿タンパク質シグネチャーの同定
最初に、我々は、PCA、q値フィルタリング、および一個抜き交差検証を用いたSVM分析を使用して、PDAC症例が正常対照と区別され得ることを示す。主成分分析は、PDACおよびNC試料の中程度の分離を明らかにし(図1A)、q値カットオフが0.1の差異分析は、PDAC対NCにおいて有意な異なる発現レベルを呈する11個の抗体をもたらした(図1B)。これらのうちの3つを、アポリポタンパク質A1(Apo−A1)を標的化し、NCと比較してPDACにおけるタンパク質レベルの低下を示した。プロパージン、C1q、C3、IgM、およびIL−8もまた、PDACにおけるレベルの低下を示したが、一方でVEGF、MAPK−8、およびCHP−1は、癌群で上昇した。さらに、336個全ての抗体からのデータを使用した一個抜き交差検証を用いたSVMは、PDACおよびNCが0.88のAUC値で分離されたことを実証した(p値=6.4×10−21、図1C)。注目すべきことに、黄疸患者を黄疸のない患者と有意に区別することができず、高ビリルビン血症が交絡因子ではなかったことを実証する(データは図示せず)。性別調整データセットにおける有意な(ウィルコクソンp<0.05)マーカーの比較は、いずれの性別も交絡因子ではなかったことを示した(表4)。
異なる病期間の区別は、これが非侵襲的な病期において膵臓癌を診断する能力に関連するため、高い関心がある。早期診断のために同定されたマーカーの重要性を評価するために、PDAC試料を病期に従って階層化した。一個抜き交差検証を用いたSVMは、全てのPDAC病期がNCから分離し、分類の精度が疾病の進行に伴って増加し、病期I、II、IIIおよびIV期とNCを区別するためのAUC値が、それぞれ0.71、0.86、0.90、および0.93であったことを示した(図3a)。病期へのサブグループ化は、病期I期患者に対するn=11から病期III期患者に対するn=34の範囲の、より小さい試料数をもたらした。統計的検出力を高めるために、早期限局疾患(病期I/II期)および後期侵襲性疾患(病期III/IV期)へのグループ分けも実施した。これらの群は、0.80(早期)および0.96(後期)のAUC値でNCと区別された。
膵臓内の原発腫瘍位置によっても試料をグループ分けし、膵頭部に位置する腫瘍由来の血漿を、膵体および/または膵尾に位置するものと比較した。他の位置(膵頸部=4、膵頸部+膵体=1、膵頭部+膵尾=1)における腫瘍を有する試料をこの分析から除外した。ウィルコクソンp<0.05のカットオフを適用すると、37個の抗体は、膵頭部対膵体/膵尾において有意に異なる強度レベルを示した(図4)。膵頭部(n=63)対膵体/膵尾(n=39)の限局性腫瘍に対するAUCは、0.64(p=5.4e−3)であった。群は、SVM分析では明確に分離されなかったが、試料形式(血清/血漿)、民族性(白人/アジア人)、技術的プロセス(アッセイプロトコルおよび計装)、ならびにデータ処理(正規化手順)(Gerdtsson, 2015)に関する違いにもかかわらず、37個の有意な抗体が、以前の研究において同定された抗体とかなり重複した(図4)。前の研究と相関しない唯一のタンパク質は、C3であり、これは血漿中で上昇することがわかったが、膵頭部対膵体/膵尾の限局性腫瘍では血清中で低下した。注目すべきことに、膵頭部/膵体/膵尾の限局性腫瘍(図4)を区別したタンパク質もまた、PDAC対NCに対するタンパク質シグネチャーとは明らかに異なった(表2)。
我々は、次に、健常対照ならびに膵炎患者との関連で分析された(Wingren et al.,2012)、後期PDAC白人コホートにおいてすでに同定された血清タンパク質シグネチャーを有する中国人の膵臓癌対照における、血漿タンパク質シグネチャーの一致を評価した。注目すべきことに、抗体マイクロアレイ含有量は、前の研究以来有意に拡大しており、2つの研究の相関測定を困難にする。前の研究は、現在使用されている抗体の36%のみを含み、例えば、コアマーカーCHP−1を含まなかった。しかしながら、他の4つのコアシグネチャータンパク質(プロパージン、VEGF、IL−8、およびC3)は全て、以前に公開された血清PDACシグネチャーの一部であった。コアパネルに加えて、2つの研究における25個の最上位にランク付けされた抗体(表2)を比較すると、2つの民族コホート間に明確な重複があり、血液ベースのプロテオミクス分析が、試料ドナー(白人/アジア人)の遺伝子構造、または試料形式(血清/血漿)による影響が少ないことを実証する。
血漿マーカーシグネチャーの同定のために、最初に、2つの相補的な戦略、(i)アッセイにおける各抗体に対する複数試験の補正されたq値を生成する、一変量差次的発現分析、ならびに(ii)症例および対照を区別するための直交情報で寄与する、マーカーの最適な組み合わせを指摘するように設計された、後退消去アプローチを使用した(Carlsson et al.,2011a)。2つの戦略は、プロパージン、VEGF、IL−8、C3、およびCHP−1の5つのタンパク質の堅牢なコアシグネチャーの同定をもたらした。プロパージンまたは補体因子Pは、血清(Wingren et al.,2012)および血漿(Gerdtsson et al、未公開の観察)中で強力に下方制御されたものとして、2つの独立した研究においてすでに同定されたが、それは別として、我々の知る限り、以前にはPDACに関連していなかった。対照的に、腫瘍成長の血管新生依存に関連したVEGFは、PDACを含む多くの癌における既知の上方制御マーカーである(Itakura et al.,1997)。特異性が質量分析によって検証されているVEGF抗体は、以前の研究でも、PDACにおいて有意に上昇したVEGFレベルを実証している(Gerdtsson,2015、Wingren et al.,2012)。また、IL−8および補体因子C3は、後期膵臓癌に関連することがすでに示されている(Chen et al.,2013、Shaw et al.,2014、Wingren et al.,2012)。対照的に、CHP−1、カルシニューリン相同タンパク質−1は、以前に測定されておらず、我々は、そのPDACとの関連が本研究に新規であると考える。CHP−1は、Ca2+結合ファミリーの一部であり、複数の細胞内コンパートメントに局在する広く発現されたタンパク質である。原形質膜にわたる輸送に関与することは別として、この推定上多能性のタンパク質の機能は、ほとんど知られていない(Jimenez−Vidal et al.,2010)。
Claims (90)
- 膵臓癌に関連した病態を診断または判断するための方法であって、
(a)試験される個体からの試料を提供するステップと、
(b)表Aに定義される群から選択される1つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および/または量を測定することによって、前記試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、
を含むか、またはそれからなり、
表Aに定義される群から選択される前記1つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および/または量が、前記個体における前記膵臓癌に関連した病態を示す、方法。 - 前記膵臓癌に関連した病態が、
(i)早期膵臓癌の診断および/または病期分類、
(ii)膵臓癌の診断および/または病期分類、からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - ステップ(b)が、表Aに列挙される1つ以上のバイオマーカー、例えば、表Aに列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、または85個の存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記膵臓癌に関連した病態が早期膵臓癌である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、病期I期または病期II期の膵臓癌の診断のためのものである、請求項4に記載の方法。
- ステップ(b)が、
(i)表A(I)、例えば、表A(I)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、または5個、
(ii)表A(III)、例えば、表A(III)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
(iii)表A(V)、例えば、表A(V)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、および
(iv)表A(XI)、例えば、表A(XI)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2または3個、
に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項5に記載の方法。 - ステップ(b)が、
(i)表A(II)、例えば、表A(II)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個、
(ii)表A(IV)、例えば、表A(IV)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個、
(iii)表A(VI)、例えば、表A(VI)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個、および
(iv)表A(XII)、例えば、表A(XII)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項5または6に記載の方法。 - 前記方法が、病期I期の膵臓癌の診断のためのものである、請求項4に記載の方法。
- ステップ(b)が、
(i)表A(I)、例えば、表A(I)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、または5個、
(ii)表A(III)、例えば、表A(III)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
(iii)表A(VII)、
に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項8に記載の方法。 - ステップ(b)が、
(i)表A(II)、例えば、表A(II)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個、
(ii)表A(IV)、例えば、表A(IV)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個、および
(iii)表A(VIII)、例えば、表A(VIII)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項8または9に記載の方法。 - 前記方法が、病期II期の膵臓癌の診断のためのものである、請求項4に記載の方法。
- ステップ(b)が、
(iv)表A(I)、例えば、表A(I)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、または5個、
(v)表A(V)、例えば、表A(V)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、または6個、
(vi)表A(IX)、
に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項11に記載の方法。 - ステップ(b)が、
(iv)表A(II)、例えば、表A(II)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個、
(v)表A(VI)、例えば、表A(VI)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個、および
(vi)表A(X)、例えば、表A(X)に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも2、3、または4個、
に列挙される1つ以上のバイオマーカーの存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項11または12に記載の方法。 - 前記膵臓癌に関連した病態が膵臓癌である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)が、CHP−1、MAPKK2、UBP7、PRD14、STAT1、AGAP−2、PGAM5、LUM、PTPROおよびUSP07からなる群から選択される1つ以上のバイオマーカー、例えば、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項14に記載の方法。
- ステップ(b)が、Apo−A1、BTK、C1q、C5、CDK−2、IgM、IL−11、IL−12、IL−6、JAK3、MAPK8、MCP−1、MUC−1、プロパージン、VEGF、C3、ICAM−1、IL−13、ATP−5B、C4、Her2/ErB−2、IL−7、IL−3、IL−8、GM−CSF、IL−9、LDL、およびORP3からなる群から選択される1つ以上のバイオマーカー、例えば、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29個の存在および/または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項14または15に記載の方法。
- ステップ(b)が、表Aに列挙される前記バイオマーカーのうちの全ての存在および/または量を測定することを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- c)i.膵臓癌に罹患していない個体、および/または
ii.膵臓癌に罹患している個体
から、1つ以上の対照試料を提供するステップであって、前記試料が、前記試験試料とは異なる病期のものであった、ステップと、
d)ステップ(b)で測定された前記1つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および/または量を測定することによって、前記1つ以上の対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、
をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ(b)で測定された1つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および/または量が、ステップ(d)で測定された1つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および/または量と異なる場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。 - e)i.膵臓癌に罹患している個体(すなわち、陽性対照)、および/または
ii.膵臓癌に罹患している個体
から、1つ以上の対照試料を提供するステップであって、前記試料が、前記試験試料と同じ病期のものであった、ステップと、
f)ステップ(b)で測定された前記1つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および/または量を測定することによって、前記対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、
をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ(b)で測定された1つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および/または量が、ステップ(f)で測定された1つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および/または量に対応する場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。 - 前記1つ以上の対照試料が得られた前記個体が、前記試料が得られた時点で、非癌性膵臓疾患または病状、例えば、急性膵炎、慢性膵炎および自己免疫性膵炎、ならびに膵臓の膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)に罹患していなかった、請求項18または19に記載の方法。
- 前記1つ以上の対照試料が得られた前記個体が、前記試料が得られた時点で、膵臓のいかなる疾患または病状にも罹患していなかった、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 膵臓癌に罹患していない前記個体が、前記試料が得られた時点で、いかなる疾患または病状にも罹患していなかった、請求項18に記載の方法。
- 膵臓癌に罹患していない前記個体が、健康な個体である、請求項18に記載の方法。
- 膵臓癌に罹患している前記1人以上の個体が、腺癌(例えば、膵管腺癌または管状乳頭状膵臓腺癌)、膵臓肉腫、悪性漿液性嚢腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を有する未分化癌からなる群から選択される膵臓癌に罹患している、請求項18〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記膵臓癌が、膵臓腺癌(例えば、膵管腺癌)である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が反復される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が反復され、ステップ(a)において、試験される前記試料が、前の方法の反復とは異なる時間に採取される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、使用された前の試験試料(複数可)とは異なる期間に採取された試験試料を使用して反復される、請求項26または27に記載の方法。
- 前記方法が、使用された前の試験試料(複数可)に対して1日〜104週間、例えば、1週間〜100週間、1週間〜90週間、1週間〜80週間、1週間〜70週間、1週間〜60週間、1週間〜50週間、1週間〜40週間、1週間〜30週間、1週間〜20週間、1週間〜10週間、1週間〜9週間、1週間〜8週間、1週間〜7週間、1週間〜6週間、1週間〜5週間、1週間〜4週間、1週間〜3週間、または1週間〜2週間の間に採取された試験試料を使用して反復される、請求項27または28に記載の方法。
- 前記方法が、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、15週間、20週間、25週間、30週間、35週間、40週間、45週間、50週間、55週間、60週間、65週間、70週間、75週間、80週間、85週間、90週間、95週間、100週間、104週間、105週間、110週間、115週間、120週間、125週間、および130週間からなる群からの期間毎に採取された試験試料を使用して反復される、請求項27または28に記載の方法。
- 前記方法が、少なくとも1回、例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、21回、22回、23、24回、または25回反復される、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、連続的に反復される、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 膵臓癌が従来の臨床的方法を使用して個体において診断されるまで、前記方法が反復される、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 各反復が、同じ個体から採取された試験試料を使用する、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記1つ以上のバイオマーカー(複数可)のタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することを含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)、(d)、および/またはステップ(f)が、表Aに列挙されるバイオマーカーに結合することが可能な1つ以上の第1の結合剤を使用して実施される、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の結合剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項36に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項37に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、scFv、Fab、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される、請求項37または38に記載の方法。
- 前記第1の結合剤が、表面上に固定化されている、請求項36〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験試料中の前記1つ以上のバイオマーカーが、検出可能な部分で標識される、請求項36〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対照試料(複数可)中の前記1つ以上のバイオマーカーが、検出可能な部分で標識される、請求項36〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択される、請求項41または42に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が、ビオチンである、請求項41または42に記載の方法。
- ステップ(b)、(d)、および/またはステップ(f)が、前記1つ以上のバイオマーカーに結合することが可能な第2の結合剤を含むアッセイを使用して実施され、前記第2の結合剤が、検出可能な部分を含む、請求項36〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の結合剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、scFv、Fab、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される、請求項46または47に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択される、請求項46〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が、蛍光部分(例えば、Alexa Fluor色素、例えば、Alexa647)である、請求項49に記載の方法。
- 前記方法が、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)を含むか、またはそれからなる、請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)、(d)、および/またはステップ(f)が、アレイを使用して実施される、請求項1〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アレイが、ビーズ系アレイである、請求項52に記載の方法。
- 前記アレイが、表面系アレイである、請求項53に記載の方法。
- 前記アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される、請求項52〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、
(i)前記試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識することと、
(ii)前記ビオチン標識タンパク質を、その表面上の別々の位置に固定化された複数のscFvを含むアレイと接触させることであって、scFvが、表Aのタンパク質のうちの1つ以上に対する特異性を有する、接触させることと、
(iii)前記固定化されたscFvを、蛍光色素を含むストレプトアビジン抱合体と接触させることと、
(iv)前記アレイ表面上の別々の位置における前記色素の存在を検出することと、
を含み、
前記アレイ表面上の前記色素の発現が、前記試料中の表IIIからのバイオマーカーの発現を示す、請求項1〜55のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(b)、(d)、および/またはステップ(f)が、前記1つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、cDNA分子またはmRNA分子である、請求項57に記載の方法。
- 前記核酸分子が、mRNA分子である、請求項58に記載の方法。
- ステップ(b)、(d)、および/または(f)において前記1つ以上のバイオマーカー(複数可)の前記発現を測定することが、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素PCR(RT−PCR)、定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィ、および原位置ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して実施される、請求項57、58、または59に記載の方法。
- ステップ(b)において前記1つ以上のバイオマーカー(複数可)の前記発現を測定することが、DNAマイクロアレイを使用して判断される、請求項57〜60のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)、(d)、および/または(f)において前記1つ以上のバイオマーカー(複数可)の前記発現を測定することが、1つ以上の結合部分を使用して実施され、各々が表Aで特定される前記バイオマーカーのうちの1つをコードする核酸分子に選択的に結合することが個々に可能である、請求項57〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の結合部分がそれぞれ、核酸分子を含むか、またはそれからなる、請求項62に記載の方法。
- 前記1つ以上の結合部分がそれぞれ、DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA、またはPMOを含むか、またはそれからなる、請求項63に記載の方法。
- 前記1つ以上の結合部分がそれぞれ、DNAを含むか、またはそれからなる、請求項63または64に記載の方法。
- 前記1つ以上の結合部分が、5〜100ヌクレオチド長である、請求項63〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の核酸分子が、15〜35ヌクレオチド長である、請求項63〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項63〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分(例えば、放射性原子)、および酵素部分からなる群から選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が、放射性原子を含むか、またはそれからなる、請求項69に記載の方法。
- 前記放射性原子が、テクネチウム−99m、ヨウ素−123、ヨウ素−125、ヨウ素−131、インジウム−111、フッ素−19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、リン−32、硫黄−35、重水素、トリチウム、レニウム−186、レニウム−188、およびイットリウム−90からなる群から選択される、請求項70に記載の方法。
- 前記結合部分の前記検出可能な部分が、蛍光部分である、請求項69に記載の方法。
- ステップ(a)、(c)、および/または(e)で提供される前記試料が、未分画血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、乳、胆汁、および尿からなる群から選択される、請求項1〜72のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)、(c)、および/または(e)で提供される前記試料が、未分画血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項73に記載の方法。
- ステップ(a)、(c)、および/または(e)で提供される試料が、血清である、請求項73または74に記載の方法。
- 前記方法の予測精度は、ROC AUC値によって決定される場合、少なくとも0.50、例えば、少なくとも0.55、少なくとも0.60、少なくとも0.65、少なくとも0.70、少なくとも0.75、少なくとも0.80、少なくとも0.85、少なくとも0.90、少なくとも0.95、少なくとも0.96、少なくとも0.97、少なくとも0.98または少なくとも0.99である、請求項1〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法の前記予測精度が、ROC AUC値によって決定される場合、少なくとも0.70である、請求項76に記載の方法。
- 前記個体が膵臓癌と診断された場合、前記方法が、
(g)前記個体に膵臓癌療法を提供するステップ
を含む、請求項1〜77のいずれか1項に記載の方法。 - 前記膵臓癌療法が、外科手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法からなる群から選択される、請求項78に記載の方法。
- 請求項36〜51および64〜72のいずれか1項に定義される1つ以上の結合剤を含む、個体における膵臓癌の存在を判断するためのアレイ。
- 前記1つ以上の結合剤が、表Aに定義される前記タンパク質のうちの全てに結合することが可能である、請求項80に記載のアレイ。
- 個体における膵臓癌の存在を判断するためのバイオマーカーとしての、表Aに定義される群から選択される1つ以上のバイオマーカーの使用。
- 表Aに定義される前記タンパク質のうちの全てが、個体における膵臓癌の存在を判断するための診断マーカーとして使用される、請求項82に記載の使用。
- 個体における膵臓癌の存在を判断するための、請求項36〜51および64〜72のいずれか1項に定義される1つ以上の結合部分の使用。
- 表Aに定義される前記タンパク質のうちの全てに対するバイオマーカーが使用される、請求項84に記載の使用。
- 膵臓癌の存在を判断するためのキットであって、
A)請求項36〜51および64〜72のいずれか1項に定義される1つ以上の結合剤、または請求項80〜81に記載のアレイと、
B)請求項1〜79のいずれか1項に定義される方法を実施するための説明書と、
を含む、キット。 - 個体における膵臓癌を治療する方法であって、
(a)請求項1〜79のいずれか1項に定義される方法に従って、膵臓癌を診断するステップと、
(b)前記個体に膵臓癌療法を提供するステップと、
を含む、方法。 - 前記膵臓癌療法が、外科手術(例えば、切除)、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法からなる群から選択される、請求項87に記載の方法。
- 実質的に本明細書に記載されるような、個体における膵臓癌の存在を判断するための方法または使用。
- 実質的に本明細書に記載されるような、個体における膵臓癌の存在を判断するためのアレイまたはキット。
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