JP2019515904A - 新血管新生に関連する障害を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、新血管新生に関連する障害(例えば、腫瘍関連性新血管新生、例えば眼メラノーマ)および同一物に関連する症状を治療するためのイムノコンジュゲート融合タンパク質が提供される。本方法は、上記患者に1回以上の投与セッションにおいて有効量の本明細書に記載した上記イムノコンジュゲートタンパク質のいずれか1つ以上を含む組成物を投与することを含み、ここで各イムノコンジュゲートは、免疫グロブリンIg Fc二量体にコンジュゲート化された少なくとも1つの変異第VIIa因子(FVIIa)タンパク質を含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2016年4月14日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第62/322,540号に対する優先権の利益を主張するものである。
本出願は、2016年4月14日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第62/322,540号に対する優先権の利益を主張するものである。
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。本配列表を含むテキストファイルの名称は、ICTH_003_01WO_ST25.txtである。本テキストファイルは、168KBであり、2017年4月13日に作成され、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。本配列表を含むテキストファイルの名称は、ICTH_003_01WO_ST25.txtである。本テキストファイルは、168KBであり、2017年4月13日に作成され、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
発明の背景
新血管新生(本明細書では、血管形成と互換的に呼ばれる)は、一般に既存の血管の成長および新規血管の形成に関し、様々な疾患において観察される。新血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移を可能にし、眼の障害における視覚的機能不全を誘発し、炎症性障害において白血球血管外遊出を促進する、および/またはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の転帰に影響を及ぼす。
新血管新生(本明細書では、血管形成と互換的に呼ばれる)は、一般に既存の血管の成長および新規血管の形成に関し、様々な疾患において観察される。新血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移を可能にし、眼の障害における視覚的機能不全を誘発し、炎症性障害において白血球血管外遊出を促進する、および/またはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の転帰に影響を及ぼす。
新血管新生は、成人健常者においては、主として創傷治癒中および所定の再生事象中に極めてまれにのみ発生する。疾患を促進または誘発する新血管新生は、病理的新血管新生と呼ぶことができ、そのような新生血管構造は、病理的新生血管構造(PNV)と呼ぶことができる。PNVは、数種の疾患に固有であり、眼メラノーマを含む固形癌および黒色腫の増殖を促進する発癌性新血管新生を含む。
固形腫瘍の残存および増殖は、支持新生血管構造の発達に決定的に左右される(Folkman,J.(1995)N.Engl.J.Med.333,1757-1763)。腫瘍関連新血管新生は、それが酸素および栄養分を供給するので、癌の進行を支持することに決定的に重要である。新血管新生は、さらに関節リウマチにおいて重要な役割を果たす(Szekanez,Z.,et al.(1998)J.Invest.Med.46,27-41)。新血管新生は、例えば、眼メラノーマや加齢性黄斑変性症(AMD)における、結果として壊滅的な失明を生じさせる大多数の眼の疾患の基礎になっている(Friedlander,M.,et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,9764-9769)。
新血管新生は、脈絡膜、虹彩および毛様体を含む眼球血管膜の黒色腫である眼メラノーマに関与している。小サイズおよび中サイズの眼の腫瘍に対する標準治療法は、典型的には放射線療法である。60%を超える患者が、プラーク放射線療法(小線源療法)または陽子線照射療法のいずれかである何らかの形態の放射線療法を受けている。しかし、放射線療法は高度に侵襲性であり、例えば網膜症、白内障、緑内障および重大な失明などの合併症を引き起こし得る。大きな腫瘍の場合は、腫瘍または眼の外科的切除が実施される場合がある。上記の治療は、いずれも転移性疾患が発生する割合に影響を及ぼさない。眼における局所再発はまれであるが、全ブドウ膜黒色腫のほぼ半数は、主として肝臓での遠隔転移を発生するであろう。
加齢性黄斑変性症(AMD)は、結果として中心視覚の消失を生じさせる斑点の慢性の進行性退行性病理を意味する。新血管AMD(滲出性または「ウエット型」AMDとも呼ばれる)は、工業化された世界において50歳を超える高齢患者における重度の視力喪失および失明の主要な原因である。
組織因子(TF)は、血管内皮細胞上に存在するサイトカイン受容体である。TFは、細胞内末端ドメイン、膜貫通ドメインならびに第VII因子(FVII)および第VIIa因子(FVIIa活性化第VII因子)に対する細胞外結合ドメインを備える内在性膜糖タンパク質である。TFは、血液凝固第VII因子(FVIIa)の活性化形に対する細胞関連受容体として機能する;この複合体の形成は、血液凝固を開始させ、細胞内シグナル伝達を媒介する。TFは、新血管新生およびサイトカイン放出の炎症カスケードのプロセスに関係しており、どちらのプロセスもPNVに含まれている。癌では、TFは、腫瘍増殖、腫瘍血管形成、病原性新血管新生、転移および血栓症を調節することにおける癌増殖の複数の態様において重要な役割を果たす。腫瘍内微小環境では、非形質転換細胞と比較して、TFは、腫瘍細胞、血管細胞、間質細胞および一部の炎症細胞によって過剰発現する。
第VII因子(FVII)は、凝固カスケードにおける血液の凝固を誘発するセリンプロテアーゼ酵素である。典型的なホメオスタシス中、血管構造系の内皮は、その循環リガンドであるFVIIからTFを分離する。内皮障壁の破損は、血管外TFのFVIIへの曝露をもたらすので、したがって凝固カスケードの迅速な活性化を引き起こす。
病理学的新血管新生に関連する障害および疾患、特に癌を治療するための1つのアプローチは、新生血管構造の機能または成長を傷つけることであった。これは、TFを阻害することによって達成され得るが、TFはホメオスタシスにとって決定的に重大な複数の生物学的活性を発揮するので、TFを単純に阻害することは実行可能な薬理学的解決策ではない。マウスにおいてTF遺伝子をノックアウトすることは致死性であり、TFの阻害が大量出血を誘発し得ることは公知である(Chu.Int.J.Inflam.2011.2011:30)。
したがって、低侵襲性であり、耐久性のある利点を提供し、発病を緩徐化する、またはさらなる疾患進行(転移など)を防止さえする、新血管新生(例えば、腫瘍関連新血管新生)に関連する障害を治療するためには、新規な治療戦略に対する未だ満たされていない医学的ニーズがある。本発明は、この必要や他のニーズに対応する。
本明細書において参照された特許、特許出願、特許出願公開、学術論文およびプロトコールは、それらの全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる。
発明の概要
一部の実施形態では、本開示は、2つの二量体化免疫グロブリン(Ig)Fc単量体および変異第VII因子タンパク質を含むイムノコンジュゲートであって、変異第VII因子タンパク質は、Fc単量体の一方にのみ融合しており、変異第VII因子タンパク質は、野生型第VII因子タンパク質と比較して、哺乳動物宿主において減少した凝固反応を示すイムノコンジュゲートに向けられる。また別の実施形態では、変異第VII因子タンパク質は、哺乳動物宿主において凝固反応を示さない。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、Ig Fc単量体と第VII因子タンパク質との間にリンカー配列を含む。一部の実施形態では、Ig Fc単量体は、ヒンジ配列を含む。一部の実施形態では、Ig Fc単量体の1つ以上は、リンカー配列およびヒンジ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーおよび/またはヒンジ配列は、1つ以上のシステインアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、2つの二量体化Ig Fc単量体は、1つ以上のジスルフィド結合によって一緒に連結されている。一部の実施形態では、二量体化Ig Fcは、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、T366Y突然変異を備えるFc単量体およびY407T突然変異を備えるFc単量体を含む、またはT366Y突然変異に対応する突然変異を備えるFc単量体およびY407T突然変異に対応する突然変異を備えるFc単量体を含む。一部の実施形態では、Ig Fc単量体の1つ以上は、配列番号27のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、本開示は、2つの二量体化免疫グロブリン(Ig)Fc単量体および変異第VII因子タンパク質を含むイムノコンジュゲートであって、変異第VII因子タンパク質は、Fc単量体の一方にのみ融合しており、変異第VII因子タンパク質は、野生型第VII因子タンパク質と比較して、哺乳動物宿主において減少した凝固反応を示すイムノコンジュゲートに向けられる。また別の実施形態では、変異第VII因子タンパク質は、哺乳動物宿主において凝固反応を示さない。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、Ig Fc単量体と第VII因子タンパク質との間にリンカー配列を含む。一部の実施形態では、Ig Fc単量体は、ヒンジ配列を含む。一部の実施形態では、Ig Fc単量体の1つ以上は、リンカー配列およびヒンジ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーおよび/またはヒンジ配列は、1つ以上のシステインアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、2つの二量体化Ig Fc単量体は、1つ以上のジスルフィド結合によって一緒に連結されている。一部の実施形態では、二量体化Ig Fcは、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、T366Y突然変異を備えるFc単量体およびY407T突然変異を備えるFc単量体を含む、またはT366Y突然変異に対応する突然変異を備えるFc単量体およびY407T突然変異に対応する突然変異を備えるFc単量体を含む。一部の実施形態では、Ig Fc単量体の1つ以上は、配列番号27のアミノ酸配列からなる。
1つの実施形態では、リンカーの存在は、リンカーが欠如するイムノコンジュゲートと比較して、イムノコンジュゲートの生成収率の増加を生じさせる。1つの実施形態では、Ig Fc単量体は、ヒトIgG Fc単量体である。また別の実施形態では、ヒトIgG Fc単量体は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択される。1つの実施形態では、ヒトIgG Fc単量体は、IgG1のFc単量体である。1つの実施形態では、ヒトIgG Fc単量体は、配列番号13、15、17、26、27、29および31から選択されるアミノ酸配列を含む。1つの実施形態では、変異ヒトFVIIタンパク質は、Lys341またはSer344で単一点突然変異を含む。1つの実施形態では、単一点突然変異は、Lys341からAla341である。1つの実施形態では、単一点突然変異は、Ser344からAla344である。1つの実施形態では、変異ヒトFVIIタンパク質は、Lys341およびSer344で点突然変異を含む。1つの実施形態では、変異ヒトFVIIタンパク質は、Ser344からAla344への点突然変異をさらに含む。1つの実施形態では、変異ヒトFVIIタンパク質は、配列番号12のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、フコシル化、N−グリコシル化、O−グリコシル化または無フコシル化されている。1つの実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号19〜25の任意の1つとの少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。1つの実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号19〜25の任意の1つとの少なくとも2つの保存的アミノ酸置換を備えるアミノ酸配列を含む。1つの実施形態では、リンカーは、少なくとも8個のアミノ酸残基を含む。1つの実施形態では、リンカーは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)アミノ酸配列からなる。1つの実施形態では、リンカーは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)アミノ酸配列の1つ以上のタンデムリピートを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはリンカー配列が欠如する。1つの実施形態では、請求項1〜29のいずれか一項のイムノコンジュゲート。
一部の実施形態では、本開示は、さらにそれを必要とする患者における癌関連新血管新生を減少させるための方法であって、該患者に本開示のイムノコンジュゲートまたは組成物のいずれか1つを投与することを含む方法にさらに向けられる。1つの実施形態では、それを必要とする患者における癌関連新血管新生の進行を緩徐化するための方法であって、該患者に本開示の組成物を投与することを含む方法。
一部の実施形態では、組成物の投与は、それを必要とする患者における新規な癌関連新血管新生を予防するための方法であって、該患者に請求項30に記載の組成物を投与することを含む方法である。1つの実施形態では、組成物の投与は、それを必要とする患者における癌関連新血管新生を逆転させるための方法である。1つの実施形態では、組成物の投与は、それを必要とする患者の眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)を治療するための方法であって、該患者に請求項30に記載の組成物を投与することを含む方法である。一部の実施形態では、ウエット型AMDを治療することは、治療を必要とする患者の眼における脈絡膜血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む。1つの実施形態では、それを必要とする患者の眼における眼性新血管新生を予防する、阻害する、または逆転させるための、該患者に本組成物を投与することを含む方法。1つの実施形態では、それを必要とする患者における腫瘍新血管新生を逆転させるための、該患者に本組成物を投与することを含む方法。1つの実施形態では、新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、新生児網膜症(ROP)または血管新生緑内障と関連する。
1つの実施形態では、新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)または血管新生緑内障に続発性である。1つの実施形態では、新血管新生は、脈絡膜血管新生である。本方法の1つの実施形態では、患者は、眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)であると以前に診断されている。1つの実施形態では、脈絡膜血管新生は、ウエット型AMDに続発性である。1つの実施形態では、患者の眼は、脈絡膜血管新生またはウエット型AMDに対して以前に治療されていない。本方法の1つの実施形態では、患者は、脈絡膜血管形成に対して、抗血管内皮細胞成長因子(VEGF)療法、レーザー療法または手術を用いて以前に治療されている。
1つの実施形態では、本方法は、硝子体内注射、脈絡膜上注射または全身性投与を含む。一部の実施形態では、投与は、複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、複数回の投与セッションは、2回以上、3回以上、4回以上または5回以上の投与セッションを含む。1つの実施形態では、各投与セッションは、約20日間〜約50日間、または約20日間〜約40日間、または約20日間〜約30日間の間隔を空けている。1つの実施形態では、複数回の投与セッションは、12〜24回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本組成物を投与することは、患者の眼内への28日間毎に1回、30日間毎に1回または35日間毎に1回の本組成物の硝子体内注射を含む。1つの実施形態では、投与することは、静脈内投与を含む。1つの実施形態では、本組成物を投与することは、腫瘍内注射を含む。
一部の実施形態では、本組成物の投与は、投与する工程の前の患者の最良矯正視力(BCVA)測定と比較して、BCVA測定において文字の消失が15文字未満であることによって測定されるように、患者が投与する工程の後に彼(または彼女)の視力を実質的に維持することを生じさせる。1つの実施形態では、患者は、投与する工程の前の患者の最良矯正視力(BCVA)測定と比較して、BCVA測定において15文字の増加によって測定されるように、投与する工程に引き続いて患者は視力の改善を経験する。1つの実施形態では、投与する工程に引き続いて、蛍光眼底血管造影法または光干渉断層撮影法によって測定されるように、CNV領域は、投与する工程の前のCNV領域と比較して、患者の眼内では減少する。1つの実施形態では、CNV領域は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%または少なくとも約50%減少する。1つの実施形態では、投与する工程に引き続いて、患者の眼において患者の眼の網膜厚は、治療開始前の眼の網膜厚と比較して減少する。
1つの実施形態では、本組成物の投与は、網膜厚の少なくとも約50μm、少なくとも約100μm、少なくとも約150μm、少なくとも約175μm、少なくとも約200μm、少なくとも約225μmまたは少なくとも約250μmの減少を生じさせる。1つの実施形態では、網膜厚は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%または少なくとも約50%減少する。1つの実施形態では、減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚(CST)、減少した中心点厚(CPT)または減少した中心窩厚(CFT)である。1つの実施形態では、本方法は、各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に患者の眼における眼内圧(IOP)を測定することをさらに含んでいる。1つの実施形態では、本方法は、患者の眼におけるIOPを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の後に約20分間、約30分間、約40分間、約50分間または約1時間測定することをさらに含んでいる。1つの実施形態では、本方法は、患者の眼におけるIOPを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に約20分間、約30分間、約40分間、約50分間または約1時間測定することをさらに含む。1つの実施形態では、IOPは、眼圧測定法によって測定される。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートを投与する本方法は、患者に有効量の新血管新生阻害剤を投与することをさらに含む。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、有効量のイムノコンジュゲートと同一組成物中に存在する。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、有効量のイムノコンジュゲートとは異なる組成物中に存在する。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、血管内皮細胞成長因子(VEGF)阻害剤、VEGF受容体阻害剤、血小板由来成長因子(PDGF)阻害剤またはPDGF受容体阻害剤である。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、ラニビズマブである。1つの実施形態では、ラニビズマブの用量は、約0.2mg〜約1mgである。1つの実施形態では、ラニビズマブの用量は、0.3mgまたは0.5mgである。1つの実施形態では、ラニビズマブは、硝子体内注射によって患者の眼に投与される。1つの実施形態では、有効量の新血管新生阻害剤を含む組成物は、硝子体内注射によって患者の眼に投与される。1つの実施形態では、有効量の新血管新生阻害剤を含む組成物は、複数回の投与セッションのそれぞれで投与される。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート組成物は、1アームドおよび2アームドイムノコンジュゲート両方の混合物であって、1アームドおよび2アームドイムノコンジュゲートは、1:1、1:5、1:10、1:25、1:50、1:100、100:1、50:1、25:1、10:1または5:1の比率で存在する混合物を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート第VII因子タンパク質は、ヒト第VII因子タンパク質である。一部の実施形態では、本開示は、医薬上許容される賦形剤をさらに含むイムノコンジュゲートを含む製剤に向けられる。1つの実施形態では、本製剤は、さらにラニビズマブを含む。1つの実施形態では、本製剤は、さらにアルギニン溶液を含む。1つの実施形態では、本製剤は、次の:HEPES溶液、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ポリソルベート−80およびアルギニン溶液のうちの1つ以上をさらに含む。
一部の実施形態では、癌関連新血管新生には、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、膵臓癌、膀胱癌、肝臓癌、眼メラノーマ、肺癌、子宮内膜癌、胃癌およびリンパ腺癌が関連する。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、同時に投与される。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、連続的に投与される。1つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、アフリベルセプトである。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達における疾患を生じさせる。1つの実施形態では、本組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を2アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも1.5倍以上減少させる。1つの実施形態では、前炎症性サイトカインは、IL−8またはGM−CSFである。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達における疾患を生じさせる。一部の実施形態では、2アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも1.5倍大きい。一部の実施形態では、前炎症性サイトカインは、IL−8またはGM−CSFである。1つの実施形態では、1アームドイムノコンジュゲートの生成は、2アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物を生じさせる。1アームドイムノコンジュゲートを含む組成物であって、ここで本組成物は2アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない。
発明の詳細な説明
用語「1つ」は、1つ以上のその実体を意味する、すなわち複数の指示対象を意味することができる。したがって、用語「1つ」、「1つ以上」および「少なくとも1つ」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「1つ」による「1つの要素」の言及は、その状況が1つの要素が存在する、および1つの要素しか存在しないことを明白に要求していない限り、2つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。
用語「1つ」は、1つ以上のその実体を意味する、すなわち複数の指示対象を意味することができる。したがって、用語「1つ」、「1つ以上」および「少なくとも1つ」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「1つ」による「1つの要素」の言及は、その状況が1つの要素が存在する、および1つの要素しか存在しないことを明白に要求していない限り、2つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。
本明細書の全体を通して「1つの実施形態」、「ある実施形態」、「1つの態様」または「ある態様」との言及は、その実施形態と結び付けて記載された特定の特徴、構造または特性が本開示の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通して様々な場所での語句「1つの実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、必ずしもすべてが同一実施形態を意味している訳ではない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、1つ以上の組合わせで任意の好適な方法で組み合わせることができる。
本明細書の特定の実施形態において使用する用語「約」または「およそ」は、数値に先行する場合は、数値±10%の範囲を示す。
本明細書の特定の実施形態において使用する用語「実質的に含まない」は、95%以上を含まないと理解すべきである。例えば、組成物Xが分子Yを実質的に含まない場合は、組成物Xは、分子Yを少なくとも95%含まないと理解すべきである。組成物Xは、5%未満の分子Yを含有する。
既存血管の異常な成長および新規血管の作製(本明細書では集合的に新血管新生と呼ぶ)は、様々な疾患において観察され、典型的には血管内皮細胞に対する特異的成長因子の放出によって引き起こされる。新血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移を可能にし、眼の障害における視覚的機能不全を誘発し、炎症性障害において白血球血管外遊出を促進する、および/またはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の転帰に影響を及ぼす。
本明細書では、ターゲティングドメイン(変異第VIIa因子(FVIIa)タンパク質;本明細書では互換的にFVIIと呼ばれる)およびエフェクタードメイン(Fcドメイン)を含むイムノコンジュゲート分子が提供されるが、ここでターゲティングドメインおよびエフェクタードメインはコンジュゲート化されている。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、1アームド変異体(本明細書では互換的にICON−1.5と呼ばれる)であり、免疫グロブリン(例えば、IgG)の2Fcエフェクター成分を含むが、ここでFc成分の1つは変異FVIIaにコンジュゲート化されており、2つのIgG Fc単量体は二量体化されている。
本明細書で提供するイムノコンジュゲート分子は、罹患組織、腫瘍および支持間質(例えば、血管構造、浸潤性単核球)中の組織因子(TF)を標的としてそれらに結合し、さらにFc受容体にも結合する。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲート分子は、変異第VII因子タンパク質(本明細書では互換的にFVIIドメインFVII成分と呼ばれる)および2つの免疫グロブリンFcタンパク質(本明細書では互換的にFcドメインFc成分およびFcエフェクター成分と呼ばれる)を含む。他の実施形態では、本イムノコンジュゲート分子は、変異第VII因子タンパク質および免疫グロブリンFcタンパク質の二量体を含む。VIIタンパク質はターゲティングドメインであり、Fcタンパク質はエフェクタードメインであるが、ここで各VIIタンパク質はFcタンパク質にコンジュゲート化されている。単一FVIIタンパク質しか存在しない場合は、FVIIタンパク質はFcタンパク質の一方にのみコンジュゲート化される。イムノコンジュゲート二量体のターゲティングドメインは、変異FVIIaタンパク質を含む。イムノコンジュゲート二量体のエフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンのFcエフェクタードメインを含む。イムノコンジュゲート分子は、二量体化エフェクタードメインにコンジュゲート化された単一ターゲティングドメインを含み得る、または2つのエフェクタードメインにコンジュゲート化された2つのターゲティングドメインを含み得る。
本明細書に提供したように、イムノコンジュゲートはTFに結合するが、凝固カスケードを開始させない、または凝固カスケードの減少した開始を示す。変異FVIIaタンパク質を含むイムノコンジュゲートは、凝固カスケードを開始させるためのFVIIaの正常な役割が発生しないように、または減少させられるように設計される。
本明細書では、アテローム硬化症、関節リウマチ、眼メラノーマ、BRAF突然変異メラノーマ、固形腫瘍、原発性または転移性固形腫瘍(メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、網膜静脈閉塞症(RVO)後の黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)および血管新生緑内障を含むがそれらに限定されない病理学的新血管新生に関連する疾患を有する患者を治療する際にイムノコンジュゲート分子を使用する方法が提供される。
イムノコンジュゲート
本明細書では、罹患組織、腫瘍および支持間質(例えば、血管構造、浸潤性単核球)中の(TF)を標的としてそれらに結合し、さらにFc受容体にも結合するイムノコンジュゲートが提供される。
本明細書では、罹患組織、腫瘍および支持間質(例えば、血管構造、浸潤性単核球)中の(TF)を標的としてそれらに結合し、さらにFc受容体にも結合するイムノコンジュゲートが提供される。
本明細書で記載したイムノコンジュゲートは、ターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを含むが、ここでターゲティングドメインおよびエフェクタードメインはコンジュゲート化されている。1つの実施形態では、エフェクタードメインおよびターゲティングドメインは、ヒンジドメイン(本明細書では、互換的にヒンジ領域、ヒンジ成分または単純にヒンジと呼ばれる)によって一緒にコンジュゲート化されている。以下では、ヒンジについてより詳細に説明する。本明細書で提示するように、一部の実施形態では、エフェクタードメインはヒンジ領域を含んでいる。他の実施形態では、エフェクタードメインは、ヒンジ領域を含んでいない。一部の実施形態では、コンジュゲート化は、さらにリンカーの含有を含む。以下では、リンカーについてより詳細に説明する。イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、変異FVIIaタンパク質(組織因子ターゲティングドメイン)を含む。イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、Ig F1免疫グロブリンのFcエフェクター成分を含む。1つの実施形態では、ターゲティングドメインは、変異ヒトFVIIaタンパク質であり、エフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンのヒトFcエフェクター成分である。また別の実施形態では、ターゲティングドメインは、変異ヒトFVIIaタンパク質であり、エフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンの非ヒトFcエフェクター成分である。1つの実施形態では、ターゲティングドメインは、非変異ヒトFVIIaタンパク質であり、エフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンのヒトFcエフェクター成分である。1つの実施形態では、ターゲティングドメインは、非変異ヒトFVIIaタンパク質であり、エフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンの非ヒト(ターゲティングドメインと同一種由来)Fcエフェクター成分である。1つの実施形態では、ターゲティングドメインは、非変異ヒトFVIIaタンパク質であり、エフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンの非ヒト(ターゲティングドメインの種とは異なる種由来の)Fcエフェクター成分である。一部の実施形態では、Fcは、IgG1以外のイソタイプ由来である。
本明細書に提供したように、イムノコンジュゲートはTFに結合するが、(1)凝固カスケードを開始しない、または(2)凝固カスケードの減少した開始を示す。変異FVIIaタンパク質を含むイムノコンジュゲートは、FVIIaの凝固カスケードを開始させる標準の役割が発生しないように、または減少させられるように設計される。
本明細書で使用する「1つのイムノコンジュゲート」または「複数のイムノコンジュゲート」は、2種のタイプのコンジュゲート化タンパク質または融合タンパク質:(1)変異FVIIタンパク質がFc単量体の一方にのみ融合している、2つの二量体化免疫グロブリン(Ig)Fc単量体および変異FVIIタンパク質を含む1アームドFVII−Fc融合タンパク質であるICON−1.5、および(2)2つの変異FVIIタンパク質に融合した2つの二量体化免疫グロブリン(Ig)Fc単量体を含む2アームドFVII−Fc融合タンパク質であるICON−1を意味する(図1および図2Bを参照)。
ICON−1.5は、例えば非コンジュゲート化FVIIもしくはFc(単量体もしくは二量体)またはFcに融合した単量体FVIIの存在などの不純物を含まない均質な分子として製造される。これに関連して、ICON−1.5の生成は、製造環境における重大な利点を提供し、ICON−1.5ではない関心対象の生成物の数を減少させる。
ICON−1.5は、ICON−1と比較して自己会合する傾向が低いため、結果として容易な操作性が生じる。ICON−1.5およびICON−1は、以下でより詳細に提示するように、類似の程度の(1)結合とADCC活性、および(2)FXa変換率を共有する。
一部の実施形態では、1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートは、サイトカインシグナル伝達に2アームドICON1−1より実質的に大きな阻害作用を示す。一部の実施形態では、1アームドイムノコンジュゲートの投与は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させる。一部の実施形態では、1アームドイムノコンジュゲートの投与は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を2アームドイムノコンジュゲートが前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させるよりも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50または100倍超減少させる。一部の実施形態では、1アームドイムノコンジュゲートの投与は、2アームドイムノコンジュゲートが前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させるよりも約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約50または約100倍超減少させる。
1つの典型的な実施形態では、前炎症性サイトカインは、IL−8である。また別の典型的な実施形態では、前炎症性サイトカインは、GM−CSFである。
一部の実施形態では、Fc領域には、天然ヒンジ領域が含まれ、イムノコンジュゲートは、FVIIタンパク質とFc領域のヒンジ領域との間に直接的に融合している。他の実施形態では、FVII−Fcイムノコンジュゲートは、リンカー領域によって分離されている。一部の実施形態では、ヒンジ領域および/またはリンカー領域は、イムノコンジュゲートには存在しない。
図1および図2Aは、2アームドFVII−Fcタンパク質の多数の非限定的実施形態の一般的構造を提供しており、他方図2Bは、1アームドFVII−Fcタンパク質の多数の非限定的実施形態の一般的構造を提供している。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、癌細胞上で発現したTFに結合する。さらに別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、癌細胞またはTFを過剰発現もしくは異所性で発現する他の細胞に結合する。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション(glypiation)、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化(butrylation)、γ−カルボキシル化、グリコシル化(N−グリコシル化、O−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化)、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれるがそれらに限定されない。
一部の実施形態では、患者に投与する際に利用される本開示の組成物には、1アームドイムノコンジュゲートおよび2アームドイムノコンジュゲート両方が含まれる。一部の実施形態では、本組成物は、約1:1000、1:900、1:800、1:700、1:600、1:500、1:400、1:300、1:200、1:150、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:65、1:60、1:55、1:50、1:45、1:40、1:35、1:30、1:25、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2または1:1の比率で1アームドイムノコンジュゲートおよび2アームドイムノコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、本組成物は、約1:1000、1:900、1:800、1:700、1:600、1:500、1:400、1:300、1:200、1:150、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:65、1:60、1:55、1:50、1:45、1:40、1:35、1:30、1:25、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2または1:1の比率で2アームドイムノコンジュゲートおよび1アームドイムノコンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、本組成物は、2アームドイムノコンジュゲートの存在量と比較して、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約31%、約32%、約33%、約34%、約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約41%、約42%、約43%、約44%、約45%、約46%、約47%、約48%、約49%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%の相対存在量で1アームドイムノコンジュゲートを含む。
全体を通して提供されるように、本明細書に記載した実施形態では、変異第VIIa因子ドメインを含組織因子ターゲティングドメインを含むイムノコンジュゲートが提供される。ターゲティングドメインは、組織因子への結合親和性を低下させることなく凝固経路の開始を阻害(または減少)させるために突然変異させられている変異第VIIa因子を含む。1つの実施形態では、ヒト第VIIa因子における突然変異は、残基341での単一点突然変異である。また別の実施形態では、ヒト第VIIa因子における突然変異はLys341からAla341である。変異第VIIa因子が非ヒト種由来である他の実施形態では、ヒト第VIIa因子の残基341での突然変異に対応する突然変異を含み得る。本明細書に提供したイムノコンジュゲートには、凝固経路を阻害する他の突然変異が含まれる。変異第VIIa因子ドメイン(TFターゲティングドメインとも呼ばれる)は、本明細書に提供した態様では、組織因子に高度の親和性および特異性で結合するが、組織因子結合に通常は関連する凝固を開始しない、または凝固を最小限に抑える。
本明細書に提供したイムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、IgG1免疫グロブリンのFcエフェクター成分を含む。1つの実施形態では、エフェクタードメインは、補体経路およびナチュラルキラー(NK)細胞の細胞毒性経路の両方を媒介する。1つの実施形態では、例えばNK細胞およびマクロファージなどの免疫細胞の細胞毒性は、免疫系の細胞上に存在するFc受容体に結合するとFcエフェクター成分を活性化することによって活性化される。IgG1 Fcエフェクタードメインは、ナチュラルキラー(NK)細胞経路および補体経路によって、イムノコンジュゲートに結合する細胞に対して溶解反応を引き起こす。1つの実施形態では、IgG1 Fcエフェクタードメインは、IgG1 Fc領域のCH2領域およびCH3領域の両方を含む。
FVIIaとTFとの間の反応は、種特異的である(Janson et al.,1984;Schreiber et al.,2005;Peterson et al.,2005):マウスFVIIは、ウサギ、ブタおよびヒトを含む多数の異種において活性であると思われるが、他方ヒトFVIIaは、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウサギおよびブタにおいて明らかに活性である。これとは逆に、ヒトIgG Fcドメインは、ヒトおよびマウスの両方において活性である。したがって、患者に依存して、イムノコンジュゲートは、対応する種に由来する、またはその患者において活性であることが公知である種に由来するターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを使用して構築される。例えば、本明細書に提供したヒトのための治療では、突然変異組織因子ターゲティングドメインは、ヒトIgG1免疫グロブリンのFC領域を含むエフェクタードメインにコンジュゲート化したヒト第VIIa因子に由来し得る。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約0.01、約0.05、約0.1、約0.15、約0.2、約0.25、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24もしくは約25mMのHEPESまたは他の医薬上許容されるバッファーを含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25mMのHEPESまたは他の医薬上許容されるバッファーを含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155、約160、約175、約180、約185、約190、約195、約200、約205、約210、約215または約220mMのNaClを含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、175、180、185、190、195、200、205、210、215または220mMのNaClを含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70もしくは約75mMのアルギニン、グリシン、ヒスチジンまたは任意の天然型アミノ酸を含む組成物中に存在する。一部の実施形態では、本組成物は、アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンの組合わせを含む。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70もしくは75mMのアルギニン、グリシン、ヒスチジンおよび/または任意の天然型アミノ酸を含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約7.0、約7.05、約7.10、約7.15、約7.2、約7.25、約7.3、約7.35、約7.4、約7.45、約7.5、約7.55、約7.6、約7.65、約7.7、約7.75または7.75のpHを備える組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、7.0、7.05、7.10、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45、7.5、7.55、7.6、7.65、7.7、7.75または7.75のpHを備える組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約0.001%、約0.0015%、約0.002%、約0.0025%、約0.003%、約0.0035%、約0.004%、約0.0045%、約0.005%、約0.0055%、約0.006%、約0.0065%、約0.007%、約0.0075%、約0.0085%、約0.009%、約0.0095%、約0.01%、約0.015%、約0.02%、約0.025%、約0.03%、約0.035%、約0.04%、約0.045%または約0.05%のポリソルベート−80を含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、0.001%、0.0015%、0.002%、0.0025%、0.003%、0.0035%、0.004%、0.0045%、0.005%、0.0055%、0.006%、0.0065%、0.007%、0.0075%、0.0085%、0.009%、0.0095%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%または0.05%のポリソルベート−80を含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約0.05、約0.1、約0.15、約0.2、約0.25、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、約0.65、約0.7、約0.75、約0.8、約0.85、約0.9、約0.95、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19または約20CaCl2を含む組成物中に存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20CaCl2を含む組成物中に存在する。
組織因子(TF)
TFは、セリンプロテアーゼ第VIIa因子に対する細胞表面受容体である。TFは、細胞および生物レベルでの様々な機能に関係しているが、TFは、血液凝固において果たす役割について最も広く知られている。第VIIa因子と複合体形成したTFは、第IX因子を活性化し、第X因子の変換を触媒して凝固の一般的経路のために不可欠なプロテアーゼである第Xa因子を活性化する。TFは、多数のタイプの癌によって発現する。TF依存性活性化は、癌関連性血栓症および転移に関係付けられてきた。凝血促進活性を有することに加えて、TFは、細胞シグナル伝達特性を有する。腫瘍細胞の表面上でのTF活性化FVII複合体の形成は、Gタンパク質結合受容体PAR2の切断および活性化を引き起こす。TF−FVIIa−PAR2シグナル伝達経路は、腫瘍増殖を促進する。Van den Berg.2012.Blood.119(4):924-932およびKasthuri.2009.J.Clin.Oncol.27(29):4834-4838)を参照されたい。
TFは、セリンプロテアーゼ第VIIa因子に対する細胞表面受容体である。TFは、細胞および生物レベルでの様々な機能に関係しているが、TFは、血液凝固において果たす役割について最も広く知られている。第VIIa因子と複合体形成したTFは、第IX因子を活性化し、第X因子の変換を触媒して凝固の一般的経路のために不可欠なプロテアーゼである第Xa因子を活性化する。TFは、多数のタイプの癌によって発現する。TF依存性活性化は、癌関連性血栓症および転移に関係付けられてきた。凝血促進活性を有することに加えて、TFは、細胞シグナル伝達特性を有する。腫瘍細胞の表面上でのTF活性化FVII複合体の形成は、Gタンパク質結合受容体PAR2の切断および活性化を引き起こす。TF−FVIIa−PAR2シグナル伝達経路は、腫瘍増殖を促進する。Van den Berg.2012.Blood.119(4):924-932およびKasthuri.2009.J.Clin.Oncol.27(29):4834-4838)を参照されたい。
本発明の1つの態様では、例えば癌、血行性転移、癌関連性血栓塞栓症などのTFの異所性発現に関連する疾患または障害を有する患者を治療するための方法が提供される。本明細書に記載するように、投与は、療法に関係する疾患または障害のタイプに依存して、局所的または全身性であってよい。
第VII因子(FVII)
時々はTFターゲティングドメインとも呼ばれる第VII因子(FVII)は、TFに高度の親和性および特異性で結合する。FVIIは、凝固カスケードにおいて血液が凝固するのを誘発するタンパク質の1つである。FVIIは、TFに結合して活性化し、順に凝固カスケードを開始させることによって、凝固カスケードの開始に関係している。FVIIへの所定の突然変異は、TFに結合する能力を維持するが、凝固を開始させない、または非突然変異形と比較して、通常はTFに結合することに関連する凝固を示さないFVIIを生じさせ得る。
時々はTFターゲティングドメインとも呼ばれる第VII因子(FVII)は、TFに高度の親和性および特異性で結合する。FVIIは、凝固カスケードにおいて血液が凝固するのを誘発するタンパク質の1つである。FVIIは、TFに結合して活性化し、順に凝固カスケードを開始させることによって、凝固カスケードの開始に関係している。FVIIへの所定の突然変異は、TFに結合する能力を維持するが、凝固を開始させない、または非突然変異形と比較して、通常はTFに結合することに関連する凝固を示さないFVIIを生じさせ得る。
FVIIとTFとの間の反応は、種特異的であると報告されている(Janson et al.,1984;Schreiber et al.,2005;Peterson et al.,2005)。マウスFVIIは、ウサギ、ブタおよびヒトを含む多数の異種において活性であると思われるが、他方ヒトFVIIはヒト、イヌ、ウサギおよびブタにおいて明らかに活性であると報告されてきた。したがって、患者に依存して、イムノコンジュゲートは、対応する種に由来する、またはその患者において活性であることが公知である種に由来するターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを使用して構築される。例えば、本明細書に提供したヒトの治療方法では、突然変異組織因子ターゲティングドメインは、ヒトIgG1免疫グロブリンのFC領域を含むエフェクタードメインにコンジュゲート化したヒト第VII因子に由来してよい。例えば、1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの変異FVII成分は、配列番号34のアミノ酸配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、リンカーおよび/またはヒンジ領域を介してエフェクタードメイン(ヒトIgG1 Fc)に結合したターゲティングドメイン(変異FVIIドメイン)を含む。
一部の実施形態では、ターゲティングドメインは、組織因子への結合親和性を低下させることなく凝固経路の開始を阻害するために変異させられている変異第VII因子を含む。1つの実施形態では、第VII因子における突然変異は、残基341での単一点突然変異である。また別の実施形態では、突然変異はLys341からAla341である。また別の実施形態では、突然変異はSer344からAla344である。しかし、凝固経路を阻害する他の突然変異は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートに含まれている。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートはFVIIを含み、FVIIは重鎖および軽鎖を含む。1つの実施形態では、FVIIは、重鎖しか含まない。また別の実施形態では、FVIIは、重鎖の断片からなる。1つの実施形態では、FVIIは、軽鎖しか含まない。また別の実施形態では、FVIIは、軽鎖の断片からなる。一部の実施形態では、軽鎖断片は、FVII軽鎖のアミノ酸残基1〜120、1〜125、1〜130、1〜135、1〜140、1〜150、1〜155、1〜160、1〜165、1〜170からなる。一部の実施形態では、軽鎖断片は、アミノ酸残基1〜145、1〜146、1〜147、1〜148、1〜149、1〜150、1〜151、1〜152、1〜153、1〜154、1〜155、1〜156、1〜157、1〜158、1〜159または1〜160からなる。
一部の実施形態では、本開示の1アームドおよび2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、NCBIアクセッション番号AF272774によってコードされた野生型第VIIドメインもしくは第VIIドメインを含むイムノコンジュゲートまたはそれらの組成物と比較して、インビトロまたはインビボで減少した凝固反応を示す。一部の実施形態では、本開示の1アームドおよび2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、インビトロまたはインビボの凝固反応を示さない。
一部の実施形態では、FVIIは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション(glypiation)、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化(butrylation)、γ−カルボキシル化、グリコシル化(N−グリコシル化、O−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化)、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれる。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号12、配列番号33または配列番号34から選択されるFVIIターゲティングドメインを含み得る。
Fcタンパク質
断片結晶化可能(Fc)タンパク質は、一般に抗体テイル領域を含む抗体断片である。Fcタンパク質は、補体系の細胞表面受容体(Fc受容体)およびタンパク質と自然に相互作用し、この特性はFc領域が宿主免疫系を活性化することを可能にする。イムノコンジュゲートの免疫グロブリンFcエフェクタードメインは、イムノコンジュゲートに結合する細胞に対する細胞溶解反応を引き起こし得る。細胞溶解反応は、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞および補体経路によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、Fcエフェクタードメインは、CH2領域およびCH3領域の両方を含む。一部の実施形態では、Fcエフェクタードメインは、CH2領域しか含まない。一部の実施形態では、Fcエフェクタードメインは、CH3領域しか含まない。一部の実施形態では、Fcは、また別の免疫グロブリン、すなわちIgM、IgE、IgAなど由来である。一部の実施形態では、IgG Fc領域は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートにおいて改変されている。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号13を含む。1つの実施形態では、IgG Fcは、配列番号13と比較してprotA突然変異を含む配列番号14を含む。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号13と比較してT366Y突然変異を含む配列番号15を含む。FcのT366Y突然変異は、ノブ突然変異と呼ばれる。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号13と比較してY407T突然変異を含む配列番号17を含む。FcのY407T突然変異は、ホール突然変異と呼ばれる。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32を含む。発現した場合にノブ/ホールFcヘテロ二量体を含むイムノコンジュゲートを一緒に作製するノブおよびホール突然変異は、イムノコンジュゲート分子を含有する完全に形成されたFcの増加した収率を生じさせる。Ridgway et al.(1996.Protein Engineering.9(7):617-621)を参照されたい。一部の実施形態では、S354CまたはT366Wは実行可能なノブ突然変異であり、Y349C、T366S、L368AおよびY407Vは実行可能なホール突然変異である。上述のノブおよびホール突然変異は、増加した安定性によって収率に寄与するが、Klein et al.(2012.MAbs.4(6):653-663)は、Fcを安定化させるための追加の改変について説明している。特異的参照残基の非存在下では、ホール突然変異についての言及はY407Tであると解釈すべきであり、ノブ突然変異についての言及はT366Yであると解釈すべきである。さらに、他のFc変異体における残基番号は異なる可能性があり、それらの場合にはY407(ホール突然変異の場合)およびT366(ノブ突然変異の場合)に対応する残基が言及されている。
断片結晶化可能(Fc)タンパク質は、一般に抗体テイル領域を含む抗体断片である。Fcタンパク質は、補体系の細胞表面受容体(Fc受容体)およびタンパク質と自然に相互作用し、この特性はFc領域が宿主免疫系を活性化することを可能にする。イムノコンジュゲートの免疫グロブリンFcエフェクタードメインは、イムノコンジュゲートに結合する細胞に対する細胞溶解反応を引き起こし得る。細胞溶解反応は、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞および補体経路によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、Fcエフェクタードメインは、CH2領域およびCH3領域の両方を含む。一部の実施形態では、Fcエフェクタードメインは、CH2領域しか含まない。一部の実施形態では、Fcエフェクタードメインは、CH3領域しか含まない。一部の実施形態では、Fcは、また別の免疫グロブリン、すなわちIgM、IgE、IgAなど由来である。一部の実施形態では、IgG Fc領域は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートにおいて改変されている。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号13を含む。1つの実施形態では、IgG Fcは、配列番号13と比較してprotA突然変異を含む配列番号14を含む。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号13と比較してT366Y突然変異を含む配列番号15を含む。FcのT366Y突然変異は、ノブ突然変異と呼ばれる。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号13と比較してY407T突然変異を含む配列番号17を含む。FcのY407T突然変異は、ホール突然変異と呼ばれる。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32を含む。発現した場合にノブ/ホールFcヘテロ二量体を含むイムノコンジュゲートを一緒に作製するノブおよびホール突然変異は、イムノコンジュゲート分子を含有する完全に形成されたFcの増加した収率を生じさせる。Ridgway et al.(1996.Protein Engineering.9(7):617-621)を参照されたい。一部の実施形態では、S354CまたはT366Wは実行可能なノブ突然変異であり、Y349C、T366S、L368AおよびY407Vは実行可能なホール突然変異である。上述のノブおよびホール突然変異は、増加した安定性によって収率に寄与するが、Klein et al.(2012.MAbs.4(6):653-663)は、Fcを安定化させるための追加の改変について説明している。特異的参照残基の非存在下では、ホール突然変異についての言及はY407Tであると解釈すべきであり、ノブ突然変異についての言及はT366Yであると解釈すべきである。さらに、他のFc変異体における残基番号は異なる可能性があり、それらの場合にはY407(ホール突然変異の場合)およびT366(ノブ突然変異の場合)に対応する残基が言及されている。
1つの実施形態では、IgG Fc領域は、protA突然変異を含む配列番号14または配列番号28を含む。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、T366Yノブ突然変異およびprotA突然変異を含む配列番号16または配列番号30を含む。1つの実施形態では、IgG Fc領域は、Y407Tホール突然変異およびprotA突然変異を含む配列番号18または配列番号32を含む。ノブおよびホールを含む他の突然変異ならびにエフェクター機能を変化させる、または改良する突然変異は、イムノコンジュゲートにおいて使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートのIgG Fc領域を含むエフェクタードメインは、補体経路およびナチュラルキラー(NK)細胞の細胞毒性経路の両方を媒介する。
一部の実施形態では、IgG1 Fc領域は、IgG2、IgG3またはIgG4領域と置換される。一部の実施形態では、IgG1 Fc領域とまた別のIgG Fc領域との置換は、エフェクター機能を調節する。一部の実施形態では、IgG1 Fc領域とまた別のIgG Fc領域との置換は、エフェクター機能における増加を誘発する。一部の実施形態では、IgG1 Fc領域とまた別のIgG Fc領域との置換は、エフェクター機能における減少を誘発する。一部の実施形態では、IgG1 Fc領域とまた別のIgG Fcとの置換は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)の調節を生じさせる。一部の実施形態ではFc二量体はホモ二量体であり、他の実施形態では、Fc二量体はヘテロ二量体である。
一部の実施形態では、IgG Fcは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション(glypiation)、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化(butrylation)、γ−カルボキシル化、グリコシル化(N−グリコシル化、O−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化)、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれる。他の実施形態では、IgG Fcはフコシル化が除去されるように改変される。また別の実施形態では、Fcのフコシル化の除去は、エフェクター機能を増加させる。
1つの実施形態では、二量体のFc単量体の一方で発生するノブ突然変異(配列番号15または29)および他方のFc単量体において発生するホール突然変異(配列番号17または31)を備える二量体のIgG Fc領域は、相補的ノブ−ホール突然変異体であるように遺伝子操作した(1つの実施形態については図5を参照されたい)。1つの実施形態では、接合ノブ−ホールFc突然変異体の使用は、結果として2アームドコンジュゲートと比較して1アームドイムノコンジュゲートの優先的な生成を生じさせる。米国特許第5,731,168号を参照されたい。一部の実施形態では、Fc単独(FVII融合なし)二量体の除去を容易にするために、プロテインA突然変異はFc、Fcノブ突然変異体、Fcホール突然変異体に遺伝子操作される。米国特許第8,586,713号を参照されたい。
一部の実施形態では、二段階精製戦略:(1)一般に使用されるMabSelect SuRe樹脂を用いるプロテインA捕捉工程、その後の(2)2アームドホモ二量体およびFc単独ホモ二量体を除去するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)またはアニオン交換クロマトグラフィーが利用される。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32から選択されるIgG Fcエフェクタードメインを含み得る。
ヒンジ領域
免疫グロブリンのヒンジ領域は、ジスルフィド結合によって重鎖を一緒に連結するための起支点である免疫グロブリンの重鎖内の柔軟性アミノ酸ストレッチである。ヒンジ領域は、安定性および/または柔軟性を増加もしくは減少させるために調節され得る特性である、安定性および柔軟性の両方を付与する構造である。それらの結合特性に影響を及ぼすことなくイムノコンジュゲートの製造性の容易さを改良するためには、ヒンジ領域を改変することができる。IgG1のヒンジ領域は、IgG Fc領域の二量体化を生じさせる1つ以上のジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号19〜25のいずれか1つを含む。典型的なIgヒンジ領域については、国際公開第2012123586A1号を参照されたい。
免疫グロブリンのヒンジ領域は、ジスルフィド結合によって重鎖を一緒に連結するための起支点である免疫グロブリンの重鎖内の柔軟性アミノ酸ストレッチである。ヒンジ領域は、安定性および/または柔軟性を増加もしくは減少させるために調節され得る特性である、安定性および柔軟性の両方を付与する構造である。それらの結合特性に影響を及ぼすことなくイムノコンジュゲートの製造性の容易さを改良するためには、ヒンジ領域を改変することができる。IgG1のヒンジ領域は、IgG Fc領域の二量体化を生じさせる1つ以上のジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号19〜25のいずれか1つを含む。典型的なIgヒンジ領域については、国際公開第2012123586A1号を参照されたい。
1つの実施形態では、ヒンジ領域は、天然型である。また別の実施形態では、ヒンジ領域は、非天然型である。1つの実施形態では、ヒト起源である。1つの実施形態では、IgG1免疫グロブリンのヒンジ領域、例えばヒトIgG1免疫グロブリンのヒンジ領域は、本明細書に記載したイムノコンジュゲート内でFVII領域をFc領域に連結させるために利用される。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのヒンジ領域は、IgG1ヒンジ領域、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(配列番号21)である。一部の実施形態では、ヒンジは、配列番号19〜25のいずれか1つから選択される。1つの実施形態では、天然IgG Fcヒンジ領域は、本開示のIgG FcのN末端部分として含まれている。
一部の実施形態では、ヒンジ領域には、(例えば、図1および2に描出されたように)モノマー鎖間で1つ以上のジスルフィド結合を形成する1つ以上のシステインアミノ酸が含まれる。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、改変されている。理論によって拘束されることを望まなくても、そのような改変はイムノコンジュゲートの収率に役立ち得ると考えられる。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートのヒンジ領域は、その間に領域の柔軟性を維持しながら、TcまたはFc受容体への結合特性に影響を及ぼすことなくイムノコンジュゲートの製造性を改良するために変化させられる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ配列が欠如する。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、配列番号8〜11および19〜25のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%または少なくとも約95%の配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、保存アミノ酸置換を含むが、ここで少なくとも1つのアミノ酸残基は、同一クラスでは他のアミノ酸残基と置換されるが、ここでアミノ酸は、次の非極性:Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met;酸性:Asp、Glu;塩基性:Lys、Arg、His;中性:Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyrのように、非極性、酸性、塩基性および中性クラスに分類される。また別の実施形態では、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個または少なくとも10個の保存アミノ酸残基が同一クラス内で他のアミノ酸残基と置換される。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、作製される非保存アミノ酸置換を含むが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されず、塩基性アミノ酸と中性または非極性アミノ酸との置換である。また別の実施形態では、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個または少なくとも10個の非保存アミノ酸残基が置換されるが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されない。また別の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、保存アミノ酸置換および非保存アミノ酸置換の両方で置換される。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、長さが少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個または少なくとも30個のアミノ酸残基である。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、N末端および/またはC末端天然型ヒンジ配列から少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個もしくは少なくとも6個の残基の欠失を有する。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、N末端および/またはC末端天然型ヒンジから少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個もしくは少なくとも6個の残基の付加を有する。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ領域が欠如し、FcおよびFVIIのヒンジのない部分を含む。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ領域が欠如し、Fc、FVIIおよびこれら2つの間のリンカーのヒンジのない部分を含む。一部の実施形態では、他の手段によって二量体化を維持するためのジスルフィド結合が達成される。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号19〜25のいずれか1つを含み得る。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ配列が欠如する。
リンカー領域
イムノコンジュゲートのリンカー領域は、FVIIとFcとの間の架橋またはコンジュゲート化点として機能する。リンカー領域の組成物は、イムノコンジュゲートの製造の容易さならびに安定性および柔軟性において役割を果たす。リンカー組成物を調節することは、イムノコンジュゲートの結合特性に影響を及ぼすことなく実施することができる。
イムノコンジュゲートのリンカー領域は、FVIIとFcとの間の架橋またはコンジュゲート化点として機能する。リンカー領域の組成物は、イムノコンジュゲートの製造の容易さならびに安定性および柔軟性において役割を果たす。リンカー組成物を調節することは、イムノコンジュゲートの結合特性に影響を及ぼすことなく実施することができる。
一部の実施形態では、リンカー領域は、イムノコンジュゲート中でFVIIタンパク質とFc領域との間で発生する。一部の実施形態では、リンカー領域は、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)の1つ以上を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはリンカー領域が欠如する。
一部の実施形態では、リンカーは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)のリンカー領域は改変されている。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカー領域は、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)と少なくとも25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%共有する。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは保存アミノ酸置換を含むが、ここで少なくとも1つのアミノ酸残基は、同一クラス内で他のアミノ酸残基と置換されるが、ここでアミノ酸は、次の非極性:Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met;酸性:Asp、Glu;塩基性:Lys、Arg、His;中性:Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyrのように、非極性、酸性、塩基性および中性クラスに分類される。また別の実施形態では、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個または少なくとも10個の保存アミノ酸残基が同一クラス内で他のアミノ酸残基と置換される。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、作製された非保存アミノ酸置換を含むが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されず、塩基性アミノ酸と中性または非極性アミノ酸との置換である。また別の実施形態では、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個または少なくとも10個の非保存アミノ酸残基が置換されるが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されない。また別の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、保存アミノ酸置換および非保存アミノ酸置換の両方で置換される。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個または少なくとも30個のアミノ酸残基である。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、N末端および/またはC末端から少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個もしくは少なくとも6個の残基の欠失を有する。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、N末端および/またはC末端から少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個もしくは少なくとも6個の残基の付加を有する。
一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10リピートのGSA、GGGおよび/またはGGSS(配列番号11)を含み得る。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)を含むリンカー領域を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはリンカー領域が欠如する。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)の1つ以上のリピートを含む。
典型的なイムノコンジュゲート
本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の成分についての典型的な配列は、表1に提供した。表2Aおよび2Bは、典型的なイムノコンジュゲートを提供する;これらの典型的なイムノコンジュゲートは、本開示の範囲内に提示したイムノコンジュゲートの属を決して制限しない。
本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の成分についての典型的な配列は、表1に提供した。表2Aおよび2Bは、典型的なイムノコンジュゲートを提供する;これらの典型的なイムノコンジュゲートは、本開示の範囲内に提示したイムノコンジュゲートの属を決して制限しない。
本明細書に記載した1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号4のタンパク質である、またはそれを含む。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号4のタンパク質である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号6または7の配列によってコードされる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号4のタンパク質である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、配列番号4の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号5のタンパク質である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、配列番号5の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号1、2、12、33もしくは34から選択されたFVIIおよび配列番号26〜32から選択されたFcである、またはそれらを含むが、ここでヒンジはFcをFvから分離し、ヒンジは配列番号19〜25の1つから選択される。1つの実施形態では、リンカーは、FVIIをヒンジから分離する。1つの実施形態では、リンカーは、FVIIをFcから分離する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号1の配列である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号1の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号2の配列である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号2の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号12の配列である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号12の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号33の配列である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号33の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号34の配列である、またはそれを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号34の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号13の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクターは、配列番号13の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号14の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号14の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号15の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号15の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号16の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号16の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号17の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号17の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号18の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号18の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号26の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号26の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号27の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号27の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号28の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号28の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号29の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号29の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号30の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号30の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号31の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号31の配列からなる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号32の配列を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号32の配列からなる。
1つの実施形態では、配列番号12の配列を含むターゲティングドメインはエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)にコンジュゲート化されており、ここでエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18の配列を含む。
1つの実施形態では、配列番号33の配列を含むターゲティングドメインはエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)にコンジュゲート化されており、ここでエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18の配列を含む。
1つの実施形態では、配列番号34の配列を含むターゲティングドメインはエフェクタードメインにコンジュゲート化されており、ここでエフェクタードメインは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18の配列を含む。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの要素はエフェクタードメインのいずれか1つをターゲティングドメインのいずれか1つにコンジュゲート化され得ることが企図されるようにモジュール式であるが、ここでリンカー配列のいずれかがエフェクタードメインをターゲティングドメインから分離することができる。一部の実施形態では、ヒンジ配列はFcをFVIIから分離することができる、またはリンカーをFcから分離することができる。
イムノコンジュゲートの生成
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートを生成する方法は、例えばBHK細胞などの哺乳動物細胞内での発現が含まれる。また別の実施形態では、細胞系は、HEK293細胞、CHOおよびSP2/0を含み得る。2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、表2Aに記載した発現構築物の哺乳動物発現によって生成され得る。1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、表2Bに記載した発現構築物の共発現によって生成される。2アームド分子および無アームドFc分子もまた含有し得る細胞培養上清から1アームド分子を生成するためには、2段階精製プロセスを利用し得る。一部の実施形態では、1アームドもしくは2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、融合タンパク質(FVII−Fc)として生成される、または化学的コンジュゲートとして生成される。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートを生成する方法は、例えばBHK細胞などの哺乳動物細胞内での発現が含まれる。また別の実施形態では、細胞系は、HEK293細胞、CHOおよびSP2/0を含み得る。2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、表2Aに記載した発現構築物の哺乳動物発現によって生成され得る。1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、表2Bに記載した発現構築物の共発現によって生成される。2アームド分子および無アームドFc分子もまた含有し得る細胞培養上清から1アームド分子を生成するためには、2段階精製プロセスを利用し得る。一部の実施形態では、1アームドもしくは2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートは、融合タンパク質(FVII−Fc)として生成される、または化学的コンジュゲートとして生成される。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートの生成は、宿主細胞を感染させるウイルスベクターからの一過性発現を経由する。他の実施形態では、本イムノコンジュゲートの生成は、宿主細胞ゲノム内の安定性に形質転換された発現ベクターの発現を経由する。
一部の実施形態では、ICON−1.5イムノコンジュゲートを生成するためには、配列番号35〜59の配列の1つ以上を利用することができる。
一部の実施形態では、1アームドイムノコンジュゲートの生成は、2アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物を生じさせる。一部の実施形態では、2アームドイムノコンジュゲートの生成は、1アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物を生じさせる。一部の実施形態では、1アームドイムノコンジュゲートを含む組成物または製剤は、2アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない。一部の実施形態では、2アームドイムノコンジュゲートを含む組成物または製剤は、1アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない。
1アームドイムノコンジュゲートの発現は、2つのオープンリーディングフレームの利用を含む。第1オープンリーディングフレーム(FVII−Fc発現構築物)は、リンカー領域を伴う、または伴わないウィンフレーム、ヒトIgG1ヒンジ配列を伴う、または伴わない変異FVII配列およびヒトIgG1 Fc領域(配列番号27)をコードする。第2オープンリーディングフレーム(Fc単独発現構築物)は、ヒトIgG1ヒンジおよびFc配列(配列番号26)をコードする。一過性トランスフェクションのためには、オープンリーディングフレームの発現は、例えばBHK21細胞、CHO−S細胞およびHEK293細胞などの哺乳動物発現宿主中での発現を可能にする哺乳動物プロモーター配列を用いて実施される。
1アームドイムノコンジュゲートは、対応する供給業者のトランスフェクションプロトコールを使用してExpiCHOまたはExpi293細胞の一過性トランスフェクションによって生成され得る(カタログ番号A29133およびA14635;ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)。製造業者が推奨した細胞密度および生存能力にある細胞は、培養1mL当たり1μgのDNAを用いてトランスフェクトされるが、DNAの1/3(すなわち、0.66μg/mL)はFVII−Fc発現構築物であり、DNAの2/3(すなわち、0.33μg/mL)はDNAFc単独発現構築物である。トランスフェクション後の当日、細胞に適切な試薬を供給する。生存性が70%〜80%の間になったら、細胞培養上清を遠心分離およびデプス濾過によって収集する。イムノコンジュゲートは、MabSelect SuRe樹脂を使用してプロテインA捕捉工程を用いて透明な上清から単離する(GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA)。1アームドイムノコンジュゲートは、引き続き中性化親和性溶出液から適切な樹脂を使用してサイズ排除クロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーによって単離する(GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA)。サイズ排除および/またはアニオン交換クロマトグラフィーは、親和性溶出液中に存在する場合は、タンパク質凝集体、2アームドイムノコンジュゲートおよびFc単独ホモ二量体の除去を可能にする。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション(glypiation)、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化(butrylation)、γ−カルボキシル化、グリコシル化(N−グリコシル化、O−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化)、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれる。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、安定性で発現する。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、一過性で発現する。
イムノコンジュゲートのアーミング
一部の実施形態では、放射性核種、放射性同位体または例えば毒素などの他の実体は、本開示のイムノコンジュゲートに結合させられる。一部の実施形態では、放射性核種をイムノコンジュゲートに連結させるためには二官能性キレート剤が利用される。1つの実施形態では、キレート剤は最初にイムノコンジュゲートに付着させられ、キレート剤−イムノコンジュゲートは金属放射性同位体と接触させられるので、したがって放射性核種または放射性同位体にさらにコンジュゲート化したイムノコンジュゲートに達する。タンパク質に放射性核種をコンジュゲート化させる方法は、米国特許第4,824,659号、同第5,574,140号および米国特許出願公開第20040136908A1号に開示されている。
一部の実施形態では、放射性核種、放射性同位体または例えば毒素などの他の実体は、本開示のイムノコンジュゲートに結合させられる。一部の実施形態では、放射性核種をイムノコンジュゲートに連結させるためには二官能性キレート剤が利用される。1つの実施形態では、キレート剤は最初にイムノコンジュゲートに付着させられ、キレート剤−イムノコンジュゲートは金属放射性同位体と接触させられるので、したがって放射性核種または放射性同位体にさらにコンジュゲート化したイムノコンジュゲートに達する。タンパク質に放射性核種をコンジュゲート化させる方法は、米国特許第4,824,659号、同第5,574,140号および米国特許出願公開第20040136908A1号に開示されている。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートへの分子のコンジュゲート化は、FcもしくはFVII領域のリシンまたはシステイン残基を介して実施されてよい。1つの実施形態では、アーミング分子は、イムノコンジュゲートのFc領域のリシンまたはシステイン残基でイムノコンジュゲートにコンジュゲート化される。1つの実施形態では、コンジュゲート化は、Fc二量体のFc単量体の一方でのみ発生する。1つの実施形態では、コンジュゲート化は、Fc二量体のFc単量体の両方で発生し、イムノコンジュゲートにコンジュゲート化された複数のアーミング分子を生じさせる。1つの実施形態では、アーミング分子は、リシンまたはシステイン残基でイムノコンジュゲートのFVIIにコンジュゲート化される。
一部の実施形態では、二官能性キレート剤には、以下のアミノ酸のジチレントリアミン(dithylenetriamine)五酢酸(DTPA)シリーズ、ヒドロキサム酸をベースとする二官能性キレート剤、p−SCN−Bz−HEHA(1,4,7,10,13,16−ヘキサアザシクロ−オクタデカン−N,N’,N’’,N’’’−六酢酸、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカンN,N’,N’’,N’’’−四酢酸(DOTA)、NOTA、TETA、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、2−ベンジル−DTPAのモノメチルまたはシクロヘキシルアナログ、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、大環状ポリエーテル、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ポリオキシムおよびチオセミカルバゾンが含まれる。
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、細胞毒性剤にコンジュゲート化される。本明細書で使用する用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および/または細胞の崩壊を誘発する物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、60CoおよびLuの放射性同位体)、化学療法薬、アルキル化剤ならびに毒素、例えばそれらの合成アナログおよび誘導体を含む、低分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素を含むことが意図されている。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートにコンジュゲート化された、例えば細胞毒性剤、抗血管新生薬、プロアポトーシス剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素または他の作用物質などの治療薬を使用することができる。有用な薬物は、抗有糸***薬、抗キナーゼ薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、アルカロイド剤、抗血管新生薬、プロアポトーシス剤およびそれらの組合わせからなる群から選択される医薬上の特性を有し得る。
一部の実施形態では、光増感剤が本開示のイムノコンジュゲートにコンジュゲート化されてよい。一部の実施形態では、光増感剤は、光力学色素(標的組織を破壊できる光力学色素)、ヘマトポルフィリン剤、例えばジヘマトポルフィリンエーテルおよびそれらの二量体および三量体、アミノレブリン酸、ポルフィリン剤、例えばホウ素化ポルフィリン剤およびベンゾポルフィリン、メロシアニン、ポルフィセン、ポルフィマーナトリウム、ベルテポルフィン、VYSUDINE,CIBA VISION, PHOTOFRIN II、PH−10、コリン類、亜鉛フタロシアニン、プルプリン、フェノホルヒド、SnCe6およびモノクローナル抗体−色素コンジュゲートから選択され得る。全てが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,693,093号、同第6,443,976号、同第4,968,715号、同第5,190,966号、同第5,028,621号、同第4,866,168号、同第4,649,151号、同第5,438,071号、同第5,079,262号、同第4,883,790号、同第4,920,143号、同第5,095,030号、同第5,171,749号、同第5,171,741号、同第5,173,504号、同第5,166,197号、同第5,198,460号、同第5,002,962号および同第5,093,349号を参照されたい。一部の実施形態では、標的光力学的療法(PDT)は、コンジュゲート化光増感剤を活性化するため、したがって最近位にある細胞を脆弱化/溶解させるために利用される。1つの実施形態では、PDTは、非熱的レーザーを備える光増感剤を活性化する。
一部の実施形態では、有用な薬剤は、5−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−1、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、10−ヒドロキシカプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラブブシル、シスプラチン(CDDP)、Cox−2阻害剤、イリノテカン(CPT−11)、SN−38、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウロルビシン、ドキソルビシン、2−ピロリノドキソルビシン(2P−DOX)、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド(VP16)、エトポシドグルクロニド、エトポシドリン酸塩、フロクスウリジン(FUdR)、3’,5’−O−ジオレオイル−FudR(FUdR−dO)、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質転移酵素阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、L−アスパラギナーゼ、レノリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、6−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトテン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、PSI−341、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド(DTICの水性形)、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、メイタンシノイド、メイタンシノイドアナログ、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC−1065、CC1065アナログ、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンアナログ、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ、オーリスタチン、トメイマイシン誘導体およびレプトマイシン誘導体を含み得る。
一部の実施形態では、有用な毒素には、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ(RNase)、例えば、オンコナーゼ、DNase I、黄色ブドウ球菌(Staphylococcal)エンテロトキシン−A、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素およびシュードモナス属(Pseudomonas)内毒素を含み得る。
一部の実施形態では、有用なケモカインは、RANTES、MCAF、MIP1−α、MIP1−βおよびIP−10を含み得る。
一部の実施形態では、抗血管新生薬、例えばアンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗VEGF抗体、抗P1GFペプチドおよび抗体、抗血管成長因子抗体、抗Flk−1抗体、抗Flt−1抗体およびペプチド、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(マクロファージ遊走阻害因子)抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−12、IP−10、Gro−B、トロンボスポンジン、2−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート、アンジオポイエチン−2、インターフェロン−α、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド(ロキノミメックス)、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP−470、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM−1470、血小板因子4またはミノサイクリンが有用であり得る。
一部の実施形態では、有用な免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子(CSF)、インターフェロン(IFN)、エリスロポイエチン、トロンボポイエチンおよびそれらの組合わせから選択され得る。特に有用であるのは、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子(TNF)、造血因子、例えばインターロイキン(IL)、コロニー刺激因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、インターフェロン、例えばインターフェロンα、βまたはγおよび幹細胞成長因子、例えば「Si因子」と名付けられた因子である。サイトカインに特に含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラクシン;プロリラクシン;糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)および黄体化ホルモン(LH);肝成長因子;プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子;プロラクチン;胎盤性ラクトゲン、OBタンパク質;腫瘍壊死因子αおよびβ;ミュラー管抑制物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポイエチン(TPO);神経成長因子、例えばNGF−β;血小板成長因子;トランスフォーミング成長因子(TGF)、例えばTGF−αおよびTGF−β;インスリン様成長因子IおよびII;エリスロポイエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−βおよび−γ;コロニー刺激因子(CSF)、例えばマクロファージ−CSF(M−CSF);インターロイキン(IL)例えば、IL−1、IL−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12;IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、IL−25、LIF、キット−リガンドまたはFLT−3、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびLTである。
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートは、IL−15と共投与される。
一部の実施形態では、有用な放射性核種または放射性同位体には、γ線エミッター、β線エミッター、α線エミッター、ポジトロンエミッターおよびそれらの2つ以上の組合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、有用な放射性核種には、111In、177Lu、137Ba、212Bi、213Bi、211At、60Co、62Cu、67Cu、137Cs、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143R、149Pm、169Er、194Ir、199Auおよび211Pbが含まれるがそれらに限定されない。
一部の実施形態では、放射性核種は、好ましくは、オージェエミッターについては20〜6,000keVの範囲内、好ましくは60〜200keV、β線エミッターについては100〜2,500keV、γ線エミッターについては20〜4,000keVおよびα線エミッターについては4,000〜6,000keVの範囲内の崩壊エネルギーを有する。有用なβ粒子放射性核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは20〜5,000keV、より好ましくは100〜4,000keVおよび最も好ましくは500〜2,500keVである。さらに好ましいのは、オージェ放射粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種である。例えば、Co−58、Ga−67、Br−80m、Tc−99m、Rh−103m、Pt−109、In−111、Sb−119、1−125、Ho−161、Os−189mおよびIr−192。有用なβ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは<1,000keV、より好ましくは<100keVおよび最も好ましくは<70keVである。さらに好ましいのは、α粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種である。そのような放射性核種には:Dy−152、At−211、Bi−212、Ra−223、Rn−219、Po−215、Bi−211、Ac−225、Fr−221、At−217、Bi−213およびFm−255が含まれるがそれらに限定されない。有用なα粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは2,000〜10,000keV、より好ましくは3,000〜8,000keVおよび最も好ましくは4,000〜7,000keVである。
一部の実施形態では、追加の有用な放射性核種には、11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113In、95Ru、97Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Ybなどがふくまれる。一部の有用な診断用放射性核種には、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTcまたは111Inが含まれる。
一部の実施形態では、有用な治療薬には、光活性剤または光活性染料を含み得る。例えば蛍光色素および他の色原体などの蛍光組成物または例えば可視光に感受性であるポルフィリンなどの色素は、好適な光線を病変に方向付けることによって病変を検出および治療するために使用されてきた。療法では、これは光線照射、光線療法または光力学的療法と呼ばれてきた。Jori et al.(eds.),Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases(Libreria Progetto 1985);van den Bergh,Chem.Britain(1986),22:430を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体は、光線療法を達成するために光活性化色素と結合されてきた。Mew et al.,J.Immunol.(1983),130:1473;idem.,Cancer Res.(1985),45:4380;Oseroff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744;idem.,Photochem.Photobiol.(1987),46:83;Hasan et al.,Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471;Tatsuta et al.,Lasers Surg.Med.(1989),9:422;Pelegrin et al.,Cancer(1991),67:2529を参照されたい。
一部の実施形態では、有用な他の治療薬には、オリゴヌクレオチド、例えばbcl−2またはp53などの癌遺伝子および癌遺伝子産物に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを含み得る。1つの実施形態では、治療用オリゴヌクレオチドは、siRNAである。
一部の実施形態では、例えば細胞毒性剤、抗血管新生薬、プロアポトーシス剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素または他の作用物質などの治療薬は、リンカーによって本開示のイムノコンジュゲートに連結できる、またはコンジュゲート化できる。本明細書に開示したリンカーは、米国特許出願公開第2005/0169933号、同第2009/0274713号および国際公開第2009/0134976号に記載されている。
1つの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、非切断可能なリンカー、親水性リンカーおよびジカルボン酸ベースのリンカーの群から選択され得る。好適なリンカーは当分野において公知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基を含み得る。リンカーは、さらに荷電リンカーおよびそれらの親水性形を含み得る。
1つの実施形態では、リンカーは、N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)またはN−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)−2−スルホペンタノエート(スルホ−SPP);N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ブタノエート(SPDB)またはN−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)−2−スルホブタノエート(スルホ−SPDB);N−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC);N−スルホスクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(スルホSMCC);N−スクシンイミジル−4−(ヨードアセチル)−アミノベンゾエート(SIAB);およびN−スクシンイミジル−[(N−マレイミドプロピオンアミド)−テトラエチレングルコール]エステル(NHS−PEG4−マレイミド)からなる群から選択され得る。所定の実施形態では、リンカーは、N−スクシンイミジル−[(N−マレイミドプロピオンアミド)−テトラエチレングリコール]エステル(NHS−PEG4−マレイミド)である。
本発明の方法
本明細書では、新血管新生に関連する疾患または障害(例えば、腫瘍関連性新血管新生、例えば癌)を有する患者を治療するための方法であって、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体を使用するための方法が提供される。本明細書に提供する方法は、アテローム硬化症、関節リウマチ、子宮内膜症、眼メラノーマ、固形腫瘍、原発性または転移性固形腫瘍(メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、網膜静脈閉塞症(RVO)後の黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)および血管新生緑内障を含むがそれらに限定されない病理学的新血管新生に関連する疾患を有する患者を治療するために治療有効量の本明細書に提供された1つ以上のイムノコンジュゲート二量体を投与することを含む。本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。1つの実施形態では、任意の癌のために患者を治療するための方法が提供される。1つの実施形態では、眼メラノーマを治療するための方法が提供される。
本明細書では、新血管新生に関連する疾患または障害(例えば、腫瘍関連性新血管新生、例えば癌)を有する患者を治療するための方法であって、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体を使用するための方法が提供される。本明細書に提供する方法は、アテローム硬化症、関節リウマチ、子宮内膜症、眼メラノーマ、固形腫瘍、原発性または転移性固形腫瘍(メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、網膜静脈閉塞症(RVO)後の黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)および血管新生緑内障を含むがそれらに限定されない病理学的新血管新生に関連する疾患を有する患者を治療するために治療有効量の本明細書に提供された1つ以上のイムノコンジュゲート二量体を投与することを含む。本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。1つの実施形態では、任意の癌のために患者を治療するための方法が提供される。1つの実施形態では、眼メラノーマを治療するための方法が提供される。
本明細書で使用する用語「患者」には、ヒトおよび他の哺乳動物種を含む他の種の両方が含まれる。したがって、本発明は、医学的用途および獣医学的用途の両方を有する。獣医学的組成物および治療においては、イムノコンジュゲートは、対応する種に由来するターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを使用して構築される。
1つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、眼メラノーマの治療を必要とする患者の眼に投与される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、配列番号2、配列番号12、配列番号33および配列番号34のターゲティングドメインを含む。1つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、眼メラノーマの転移を治療するために投与される。そのような転移には、眼に遠位で、すなわち、肝臓、肺、骨、皮膚、脳、リンパ節および副腎組織で発生する転移事象が含まれる。
1つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、ウエット型AMDの治療を必要とする患者の眼に投与される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、配列番号2、配列番号12、配列番号33または配列番号34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。
1つの実施形態では、ウエット型AMDを治療する方法は、治療を必要とする患者の眼における脈絡膜血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む。また別の実施形態では、脈絡膜血管新生は、治療前の患者の罹患した眼中に存在した脈絡膜血管新生と比較して、治療後に少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%または少なくとも約40%逆転させられる。
眼の血管新生に関連する他の眼の障害は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートおよび方法を用いると治療可能である。1つの実施形態では、眼の血管新生は、脈絡膜血管新生である。また別の実施形態では、眼の血管新生は、網膜血管新生である。さらにまた別の実施形態では、眼の血管新生は、角膜血管新生である。さらにまた別の実施形態では、眼の血管新生は、腫瘍関連性の眼の血管新生である。したがって、1つの実施形態では、脈絡膜、網膜または角膜血管新生に関連する眼の障害は、本明細書に提供した方法の1つ以上によって治療可能である。さらにまた別の実施形態では、本方法は、それを必要とする患者の眼に、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の1つを投与することを含む。また別の実施形態では、本治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、配列番号12、配列番号33または配列番号34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。さらにまた別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号13〜18のヒトIgG1領域にコンジュゲート化した配列番号2の変異FVIIドメインを含む。コンジュゲート化は、1つの実施形態では、IgG1ヒンジ領域、例えば配列番号8〜11および19〜25の配列を介してである。また別の実施形態では、コンジュゲート化は、GSA、GGGもしくはGGSS(配列番号11)リンカーまたはそれらのリピートを介してである。
例えば、1つの実施形態では、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)、または血管新生緑内障の治療を必要とする患者は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートの1つを用いて、例えば、罹患した眼中へのイムノコンジュゲートの硝子体内注射、脈絡膜上注射または局所投与(例えば、点眼剤による)を介して治療される。1つの実施形態では、治療は複数回の投与セッションにわたり行われる。上述の障害に関連して、眼の血管新生は、各障害と「関連する」または「続発性である」と言うべきである。
1つの実施形態では、網膜上膜閉塞症(RVO)後の黄斑浮腫の治療を必要とする患者は、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体の1つによって治療される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、2、12、33または34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与を介して投与される。
また別の実施形態では、糖尿病性黄斑浮腫(DME)の治療を必要とする患者は、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体の1つによって治療される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、2、12、33または34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与によって投与される。いっそうまた別の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、各投与セッション時に硝子体内投与される。
さらにまた別の実施形態では、糖尿病性網膜症は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートの1つによって、それを必要とする患者に、例えばDMEを有する患者において治療される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、2、12、33または34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与によって投与される。いっそうまた別の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与によって投与される。
本明細書に記載した1つの実施形態では、本明細書に提供した1つ以上のイムノコンジュゲートは、それを必要とする患者、例えば、癌患者における腫瘍血管新生に関連する疾患または障害を治療するための方法において使用される。1つの実施形態では、本方法は、患者に、例えば腫瘍内または静脈内注射によって、本明細書に記載した治療有効量のイムノコンジュゲート二量体を含む組成物を投与することを含む。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、2、12、33または34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。
癌の治療においては、イムノコンジュゲート二量体は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない様々な癌、特に原発性または転移性固形腫瘍を治療するために使用される。1つの実施形態では、癌は、婦人科癌である。また別の実施形態では、婦人科癌は、漿液性癌、明細胞癌、類内膜または未分化卵巣癌である。1つの実施形態におけるイムノコンジュゲート二量体は、腫瘍血管構造、特に血管内皮細胞および/または腫瘍細胞を標的とするために使用される。理論によって拘束することを望まなくても、腫瘍血管構造を標的とすることは、以下のように、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の1つ以上を用いる癌免疫療法の複数の利点を提供できる。(i)組織因子を含む血管標的の一部は全腫瘍にとって同一であるはずである;(ii)血管構造に標的化されるイムノコンジュゲートは、それらの標的に到達するために腫瘤に浸潤する必要がない;(iii)腫瘍血管構造の標的化は、各血管がその生存性が血管の機能的完全性に依存する極めて多数の腫瘍細胞に栄養分を与えるために、増幅した治療応答を生成するはずである;および(iv)血管構造は、血管を内張りしている全内皮層の修飾を必要とするであろうために、イムノコンジュゲートへの耐性を発生する可能性が低い。以前に記載された新規血管増殖を阻害する抗血管形成法とは異なり、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、新生血管構造に対する細胞溶解反応を引き出す。
また別の実施形態では、本明細書に記載した1つ以上のイムノコンジュゲートは、アテローム硬化症または関節リウマチを治療するための方法において使用される。1つの実施形態では、治療は、本イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、2、12、33または34のターゲティングドメインを含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および/または配列番号26のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。
イムノコンジュゲート二量体を用いて例えば眼メラノーマなどの眼の障害を治療するための方法、例えば、ウエット型AMD、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫またはウエット型AMDなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法の1つの実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力(BCVA)測定値と比較して、BCVA測定値における15文字未満の消失によって測定されるように、治療(例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション)後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の消失文字数は、治療を受ける前の患者のBCVA測定値と比較して、BCVA測定値において10文字未満、8文字未満、6文字未満または5文字未満である。
イムノコンジュゲート二量体を用いて例えば眼の障害を治療するための方法、例えば、眼メラノーマ、ウエット型AMD、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、腫瘍関連性新血管新生またはウエット型AMDなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法のまた別の実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力(BCVA)測定値と比較して、BCVA測定値における15文字以上の獲得によって測定されるように、治療(例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション)後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のBCVA測定値と比較して、BCVA測定値において約15文字以上、約20文字以上または約25文字以上である。いっそうさらに別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のBCVA測定値と比較して、BCVA測定値において約15〜約30文字、約15文字〜約20文字、約15文字〜約20文字である。
イムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼の障害を治療するための方法、例えば、ウエット型AMD、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または例えば本明細書に提供したウエット型AMDなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法の1つの実施形態では、眼の血管新生領域、例えば患者の眼の脈絡膜血管新生の領域は、治療前の眼の血管新生(例えば、CNV領域)と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は1回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、1つの実施形態では眼の血管新生領域(例えば、CNV領域)の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、眼の血管新生領域(例えば、CNV領域)は、フルオレセイン血管造影法によって測定して少なくとも約5%、または少なくとも約10%、または少なくとも約15%、または少なくとも約20%、または少なくとも約25%、または少なくとも約30%、または少なくとも約35%、または少なくとも約40%、または少なくとも約45%、または少なくとも約50%減少させられる。
イムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼の障害を治療するための方法、例えば、ウエット型AMD、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または例えばウエット型AMDなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法の1つの実施形態では、治療される眼の網膜厚は、光干渉断層撮影法(OCT)によって測定して、治療前の網膜厚と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は1回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、1つの実施形態では網膜厚の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、網膜厚は、OCTによって測定して少なくとも約5%、または少なくとも約10%、または少なくとも約15%、または少なくとも約20%、または少なくとも約25%、または少なくとも約30%、または少なくとも約35%、または少なくとも約40%、または少なくとも約45%、または少なくとも約50%減少させられる。また別の実施形態では、減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚(CST)、減少した中心点厚(CPT)または減少した中心窩厚(CFT)である。
本開示の方法の1つの実施形態では、患者は、1回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さと比較して、1回以上の投与セッションの後に眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さの減少を示す。また別の実施形態では、眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さとの減少は、超音波、高分解能超音波生体顕微鏡検査法、磁気共鳴イメージング法および/またはコンピューター横断断層撮影法によって測定される。
本開示の方法の1つの実施形態では、患者は、1回以上の投与セッションの前の網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および/または液体貯留と比較して、1回以上の投与セッションの後に網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および/または液体貯留の減少を示す。また別の実施形態では、腫脹および/または液体貯留の減少は、眼干渉断層撮影法によって測定される。
本開示の方法の1つの実施形態では、患者は、1回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さと比較して、1回以上の投与セッションの後には眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さの減少を示す。さらに別の実施形態では、この減少は、蛍光眼底血管造影法またはインドシアニングリーン血管造影法によって測定される。
本開示の方法の1つの実施形態では、1回以上の投与セッションの前の虹彩絞りのサイズおよび/または数と比較して、1回以上の投与セッションの後に虹彩絞りのサイズおよび/または数の減少を示す。さらにまた別の実施形態では、この減少は、隅角鏡、細隙灯生体顕微鏡および/または検眼鏡によって測定される。
本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、病理学的新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。例えば、1つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、眼メラノーマの治療を必要とする患者の眼に投与される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。全体を通して提供されるように、イムノコンジュゲート二量体は、それぞれがヒト免疫グロブリンG1(IgG1)Fcドメインにコンジュゲート化された変異ヒト第FVIIa因子(FVIIa)タンパク質を含む単量体単位を含む。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4または5のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号4のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号5のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号1、2、12、33または34のターゲティングドメインを含み、配列番号13〜18および26〜32のエフェクタードメイン(ヒンジ領域を含む)を含む。
1つの実施形態では、眼メラノーマを治療する方法は、治療を必要とする患者の眼における腫瘍関連性新血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む。また別の実施形態では、新血管新生は、治療前の患者の罹患した眼中に存在した脈絡膜血管新生と比較して、治療後に少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%または少なくとも約40%逆転させられる。
イムノコンジュゲート二量体を用いて眼メラノーマなどの眼の障害を治療するための方法の1つの実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力(BCVA)測定値と比較して、BCVA測定値における15文字未満の消失によって測定されるように、治療(例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション)後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の消失文字数は、治療を受ける前の患者のBCVA測定値と比較して、BCVA測定値において10文字未満、8文字未満、6文字未満または5文字未満である。
イムノコンジュゲート二量体を用いて眼メラノーマを治療するための方法のまた別の実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力(BCVA)測定値と比較して、BCVA測定値における15文字以上の獲得によって測定されるように、治療(例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション)後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のBCVA測定値と比較して、BCVA測定値において約15文字以上、約20文字以上または約25文字以上である。いっそうさらに別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のBCVA測定値と比較して、BCVA測定値において約15〜約30文字、約15文字〜約20文字、約15文字〜約20文字である。
本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼メラノーマを治療するための1つの実施形態では、患者の眼の血管新生領域は、治療前の眼の血管新生領域と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は1回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、1つの実施形態では眼の血管新生領域(例えば、CNV領域)の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、眼の血管新生領域(例えば、CNV領域)は、蛍光眼底血管造影法によって測定して少なくとも約5%、または少なくとも約10%、または少なくとも約15%、または少なくとも約20%、または少なくとも約25%、または少なくとも約30%、または少なくとも約35%、または少なくとも約40%、または少なくとも約45%、または少なくとも約50%減少させられる。
イムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼メラノーマを治療するための方法の1つの実施形態では、治療される眼の網膜厚は、光干渉断層撮影法(OCT)によって測定して、治療前の網膜厚と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は1回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、1つの実施形態では網膜厚の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、網膜厚は、OCTによって測定して少なくとも約5%、または少なくとも約10%、または少なくとも約15%、または少なくとも約20%、または少なくとも約25%、または少なくとも約30%、または少なくとも約35%、または少なくとも約40%、または少なくとも約45%、または少なくとも約50%減少させられる。また別の実施形態では、減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚(CST)、減少した中心点厚(CPT)または減少した中心窩厚(CFT)である。
本開示の方法の1つの実施形態では、患者は、1回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さと比較して、1回以上の投与セッションの後に眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さの減少を示す。また別の実施形態では、眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さとの減少は、超音波、高分解能超音波生体顕微鏡検査法、磁気共鳴イメージング法および/またはコンピューター横断断層撮影法によって測定される。
本開示の方法の1つの実施形態では、患者は、1回以上の投与セッションの前の網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および/または液体貯留と比較して、1回以上の投与セッションの後に網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および/または液体貯留の減少を示す。また別の実施形態では、腫脹および/または液体貯留の減少は、眼干渉断層撮影法によって測定される。
本開示の方法の1つの実施形態では、患者は、1回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さと比較して、1回以上の投与セッションの後には眼メラノーマのサイズ、容積および/または厚さの減少を示す。さらに別の実施形態では、この減少は、蛍光眼底血管造影法またはインドシアニングリーン血管造影法によって測定される。
本開示の方法の1つの実施形態では、1回以上の投与セッションの前の虹彩絞りのサイズおよび/または数と比較して、1回以上の投与セッションの後に虹彩絞りのサイズおよび/または数の減少を示す。さらにまた別の実施形態では、この減少は、隅角鏡、細隙灯生体顕微鏡および/または検眼鏡によって測定される。
1つの実施形態では、固形腫瘍は、本開示のイムノコンジュゲートを用いて、本イムノコンジュゲートの全身性投与を用いて治療される。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートの全身性投与は、近付きがたい固形腫瘍を考慮して局所投与よりも優先される。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは全身性および局所的両方で投与される。
他の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、TFの異所性発現が観察される任意の疾患または障害において使用するために適用できる。例えば、1つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、TF発現性グリオーマの治療を必要とする患者に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。例えば、1つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)の治療を必要とする患者の眼に投与される。また別の態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、眼メラノーマの治療を必要とする患者の眼に投与される。1つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲートの複数回の投与セッションを含む。
癌の治療における一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含む様々な癌、特に原発性または転移性固形腫瘍を治療するために使用される。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、さらに次の癌:ユーイング腫瘍、ウィルムス腫瘍、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、甲状腺癌、胸腺癌、精巣癌、胃癌、小腸癌、メルケル細胞癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血漿、軟部組織肉腫、唾液腺癌、横紋筋肉腫、網膜芽腫、前立腺癌、下垂体癌、陰茎癌、膵臓癌、グリオーマ、婦人科癌(漿液癌、明細胞癌、子宮内膜癌、未分化卵巣癌)、骨肉腫、中咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、鼻咽頭癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、肺癌(小細胞性、非小細胞性、カルチノイド腫瘍)、肝臓癌、白血病(急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性単球性)、咽頭癌、下咽頭癌、腎臓癌、カポジ肉腫、ホジキン病、妊娠絨毛性疾患、胃腸腫瘍(間質腫瘍、カルチノイド腫瘍)、胆嚢癌、眼癌、食道癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、乳癌、脳腫瘍、CNS、骨肉腫、膀胱癌、胆管癌、肛門癌および副腎癌を治療するために使用される。
1つの実施形態では、癌は、婦人科癌である。また別の実施形態では、婦人科癌は、漿液性癌、明細胞癌、類内膜または未分化卵巣癌である。
1つの実施形態におけるイムノコンジュゲートは、腫瘍血管構造、特に血管内皮細胞および/または腫瘍細胞を標的とするために使用される。理論によって拘束することを望まなくても、腫瘍血管構造を標的とすることは、以下のように、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の1つ以上を用いる癌免疫療法の複数の利点を提供する:(i)組織因子を含む血管標的の一部は全腫瘍にとって同一であるはずである;(ii)血管構造に標的化されるイムノコンジュゲートは、それらの標的に到達するために腫瘤に浸潤する必要がない;(iii)腫瘍血管構造の標的化は、各血管がその生存性が血管の機能的完全性に依存する極めて多数の腫瘍細胞に栄養分を与えるために、増幅した治療応答を生成するはずである;および(iv)血管構造は、血管を内張りしている全内皮層の修飾を必要とするであろうために、イムノコンジュゲートへの耐性を発生する可能性が低い。以前に記載された新規血管増殖を阻害する抗血管形成法とは異なり、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、新生血管構造に対する細胞溶解反応を引き出す。
製剤、用法および用量
本明細書では、本イムノコンジュゲートまたはイムノコンジュゲートを含む組成物のための用法および用量の実施形態が提供される。一部の実施形態では、投与は、療法に関係する病理学的状態のタイプに依存して、局所的または全身性であってよい。
本明細書では、本イムノコンジュゲートまたはイムノコンジュゲートを含む組成物のための用法および用量の実施形態が提供される。一部の実施形態では、投与は、療法に関係する病理学的状態のタイプに依存して、局所的または全身性であってよい。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、液剤または懸濁剤として投与される。1つの実施形態におけるイムノコンジュゲート二量体は、アルギニンまたはプロテインAを含む。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、アルギニンを含む。いっそうまた別の実施形態では、アルギニンは、組成物中に約20mM〜約40mM、例えば25mMで存在する。1つの実施形態における組成物の他の成分は、HEPES、塩化ナトリウム、ポリソルベート−80、塩化カルシウムまたはそれらの組合わせを含んでいた。1つの実施形態では、ヒスチジンが存在する。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、1μg〜1500μgの用量で投与される。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、10μg〜600μg、10μg〜500μg、10μg〜400μg、10μg〜300μg、10μg〜200μg、10μg〜100μg、10μg〜50μg、50μg〜600μg、50μg〜500μg、50μg〜400μg、50μg〜300μg、50μg〜200μg、50μg〜100μg、100μg〜600μg、100μg〜500μg、100μg〜400μg、100μg〜300μg、100μg〜200μg、200μg〜600μg、200μg〜500μg、200μg〜400μg、200μg〜300μg、300μg〜500μg、300μg〜400μgまたは400μg〜500μgの用量で投与される。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、300μgの単回投与で投与される。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、各300μgの複数回投与で投与される。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、600μgの単回投与で投与される。1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、各600μgの複数回投与で投与される。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、約1μg、10μg、約20μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約80μg、約90μg、約100μg、約125μg、約150μg、約175μg、約200μg、約225μg、約250μg、約275μg、約300μg、約325μg、約350μg、約375μg、約400μg、約425μg、約450μg、約475μg、約500μg、約525μg、約550μg、約575μg、約600μg、約625μg、約650μg、約675μg、約700μg、約725μg、約750μg、約775μg、約800μg、約825μg、約850μg、875μg、約900μg、約925μg、約950μg、約975μg、約1000μg、約1100μg、約1200μg、約1300μg、約1400μgまたは約1500μgからなる用量で投与される。
一部の実施形態では、単回用量のイムノコンジュゲート二量体が投与される。一部の実施形態では、2回以上の用量のイムノコンジュゲート二量体が投与される。典型的な実施形態では、各300μgの2回の投与が、1週間(7日間)の間隔を空けて投与される。典型的な実施形態では、各600μgの2回の投与が、1週間(7日間)の間隔を空けて投与される。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、10μL〜200μL、10μL〜180μL、10μL〜160μL、10μL〜140μL、10μL〜120μL、10μL〜100μL、10μL〜80μL、10μL〜60μL、10μL〜40μL、10μL〜20μL、10μL〜15μL、20μL〜200μL、20μL〜180μL、20μL〜160μL、20μL〜140μL、20μL〜120μL、20μL〜100μL、20μL〜80μL、20μL〜60μL、20μL〜40μL、40μL〜200μL、40μL〜180μL、40μL〜160μL、40μL〜140μL、40μL〜120μL、40μL〜100μL、40μL〜80μL、40μL〜60μL、60μL〜200μL、60μL〜180μL、60μL〜160μL、60μL〜140μL、60μL〜120μL、60μL〜100μL、60μL〜80μL、80μL〜200μL、80μL〜180μL、80μL〜160μL、80μL〜140μL、80μL〜120μL、80μL〜100μL、100μL〜200μL、100μL〜180μL、100μL〜160μL、100μL〜140μL、100μL〜120μL、120μL〜200μL、120μL〜180μL、120μL〜160μL、120μL〜140μL、140μL〜200μL、140μL〜180μL、140μL〜160μL、160μL〜200μL、160μL〜180μLまたは180μL〜200μLの溶質容積で投与される。
1つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、約10μL、約15μL、約20μL、約25μL、約30μL、約35μL、約40μL、約45μL、約50μL、約55μL、約60μL、約65μL、約70μL、約75μL、約80μL、約85μL、約90μL、約95μLまたは約100μLからなる溶質容積で投与される。
本発明の典型的な組成物は、下記の表3〜5に提供した。
特定の実施形態では、本製剤は、様々な濃度で、アルギニンを含み得る、もしくはヒスチジンを含み得る;またはアルギニンおよびヒスチジンを含み得る。本製剤は、追加して、または代わりに、他のアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体を含み得る。
本明細書に提供した方法によって含まれる投与方法には、硝子体内注射、脈絡膜上注射、局所投与(例えば、点眼剤)、静脈内および腫瘍内投与または治療対象の状態もしくは疾患に依存して任意の他の方法が含まれるがそれらに限定されない。他の実施形態では、投与は、本イムノコンジュゲートもしくは複製欠損性アデノウイルスベクターまたは本イムノコンジュゲートの分泌形をコードするcDNAを運ぶ他のウイルスベクターの静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、滑液嚢内、眼内、プラーク内、クモ膜下もしくは皮内注射を介してである。1つの実施形態では、全身性投与は、非経口注射によって行われ得る。1つの実施形態では、治療を必要とする患者は、1つ以上のイムノコンジュゲートタンパク質の硝子体内、静脈内もしくは腫瘍内注射、または他の部位での注射によって1つ以上の融合タンパク質が投与される。または、1つの実施形態では、治療を必要とする患者は、1つ以上の融合タンパク質が、本明細書に提供した1つ以上の融合タンパク質の分泌形をコードするcDNAを運ぶ1つ以上の発現ベクターの静脈内もしくは腫瘍内注射、または他の部位での注射によって投与される。一部の実施形態では、患者は、有効量の1つ以上の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは1つ以上のタイプのイムノコンジュゲートタンパク質の分泌形をコードするcDNAを運ぶ1つ以上のアデノ関連ベクターの静脈内または腫瘍内注射によって治療される。
一部の実施形態では、1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの全身性投与は、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって行われ得る。一部の実施形態では、本明細書で利用される全身性投与は、必要とする患者への本開示の物質の投与であって、その物質が循環系に進入し、必要とする患者の全身内に分散する投与である。1つの実施形態では、本開示の物質の全身性投与には、物質の血液脳関門を越えた分布が含まれる。
1つの実施形態では、硝子体内注射の方法が使用される。また別の実施形態では、注射のために1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートを調製する場合には、滅菌手袋、滅菌ドレープおよび滅菌眼瞼検鏡(または同等物)の使用によって、無菌技術が使用される。1つの実施形態では、患者は、注射前に麻酔および広域殺菌剤を受ける。
本明細書に提供したイムノコンジュゲートの1つ以上の硝子体内注射は、1ccのツベルクリンシリンジに取り付けられた5μの19ゲージフィルターニードルを通してイムノコンジュゲート組成物溶液のウイルス含量を抜き出すことによって調製される。また別の実施形態におけるフィルターニードルは、その後廃棄され、硝子体内注射のための滅菌30ゲージ×1/2インチニードルと置換される。ウイルスの含量は、プランジャーチップが送達のために適切な容量をマークするシリンジ上のラインと整列させられるまで排出される。
また別の実施形態では、本明細書に提供した治療方法は、複数回の投与セッションを含む。さらに別の実施形態では、複数回の投与セッションは、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの1つの複数回の眼内注射である。1つの実施形態での複数回の投与セッションは、2回以上、3回以上、4回以上または5回以上の投与セッションを含む。また別の実施形態では、各投与セッションは、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの1つの眼内注射、または本明細書に記載したイムノコンジュゲートの1つの腫瘍内注射(すなわち、発現したタンパク質として、または可溶性融合タンパク質をコードするベクターによってのいずれかで)を含む。また別の実施形態では、上記の2回以上、3回以上、4回以上または5回以上の投与セッションのそれぞれは、全身性投与を含み得る。
1つの実施形態では、約2回〜約24回の投与セッション、例えば、約2回〜約24回の眼内投与セッション(例えば、硝子体内注射または脈絡膜上注射)が使用される。さらに別の実施形態では、約3回〜約30回、または約5回〜約30回、または約7回〜約30回、または約9回〜約30回、または約10回〜約30回、または約12回〜約30回の投与セッションが使用される。
複数回の投与セッションが使用される1つの実施形態では、投与セッションは、約10日間〜約60日間、または約10日間〜約50日間、または約10日間〜約40日間、または約10日間〜約30日間、または約10日間〜約20日間の間隔を空けて投与される。複数回の投与セッションが使用されるまた別の実施形態では、各投与セッションは、約20日間〜約60日間、または約20日間〜約50日間、または約20日間〜約40日間、または約20日間〜約30日間の間隔を空けている。いっそうまた別の実施形態では、複数回の投与セッションは、隔週に1回(例えば、約14日間毎)、月1回(例えば、約30日間毎)、または隔月に1回(例えば、約60日間毎)である。さらにまた別の実施形態では、投与セッションは、約28日の間隔を空けている。
共投与
一部の実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、上述の疾患または障害の1つに対して患者を治療するため、例えば、ウエット型AMDまたは新血管新生に関連するまた別の眼の疾患を治療するために共治療レジメンで投与される。本方法は、第2活性剤の(併用または非併用のいずれかの)投与を含む。1つの実施形態では、第2活性剤は、イムノコンジュゲートと同一組成物中で投与される。しかし、別の実施形態では、第2活性剤は、別個の組成物中で投与される。1つの実施形態では、第2活性剤は、新血管新生阻害剤、血管形成阻害剤または癌化学療法薬である。1つの実施形態では、第2活性剤は、チェックポイント阻害剤(抗CTLA4、抗PD1/PDL1)である。また別の実施形態では、第2活性剤は、免疫療法薬/免疫療法である。
一部の実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、上述の疾患または障害の1つに対して患者を治療するため、例えば、ウエット型AMDまたは新血管新生に関連するまた別の眼の疾患を治療するために共治療レジメンで投与される。本方法は、第2活性剤の(併用または非併用のいずれかの)投与を含む。1つの実施形態では、第2活性剤は、イムノコンジュゲートと同一組成物中で投与される。しかし、別の実施形態では、第2活性剤は、別個の組成物中で投与される。1つの実施形態では、第2活性剤は、新血管新生阻害剤、血管形成阻害剤または癌化学療法薬である。1つの実施形態では、第2活性剤は、チェックポイント阻害剤(抗CTLA4、抗PD1/PDL1)である。また別の実施形態では、第2活性剤は、免疫療法薬/免疫療法である。
1つの実施形態では、第2活性剤は、血管内皮細胞成長因子(VEGF)阻害剤、VEGF受容体阻害剤、血小板由来成長因子(PDGF)阻害剤またはPDGF受容体阻害剤である。
また別の実施形態では、新血管新生阻害剤である第2活性剤は、インテグリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、接着分子アンタゴニスト(例えば、細胞間接着分子(ICAM)−1、ICAM−2、ICAM−3、血小板内皮細胞接着分子(PCAM)、血管細胞接着分子(VCAM))、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1))、塩基性線維芽細胞増殖因子アンタゴニスト、血管内皮細胞成長因子(VEGF)モデュレーターまたは血小板由来成長因子(PDGF)モデュレーター(例えば、PDGFアンタゴニスト)である。患者がインテグリンアンタゴニストに応答する可能性が高いかどうかを決定する1つの実施形態では、インテグリンアンタゴニストは、低分子インテグリンアンタゴニスト、例えば、Paolillo et al.(全体として参照により本明細書に組み込まれるMini Rev Med Chem,2009,volume 12,pp.1439-1446)によって記載されたアンタゴニスト、またはその全体として本明細書に参照により組み込まれる米国特許第6,524,581号に記載された白血球接着誘導性サイトカインもしくは成長因子アンタゴニスト(例えば、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン−1β(IL−1β)、単球走化性タンパク質1(MCP−1)および血管内皮細胞成長因子(VEGF))である。
また別の実施形態では、新血管新生阻害剤である第2活性剤は、次の血管形成阻害剤:インターフェロンγ1β、ピルフェニドンを含むインターフェロンγ1β(Actimmune(登録商標))、ACUHTR028、αVβ5、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドP、ANG1122、ANG1170、ANG3062、ANG3281、ANG3298、ANG4011、抗CTGF RNAi、アプリジン、サルビアおよびチョウセンゴミシ(schisandra chinensis)を含むレンゲ属(astragalus)膜性円板抽出物および、アテローム硬化症性プラークブロッカー、アゾール、AZX100、BB3、結合組織成長因子抗体、CT140、ダナゾール、Esbriet、EXC001、EXC002、EXC003、EXC004、EXC005、F647、FG3019、フィブロコリン、フォリスタチン、FT011、ガレクチン−3阻害剤、GKT137831、GMCT01、GMCT02、GRMD01、GRMD02、GRN510、ヘベロンαR、インターフェロンα−2β、ITMN520、JKB119、JKB121、JKB122、KRX168、LPA1受容体アンタゴニスト、MGN4220、MIA2、ミクロRNA29aオリゴヌクレオチド、MMI0100、ノスカピン、PBI4050、PBI4419、PDGFR阻害剤、PF−06473871、PGN0052、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、PRM151、Px102、PYN17、PYN17を含むPYN22、レリベルゲン、rhPTX2融合タンパク質、RXI109、セクレチン、STX100、TGF−β阻害剤、トランスフォーミング成長因子、β−受容体2オリゴヌクレオチド、VA999260、XV615またはそれらの組合わせの1つ以上である。
また別の実施形態では、第2活性剤は、内因性血管形成阻害剤である。また別の実施形態では、内因性血管形成阻害剤は、エンドスタチン、XVIII型コラーゲン由来の20kDaのC末端断片、アンジオスタチン(プラスミンの38kDa断片)またはタンパク質のトロンボスポンジン(TSP)ファミリーのメンバーである。また別の実施形態では、血管形成阻害剤は、TSP−1、TSP−2、TSP−3、TSP−4およびTSP−5である。次の血管形成阻害剤:可溶性VEGF受容体、例えば、可溶性VEGFR−1およびニューロピリン1(NPR1)、アンジオポエチン−1、アンジオポエチン−2、バソスタチン、カルレチキュリン、血小板因子−4、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)(例えば、TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4)、軟骨由来血管形成阻害剤(例えば、ペプチドトロポニンIおよびクロノドモデュリンI)、トロンボスポンジンモチーフ1を備えるジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、インターフェロン(IFN)(例えば、IFN−α、IFN−β、IFN−γ)、ケモカイン、例えば、C−X−Cモチーフを有するケモカイン(例えば、CXCL10、さらにインターフェロンγ誘導性タンパク質10または小誘導性サイトカインB10)、インターロイキンサイトカイン(例えば、IL−4、IL−12、IL−18)、プロトロンビン、アンチトロンビンIII断片、プロラクチン、TNFSF15遺伝子によってコードされたタンパク質、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質の1つ以上への応答の可能性を決定するための方法もまた提供される。
1つの実施形態では、下記の新血管新生阻害剤:アンジオポエチン−1、アンジオポエチン−2、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、トロンボスポンジン、カルレチキュリン、血小板因子4、TIMP、CDAI、インターフェロンα、インターフェロンβ、血管内皮細胞成長因子(VEGI)meth−1、meth−2、プロラクチン、VEGI、SPARC、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質(PRP)、レスチン、TSP−1、TSP−2、インターフェロンγ1β、ACUHTR028、αVβ5、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドP、ANG1122、ANG1170、ANG3062、ANG3281、ANG3298、ANG4011、抗CTGF RNAi、アプリジン、サルビアおよびチョウセンゴミシ(schisandra chinensis)を含むレンゲ属(astragalus)膜性円板抽出物および、アテローム硬化症性プラークブロッカー、アゾール、AZX100、BB3、結合組織成長因子抗体、CT140、ダナゾール、Esbriet、EXC001、EXC002、EXC003、EXC004、EXC005、F647、FG3019、フィブロコリン、フォリスタチン、FT011、ガレクチン−3阻害剤、GKT137831、GMCT01、GMCT02、GRMD01、GRMD02、GRN510、ヘベロンαR、インターフェロンα−2β、ITMN520、JKB119、JKB121、JKB122、KRX168、LPA1受容体アンタゴニスト、MGN4220、MIA2、ミクロRNA29aオリゴヌクレオチド、MMI0100、ノスカピン、PBI4050、PBI4419、PDGFR阻害剤、PF−06473871、PGN0052、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、PRM151、Px102、PYN17、PYN17を含むPYN22、レリベルゲン、rhPTX2融合タンパク質、RXI109、セクレチン、STX100、TGF−β阻害剤、トランスフォーミング成長因子、β−受容体2オリゴヌクレオチド、VA999260、XV615またはそれらの組合わせの1つ以上が、本明細書に記載したイムノコンジュゲートとともに投与される。
さらにまた別の併用療法実施形態は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの1つと次の:パゾパニブ(Votrient)、スニチニブ(Sutent)、ソラフェニブ(Nexavar)、アキシチニブ(Inlyta)、ポナチニブ(Iclusig)、バンデタニブ(Caprelsa)、カボザンチニブ(Cometrig)、ベバシズマブ(Avastin)、ラムシルマブ(Cyramza)、レゴラフェニブ(Stivarga)、ジブ−アフリベルセプト(Zaltrap)またはそれらの組合わせの1つ以上との投与を含む。また別の実施形態では、血管形成阻害剤は、VEGF阻害剤である。また別の実施形態では、VEGF阻害剤は、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブまたはモテサニブである。1つの典型的な実施形態では、併用療法は、1アームドイムノコンジュゲート二量体(ICON−1.5)とアフリベルセプトの投与を含む。
他の実施形態では、追加の併用療法は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの1つと次の免疫チェックポイント阻害剤:イピリミウマブ、ニボルマン、ペンブロリズマブおよび腫瘍微小環境に影響を及ぼす他の分子の1つ以上との投与を含む。
1つの実施形態では、血管形成阻害剤は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。また別の実施形態では、血管形成阻害剤は、ラニビズマブである。1つの典型的な実施形態では、併用療法は、1アームドイムノコンジュゲート二量体(ICON−1.5)とラニビズマブの投与を含む。いっそうさらにまた別の実施形態では、ラニビズマブは、1投与セッションあたり0.5mgまたは0.3mgの用量で投与され、LUCENTISについての処方情報に規定されたように投与される。
1つの実施形態では、併用療法は、血小板由来成長因子(PDGF)ファミリーのメンバーのアンタゴニスト、例えば、PDGF受容体(PEGFR)のシグナル伝達および/または活性を阻害する、減少させる、もしくは調節する薬物の投与を含む。例えば、1つの実施形態におけるPDGFアンタゴニストは、抗PDGFアプタマー、抗PDGF抗体もしくはその断片、抗PDGFR抗体もしくはその抗体または低分子アンタゴニストである。1つの実施形態では、PDGFアンタゴニストは、PDGFR−αまたはPDGFR−βのアンタゴニストである。1つの実施形態では、PDGFアンタゴニストは、抗PDGF−βアプタマーE10030、スニチニブ、アキシチニブ、ソレフェニブ、イマチニブ、イマチニブメシレート、ニンテダニブ、パゾパニブHCl、ポナチニブ、MK−2461、ドビチニブ、パゾパニブ、クレノラニブ、PP−121、テラチニブ、イマチニブ、KRN633、CP673451、TSU−68、Ki8751、アムバチニブ、チボザニブ、マシチニブ、モテサニブ二リン酸、ドビチニブ二乳酸、リニファニブ(ABT−869)である。
医薬組成物
本出願は、1種以上の医薬上許容される賦形剤とともに本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体のいずれか1つを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、無菌である。医薬組成物は、一般に有効量のイムノコンジュゲート二量体を含む。
本出願は、1種以上の医薬上許容される賦形剤とともに本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体のいずれか1つを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、無菌である。医薬組成物は、一般に有効量のイムノコンジュゲート二量体を含む。
キットおよび製造品
本出願は、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、医薬上許容される賦形剤および取扱説明書をさらに含む。1つの特定の実施形態では、キットは、1種以上の医薬上許容される賦形剤とともに本明細書に記載した治療用組成物のいずれか1つ以上を含む。本出願は、本明細書に記載した治療用組成物またはキットのいずれか1つを含む製造品をさらに提供する。製造品の例には、バイアル(密閉バイアルを含む)が含まれる。
本出願は、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、医薬上許容される賦形剤および取扱説明書をさらに含む。1つの特定の実施形態では、キットは、1種以上の医薬上許容される賦形剤とともに本明細書に記載した治療用組成物のいずれか1つ以上を含む。本出願は、本明細書に記載した治療用組成物またはキットのいずれか1つを含む製造品をさらに提供する。製造品の例には、バイアル(密閉バイアルを含む)が含まれる。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより十分に理解されるであろう。しかしそれらの実施例は、要求した本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載した実施例および実施形態は、例示するためにのみ記載されていると理解されている。
実施例
本発明について、以下の実施例を参照しながら詳細に例示する。実施例は、上述した実施形態と同様に、例示することを目的としており、決して本発明の範囲を制限するものであると解釈すべきではない。
本発明について、以下の実施例を参照しながら詳細に例示する。実施例は、上述した実施形態と同様に、例示することを目的としており、決して本発明の範囲を制限するものであると解釈すべきではない。
実施例1
加齢性黄斑変性症に続発性のCNVを有する患者におけるICON−1.5の発現および精製
本試験では、ICON−1.5イムノコンジュゲートを発現させて精製した。哺乳動物CHO−S細胞を利用して本発明に関連する様々な構築物を生成した。図8に示したように、構築物をCHO−S細胞内に共形質転換させ、細胞培養上清を収集し、本発明に関連するタンパク質、特に抗FVII抗体および抗ヒトIgG1 Fc抗体に結合しているタンパク質の存在について評価した。
加齢性黄斑変性症に続発性のCNVを有する患者におけるICON−1.5の発現および精製
本試験では、ICON−1.5イムノコンジュゲートを発現させて精製した。哺乳動物CHO−S細胞を利用して本発明に関連する様々な構築物を生成した。図8に示したように、構築物をCHO−S細胞内に共形質転換させ、細胞培養上清を収集し、本発明に関連するタンパク質、特に抗FVII抗体および抗ヒトIgG1 Fc抗体に結合しているタンパク質の存在について評価した。
トランスフェクション後の当日、細胞に適切な試薬を供給した。生存性が70%〜80%の間になったら、細胞上清を遠心分離およびデプス濾過によって収集した。
次の上清をウェスタンブロット上で2回ずつランしたが、1回のランでは抗FVIIに曝露させ、もう1回のランでは抗ヒトIgG1 Fcに曝露させた。レーン1は、変異FVII−Fc(配列番号4)を含む構築物の純正トランスフェクション由来の上清を含むが、他方レーン2および3はそれぞれ、IgG1の下方ヒンジに、その後に残りのIgG1配列(配列番号13)に接続されたGGSSリンカー(配列番号11)に融合した変異FVII(配列番号12)を含むFVII−Fcの変異体4(v4)を含む単独構築物だけを用いてトランスフェクトされている細胞由来の上清を有する。レーン4は、V4構築物およびFc単独発現構築物(配列番号13)である第2構築物を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン5は、V4構築物およびプロテインA突然変異を備えるFcを発現する第2構築物(配列番号14)を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン6は、ホール構築物(しかしFcホール突然変異を特徴とするv4であり、ここで配列番号13は配列番号17と置換される)、およびプロテインAおよびノブ突然変異を備えるFcを発現する第2構築物(配列番号16)を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン7は、V4構築物およびノブ突然変異を備えるFcを発現する第2構築物(配列番号15)を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン8は、v4ノブ構築物(しかしFcホール突然変異を特徴とするv4であり、ここで配列番号13は配列番号15と置換される)、およびプロテインAおよびホール突然変異を備えるFcを発現する第2構築物(配列番号18)を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン9は、V4ノブ構築物およびホール突然変異を備えるFcタンパク質を発現する第2構築物(配列番号17)を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。
ウェスタンブロットは、1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートが、特にノブ−ホール突然変異Fcヘテロ二量体を利用した細胞内で、2アームドイムノコンジュゲートより大量で発現することを証明した。
イムノコンジュゲートは、図9において「単量体」と表示したICON−1.5イムノコンジュゲートを含む優勢ピークを描出している図9によって証明されたように、サイズ排除クロマトグラフィーを通して上清から単離した。したがって、ICON−1.5イムノコンジュゲートを単離し、さらに細胞上清から精製することができる。
実施例2
ICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの特性解析
ICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性について特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告した(図3A参照)。
ICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの特性解析
ICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性について特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告した(図3A参照)。
次にICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート変異体は、免疫学的エフェクター細胞内で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を活性化するために抗体に関してさらに特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Promega ADCCレポーターバイオアッセイキット(カタログ番号G7018、Fitchburg, Wisconsin)を利用して抗体のADCC活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性NFAT応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のFc領域との係合後、特異的FcγRを発現するADCCバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてNFAT媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる(図3B参照)。ADCCアッセイにおいて利用された細胞系は、TFを発現する細胞系であり、これはこれらがインビトロアッセイであることを前提にすると、血管構造が非存在である場合でさえ、1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートを備えるADCCの明白な誘導であることを証明している。
実施例3
ICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート対ICON−1 2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの生成収率
ICON−1.5イムノコンジュゲートおよびICON−1イムノコンジュゲートは、別個の実験においてCHO−S哺乳動物細胞内で一過性で発現させた。ICON−1.5イムノコンジュゲートの生成収率は、ICON−1イムノコンジュゲートの生成収率より16倍高かった。
ICON−1.5 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート対ICON−1 2アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの生成収率
ICON−1.5イムノコンジュゲートおよびICON−1イムノコンジュゲートは、別個の実験においてCHO−S哺乳動物細胞内で一過性で発現させた。ICON−1.5イムノコンジュゲートの生成収率は、ICON−1イムノコンジュゲートの生成収率より16倍高かった。
実施例4
CHO−S細胞由来イムノコンジュゲート内での1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート対2アームドイムノコンジュゲートのICON−1.5結合および活性の特性解析
ICON−1.5 1アームドイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性に関してICON−1 2アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なAF488標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにプロピジウムヨウ化物(PI)染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告した(図6A参照)。結果は、ICON−1.5がICON−1と少なくとも同等に効果的に結合することを証明している。
CHO−S細胞由来イムノコンジュゲート内での1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート対2アームドイムノコンジュゲートのICON−1.5結合および活性の特性解析
ICON−1.5 1アームドイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性に関してICON−1 2アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なAF488標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにプロピジウムヨウ化物(PI)染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告した(図6A参照)。結果は、ICON−1.5がICON−1と少なくとも同等に効果的に結合することを証明している。
次にICON−1.5 1アームドイムノコンジュゲートは、免疫学的エフェクター細胞内で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を活性化する能力に関して、ICON−1 2アームドイムノコンジュゲートと一緒にさらに特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Promega ADCCレポーターバイオアッセイキット(カタログ番号G7018、Fitchburg, Wisconsin)を利用して抗体のADCC活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性NFAT応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のFc領域との係合後、特異的FcγRを発現するADCCバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてNFAT媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる(図6B参照)。結果は、ICON−1.5がADCCを活性化する能力においてICON−1と同等の活性を示すことを証明している。ADCCアッセイにおいて利用された細胞系は、TFを発現する細胞系であり、これはこれらがインビトロアッセイであることを前提にすると、血管構造が非存在である場合でさえ、1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートを備えるADCCの明白な誘導であることを証明している。
実施例5
HEK293細胞由来イムノコンジュゲート内での1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート対2アームドイムノコンジュゲートのICON−1.5結合および活性の特性解析
GGSS(配列番号11)リンカー配列を含むHEK293細胞由来ICON−1 1アームドイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性に関してGGSS(配列番号11)リンカー配列が欠如するHEK293細胞由来ICON−1.5 1アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性から死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告した(図7A参照)。結果は、GGSS(配列番号11)リンカー配列が欠如するICON−1.5イムノコンジュゲートを結合に関して上記リンカー配列を含むICON−1.5から識別不能であったことを証明している。
HEK293細胞由来イムノコンジュゲート内での1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート対2アームドイムノコンジュゲートのICON−1.5結合および活性の特性解析
GGSS(配列番号11)リンカー配列を含むHEK293細胞由来ICON−1 1アームドイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性に関してGGSS(配列番号11)リンカー配列が欠如するHEK293細胞由来ICON−1.5 1アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性から死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告した(図7A参照)。結果は、GGSS(配列番号11)リンカー配列が欠如するICON−1.5イムノコンジュゲートを結合に関して上記リンカー配列を含むICON−1.5から識別不能であったことを証明している。
GGSS(配列番号11)リンカー配列を含むHEK293細胞由来ICON−1 1アームドイムノコンジュゲートを免疫学的エフェクター細胞内で、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を活性化する能力に関して、GGSS(配列番号11)リンカー配列が欠如するHEK293細胞由来ICON−1.5 1アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Promega ADCCレポーターバイオアッセイキット(カタログ番号G7018、Fitchburg, Wisconsin)を利用して抗体のADCC活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性NFAT応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のFc領域との係合後、特異的FcγRを発現するADCCバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてNFAT媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる(図7B参照)。結果は、GGSS(配列番号11)リンカー配列が欠如するICON−1.5イムノコンジュゲートが、ADCCを活性化する能力における活性に関して、上記リンカー配列を含むICON−1.5から識別不能であったことを証明している。ADCCアッセイにおいて利用された細胞系は、TFを発現する細胞系であり、これはこれらがインビトロアッセイであることを前提にすると、血管構造が非存在である場合でさえ、1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートを備えるADCCの明白な誘導であることを証明している。
実施例6
加齢性黄斑変性症に続発性のCNVを有する患者におけるICON−1.5を評価する無作為割り付け二重盲験多施設共同実薬対照試験
本試験では、加齢性黄斑変性症(AMD)に続発性の脈絡膜新生血管(CNV)を有する患者におけるラニビズマブ単剤療法と比較して、単剤療法として、またはラニビズマブ(LUCENTIS)と併用して投与した1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの硝子体内注射の安全性を評価する。
加齢性黄斑変性症に続発性のCNVを有する患者におけるICON−1.5を評価する無作為割り付け二重盲験多施設共同実薬対照試験
本試験では、加齢性黄斑変性症(AMD)に続発性の脈絡膜新生血管(CNV)を有する患者におけるラニビズマブ単剤療法と比較して、単剤療法として、またはラニビズマブ(LUCENTIS)と併用して投与した1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの硝子体内注射の安全性を評価する。
さらに、ラニビズマブ単剤療法と比較して、単剤療法として、またはラニビズマブ(LUCENTIS)と併用して投与した1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの生物活性および薬力学的効果を評価する。
本実施例に提示した試験は、無作為割り付け二重盲験実薬対照試験として計画されている。患者は、CNVに対する治療をこれまで受けていない。患者は、1:1:1の比率で選択した試験眼において次の3つの治療群の1つに無作為割り付けされる:
・ 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート単剤療法(0.3mg)+偽薬注射
・ ラニビズマブ単剤療法(0.5mg)+偽薬注射
・ 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート(0.3mg)+ラニビズマブ(0.5mg)併用療法
・ 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート単剤療法(0.3mg)+偽薬注射
・ ラニビズマブ単剤療法(0.5mg)+偽薬注射
・ 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート(0.3mg)+ラニビズマブ(0.5mg)併用療法
無作為化は、ベースライン時の試験眼における最良矯正視力(BCVA)文字スコア(≦54文字対≧55文字)および試験実施施設によって階層化する。
患者は、注射のための各来院時に2回までの硝子体内注射を受ける。治療群間の試験遮蔽を維持するために、単剤療法を受けている患者においては偽薬注射を使用する。
患者には第0月、第1月および第2月に4週間毎に1回、試験眼に硝子体内注射が投与される。第3月以後(第3月、第4月および第5月)は、患者は、彼らの個々の観察された治療応答に基づいて、彼らの割り付けられた治療群にしたがって再治療される。遮蔽された試験担当者は、次の再治療基準を使用してこれらの来院時に治療が必要とされるかどうかを(個々の患者の応答のカテゴリーに基づいて)決定する:
・ 以前の計画来院時と比較してAMDに起因するBCVAの≧5文字の消失。
・ BCVA変化とは無関係に、以前の計画来院時と比較して増加したCNV活性(例えば、新規もしくは増加した液体および/または漏出、出血)の任意の解剖学的証拠。
・ ベースライン時(第2回来院)と比較してBCVAの変化は見られないが、持続性CNV活性の解剖学証拠(例えば、ベースライン時と比較して同一の持続性液体およびCST)がある。
・ 以前の計画来院時と比較してAMDに起因するBCVAの≧5文字の消失。
・ BCVA変化とは無関係に、以前の計画来院時と比較して増加したCNV活性(例えば、新規もしくは増加した液体および/または漏出、出血)の任意の解剖学的証拠。
・ ベースライン時(第2回来院)と比較してBCVAの変化は見られないが、持続性CNV活性の解剖学証拠(例えば、ベースライン時と比較して同一の持続性液体およびCST)がある。
0.5mgのラニビズマブを用いた救命治療は、6カ月間の治療中および下記の状態のいずれかが発生した場合のフォローアップ器官中の任意の時点にアドオン療法として試験眼に投与される。
・ ベースライン(第2回来院)時と比較してAMDに起因するBCVAの≧15文字の消失。
・ 2回の連続来院時に確証されるAMDに起因するBCVAのベースライン(第2回来院)時からの≧10文字の消失。ベースライン時と比較して≧10文字の消失を有する患者は、7日間以内に、または計画外の来院時の追加のフォローアップのためにできる限り速く病院に再来院することを要請される。
・ ベースライン(第2回来院)時と比較してAMDに起因するBCVAの≧15文字の消失。
・ 2回の連続来院時に確証されるAMDに起因するBCVAのベースライン(第2回来院)時からの≧10文字の消失。ベースライン時と比較して≧10文字の消失を有する患者は、7日間以内に、または計画外の来院時の追加のフォローアップのためにできる限り速く病院に再来院することを要請される。
遮蔽された試験担当者は、上記の基準にしたがって救命治療が必要かどうかの決定を下すことになる。
救命治療が計画された注射のための来院中に試験眼に投与される場合は、試験遮蔽が維持されていることを保証するために、非遮蔽医師が救命治療を施すが、患者の計画された試験治療/再治療は下記のとおりである。
・ 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート単剤療法群:イムノコンジュゲート単量体(0.3mg)+救命療法(0.5mgのラニビズマブ)
・ ラニビズマブ単剤療法群:ラニビズマブ(0.5mg)+偽薬注射
・ 併用療法:1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート(0.3mg)+ラニビズマブ(0.5mg)
・ 1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート単剤療法群:イムノコンジュゲート単量体(0.3mg)+救命療法(0.5mgのラニビズマブ)
・ ラニビズマブ単剤療法群:ラニビズマブ(0.5mg)+偽薬注射
・ 併用療法:1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲート(0.3mg)+ラニビズマブ(0.5mg)
救命治療が計画外の来院時に試験眼に投与される場合は、遮蔽されていない医師が要請に応じて救命治療を施す。
救命治療が試験眼に投与される場合は、患者は、プロトコールにしたがって次の来院について試験来院スケジュールを継続し、割り付けられた無作為割り付け群にしたがって試験治療を受け続ける。
安全性は、有害事象の追跡、臨床検査室試験(血清化学、血液学および凝固)、バイタルサイン測定、簡易身体検査、細隙灯生体顕微鏡検査、眼内圧(IOP)および拡張検眼鏡検査によって評価する。薬力学的および生物学的活性は、ETDRS視力表によるBCVA、スペクトル−ドメイン光コヒーレンス断層撮影法(sdOCT)、カラー眼底撮影法(CFP)、蛍光眼底血管造影法(FA)、眼底自己蛍光法(FAF)、コントラスト感受性およびマイクロペリメトリーによって測定される。薬物力学的(PK)および免疫原性は、hI−con1および抗薬物抗体の血漿中濃度を測定することによって評価する。
実施例7
CHO細胞および292細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよびADCCレポーターアッセイ
CHO細胞および293細胞中で生成されたGGSSリンカー配列[配列番号12、11および15の連鎖と共発現した配列番号18]を含有する1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートをFc融合タンパク質のセルベース結合親和性に関して生成宿主細胞系の効果を評価するためにBHK細胞および293細胞中で生成された2アームドICON−1イムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用することによって、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告し、95%信頼区間(95%CI)を備えるEC50値は、4パラメーターフィット法を使用して引き出した。図10の左側のパネルを参照。結果は、293細胞中で生成されたICON−1.5がBHK細胞中で生成されたICON−1と類似してTFに結合するが、他方CHO細胞中で生成されたどちらの形態も減少した結合を有する。
CHO細胞および292細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよびADCCレポーターアッセイ
CHO細胞および293細胞中で生成されたGGSSリンカー配列[配列番号12、11および15の連鎖と共発現した配列番号18]を含有する1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートをFc融合タンパク質のセルベース結合親和性に関して生成宿主細胞系の効果を評価するためにBHK細胞および293細胞中で生成された2アームドICON−1イムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用することによって、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告し、95%信頼区間(95%CI)を備えるEC50値は、4パラメーターフィット法を使用して引き出した。図10の左側のパネルを参照。結果は、293細胞中で生成されたICON−1.5がBHK細胞中で生成されたICON−1と類似してTFに結合するが、他方CHO細胞中で生成されたどちらの形態も減少した結合を有する。
CHO細胞および293細胞中で生成された1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートは、免疫学的エフェクター細胞中で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を活性化する能力に関して、BHK細胞およびCHO細胞中で生成された2アームドICON−1イムノコンジュゲートと一緒にさらに特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Promega ADCCレポーターバイオアッセイキット(カタログ番号G7018、Fitchburg, Wisconsin)を利用してFC融合タンパク質のADCC活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性NFAT応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のFc領域またはFc融合タンパク質との係合後、特異的FcγRを発現するADCCバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてNFAT媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる(図10の右側のパネルを参照。結果は、BHK細胞中で生成されたICON−1が、CHO細胞中で生成されたICON−1ならびにCHO細胞および293細胞中で生成されたICON−1.5イムノコンジュゲートよりも低いEC50および高い絶対シグナルによって観察されるように、より強力なADCC活性を示すことを証明している。これらの所見に基づくと、ICON−1.5はさらにBHK細胞中でも生成されたので、同一タイプのアッセイにおける試験を受けた。図11を参照。
実施例8
BHK細胞および292細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよびADCCレポーターアッセイ
GGSS(配列番号11)リンカー配列(配列番号12および15の連鎖を用いて共発現した配列番号18)を伴わないBHK細胞1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートは、BHK細胞ICON−1と一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用することによって、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告し、95%信頼区間(95%CI)を備えるEC50値は、4パラメーターフィット法を使用して引き出した。図11の左側のパネルを参照。結果は、BHK細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲートが結合に関してBHK細胞由来ICON−1から識別不能であったことを証明している。
BHK細胞および292細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよびADCCレポーターアッセイ
GGSS(配列番号11)リンカー配列(配列番号12および15の連鎖を用いて共発現した配列番号18)を伴わないBHK細胞1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートは、BHK細胞ICON−1と一緒に特性解析した。TFを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系A431(ATCC CRL-1555(商標)、Manassas, Virginia)由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した(18種の異なる濃度の)タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Fc二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにTO−PRO−3ヨウ化物染色アッセイを使用することによって、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度(MFI)として報告し、95%信頼区間(95%CI)を備えるEC50値は、4パラメーターフィット法を使用して引き出した。図11の左側のパネルを参照。結果は、BHK細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲートが結合に関してBHK細胞由来ICON−1から識別不能であったことを証明している。
1アームドBHK細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲートは、免疫学的エフェクター細胞中で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を活性化する能力に関して、BHK細胞由来ICON−1と一緒に特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Promega ADCCレポーターバイオアッセイキット(カタログ番号G7018、Fitchburg, Wisconsin)を利用してFC融合タンパク質のADCC活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性NFAT応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のFc領域またはFc融合タンパク質との係合後、特異的FcγRを発現するADCCバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてNFAT媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる。図11の右側のパネルを参照。結果は、BHK細胞由来ICON−1.5イムノコンジュゲートがADCCを活性化する能力における活性に関してBHK細胞由来ICON−1から識別不能であったことを証明している。
実施例9
セルベースFXa変換アッセイ
FVIIaのTFへの結合はFX酵素原を組立て、活性凝固プロテアーゼFXaへの転換をもたらすが、これはTF:FVIIa複合体からの放出が生じると、トロンビン生成および血餅形成を促進する。ICON−1.5の潜在的抗凝固活性およびFVIIa誘導性FX活性化を妨害する能力を決定するために、細胞は、200nMのFX酵素原および20nMのFVIIaの存在下で指示した濃度のICON−1およびICON1.5とともにインキュベートした。5分間のインキュベーション後、反応はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を用いて停止させ、FXから生成したFXaの量はSN−7と呼ばれる蛍光原基質(Haemtech SN−7 6−アミノ−1−ナフタレンスルホンアミドベースの(ANSN)蛍光原基質)の変換を測定することによって評価した。このアッセイの結果は、ICON−1およびICON−1.5がFVIIa誘導性FX活性化を妨害する、匹敵する限定された能力を有することを示している。図12を参照。
セルベースFXa変換アッセイ
FVIIaのTFへの結合はFX酵素原を組立て、活性凝固プロテアーゼFXaへの転換をもたらすが、これはTF:FVIIa複合体からの放出が生じると、トロンビン生成および血餅形成を促進する。ICON−1.5の潜在的抗凝固活性およびFVIIa誘導性FX活性化を妨害する能力を決定するために、細胞は、200nMのFX酵素原および20nMのFVIIaの存在下で指示した濃度のICON−1およびICON1.5とともにインキュベートした。5分間のインキュベーション後、反応はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を用いて停止させ、FXから生成したFXaの量はSN−7と呼ばれる蛍光原基質(Haemtech SN−7 6−アミノ−1−ナフタレンスルホンアミドベースの(ANSN)蛍光原基質)の変換を測定することによって評価した。このアッセイの結果は、ICON−1およびICON−1.5がFVIIa誘導性FX活性化を妨害する、匹敵する限定された能力を有することを示している。図12を参照。
実施例10
組換えTF因子キサーゼアッセイ
キサーゼは、TF、FVIIa、リン脂質およびCa++からなるタンパク分解性複合体である。キサーゼは、第X因子を第Xa因子に切断する。アッセイの根拠は、キサーゼ複合体を単独または試験分子と組み合わせてインキュベートし、次に第X因子を添加することである。試験分子がFVIIaアナログ、例えばICON−1およびICON−1.5である場合は、反応は、それらの凝結促進活性を評価するために、添加されたFVIIaの非存在下でランすることができる。反応は、Ca++をキレート化するEDTAを含有する溶液の添加によって、規定の時点に停止させる。Spectrazyme FXaは、次にFXaと一緒にFXを含有するキレート化反応混合物に添加される。切断されたSpectrazyme FXaの量は、存在するFXaseの量に正比例している。試験品目がFVIIaのTFへの結合を妨害する場合は、これはFXase活性の減少を生じさせるであろう。BHK細胞由来1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートは、TFの3種の形態:Innovin、RecombiplasTin 2Gおよび胎盤TFを使用してFXaseを調節する能力に関して、BHK細胞由来ICON−1と一緒に特性解析した。データは、反応混合物に20nMで添加されたFVIIaを用いて210秒間で観察された活性の百分率として表示する。これらの結果は、ICON−1およびICON−1.5がFXaseを媒介する、匹敵する弱い能力を有する(FVIIaを用いて観察された20%未満の活性)。結果は、ICON−1およびICON−1.5がインビトロFXase活性において3つの形態のTFと相互作用する組換えFVIIaの能力に類似の阻害活性を有することもさらに示している。図13を参照。
組換えTF因子キサーゼアッセイ
キサーゼは、TF、FVIIa、リン脂質およびCa++からなるタンパク分解性複合体である。キサーゼは、第X因子を第Xa因子に切断する。アッセイの根拠は、キサーゼ複合体を単独または試験分子と組み合わせてインキュベートし、次に第X因子を添加することである。試験分子がFVIIaアナログ、例えばICON−1およびICON−1.5である場合は、反応は、それらの凝結促進活性を評価するために、添加されたFVIIaの非存在下でランすることができる。反応は、Ca++をキレート化するEDTAを含有する溶液の添加によって、規定の時点に停止させる。Spectrazyme FXaは、次にFXaと一緒にFXを含有するキレート化反応混合物に添加される。切断されたSpectrazyme FXaの量は、存在するFXaseの量に正比例している。試験品目がFVIIaのTFへの結合を妨害する場合は、これはFXase活性の減少を生じさせるであろう。BHK細胞由来1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートは、TFの3種の形態:Innovin、RecombiplasTin 2Gおよび胎盤TFを使用してFXaseを調節する能力に関して、BHK細胞由来ICON−1と一緒に特性解析した。データは、反応混合物に20nMで添加されたFVIIaを用いて210秒間で観察された活性の百分率として表示する。これらの結果は、ICON−1およびICON−1.5がFXaseを媒介する、匹敵する弱い能力を有する(FVIIaを用いて観察された20%未満の活性)。結果は、ICON−1およびICON−1.5がインビトロFXase活性において3つの形態のTFと相互作用する組換えFVIIaの能力に類似の阻害活性を有することもさらに示している。図13を参照。
実施例11
二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性(ADC)アッセイ
二次ADCアッセイは、その受容体への結合後に、抗体またはFc融合タンパク質がこの抗体またはFC融合タンパク質へのペイロードの直接的コンジュゲート化を伴わずに内在化して細胞死滅を媒介する能力を評価することを可能にする。二次抗体、この場合は抗チューブリン剤MMAFに結合した抗Fc Fab断片(モノメチルアウリスタチンF)またはDNA挿入剤PNU−159268(ネモルビシンの誘導体)は、分子のFc部分に結合する。細胞がコンジュゲート化した二次抗体との複合体中に抗体またはFc融合タンパク質を内在化する場合は、用量依存性細胞殺滅が観察される。培養中の生存細胞の数をATP(代謝的に活性な細胞のインジケーター)の定量に基づいて決定するための方法であるCellTiter-Glo 2.0(CTG)アッセイを使用した。
二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性(ADC)アッセイ
二次ADCアッセイは、その受容体への結合後に、抗体またはFc融合タンパク質がこの抗体またはFC融合タンパク質へのペイロードの直接的コンジュゲート化を伴わずに内在化して細胞死滅を媒介する能力を評価することを可能にする。二次抗体、この場合は抗チューブリン剤MMAFに結合した抗Fc Fab断片(モノメチルアウリスタチンF)またはDNA挿入剤PNU−159268(ネモルビシンの誘導体)は、分子のFc部分に結合する。細胞がコンジュゲート化した二次抗体との複合体中に抗体またはFc融合タンパク質を内在化する場合は、用量依存性細胞殺滅が観察される。培養中の生存細胞の数をATP(代謝的に活性な細胞のインジケーター)の定量に基づいて決定するための方法であるCellTiter-Glo 2.0(CTG)アッセイを使用した。
293細胞中で生成されたICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成されたICON−1は、高レベルのTFを発現するブドウ膜メラノーマ細胞系Mel290を用いた二次ADCアッセイにおいて評価した。10nMのICON−1またはICON−1.5および60mMの二次試薬で出発する10時点の3.5倍滴定を細胞に加えた。細胞を3日間インキュベートし、その後にCTGアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む1アームドICON−1.5および2アームドICON−1イムノコンジュゲートについて匹敵するIC50が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図14を参照。
実施例12
多数の細胞背景由来の二次抗体を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性(ADC)アッセイ
293細胞中で生成した1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成した2アームドICON−1イムノコンジュゲートは、二次抗体が、どちらの細胞系も高レベルのTFを発現する扁平上皮癌細胞系A431および膵臓腺癌細胞系BxPC3中のチューブリン阻害剤MMAFとコンジュゲート化させられるADCアッセイにおいて評価した。10nMのICON−1およびICON−1.5および60mMの二次試薬で出発する10時点の3.5倍滴定を細胞に加えた。細胞を3日間インキュベートし、その後にCTGアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む1アームドICON−1.5および2アームドICON−1イムノコンジュゲートについて匹敵するIC50が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図15を参照。
多数の細胞背景由来の二次抗体を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性(ADC)アッセイ
293細胞中で生成した1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成した2アームドICON−1イムノコンジュゲートは、二次抗体が、どちらの細胞系も高レベルのTFを発現する扁平上皮癌細胞系A431および膵臓腺癌細胞系BxPC3中のチューブリン阻害剤MMAFとコンジュゲート化させられるADCアッセイにおいて評価した。10nMのICON−1およびICON−1.5および60mMの二次試薬で出発する10時点の3.5倍滴定を細胞に加えた。細胞を3日間インキュベートし、その後にCTGアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む1アームドICON−1.5および2アームドICON−1イムノコンジュゲートについて匹敵するIC50が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図15を参照。
実施例13
MDA−MB−231トリプルネガティブ乳癌細胞系由来の二次抗体を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性(ADC)アッセイ
293細胞中で生成した1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成した2アームドICON−1イムノコンジュゲートは、二次抗体が高レベルのTFを発現するトリプルネガティブ乳癌細胞系MDA−MB−231中のチューブリン阻害剤MMAFとコンジュゲート化させられるADCアッセイにおいて評価した。10nMのICON−1またはICON−1.5および60mMの二次試薬で出発する10時点の3.5倍滴定を細胞に加えた。細胞を3日間インキュベートし、その後にCTGアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む1アームドICON−1.5および2アームドICON−1イムノコンジュゲートについて匹敵するIC50が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図16を参照。
MDA−MB−231トリプルネガティブ乳癌細胞系由来の二次抗体を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性(ADC)アッセイ
293細胞中で生成した1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成した2アームドICON−1イムノコンジュゲートは、二次抗体が高レベルのTFを発現するトリプルネガティブ乳癌細胞系MDA−MB−231中のチューブリン阻害剤MMAFとコンジュゲート化させられるADCアッセイにおいて評価した。10nMのICON−1またはICON−1.5および60mMの二次試薬で出発する10時点の3.5倍滴定を細胞に加えた。細胞を3日間インキュベートし、その後にCTGアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む1アームドICON−1.5および2アームドICON−1イムノコンジュゲートについて匹敵するIC50が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図16を参照。
実施例14
BHK細胞由来のICON−1および293細胞由来のICON−1.5がFVIIa誘導性細胞シグナル伝達に及ぼす作用
FVIIaのTFへの結合は、PAR2およびMAPKシグナル伝達のタンパク質溶解活性化を含む、複数のシグナル伝達カスケードの活性化を媒介する。これらの事象は、例えばIL−8、GM−CSFおよびCXCL1などの前炎症性サイトカインのアップレギュレーションをもたらし、結果として新血管新生、腫瘍増殖および転移を促進する。293細胞中で生成した1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成した2アームドICON−1イムノコンジュゲートをFVIIa誘導性細胞シグナル伝達において試験した。これらの実験のために、MDA−MB−231細胞を2時間にわたり血清飢餓させ、その後にICON−1またはICON−1.5(250nMで開始して7時点、4倍の滴定)との30分間のインキュベーションを続けた。次にFVIIaは、培地および細胞を含有するFC融合タンパク質に5時間にわたって加え、上清を収集した。IL−8およびGM−CSFレベルをELISAによって測定した。これらの結果は、1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートがサイトカインシグナル伝達に2アームドICON1−1より実質的に大きな阻害作用を有することを示している。図17を参照。
BHK細胞由来のICON−1および293細胞由来のICON−1.5がFVIIa誘導性細胞シグナル伝達に及ぼす作用
FVIIaのTFへの結合は、PAR2およびMAPKシグナル伝達のタンパク質溶解活性化を含む、複数のシグナル伝達カスケードの活性化を媒介する。これらの事象は、例えばIL−8、GM−CSFおよびCXCL1などの前炎症性サイトカインのアップレギュレーションをもたらし、結果として新血管新生、腫瘍増殖および転移を促進する。293細胞中で生成した1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成した2アームドICON−1イムノコンジュゲートをFVIIa誘導性細胞シグナル伝達において試験した。これらの実験のために、MDA−MB−231細胞を2時間にわたり血清飢餓させ、その後にICON−1またはICON−1.5(250nMで開始して7時点、4倍の滴定)との30分間のインキュベーションを続けた。次にFVIIaは、培地および細胞を含有するFC融合タンパク質に5時間にわたって加え、上清を収集した。IL−8およびGM−CSFレベルをELISAによって測定した。これらの結果は、1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートがサイトカインシグナル伝達に2アームドICON1−1より実質的に大きな阻害作用を有することを示している。図17を参照。
実施例15
マウス異種移植片試験においてインビボ腫瘍増殖上のTFに対して向けられた作用物質の作用
TFに対して向けられた作用物質がインビボでの腫瘍増殖に及ぼす潜在的作用を評価するために、雌性無胸腺ヌードマウス(Crl:NU(NCr)−Foxn1nu、Charles River)において異種移植片試験を実施した。A431細胞を指数増殖中に採取し、1×108cells/mLの濃度でPBS中に再懸濁させた。移植当日、各試験マウスには、右側腹部の皮下に1×107A431細胞(0.1mLの細胞懸濁液)を移植し、細胞増殖が平均サイズが100〜125mm3の標的範囲に近付く様子を監視した。試験の第1日と指定された7日後、動物を3コホート(n=10)に分類したが、個々の腫瘍容積は88〜172mm3の範囲内であり、群平均腫瘍容積は108〜140mm3であった。293細胞中で生成された1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成された2アームドICON−1イムノコンジュゲートが腫瘍増殖に及ぼす作用を試験するために、タンパク質を3週間にわたり週1回、10mg/kgの用量の腹腔内注射によって送達した。
マウス異種移植片試験においてインビボ腫瘍増殖上のTFに対して向けられた作用物質の作用
TFに対して向けられた作用物質がインビボでの腫瘍増殖に及ぼす潜在的作用を評価するために、雌性無胸腺ヌードマウス(Crl:NU(NCr)−Foxn1nu、Charles River)において異種移植片試験を実施した。A431細胞を指数増殖中に採取し、1×108cells/mLの濃度でPBS中に再懸濁させた。移植当日、各試験マウスには、右側腹部の皮下に1×107A431細胞(0.1mLの細胞懸濁液)を移植し、細胞増殖が平均サイズが100〜125mm3の標的範囲に近付く様子を監視した。試験の第1日と指定された7日後、動物を3コホート(n=10)に分類したが、個々の腫瘍容積は88〜172mm3の範囲内であり、群平均腫瘍容積は108〜140mm3であった。293細胞中で生成された1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよびBHK細胞中で生成された2アームドICON−1イムノコンジュゲートが腫瘍増殖に及ぼす作用を試験するために、タンパク質を3週間にわたり週1回、10mg/kgの用量の腹腔内注射によって送達した。
腫瘍は、サイズを監視するために2次元のカリパスを用いて第1日に出発して週2回測定した。試験エンドポイントは、コントロール群における2,000mm3の平均腫瘍容積または22日間のいずれか早い方であると規定した。試験は、第22日に終了した。これらの結果は、1アームドICON−1.5イムノコンジュゲートおよび2アームドICON−1が腫瘍増殖に類似の作用を有したことを示している。図18を参照。
実施例17
レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のウサギモデルにおけるICON−1.5の有効性を評価する薬理学的試験
本試験は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のウサギモデルにおける抗VEGF単剤療法と比較して、単剤療法または抗VEGF剤、例えばラニビズマブ(LUCENTIS)またはアフリベルセプト(EYLEA)との併用療法として投与された1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの硝子体内注射の有効性を評価する。1群当たり動物4匹および6群。群は:(1)ビヒクル群、(2)300μg群、(3)600μg群、(4)900μg群、(5)アフリベルセプト2.0mg群、および(6)アフリベルセプト2.0mg+600μgのICON−1(並行研究ではICON−1.5)群からなる。
レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のウサギモデルにおけるICON−1.5の有効性を評価する薬理学的試験
本試験は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のウサギモデルにおける抗VEGF単剤療法と比較して、単剤療法または抗VEGF剤、例えばラニビズマブ(LUCENTIS)またはアフリベルセプト(EYLEA)との併用療法として投与された1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの硝子体内注射の有効性を評価する。1群当たり動物4匹および6群。群は:(1)ビヒクル群、(2)300μg群、(3)600μg群、(4)900μg群、(5)アフリベルセプト2.0mg群、および(6)アフリベルセプト2.0mg+600μgのICON−1(並行研究ではICON−1.5)群からなる。
ウサギは第0日(D0)に両眼についてレーザー治療する(OU)。試験製品およびビヒクルは、D7に硝子体内(IVT)注射によって両眼に投与する。ラニビズマブ(LUCENTIS)またはアフリベルセプト(EYLEA)は、レーザー直後の第0日(D0)に投与する。併用群(第7群)では、抗VEGF剤はD0に注射し、1アームドFVII−FcイムノコンジュゲートをD7に注射する。
眼検査:眼検査のための散瞳は、局所的1%トロピカミドHCL(試験15分前に各眼に1滴)を使用して実施する。眼の表面形態、前区および後区炎症、白内障形成および網膜変化を評価するための側像検眼鏡検査および細隙灯生体顕微鏡検査を使用する完全眼検査(Hackett and McDonaldの変法)は、ベースライン時およびD14に獣医学眼科医によって実施する。
蛍光眼底血管造影法(FA):FAは、レーザー治療後のD7、D10およびD14に全動物の両眼で実施する。FAのための散瞳は、局所的1%トロピカミドHCL(試験15分前に各眼に1滴)を使用して実施する。全FAは、硝子体内フルオレセインナトリウム注射(12mg/kg)の1〜5分後に実施する。得られた遮蔽画像は、読取者が分析する。最大フルオレセイン漏出面積は、各病変についてImage Jを使用して測定する。
インサイチューハイブリダイゼーション(ISH)およびフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン染色によって検出された脈絡膜血管分布のフラットマウント分析のために全眼を収集した。
実施例18
レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のブタモデルにおけるICON−1.5の有効性を評価する薬理学的試験
本試験は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のブタモデルにおける抗VEGF単剤療法と比較して、単剤療法または抗VEGF剤、例えばラニビズマブ(LUCENTIS)またはアフリベルセプト(EYLEA)との併用療法として投与された1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの硝子体内注射の有効性を評価する。1群当たり動物4匹および6群。群は:(1)ビヒクル群、(2)300μg群、(3)600μg群、(4)900μg群、(5)アフリベルセプト2.0mg群、および(6)アフリベルセプト2.0mg+600μgのICON−1(並行研究ではICON−1.5)群からなる。
レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のブタモデルにおけるICON−1.5の有効性を評価する薬理学的試験
本試験は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生(CNV)のブタモデルにおける抗VEGF単剤療法と比較して、単剤療法または抗VEGF剤、例えばラニビズマブ(LUCENTIS)またはアフリベルセプト(EYLEA)との併用療法として投与された1アームドFVII−Fcイムノコンジュゲートの硝子体内注射の有効性を評価する。1群当たり動物4匹および6群。群は:(1)ビヒクル群、(2)300μg群、(3)600μg群、(4)900μg群、(5)アフリベルセプト2.0mg群、および(6)アフリベルセプト2.0mg+600μgのICON−1(並行研究ではICON−1.5)群からなる。
ブタは第0日(D0)に両眼についてレーザー治療する(OU)。試験製品およびビヒクルは、D7に硝子体内(IVT)注射によって両眼に投与する。ラニビズマブ(LUCENTIS)またはアフリベルセプト(EYLEA)は、レーザー直後の第0日(D0)に投与する。併用群(第7群)では、抗VEGF剤はD0に注射し、1アームドFVII−FcイムノコンジュゲートをD7に注射する。
眼検査:眼検査のための散瞳は、局所的1%トロピカミドHCL(試験15分前に各眼に1滴)を使用して実施する。眼の表面形態、前区および後区炎症、白内障形成および網膜変化を評価するために側像検眼鏡検査および細隙灯生体顕微鏡検査を使用する完全眼検査(Hackett and McDonaldの変法)は、ベースライン時およびD14に獣医学眼科医によって実施する。
蛍光眼底血管造影法(FA)FAは、レーザー治療後のD7、D10およびD14に全動物の両眼で実施する。FAのための散瞳は、局所的1%トロピカミドHCL(試験15分前に各眼に1滴)を使用して実施する。全FAは、硝子体内フルオレセインナトリウム注射(12mg/kg)の1〜5分後に実施する。得られた遮蔽画像は、読取者が分析する。最大フルオレセイン漏出面積は、各病変についてImage Jを使用して測定する。
全眼は、ISHおよびフラットマウント分析のために収集する。
本発明は本発明の特定の実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者であれば、様々な変更を加えることができ、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱せずに同等物と置換できることを理解できるはずである。さらに、ここに記載した発明の客観的趣旨および範囲に対する特定の状態、材料、合成物、プロセス、プロセス工程(単数または複数)を採用するために、多数の修飾を加えることができる。そのようなすべての修飾は、添付の特許請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
本明細書において参照された特許、特許出願、特許出願公開、学術論文およびプロトコールは、それらの全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる。
Claims (95)
- 2つの二量体化免疫グロブリン(Ig)Fc単量体および変異第VII因子タンパク質を含むイムノコンジュゲートであって、前記変異第VII因子タンパク質は、前記Fc単量体の一方にのみ融合しており、前記変異第VII因子タンパク質は、野生型第VII因子タンパク質と比較して、哺乳動物宿主において減少した凝固反応を示すイムノコンジュゲート。
- 前記変異第VII因子タンパク質は、哺乳動物宿主において凝固反応を示さない、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記Ig Fc単量体と前記第VII因子タンパク質との間にリンカー配列をさらに含む、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記Ig Fc単量体のそれぞれは、ヒンジ配列を含む、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記Ig Fc単量体の1つ以上は、リンカー配列およびヒンジ配列を含む、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記リンカーおよび/またはヒンジ配列は、1つ以上のシステインアミノ酸残基を含む、請求項3〜5のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記2つの二量体化Ig Fc単量体は、1つ以上のジスルフィド結合によって一緒に連結されている、請求項6に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記二量体化Ig Fcは、ホモ二量体である、請求項7に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記二量体化Ig Fcは、ヘテロ二量体である、請求項7に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記ヘテロ二量体は、T366Y突然変異を備えるFc単量体およびY407T突然変異を備えるFc単量体を含む、またはT366Y突然変異に対応する突然変異を備えるFc単量体およびY407T突然変異に対応する突然変異を備えるFc単量体を含む、請求項9に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記Ig Fc単量体の1つ以上は、配列番号27の前記アミノ酸配列からなる、請求項7に記載のイムノコンジュゲート。
- リンカーの前記存在は、リンカーが欠如する前記イムノコンジュゲートと比較して、前記イムノコンジュゲートの生成収率の増加を生じさせる、請求項3および5〜11のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記Ig Fc単量体は、ヒトIgG Fc単量体である、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記ヒトIgG Fc単量体は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択される、請求項13に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記ヒトIgG Fc単量体は、IgG1の単量体である、請求項14に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記ヒトIgG Fc単量体は、配列番号13、15、17、26、27、29および31から選択される前記アミノ酸配列を含む、請求項15に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記変異ヒトFVIIタンパク質は、Lys341またはSer344で単一点突然変異を含む、請求項1〜16に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記単一点突然変異は、Lys341からAla341である、請求項17に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記単一点突然変異は、Ser344からAla344である、請求項17に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記変異ヒトFVIIタンパク質は、Lys341およびSer344で点突然変異を含む、請求項1〜16に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記変異ヒトFVIIタンパク質は、Ser344からAla344の点突然変異をさらに含む、請求項20に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記変異ヒトFVIIタンパク質は、配列番号12の前記アミノ酸配列を含む、請求項21に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記イムノコンジュゲートは、フコシル化、N−グリコシル化、O−グリコシル化または無フコシル化されている、請求項1〜22に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記ヒンジ配列は、配列番号19〜25の任意の1つとの少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項6〜23に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記ヒンジ配列は、配列番号19〜25のいずれか1つにおける少なくとも2つの保存的アミノ酸置換を備えるアミノ酸配列を含む、請求項6〜24に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記リンカーは、少なくとも8個のアミノ酸残基を含む、請求項6〜25に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記リンカーは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)アミノ酸配列からなる、請求項6〜25に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記リンカーは、GSA、GGGまたはGGSS(配列番号11)アミノ酸配列の1つ以上のタンデムリピートを含む、請求項6〜25に記載のイムノコンジュゲート。
- 前記イムノコンジュゲートにはリンカー配列が欠如する、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記イムノコンジュゲートを含む組成物。
- それを必要とする患者における癌関連新血管新生を減少させるための方法であって、前記患者に請求項1〜29に記載の前記イムノコンジュゲートまたは請求項30に記載の前記組成物のいずれか1つを投与することを含む方法。
- それを必要とする患者における癌関連新血管新生の進行を緩徐化するための方法であって、前記患者に請求項30に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
- それを必要とする患者における新規な癌関連新血管新生を予防するための方法であって、前記患者に請求項30に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
- それを必要とする患者における癌関連新血管新生を逆転させるための方法であって、前記患者に請求項30に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
- それを必要とする患者の眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)を治療するための方法であって、前記患者に請求項30に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
- 前記ウエット型AMDを治療することは、治療を必要とする前記患者の眼における脈絡膜血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む、請求項35に記載の方法。
- それを必要とする患者の眼における眼の血管新生を予防する、阻害する、または逆転させるための方法であって、前記患者に請求項30に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
- それを必要とする患者における腫瘍新血管新生を逆転させるための方法であって、前記患者に請求項30に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
- 前記新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、新生児網膜症(ROP)または血管新生緑内障と関連する、請求項37または38に記載の方法。
- 前記新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)または血管新生緑内障に続発性である、請求項37または38に記載の方法。
- 前記新血管新生は、脈絡膜血管新生である、請求項37または38に記載の方法。
- 前記患者は、前記眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症(AMD)であると以前に診断されている、請求項41に記載の方法。
- 前記脈絡膜血管新生は、ウエット型AMDに続発性である、請求項41に記載の方法。
- 前記患者の前記眼は、脈絡膜血管新生またはウエット型AMDに対して以前に治療されていない、請求項40または41に記載の方法。
- 前記患者は、脈絡膜血管形成に対して、抗血管内皮細胞成長因子(VEGF)療法、レーザー療法または手術を用いて以前に治療されている、請求項40または41に記載の方法。
- 投与することは、硝子体内注射を含む、請求項35〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 投与することは、脈絡上板注射を含む、請求項35〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 全身性投与を含む、請求項35〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 投与することは、複数回の投与セッションを含む、請求項35〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数回の投与セッションは、2回以上、3回以上、4回以上または5回以上の投与セッションを含む、請求項49に記載の方法。
- 各投与セッションは、約20日間〜約50日間、または約20日間〜約40日間、または約20日間〜約30日間の間隔を空けている、請求項49または50に記載の方法。
- 前記複数回の投与セッションは、12〜24回の投与セッションを含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 投与することは、前記患者の前記眼内への28日間毎に1回、30日間毎に1回または35日間毎に1回の前記組成物の硝子体内注射を含む、請求項49〜52に記載のいずれか一項に記載の方法。
- 投与することは、静脈内注射を含む、請求項31〜45および46〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 投与することは、腫瘍内注射を含む、請求項31〜45および46〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者は、投与する工程の前の前記患者の最良矯正視力(BCVA)測定と比較して、BCVA測定において文字の消失が15文字未満であることによって測定されるように、前記投与する工程の後に彼(または彼女)の視力を実質的に維持する、請求項35〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者は、前記投与する工程の前の前記患者の最良矯正視力(BCVA)測定と比較して、BCVA測定において15文字の増加によって測定されるように、前記投与する工程に引き続いて視力の改善を経験する、請求項35〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与する工程に引き続いて、蛍光眼底血管造影法または光干渉断層撮影法によって測定されるように、前記CNV領域は、前記投与する工程の前の前記CNV領域と比較して、前記患者の前記眼内で減少する、請求項35〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CNV領域は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%または少なくとも約50%減少する、請求項58に記載の方法。
- 前記投与する工程に引き続いて、前記患者の前記眼の前記網膜厚は、前記患者の前記眼においては、前記治療開始前の前記眼の前記網膜厚と比較して減少する、請求項35〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記網膜厚は、少なくとも約50μm、少なくとも約100μm、少なくとも約150μm、少なくとも約175μm、少なくとも約200μm、少なくとも約225μmまたは少なくとも約250μm減少する、請求項60に記載の方法。
- 前記網膜厚は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%または少なくとも約50%減少する、請求項60に記載の方法。
- 前記減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚(CST)、減少した中心点厚(CPT)または減少した中心窩厚(CFT)である、請求項60〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に前記患者の前記眼における前記眼内圧(IOP)を測定することをさらに含む、請求項35〜53および56〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者の前記眼における前記IOPを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の後に約20分間、約30分間、約40分間、約50分間または約1時間測定することをさらに含む、請求項61に記載の方法。
- 前記患者の前記眼における前記IOPを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に約20分間、約30分間、約40分間、約50分間または約1時間測定することを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記IOPは、眼圧測定法によって測定される、請求項64〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者に有効量の新血管新生阻害剤を投与することをさらに含む、請求項31〜33および35〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、前記有効量の前記イムノコンジュゲートと前記同一組成物中に存在する、請求項68に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、前記有効量の前記イムノコンジュゲートとは異なる組成物中に存在する、請求項68に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、血管内皮細胞成長因子(VEGF)阻害剤、VEGF受容体阻害剤、血小板由来成長因子(PDGF)阻害剤またはPDGF受容体阻害剤である、請求項68〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、ラニビズマブである、請求項68に記載の方法。
- ラニビズマブの前記用量は、約0.2mg〜約1mgである、請求項72に記載の方法。
- ラニビズマブの前記用量は、0.3mgまたは0.5mgである、請求項72または73に記載の方法。
- ラニビズマブは、硝子体内注射によって前記患者の前記眼に投与される、請求項72〜74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量の前記新血管新生阻害剤を含む前記組成物は、硝子体内注射によって前記患者の前記眼に投与される、請求項68〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量の前記新血管新生阻害剤を含む前記組成物は、前記複数回の投与セッションのそれぞれで投与される、請求項76に記載の方法。
- 1アームドおよび2アームドイムノコンジュゲート両方の混合物を含む組成物であって、前記1アームドおよび2アームドイムノコンジュゲートは、1:1、1:5、1:10、1:25、1:50、1:100、100:1、50:1、25:1、10:1または5:1の比率で存在する組成物。
- 前記第VII因子タンパク質は、ヒト第VII因子タンパク質である、請求項1に記載のイムノコンジュゲート。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記イムノコンジュゲートおよび医薬上許容される賦形剤を含む製剤。
- 前記製剤は、ラニビズマブをさらに含む、請求項80に記載の製剤。
- 前記製剤は、アルギニン溶液をさらに含む、請求項80または81に記載の製剤。
- 前記製剤は、下記の:HEPES溶液、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ポリソルベート−80およびアルギニン溶液のうちの1つ以上をさらに含む、請求項80〜82のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記癌関連新血管新生には、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、膵臓癌、膀胱癌、肝臓癌、眼メラノーマ、肺癌、子宮内膜癌、胃癌およびリンパ腺癌が関連する、請求項31に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、同時に投与される、請求項68に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、連続的に投与される、請求項68に記載の方法。
- 前記新血管新生阻害剤は、アフリベルセプトである、請求項68に記載の方法。
- 前記組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させる、請求項30または78に記載の組成物。
- 前記組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を2アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも1.5倍以上減少させる、請求項88に記載の組成物。
- 前記前炎症性サイトカインは、IL−8またはGM−CSFである、請求項88に記載の組成物。
- 前記投与は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させる、請求項30〜77および84〜87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を2アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも1.5倍以上減少させる、請求項91に記載の方法。
- 前記前炎症性サイトカインは、IL−8またはGM−CSFである、請求項91に記載の方法。
- 1アームドイムノコンジュゲートを含む組成物であって、2アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記イムノコンジュゲートを含む組成物であって、2アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2001002439A1 (en) * | 1999-07-01 | 2001-01-11 | Yale University | Neovascular-targeted immunoconjugates |
US6924359B1 (en) * | 1999-07-01 | 2005-08-02 | Yale University | Neovascular-targeted immunoconjugates |
JP2006516564A (ja) * | 2003-01-22 | 2006-07-06 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Tf結合薬剤及びそれらの使用 |
TWI353991B (en) * | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
RU2373282C2 (ru) * | 2003-06-19 | 2009-11-20 | Байер Хелткэр Ллк | ВАРИАНТЫ ДОМЕНА GLA ФАКТОРА VII ИЛИ VIIa |
US20080193441A1 (en) * | 2003-11-18 | 2008-08-14 | Iconic Therapeutics, Inc. | Homogeneous Preparations of Chimeric Protein |
WO2008100470A2 (en) * | 2007-02-15 | 2008-08-21 | Transtech Pharma, Inc. | Rage - immunoglobulin fusion proteins |
TWI538916B (zh) * | 2008-04-11 | 2016-06-21 | 介控生化科技公司 | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
US9879081B2 (en) * | 2013-06-25 | 2018-01-30 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof |
RU2018106348A (ru) * | 2015-07-22 | 2019-08-22 | Айконик Терапьютикс, Инк. | Способы лечения расстройств, связанных с ангиогенезом и неоваскуляризацией |
US20180355030A1 (en) * | 2015-11-13 | 2018-12-13 | Iconic Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating disorders associated with pathological neovascularization |
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