JP2019509468A - 蛍光クエンチングおよび再染色を連続して使用した生体試料の複数表現型サブタイプ分類 - Google Patents
蛍光クエンチングおよび再染色を連続して使用した生体試料の複数表現型サブタイプ分類 Download PDFInfo
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Abstract
Description
標準的なCTC蛍光染色パネルは、FDAが承認したCellSearch(登録商標)システムと同じ臨床的に予後を判定するCTCを同定し、定量し、および採点できることが示されている。しかしながら、本発明は、サイトケラチン信号がダウンレギュレートした細胞、およびEpCAM信号が無い細胞を含む、EMTのさらなる数多くのサブタイプの同定を可能にする。上皮性マーカーのダウンレギュレーションはがんにおけるEMTの特徴であるが、さらに間葉マーカーのアップレギュレートを確認することは、それらの幹細胞および運動特性を適切にプロファイルするために重要である。
(健常者および患者の血液試料)
2012年から2013年までウィスコンシン医科大学でステージI〜IVの膵がんの治療を積極的に受けていた患者から12の全末梢血試料を採取した。試料はウィスコンシン医科大学の地方の施設内治験審査委員会(IRB)に従って収集され承認された。患者はインフォームドコンセントに署名した。血液試料をすべてCellSave preservative tube(商標)(約9mL、Janssen Diagnostics)に取り込み、処理のため臨床で中核となる実験室へ輸送した。研究機関からの結果および患者の識別は、研究の完成まで共有されたり伝えらたりすることはなかった。患者試料はすべて、FITC標識抗サイトケラチン8、18、19;r−フィコエリトリン(PE)標識抗EpCAM;およびシアニン5標識抗CD45からなる、上皮細胞を染色する標準的な抗体の混合物で最初に標識した。
(CellSieve(商標)フィルターで実施したCTC染色手順)
低圧の真空システムを使用して、CellSieve(商標)CTC Enumeration Kit試薬(Creatv MicroTech)で試料をろ過した。このシステムは約7ミクロンのサイズ排除に基づいてCTCを分離する。CTC計数染色剤(実施例4)を使用して、細胞を蛍光により染色し、そして同定した。低圧システムは、CellSieve(商標)フィルターが取り付けられたフィルターホルダーアセンブリーを使用して作成された。末梢血(7.5ml)を前固定緩衝液で希釈し、フィルターを通して吸引した。フィルターを洗浄し、CellSieve(商標)後固定緩衝液で後固定し、CellSieve(商標)透過緩衝液で透過処理した。捕捉した細胞を、FITC抗サイトケラチン8、18、19、PE−抗−EpCAMおよびCy5−抗−CD45からなる抗体カクテルで1時間染色し、そして、Fluoromount−G/DAPI(Southern Biotech)にマウントした。Carl ZeissのAxioCamを備えたオリンパスBX54WI蛍光顕微鏡を用いて試料を画像化した。露出は、細胞間で信号を同等に比較するため、2秒(Cyanine5)、2秒(PE)、100〜750msec(FITC)および10〜50msec(DAPI)にプリセットした。Zen2011 Blue(Carl Zeiss)とAxioVision Mark and Findモジュールを使用し、半自動化された形で、画像を処理し、細胞のx/y配置をマークし、そして、以前に画像化した細胞を再配置した。試料を1週間から2年間、保管所で4℃で保管し、そして配置した。
(細胞株)
MCF−7(HTB−22)およびMDA−MB−231(HTB−26)ヒト乳がん細胞株;LNCaP(CRL−1740、クローンFGC)前立腺腺癌;A2058(CRL−11147)ヒト皮膚メラノーマ細胞株;および、HUVEC−C(CRL−1730)内皮細胞をATCC(Manassas、VA)から入手した。細胞株はすべて、ATCC推奨のウシ胎児血清(FBS)を含む細胞株特異的培地で増殖した。MDA−MB−231細胞株以外の細胞株は指示された細胞培養条件(5%CO2、37℃)で、3〜4日ごとに培地を交換しながら、T−75フラスコ内で維持した。MDA−MB−231細胞株のみCO2を加えず37℃で培養した。細胞はトリプシン−EDTA(ATCC Manassas、VA)を使用し回収し、125×gで5分間、遠心分離し、1%のパラホルムアルデヒドを含むPBSで再懸濁した。インキュベーション後、細胞を10倍PBS溶液で希釈し、遠心分離し、新鮮なPBSで再懸濁してから、正常な血液に加え、5分以内にミクロフィルターで分離した。
(追加のマーカーパネル)
マーカーはマーカーに対する抗体により同定される。試料を、室温で1時間、蛍光の標識抗体でインキュベートして染色した。第1のCTCパネル:FITC標識抗サイトケラチン8、18、19;r−フィコエリトリン(PE)標識抗EpCAM;およびCyanine5標識抗CD45(Creatv MicroTech)、第2のパネル:Alexafluor488標識抗PDL1(2.5μg/mL)およびDylight650標識PD−1(5μg/mL)、PD−L1とPD−1どちらもMDアンダーソンがんセンターのSteven Lin博士からの寄贈、PE標識CD34(2.5μg/ml、クローン4H11)、および第3のパネル:FITC標識抗CD14(5μg/ml、クローン61D3)、PE標識抗CD184(5μg/ml、クローン2B11)、efluor660標識抗ビメンチン(2.5μg/ml、クローンV9)。
1.フィルター上の細胞の蛍光クエンチング(QUAS−R)
保管試料を、最初のCTC染色後1週間から2年で保管所から取り出した。試料は、クエンチング手順に先立って予め染色し、画像化し、そして、マークした。スライドを15分間、100mLの1×PBSに浸漬し、慎重に取り外した。フィルターを反応槽(Corning)に置き、1mLの1×PBSで5回洗浄した。
保管した生検試料を、最初の蛍光染色後1週間から2年で保管所から取り出した。試料は、クエンチング手順に先立って予め画像化し、そして、マークした。スライドを15分間、100mLの1×PBSに浸漬した。スライドを1mLの1×PBSで5回洗浄した。その後スライドをコートするか、またはドラフトチャンバーで、室温で1時間、1mg/mlの水素化ホウ素ナトリウム溶液(Fisher Scientific)を含むコプリンジャーに浸漬した。ホウ化水素溶液を除去し、スライドを1mlの1×PBSで6回洗浄した。スライドを清潔なコプリンジャー内に置き、室温で1時間、100mMのTris、pH=9.0でインキュベートした。Trisを除去し、そして、スライドを1mlのPBSで3回洗浄し、そして、1×PBS/20%FBSの入ったコプリンジャー内に30分間置いた。インキュベーション後、PBS/FBS溶液を除去し、そして、抗体染色の次のセットを室温で1時間、生検試料に追加した。抗体インキュベーション後、スライドを1×PBS/1%Tweenで洗浄し、そして、スライドをFluoromount−G/DAPI(Southern Biotech)にマウントした。試料をx/y軸に沿って配置し、そして、以前に画像化した細胞を、蛍光顕微鏡およびZen2011 Blue(Carl Zeiss)ソフトウェア等のソフトウェアを使用して再配置した。画像および露出を上述のようにプリセットし、そして、Zen2011 Blue(Carl Zeiss)を使用して画像を処理した。細胞上の蛍光マーカーの画像化後、QUAS−R手順を別の抗体カクテルで繰り返し、そして、再画像化できる。
(細胞株におけるバイオマーカーの連続的スクリーニング)
各細胞株をミクロフィルターで個々にろ過し、各細胞型(n=3)を、抗体パネル1(CK、EpCAMおよびCD45)、抗体パネル2(PD−L1、CD34およびPD−1)または抗体パネル3(CD14、CXCR4およびビメンチン)のいずれかで染色した。図5a。画像化およびマーキングの後、個々のフィルターはそれぞれ、上述の通りにQUAS−R法によりクエンチし、次に第2の抗体セットで染色した。つまり、フィルターセット1を最初、CK、EpCAMおよびCD45で染色し、そして、次に抗体パネル2(PD−L1、CD34およびPD−1)で染色した;フィルターセット2は最初、PD−L1、CD34およびPD−1で染色し、そして、次に抗体パネル3(CD14、CXCR4、ビメンチン)で染色した;また、フィルターセット3は最初、CD14、CXCR4およびビメンチンで染色し、そして、次に抗体パネル2(CK、EpCAMおよびCD45)で染色した。元々マークされていた細胞をすべて発見し、そして再画像化した。
a.上述のクエンチング工程は、ポリマー上にマウントした細胞への適用を記述する。このプロセスは、生体試料をマウントするすべての材料で使用できる。
b.QUAS−R技術は、基板上にマウントしていない、溶液中の細胞で実施できる。
c.この技術はスライドガラス上にマウントしたFFPE試料で実施できる。
a.これは固定された試料または固定されていない試料を含む。
b.特定の蛍光のクエンチに加えて、古い試料にはクエンチングが必要な追加の非特異蛍光がある。
c.非特異蛍光もプロセスの間にクエンチされる。
d.過去に染色されていない試料は、バックグラウンド蛍光および天然の自家蛍光の除去のためクエンチされなければならない。
e.固定生体試料または古い試料には三次構造において化学的修飾または変質によりブロックされる可能性のあるエピトープがある。クエンチングに加えて、ホウ化水素の副次的効果には、再染色のためエピトープのブロックを解除する能力がある。
Claims (20)
- 生体試料をバイオマーカーについて再染色する方法であって、
a.蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
b.非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
c.前記試料を1つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。 - 前記生体試料が、1つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されている、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも1週間保管されたものである、請求項1に記載の方法。
- a.前記試料を表面上に固定するステップと、
b.前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項2または請求項3に記載の方法。 - 前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−n−ブチルアンモニウム、および水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項2または請求項3に記載の方法。
- 前記ホウ化水素が水素化ホウ素ナトリウムである、請求項2または請求項3に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、細胞、ウイルス成分、細菌成分および疾患成分から本質的になる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、組織、血液中のがんに関連する細胞、CTC、EMT、CAML、CEC、血液細胞、リンパ細胞、毛髪細胞、皮膚細胞および骨髄細胞からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記がん細胞がヒトがん細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記生体試料が、血液、尿、骨髄、リンパ組織、脳脊髄液、羊水、胆液、唾液、痰、腹水、胸水、膣液、卵巣嚢腫液、子宮内膜液、リンパ浮腫からなる群から選択される、請求項2または請求項3に記載の方法。
- 生体試料においてバイオマーカーについてスクリーニングする方法であって、
a.蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
b.非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
c.前記試料を1つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。 - 前記生体試料が、1つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されている、請求項11に記載の方法。
- 前記生体試料が、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも1週間保管されたものである、請求項11に記載の方法。
- 前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−n−ブチルアンモニウム、および水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項12または請求項13に記載の方法。
- a.前記試料を表面上に固定するステップと、
b.前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項12または請求項13に記載の方法。 - 生体試料においてバイオマーカーを特徴づける方法であって、
a.蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
b.非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
c.前記試料を1つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。 - 前記生体試料が1つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されている、請求項16に記載の方法。
- 前記生体試料が、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも1週間保管されたものである、請求項16に記載の方法。
- a.前記試料を表面上に固定するステップと、
b.前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項16に記載の方法。 - 前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−n−ブチルアンモニウム、水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項16に記載の方法。
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LIN ET AL.: "MINI02.04 SequentioalAssessment of DNA Damage Response and PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cel", MOLECULAR THERAPY, vol. Vol.10,No.9,Supple.2, JPN6020037559, 2015, pages 266 - 267, ISSN: 0004494167 * |
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