JP2019501964A - ポリペプチド化合物、並びにその調製方法及び適用 - Google Patents
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Abstract
Description
Aは生物活性を有する短ペプチドフラグメントであり、Kは2つの活性アミノ基を含有するリシンFmoc−Lys(Dde)−OHであり、nはKの数であり、Yは存在しない(null)か、又は任意の1つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、例えばnが1である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はA−(A−K)−Yであり、nが2である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はA−(A−K)2−Yであり、nが3である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はA−(A−K)3−Yであり、
Aは、好ましくは短ペプチドフラグメントXAXBXCXD−Xであり、AがXAXBXCXD−Xである場合、該ポリペプチド化合物の構造式はXAXBXCXD−X−(XAXBXCXD−X−K)n−Yであり、ここで、XA及びXBは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸であり、XC及びXDは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Xは存在しないか、又は任意の1つ以上のアミノ酸若しくは化学基である、多コピーポリペプチド化合物を提供する。
Aは好ましくは短ペプチドフラグメントXAXBXCXD−Xであり、AがXAXBXCXD−Xである場合、ポリペプチド化合物の構造式はXAXBXCXD−X−(XAXBXCXD−X−K)n−Yであり、ここで、XA及びXBは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸であり、XC及びXDは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Xは存在しないか、又は任意の1つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、
初めに、Yを固体樹脂に固定し、Y−固体樹脂を得て、該Y−固体樹脂をFmoc脱保護によって処理し、n個のFmoc−Lys(Dde)−OHを1つずつ縮合させ、Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格の調製を達成した後、該Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格を側鎖アミノ基Dde及びFmocの脱保護によって処理し、セグメントAの伸長及び導入をKn−Y−固体樹脂の遊離アミノ基上で同時に行い、A−(A−K)nY−固体樹脂を得て、合成の完了後にA−(A−K)nYを固体樹脂から切り出し、粗ペプチド生成物を得て、該粗ペプチド生成物を高速液体クロマトグラフィーによって精製し、ポリペプチド化合物A−(A−K)nYを得る、方法を提供する。
ここで、Yが単一アミノ酸である場合、Y−固体樹脂を直接購入することができ、Yが複数のアミノ酸を含有する短ペプチドである場合、固相Fmoc/tBu法を用いる、すなわち、Fmoc−aa1−Wang樹脂を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端(C)からアミノ末端(N)へと行い、アミノ末端のFmoc保護基を、該アミノ末端が遊離アミノ基となるように除去した後、Y−固体樹脂が得られるまで該アミノ末端を樹脂と縮合させる。
ここで、Y−固体樹脂をFmoc脱保護により処理して、遊離アミノ基を露出させ、Fmoc−Lys(Dde)−OHを用いて縮合を行い(縮合方法は工程1のものと同じである)、n個のFmoc−Lys(Dde)−OHが縮合するまで縮合を繰り返し(「サイクル1」と表記する)、それによりKn−Y−固体樹脂ペプチド骨格を調製する。
ここで、Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格中のLysの側鎖Dde及びFmoc保護基を除去して、側鎖上の遊離アミノ基が遊離したKn−Y−固体樹脂を得る。
ここで、工程1に記載される方法により、セグメントAが完成し、A−(A−K)nY−固体樹脂が得られるまでアミノ酸を1つずつ縮合させる(「サイクル2」と表記する)。
ここで、粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(high efficiency liquid chromatography)(HPLC)によって精製して、純度が98%を超えるポリペプチド化合物A−(A−K)nYを得る。
ここで、凍結乾燥後に得られる白色の綿状ポリペプチド化合物A−(A−K)nYを冷暗環境に保管する。
本発明において開示されるポリペプチド化合物は、それが2つのコピー、3つのコピー又は5つのコピー等を含むかにかかわらず、同じコピーペプチドセグメントAを有し、ここで、Aは生物活性を有する短ペプチドフラグメントXAXBXCXD−Xであり、XA及びXBは、フェニルアラニン(Phe、F)、バリン(Val、V)、ロイシン(Leu、L)、イソロイシン(Ile、I)、メチオニン(Met、M)、システイン(Cys、C)、アルギニン(Arg、R)、リシン(Lys、K)、グリシン(Gly、G)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、アスパラギン酸(Asp、D)、アスパラギン(Asn、N)、グルタミン酸(Glu、E)及びグルタミン(Gln、Q)のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよく、XC及びXDは、上述の脂肪族アミノ酸分子のいずれかから選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、又はXC及びXDは、トリプトファン(Trp、W)、ヒスチジン(His、H)及びプロリン(Pro、P)のいずれかを含む複素環式アミノ酸から選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、Kは2つの活性アミノ基を含有するリシンFmoc−Lys(Dde)−OHであり、X又はYは存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸によって構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸とペプチドフラグメントとを結合することができる化学基であり、幾つかの考え得る組合せを表2に示すが、本発明はこれらの組合せに限定されない。
本発明においては、遊離カルボキシル末端を有するペプチド分子の調製により合成を例示的に説明する。実際の用途では、合成ペプチド分子のカルボキシル末端は、この形態に限定されず、適切な固体樹脂を必要に応じて合成に選択することができる。
Y−固体樹脂→Fmoc−Lys(Dde)−OH縮合「サイクル1」の開始→2回の「サイクル1」の完了→Fmoc−Lys(Dde)−Lys(Dde)−Y−固体樹脂→Dde及びFmoc脱保護→H2N−Lys(H2N)−Lys(H2N)−Y−固体樹脂→セグメントAの合成 − Fmoc−aa−OH縮合の「サイクル2」の開始→A−Lys(A)−Lys(A)−Y−固体樹脂→合成の完了→A−Lys(A)−Lys(A)−Yの粗生成物を得るための側鎖上の保護基の除去及び樹脂からのペプチドの切出し→精製→精ペプチド生成物→冷環境での保管。
粗生成物を、クロマトグラフィーカラム(モデル:Daiso C18、10μm、100Å、50×250mm)を用いて精製する。ここで、クロマトグラフィー操作における移動相Aは、0.05%トリフルオロ酢酸及び2%アセトニトリルを含有する水溶液であり、移動相Bは90%アセトニトリル/水であり、流速は25mL/分であり、紫外検出波長は220nmである。溶出ピーク溶液を回収した後、凍結乾燥させる。これにより、白色の綿状XAXBXCXD−X−(XAXBXCXD−X−K)2Yポリペプチド化合物が得られる。次いで、ポリペプチド化合物を後に使用するために密閉状態で包装し、冷蔵庫に保管する。ポリペプチド化合物の純度は、99%超であり得る。
本発明において提供される5コピーペプチド分子A−(A−K)4−Yは、5コピーのXAXBXCXD−Xを含有するポリペプチド化合物XAXBXCXD−X−(XAXBXCXD−X−K)4−Yである。構造及び合成経路を式2に示す。ここで、XA及びXBは、フェニルアラニン(Phe、F)、バリン(Val、V)、ロイシン(Leu、L)、イソロイシン(Ile、I)、メチオニン(Met、M)、システイン(Cys、C)、アルギニン(Arg、R)、リシン(Lys、K)、グリシン(Gly、G)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、アスパラギン酸(Asp、D)、アスパラギン(Asn、N)、グルタミン酸(Glu、E)及びグルタミン(Gln、Q)のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよく、XC及びXDは、上述の脂肪族アミノ酸分子のいずれかから選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、又はXC及びXDは、トリプトファン(Trp、W)、ヒスチジン(His、H)及びプロリン(Pro、P)のいずれかを含む複素環式アミノ酸から選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、Kは、2つの活性アミノ基を含有するリシンFmoc−Lys(Dde)−OHであり、X又はYは存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸によって構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸とペプチドフラグメントとを結合することができる化学基である。
Y−固体樹脂→Fmoc−Lys(Dde)−Lys(Dde)−OH縮合の「サイクル1」の開始→4回の「サイクル1」の完了→Fmoc−Lys(Dde)−Lys(Dde)−Lys(Dde)−Lys(Dde)−Y−固体樹脂→側鎖上のアミノ基に対するDde及びFmoc脱保護→H2N−Lys(H2N)−Lys(H2N)−Lys(H2N)−Lys(H2N)−Y−固体樹脂→セグメントAの合成 − Fmoc−aa−OH縮合の「サイクル2」の開始→A−Lys(A)−Lys(A)−Lys(A)−Lys(A)−Y−固体樹脂→合成の完了→A−Lys(A)−Lys(A)−Lys(A)−Lys(A)−Yの粗生成物を得るための側鎖上の保護基の除去及び樹脂からのペプチドの切出し→精製→精ペプチド生成物→冷環境での保管。
本実施形態においては、アミノ酸をポリペプチドのカルボキシル末端(C)からアミノ末端(N)へと1つずつ縮合及び伸長させた後、合成の終了後に標的ポリペプチドをTFA法により固体樹脂から切り出すことによってポリペプチドを手動合成する。
粗生成物を、クロマトグラフィーカラム(モデル:Daiso C18、10μm、100Å、50×250mm)を用いて精製する。ここで、クロマトグラフィー操作における移動相Aは、0.05%トリフルオロ酢酸及び2%アセトニトリルを含有する水溶液であり、移動相Bは90%アセトニトリル/水であり、流速は25mL/分であり、紫外検出波長は220nmである。溶出ピーク溶液を回収した後、凍結乾燥させる。これにより、白色の綿状A−(A−K)4−Yポリペプチド化合物が得られる。次いで、ポリペプチド化合物を後に使用するために密閉状態で包装し、冷蔵庫に保管する。ポリペプチド化合物の純度は、99%超であり得る。
ヒト又は動物の身体内の赤血球は、ヘマグルチニン(HA)を含有するウイルスによって凝集することがあり、この現象は赤血球凝集現象と称される。かかる赤血球凝集現象は、特定の免疫血清又は特異的抗体によって阻害することができ、阻害試験は「赤血球凝集阻害試験」(HI)と称される。
1. 高い感度:HI法では、微量の抗体を検出することができ、結果は比較的正確であり、反応は高感度な血清学的検出反応の1つである;
2. 高い特異性:赤血球の凝集を引き起こすウイルスは、特異的抗体によってのみ阻害することができる;
3. 高い検出速度:HI試験では結果を判定するのに約2時間しか必要とされない;
4. HI試験は高い環境要件を何ら有さず、操作は単純かつ迅速であり、1回の試験で多量のサンプルを検出することができる。
ブランク群:0.3mlの通常生理食塩水を注射する;
対照群:0.3mlのニューカッスル病生ワクチン(「ワクチン」と略記、CS2株、Chengdu Tecbond Biological Products Co., Ltd.製)を接種する;
実験群:本発明において提供されるポリペプチド化合物0.2μgと混合した0.3mlのワクチンを接種する。
生物活性ペプチド分子、3コピー活性ペプチド分子及び5コピー活性ペプチド分子を実験例1において無作為に選択し、免疫効果に対する種々のコピー数の活性ペプチドセグメントを含有する活性ペプチド分子の影響を試験する。試験結果を表5に示す。
ブランク群:0.3mlの通常生理食塩水を注射する;
対照群:0.3mlのニューカッスル病生ワクチン(「ワクチン」と略記、CS2株)を、ワクチン製造業者により提供される仕様書に従って各ニワトリに接種する;
実験群:0.2μgのペプチドと混合した0.3mlのワクチンを、ワクチン製造業者により提供される仕様書に従って各ニワトリに接種する;
実験の目的:マウスにおける固形腫瘍に対する種々のコピー数のペプチドセグメントを含有する合成ペプチドサンプルの阻害効果を試験する。
試験サンプル:合成ペプチドサンプル#6−1、#6−3及び#6−5、全て5mg/バイアル規格の凍結乾燥サンプル、純度98.5%超、冷蔵庫内に−20℃で保管;サンプルをその場で注射用水により2mg/mlに希釈し、マウスの首筋に皮下注射により注射する;各注射後の残りのサンプルは捨てる。
陽性対照サンプル:5−フルオロウラシル(5−FUと略記)、Tianjin Kingyork Amino Acids Co., Ltd.製、250mg/10mL/バイアル規格、ロット番号:1600108;薬物をマウスの腹部に注射し、各注射後の残りの薬物は捨てる。
試験動物:ハツカネズミ(Mus Musculus)Balb/c雌性マウス、6週〜8週齢、体重23±2g。試験動物は、Beijing Huabukang Biological Technology Co., Ltdから得られる。
マウスを温度22±3℃及び相対湿度40%〜80%のSPFレベル恒温恒湿層流家禽小屋内で、各ケージに5匹のマウスを収容して飼育する。マウスにクリーングレードのマウス飼料ブロック及び濾過滅菌水を自由に摂取させ、家禽小屋についてのマウス飼育規則に従って管理する。
試験方法:in vitroで培養した対数増殖期の肝細胞癌22(H22)腫瘍細胞を接種に使用し、懸濁腫瘍細胞をPBS緩衝液で1×106個/0.1mlの濃度に希釈した後、皮下注射によりマウスの右肩甲骨に接種する。マウスにおける腫瘍成長状態を綿密に観察し、マウスの皮膚下の腫瘍が約50mm3〜80mm3に成長した時点で薬物を群内のマウスに投与する。
実験の終了:群内のマウスにおける腫瘍体積を、腫瘍の最大径及び最小径を2日おきにバーニヤで測定することによって測定する。対照群の平均腫瘍体積が2000mm3に達した時点で全ての実験動物を頸椎脱臼(neck dislocation)によって屠殺し、腫瘍組織を剥離し、秤量し、各腫瘍の重量及び各群の平均腫瘍重量を記録する。腫瘍阻害率を各群の平均腫瘍重量に従って算出する。すなわち、腫瘍阻害率(%)=(1−サンプル群の平均腫瘍重量/ブランク群の平均腫瘍重量)×100%。一元配置ANOVA検証を、SPSS v13.0統計ソフトウェアを用いて行う。結果を表6に示す。
サンプル群の平均腫瘍重量とブランク群の平均腫瘍重量との比較により、腫瘍阻害効果が活性ペプチドのコピー数の増大とともに改善することが見出される。
実験の目的:5コピーのペプチドセグメントを含有する3つの生物活性ペプチド化合物を無作為に選択し、肝細胞癌22(H22)固形腫瘍に対するそれらの阻害効果を試験する。
試験サンプル:合成ペプチドサンプル#4−5、#9−5及び#14−5、全て5mg/バイアル規格の凍結乾燥サンプル、純度98.5%超、冷蔵庫内に−20℃で保管;サンプルをその場で注射用水により2mg/mlに希釈し、マウスの首筋に皮下注射により注射する;各注射後の残りのサンプルは捨てる。
陽性対照サンプル:5−フルオロウラシル(5−FUと略記)、Tianjin Kingyork Amino Acids Co., Ltd.製、250mg/10mL/バイアル規格、ロット番号:1600108;薬物をマウスの腹部に注射し、各注射後の残りの薬物は捨てる。
試験動物:ハツカネズミBalb/c雌性マウス、6週〜8週齢、体重23±1g。試験動物は、Beijing HFK Bioscience Co., Ltdから得られる。
マウスを温度22±3℃及び相対湿度40%〜80%のSPFレベル恒温恒湿層流家禽小屋内で、各ケージに5匹のマウスを収容して飼育する。マウスにクリーングレードのマウス飼料ブロック及び濾過滅菌水を自由に摂取させ、家禽小屋についてのマウス飼育規則に従って管理する。
試験方法:in vitroで培養した対数増殖期の肝細胞癌22(H22)腫瘍細胞を接種に使用し、懸濁腫瘍細胞をPBS緩衝液で1×106個/0.1mlの濃度に希釈した後、皮下注射によりマウスの右肩甲骨に接種する。マウスにおける腫瘍成長状態を綿密に観察し、マウスの皮膚下の腫瘍が約50mm3〜80mm3に成長した時点で薬物を群内のマウスに投与する。
実験の終了:群内のマウスにおける腫瘍体積を、腫瘍の最大径及び最小径を2日おきにバーニヤで測定することによって測定する。対照群の平均腫瘍体積が2000mm3に達した時点で全ての実験動物を頸椎脱臼によって屠殺し、腫瘍組織を剥離し、秤量し、各腫瘍の重量及び各群の平均腫瘍重量を記録する。腫瘍阻害率を各群の平均腫瘍重量に従って算出する。すなわち、腫瘍阻害率(%)=(1−サンプル群の平均腫瘍重量/ブランク群の平均腫瘍重量)×100%。一元配置ANOVA検証を、SPSS v13.0統計ソフトウェアを用いて行う。結果を表7に示す。
サンプル群の平均腫瘍重量とブランク群の平均腫瘍重量との比較及び統計分析により、結果はP<0.05を示し、実施例#4−5、#9−5及び#14−5において肝細胞癌22(H22)腫瘍阻害効果に有意な差があることが証明される。
Claims (24)
- nが自然数である構造式A−(A−K)n−Yによって表されるポリペプチド化合物であって、
Aは生物活性を有する短ペプチドフラグメントであり、Kは2つの活性アミノ基を含有するリシンFmoc−Lys(Dde)−OHであり、nはKの数であり、Yは存在しないか、又は任意の1つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、例えばnが1である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はA−(A−K)−Yであり、nが2である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はA−(A−K)2−Yであり、nが3である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はA−(A−K)3−Yであり、
Aは、好ましくは短ペプチドフラグメントXAXBXCXD−Xであり、AがXAXBXCXD−Xである場合、該ポリペプチド化合物の構造式はXAXBXCXD−X−(XAXBXCXD−X−K)n−Yであり、ここで、XA及びXBは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸であり、XC及びXDは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Xは存在しないか、又は任意の1つ以上のアミノ酸若しくは化学基である、ポリペプチド化合物。 - X又はYが存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸から構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸若しくはペプチドフラグメントを接続することができる化学基であり、X及びYは同じであっても又は互いに異なっていてもよく、例えばXが存在せず、かつYをグリシン(Gly、G)とすることができる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- XA及びXBがフェニルアラニン(Phe、F)、バリン(Val、V)、ロイシン(Leu、L)、イソロイシン(Ile、I)、メチオニン(Met、M)、システイン(Cys、C)、アルギニン(Arg、R)、リシン(Lys、K)、グリシン(Gly、G)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、アスパラギン酸(Asp、D)、アスパラギン(Asn、N)、グルタミン酸(Glu、E)及びグルタミン(Gln、Q)のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよい、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- XC及びXDがフェニルアラニン(Phe、F)、バリン(Val、V)、ロイシン(Leu、L)、イソロイシン(Ile、I)、メチオニン(Met、M)、システイン(Cys、C)、アルギニン(Arg、R)、リシン(Lys、K)、グリシン(Gly、G)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、アスパラギン酸(Asp、D)、アスパラギン(Asn、N)、グルタミン酸(Glu、E)、グルタミン(Gln、Q)、トリプトファン(Trp、W)、ヒスチジン(His、H)及びプロリン(Pro、P)のいずれかから選択され、同じであっても又は異なっていてもよい、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物と有機酸又は無機酸とによって形成される塩化合物を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物に含まれるヒドロキシルによって形成され得るエーテル、エステル、グルコシド又はグリコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルによって形成され得るチオエーテル若しくはチオグリコシド化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルとシステイン若しくはシステインを含有するペプチドとによって形成され得るジスルフィド結合を含有する化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物に含まれるアミドによって形成され得るアシレート若しくはアルキレート化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるアミドとサッカリドとによって形成され得るグルコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物に含まれるカルボキシル基によって形成され得るエステル又はアミド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物に含まれるイミノ基によって形成され得るグルコシド、アシレート又はアルキレート化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルによって形成され得るエステル、エーテル、グルコシド若しくはグリコシド化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルと有機アルカリ若しくは無機アルカリとによって形成され得る塩化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物と金属イオンとによって形成される配位、包接又はキレート化合物を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 前記ポリペプチド化合物によって形成される水和物又は溶媒を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物を含有する医薬組成物、該医薬組成物の幾何異性体、該医薬組成物の薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物、及び医薬担体又は賦形剤の形態の該医薬組成物。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物を作製する方法であって、A−(A−K)n−Yの合成経路が式5:
Aは好ましくは短ペプチドフラグメントXAXBXCXD−Xであり、AがXAXBXCXD−Xである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式はXAXBXCXD−X−(XAXBXCXD−X−K)n−Yであり、ここで、XA及びXBは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸であり、XC及びXDは1つ又は2つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Xは存在しないか、又は任意の1つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、
初めに、Yを固体樹脂に固定し、Y−固体樹脂を得て、該Y−固体樹脂をFmoc脱保護によって処理し、n個のFmoc−Lys(Dde)−OHを1つずつ縮合させ、Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格の調製を達成した後、該Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格を側鎖アミノ基Dde及びFmocの脱保護によって処理し、セグメントAの伸長及び導入をKn−Y−固体樹脂の遊離アミノ基上で同時に行い、A−(A−K)nY−固体樹脂を得て、合成の完了後にA−(A−K)nYを前記固体樹脂から切り出し、粗ペプチド生成物を得て、該粗ペプチド生成物を高速液体クロマトグラフィーによって精製し、ポリペプチド化合物A−(A−K)nYを得る、方法。 - 作製に適切な樹脂がペプチド生成物のカルボキシル末端の特徴に応じて選択され、該ペプチド生成物のカルボキシル末端が遊離カルボキシル基である場合に「WANG樹脂」を選択し、合成ペプチドのカルボキシル末端がアミド基である場合に「Rink樹脂」を選択し、該ペプチド生成物のカルボキシル末端がCys、Pro又はHisである場合に「CTC樹脂」を選択する、請求項17に記載の方法。
- 前記ポリペプチド化合物を、以下の工程:
工程1:Y−固体樹脂を調製する工程と、
ここで、Yが単一アミノ酸である場合、Y−固体樹脂を直接購入することができ、Yが複数のアミノ酸を含有する短ペプチドである場合、固相Fmoc/tBu法を用いる、すなわち、Fmoc−aa1−Wang樹脂を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端(C)からアミノ末端(N)へと行い、アミノ末端のFmoc保護基を、該アミノ末端が遊離アミノ基となるように除去した後、Y−固体樹脂が得られるまで該アミノ末端を樹脂と縮合させる;
工程2:Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格を調製する工程と、
ここで、前記Y−固体樹脂をFmoc脱保護により処理して、遊離アミノ基を露出させ、Fmoc−Lys(Dde)−OHを用いて縮合を行い(縮合方法は前記工程1のものと同じである)、n個のFmoc−Lys(Dde)−OHが縮合するまで縮合を繰り返し(「サイクル1」と表記する)、それによりKn−Y−固体樹脂ペプチド骨格を調製する;
工程3:Kn−Y−固体樹脂に対してアミノ脱保護を行う工程と、
ここで、Kn−Y−固体樹脂ペプチド骨格中の側鎖LysのDde及びFmoc保護基を除去して、側鎖上の遊離アミノ基が遊離したKn−Y−固体樹脂を得る;
工程4:Kn−Y−固体樹脂の遊離アミノ基上のセグメントAを同時に合成する工程と、 ここで、前記工程1に記載される方法により、セグメントAが完成し、A−(A−K)nY−固体樹脂が得られるまでアミノ酸を1つずつ縮合させる(「サイクル2」と表記する);
工程5:合成の完了後にA−(A−K)nYを固体樹脂から切り出し、側鎖上の保護基を除去して、粗生成物A−(A−K)nYを得る工程と、
工程6:精製して精生成物を得る工程と、
ここで、粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製して、純度が98%を超えるポリペプチド化合物A−(A−K)nYを得る;
を含む固相ポリペプチド合成法により作製する、請求項17又は18に記載の方法。 - アミノ酸を導入及び縮合させるたびに、各アミノ酸を前記「サイクル1」と前記「サイクル2」との間で縮合させた後に、「カイザーテスト」を行って遊離アミノ基の含量を検出し、反応の縮合率が十分に高くない場合に縮合をもう一度繰り返す、請求項19に記載の方法。
- ヒト又は動物の身体内での腫瘍成長を阻害するための薬物の調製における請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物又は請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用。
- 前記腫瘍が、ヒトの身体内の固形腫瘍(又は外科手術後の残存腫瘍)又は非固形腫瘍である、請求項21に記載の適用。
- ヒトの身体内の前記固形腫瘍(又は外科手術後の残存腫瘍)が肉腫、肝癌、結腸癌、肺癌、胃癌、乳癌及び子宮頸癌を含むが、これらに限定されず、前記非固形腫瘍が、例えば血液系腫瘍(白血病及びリンパ腫を含む)である、請求項22に記載の適用。
- ヒト又は動物用の免疫薬又は免疫機能を改善する薬物の調製における請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物又は請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用。
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