JP2019215766A - 画像処理装置、細胞認識装置、細胞認識方法および細胞認識プログラム - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、細胞の画像において、核領域の画素値が背景の画素値よりも大きくなる。したがって、核領域においてスコアがピークになるスコアを使用し、スコアが大きい画素から順に円形または球形の排他的領域を配置することによって、対象物である細胞の位置を特定している。
すなわち、特許文献1では、対象物が密集し相互に近接している場合に、既に配置されている他の排他的領域と重ならないように、排他的領域が配置される。しかし、細胞が互いの形状に影響を及ぼす程、密集または隣接している場合に、一定の形状を有する排他的領域によって個々の細胞の位置や領域を正確に認識することは難しい。
本発明の第1の態様は、複数の細胞を撮影したスタック画像から3次元細胞領域を形成する画像処理装置であって、前記スタック画像は、スタック方向にスタックされた複数枚の2次元のスライス画像から構成され、前記3次元細胞領域は複数の2次元細胞領域を積層することによって形成され、前記スタック画像内に複数の第1シード位置を設定し、該複数の第1シード位置の各々は画素値が3次元的なピークを示す画素の位置である、第1シード位置設定部と、前記複数の第1シード位置の各々に固有の識別番号を付番する第1付番部と、前記スタック画像の所定の方向における細胞の標準サイズを設定する標準サイズ設定部と、前記複数の第1シード位置の各々を参照し、前記複数の第1シード位置の各々を中心とする前記標準サイズの範囲内に第2シード位置を設定し、該第2シード位置が前記第1シード位置に対し前記所定の方向にずらした位置である、第2シード位置設定部と、前記第2シード位置の各々に識別番号を付番し、各前記第2シード位置の識別番号が各前記第2シード位置の設定において参照した前記第1シード位置の識別番号と同一である、第2付番部と、前記第1および第2シード位置の各々に2次元細胞領域を形成し、該2次元細胞領域が前記所定の方向に交差する領域である、細胞領域形成部を備え、該細胞領域形成部は、全ての前記第1シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成し、その後に前記第2シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成する画像処理装置である。
この構成によって、スライス画像上に、またはスライス画像に平行な平面上に、2次元細胞領域を形成することができる。
この構成によって、個々の3次元細胞領域をスタック方向に積層された2次元細胞領域から形成することができる。
光学的なぼけ等が原因で、細胞の像が見かけ上、スタック方向に伸張することがある。このような場合に、所定の方向における細胞のサイズの伸張を考慮して、より適切な標準サイズを設定することができる。
細胞の中心部分は周辺よりも明るいので、細胞の中心部分の画素の特徴量は周辺画素の特徴量よりも大きくなる。したがって、第1シード位置を設定すべき細胞の中心部分を特徴量に基づいて検出することができる。
この構成によって、画素値の極値らしさを正確に表す特徴量として、LoGフィルタ出力値を算出することができる。
細胞の境界では、画素値および画素値勾配が周辺に比べて大きくなる。したがって、画素値分布および画素値勾配の少なくとも1つに基づいてスタック画像内の細胞の境界を高精度に認識し、検出された境界を2次元細胞領域の境界として画定することができる。
この構成によって、スタック画像内の細胞の境界をさらに高精度に認識することができる。
この構成によって、同一の識別番号の2次元細胞領域が第2シード位置の隣に既に形成されている場合にのみ、当該第2シード位置に2次元細胞領域が形成される。これにより、所定の方向に連続する3次元細胞領域を形成することができる。
この構成によって、細胞の中心部分の第1シード位置に2次元細胞領域が形成された後、細胞の中心部分に近い側から遠い側に向かって順番に2次元細胞領域が形成される。これにより、より明るい位置から順に2次元細胞領域を形成し、個々の細胞をさらに高精度に認識することができる。
第1シード位置を中心とする標準サイズの範囲内には、細胞の他に背景も含まれ得る。細胞における画素値は、背景における画素値よりも高い。したがって、第2シード位置の候補として選択された位置の画素値を所定値と比較することによって、選択された位置が細胞内の位置であるか、または背景内の位置であるかを判断することができる。そして、細胞内の位置であると判断された位置のみを第2シード位置に設定することによって、スタック画像内の背景に2次元細胞領域が誤って形成されることを防止することができる。
この構成によって、第2シード位置の候補として選択された位置が細胞内の位置であるか、または背景内の位置であるかをより正確に判断することができる。
本実施形態に係る細胞認識装置100は、図1に示されるように、細胞の画像を取得する撮像装置(撮像部)20と、撮像装置20によって取得された画像を処理する画像処理装置10とを備えている。
図2は、複数の細胞Cが3次元的に凝集したスフェロイドSの一例を示している。図3(a)は、図2のスフェロイドSのZスタック画像を示している。図3(b)は、図3(a)のZスタック画像に含まれるスライス画像の1つを示している。Z方向は、光学顕微鏡および撮像装置20の光軸に沿う方向である。X方向およびY方向は、Z方向に直交し、かつ相互に直交する方向である。スライス画像は、XY平面の画像である。
平均サイズ設定部1は、標準サイズ設定部2および第1シード位置設定部3に接続されている。第1シード位置設定部3は、第1付番部4に接続されている。第1付番部4は、第2シード位置設定部5およびソート部7に接続されている。第2シード位置設定部5は、第2付番部6に接続されている。第2付番部6は、ソート部7に接続されている。ソート部7は、細胞領域形成部8に接続されている。細胞領域形成部8は、出力部9に接続されている。
画像処理装置10は、CPU(中央演算処理装置)のようなプロセッサと、RAMのような主記憶装置と、ROMのような補助記憶装置とを備えるコンピュータであってもよい。補助記憶装置には、後述するステップS1〜S9の処理をプロセッサに実行させる細胞認識プログラムが格納される。細胞認識プログラムに従ってプロセッサが処理を実行することによって、各処理部1〜9の機能が実現される。
撮像装置20は、初期化部31に接続されている。初期化部31は、LoGフィルタ部32に接続されている。LoGフィルタ部32は、ピーク検出部33に接続されている。平均サイズ設定部1およびピーク検出部33は、ピーク統合部34に接続されている。ピーク統合部34は、第1付番部4に接続されている。
LoG(x,y)
=(x2+y2−2σ2)/(2πσ6)×exp{−(x2+y2)/(2σ2)}
ここで、xおよびyは、画素の位置である。LoG(x,y)は、フィルタ出力値(特徴量。以下、LoG出力値と呼称する。)である。σは、フィルタ効果を調整するためのパラメータである。
LoGフィルタ部32は、初期化されたZスタック画像の各スライス画像に2次元LoGフィルタを適用し、各画素のLoG出力値を算出し、LoG出力値を画素値とするLoG出力値画像を生成する。LoG出力値画像は、ピーク検出部33に送信される。
LoGフィルタ部32は、2次元LoGフィルタを2次元のスライス画像に適用することに代えて、3次元LoGフィルタを3次元のZスタック画像に適用してもよい。
具体的には、ピーク統合部34は、親シード情報から2つのピーク画素の座標を選択し、2つの座標間の空間的距離を計算する。次に、ピーク統合部34は、空間的な距離が閾値以下である場合に、2つのピーク画素が細胞Cの平均サイズDと比較して十分に近接していると判定し、2つのピーク画素を統合する。閾値は、平均サイズDに基づいて設定される。
第1付番部4および標準サイズ設定部2は、子シード位置選択部51に接続されている。撮像装置20は、背景値推定部52に接続されている。子シード位置選択部51および背景値推定部52は、子シード位置判定部53に接続されている。子シード位置判定部53は、第2付番部6に接続されている。
ソート部7、重複判定部83および隣接判定部84は、シード記録部81に接続されている。シード記録部81は、シード選択部82に接続されている。シード選択部82および領域記録部87は、重複判定部83に接続されている。重複判定部83および領域記録部87は、隣接判定部84に接続されている。隣接判定部84および撮像装置20は、周辺領域抽出部85に接続されている。周辺領域抽出部85は、2次元領域形成部86に接続されている。2次元領域形成部86は、領域記録部87に接続されている。領域記録部87は出力部9に接続されている。
シード選択部82は、シード記録部81に記録されたソート済みシード情報内のシード位置を上位から順番に1つずつ選択し、選択されたシード位置を重複判定部83に送信する。
一方、隣接判定部84は、シード位置とZ方向に隣接する位置に2次元細胞領域が既に形成されており、かつ、この2次元細胞領域の識別番号が当該シード位置の識別番号と同一である場合、当該シード位置を周辺領域抽出部85に送信する。
好ましくは、2次元領域形成部86は、トリミング画像の画素値に基づいて算出された適応的閾値を閾値処理に用いる。この場合、2次元領域形成部86は、トリミング画像の画素値のヒストグラムを作成する。次に、2次元領域形成部86は、ヒストグラムに基づき、例えば大津の方法によって適応的閾値を算出する。
細胞認識方法は、図12に示されるように、Zスタック画像を取得するステップS1と、平均サイズDを設定するステップS2と、細胞Cの標準サイズD’を設定するステップS3と、Zスタック画像内に複数の親シード位置P1を設定し親シード情報を作成するステップS4と、各親シード位置P1に固有の識別番号を付番するステップS5と、各親シード位置P1を中心とする標準サイズD’の範囲R内に子シード位置P2を設定し子シード情報を作成するステップS6と、各子シード位置P2に識別番号を付番するステップS7と、親シード情報および子シード情報を統合し親シード位置P1および子シード位置P2の順番を並べ替えるステップS8と、各シード位置に2次元細胞領域を形成するステップS9とを含む。
次に、ステップS2において、平均サイズ設定部1によって、Zスタック画像内の細胞Cの平均サイズDが設定される。
次に、ステップS3において、標準サイズ設定部2によって、平均サイズDに基づいて標準サイズD’が設定される。
具体的には、図13に示されるように、初期化部31によってZスタック画像が初期化される(ステップS41)。次に、LoGフィルタ部32によって、Zスタック画像に対してLoGフィルタ処理が施される(ステップS42)。次に、ピーク検出部33によって、LoGフィルタ出力値がピークを示すピーク画素が検出され、ピーク画素の座標および画素値を含む親シード情報が作成される(ステップS43)。次に、ピーク統合部34によって、親シード情報内のピーク画素の内、距離が平均サイズDと比べて十分に近いピーク画素が統合される(ステップS44)。ピーク画素の統合後に残ったピーク画素の位置が親シード位置P1に設定される。
次に、ステップS6において、第2シード位置設定部5によって、親シード情報内の各親シード位置P1に対して子シード位置P2が設定される。
具体的には、図14に示されるように、子シード位置選択部51によって、親シード情報内の親シード位置P1を参照してZスタック画像内の各親シード位置P1を含む範囲R内から子シード位置P2が選択され、子シード位置P2の座標および画素値を含む子シード情報が作成される(ステップS61)。子シード位置P2は、親シード位置P1からZ方向に異なる位置である。次に、背景値推定部52によって、Zスタック画像の背景画素値が推定される(ステップS62)。次に、子シード位置判定部53によって、ステップS61で選択された子シード位置P2の内、画素値が背景画素値以下である子シード位置P2が子シード情報から削除される(ステップS63)。
次に、ステップS8において、ソート部7によって、親シード情報および子シード情報が1つに統合され、全てのシード位置が、参照元の親シード位置P1からの距離が近い順に並べ替えられ、ソート済みシード情報が作成される。ソート済みシード情報において、親シード位置P1が上位に位置し、全ての子シード位置P2が全ての親シード位置P1よりも下位に位置する。
具体的には、図15に示されるように、ソート済みシード情報がシード記録部81に記録される(ステップS91)。次に、シード選択部82によって、ソート済みシード情報内のシード位置が上位から順に1つずつ選択される(ステップS92)。次に、重複判定部83によって、選択されたシード位置が、既に形成された2次元細胞領域と重複するか否かが判定される(ステップS93)。
選択されたシード位置が既に形成された2次元細胞領域と重複している場合(ステップS93のYES)、選択されたシード位置が、シード記録部81に記録されているソート済みシード情報から削除され(ステップS95)、ステップS92に戻る。
隣接する位置に2次元細胞領域が未だ形成されていないか、または、異なる識別番号の2次元細胞領域が既に形成されている場合(ステップS94のNO)、選択されたシード位置が、シード記録部81に記録されているソート済みシード情報から削除され(ステップS95)、ステップS92に戻る。
ソート済みシード情報内のシード位置が最上位から最下位まで順にシード選択部82によって選択されることにより(ステップS99)、ステップS93〜S98の処理が繰り返し実行される。
特に、スフェロイドSのように複数の細胞Cが立体的に密に集合し細胞C同士が相互に接触している場合、個々の細胞Cを正確に認識するためには隣接する2つの細胞Cの境界を正確に認識することが重要となる。
2 標準サイズ設定部
3 第1シード位置設定部
4 第1付番部
5 第2シード位置設定部
6 第2付番部
7 ソート部
8 細胞領域形成部
9 出力部
10 画像処理装置
20 撮像装置(撮像部)
100 細胞認識装置
D 平均サイズ
D’ 標準サイズ
P1 親シード位置(第1シード位置)
P2 子シード位置(第2シード位置)
Claims (15)
- 複数の細胞を撮影したスタック画像から3次元細胞領域を形成する画像処理装置であって、
前記スタック画像は、スタック方向にスタックされた複数枚の2次元のスライス画像から構成され、前記3次元細胞領域は複数の2次元細胞領域を積層することによって形成され、
前記スタック画像内に複数の第1シード位置を設定し、該複数の第1シード位置の各々は画素値が3次元的なピークを示す画素の位置である、第1シード位置設定部と、
前記複数の第1シード位置の各々に固有の識別番号を付番する第1付番部と、
前記スタック画像の所定の方向における細胞の標準サイズを設定する標準サイズ設定部と、
前記複数の第1シード位置の各々を参照し、前記複数の第1シード位置の各々を中心とする前記標準サイズの範囲内に第2シード位置を設定し、該第2シード位置が前記第1シード位置に対し前記所定の方向にずらした位置である、第2シード位置設定部と、
前記第2シード位置の各々に識別番号を付番し、各前記第2シード位置の識別番号が各前記第2シード位置の設定において参照した前記第1シード位置の識別番号と同一である、第2付番部と、
前記第1および第2シード位置の各々に2次元細胞領域を形成し、該2次元細胞領域が前記所定の方向に交差する領域である、細胞領域形成部を備え、
該細胞領域形成部は、全ての前記第1シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成し、その後に前記第2シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成する画像処理装置。 - 前記2次元細胞領域は、前記スタック方向に垂直に交差する平面上に形成される請求項1に記載の画像処理装置。
- 前記所定の方向は、前記スタック方向である請求項1または請求項2に記載の画像処理装置。
- 前記スタック方向に交差する平面上における細胞の平均サイズを設定する平均サイズ設定部を備え、
前記標準サイズ設定部は、前記平均サイズに基づいて前記標準サイズを設定する請求項3に記載の画像処理装置。 - 前記スタック画像内の各画素の特徴量を算出し、該特徴量が、画素値の極値らしさを表す量である、特徴量算出部を備え、
前記第1シード位置設定部は、前記特徴量が周辺画素よりも大きい画素の位置を第1シード位置に設定する請求項1から請求項4のいずれかに記載の画像処理装置。 - 前記特徴量は、LoGフィルタ出力値である請求項5に記載の画像処理装置。
- 前記細胞領域形成部は、前記第1および第2シード位置の各々の周辺の画素値分布および画素値勾配の少なくとも1つに基づいて前記2次元細胞領域の境界を画定する請求項1から請求項6のいずれかに記載の画像処理装置。
- 前記細胞領域形成部は、前記画素値分布および前記画素値勾配の少なくとも1つの適応的閾値処理によって前記境界を画定する請求項7に記載の画像処理装置。
- 前記細胞領域形成部は、前記第2シード位置と前記所定の方向に隣接する前記第1シード位置または他の前記第2シード位置に、前記第2シード位置と同一の識別番号の2次元細胞領域が既に形成されている場合にのみ、当該第2シード位置に前記2次元細胞領域を形成する請求項1から請求項8のいずれかに記載の画像処理装置。
- 前記細胞領域形成部は、参照元である前記第1シード位置からの距離が小さい第2シード位置から順に前記2次元細胞領域を形成する請求項1から請求項9のいずれかに記載の画像処理装置。
- 前記第2シード位置設定部は、前記第1シード位置に対し前記所定の方向にずらした位置を前記第2シード位置の候補として選択し、選択された位置における画素値が所定値よりも大きい場合にのみ選択された位置を第2シード位置に設定する請求項1から請求項10のいずれかに記載の画像処理装置。
- 前記スタック画像内の背景領域の平均画素値を推定し、該背景領域が細胞を含まない領域である、背景値推定部を備え、
前記所定値は、前記背景領域の平均画素値に基づいて設定される請求項11に記載の画像処理装置。 - 複数の細胞を撮影したスタック画像を取得する撮像部と、
請求項1から請求項12のいずれかに記載の画像処理装置とを備える細胞認識装置。 - 複数の細胞を撮影したスタック画像から3次元細胞領域を形成する細胞認識方法であって、前記スタック画像は、スタック方向にスタックされた複数枚の2次元のスライス画像から構成され、前記3次元細胞領域は複数の2次元細胞領域を積層することによって形成され、
前記スタック画像内に複数の第1シード位置を設定し、該複数の第1シード位置の各々は画素値が3次元的なピークを示す画素の位置である、工程と、
前記複数の第1シード位置の各々に固有の識別番号を付番する工程と、
前記スタック画像の所定の方向における細胞の標準サイズを設定する工程と、
前記複数の第1シード位置の各々を参照し、前記複数の第1シード位置の各々を中心とする前記標準サイズの範囲内に第2シード位置を設定し、該第2シード位置が前記第1シード位置に対し前記所定の方向にずらした位置である、工程と、
前記第2シード位置の各々に識別番号を付番し、各前記第2シード位置の識別番号が各前記第2シード位置の設定において参照した前記第1シード位置の識別番号と同一である、工程と、
前記第1および第2シード位置の各々に2次元細胞領域を形成し、該2次元細胞領域が前記所定の方向に交差する領域である、工程を含み、
前記2次元細胞領域を形成する工程において、全ての前記第1シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成し、その後に前記第2シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成する細胞認識方法。 - 複数の細胞を撮影したスタック画像から3次元細胞領域を形成する処理をプロセッサに実行させる細胞認識プログラムであって、前記スタック画像はスタック方向にスタックされた複数枚の2次元のスライス画像から構成され、前記3次元細胞領域は複数の2次元細胞領域を積層することによって形成され、
前記スタック画像内に複数の第1シード位置を設定し、該複数の第1シード位置の各々は画素値が3次元的なピークを示す画素の位置である、工程と、
前記複数の第1シード位置の各々に固有の識別番号を付番する工程と、
前記スタック画像の所定の方向における細胞の標準サイズを設定する工程と、
前記複数の第1シード位置の各々を参照し、前記複数の第1シード位置の各々を中心とする前記標準サイズの範囲内に第2シード位置を設定し、該第2シード位置が前記第1シード位置に対し前記所定の方向にずらした位置である、工程と、
前記第2シード位置の各々に識別番号を付番し、各前記第2シード位置の識別番号が各前記第2シード位置の設定において参照した前記第1シード位置の識別番号と同一である、工程と、
前記第1および第2シード位置の各々に2次元細胞領域を形成し、該2次元細胞領域が前記所定の方向に交差する領域である、工程をプロセッサに実行させ、
前記2次元細胞領域を形成する工程において、全ての前記第1シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成し、その後に前記第2シード位置の各々に前記2次元細胞領域を形成する細胞認識プログラム。
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