JP2019207106A - Glycoside analysis method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体試料に含有される配糖体をスクリーニングする方法および定量する方法に関する。 The present invention relates to a method for screening and quantifying glycosides contained in a biological sample.
配糖体とは、およそ生物界に広く存在し、様々な有機化合物（非糖）に対して糖が結合したものの総称である。糖が結合する非糖の有機化合物（以下、「アグリコン」という）には多種多様な化合物が存在し、タンパク質、ペプチド、脂質、糖質、ポリフェノールなどが含まれる。 Glycosides are a general term for substances that exist widely in the living world and have sugars bound to various organic compounds (non-sugars). There are a wide variety of non-sugar organic compounds (hereinafter referred to as “aglycones”) to which sugars bind, and include proteins, peptides, lipids, carbohydrates, polyphenols, and the like.
例えば、植物中の配糖体には生理学的な調節機能があり、多種多様なものが存在するが、その多くは未だ同定されていない。
特に、たばこ植物中の配糖体は生理学的機能を有するのに加え、喫煙時の香喫味成分としての機能も有する。たばこ植物中に含まれる配糖体としては、スコポレチン７−グルコシド（スコポレチン）、クェルセチン３−β−Ｄ−グルコシド（イソクェルセチン）などのグルコシド；ナリンゲニン７−ラムノグルコシド（ナリンギン）、クェルセチン３−ラムノグルコシド（ルチン）などのラムノグルコシド（ルチノシド）；リシチンβ−ソホロシド、クェルセチン３−β−Ｄ−ソホロシドなどのソホロシドなどが同定されている（非特許文献１）が、未だ同定されていないものも多数存在する。一方、今後、分析方法の進歩により配糖体成分の同定が進めば、生理学的機能の解明に大いに資することが期待される。
For example, glycosides in plants have a physiological regulatory function, and a wide variety exists, but many of them have not yet been identified.
In particular, glycosides in tobacco plants have a physiological function, and also have a function as a flavor component when smoking. Glycosides contained in tobacco plants include glucosides such as scopoletin 7-glucoside (scopoletin) and quercetin 3-β-D-glucoside (isoquercetin); naringenin 7-rhamnoglucoside (naringin), quercetin 3-rhamno Rhamnoglucoside (rutinoside) such as glucoside (rutin); sophoroside such as ricitin β-sophoroside, quercetin 3-β-D-sophoroside and the like have been identified (Non-patent Document 1), but those not yet identified There are many. On the other hand, if identification of glycoside components progresses in the future due to advances in analytical methods, it is expected to contribute greatly to elucidation of physiological functions.
配糖体の分析法としては、古くは、酸加水分解によるアグリコンの遊離回収とその後の化学的手法による検出が行われてきたが、強酸や加熱等の条件が厳しく、配糖体成分が分解してしまうといった問題、酸の中和等の処理が必要になり、精製・回収時に配糖体成分が失われるといった問題が存在していた。 In the past, glycosides have been analyzed by free recovery of aglycone by acid hydrolysis and subsequent detection by chemical methods, but the conditions such as strong acid and heating are severe, and glycoside components are degraded. In other words, a problem such as neutralization of the acid is required, and glycoside components are lost during purification and recovery.
ガスクロマトグラフ（ＧＣ）を紫外分光検出器（ＵＶ検出器）や質量分析計（ＭＳ）と組み合わせて配糖体を分析することも行われてきた。しかし、ＧＣで高温に曝されることにより配糖体成分が分解してしまうといった問題が存在する。そのため、事前に試料に含有される配糖体の糖を加水分解で遊離除去し、生じたアグリコンを分析対象としてガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）により分析する方法が提案されている。例えば、たばこ葉中の配糖体を酵素（β−グルコシダーゼ）あるいは酸で加水分解し、生じたアグリコンをＧＣ−ＭＳで分析する方法がある（非特許文献２および３）。しかし、酵素による加水分解では反応効率、酸による加水分解ではアグリコンの分解などの不確定要素が存在するため、定量性に問題があり、ＧＣで高温に曝されることによるアグリコンの化学構造の変換などの問題も考慮しなければならない。 Analysis of glycosides by combining a gas chromatograph (GC) with an ultraviolet spectroscopic detector (UV detector) or a mass spectrometer (MS) has also been performed. However, there is a problem that the glycoside component is decomposed when exposed to high temperature by GC. Therefore, a method has been proposed in which sugars of glycosides contained in a sample are removed by hydrolysis in advance, and the resulting aglycone is analyzed with a gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS). For example, there is a method in which a glycoside in tobacco leaves is hydrolyzed with an enzyme (β-glucosidase) or acid, and the resulting aglycone is analyzed by GC-MS (Non-patent Documents 2 and 3). However, there are uncertainties such as reaction efficiency in enzymatic hydrolysis and aglycone degradation in acid hydrolysis, so there is a problem in quantitativeness, and conversion of the chemical structure of aglycone by exposure to high temperatures in GC Such issues must also be considered.
一方で、液体クロマトグラフ（ＬＣ）をＵＶ検出器やＭＳと組み合わせて検出することも行われてきた。この方法は、ＧＣを用いる方法と比較して配糖体成分の分解が起こりにくいという利点はあるものの、配糖体成分と夾雑成分の分離効率が低いといった問題が存在し、多成分の配糖体が含有される試料や夾雑成分が多い試料では十分に配糖体のピークが分離せず、分析が困難である。そのため、ＭＳを２台直列に結合させて分離能を向上させたタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）とＬＣを結合した液体クロマトグラフタンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析する方法が提案されている。例えば、たばこ葉中の配糖体を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析する方法（非特許文献４）、未知または既知物質のマススペクトルのフラグメントパターンによって、混合物中の小さな分子化合物の同定および構造決定を行うため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する方法（特許文献１）、油ヤシ中のオイル含量の推定のため、葉や中果皮中のフラボノイドの配糖体を含む糖の誘導体をＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する方法（特許文献２および３）、心臓病患者の死亡危険率を算出するため、ヒト尿中のスフィンゴ糖脂質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する方法（特許文献４）、複雑な試料に含有されるインタクトな糖ペプチドを同定するため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する方法（特許文献５）などがある。しかし、検出されたピークが配糖体由来であることを確認するためには、配糖体の標準品の質量スペクトルまたは既存のデータベース中の配糖体の質量スペクトルとの比較が必要であり、試料に含有される夾雑成分が多い場合や検出されたピークが標準品のない未同定の配糖体に由来する場合には、検出されたピークが配糖体由来であるとの確認が困難である。 On the other hand, a liquid chromatograph (LC) has also been detected in combination with a UV detector or MS. Although this method has an advantage that the glycoside component is not easily decomposed as compared with the method using GC, there is a problem that the separation efficiency of the glycoside component and the contaminated component is low, and a multi-component glycoside is present. A sample containing a body or a sample having many contaminating components does not sufficiently separate glycoside peaks and is difficult to analyze. Therefore, there is a method of analyzing by a tandem mass spectrometer (MS / MS) in which two MSs are connected in series to improve resolution and a liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) in which LC is combined. Proposed. For example, the method for analyzing glycosides in tobacco leaves by LC-MS / MS (Non-Patent Document 4), the identification and structure determination of small molecular compounds in a mixture by the fragment pattern of the mass spectrum of an unknown or known substance LC-MS / MS analysis method (Patent Document 1), and for estimation of oil content in oil palm, sugar derivatives including flavonoid glycosides in leaves and mesocarp are analyzed by LC-MS. And LC-MS / MS analysis methods (Patent Documents 2 and 3), and a method for analyzing glycosphingolipids in human urine by LC-MS / MS to calculate the mortality risk of heart disease patients (Patent Documents) 4) In order to identify intact glycopeptides contained in complex samples, there is a method of analyzing by LC-MS / MS (Patent Document 5). However, in order to confirm that the detected peak is derived from a glycoside, it is necessary to compare with the mass spectrum of a standard glycoside or a mass spectrum of a glycoside in an existing database. If the sample contains many contaminating components or if the detected peak is derived from an unidentified glycoside without a standard product, it is difficult to confirm that the detected peak is derived from the glycoside. is there.
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで検出されたピークが配糖体由来であるとの確認までしている例として、ぶどうの粗抽出試料に含まれる配糖体をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析して、データベースを用いて構造解析するとともに、酵素で加水分解して遊離したアグリコンをＧＣ−ＭＳで分析して、そのピークのシグナル強度とＬＣ−ＭＳによる分析における対応する配糖体のピークのシグナル強度の相関により、構造解析した対象が配糖体であることを確認したという報告（非特許文献５）もあるが、データベースによる解析およびＧＣ−ＭＳによる分析が必要であるなど、簡便に試料中の配糖体を一斉分析して、未同定の配糖体を含む全体的な配糖体の組成を調べることはできていない。 As an example of confirming that the peak detected by LC-MS / MS is derived from a glycoside, a glycoside contained in a crude extract sample of grape was analyzed by LC-MS / MS, and the database was Analysis of the aglycone hydrolyzed by the enzyme and analysis by GC-MS, and the correlation between the peak signal intensity and the corresponding glycoside peak signal intensity in the LC-MS analysis There is also a report (Non-patent Document 5) that it was confirmed that the target of the structural analysis was a glycoside, but glycosylation in the sample was simple, such as analysis by database and analysis by GC-MS. It is not possible to simultaneously analyze the body to examine the overall glycoside composition including unidentified glycosides.
本発明が解決しようとする課題は、夾雑成分が多い生物試料や未同定の配糖体を含有する生物試料であっても、簡便に含有される配糖体を一斉に分析してスクリーニングする方法および定量する方法を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is a method for easily analyzing and screening for glycosides that are easily contained, even for biological samples that contain many contaminating components or biological samples that contain unidentified glycosides. And providing a method of quantification.
本発明者は、かかる課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料と酵素で処理しない分析用試料を準備して、それぞれをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果を比較して、酵素処理により消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定することにより、夾雑成分が多い生物試料や未同定の配糖体を含有する生物試料であっても、簡便に含有される配糖体を一斉に分析できることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventor has intensively studied to solve this problem, and from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample, recognizes the sugar structure of the glycoside and hydrolyzes the glycosidic bond. Prepare analytical samples treated with enzyme and analytical samples not treated with enzyme, compare the results analyzed by LC-MS / MS, and decrease disappearance or strength (height or area) by enzymatic treatment By determining that the peaks are derived from glycosides, it is easy to collect the glycosides that are easily contained even in biological samples with many contaminating components or biological samples containing unidentified glycosides. As a result, the present invention was completed.
すなわち本発明は、夾雑成分が多い生物試料や未同定の配糖体を含有する生物試料であっても、簡便に含有される配糖体を一斉に分析してスクリーニングする方法および定量する方法に関する。 That is, the present invention relates to a method for screening and quantifying a glycoside that is easily contained in a sample, even if it is a biological sample with many contaminating components or a biological sample containing an unidentified glycoside. .
本発明の１つの側面において、以下の［１］〜［９］の配糖体のスクリーニング方法、および［１０］〜［２０］の配糖体の定量方法が提供される。
［１］生物試料に含有される配糖体をスクリーニングする方法であって、
（１）（１−ｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料１を準備すること、および
（１−ｉｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、酵素で処理しない分析用試料２を準備すること、
（２）分析用試料１および２を液体クロマトグラフタンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）またはキャピラリー電気泳動タンデム質量分析計（ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ）により分析すること、ならびに
（３）分析結果において、分析用試料２と比較して分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定すること、
の工程を含む、前記方法。
In one aspect of the present invention, the following glycoside screening methods [1] to [9] and [10] to [20] glycoside quantification methods are provided.
[1] A method for screening glycosides contained in a biological sample,
(1) (1-i) Analytical sample 1 treated with an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond is prepared from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample. And (1-ii) preparing an analytical sample 2 that is not treated with an enzyme from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample,
(2) Analyzing samples 1 and 2 for analysis with a liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) or a capillary electrophoresis tandem mass spectrometer (CE-MS / MS), and (3) Analysis results , Determining that the peak in which the disappearance or intensity (height or area) is decreased in the analytical sample 1 compared to the analytical sample 2 is derived from a glycoside,
The method comprising the steps of:
［２］生物試料が植物に由来する試料である、［１］に記載の方法。
［３］配糖体がグルコシド、ルチノシド、アラビノシド、ガラクトシド、マンノシド、アピオシド、キシロシド、およびフコシドから選択される、［１］または［２］に記載の方法。
[2] The method according to [1], wherein the biological sample is a plant-derived sample.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the glycoside is selected from glucoside, rutinoside, arabinoside, galactoside, mannoside, apioside, xyloside, and fucoside.
［４］酵素が配糖体中の糖と非糖部の間のグリコシド結合、または糖と糖の間のグリコシド結合を加水分解する機能を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］酵素がグルコシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、アピオシル-グルコシダーゼ、およびフコシダーゼから選択される１つまたは複数である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
[4] The enzyme according to any one of [1] to [3], wherein the enzyme has a function of hydrolyzing a glycosidic bond between a sugar and a non-sugar part in a glycoside, or a glycosidic bond between a sugar and a sugar. the method of.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the enzyme is one or more selected from glucosidase, rhamnosidase, xylosidase, arabinosidase, galactosidase, mannosidase, apiosyl-glucosidase, and fucosidase. .
［６］酵素がβ−グルコシダーゼである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］タンデム質量分析計が三連四重極質量分析計である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the enzyme is β-glucosidase.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the tandem mass spectrometer is a triple quadrupole mass spectrometer.
［８］分析がコンスタントニュートラルロススキャンによって行われる、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］コンスタントニュートラルロススキャンにおけるニュートラルロス質量の設定が１６２ｕである、［８］に記載の方法。
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the analysis is performed by a constant neutral loss scan.
[9] The method according to [8], wherein the neutral loss mass setting in the constant neutral loss scan is 162u.
［１０］生物試料に含有される配糖体を定量する方法であって、
（１）（１−ｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料１を準備すること、および
（１−ｉｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、酵素で処理しない分析用試料２を準備すること、
（２）分析用試料２のみ、または分析用試料１および２の両方に内部標準物質を添加すること、
（３）分析用試料１および２をＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＣＥ−ＭＳ／ＭＳにより分析すること、
（４）分析結果において、分析用試料２と比較して分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定すること、ならびに
（５）分析用試料２の分析結果において、配糖体に由来すると決定されたピークと内部標準物質ピークの強度（高さまたは面積）比を算出すること、
の工程を含む、前記方法。
[10] A method for quantifying glycosides contained in a biological sample,
(1) (1-i) Analytical sample 1 treated with an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond is prepared from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample. And (1-ii) preparing an analytical sample 2 that is not treated with an enzyme from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample,
(2) adding an internal standard substance only to analytical sample 2 or both analytical samples 1 and 2;
(3) Analyzing analytical samples 1 and 2 by LC-MS / MS or CE-MS / MS,
(4) In the analysis result, it is determined that a peak whose disappearance or intensity (height or area) is decreased in the analytical sample 1 as compared with the analytical sample 2 is derived from the glycoside, and (5) ) Calculating the intensity (height or area) ratio between the peak determined to be derived from the glycoside and the internal standard substance peak in the analysis result of the analytical sample 2;
The method comprising the steps of:
［１１］生物試料が植物に由来する試料である、［１０］に記載の方法。
［１２］配糖体がグルコシド、ルチノシド、アラビノシド、ガラクトシド、マンノシド、アピオシド、キシロシド、およびフコシドから選択される、［１０］または［１１］に記載の方法。
[11] The method according to [10], wherein the biological sample is a plant-derived sample.
[12] The method according to [10] or [11], wherein the glycoside is selected from glucoside, rutinoside, arabinoside, galactoside, mannoside, apioside, xyloside, and fucoside.
［１３］酵素が配糖体中の糖と非糖部の間のグリコシド結合、または糖と糖の間のグリコシド結合を加水分解する機能を有する、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］酵素がグルコシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、アピオシル-グルコシダーゼ、およびフコシダーゼから選択される１つまたは複数である、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
[13] The enzyme according to any one of [10] to [12], wherein the enzyme has a function of hydrolyzing a glycosidic bond between a sugar and a non-sugar part in a glycoside, or a glycosidic bond between a sugar and a sugar. the method of.
[14] The method according to any one of [10] to [13], wherein the enzyme is one or more selected from glucosidase, rhamnosidase, xylosidase, arabinosidase, galactosidase, mannosidase, apiosyl-glucosidase, and fucosidase. .
［１５］酵素がβ−グルコシダーゼである、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］タンデム質量分析計が三連四重極質量分析計である、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
[15] The method according to any one of [10] to [14], wherein the enzyme is β-glucosidase.
[16] The method according to any one of [10] to [15], wherein the tandem mass spectrometer is a triple quadrupole mass spectrometer.
［１７］分析がコンスタントニュートラルロススキャンによって行われる、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］コンスタントニュートラルロススキャンにおけるニュートラルロス質量の設定が１６２ｕである、［１７］に記載の方法。
[17] The method according to any one of [10] to [16], wherein the analysis is performed by a constant neutral loss scan.
[18] The method according to [17], wherein the neutral loss mass setting in the constant neutral loss scan is 162u.
［１９］分析が選択反応モニタリング（ＳＲＭ）によって行われる、［１０］〜［１６］に記載の方法。
［２０］ＳＲＭにおいてモニターされる配糖体由来のプリカーサーイオン／プロダクトイオンのトランジションのｍ／ｚ値が、４８１／３１９、４７１／３０９、４５５／２９３、４５３／２９１、４２７／２６５、３５９／１９７、３５５／１９３、３５１／１８９、３４１／１７９、３２５／１６３、３２１／１５９、３１９／１５７、４９５／３３３、４６５／３０３、４１５／２５３、３７３／２１１、３７１／２０９、４９３／３３１、４４９／２８７、４１１／２４９、３９９／２３７、３９７／２３５、３８５／２２３、および３８１／２１９（各ｍ／ｚ値を中心とする前後０．２ｕの範囲を含む）から選択される一つ以上である、［１９］に記載の方法。
[19] The method according to [10] to [16], wherein the analysis is performed by selective reaction monitoring (SRM).
[20] The m / z values of the glycoside-derived precursor ion / product ion transition monitored in SRM are 481/319, 471/309, 455/293, 453/291, 427/265, 359/197. 355/193, 351/189, 341/179, 325/163, 321/159, 319/157, 495/333, 465/303, 415/253, 373/211, 371/209, 493/331, 449 One or more selected from / 287, 411/249, 399/237, 397/235, 385/223, and 381/219 (including a range of 0.2u around each m / z value) The method according to [19].
本発明の配糖体のスクリーニング方法および定量方法によれば、夾雑成分が多い生物試料や未同定の配糖体を含有する生物試料であっても、簡便に含有される配糖体を一斉に分析することが可能となる。また、生物試料につき分析用試料の準備を一度行うだけでスクリーニングと定量を行うことも可能となる。 According to the glycoside screening method and the quantification method of the present invention, even a biological sample having a large amount of contaminant components or a biological sample containing an unidentified glycoside, the glycosides that are easily contained can be simultaneously contained. It becomes possible to analyze. In addition, screening and quantification can be performed by preparing an analysis sample once for each biological sample.
以下、非限定的に本発明の態様を説明する。
本発明の生物試料に含有される配糖体のスクリーニング方法は、以下の工程：
（１）（１−ｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料１を準備すること、および
（１−ｉｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、酵素で処理しない分析用試料２を準備すること、
（２）分析用試料１および２を液体クロマトグラフタンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）またはキャピラリー電気泳動タンデム質量分析計（ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ）により分析すること、ならびに
（３）分析結果において、分析用試料２と比較して分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定すること、
を含んでいる。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in a non-limiting manner.
The screening method for glycosides contained in the biological sample of the present invention comprises the following steps:
(1) (1-i) Analytical sample 1 treated with an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond is prepared from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample. And (1-ii) preparing an analytical sample 2 that is not treated with an enzyme from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample,
(2) Analyzing samples 1 and 2 for analysis with a liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) or a capillary electrophoresis tandem mass spectrometer (CE-MS / MS), and (3) Analysis results , Determining that the peak in which the disappearance or intensity (height or area) is decreased in the analytical sample 1 compared to the analytical sample 2 is derived from a glycoside,
Is included.
また、本発明の生物試料に含有される配糖体の定量方法は、以下の工程：
（１）（１−ｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料１を準備すること、および
（１−ｉｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、酵素で処理しない分析用試料２を準備すること、
（２）分析用試料２のみ、または分析用試料１および２の両方に内部標準物質を添加すること、
（３）分析用試料１および２をＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＣＥ−ＭＳ／ＭＳにより分析すること、
（４）分析結果において、分析用試料２と比較して分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定すること、ならびに
（５）分析用試料２の分析結果において、配糖体に由来すると決定されたピークと内部標準物質ピークの強度（高さまたは面積）比を算出すること、
を含んでおり、スクリーニングと定量を連続して行うことができる。 本明細書で「グリコシド結合」とは、糖と非糖の有機化合物、または糖と糖とが脱水縮合して形成される共有結合を指す。
The method for quantifying glycosides contained in the biological sample of the present invention includes the following steps:
(1) (1-i) Analytical sample 1 treated with an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond is prepared from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample. And (1-ii) preparing an analytical sample 2 that is not treated with an enzyme from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample,
(2) adding an internal standard substance only to analytical sample 2 or both analytical samples 1 and 2;
(3) Analyzing analytical samples 1 and 2 by LC-MS / MS or CE-MS / MS,
(4) In the analysis result, it is determined that a peak whose disappearance or intensity (height or area) is decreased in the analytical sample 1 as compared with the analytical sample 2 is derived from the glycoside, and (5) ) Calculating the intensity (height or area) ratio between the peak determined to be derived from the glycoside and the internal standard substance peak in the analysis result of the analytical sample 2;
Screening and quantification can be carried out continuously. As used herein, “glycoside bond” refers to a covalent bond formed by dehydration condensation between a sugar and a non-sugar organic compound, or a sugar and a sugar.
本明細書で「配糖体」とは、糖と非糖の有機化合物がグリコシド結合により結合した化合物を総称するものとして用いられる。非糖の有機化合物に結合している糖は単糖であってもよいし、二糖、または三糖以上の多糖であってもよい。また、アミノ糖、酸性糖などの電荷を持つ糖を含んでいてもよい。 In the present specification, the “glycoside” is used as a general term for compounds in which a sugar and a non-sugar organic compound are bonded by a glycosidic bond. The saccharide bonded to the non-saccharide organic compound may be a monosaccharide, a disaccharide, or a polysaccharide of three or more sugars. Further, it may contain a charged sugar such as an amino sugar or an acidic sugar.
本明細書で「アグリコン」とは、配糖体を構成する前の非糖の有機化合物を指す。非糖の有機化合物は特に限定されない。例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、糖質、ポリフェノール、アルコール、アルカロイド、テルペノイドなどが挙げられる。 As used herein, “aglycone” refers to a non-sugar organic compound before constituting a glycoside. The non-sugar organic compound is not particularly limited. Examples include proteins, peptides, lipids, carbohydrates, polyphenols, alcohols, alkaloids, terpenoids, and the like.
本明細書で配糖体の「スクリーニング」とは、生物試料に含有される配糖体をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、得られるクロマトグラム上のピークを配糖体由来のものとそうでないものとに分類することを指す。 In this specification, “screening” of glycosides means that glycosides contained in biological samples are analyzed by LC-MS / MS, and the peak on the chromatogram obtained is not derived from glycosides. Refers to classifying things.
本明細書で配糖体の「定量」とは、単一の生物試料に含有される複数の配糖体間または複数の生物試料に含有される対応する配糖体間での比較による、定量値の推定または相対定量を意味する。比較には、配糖体のスクリーニングにより配糖体由来のものと決定されたピークの強度（高さまたは面積）の値を用いるが、試料注入時の量の誤差を減らすために添加した内部標準物質のピークの強度（高さまたは面積）との比の値を算出して用いてもよい。本発明の定量方法は、単一の生物試料に含有される複数の配糖体の量を比較して含有される配糖体の組成を調べること、複数の生物試料に含有される配糖体の量を比較して含有される配糖体の組成の変化を調べることなどに用いることができる。 As used herein, “quantification” of a glycoside means quantification by comparison between a plurality of glycosides contained in a single biological sample or between corresponding glycosides contained in a plurality of biological samples. Means estimation or relative quantification of values. For comparison, the value of peak intensity (height or area) determined to be derived from glycosides by screening for glycosides is used, but an internal standard added to reduce the amount error during sample injection. You may calculate and use the value of ratio with the intensity | strength (height or area) of the peak of a substance. The quantification method of the present invention is to examine the composition of a glycoside contained by comparing the amount of a plurality of glycosides contained in a single biological sample, and the glycoside contained in a plurality of biological samples. It can be used for examining changes in the composition of glycosides contained by comparing the amounts of these.
本発明で用いることのできる生物試料は特に限定されない。
「生物」は、特に限定されず、動物、植物、微生物のいずれでもよい。「動物」は、特に限定されず、脊椎動物、無脊椎動物のいずれでもよい。脊椎動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類のいずれでもよい。
The biological sample that can be used in the present invention is not particularly limited.
The “organism” is not particularly limited and may be any animal, plant, or microorganism. The “animal” is not particularly limited, and may be a vertebrate or an invertebrate. The vertebrate may be any of mammals, birds, reptiles, amphibians and fish.
動物由来の「生物試料」は、例えば、動物の器官（例えば、内臓器官（例えば、胃、肺、心臓、肝臓、腸、すい臓、脾臓など）など）、動物の組織（筋肉などの筋組織、骨、軟骨、腱、真皮、皮下組織などの結合組織、中枢神経系、末梢神経系などの神経組織など）、動物の体液（血液、尿、母乳、リンパ液、脳脊髄液、膵液、胆汁など）などを用いることができる。 “Biological samples” derived from animals include, for example, animal organs (eg, internal organs (eg, stomach, lung, heart, liver, intestine, pancreas, spleen, etc.)), animal tissues (muscle tissues such as muscle, Bone, cartilage, tendon, dermis, connective tissue such as subcutaneous tissue, nervous system such as central nervous system and peripheral nervous system), animal body fluid (blood, urine, breast milk, lymph, cerebrospinal fluid, pancreatic juice, bile, etc.) Etc. can be used.
「植物」の種類は特に限定されるものではない。コケ植物、シダ植物、裸子植物、被子植物（双子葉植物および単子葉植物）のいずれでもよく、好ましくは被子植物であり、より好ましくは双子葉植物である。さらに好ましくは、ナス科植物であり、最も好ましくは、タバコ属植物である。 The kind of “plant” is not particularly limited. Moss plants, fern plants, gymnosperms, and angiosperms (dicotyledonous and monocotyledonous plants) may be used, preferably angiosperms, and more preferably dicotyledonous plants. More preferred are solanaceous plants, and most preferred are tobacco plants.
植物由来の「生物試料」は、例えば、植物の種、胚、葉、茎、花、根などより選択される。
本発明で分析される配糖体は、例えば、グルコシド、ルチノシド、アラビノシド、ガラクトシド、マンノシド、アピオシド、キシロシド、フコシド、好ましくはグルコシド、ルチノシド、キシロシド、より好ましくはグルコシド、ルチノシドを挙げることができる。
The “biological sample” derived from a plant is selected from, for example, plant seeds, embryos, leaves, stems, flowers, roots and the like.
Examples of the glycoside analyzed in the present invention include glucoside, rutinoside, arabinoside, galactoside, mannoside, apioside, xyloside, fucoside, preferably glucoside, rutinoside, xyloside, more preferably glucoside, rutinoside.
本発明において用いる酵素は、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素である限り特に限定されない。好ましくは、配糖体中の糖と非糖部の間のグリコシド結合、または糖と糖の間のグリコシド結合を加水分解する機能を有する酵素である。例えば、国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＩＵＢＭＢ）の酵素番号（ＥＣ番号、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）でＥＣ３．２．１の区分に分類される酵素、あるいはグルコシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、アピオシル−グルコシダーゼ、フコシダーゼ、好ましくはグルコシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、より好ましくはグルコシダーゼ、さらに好ましくはβ−グルコシダーゼを挙げることができる。 The enzyme used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond. Preferably, it is an enzyme having a function of hydrolyzing a glycosidic bond between a sugar and a non-sugar part in a glycoside, or a glycosidic bond between a sugar and a sugar. For example, an enzyme classified as EC 3.2.1 by the enzyme number (EC number, Enzyme Commission number) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), or a glucosidase or rhamnosidase Xylosidase, arabinosidase, galactosidase, mannosidase, apiosyl-glucosidase, fucosidase, preferably glucosidase, rhamnosidase, xylosidase, more preferably glucosidase, more preferably β-glucosidase.
「液体クロマトグラフタンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）」は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）にタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を結合した装置であり、液体クロマトグラフィーの方法で分離した化合物をＭＳ／ＭＳで分析することができる。本発明で用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＬＣおよびＭＳ／ＭＳ以外の部分を含むものであってもよい。 "Liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS / MS)" is a device in which a tandem mass spectrometer (MS / MS) is coupled to a liquid chromatograph (LC) and is a compound separated by a liquid chromatography method Can be analyzed by MS / MS. The LC-MS / MS used in the present invention may include parts other than LC and MS / MS.
「液体クロマトグラフィー」は、液体の移動相をポンプなどによって加圧してカラムを通過させ、試料中の化合物をカラムの固定相および移動相との相互作用の差を利用して分離する方法である。利用する相互作用の種類により、分配クロマトグラフィー（順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィーなど）、吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーなど）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの分離モードが存在する。 “Liquid chromatography” is a method in which a liquid mobile phase is pressurized with a pump or the like and passed through a column, and a compound in a sample is separated by utilizing the difference in interaction between the stationary phase and the mobile phase of the column. . Depending on the type of interaction used, partition chromatography (normal phase chromatography, reverse phase chromatography, hydrophilic interaction chromatography, etc.), adsorption chromatography, size exclusion chromatography (gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, etc.) ), Separation modes such as ion exchange chromatography and affinity chromatography.
本発明で用いる液体クロマトグラフィーの分離モードは特に限定されないが、好ましくは分配クロマトグラフィー、より好ましくは逆相クロマトグラフィーの分離モードを用いることができる。 The separation mode of liquid chromatography used in the present invention is not particularly limited, but partition chromatography, more preferably reverse phase chromatography, can be used.
「キャピラリー電気泳動タンデム質量分析計（ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ）」は、キャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）にタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を結合した装置であり、キャピラリー電気泳動の方法で分離した化合物をＭＳ／ＭＳで分析することができる。本発明で用いるＣＥ−ＭＳ／ＭＳは、ＣＥおよびＭＳ／ＭＳ以外の部分を含むものであってもよい。 The “capillary electrophoresis tandem mass spectrometer (CE-MS / MS)” is an apparatus in which a tandem mass spectrometer (MS / MS) is coupled to a capillary electrophoresis apparatus (CE) and separated by a capillary electrophoresis method. Compounds can be analyzed by MS / MS. CE-MS / MS used in the present invention may include parts other than CE and MS / MS.
「キャピラリー電気泳動」は、泳動液または泳動液を含む支持体（ゲルなど）を充填したキャピラリー内に試料を狭いゾーンとして導入した後、キャピラリーの両端に電圧を加えてキャピラリー内に均一な電位勾配を作成し、電荷および分子サイズによって決まる電気泳動移動度の差を利用して試料中のイオン性化合物を分離するキャピラリーゾーン電気泳動；キャピラリー内に先行イオンを含む泳動液と後続イオンとを含む泳動液を充填し、その境界面に試料を導入した後キャピラリーの両端に電圧を加えて、試料中のイオン性化合物を先行イオンと後続イオンとの間でその移動度の順に電位勾配一定のゾーンを形成させながら等速移動させて、イオン性化合物を分離するキャピラリー等速電気泳動；泳動液または泳動液を含む支持体を充填したキャピラリー内にｐＨ勾配を作成し、これに試料を導入して電圧を加えて、試料中の両性イオン性化合物をその等電点まで移動させて濃縮されたバンドを形成させるキャピラリー等電点電気泳動；キャピラリーに機能性イオンを添加した泳動液を充填し、試料を導入して電圧を加えて、試料中の化合物を等速移動する機能性イオンと相互作用させ、その作用の度合いに応じて化合物を分離するキャピラリー動電クロマトグラフィー（ミセル動電クロマトグラフィーなど）；液体クロマトグラフィー用のキャピラリーカラムを用いて電圧を加えて、カラムの固定相との相互作用の大きさの違い、および電場下における溶液内での電気泳動速度の違いにより試料中の化合物を分離するキャピラリー電気クロマトグラフィーなどの分離モードが存在する。 In “capillary electrophoresis”, a sample is introduced as a narrow zone into a capillary filled with an electrophoretic solution or a support (gel etc.) containing the electrophoretic solution, and then a voltage is applied to both ends of the capillary to create a uniform potential gradient in the capillary. Capillary zone electrophoresis that separates ionic compounds in a sample by using the difference in electrophoretic mobility determined by the charge and molecular size; electrophoresis that includes electrophoresis solution containing preceding ions and subsequent ions in the capillary After filling the liquid and introducing the sample to the boundary surface, a voltage is applied to both ends of the capillary so that the ionic compound in the sample has a constant potential gradient zone in the order of its mobility between the preceding ion and the following ion. Capillary isotachophoresis in which ionic compounds are separated by moving at constant speed while forming; electrophoresis solution or a support containing electrophoresis solution is filled Create a pH gradient in the capillary, introduce a sample into it, apply a voltage, and move the zwitterionic compound in the sample to its isoelectric point to form a concentrated band. Electrophoresis: Capillary solution filled with functional ions is filled, a sample is introduced, voltage is applied, and the compounds in the sample interact with functional ions that move at a constant speed, depending on the degree of action. Capillary electrokinetic chromatography (such as micellar electrokinetic chromatography) to separate compounds; applying a voltage using a capillary column for liquid chromatography, the magnitude of the interaction with the stationary phase of the column, and under an electric field Separation modes such as capillary electrochromatography, which separates compounds in a sample based on differences in electrophoresis speed in solution Exist.
本発明で用いるキャピラリー電気泳動の分離モードは特に限定されない。
「タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）」は、質量分析計を２台直列に結合した装置である。イオン源でイオン化されたイオン群から、１台目の質量分析計（ＭＳ１）で分離して選択したプリカーサーイオン（前駆イオン）を、不活性ガスと衝突させることによる衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子を照射することによる電子捕獲解離（ＥＣＤ）、イオン同士で反応させることによる電子移動解離（ＥＴＤ）などの方法によりフラグメント化した後、得られるプロダクトイオン群を２台目の質量分析計で測定する。本発明で用いるタンデム質量分析計は、特に限定されず、例えば、三連四重極質量分析計（ＱｑＱ）、四重極−飛行時間型質量分析計（ＱｑＴＯＦ）、四重極イオントラップ質量分析計（ＱＩＴ）など、好ましくはＱｑＱ、ＱｑＴＯＦなど、より好ましくはＱｑＱ、ＱｑＴＯＦ、さらに好ましくはＱｑＱを用いることができる。
The separation mode of capillary electrophoresis used in the present invention is not particularly limited.
A “tandem mass spectrometer (MS / MS)” is an apparatus in which two mass spectrometers are connected in series. Collision-induced dissociation (CID), electrons generated by colliding a precursor ion (precursor ion) selected from a group of ions ionized by an ion source with a first mass spectrometer (MS1) with an inert gas After fragmentation by electron capture dissociation (ECD) by irradiating ions and electron transfer dissociation (ETD) by reacting ions, the resulting product ion group is measured with a second mass spectrometer. . The tandem mass spectrometer used in the present invention is not particularly limited. For example, a triple quadrupole mass spectrometer (QqQ), a quadrupole-time-of-flight mass spectrometer (QqTOF), or a quadrupole ion trap mass spectrometer. A total (QIT) or the like, preferably QqQ, QqTOF or the like, more preferably QqQ, QqTOF, or more preferably QqQ can be used.
本発明において、イオン源におけるイオン化法は、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）または、ＡＰＣＩとＡＰＰＩの組合せなどの方法を用いることができる。 In the present invention, as the ionization method in the ion source, for example, electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), atmospheric pressure photoionization (APPI), or a combination of APCI and APPI can be used.
本発明において、ＣＩＤのための不活性ガスは、例えば、窒素、ヘリウム、アルゴンなどを用いることができる。
ＭＳ／ＭＳの測定法としては、定性のための測定法および定量のための測定法がある。本発明において、配糖体のスクリーニングには定性のための測定法を用い、配糖体の定量には定量のための測定法を用いる。
In the present invention, as the inert gas for CID, for example, nitrogen, helium, argon or the like can be used.
MS / MS measurement methods include a qualitative measurement method and a quantitative measurement method. In the present invention, a qualitative measurement method is used for screening glycosides, and a quantification measurement method is used for quantification of glycosides.
一般に、定性のための測定法には、主に以下の３つがある。なお、これらの測定法は定量のためにも用いることができる。
（１）ＭＳ１で選択したプリカーサーイオン（前駆イオン）をＣＩＤによって開裂して生成したプロダクトイオンを測定するプロダクトイオンスキャン。プリカーサーイオンの構造解析に有効である。
In general, there are mainly the following three measurement methods for qualification. These measurement methods can also be used for quantification.
(1) Product ion scan for measuring product ions generated by cleaving precursor ions (precursor ions) selected by MS1 with CID. It is effective for structural analysis of precursor ions.
（２）ＣＩＤによって、ある特定のプロダクトイオンを開裂・生成するプリカーサーイオンを測定するプリカーサーイオンスキャン。ＣＩＤにおいて、プリカーサーイオンから、化合物が持つ特定の官能基に特徴的なフラグメントイオンが生じる場合や、化合物が持つ構造由来の特定のフラグメントイオンが生じる場合などに有効である。 (2) A precursor ion scan for measuring a precursor ion that cleaves and generates a specific product ion by CID. In CID, it is effective when a fragment ion characteristic of a specific functional group of a compound is generated from a precursor ion, or when a specific fragment ion derived from the structure of a compound is generated.
（３）ＣＩＤによって、ある特定の電荷的に中性の分子を失ったプリカーサーイオンを測定するコンスタントニュートラルロススキャン。試料に含有される化合物のプリカーサーイオンからＣＩＤにおいて特定の部分構造や官能基由来の共通の質量が脱離する場合などに有効である。本明細書において、失われた中性分子の分子量を「ニュートラルロス質量」と称する。 (3) Constant neutral loss scan that measures precursor ions that have lost a particular charge neutral molecule by CID. This is effective when a common mass derived from a specific partial structure or functional group in the CID is eliminated from the precursor ion of the compound contained in the sample. In the present specification, the molecular weight of the lost neutral molecule is referred to as “neutral loss mass”.
これらの測定法により、「プロダクトイオンスペクトル」、「プリカーサーイオンスペクトル」、「コンスタントニュートラルロススペクトル」などの多様なＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができる。 By these measurement methods, various MS / MS spectra such as “product ion spectrum”, “precursor ion spectrum”, and “constant neutral loss spectrum” can be obtained.
本発明において、配糖体のスクリーニングに用いる定性のための測定法は特に限定されず、プロダクトイオンスキャン、コンスタントニュートラルロススキャン、プリカーサーイオンスキャンを用いることができ、好ましくはコンスタントニュートラルロススキャン、プリカーサーイオンスキャン、より好ましくはコンスタントニュートラルロススキャンを用いることができる。 In the present invention, the qualitative measurement method used for screening for glycosides is not particularly limited, and product ion scan, constant neutral loss scan, precursor ion scan can be used, preferably constant neutral loss scan, precursor ion. A scan, more preferably a constant neutral loss scan, can be used.
また、本発明において、コンスタントニュートラルロススキャンにおけるニュートラルロス質量の設定は、例えば１４６ｕ、１６２ｕ、２０４ｕ、３０８ｕ、３２４ｕ、好ましくは１６２ｕ、１４６ｕとすることができる。１４６ｕでは、例えば、ラムノシドなどのデオキシ糖の配糖体が、１６２ｕでは、例えば、グルコシドやガラクトシドなどの単糖の配糖体が、２０４ｕでは、例えば、アセチルグルコシドなどのアシル化糖の配糖体が、３０８ｕでは、例えば、ルチノシドなどの配糖体が、３２４ｕでは、カフェオイルグルコシドなどのアシル化糖の配糖体が検出される。 In the present invention, the setting of the neutral loss mass in the constant neutral loss scan can be set to, for example, 146u, 162u, 204u, 308u, 324u, preferably 162u, 146u. In 146u, for example, glycosides of deoxy sugars such as rhamnoside, in 162u, for example, glycosides of monosaccharides such as glucoside and galactoside, in 204u, for example, glycosides of acylated sugars such as acetylglucoside, etc. However, in 308u, for example, a glycoside such as rutinoside is detected, and in 324u, a glycoside of an acylated sugar such as caffeoylglucoside is detected.
定量のための測定法には、上記の測定法の他、測定対象化合物の選択性の向上を目的とした選択反応モニタリング（ＳＲＭ）がある。
ＳＲＭでは、ＭＳ１を目的のプリカーサーイオンのｍ／ｚに固定してプリカーサーイオンを選択し、さらにＭＳ２を、フラグメント化により得られる特徴的なプロダクトイオンのｍ／ｚに固定してプロダクトイオンを選択して測定する方法である。目的の化合物のプリカーサーイオンから生じるプロダクトイオンによる定量法であり、夾雑成分のイオンとの分離をＭＳ／ＭＳで行うためノイズが小さくなり、精度のよい高感度な分析が可能となる。
As a measurement method for quantification, there is selective reaction monitoring (SRM) for the purpose of improving the selectivity of the measurement target compound in addition to the above-described measurement method.
In SRM, MS1 is fixed to the target precursor ion m / z to select the precursor ion, and MS2 is fixed to the characteristic product ion m / z obtained by fragmentation to select the product ion. It is a method to measure. This is a quantification method using product ions generated from precursor ions of the target compound, and separation of impurities from ions is performed by MS / MS, thereby reducing noise and enabling highly accurate and highly sensitive analysis.
生物試料の一般的な準備
以下に、本発明の配糖体のスクリーニング方法および定量方法を行う前の一般的な準備について、例を挙げて非限定的に説明する。
General Preparation of Biological Sample Hereinafter, general preparation before performing the glycoside screening method and quantification method of the present invention will be described in a non-limiting manner.
（ｉ）生物試料の破砕
配糖体の分析の対象物を破砕して細かくしておく事は、配糖体の抽出効率を向上させる上で有効である。分析対象物によって、試料の破砕方法が異なる。以下に手順を例示するが、これに限定されるものではない。
(I) Disruption of biological sample It is effective to improve the extraction efficiency of glycosides by crushing the object of glycoside analysis into fine pieces. The sample crushing method differs depending on the analysis object. The procedure is illustrated below, but is not limited thereto.
含水率が低い試料（たとえば乾燥した植物の葉など）は、市販の粉砕機（ミル）を用いて簡便に破砕することができる。含水率が高い試料（例えば、生体組織、生きている植物の葉や培養細胞など）は、溶液中でホモジナイザーを用いて粉砕する方法、または凍結してミルなどにより試料を破砕する方法を用いることができる。また、含水率が高い試料は、凍結乾燥を行った後に、ミルを用いて簡便に破砕することができる。 A sample having a low water content (for example, dried plant leaves) can be easily crushed using a commercially available pulverizer (mill). For samples with high water content (for example, living tissue, living plant leaves, cultured cells, etc.), use a method of crushing the sample using a homogenizer in solution, or a method of freezing and crushing the sample using a mill. Can do. A sample having a high water content can be easily crushed using a mill after lyophilization.
（ｉｉ）生物試料の含水率測定
生物試料の乾物重量を基準に、複数の生物試料間で含有される配糖体の組成を比較する場合、および含有される配糖体成分量を比較する場合、生物試料の含水率を並行して測定しておくのが好ましい。以下に手順を例示するが、これに限定されるものではなく、また、本測定を行うかは任意である。
(Ii) Measurement of moisture content of biological sample When comparing the composition of glycosides contained among multiple biological samples based on the dry matter weight of biological samples, and when comparing the amount of glycoside components contained It is preferable to measure the moisture content of the biological sample in parallel. The procedure is exemplified below, but the procedure is not limited to this, and it is optional whether to perform this measurement.
例えば、生物試料を８０〜１００℃に設定したオーブン内で５分〜３時間乾燥させた後に冷却させ、乾燥前後での重量減少分を元の生物試料の水分量として含水率を算出することができる。あるいは、例えば、生物試料を凍結乾燥（１０Ｐａ以下の圧力、１２〜７２時間）させた後、乾燥前後での重量減少分を元の生物試料の水分量として含水率を算出することができる。 For example, the biological sample is dried in an oven set at 80 to 100 ° C. for 5 minutes to 3 hours and then cooled, and the moisture content is calculated using the weight loss before and after drying as the moisture content of the original biological sample. it can. Alternatively, for example, after the biological sample is freeze-dried (pressure of 10 Pa or less, 12 to 72 hours), the moisture content can be calculated using the weight loss before and after drying as the water content of the original biological sample.
配糖体を含む調製物からの分析用試料の準備
以下に、本発明の配糖体のスクリーニング方法および定量方法における、生物試料より調製された配糖体を含む調製物からの分析用試料の準備について、例を挙げて非限定的に説明する。「生物試料より調製された配糖体を含む調製物」は、生物試料からの抽出などの操作によって調製したものであってもよいし、市販品などの既に調製済のものであってもよい。調製物の態様は特に限定されず、例えば、溶液、粉末、ペースト、油状液体などを用いることができる。
Preparation of Analytical Sample from Preparation Containing Glycoside In the following, a sample for analysis from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample in the glycoside screening and quantification method of the present invention is prepared. Preparation will be described by way of non-limiting example. The “preparation containing a glycoside prepared from a biological sample” may be prepared by an operation such as extraction from a biological sample, or may be an already prepared product such as a commercial product. . The form of the preparation is not particularly limited, and for example, a solution, powder, paste, oily liquid, or the like can be used.
（ｉ）配糖体を含む調製物の生物試料からの調製
既に調製されている配糖体を含む調製物を用いるのでない場合には、生物試料より配糖体を含む調製物を調製する必要がある。以下に手順を例示するが、これに限定されるものではない。
(I) Preparation of a preparation containing a glycoside from a biological sample When a preparation containing an already prepared glycoside is not used, it is necessary to prepare a preparation containing the glycoside from the biological sample. There is. The procedure is illustrated below, but is not limited thereto.
例えば、葉たばこ試料などの農産物試料であれば、メタノール、含水エタノールなどの有機溶媒を加え、１００〜３００ｒｐｍで３０分〜１時間振盪抽出し、超音波処理をしながら３０分〜１時間抽出する。抽出液を３，０００〜２０，０００×ｇで２〜１５分間遠心し、上清液をろ過する。その後、ろ液から有機溶媒を留去する。有機溶媒を留去した後の乾固物に対して、酢酸緩衝液、マッキルベイン緩衝液（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ）などの緩衝液（例えば、ｐＨ３．５〜７．５、好ましくはｐＨ４．５〜６．５、より好ましくはｐＨ５．６）を加え、超音波処理をしながら再溶解させる。定容時の濃度目安として、抽出に用いた葉たばこ試料の乾燥重量０．０５〜０．１０ｇ相当の溶解物を１ｍＬに溶解させた状態が挙げられる。再溶解した溶液をろ過滅菌して、配糖体を含む調製物をろ液として調製する。 For example, in the case of an agricultural product sample such as a leaf tobacco sample, an organic solvent such as methanol or hydrous ethanol is added, extracted by shaking at 100 to 300 rpm for 30 minutes to 1 hour, and extracted for 30 minutes to 1 hour while sonicating. The extract is centrifuged at 3,000 to 20,000 × g for 2 to 15 minutes, and the supernatant is filtered. Thereafter, the organic solvent is distilled off from the filtrate. A buffer solution (for example, pH 3.5 to 7.5, preferably pH 4.5 to 6.5) such as an acetate buffer and a McIlvaine buffer is applied to the dried product after the organic solvent has been distilled off. More preferably, pH 5.6) is added and redissolved while sonicating. As a standard for concentration at the time of constant volume, a state in which a dissolved substance corresponding to a dry weight of 0.05 to 0.10 g of a leaf tobacco sample used for extraction is dissolved in 1 mL can be mentioned. The redissolved solution is sterilized by filtration, and a preparation containing a glycoside is prepared as a filtrate.
（ｉｉ）配糖体を含む調製物の酵素処理
「生物試料より調製した配糖体を含む調製物」を、緩衝液などに溶解させ、グリコシド結合を加水分解する酵素で処理する。以下に手順を例示するが、これに限定されるものではない。
(Ii) Enzymatic treatment of a preparation containing a glycoside [Preparation containing a glycoside prepared from a biological sample] is dissolved in a buffer solution and treated with an enzyme that hydrolyzes a glycosidic bond. The procedure is illustrated below, but is not limited thereto.
配糖体を含むろ液などの調製物を２つの容器に分注し、一方に酵素（溶液など）を添加する。もう一方は再溶解に用いた緩衝液を添加する。容器を密閉し、例えば２０〜６０℃で１〜１００時間、好ましくは４０℃で２４〜６０時間、より好ましくは４０℃で４８時間インキュベートする。インキュベート後、反応液を限外ろ過（排除限界：１〜１０ｋＤａ、好ましくは３〜１０ｋＤａ、最も好ましくは１０ｋＤａ）して酵素を除去する。 A preparation such as a filtrate containing a glycoside is dispensed into two containers, and an enzyme (such as a solution) is added to one container. The other adds the buffer used for redissolution. The container is sealed and incubated at, for example, 20-60 ° C. for 1-100 hours, preferably 40 ° C. for 24-60 hours, more preferably 40 ° C. for 48 hours. After the incubation, the reaction solution is subjected to ultrafiltration (exclusion limit: 1 to 10 kDa, preferably 3 to 10 kDa, most preferably 10 kDa) to remove the enzyme.
このように、「生物試料より調製された配糖体を含む調製物」をさらに、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理して準備したものを、「分析用試料１」とする。 Thus, the “preparation containing glycosides prepared from biological samples” was further prepared by treating with an enzyme that recognizes the glycostructure of glycosides and hydrolyzes glycosidic bonds. Sample 1 ”.
それに対し、「生物試料より調製された配糖体を含む調製物」に対して、酵素処理を行わないで準備したものを「分析用試料２」とする。
上記に例示した方法によって準備した分析用試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析するが、分析前に分析用試料に内部標準物質を添加してもよい。内部標準物質としては、標準品が入手でき、生体試料に含有される配糖体とピークが重ならない適当な配糖体などを用いる。例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、エチルバニリンβ−Ｄ−グルコピラノシド、フロリジンなど、好ましくは、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシドを内部標準物質として用いることができる。
On the other hand, a “preparation containing glycoside prepared from a biological sample” prepared without performing enzyme treatment is referred to as “analytical sample 2”.
The analytical sample prepared by the method exemplified above is analyzed by LC-MS / MS, but an internal standard substance may be added to the analytical sample before analysis. As the internal standard substance, a standard product is available, and an appropriate glycoside that does not overlap with the glycoside contained in the biological sample is used. For example, n-dodecyl-β-D-glucopyranoside, ethyl vanillin β-D-glucopyranoside, phlorizin and the like, preferably n-dodecyl-β-D-glucopyranoside can be used as the internal standard substance.
本発明では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析結果のクロマトグラムにおいて分析用試料１と分析用試料２を比較して、分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定する。これは、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理することにより、分析用試料１に含まれるある配糖体は、その全てまたは一部が、例えば糖とアグリコンに分解され、酵素処理を行っていない分析用試料２の分析結果のクロマトグラムで存在する該配糖体のピークが、分析用試料１の分析結果のクロマトグラムでは、消失またはピークの強度（高さまたは面積）が減少するという原理に基づく。消失しているピークおよびピークの強度（高さまたは面積）が、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上減少しているピークを配糖体由来のピークであると決定する。 In the present invention, the analysis sample 1 and the analysis sample 2 are compared in the chromatogram of the analysis result by LC-MS / MS, and the peak in which the disappearance or intensity (height or area) is reduced in the analysis sample 1 Are derived from glycosides. This is because, by treating with an enzyme that recognizes the sugar structure of the glycoside and hydrolyzes the glycosidic bond, all or a part of the glycoside contained in the analytical sample 1 is composed of, for example, sugar and aglycone. The glycoside peak present in the chromatogram of the analysis result of the analysis sample 2 that has been decomposed into the enzyme sample and is not treated with an enzyme is disappeared or the peak intensity (high Or the area) is reduced. The disappearing peak and the peak in which the intensity (height or area) is reduced by, for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more are determined to be glycoside-derived peaks. To do.
また、本発明では、配糖体由来のピークであると決定されたあるピークについて、ピークの強度（高さまたは面積）の値、またはピークの強度（高さまたは面積）の値の内部標準物質のピークの強度（高さまたは面積）の値との比を用いて、該ピークが由来する配糖体の生物試料中における存在量を、他の生物試料との相対比較や該生物試料中の他の配糖体由来のピークとの相対比較することなどにより、推定することができる。 Further, in the present invention, for a certain peak determined to be a glycoside-derived peak, an internal standard substance having a peak intensity (height or area) value or a peak intensity (height or area) value Using the ratio to the intensity (height or area) value of the peak, the abundance in the biological sample of the glycoside from which the peak is derived can be compared relative to other biological samples or in the biological sample. It can be estimated by making a relative comparison with peaks derived from other glycosides.
以下、本発明の具体的態様を実施例として説明する。
実施例１．葉たばこ試料の分析用試料の準備
葉たばこ試料１（１．０ｇ、日本酸黄色種）を１００℃に設定したロータリーオーブン（Ｔｓｕｋａｓａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本、東京）内にて１時間乾燥した。乾燥後、検体はデシケーターの中で室温まで冷却した。乾燥前後での重量変化分を水分量とした。
Specific embodiments of the present invention will be described below as examples.
Example 1. Preparation of analysis sample of leaf tobacco sample Tobacco sample 1 (1.0 g, yellow acid of Japanese acid) was dried in a rotary oven (Tsukasa Co., Ltd., Tokyo, Japan) set at 100 ° C. for 1 hour. After drying, the specimen was cooled to room temperature in a desiccator. The change in weight before and after drying was taken as the amount of water.
ミル（メリタジャパン株式会社）を用いて粉砕した乾燥葉たばこ試料１（０．５ｇ）をそれぞれ５０ｍＬ遠心チューブに秤量し、２０ｍＬのメタノール（和光純薬工業株式会社、日本）を加えて２００ｒｐｍで３０分間振盪抽出した。さらに、超音波（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｃｏ．、米国）処理をしながら３０分間抽出した。抽出液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清液約１５ｍＬを孔径０．２μｍのＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケア、英国)を用いてろ過した。ろ液を１０ｍＬナスフラスコに採取し、ロータリーエバポレーターを用いてメタノールを留去した。乾固物を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）５ｍＬに懸濁して再溶解させた。再溶解させた溶液を、孔径０．２μｍの滅菌済メンブレン（Ｗｈａｔｍａｎｎ（登録商標））を用いてろ過滅菌して、配糖体を含むろ液を調製した。ろ液を２つのバイアル瓶に２ｍＬずつ分注し、一方に１０００Ｕ／ｍＬのβ-グルコシダーゼ（オリエンタル酵母工業株式会社）溶液を１００μＬ添加した。もう一方には５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を１００μＬ添加した。各容器を密閉し、４０℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、１０ｋＤａ限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式限外ろ過チューブ、メルクジャパン）を用いて溶液をろ過し、これらのろ液を分析用試料１（β-グルコシダーゼ溶液を添加）および分析用試料２（５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を添加）とした。また、内部標準物質として、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ・アルドリッチジャパン）を終濃度２０μｇ／ｍＬで分析用試料１および２に添加した。 Each dry leaf tobacco sample 1 (0.5 g) crushed using a mill (Melita Japan Co., Ltd.) was weighed into a 50 mL centrifuge tube, 20 mL of methanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) was added, and 200 rpm was added for 30 minutes. Shake extracted. Furthermore, extraction was performed for 30 minutes while ultrasonic treatment (Branson Ultrasonic Co., USA). The extract was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and about 15 mL of the supernatant was filtered using a PVDF membrane (GE Healthcare, UK) having a pore size of 0.2 μm. The filtrate was collected in a 10 mL eggplant flask and methanol was distilled off using a rotary evaporator. The dried product was suspended in 5 mL of 50 mM acetate buffer (pH 5.6) and redissolved. The redissolved solution was sterilized by filtration using a sterilized membrane (Whatmann (registered trademark)) having a pore size of 0.2 μm to prepare a filtrate containing a glycoside. 2 mL each of the filtrate was dispensed into two vials, and 100 μL of a 1000 U / mL β-glucosidase (Oriental Yeast Co., Ltd.) solution was added to one. The other was added with 100 μL of 50 mM acetate buffer (pH 5.6). Each container was sealed and incubated at 40 ° C. for 48 hours. After incubation, the solution was filtered using a 10 kDa ultrafiltration membrane (Amicon Ultra centrifugal ultrafiltration tube, Merck Japan), and these filtrates were analyzed for sample 1 (with β-glucosidase solution added) and for analysis. 2 (50 mM acetate buffer (pH 5.6) was added). In addition, n-dodecyl-β-D-glucopyranoside (Sigma Aldrich Japan) was added to analytical samples 1 and 2 at a final concentration of 20 μg / mL as an internal standard substance.
実施例２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる配糖体のスクリーニング
分析用試料１および２を、以下の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりそれぞれ分析した。
装置
Ａｇｉｌｅｎｔ ６４１０ トリプル四重極ＬＣ／ＭＳ
クロマトグラフィー条件
カラム：ＹＭＣ-Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８（株式会社ワイエムシィ（ＹＭＣ Ｃｏ．，Ｌｔｄ.））、内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、粒子径３μｍ
注入量（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）：５μＬ
流速（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）：０．１５ｍＬ／分
分析時間（ｒｕｎ ｔｉｍｅ）：６０分
溶離方法：グラジエント溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ）
溶離液Ａ：１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル
グラジエント条件：１５％Ｂ（０〜５分）、１５〜４５％Ｂ（５〜１５分）、４５〜９０％Ｂ（１５〜４５分）、９０％Ｂ（４５〜６０分）
再平衡化（ｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）時間：２０分
カラム温度：４０℃
イオン源パラメーター
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）
ネブライザーガス：窒素
ネブライザーガス温度：３５０℃
ネブライザーガス流量：１１Ｌ／分
ネブライザー圧力：３５ｐｓｉ
キャピラリー電圧：４０００Ｖ
質量分析計パラメーター
イオン極性：正
フラグメンター電圧：１００Ｖ
衝突ガス（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ）：窒素
衝突エネルギー（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）：２０Ｖ
測定モード：スキャン
ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ２５０〜５００
スキャン時間：５００ｍｓ
スキャン方法：コンスタントニュートラルロススキャン
ニュートラルロス質量設定値（ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ ｏｆｆ−ｓｅｔ）：１６２ｕ
分析用試料１および２について、得られた結果のクロマトグラムを図１に示す。図１中の破線は分析用試料１から得られたクロマトグラムであり、実線は分析用試料２から得られたクロマトグラムである。分析用試料１から得られたクロマトグラムには、分析用試料２から得られたクロマトグラムと比較して検出強度が低下しているピークが存在する。下記の比較例１で明らかであるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるコンスタントニュートラルロススキャン（ニュートラルロス質量設定値：１６２ｕ）での分析のみで得られたクロマトグラム中のピークは、プリカーサーイオンから糖質構造がニュートラルロスにより脱離することによって生じたという確証がないため、配糖体由来のピークであると決定されることはできない。しかし、本実施例の結果において、分析用試料１で、分析用試料２と比較してピークが消失またはピーク強度（ピーク高さまたはピーク面積）が減少したピークは、配糖体由来のピークであり、配糖体中のグリコシド結合が加水分解により切断されたためにそのような挙動を示したと考えられる。
Example 2 Samples 1 and 2 for glycoside screening analysis by LC-MS / MS were analyzed by LC-MS / MS, respectively, under the following conditions.
Equipment Agilent 6410 Triple Quadrupole LC / MS
Chromatographic condition column: YMC-Pack Pro C18 (YMC Co., Ltd.), inner diameter 2.0 mm × length 150 mm, particle diameter 3 μm
Injection volume: 5 μL
Flow rate: 0.15 mL / min Analysis time: 60 minutes Elution method: gradient elution
Eluent A: 1% formic acid, eluent B: acetonitrile Gradient conditions: 15% B (0-5 minutes), 15-45% B (5-15 minutes), 45-90% B (15-45 minutes), 90% B (45-60 minutes)
Re-equilibrium time: 20 minutes Column temperature: 40 ° C
Ion source parameter ionization method: electrospray ionization (ESI)
Nebulizer gas: Nitrogen Nebulizer gas temperature: 350 ° C
Nebulizer gas flow rate: 11 L / min Nebulizer pressure: 35 psi
Capillary voltage: 4000V
Mass spectrometer parameter Ion polarity: Positive Fragmentor voltage: 100V
Collision gas: nitrogen Collision energy: 20V
Measurement mode: Scan MS scan range: m / z 250-500
Scan time: 500ms
Scanning Method: Constant Neutral Loss Scan Neutral Loss Mass Set Value (neutral loss off-set): 162u
The resulting chromatograms for analytical samples 1 and 2 are shown in FIG. The broken line in FIG. 1 is a chromatogram obtained from the analytical sample 1, and the solid line is a chromatogram obtained from the analytical sample 2. The chromatogram obtained from the analytical sample 1 has a peak having a lower detection intensity than the chromatogram obtained from the analytical sample 2. As is clear from Comparative Example 1 below, the peak in the chromatogram obtained only by the analysis with the constant neutral loss scan (neutral loss mass setting value: 162 u) by LC-MS / MS is from the precursor ion to the sugar. Since there is no confirmation that the quality structure was caused by elimination by neutral loss, it cannot be determined to be a glycoside-derived peak. However, in the results of this example, the peak in which the peak disappeared or the peak intensity (peak height or peak area) decreased in the analytical sample 1 as compared with the analytical sample 2 is a peak derived from a glycoside. The glycoside bond in the glycoside is considered to be such a behavior because it was cleaved by hydrolysis.
このことより、コンスタントニュートラルロススキャン（ニュートラルロス質量設定値：１６２ｕ）により得られたクロマトグラム中のピークの内、配糖体由来のピークを決定することができた。例えば、本実施例でコンスタントニュートラルロススキャンにより検出されたｍ／ｚ３７３のプリカーサーイオンのピークは、図２に示すように、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）上において分析用試料１では消失していたことから、配糖体由来のピークであると決定された。一方、ｍ／ｚ４７３のプリカーサーイオンのピークは、図３に示すように、分析用試料１と分析用試料２で差がなかったことから、配糖体由来のピークではないと決定された。 From this, it was possible to determine a glycoside-derived peak among the peaks in the chromatogram obtained by the constant neutral loss scan (neutral loss mass setting value: 162 u). For example, the precursor ion peak of m / z 373 detected by a constant neutral loss scan in this example disappeared in the sample 1 for analysis on the extracted ion chromatogram (EIC) as shown in FIG. From this, it was determined that the peak was derived from a glycoside. On the other hand, the peak of the precursor ion at m / z 473 was determined not to be a glycoside-derived peak because there was no difference between analytical sample 1 and analytical sample 2 as shown in FIG.
比較例１．ニュートラルロス質量設定値の検討
実施例１の分析用試料２と同様の手順で比較用試料を準備し、以下の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりそれぞれ分析した。
Comparative Example 1 Examination of Neutral Loss Mass Set Value A comparative sample was prepared in the same procedure as the analytical sample 2 in Example 1, and analyzed by LC-MS / MS under the following conditions.
装置
実施例２に同じ
クロマトグラフィー条件
実施例２に同じ
イオン源パラメーター
実施例２に同じ
質量分析計パラメーター
イオン極性：正
フラグメンター電圧：１００Ｖ
衝突ガス（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ）：窒素
衝突エネルギー（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）：２０Ｖ
測定モード：スキャン
ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ２５０〜７５０（ニュートラルロス質量設定：１４６ｕ、１６２ｕ、２０４ｕ）、ｍ／ｚ３２０〜８２０（ニュートラルロス質量設定３０８ｕ）、ｍ／ｚ４００〜９００（ニュートラルロス質量設定３２４ｕ）
スキャン時間：５００ｍｓ
スキャン方法：コンスタントニュートラルロススキャン
ニュートラルロス質量設定値（ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ ｏｆｆ−ｓｅｔ）：１４６ｕ、１６２ｕ、２０４ｕ（ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ２５０〜７５０）、３０８ｕ（ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ３２０〜８２０）、３２４ｕ（ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ４００〜９００）
比較用試料について、得られた結果のクロマトグラムを図４に示す。ニュートラルロス質量設定値が１６２ｕの場合に最も多数のピークが検出された。ニュートラルロス質量設定値が１６２ｕの場合に検出される配糖体としてはグルコシドなどが考えられる。
Same as device example 2
Chromatographic conditions Same as Example 2
Ion source parameters Same as Example 2
Mass spectrometer parameter Ion polarity: Positive Fragmentor voltage: 100V
Collision gas: nitrogen Collision energy: 20V
Measurement mode: scan MS scan range: m / z 250-750 (neutral loss mass setting: 146u, 162u, 204u), m / z 320-820 (neutral loss mass setting 308u), m / z 400-900 (neutral loss mass setting 324u) )
Scan time: 500ms
Scanning method: Constant neutral loss scan Neutral loss off-set: 146u, 162u, 204u (MS scan range: m / z 250-750), 308u (MS scan range: m / z 320-820), 324u (MS scan range: m / z 400-900)
The resulting chromatogram for the comparative sample is shown in FIG. The most numerous peaks were detected when the neutral loss mass setting was 162u. As a glycoside detected when the neutral loss mass set value is 162 u, glucoside or the like can be considered.
また、溶出時間が１５分付近および１７〜１８分付近の、ニュートラルロス設定値が１４６ｕ、１６２ｕ、および３０８ｕに共通して現れたピークは、以下のように推定されるニュートラルロスの様式（例、ルチン）を示す、ルチノシドに由来するピークであることが示唆された。 In addition, the peaks appearing in common with the neutral loss setting values of 146u, 162u, and 308u at the elution time of around 15 minutes and around 17-18 minutes are the modes of neutral loss estimated as follows (eg, It was suggested that the peak was derived from rutinoside indicating rutin).
しかし、ニュートラルロス設定値が１６２ｕの場合に現われた多数のピークの大半は特定の化合物への帰属が困難であり、糖質構造がニュートラルロスにより脱離しているとの確証もないため、配糖体由来のピークであると決定することができなかった。 However, most of the many peaks that appear when the neutral loss setting value is 162u are difficult to assign to a specific compound, and there is no confirmation that the carbohydrate structure is eliminated due to neutral loss. It could not be determined that the peak was derived from the body.
実施例３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる配糖体の定量
実施例１の分析用試料２（葉たばこ試料１を用いて準備した）を、配糖体由来であると決定されたピークについて、以下の条件でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）により分析した。また、葉たばこ試料２（日本産黄色種）を用いて、分析用試料２と同様に準備した分析用試料３を、同条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
Example 3 Quantification of glycosides by LC-MS / MS Analytical sample 2 of Example 1 (prepared using leaf tobacco sample 1) was subjected to LC under the following conditions for the peak determined to be derived from the glycoside. -Analyzed by MS / MS selective reaction monitoring (SRM). Moreover, the analysis sample 3 prepared similarly to the analysis sample 2 was analyzed by LC-MS / MS on the same conditions using the leaf tobacco sample 2 (Japanese yellow varieties).
装置
実施例１に同じ
クロマトグラフィー条件
実施例１に同じ
イオン源パラメーター
実施例１に同じ
質量分析計パラメーター
イオン極性：正
フラグメンター電圧：１００Ｖ
衝突ガス：窒素
測定モード：選択反応モニタリング（ＳＲＭ）
ＳＲＭにおいてモニターされるプリカーサーイオンおよびプロダクトイオンの組み合わせ（ＳＲＭトランジション）は、以下の表１のとおりに設定した。
Same as device example 1
Chromatographic conditions Same as Example 1
Ion source parameters Same as Example 1
Mass spectrometer parameter Ion polarity: Positive Fragmentor voltage: 100V
Collision gas: Nitrogen Measurement mode: Selective reaction monitoring (SRM)
The combinations of precursor ions and product ions (SRM transitions) monitored in the SRM were set as shown in Table 1 below.
分析用試料２について、得られた結果のクロマトグラムを図５に示す。ＳＲＭを用いることにより、未同定のものも含むたばこ乾燥葉試料中の各配糖体を精度良く分析することが可能であり、さらに各配糖体由来のピークと内部標準物質のｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシドのピーク（ｍ／ｚ３７１のプリカーサーイオンおよびｍ／ｚ３７１のプロダクトイオンのトランジション）とのピーク面積比を算出し、分析試料３について算出された値と比較することにより、乾燥葉たばこ試料１および２の間で各配糖体を相対的に定量することが可能であった。乾燥葉たばこ試料１および２で得られた各配糖体由来のピークの面積値および内部標準物質のピークとの面積比を、表２および表３にそれぞれ示す。 FIG. 5 shows a chromatogram of the obtained results for the sample 2 for analysis. By using SRM, it is possible to accurately analyze each glycoside in a dry tobacco leaf sample including unidentified ones. Furthermore, a peak derived from each glycoside and an internal standard n-dodecyl- By calculating the peak area ratio with the peak of β-D-glucopyranoside (the transition of the precursor ion of m / z 371 and the product ion of m / z 371) and comparing it with the value calculated for analytical sample 3, a dry leaf tobacco sample It was possible to relatively quantify each glycoside between 1 and 2. Tables 2 and 3 show the area values of the peaks derived from the glycosides obtained in the dry leaf tobacco samples 1 and 2 and the area ratios with the peaks of the internal standard substance, respectively.
これらの結果より、乾燥葉たばこ試料１および２に含有される各配糖体の量の比較および配糖体組成の比較が可能であった。 From these results, it was possible to compare the amount of each glycoside contained in the dry leaf tobacco samples 1 and 2 and to compare the glycoside composition.
本発明により、夾雑成分が多い生物試料や未同定の配糖体を含有する生物試料であっても、簡便に含有される配糖体を一斉に分析することが可能なスクリーニング方法および定量方法を提供することができる。また、生物試料につき分析用試料の準備を一度行うだけで、含有される配糖体のスクリーニングと定量の両方を行うことが可能な方法を提供することができる。
According to the present invention, there is provided a screening method and a quantification method capable of easily analyzing a glycoside contained easily even in a biological sample containing many contaminating components or a biological sample containing an unidentified glycoside. Can be provided. In addition, it is possible to provide a method capable of performing both screening and quantification of contained glycosides only by once preparing a sample for analysis per biological sample.
Claims (20)
（１）（１−ｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料１を準備すること、および
（１−ｉｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、酵素で処理しない分析用試料２を準備すること、
（２）分析用試料１および２を液体クロマトグラフタンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）またはキャピラリー電気泳動タンデム質量分析計（ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ）により分析すること、ならびに
（３）分析結果において、分析用試料２と比較して分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定すること、
の工程を含む、前記方法。 A method for screening glycosides contained in a biological sample,
(1) (1-i) Analytical sample 1 treated with an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond is prepared from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample. And (1-ii) preparing an analytical sample 2 that is not treated with an enzyme from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample,
(2) Analyzing samples 1 and 2 for analysis with a liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) or a capillary electrophoresis tandem mass spectrometer (CE-MS / MS), and (3) Analysis results , Determining that the peak in which the disappearance or intensity (height or area) is decreased in the analytical sample 1 compared to the analytical sample 2 is derived from a glycoside,
The method comprising the steps of:
（１）（１−ｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、配糖体の糖構造を認識してグリコシド結合を加水分解する酵素で処理した分析用試料１を準備すること、および
（１−ｉｉ）生物試料より調製された配糖体を含む調製物から、酵素で処理しない分析用試料２を準備すること、
（２）分析用試料２のみ、または分析用試料１および２の両方に内部標準物質を添加すること、
（３）分析用試料１および２をＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＣＥ−ＭＳ／ＭＳにより分析すること、
（４）分析結果において、分析用試料２と比較して分析用試料１で消失または強度（高さまたは面積）が減少しているピークを配糖体由来であると決定すること、ならびに
（５）分析用試料２の分析結果において、配糖体に由来すると決定されたピークと内部標準物質ピークの強度（高さまたは面積）比を算出すること、
の工程を含む、前記方法。 A method for quantifying glycosides contained in a biological sample,
(1) (1-i) Analytical sample 1 treated with an enzyme that recognizes the sugar structure of a glycoside and hydrolyzes a glycosidic bond is prepared from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample. And (1-ii) preparing an analytical sample 2 that is not treated with an enzyme from a preparation containing a glycoside prepared from a biological sample,
(2) adding an internal standard substance only to analytical sample 2 or both analytical samples 1 and 2;
(3) Analyzing analytical samples 1 and 2 by LC-MS / MS or CE-MS / MS,
(4) In the analysis result, it is determined that a peak whose disappearance or intensity (height or area) is decreased in the analytical sample 1 as compared with the analytical sample 2 is derived from the glycoside, and (5) ) Calculating the intensity (height or area) ratio between the peak determined to be derived from the glycoside and the internal standard substance peak in the analysis result of the analytical sample 2;
The method comprising the steps of:
The m / z values of glycoside-derived precursor ion / product ion transition monitored in SRM are 481/319, 471/309, 455/293, 453/291, 427/265, 359/197, 355 / 193, 351/189, 341/179, 325/163, 321/159, 319/157, 495/333, 465/303, 415/253, 373/211, 371/209, 493/331, 449/287, 411/249, 399/237, 397/235, 385/223, and 381/219 (including a range of 0.2u before and after centering each m / z value), Item 20. The method according to Item 19.
Priority Applications (2)
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