JP2019202957A - Immune composition - Google Patents
Immune composition Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019202957A JP2019202957A JP2018099129A JP2018099129A JP2019202957A JP 2019202957 A JP2019202957 A JP 2019202957A JP 2018099129 A JP2018099129 A JP 2018099129A JP 2018099129 A JP2018099129 A JP 2018099129A JP 2019202957 A JP2019202957 A JP 2019202957A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- surfactant
- ova
- fitc
- fatty acid
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
本発明は、免疫組成物に関する。 The present invention relates to immune compositions.
医薬品分野において、癌や自己免疫疾患等の難病治療薬におけるバイオ医薬品の位置づけは一層高まっており、現在主流である抗体医薬に続く次世代バイオ医薬品として、ワクチンが注目されている。ワクチンとは、病原体を弱毒化又は不活化した抗原からなる製剤で、体内の抗原特異的な免疫を誘導及び活性化する医薬品である。他の方法と比較して、効果が長期間持続し、また副作用の報告が少ないことが特徴である。ワクチンは最も有効かつ経済的な『予防』策であると認識されているが、近年では癌ワクチンをはじめ『治療』を目的としたワクチンの開発も行われており、ライフサイエンスにおける重要な研究領域である。 In the pharmaceutical field, the position of biopharmaceuticals in the treatment of intractable diseases such as cancer and autoimmune diseases is further increased, and vaccines are attracting attention as next-generation biopharmaceuticals following the current mainstream antibody drugs. A vaccine is a pharmaceutical product composed of an antigen in which a pathogen is attenuated or inactivated, and is a pharmaceutical product that induces and activates antigen-specific immunity in the body. Compared with other methods, the effect is long-lasting and there are few reports of side effects. Vaccines are recognized as the most effective and economical “prevention” measures, but in recent years, vaccines aimed at “treatment” including cancer vaccines are also being developed, which is an important research area in life sciences. It is.
多くの場合、ワクチンには、抗原の他に、アジュバントと呼ばれる免疫を活性化する効果をもった添加剤が含まれている。２０世紀後半にかけての分子生物学の発展により、アジュバント成分を特異的に認識するトール様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）等の受容体が、ワクチンに必須な抗原提示細胞の活性を厳密に制御しており、その後の獲得免疫反応に深く関係することが判明した。具体例として、エンドトキシン由来のリポ多糖であるｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ（ＭＰＬ）や細菌の持つＤＮＡの非メチル化シトシン−グアニン配列であるオリゴ核酸（ＣｐＧ）等、分子レベルでもアジュバント機能を持ったものが多く報告されている（例えば、非特許文献１等参照）。 In many cases, vaccines contain an additive called an adjuvant having an effect of activating immunity, in addition to an antigen. With the development of molecular biology in the latter half of the 20th century, receptors such as toll-like receptors (TLRs) that specifically recognize adjuvant components, strictly regulate the activity of antigen-presenting cells essential for vaccines. It was found to be controlled and deeply related to the subsequent acquired immune response. As specific examples, there are many reports that have an adjuvant function at the molecular level such as monophosphoryl lipid (MPL) which is lipopolysaccharide derived from endotoxin and oligonucleic acid (CpG) which is an unmethylated cytosine-guanine sequence of bacterial DNA. (See, for example, Non-Patent Document 1).
エマルションアジュバントは、臨床でも用いられている実用的なアジュバントの１つである。既往のＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）型エマルションアジュバントであるフロイント不完全アジュバントは、用いられているシリコンオイルの皮膚滞留性により免疫が不活性化するという欠点を持つため、実用化が困難であった。また、ＭＦ５９（平均粒子径：約１６０ｎｍ）等のＯｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ（Ｏ／Ｗ）型エマルションアジュバントは、現在インフルエンザワクチンとして日本国内でも利用されている。 An emulsion adjuvant is one of the practical adjuvants used also in the clinic. Freund's incomplete adjuvant, which is an existing water-in-oil (W / O) type emulsion adjuvant, has the disadvantage that immunity is inactivated due to the skin retention of the silicone oil used, making it difficult to put it to practical use. Met. Oil-in-water (O / W) type emulsion adjuvants such as MF59 (average particle size: about 160 nm) are currently used in Japan as influenza vaccines.
一方、発明者らは、これまで、Ｗ／Ｏ型エマルションから内水相を除去したＳｏｌｉｄ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｓ／Ｏ）型の経皮免疫剤（例えば、特許文献１等参照）や、このＳ／Ｏ型製剤を水相に分散させたＳｏｌｉｄ−ｉｎ−Ｏｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型の薬物輸送キャリアを開発してきた（例えば、特許文献２等参照）。 On the other hand, the inventors have so far made a solid-in-oil (S / O) type transdermal immunizing agent from which the inner aqueous phase has been removed from the W / O type emulsion (see, for example, Patent Document 1), A solid-in-oil-in-water (S / O / W) type drug transport carrier in which an S / O type formulation is dispersed in an aqueous phase has been developed (see, for example, Patent Document 2).
従来のＯｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ（Ｏ／Ｗ）型エマルションアジュバントでは、親水性である抗原は外水相に存在し、キャリアに封入されていないため、抗原とアジュバントとが別々に投与されていた。そのため、免疫賦活作用が十分に生かされておらず、その効果は限定的であった。 In a conventional Oil-in-Water (O / W) type emulsion adjuvant, since the antigen that is hydrophilic exists in the outer aqueous phase and is not encapsulated in the carrier, the antigen and the adjuvant are administered separately. Therefore, the immunostimulatory action is not fully utilized, and the effect is limited.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れた免疫組成物を提供する。 This invention is made | formed in view of the said situation, Comprising: An antigen and an adjuvant can be simultaneously delivered to an immune cell, and the immune composition excellent in the immunostimulation effect | action is provided.
発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と疎水性アジュバントとを油相に溶解又は分散させ、さらに該油相を第２の界面活性剤によって被覆させて、水相に分散させたＳ／Ｏ／Ｗ型の免疫組成物が、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、優れた免疫賦活作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the inventors have made a solid hydrophilic antigen-first surfactant complex coated with a first surfactant and a hydrophobic substance. An S / O / W type immune composition in which an adjuvant is dissolved or dispersed in an oil phase, the oil phase is further coated with a second surfactant and dispersed in an aqueous phase, the antigen and the adjuvant are separated from each other. At the same time, it was found that it can be delivered to immune cells and has an excellent immunostimulatory action, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る免疫組成物は、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と、疎水性アジュバントと、油相と、第２の界面活性剤と、水相と、を含み、前記親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び前記疎水性アジュバントが前記油相に溶解又は分散しており、前記油相が前記第２の界面活性剤によって被覆されて水相に分散している。
前記疎水性アジュバントが自然免疫受容体に対するリガンドであってもよい。
前記疎水性アジュバントがトール様受容体に対するリガンドであってもよい。
前記第１の界面活性剤がショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール及び卵ホスファチジルコリンからなる群より選択される１種以上であってもよい。
前記第２の界面活性剤がホスファチジルコリン、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル及びジアンヒドロ−Ｄ−マンニトール（Ｚ）−９−オクタデセノアートからなる群より選択される１種以上であってもよい。
上記第１態様に係る免疫組成物は、第３の界面活性剤を更に含み、前記第３の界面活性剤が前記油相に溶解又は分散していてもよい。
前記第３の界面活性剤がソルビタン脂肪酸エステル又はＤＬ−α−トコフェロールであってもよい。
前記油相が植物油、動物油、中性脂質、長鎖脂肪酸エステル及び炭化水素類からなる群より選択される１種以上であってもよい。
前記第２の界面活性剤によって被覆された前記油相の平均粒子径が３５０ｎｍ以下であってもよい。
That is, the present invention includes the following aspects.
The immune composition according to the first aspect of the present invention includes a solid hydrophilic antigen-first surfactant complex in which a hydrophilic antigen is coated with a first surfactant, a hydrophobic adjuvant, an oil A phase, a second surfactant, and an aqueous phase, wherein the hydrophilic antigen-first surfactant complex and the hydrophobic adjuvant are dissolved or dispersed in the oil phase, and the oil The phase is coated with the second surfactant and dispersed in the aqueous phase.
The hydrophobic adjuvant may be a ligand for an innate immune receptor.
The hydrophobic adjuvant may be a ligand for a toll-like receptor.
The first surfactant may be one or more selected from the group consisting of sucrose fatty acid ester, cholesterol, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, DL-α-tocopherol and egg phosphatidylcholine.
The second surfactant is phosphatidylcholine, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol monostearate, polyethylene glycol distearoyl phosphatidylethanolamine, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium dodecyl sulfate, glycerin fatty acid ester and dianhydro-D-mannitol ( Z) It may be one or more selected from the group consisting of -9-octadecenoate.
The immune composition according to the first aspect may further include a third surfactant, and the third surfactant may be dissolved or dispersed in the oil phase.
The third surfactant may be sorbitan fatty acid ester or DL-α-tocopherol.
The oil phase may be one or more selected from the group consisting of vegetable oils, animal oils, neutral lipids, long chain fatty acid esters, and hydrocarbons.
An average particle diameter of the oil phase coated with the second surfactant may be 350 nm or less.
上記態様の免疫組成物によれば、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れる。 According to the immune composition of the above aspect, the antigen and the adjuvant can be simultaneously delivered to immune cells, and the immunostimulatory action is excellent.
≪免疫組成物≫
本実施形態の免疫組成物は、親水性抗原が第１の界面活性剤によって被覆された固体状の親水性抗原−第１の界面活性剤複合体と、疎水性アジュバントと、油相と、第２の界面活性剤と、水相と、を含む。
図１Ａ及び図１Ｂは、本実施形態の免疫組成物の一例を示す概略構成図である。なお、図１Ｂは、図１Ａの拡大図であり、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０の内部構造を模式的に表した図である。図１Ａ及び図１Ｂを参照しながら、本実施形態の免疫組成物の構造について、以下に詳細を説明する。
図１Ａ及び図１Ｂに示す免疫組成物１００は、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０と、水相２１とを含む。第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、油相１１が第２の界面活性剤１３によって被覆されたものであり、水相２１中に分散している。具体的には、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、油相１１と水相２１との界面に第２の界面活性剤１３が会合し、油相１１を被覆するという構成を有している。
また、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、油相１１の他に、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０及び疎水性アジュバント１２を含み、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０及び疎水性アジュバント１２が油相１１に溶解又は分散している。
また、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０は、図１Ｂに示すように、第３の界面活性剤１４を更に含んでもよい。第３の界面活性剤１４は、油相１１に溶解又は分散している。
また、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０は、親水性抗原１と第１の界面活性剤２を主な構成成分として含んでいる。また、親水性抗原１に第１の界面活性剤２の親水性部分が会合し、親水性抗原１の周りを被覆するという構成を有している。
親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０は、粒子が大きくなり過ぎるのを防ぐために、親水性抗原１及び第１の界面活性剤２のみからなるものであってもよく、医薬用製剤において許容される製剤成分（例えば、添加成分等）を含んでもよい。
≪Immune composition≫
The immune composition of the present embodiment comprises a solid hydrophilic antigen-first surfactant complex in which a hydrophilic antigen is coated with a first surfactant, a hydrophobic adjuvant, an oil phase, 2 surfactants and an aqueous phase.
1A and 1B are schematic configuration diagrams showing an example of the immune composition of the present embodiment. FIG. 1B is an enlarged view of FIG. 1A and schematically shows the internal structure of the
The
The
The
Further, the hydrophilic antigen-
The hydrophilic antigen-
免疫組成物１００において、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０の形状は、球状又は略球状である。また、第２の界面活性剤によって被覆された油相２０の平均粒子径の上限値は、ナノサイズであればよく、免疫細胞へ効率的に送達する観点から、３５０ｎｍであることが好ましく、３００ｎｍであることがより好ましく、２００ｎｍであることがさらに好ましい。
一方、平均粒子径の下限値は、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１０及び疎水性アジュバント１２を封入可能な大きさであればよく、例えば１０ｎｍとすることができる。
In the
On the other hand, the lower limit value of the average particle diameter is not particularly limited as long as the hydrophilic antigen-
本実施形態の免疫組成物は、上記構成を有することで、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れる。
次いで、本実施形態の免疫組成物の各構成成分について、以下に詳細を説明する。
Since the immune composition of the present embodiment has the above-described configuration, the antigen and the adjuvant can be simultaneously delivered to immune cells, and the immunostimulatory effect is excellent.
Next, details of each component of the immune composition of the present embodiment will be described below.
＜構成成分＞
［親水性抗原］
親水性抗原としては、水相に溶解又は分散可能であって、免疫応答を惹起する物質であり、且つ、免疫原性を誘導するものであれば特に限定されず、従来の免疫等に用いられる抗原やワクチン、免疫原性物質、ガン抗原等が用いられる。具体的には、例えば、生理活性物質等のタンパク質やペプチド（例えば、鶏卵白由来リゾチーム、スギ花粉症の抗原領域ペプチド等）、タンパク質やペプチドを結合したハプテン化物質、生又は不活性化（死滅）された細菌やウイルス（全部）又はこれらの部分分解物、不活性化（死滅）させた癌細胞（全部）又はその部分分解物、核酸等が挙げられる。また、抗原性に欠けるもの（例えば、糖質や脂質、無機物等）にハプテン化等の手段によって抗原性を付与させたものも親水性抗原として用いられる。親水性抗原は、動物由来又は植物由来のいずれものであってもよい。例えば、親水性抗原は、家禽及び家畜用抗原又は愛玩動物用抗原であってもよく、牛用抗原、鶏用抗原又は豚用抗原であってもよく、ダニ等の節足動物や昆虫由来であってもよい。また、親水性抗原は、食物由来のものであってもよい。
また、これら親水性抗原は、単一の分子であってもよく、又は、疎水性抗原等を封入したナノゲル（コレステロール修飾プルラン）等の親水性水溶性ナノキャリアであってもよい。また、これら親水性抗原に、後述するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等の水にも可溶な親水性アジュバントを混合して用いてもよい。
<Constituents>
[Hydrophilic antigen]
The hydrophilic antigen is not particularly limited as long as it is a substance that can be dissolved or dispersed in an aqueous phase, induces an immune response, and induces immunogenicity, and is used for conventional immunization and the like. Antigens, vaccines, immunogenic substances, cancer antigens and the like are used. Specifically, for example, proteins and peptides such as physiologically active substances (eg, hen egg white-derived lysozyme, cedar pollinosis antigen domain peptides, etc.), haptenized substances bound with proteins and peptides, live or inactivated (dead) ) Bacteria or viruses (all) or partial degradation products thereof, inactivated (dead) cancer cells (all) or partial degradation products thereof, nucleic acids, and the like. In addition, those lacking antigenicity (for example, saccharides, lipids, inorganic substances, etc.) provided with antigenicity by means such as haptenization are also used as hydrophilic antigens. The hydrophilic antigen may be derived from animals or plants. For example, the hydrophilic antigen may be an antigen for poultry and livestock or a pet animal, may be an antigen for cattle, an antigen for chickens or an antigen for pigs, and may be derived from arthropods such as ticks and insects. There may be. The hydrophilic antigen may be derived from food.
These hydrophilic antigens may be a single molecule or a hydrophilic water-soluble nanocarrier such as a nanogel (cholesterol-modified pullulan) encapsulating a hydrophobic antigen or the like. Further, these hydrophilic antigens may be used by mixing a hydrophilic adjuvant that is soluble in water such as CpG oligodeoxynucleotide described later.
本実施形態の免疫組成物中の親水性抗原の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．０１質量％以上０．１質量%以下とすることができ、例えば０．０２質量%以上０．０５質量％以下とすることができる。 The content of the hydrophilic antigen in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 0.01% by mass to 0.1% by mass with respect to the total mass of the immune composition, for example, 0.02 It can be set to mass% or more and 0.05 mass% or less.
［界面活性剤］
界面活性剤は、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限なく用いることができる。界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、胆汁酸塩等が挙げられる。
これらの中でも、上記第１の界面活性剤、上記第２の界面活性剤及び上記第３の界面活性剤としてそれぞれ好適に用いられるものについて、以下に詳細を説明する。
[Surfactant]
The surfactant can be used without particular limitation as long as it is acceptable in pharmaceutical preparations. Examples of the surfactant include a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and a bile salt.
Among these, what is suitably used as the first surfactant, the second surfactant, and the third surfactant will be described in detail below.
（第１の界面活性剤）
第１の界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｙｏｌｋ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＥＰＣ）等が挙げられる。
ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えば、ショ糖ラウリン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１２）、ショ糖ミリスチン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１４）、ショ糖パルミチン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１６）、ショ糖ステアリン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１８）、ショ糖オレイン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：１８、二重結合の数：１）、ショ糖ベヘニン酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：２２）、ショ糖エルカ酸エステル（構成脂肪酸の炭素数：２２、二重結合の数：１）、ショ糖混合脂肪酸エステル等が挙げられる。
グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノベヘン酸グリセリン、モノラウリン酸グリセリン等が挙げられる。
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、モノオレイン酸ソルビタン（スパン８０）、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５）、トリステアリン酸ソルビタン（スパン６５）、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン（スパン２０）等が挙げられる。
これら界面活性剤を１種単独でも用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
(First surfactant)
Examples of the first surfactant include sucrose fatty acid ester, cholesterol, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, DL-α-tocopherol, egg phosphatidyl choline (egg yolk phosphatidylcholine; EPC) and the like.
Examples of the sucrose fatty acid ester include sucrose laurate (carbon number of constituent fatty acid: 12), sucrose myristic acid ester (carbon number of constituent fatty acid: 14), sucrose palmitate (carbon number of constituent fatty acid). 16), sucrose stearate (carbon number of constituent fatty acid: 18), sucrose oleate (carbon number of constituent fatty acid: 18, number of double bonds: 1), sucrose behenate ester (constituent fatty acid) Sucrose erucic acid ester (carbon number of constituent fatty acid: 22, number of double bonds: 1), sucrose mixed fatty acid ester, and the like.
Examples of the glycerin fatty acid ester include glyceryl monostearate, glyceryl monobehenate, and glyceryl monolaurate.
Examples of the sorbitan fatty acid ester include sorbitan monooleate (span 80), sorbitan trioleate (span 85), sorbitan tristearate (span 65), sorbitan sesquioleate, sorbitan monolaurate (span 20), and the like. It is done.
These surfactants may be used alone or in combination of two or more.
中でも、第１の界面活性剤としては、親水性抗原を被覆して、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を形成させて、この親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を油相に溶解又は分散するために、疎水性（親油性）の高いものを用いることが好ましい。
なお、本明細書において、親水性（疎油性）及び疎水性（親油性）の指標としては、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）値を用いることができる。一般に、「ＨＬＢ値」とは、界面活性剤の水及び油(水に不溶性の有機化合物)への親和性の程度を表す値である。ＨＬＢ値は０から２０までの値を取り、０に近いほど親油性が高くなり、２０に近いほど親水性が高くなる。第１の界面活性剤におけるＨＬＢ値の上限値は１０が好ましく、８がより好ましい。一方、第１の界面活性剤におけるＨＬＢ値の下限値は、特別な限定はなく、例えば１である。第１の界面活性剤において、当該界面活性剤を構成する炭化水素基の炭素数を増加させること、又は、エステル化度等の親水性官能基の数を減少させること等により疎水性を高めることができ、ＨＬＢ値を低くすることができる。
Among them, as the first surfactant, a hydrophilic antigen is coated to form a hydrophilic antigen-first surfactant complex, and this hydrophilic antigen-first surfactant complex is used as the first surfactant. In order to dissolve or disperse in the oil phase, it is preferable to use one having high hydrophobicity (lipophilicity).
In the present specification, HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance) values can be used as indicators of hydrophilicity (oleophobicity) and hydrophobicity (lipophilicity). In general, the “HLB value” is a value representing the degree of affinity of a surfactant for water and oil (an organic compound insoluble in water). The HLB value takes a value from 0 to 20, and the closer to 0, the higher the lipophilicity, and the closer to 20, the higher the hydrophilicity. The upper limit value of the HLB value in the first surfactant is preferably 10, and more preferably 8. On the other hand, the lower limit value of the HLB value in the first surfactant is not particularly limited, and is 1, for example. In the first surfactant, the hydrophobicity is increased by increasing the number of carbon atoms of the hydrocarbon group constituting the surfactant or by decreasing the number of hydrophilic functional groups such as the degree of esterification. And the HLB value can be lowered.
上記特性を有する界面活性剤として具体的には、例えば、三菱ケミカルフーズ社製のショ糖エルカ酸エステルであるリョートーシュガーエステルＥＲ−１９０（ＨＬＢ値:１、脂肪酸純度：９０％）、同ＥＲ−２９０（ＨＬＢ値:２、脂肪酸純度：９０％）、ショ糖オレイン酸エステルであるリョートーシュガーエステルＯ−１７０（ＨＬＢ値:１、脂肪酸純度：７０％）、ショ糖混合脂肪酸エステルであるリョートーシュガーエステルＰＯＳ−１３５（ＨＬＢ値:１、パルミチン酸、オレイン酸及びステアリン酸の混合脂肪酸、脂肪酸純度：３５％）、ソルビタン脂肪酸エステルであるスパン８５（ＨＬＢ値：１．８）、コレステロール（ＨＬＢ値:４）、ＥＰＣ（ＨＬＢ値:７）等が挙げられ、中でも、細胞毒性が低いことから、コレステロール又はＥＰＣが好ましい。 Specific examples of the surfactant having the above-mentioned properties include, for example, Ryoto Sugar Ester ER-190 (HLB value: 1, fatty acid purity: 90%), which is a sucrose erucic acid ester manufactured by Mitsubishi Chemical Foods, Ltd. -290 (HLB value: 2, fatty acid purity: 90%), Ryoto sugar ester O-170 which is sucrose oleate (HLB value: 1, fatty acid purity: 70%), Ryo which is sucrose mixed fatty acid ester Toe sugar ester POS-135 (HLB value: 1, mixed fatty acid of palmitic acid, oleic acid and stearic acid, fatty acid purity: 35%), sorbitan fatty acid ester span 85 (HLB value: 1.8), cholesterol (HLB) Value: 4), EPC (HLB value: 7), etc. Among them, cholesterol is low because of its low cytotoxicity. The EPC is preferred.
本実施形態の免疫組成物中の第１の界面活性剤の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．１質量％以上１質量%以下とすることができ、例えば０．３質量%以上０．７質量％以下とすることができる。 The content of the first surfactant in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 0.1% by mass or more and 1% by mass or less with respect to the total mass of the immune composition. It can be 3 mass% or more and 0.7 mass% or less.
（第２の界面活性剤）
第２の界面活性剤としては、ホスファチジルコリン、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル、ジアンヒドロ−Ｄ−マンニトール（Ｚ）−９−オクタデセノアート等が挙げられ、これらに限定されない。
ホスファチジルコリンとしては、例えば、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）等が挙げられる。
モノステアリン酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としては、ポリエチレングリコールの分子量が異なるものが存在し、例えば、モノステアリン酸ＰＥＧ−２、モノステアリン酸ＰＥＧ−１０、モノステアリン酸ＰＥＧ−１５、モノステアリン酸ＰＥＧ−２０、モノステアリン酸ＰＥＧ−４０、モノステアリン酸ＰＥＧ−５０、モノステアリン酸ＰＥＧ−１００、モノステアリン酸ＰＥＧ−１５０、モノステアリン酸ＰＥＧ−１０００、モノステアリン酸ＰＥＧ−２０００等が挙げられる。なお、ＰＥＧの後ろの数値は、分子量を示している。
ポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）としては、ポリエチレングリコールの分子量が異なるものが存在し、例えば、ＰＥＧ−１０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−３０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−５０００−ＤＳＰＥ等が挙げられる。なお、ＰＥＧの後ろの数値は、分子量を示している。また、ＰＥＧ−ＤＳＰＥとしては、ポリエチレングリコール鎖に加えて、酸無水物基を有するものを用いてもよく、当該官能基を有するものとしては、例えば、日油社製のＰＥＧ−ｃｏｍｂ−ｓｈａｐｅｄ−ＤＳＰＥであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＤＳＰＥ−ＡＭ０５３０Ｋ等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））等が挙げられる。
ショ糖脂肪酸エステル及びグリセリン脂肪酸エステルとしては、上記「第１の界面活性剤」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、これら界面活性剤を１種単独で含んでもよく、２種以上組み合わせて含んでもよい。
(Second surfactant)
As the second surfactant, phosphatidylcholine, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol monostearate, polyethylene glycol distearoyl phosphatidylethanolamine, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium dodecyl sulfate, glycerin fatty acid ester, dianhydro-D-mannitol (Z) -9-octadecenoate etc. are mentioned, However, it is not limited to these.
Examples of the phosphatidylcholine include egg phosphatidylcholine (EPC), soybean phosphatidylcholine (SPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), hydrogen Soybean phosphatidylcholine (HSPC), palmitoyl stearoyl phosphatidylcholine (PSPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (POPC) and the like.
As polyethylene glycol monostearate (PEG), those having different molecular weights of polyethylene glycol exist, such as PEG-2 monostearate, PEG-10 monostearate, PEG-15 monostearate, PEG-
Polyethylene glycol distearoyl phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) includes those having different molecular weights of polyethylene glycol, such as PEG-1000-DSPE, PEG-2000-DSPE, PEG-3000-DSPE, PEG-5000- DSPE etc. are mentioned. In addition, the numerical value after PEG has shown molecular weight. Moreover, as PEG-DSPE, in addition to a polyethylene glycol chain, you may use what has an acid anhydride group, and as what has the said functional group, for example, PEG-comb-shaped- Examples thereof include SUNBRIGHT (registered trademark) DSPE-AM0530K which is DSPE.
Examples of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20 (registered trademark)), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80 (registered trademark)), and the like.
Examples of the sucrose fatty acid ester and glycerin fatty acid ester include those similar to those exemplified in the above “first surfactant”.
Moreover, these surfactants may be included singly or in combination of two or more.
中でも、第２の界面活性剤としては、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び疎水性アジュバントが溶解又は分散している油相を被覆して、第２の界面活性剤によって被覆された油相を形成させて、この第２の界面活性剤によって被覆された油相を水相に分散するために、親水性の高いものを用いることが好ましい。第２の界面活性剤におけるＨＬＢ値の下限値は１１が好ましく、１２がより好ましく、１３がさらに好ましい。一方、第２の界面活性剤におけるＨＬＢ値の上限値は、特別な限定はなく、例えば２０である。第２の界面活性剤において、当該界面活性剤を構成する炭化水素基の炭素数を減少させること、又は、エステル化度等の親水性官能基の数を増加させること等により親水性を高めることができ、ＨＬＢ値を高くすることができる。 Among these, as the second surfactant, the oily phase in which the hydrophilic antigen-first surfactant complex and the hydrophobic adjuvant are dissolved or dispersed is coated and coated with the second surfactant. In order to form an oil phase and disperse the oil phase coated with the second surfactant in the aqueous phase, it is preferable to use a highly hydrophilic material. The lower limit of the HLB value in the second surfactant is preferably 11, more preferably 12, and even more preferably 13. On the other hand, the upper limit value of the HLB value in the second surfactant is not particularly limited, and is 20, for example. In the second surfactant, the hydrophilicity is increased by reducing the number of carbon atoms of the hydrocarbon group constituting the surfactant or by increasing the number of hydrophilic functional groups such as the degree of esterification. And the HLB value can be increased.
上記特性を有する界面活性剤として具体的には、例えば、三菱ケミカルフーズ社製のショ糖ラウリン酸エステルであるリョートーシュガーエステルＬ−１６９５（ＨＬＢ値:１６、脂肪酸純度：９５％）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標））（ＨＬＢ値：１５）等が挙げられ、中でも、ヒトでの安全性が担保されていることから、Ｔｗｅｅｎ ８０が好ましい。
Specific examples of the surfactant having the above-described properties include, for example, Ryoto Sugar Ester L-1695 (HLB value: 16, fatty acid purity: 95%), which is a sucrose laurate produced by Mitsubishi Chemical Foods, polyoxy Examples include ethylene sorbitan monooleate (Tween 80 (registered trademark)) (HLB value: 15). Among them,
本実施形態の免疫組成物中の第２の界面活性剤の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．１質量％以上１質量％以下とすることができ、例えば０．３質量％以上０．７質量％以下とすることができる。 The content of the second surfactant in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 0.1% by mass or more and 1% by mass or less with respect to the total mass of the immune composition. It can be 3 mass% or more and 0.7 mass% or less.
（第３の界面活性剤）
また、本実施形態の免疫組成物は、図１Ｂに示すように、第３の界面活性剤を更に含んでもよい。第３の界面活性剤としては、油相に溶解又は分散可能なものであればよく、ＨＬＢ値が１０以下のものが好ましい。上記特性を有する界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロール等が挙げられる。
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、上記「第１の界面活性剤」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、これら界面活性剤を１種単独で含んでもよく、２種以上組み合わせて含んでもよい。中でも、第３の界面活性剤としては、トリオレイン酸ソルビタン（スパン８５）が好ましい。
(Third surfactant)
Moreover, as shown to FIG. 1B, the immune composition of this embodiment may further contain the 3rd surfactant. The third surfactant may be any one that can be dissolved or dispersed in the oil phase, and preferably has an HLB value of 10 or less. As surfactant which has the said characteristic, sorbitan fatty acid ester, DL- (alpha) -tocopherol etc. are mentioned, for example.
Examples of the sorbitan fatty acid ester include those exemplified in the above “first surfactant”.
Moreover, these surfactants may be included singly or in combination of two or more. Among these, sorbitan trioleate (span 85) is preferable as the third surfactant.
本実施形態の免疫組成物中の第３の界面活性剤の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．１質量％以上１質量％以下とすることができ、例えば０．３質量％以上０．７質量％以下とすることができる。 The content of the third surfactant in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 0.1% by mass or more and 1% by mass or less with respect to the total mass of the immune composition. It can be 3 mass% or more and 0.7 mass% or less.
［疎水性アジュバント］
疎水性アジュバントとしては、ワクチンに通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、自然免疫受容体に対するリガンド等が挙げられる。ここでいう「リガンド」とは、受容体に特異的に結合するものを意味し、特に、受容体に特異的に結合して、種々の生理作用を示す物質を用いることができる。このような物質を「アゴニスト」ともいう。
自然免疫受容体としては、例えば、トール様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＯＤ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＬＲ）等が挙げられる。
中でも、ＴＬＲに対するリガンド（以下、「ＴＬＲリガンド」と称する場合がある）又はＣＬＲに対するリガンド（以下、「ＣＬＲリガンド」と称する場合がある）が好ましく、抗原提示細胞の活性化に大きく寄与することが知られていることから、抗原提示細胞の細胞膜上に存在しているＴＬＲに対するリガンドがより好ましい。
[Hydrophobic adjuvant]
The hydrophobic adjuvant is not particularly limited as long as it is usually used in vaccines, and examples thereof include ligands for innate immune receptors. The term “ligand” as used herein means a substance that specifically binds to a receptor, and in particular, a substance that specifically binds to a receptor and exhibits various physiological actions can be used. Such a substance is also referred to as an “agonist”.
Examples of innate immune receptors include toll-like receptor (TLR), RIG-I-like receptor (RIG-I-like receptor; RLR), NOD-like receptor (NOD-like receptor; NLR). ) And C-type lectin receptor (CLR).
Among them, a ligand for TLR (hereinafter sometimes referred to as “TLR ligand”) or a ligand for CLR (hereinafter sometimes referred to as “CLR ligand”) is preferable, which greatly contributes to activation of antigen-presenting cells. Since it is known, a ligand for TLR existing on the cell membrane of the antigen-presenting cell is more preferable.
（ＴＬＲリガンド）
ＴＬＲリガンドとしては、例えば、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８及びＴＬＲ−９からなる群より選択される少なくとも１種のＴＬＲと相互作用するものを適宜選択すればよい。
ＴＬＲ−２リガンドとしては、例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４等が挙げられる。
ＴＬＲ−３リガンドとしては、例えば、ポリＩＣＬＣ、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）等が挙げられる。
ＴＬＲ−４リガンドとしては、例えば、Ｒ型リポ多糖、Ｓ型リポ多糖、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ等が挙げられる。
ＴＬＲ−５リガンドとしては、例えば、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）等が挙げられる。
ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−６リガンドとしては、例えば、ＭＡＬＰ−２等が挙げられる。
ＴＬＲ−７及びＴＬＲ−８リガンドとしては、例えば、レシキモド（Ｒ８４８）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、Ｒ８３７）、ガルジキモド（ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）等が挙げられる。
ＴＬＲ−９リガンドとしては、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等が挙げられる。
中でも、ヒト及びマウスにおける安全性及び免疫を活性化する効果が確認されていることから、疎水性アジュバントとしては、レシキモド（Ｒ８４８）が好ましい。
(TLR ligand)
Examples of the TLR ligand include at least one TLR selected from the group consisting of TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, and TLR-9. It is only necessary to appropriately select one that interacts with.
Examples of the TLR-2 ligand include Pam3CSK4.
Examples of the TLR-3 ligand include poly ICLC, polyinosine: polycytidylic acid (poly I: C), and the like.
Examples of the TLR-4 ligand include R-type lipopolysaccharide, S-type lipopolysaccharide, paclitaxel, lipid A, monophosphoryl lipid A, and the like.
Examples of TLR-5 ligand include flagellin.
Examples of TLR-2 and TLR-6 ligands include MALP-2.
Examples of TLR-7 and TLR-8 ligands include resiquimod (R848), imiquimod (R837), gardiquimod, and loxoribine.
Examples of the TLR-9 ligand include CpG oligodeoxynucleotide.
Among them, resiquimod (R848) is preferable as the hydrophobic adjuvant because safety and immunity activation effects in humans and mice have been confirmed.
（ＣＬＲリガンド）
ＣＬＲリガンドとしては、例えば、マクロファージ誘導性Ｃ型レクチン（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ；Ｍｉｎｃｌｅ）受容体、マクロファージＣ型レクチン（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ；ＭＣＬ）受容体、樹状細胞関連Ｃ型レクチン−２（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ−２；Ｄｅｃｔｉｎ−２）受容体及び樹状細胞免疫活性化受容体（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＣＡＲ）からなる群より選択される少なくとも１種のＣＬＲと相互作用するものを適宜選択すればよい。
Ｍｉｎｃｌｅ受容体リガンド及びＭＣＬ受容体リガンドとしては、例えば、トレハロースジミコール酸等が挙げられる。
Ｄｅｃｔｉｎ−２受容体リガンドとしては、例えば、リポアラビノマンナン等が挙げられる。
ＤＣＡＲリガンドとしては、例えば、ホスファチジルイノシトールマンノシド等が挙げられる。
(CLR ligand)
Examples of CLR ligands include macrophage-inducible C-type lectin (Macroage c-type lectin), macrophage C-type lectin (MCL) receptor, dendritic cell-related C-type lectin- 2 (dendritic cell-associated c-type lectin-2; Dectin-2) receptor and at least one CLR selected from the group consisting of dendritic cell immunoactivator receptor (DCAR) What works may be selected as appropriate.
Examples of the Mincle receptor ligand and MCL receptor ligand include trehalose dimycolic acid.
Examples of the Dectin-2 receptor ligand include lipoarabinomannan.
Examples of the DCAR ligand include phosphatidylinositol mannoside.
本実施形態の免疫組成物中の疎水性アジュバントの含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば０．００１質量％以上０．１質量％以下とすることができ、例えば０．００２質量％以上０．００５質量％以下とすることができる。 The content of the hydrophobic adjuvant in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 0.001% by mass to 0.1% by mass with respect to the total mass of the immune composition, for example, 0.002 It can be set to mass% or more and 0.005 mass% or less.
［油相］
油相としては、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、植物油、動物油、中性脂質（モノ置換、ジ置換又はトリ置換のグリセライド）、合成油脂、ステロール誘導体、長鎖脂肪酸エステル、乳酸エステル、多価カルボン酸エステル、その他のカルボン酸のエステル、炭化水素類、シリコーン類等が挙げられる。
植物油としては、例えば、大豆油、綿実油、菜種油、ゴマ油、コーン油、落花生油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ナタネ油、シソ油、ウイキョウ油、カカオ油、ケイヒ油、ハッカ油、ベルガモット油等が挙げられる。
動物油としては、例えば、牛脂、豚油、魚油等が挙げられる。
中性脂質としては、例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド、トリオレイン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリアラキドニン等が挙げられる。
合成脂質としては、例えば、アゾン等が挙げられる。
ステロール誘導体としては、例えば、コレステリルオレエート、コレステリルリノレート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミデート、コレスレリルアラキデート等が挙げられる。
長鎖脂肪酸エステルとしては、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸セチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル等が挙げられる。
乳酸エステルとしては、例えば、乳酸エチル、乳酸セチル等が挙げられる。
多価カルボン酸エステルとしては、例えば、クエン酸トリエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル等が挙げられる。
その他のカルボン酸のエステルとしては、例えば、２−エチルヘキサン酸セチル等が挙げられる。
炭化水素類としては、例えば、ワセリン、パラフィン、スクワラン、スクワレン等が挙げられる。
これら油相を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
中でも、油相としては、スクワレンが好ましい。
[Oil phase]
The oil phase is not particularly limited as long as it is acceptable in pharmaceutical preparations. For example, vegetable oils, animal oils, neutral lipids (mono-substituted, di-substituted or tri-substituted glycerides), synthetic fats and oils, sterol derivatives, long Examples include chain fatty acid esters, lactic acid esters, polyvalent carboxylic acid esters, esters of other carboxylic acids, hydrocarbons, and silicones.
Examples of vegetable oils include soybean oil, cottonseed oil, rapeseed oil, sesame oil, corn oil, peanut oil, safflower oil, sunflower oil, olive oil, rapeseed oil, perilla oil, fennel oil, cacao oil, cinnamon oil, peppermint oil, bergamot Oil etc. are mentioned.
Examples of animal oils include beef tallow, pork oil, fish oil and the like.
Examples of the neutral lipid include medium chain fatty acid triglyceride, triolein, trilinolein, tripalmitin, tristearin, trimyristin, triarachidonin and the like.
Examples of synthetic lipids include azone.
Examples of the sterol derivative include cholesteryl oleate, cholesteryl linoleate, cholesteryl myristate, cholesteryl palmidate, cholesrelyl arachidate, and the like.
Examples of the long-chain fatty acid ester include isopropyl myristate, octyldodecyl myristate, cetyl myristate, ethyl oleate, ethyl linoleate, isopropyl linoleate, isopropyl palmitate, and butyl stearate.
Examples of the lactic acid ester include ethyl lactate and cetyl lactate.
Examples of the polyvalent carboxylic acid ester include triethyl citrate, diisopropyl adipate, diethyl sebacate, diisopropyl sebacate and the like.
Examples of other carboxylic acid esters include cetyl 2-ethylhexanoate.
Examples of hydrocarbons include petrolatum, paraffin, squalane, squalene, and the like.
These oil phases may be used alone or in combination of two or more.
Among them, squalene is preferable as the oil phase.
本実施形態の免疫組成物中の油相の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば１質量％以上５０質量％以下とすることができ、例えば２質量％以上３０質量％以下とすることができる。 The content of the oil phase in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 1% by mass to 50% by mass with respect to the total mass of the immune composition, for example, 2% by mass to 30% by mass. It can be.
［水相］
水相としては、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。
[Water phase]
The aqueous phase is not particularly limited as long as it is acceptable in pharmaceutical preparations. Examples thereof include pure water, purified water, distilled water, physiological saline, and buffer solution.
本実施形態の免疫組成物中の水相の含有量は、免疫組成物の総質量に対して、例えば５０質量％以上９９．５質量％以下とすることができ、例えば７０質量％以上９５質量％以下とすることができる。 The content of the aqueous phase in the immune composition of the present embodiment can be, for example, 50% by mass to 99.5% by mass with respect to the total mass of the immune composition, for example, 70% by mass to 95% by mass. % Or less.
［その他添加成分］
本実施形態の免疫組成物は、上記構成成分に加えて、更に、その他添加成分を含んでもよい。
その他添加成分としては、例えば、賦形剤、着色剤、結合剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤（例えば、カルメロースナトリウム等）、緩衝剤、ｐＨ調整剤、基剤、炭化水素類、エステル類、トリグリセリド類、吸収促進剤、等張化剤、有機溶媒、界面活性剤等が挙げられる。
賦形剤としては、例えば、白糖等の糖類、デキストリン等のデンプン誘導体、カルメロースナトリウム等のセルロース誘導体、キサンタンガム等の水溶性高分子等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、上記賦形剤、マクロゴール等が挙げられる。
湿潤剤としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
安定剤としては、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル類、アルコール類、塩化ベンザルコニウム、フェノール類、チメロサール、無水酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。パラヒドロキシ安息香酸エステル類としては、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル類メチルパラベン、プロピルパラベン等が挙げられる。アルコール類としては、例えば、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等が挙げられる。フェノール類としては、例えば、フェノール、クレゾール等が挙げられる。
溶剤としては、例えば、水、グリセリン、エタノール、高級アルコール類等が挙げられる。高級アルコール類としては、例えば、オレイルアルコール等が挙げられる。
基剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、クロタミトン、セバシン酸ジエチル、ワセリン等が挙げられる。
炭化水素類としては、例えば、ワセリン、マイクロクリスタンワックス等が挙げられる。
エステル類としては、例えば、ホホバアブアラ、ゲイロウ等が挙げられる。
トリグリセリド類としては、例えば、牛脂、オリーブ油等が挙げられる。
吸収促進剤としては、例えば、メントール等が挙げられる。
本実施形態の免疫組成物において、上記添加成分は、通常の配合量で配合できる。
[Other additive components]
The immune composition of the present embodiment may further contain other additive components in addition to the above components.
Other additive components include, for example, excipients, colorants, binders, emulsifiers, thickeners, wetting agents, stabilizers, preservatives, solvents, solubilizers, suspending agents (for example, carmellose sodium, etc. ), Buffers, pH adjusters, bases, hydrocarbons, esters, triglycerides, absorption enhancers, tonicity agents, organic solvents, surfactants, and the like.
Examples of the excipient include sugars such as sucrose, starch derivatives such as dextrin, cellulose derivatives such as carmellose sodium, and water-soluble polymers such as xanthan gum.
Examples of the binder include the above excipients and macrogol.
Examples of the wetting agent include glycerin.
Examples of the stabilizer include parahydroxybenzoic acid esters, alcohols, benzalkonium chloride, phenols, thimerosal, acetic anhydride, sorbic acid and the like. Examples of the parahydroxybenzoic acid esters include parahydroxybenzoic acid esters such as methyl paraben and propyl paraben. Examples of alcohols include chlorobutanol, benzyl alcohol, and phenylethyl alcohol. Examples of phenols include phenol and cresol.
Examples of the solvent include water, glycerin, ethanol, higher alcohols and the like. Examples of higher alcohols include oleyl alcohol.
Examples of the base include polyethylene glycol, crotamiton, diethyl sebacate, petrolatum and the like.
Examples of hydrocarbons include petrolatum, microcrystalline wax, and the like.
Examples of the esters include jojoba abbara and gay wax.
Examples of triglycerides include beef tallow and olive oil.
Examples of the absorption promoter include menthol.
In the immune composition of the present embodiment, the additive component can be blended in a normal blending amount.
＜免疫組成物の製造方法＞
本実施形態の免疫組成物は、例えば、以下の工程（１）〜（３）を含む方法を用いて、製造できる。
（１）親水性抗原を含む水相と、第１の界面活性剤を含む有機溶媒とを攪拌混合して、前記水相を前記有機溶媒中に分散させたＷ／Ｏ型エマルションを形成させる工程；
（２）前記Ｗ／Ｏ型エマルションから内側の前記水相と外側の前記有機溶媒とを除いて、前記親水性抗原が前記第１の界面活性剤によって被覆された前記親水性抗原−前記第１の界面活性剤を形成させた後、前記親水性抗原−前記第１の界面活性剤複合体を疎水性アジュバントを含む油相中に分散させたＳ／Ｏ型エマルションを形成させる工程；
（３）前記Ｓ／Ｏ型エマルションと、第２の界面活性剤を含む新たな水相とを攪拌混合して、前記Ｓ／Ｏ型エマルションを前記水相に分散させたＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させる工程。
<Method for producing immune composition>
The immune composition of the present embodiment can be produced using, for example, a method including the following steps (1) to (3).
(1) A step of stirring and mixing an aqueous phase containing a hydrophilic antigen and an organic solvent containing a first surfactant to form a W / O emulsion in which the aqueous phase is dispersed in the organic solvent. ;
(2) The hydrophilic antigen-the first, wherein the hydrophilic antigen is coated with the first surfactant, excluding the inner aqueous phase and the outer organic solvent from the W / O emulsion. Forming an S / O type emulsion in which the hydrophilic antigen-first surfactant complex is dispersed in an oil phase containing a hydrophobic adjuvant,
(3) S / O / W type in which the S / O type emulsion and a new aqueous phase containing a second surfactant are stirred and mixed to disperse the S / O type emulsion in the aqueous phase. Forming an emulsion;
上記各工程について、以下に詳細を説明する。 Details of each of the above steps will be described below.
［工程（１）］
まず、親水性抗原の水溶液を調製する。このとき、必要に応じて、上記その他添加成分のうち、親水性のものを併せて添加してもよい。また、ここで使用する水としては、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。必要に応じて、エタノール等水混和性の有機溶媒を少量添加してもよいが、アルコール等を加え過ぎるとエマルションが形成されにくくなる場合があるため、水のみを用いることが好ましい。
上記水溶液における親水性抗原の濃度（上記その他添加成分を更に添加する場合は、これらの合計濃度）は、これらを実質的に完全に溶解できれば特に制限されないが、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。
[Step (1)]
First, an aqueous solution of a hydrophilic antigen is prepared. At this time, if necessary, among the other additive components, hydrophilic ones may be added together. Examples of the water used here include pure water, purified water, distilled water, physiological saline, and buffer solution. If necessary, a small amount of a water-miscible organic solvent such as ethanol may be added. However, it may be difficult to form an emulsion if alcohol or the like is added excessively, so that it is preferable to use only water.
The concentration of the hydrophilic antigen in the aqueous solution is not particularly limited as long as it can be dissolved substantially completely (for example, when these additional components are further added), for example, 0.1 mg / mL or more and 30 mg or more. / ML or less.
別途、第１の界面活性剤の有機溶媒溶液を調製する。ここで使用する有機溶媒は、第１の界面活性剤を溶解することができ、且つ、次工程で除去できるものであれば特に制限されないが、例えば、アルコール、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル系溶剤、ハロゲン系脂肪族炭化水素等が挙げられる。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール等が挙げられる。脂肪族炭化水素としては、例えば、ヘキサン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えば、トルエン等が挙げられる。エステル系溶剤としては、例えば、酢酸エチルエステル等が挙げられる。ハロゲン系脂肪族炭化水素としては、例えば、塩化メチレン等が挙げられる。
また、上記有機溶媒溶液における第１の界面活性剤の濃度も特に制限されないが、例えば、１質量％以上１０質量％以下程度とすることができる。
Separately, an organic solvent solution of the first surfactant is prepared. The organic solvent used here is not particularly limited as long as it can dissolve the first surfactant and can be removed in the next step. For example, alcohol, aliphatic hydrocarbon, aromatic hydrocarbon , Ester solvents, halogenated aliphatic hydrocarbons and the like. Examples of the alcohol include methanol and ethanol. Examples of the aliphatic hydrocarbon include hexane. As an aromatic hydrocarbon, toluene etc. are mentioned, for example. Examples of the ester solvent include ethyl acetate. Examples of the halogenated aliphatic hydrocarbon include methylene chloride.
Further, the concentration of the first surfactant in the organic solvent solution is not particularly limited, but can be, for example, about 1% by mass to 10% by mass.
次に、上記親水性抗原の水溶液、及び、第１の界面活性剤の有機溶剤溶液を、常法に従って攪拌混合して、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製する。具体的な攪拌方法としては、例えば、ホモジェナイザーにより高速撹拌する方法、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌する方法、これらに加えて超音波を照射することにより攪拌する方法等が挙げられる。或いは、多孔質膜を用いた膜乳化によってＷ／Ｏ型エマルションを調製してもよい。多孔質膜として、例えば、市販の疎水性のシラス多孔質ガラス膜（ＳＰＧ、ＳＰＧテクノ社製）を用いることができる。この多孔膜を用いることで、多孔質ガラス膜の細孔径に対応する粒径の分散相粒子（親水性抗原−第１の界面活性剤複合体）が得られる。 Next, the aqueous solution of the hydrophilic antigen and the organic solvent solution of the first surfactant are stirred and mixed according to a conventional method to prepare a W / O type emulsion. Specific examples of the stirring method include a method of stirring at high speed with a homogenizer, a method of stirring with a stirrer such as a propeller mixer and a disper, and a method of stirring by irradiating ultrasonic waves in addition to these. . Alternatively, a W / O type emulsion may be prepared by membrane emulsification using a porous membrane. As the porous membrane, for example, a commercially available hydrophobic shirasu porous glass membrane (SPG, manufactured by SPG Techno) can be used. By using this porous membrane, dispersed phase particles (hydrophilic antigen-first surfactant complex) having a particle size corresponding to the pore size of the porous glass membrane can be obtained.
［工程（２）］
次に、上記工程（１）で得られたＷ／Ｏ型エマルションを乾燥し、水分及び有機溶媒を除去して、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を形成させる。乾燥方法は特に制限されず、例えば、凍結乾燥、減圧乾燥等が挙げられるが、凍結乾燥が好ましい。具体的な条件は、常法に従えばよい。また、残存する水分は親水性抗原の加水分解を生む原因となる可能性があり、また、残存する有機溶媒は、生体に悪影響を及ぼす可能性があるため、当該工程では、水分と有機溶媒とを実質的に完全に除去することが好ましい。具体的には、例えば、カールフィッシャー法による測定で、含水率が１％以下になる程度に乾燥することができる。
[Step (2)]
Next, the W / O type emulsion obtained in the above step (1) is dried to remove water and an organic solvent to form a hydrophilic antigen-first surfactant complex. The drying method is not particularly limited, and examples include lyophilization and reduced pressure drying, and lyophilization is preferred. Specific conditions may follow a conventional method. In addition, the remaining water may cause hydrolysis of the hydrophilic antigen, and the remaining organic solvent may adversely affect the living body. Is preferably removed substantially completely. Specifically, for example, it can be dried to such an extent that the moisture content is 1% or less as measured by the Karl Fischer method.
次に、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体を、疎水性アジュバントを含む油相に分散することによって、Ｓ／Ｏ化を行なう。このとき、油相は、疎水性アジュバントに加えて、更に、第３の界面活性剤を含んでもよい。具体的な攪拌方法としては、例えば、ボルテックス又はホモジェナイザーにより高速撹拌する方法、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌する方法、これらに加えて超音波を照射することにより攪拌する方法等が挙げられる。
また、ここで使用する油相、疎水性アジュバント及び第３の界面活性剤としては、上記「免疫組成物」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
上記工程で使用する油相の量は、第１の界面活性剤と油相の種類との相性等にもよるが、例えば、親水性抗原−第１の界面活性剤複合体１ｇ当たり、１ｍＬ以上１０ｍＬ以下程度とすることができる。
Next, S / O conversion is performed by dispersing the hydrophilic antigen-first surfactant complex in an oil phase containing a hydrophobic adjuvant. At this time, the oil phase may further contain a third surfactant in addition to the hydrophobic adjuvant. Specific examples of the stirring method include, for example, a method of stirring at high speed with a vortex or a homogenizer, a method of stirring with a stirrer such as a propeller mixer or a disper, and a method of stirring by irradiating ultrasonic waves in addition to these. Can be mentioned.
In addition, examples of the oil phase, the hydrophobic adjuvant and the third surfactant used here include the same as those exemplified in the above “immune composition”.
The amount of the oil phase used in the above step depends on the compatibility between the first surfactant and the type of the oil phase, for example, 1 mL or more per 1 g of the hydrophilic antigen-first surfactant complex. It can be about 10 mL or less.
［工程（３）］
次に、上記工程（２）で得られたＳ／Ｏ型エマルション、及び、第２の界面活性剤を含む新たな水相を、常法に従って攪拌混合して、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する。具体的な攪拌方法としては、例えば、ホモジェナイザーにより高速撹拌する方法、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌する方法、これらに加えて超音波を照射することにより攪拌する方法等が挙げられる。或いは、多孔質膜を用いた膜乳化によってＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製してもよい。多孔質膜として、例えば、後述の実施例にて用いられた、市販の０．２μｍフィルター（例えば、ミリポア社製等）を用いることができる。この多孔膜を用いることで、多孔質膜の細孔径に対応する粒径の分散相粒子（第２の界面活性剤によって被覆された油相）が得られる。
また、ここで使用する水としては、上記「免疫組成物」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
[Step (3)]
Next, the S / O emulsion obtained in the above step (2) and a new aqueous phase containing the second surfactant are stirred and mixed according to a conventional method to obtain an S / O / W emulsion. Prepare. Specific examples of the stirring method include a method of stirring at high speed with a homogenizer, a method of stirring with a stirrer such as a propeller mixer and a disper, and a method of stirring by irradiating ultrasonic waves in addition to these. . Alternatively, an S / O / W type emulsion may be prepared by membrane emulsification using a porous membrane. As the porous membrane, for example, a commercially available 0.2 μm filter (for example, manufactured by Millipore) used in Examples described later can be used. By using this porous membrane, dispersed phase particles (oil phase coated with the second surfactant) having a particle size corresponding to the pore size of the porous membrane can be obtained.
Moreover, as water used here, the thing similar to what was illustrated in the said "immune composition" is mentioned.
［その他工程］
上記Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、そのまま、経皮的、皮下注射、静脈注射又は筋肉注射により、被検体に投与してもよいが、医薬として通常添加される上記その他添加成分を添加して製剤化することが好ましい。
[Other processes]
The S / O / W emulsion may be administered to the subject as it is, transdermally, subcutaneously, intravenously, or intramuscularly. However, the other additive components that are usually added as pharmaceuticals are added. It is preferable to formulate.
各剤形に応じた常套手段によって、上記Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションと上記その他添加成分とを混合して、例えば、軟膏剤、ローション剤、エアゾール剤、硬膏剤、水性パップ剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、プラスター剤、リザーバー型貼付剤、マトリックス型貼付剤、テープ剤、注射剤等とすることができるが、これらに限定されない。 The S / O / W emulsion and the other additive components are mixed by conventional means according to each dosage form, for example, ointments, lotions, aerosols, plasters, aqueous poultices, creams, Although it can be set as an ointment, a gel agent, a plaster agent, a reservoir type patch, a matrix type patch, a tape agent, an injection, etc., it is not limited to these.
＜投与方法＞
本実施形態の免疫組成物の投与量は、配合する抗原の種類や量、また、患者の年齢や症状等に応じて適宜調整すればよい。例えば、通常、成人１人あたり、１回の投与につき、概ね５０μｇ以上５００μｇ以下とすることができ、概ね５０μｇ以上２００μｇ以下とすることができ、数週間から数ヶ月にわたって、少なくとも２回以上投与することが好ましい。
<Method of administration>
What is necessary is just to adjust the dosage of the immune composition of this embodiment suitably according to the kind and quantity of the antigen to mix | blend, a patient's age, symptom, etc. For example, it can be generally about 50 μg or more and 500 μg or less per administration per adult, and can be generally about 50 μg or more and 200 μg or less, and is administered at least twice over several weeks to several months. It is preferable.
＜使用用途＞
本実施形態の免疫組成物は、経皮的に投与することができ、極めて安全性の高い非侵襲性の免疫原性製剤又はワクチンとして非常に有用である。
また、本実施形態の免疫組成物は、親水性抗原としてがん抗原を封入し、皮下注射、静脈注射又は筋肉注射により投与することができ、さらに抗ＰＤ−１抗体（オプジーボ（登録商標））等の免疫チェックポイント阻害剤と併用することで、極めて安全性及び治療効果の高い抗がん剤として非常に有用である。
<Uses>
The immune composition of this embodiment can be administered transdermally and is very useful as a highly safe non-invasive immunogenic preparation or vaccine.
In addition, the immune composition of the present embodiment encapsulates a cancer antigen as a hydrophilic antigen and can be administered by subcutaneous injection, intravenous injection, or intramuscular injection. Further, an anti-PD-1 antibody (OPDIVO (registered trademark)) It is very useful as an anticancer agent having extremely high safety and therapeutic effect when used together with an immune checkpoint inhibitor such as
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.
［参考例１］ＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
図２は、ＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造方法を示す概略工程図である。図２を参照しながら、ＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造方法について、以下に詳細を説明する。
Reference Example 1 Production of FITC Labeled Ovalbumin Encapsulated S / O / W Type Emulsion FIG. 2 is a schematic process diagram showing a method for producing a FITC labeled ovalbumin encapsulated S / O / W type emulsion. The method for producing a FITC-labeled ovalbumin-encapsulated S / O / W type emulsion will be described in detail below with reference to FIG.
（１）ＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体又はＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体の調製
１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識されたオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）（以下、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ」と略記する場合がある）を蒸留水に溶解して調製した溶液と、卵黄由来ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ ｙｏｌｋ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＥＰＣ）（日油コートソーム社製、ＮＣ−５０）及びＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）（Ｓｉｇｍａ社製）を含むシクロヘキサン溶液、又は、ＥＲ−２９０（ショ糖エルカ酸エステル）（三菱ケミカルフーズ社製）を含むシクロヘキサン溶液とを、１：２の容量比となるように混合した。次いで、混合液を、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、２６０００ｒｐｍで２分間攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製した。調製後、得られたＷ／Ｏ型エマルションを凍結乾燥することで、ＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体又はＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体の固体を得た。
(1) Preparation of EPC-Span85-FITC-OVA complex or ER-290-FITC-OVA complex 1 mg / mL FITC-labeled ovalbumin (Ovalbumin; OVA) (hereinafter abbreviated as “FITC-OVA”) Solution prepared by dissolving in distilled water, egg yolk phosphatidylcholine (EPC) (manufactured by NOF Coatsome, NC-50) and Span 85 (sorbitan trioleate) (manufactured by Sigma) ) Or a cyclohexane solution containing ER-290 (sucrose erucic acid ester) (manufactured by Mitsubishi Chemical Foods Co., Ltd.) in a volume ratio of 1: 2. Next, the mixed solution was stirred at 26000 rpm for 2 minutes using a Polytron homogenizer (manufactured by KINEMATICA) to prepare a W / O type emulsion. After the preparation, the obtained W / O emulsion was freeze-dried to obtain an EPC-Span85-FITC-OVA complex or ER-290-FITC-OVA complex solid.
（２）Ｓ／Ｏ型製剤の製造
次いで、（１）で得られたＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体又はＥＲ−２９０−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体に、スクワレン（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ型製剤を得た。
(2) Production of S / O type preparation Next, squalene (manufactured by Sigma) was added to the EPC-Span85-FITC-OVA complex or ER-290-FITC-OVA complex obtained in (1), Two types of FITC-OVA encapsulated S / O type preparations were obtained.
（３）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
次いで、（２）で得られた２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ型製剤と、０．５質量％のＴｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）とを混合した。次いで、混合液を、１２ｍＬのバイアル瓶中でポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、２６０００ｒｐｍで２分間攪拌し、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）は、以下の表１に示すとおりである。
(3) Production of FITC-OVA Encapsulated S / O / W Type Emulsion Next, phosphoric acid containing two types of FITC-OVA encapsulated S / O type preparations obtained in (2) and 0.5% by mass of
［比較例１］従来のＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
ＥＰＣ及びＳｐａｎ８５、又は、ＥＲ−２９０を含むスクワレン（Ｓｉｇｍａ社製）と、０．５質量％のＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳとを混合した。次いで、混合液を、１２ｍＬのバイアル瓶中でポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、２６０００ｒｐｍで２分間攪拌し、Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。次いで、このＯ／Ｗ型エマルションに、終濃度が０．０２質量％となるように１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ＯＶＡを添加して、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションを得た。得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）は、上記表１と同様である。
Comparative Example 1 Production of Conventional FITC-OVA Mixed O / W Type Emulsion EPC and Span 85 or Squalene containing ER-290 (manufactured by Sigma) and PBS containing 0.5% by mass of
［試験例１］ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおけるＦＩＴＣ−ＯＶＡの封入率評価試験
（１）遠心分離法による間接的な封入率評価
参考例１で得られた２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション及び比較例１で得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションについて、それぞれ遠心分離（２０℃、２００００ｇ、１５分間）を行い、外水相のみを得た。次いで、マイクロプレートリーダーを用いて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションに対するＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの相対蛍光強度を以下の式を用いて算出し、間接的な封入率を評価した。なお、以下の式において、「Ｆ０」は遠心分離後のＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションの外水相の蛍光強度を示し、「ＦＳ／Ｏ／Ｗ−１」は、遠心分離後のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの外水相の蛍光強度を示す。結果を図３Ａに示す。
封入率Ｅ０（％）＝（Ｆ０−ＦＳ／Ｏ／Ｗ−１）／Ｆ０×１００
[Test Example 1] FITC-OVA Encapsulated S / O / W Emulsion Encapsulation Rate Evaluation Test of FITC-OVA (1) Indirect Enclosure Rate Evaluation by Centrifugation Method Two types of FITC- obtained in Reference Example 1 The OVA-encapsulated S / O / W type emulsion and the FITC-OVA mixed O / W type emulsion obtained in Comparative Example 1 were each centrifuged (20 ° C., 20000 g, 15 minutes) to obtain only the outer aqueous phase. . Next, using a microplate reader, the relative fluorescence intensity of the FITC-OVA encapsulated S / O / W emulsion to the FITC-OVA mixed O / W emulsion was calculated using the following formula, and the indirect encapsulation rate was calculated. evaluated. In the following formula, “F 0 ” indicates the fluorescence intensity of the outer aqueous phase of the FITC-OVA mixed O / W emulsion after centrifugation, and “FS / O / W-1 ” indicates after centrifugation. The fluorescence intensity of the outer aqueous phase of FITC-OVA-encapsulated S / O / W type emulsion is shown. The results are shown in FIG. 3A.
Encapsulation rate E 0 (%) = (F 0 −FS / O / W−1 ) / F 0 × 100
（２）キャリア崩壊法による直接的な封入率評価
また、上記遠心分離後に外水相を取り除いて残存した固形分に、外水相と等重量のＰＢＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。このときのＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度は１０質量％とした。その後、ホモジナイザーを用いて２６０００ｒｐｍ、２分間高速攪拌して３７℃で静置した。２日後、このサンプルに対して、遠心分離（２０℃、２００００ｇ、１５分間）を行った。次いで、得られた溶液について、マイクロプレートリーダーを用いて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ混合Ｏ／Ｗ型エマルションに対するＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの相対蛍光強度を以下の式を用いて算出し、直接的な封入率を評価した。「Ｆ０」は上記と同様であり、「ＦＳ／Ｏ／Ｗ−２」は、遠心分離後のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの固形分の蛍光強度を示す。
封入率Ｅ１（％）＝ＦＳ／Ｏ／Ｗ−２／Ｆ０×１００
(2) Direct encapsulation rate evaluation by carrier disintegration method Further, PBS and Triton X-100 having the same weight as the outer aqueous phase were added to the solid content remaining after removing the outer aqueous phase after the centrifugation. The concentration of Triton X-100 at this time was 10% by mass. Thereafter, the mixture was stirred at 26000 rpm for 2 minutes using a homogenizer and allowed to stand at 37 ° C. Two days later, this sample was centrifuged (20 ° C., 20000 g, 15 minutes). Next, for the obtained solution, using a microplate reader, the relative fluorescence intensity of the FITC-OVA-encapsulated S / O / W emulsion relative to the FITC-OVA mixed O / W emulsion was calculated using the following formula: Direct encapsulation rate was evaluated. “F 0 ” is the same as described above, and “FS / O / W-2 ” indicates the fluorescence intensity of the solid content of the FITC-OVA-encapsulated S / O / W emulsion after centrifugation.
Encapsulation rate E 1 (%) = FS / O / W-2 / F 0 × 100
図３Ａから、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおけるＦＩＴＣ−ＯＶＡの封入率は、ＥＲ−２９０を用いた場合では５５％、ＥＰＣを用いた場合では３５％であった。また、上記（１）及び上記（２）の結果から、遠心分離法を用いた場合でも、キャリア崩壊法を用いた場合でも、得られる封入率は同程度であった（図示せず）。 From FIG. 3A, the encapsulation rate of FITC-OVA in the S / O / W emulsion was 55% when ER-290 was used and 35% when EPC was used. In addition, from the results of (1) and (2) above, the encapsulating rate obtained was the same (not shown) regardless of whether the centrifugal separation method or the carrier decay method was used.
（３）経時的な封入率の変化の評価
次いで、ＥＲ−２９０を用いたＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションについて、製造から２４時間後、３６時間後及び１６８時間（１週間）後に、上記（１）と同様の方法を用いて、遠心分離法による間接的な封入率を評価した。結果を図３Ｂに示す。
(3) Evaluation of change in encapsulation rate over time Next, for the S / O / W emulsion using ER-290, the above (1) was obtained 24 hours, 36 hours and 168 hours (1 week) after production. The indirect encapsulation rate by the centrifugation method was evaluated using the same method as in (1). The results are shown in FIG. 3B.
図３Ｂから、ゆるやかにＦＩＴＣ−ＯＶＡが放出されることが明らかとなった。また、製造から１週間後においても、封入率は４０％程度あり、ＦＩＴＣ−ＯＶＡがＳ／Ｏ／Ｗ型エマルション中に残っていた。 From FIG. 3B, it became clear that FITC-OVA was released gradually. Further, even after one week from the production, the encapsulation rate was about 40%, and FITC-OVA remained in the S / O / W emulsion.
［試験例２］ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子径及び毒性の評価
（１）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子径評価
参考例１で得られたＥＰＣを用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションについて、動的光散乱測定装置（マルバーン社製）を用いて、粒子径を測定した。結果を図４Ａに示す。なお、図４Ａにおける平均粒子径は２９７ｎｍであった。
さらに、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを、市販の０．２μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過した後に、再度同様の方法を用いて、粒子径を測定した。結果を図４Ｂに示す。なお、図４Ｂにおける平均粒子径は１７４ｎｍであった。
Test Example 2 Evaluation of Particle Size and Toxicity of FITC-OVA Encapsulated S / O / W Type Emulsion (1) Particle Size Evaluation of FITC-OVA Encapsulated S / O / W Emulsion EPC obtained in Reference Example 1 About the used FITC-OVA enclosure S / O / W type | mold emulsion, the particle diameter was measured using the dynamic light-scattering measuring apparatus (made by Malvern). The results are shown in FIG. 4A. In addition, the average particle diameter in FIG. 4A was 297 nm.
Furthermore, after filtering the FITC-OVA encapsulated S / O / W type emulsion with a commercially available 0.2 μm filter (Millipore), the particle size was measured again using the same method. The results are shown in FIG. 4B. In addition, the average particle diameter in FIG. 4B was 174 nm.
図４Ａ及び図４Ｂから、ナノサイズのＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションが得られていることが確かめられた。また、０．２μｍフィルターによるろ過を施すことで、従来のＯ／Ｗ型エマルションであるＭＦ５９と同程度の粒子径のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションが得られることが確かめられた。 From FIG. 4A and FIG. 4B, it was confirmed that a nano-sized FITC-OVA encapsulated S / O / W type emulsion was obtained. Further, it was confirmed that a FITC-OVA-encapsulated S / O / W type emulsion having a particle size similar to that of MF59, which is a conventional O / W type emulsion, can be obtained by filtering with a 0.2 μm filter.
（２）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの毒性評価
参考例１で得られた２種類のＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションをそれぞれＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。その結果、ＥＲ−２９０を用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションでは、マウスの皮下注射した部分に炎症が見られたが、ＥＰＣを用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションでは、マウスの皮下注射した部分に特段変化は見られなかった（図示せず）。
よって、ＥＰＣを用いたＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、毒性が低いことが確かめられた。
(2) Toxicity Evaluation of FITC-OVA Encapsulated S / O / W Emulsion Two types of FITC-OVA encapsulated S / O / W emulsion obtained in Reference Example 1 were each injected subcutaneously into C57BL / 6 mice. As a result, in the FITC-OVA encapsulated S / O / W type emulsion using ER-290, inflammation was observed in the subcutaneously injected part of the mouse, but the FITC-OVA encapsulated S / O / W type using EPC was used. In the emulsion, no particular change was seen in the subcutaneously injected part of the mouse (not shown).
Therefore, it was confirmed that the FITC-OVA encapsulated S / O / W type emulsion using EPC has low toxicity.
［実施例１］ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを投与した場合の抗原デリバリーと細胞の活性化との関係を調べるために、ＴＬＲ７／８を刺激することが知られているＴＬＲアジュバントであるＲ８４８を油相に封入したＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。Ｒ８４８はイミダゾキノリン骨格を持つ親油性の低分子化合物アジュバントである。具体的な製造方法は、以下に示すとおりである。
[Example 1] Production of FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W type emulsion In order to investigate the relationship between antigen delivery and cell activation when S / O / W type emulsion was administered, TLR7 / 8 An S / O / W emulsion was prepared in which R848, a TLR adjuvant known to stimulate water, was encapsulated in an oil phase. R848 is a lipophilic low molecular weight compound adjuvant having an imidazoquinoline skeleton. A specific manufacturing method is as follows.
（１）ＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体の調製
参考例１の（１）と同様の方法を用いて、ＥＰＣ−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体を調製した。
(1) Preparation of EPC-Span85-FITC-OVA Complex An EPC-FITC-OVA complex was prepared using the same method as (1) of Reference Example 1.
（２）Ｓ／Ｏ型製剤の製造
次いで、（１）で得られたＥＰＣ−Ｓｐａｎ８５−ＦＩＴＣ−ＯＶＡ複合体に、スクワレン（Ｓｉｇｍａ社製）及びＲ８４８（Ｅｎｚｏ社製）を加えて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ型製剤を得た。
(2) Manufacture of S / O type preparation Next, squalene (manufactured by Sigma) and R848 (manufactured by Enzo) were added to the EPC-Span85-FITC-OVA complex obtained in (1), and FITC-OVA An encapsulated S / O type preparation was obtained.
（３）ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの製造
次いで、参考例１の（３）と同様の方法を用いて、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製した。得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）は、以下の表２に示すとおりである。また、試験例２の（１）と同様の方法を用いて、粒子径を測定した結果、平均粒子径は３０９．９±６．７ｎｍであった。
(3) Production of FITC-OVA and R848 Encapsulated S / O / W Type Emulsion Next, using the same method as (3) of Reference Example 1, FITC-OVA and R848 encapsulated S / O / W type emulsion was prepared. did. The composition of the obtained FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W emulsion and the content of each component (% by mass in PBS) are as shown in Table 2 below. Moreover, as a result of measuring a particle diameter using the method similar to (1) of Test Example 2, the average particle diameter was 309.9 ± 6.7 nm.
［試験例３］抗原提示細胞の活性化及び抗原デリバリー評価
培養したマクロファージ細胞（ＲＡＷ細胞）に実施例１で得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを投与して、ＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込みと細胞表面のＣＤ４０及びＣＤ８０の発現との関係をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）で分析した。具体的な操作は以下に示すとおりである。
[Test Example 3] Activation of antigen-presenting cells and evaluation of antigen delivery FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W emulsion obtained in Example 1 were administered to cultured macrophage cells (RAW cells), and FITC -The relationship between uptake of OVA and the expression of CD40 and CD80 on the cell surface was analyzed by FACS (fluorescence activated cell sorting). Specific operations are as follows.
（１）マクロファージ細胞へのＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの投与
実施例１で得られたＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションをＰＢＳで１０倍に希釈した後、遠心分離（２０℃、２００００ｇ、１５分間）を行った。次いで、エマルション相を避けて、シリンジで７割の水相を吸い取り分取し、同量の培地を加えた。これをさらに５倍希釈してＲＡＷ細胞に投与した（以下、この群を「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群と称する場合がある）。なお、エマルションを遠心精製した後のＦＩＴＣ−ＯＶＡの封入率は３０％であり、その内７割の水層を除去したため、系には初期の４９％のＦＩＴＣ−ＯＶＡが存在していると推察された。
また、対照群として、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションと同様の濃度のＦＩＴＣ−ＯＶＡを含む培地（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ濃度：０．１ｍｇ／ｇ）を調製し、ＲＡＷ細胞に加えた（以下、この群を「Ｆｒｅｅ ＯＶＡ」群と称する場合がある）。
また、対照群として、比較例１で得られたＯ／Ｗ型エマルションの水相をＦＩＴＣ−ＯＶＡを含む培地（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ濃度：０．１ｍｇ／ｇ）に置換し、油相にＲ８４８（Ｒ８４８濃度：１０μｇ／ｇ）を添加したものを調製し、ＲＡＷ細胞に加えた（以下、この群を「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群と称する場合がある）。
(1) Administration of FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W emulsion to macrophage cells The FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W emulsion obtained in Example 1 was diluted 10 times with PBS. Thereafter, centrifugation (20 ° C., 20000 g, 15 minutes) was performed. Next, avoiding the emulsion phase, 70% of the aqueous phase was sucked and collected with a syringe, and the same amount of medium was added. This was further diluted 5-fold and administered to RAW cells (hereinafter, this group may be referred to as “FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W type emulsion” group). In addition, since the encapsulation rate of FITC-OVA after centrifugal purification of the emulsion was 30% and 70% of the water layer was removed, it was estimated that 49% of the initial FITC-OVA was present in the system. It was done.
As a control group, a medium containing FITC-OVA at the same concentration as FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W emulsion (FITC-OVA concentration: 0.1 mg / g) was prepared and added to RAW cells. (Hereinafter, this group may be referred to as the “Free OVA” group).
As a control group, the aqueous phase of the O / W emulsion obtained in Comparative Example 1 was replaced with a medium containing FITC-OVA (FITC-OVA concentration: 0.1 mg / g), and R848 (R848) was replaced with the oil phase. (Concentration: 10 μg / g) was prepared and added to RAW cells (hereinafter this group may be referred to as “FITC-OVA and R848 mixed O / W emulsion” group).
（２）ＦＡＣＳ分析
次いで、（１）における各群の培養開始から１日後に、細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。分析装置としては、日本ＢＤ社製のＢＤ ＦＡＣＳ（登録商標）フローサイトメトリーシステムを用いた。また、ＣＤ４０及びＣＤ８０の標識抗体として、ＰＥ−Ｃｙ７−抗ＣＤ４０抗体及びＡＰＣ−抗ＣＤ８０抗体（共に、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。全ＲＡＷ細胞中のＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合（％）を図５Ａに、ＣＤ４０及びＣＤ８０陽性細胞中のＯＶＡの取り込み割合（％）を図５Ｂに示す。なお、図５Ａ及び図５Ｂにおいて、「Ｆｒｅｅ ＯＶＡ」は「Ｆｒｅｅ ＯＶＡ」群の結果であり、「Ｏ／Ｗ」は「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群の結果であり、「Ｓ／Ｏ／Ｗ」は「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群の結果である。
(2) FACS analysis Next, one day after the start of culture in each group in (1), the cells were collected and subjected to FACS analysis. As an analysis apparatus, a BD FACS (registered trademark) flow cytometry system manufactured by Japan BD was used. In addition, as labeled antibodies for CD40 and CD80, PE-Cy7-anti-CD40 antibody and APC-anti-CD80 antibody (both manufactured by Biolegend) were used. The uptake ratio (%) of FITC-OVA in all RAW cells is shown in FIG. 5A, and the uptake ratio (%) of OVA in CD40 and CD80 positive cells is shown in FIG. 5B. In FIG. 5A and FIG. 5B, “Free OVA” is the result of the “Free OVA” group, “O / W” is the result of the “FITC-OVA and R848 mixed O / W emulsion” group, "S / O / W" is a result of the "FITC-OVA and R848 encapsulated S / O / W type emulsion" group.
図５Ａから、「Ｆｒｅｅ ＯＶＡ」群（８％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群（２９％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群（４５％）の順で、ＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合が上昇することが明らかとなった。このことから、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションはＲＡＷ細胞への抗原デリバリー能力に優れることが確かめられた。
また、図５Ｂから、「Ｆｒｅｅ ＯＶＡ」群（１７％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群（２９％）、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群（５３％）の順でＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合が上昇しており、全ＲＡＷ細胞中のＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込み割合よりも、「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション」群と「ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション」群との差がより顕著であった。すなわち、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、抗原とＴＬＲアジュバントとを同時に封入したキャリアであり、抗原を外水相に封入したＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ８４８混合Ｏ／Ｗ型エマルション（既存のキャリアの類似物）と比較して、ＴＬＲアジュバントによって活性化された細胞における抗原のデリバリーが顕著に向上することが確認された。
From FIG. 5A, “Free OVA” group (8%), “FITC-OVA and R848 mixed O / W emulsion” group (29%), “FITC-OVA and R848 encapsulated S / O / W emulsion” group ( It became clear that the uptake ratio of FITC-OVA increased in the order of 45%). From this, it was confirmed that FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W type emulsion were excellent in antigen delivery ability to RAW cells.
Further, from FIG. 5B, “Free OVA” group (17%), “FITC-OVA and R848 mixed O / W emulsion” group (29%), “FITC-OVA and R848 encapsulated S / O / W emulsion” The FITC-OVA uptake ratio increased in the order of the group (53%), and the “FITC-OVA and R848 mixed O / W emulsion” group and the “uptake ratio of FITC-OVA in all RAW cells” and “ The difference from the “FITC-OVA and R848-encapsulated S / O / W type emulsion” group was more remarkable. That is, the FITC-OVA and R848 encapsulated S / O / W type emulsion is a carrier in which an antigen and a TLR adjuvant are encapsulated at the same time, and the FITC-OVA and R848 mixed O / W type emulsion in which the antigen is encapsulated in an outer aqueous phase ( Compared to existing carrier analogues), it was confirmed that antigen delivery in cells activated by TLR adjuvant was significantly improved.
図６は、ＲＡＷ細胞での抗原（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）の取り込みと、ＣＤ４０及びＣＤ８０の発現の関係と、を示す概念図である。図６に示すように、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ４８４封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、ＴＬＲアジュバントのデリバリーキャリアとして機能し、抗原提示細胞を活性化することが示唆された。さらに、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ及びＲ４８４封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、ＴＬＲアジュバントと同時に抗原を封入しているため、活性化した抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーできるキャリアであることが示唆された。 FIG. 6 is a conceptual diagram showing the relationship between antigen (FITC-OVA) uptake in RAW cells and the expression of CD40 and CD80. As shown in FIG. 6, it was suggested that FITC-OVA and R484-encapsulated S / O / W type emulsion function as a TLR adjuvant delivery carrier and activate antigen-presenting cells. Furthermore, it was suggested that FITC-OVA and R484-encapsulated S / O / W emulsions are carriers capable of efficiently delivering antigens to activated antigen-presenting cells because they encapsulate antigens simultaneously with TLR adjuvants. .
［参考試験例１］動物実験による抗原特異的ＣＴＬの活性化
Ｃ５７ＢＬ/６マウス（日本クレアより購入）にＦｒｅｅ ＯＶＡ、ＯＶＡ混合Ｏ/Ｗ型エマルション、又は、ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション（全てＲ８４８は含まない）の皮下投与を行い、脾臓の細胞の細胞表面染色及び細胞内サイトカイン染色による抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）の免疫活性化評価を行った。
[Reference Test Example 1] Activation of antigen-specific CTL by animal experiment Free OVA, OVA mixed O / W emulsion, or OVA-encapsulated S / O / W emulsion (obtained from Clea Japan) All of them did not contain R848), and immunostimulation of antigen-specific cytotoxic T cells (CTL) by cell surface staining of spleen cells and intracellular cytokine staining was performed.
（１）サンプルの調製
ＦＩＴＣ−ＯＶＡの代わりに、蛍光標識されていないＯＶＡを用いた以外は、参考例１及び比較例１と同様の方法を用いて、ＯＶＡ混合Ｏ/Ｗ型エマルション、及び、ＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションを作製した。次いで、試験例３の（１）と同様の方法を用いて、各サンプルを調製した。各サンプルの組成及び各成分の含有量（質量％、ＰＢＳ中）を以下の表３に示す。なお、表３において、「Ｏ／Ｗ」はＯＶＡ混合Ｏ/Ｗ型エマルションである。また、「Ｓ／Ｏ／Ｗ」はＯＶＡ封入Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションである。
(1) Preparation of sample An OVA mixed O / W emulsion, using the same method as in Reference Example 1 and Comparative Example 1, except that OVA not fluorescently labeled was used instead of FITC-OVA, and An OVA-encapsulated S / O / W type emulsion was prepared. Subsequently, each sample was prepared using the same method as in Test Example 3 (1). The composition of each sample and the content of each component (% by mass in PBS) are shown in Table 3 below. In Table 3, “O / W” is an OVA mixed O / W emulsion. “S / O / W” is an OVA-enclosed S / O / W emulsion.
（２）マウスへの免疫及び細胞の培養
各サンプルに対して６匹ずつのマウス（計１８匹）に、２００μＬ／匹の投与量で投与した。剃毛後、背部に一週間おきに２回皮下投与した。最終免疫から７日後に、マウスの脾細胞を取り出した。次いで、２４穴プレートで各脾細胞を２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種して、培養した。ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド（配列番号１：ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（ＭＢＬ社製）を１μｇ／ｍＬとなるように添加し、１時間培養した。対照として、上記エピトープペプチドを添加しない群も準備して、同様に培養した。その後、タンパク質輸送阻害剤（Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ、ＢＤ社製）を添加し、さらに一晩培養を行った。
(2) Immunization to mice and cell culture Six mice (18 mice in total) for each sample were administered at a dose of 200 μL / mouse. After shaving, it was subcutaneously administered twice every other week on the back. Seven days after the final immunization, mouse splenocytes were removed. Subsequently, each spleen cell was seeded at 2.0 × 10 7 cells / well in a 24-well plate and cultured. An epitope peptide (SEQ ID NO: 1: SIINFEKL) of MVA class I molecule of OVA was added to 1 μg / mL and cultured for 1 hour. As a control, a group not added with the epitope peptide was prepared and cultured in the same manner. Thereafter, a protein transport inhibitor (Golgi Plug, manufactured by BD) was added, and further overnight culture was performed.
（３）細胞の染色及びフローサイトメトリーによる評価
得られた細胞をＡＰＣ−ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色し、ホルマリン固定及び界面活性剤による膜透過処理を行った。その後、ＰＥ−ＩＦＮ−γ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で染色した。洗浄後フローサイトメトリーで評価した。結果を図７に示す。図７では、各サンプルで免疫したマウスから得られ、ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド存在下又は非存在下で培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞中のＩＦＮ−γを発現した細胞（ＯＶＡ特異的ＣＴＬ）の割合を示している。なお、図７において、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（−）」とはＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド非存在下で培養した細胞であり、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（＋）」とは、ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ分子のエピトープペプチド存在下で培養した細胞である。
(3) Cell staining and evaluation by flow cytometry The obtained cells were stained with an APC-CD8 antibody (manufactured by Biolegend), and subjected to membrane fixation treatment with formalin and a surfactant. Then, it dye | stained with PE-IFN-gamma antibody (made by Biolegend). After washing, it was evaluated by flow cytometry. The results are shown in FIG. In FIG. 7, cells expressing IFN-γ in CD8 positive T cells obtained from mice immunized with each sample and cultured in the presence or absence of epitope peptides of MHC class I molecules of OVA (OVA specific CTLs). ) Percentage. In FIG. 7, “Stimulation (−)” is a cell cultured in the absence of an epitope peptide of OVA MHC class I molecule, and “Stimulation (+)” is an epitope of OVA MHC class I molecule. Cells cultured in the presence of peptides.
図７から、Ｆｒｅｅ ＯＶＡ＜Ｏ／Ｗ型エマルション＜Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルションの順で、ＣＴＬの割合が上昇することが明らかとなった。これにより、従来の抗原が油中に封入されていないＯ／Ｗ型エマルションと比較して、抗原が油中に封入されているＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションのほうが、高い免疫誘導が可能であることが示唆された。 FIG. 7 revealed that the ratio of CTL increased in the order of Free OVA <O / W type emulsion <S / O / W type emulsion. Thereby, compared with the O / W type emulsion in which the antigen is not encapsulated in the oil, the S / O / W type emulsion in which the antigen is encapsulated in the oil can induce higher immunity. It has been suggested.
本実施形態の免疫組成物によれば、抗原とアジュバントとを同時に免疫細胞へ送達でき、免疫賦活作用に優れる。 According to the immune composition of the present embodiment, the antigen and the adjuvant can be simultaneously delivered to immune cells, and the immunostimulatory action is excellent.
１…親水性抗原、２…第１の界面活性剤、１０…親水性抗原−第１の界面活性剤複合体、１１…油相、１２…疎水性アジュバント、１３…第２の界面活性剤、１４…第３の界面活性剤、２０…第２の界面活性剤によって被覆された油相、２１…水相、１００…免疫組成物。
DESCRIPTION OF
Claims (9)
疎水性アジュバントと、
油相と、
第２の界面活性剤と、
水相と、
を含み、
前記親水性抗原−第１の界面活性剤複合体及び前記疎水性アジュバントが前記油相に溶解又は分散しており、
前記油相が前記第２の界面活性剤によって被覆されて水相に分散している免疫組成物。 A solid hydrophilic antigen-first surfactant complex in which a hydrophilic antigen is coated with a first surfactant;
A hydrophobic adjuvant;
Oil phase,
A second surfactant;
The water phase,
Including
The hydrophilic antigen-first surfactant complex and the hydrophobic adjuvant are dissolved or dispersed in the oil phase;
An immune composition wherein the oil phase is coated with the second surfactant and dispersed in an aqueous phase.
前記第３の界面活性剤が前記油相に分散している請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫組成物。 Further comprising a third surfactant;
The immune composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the third surfactant is dispersed in the oil phase.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018099129A JP2019202957A (en) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Immune composition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018099129A JP2019202957A (en) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Immune composition |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019202957A true JP2019202957A (en) | 2019-11-28 |
Family
ID=68726130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018099129A Pending JP2019202957A (en) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Immune composition |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2019202957A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113975224A (en) * | 2021-11-01 | 2022-01-28 | 中国药科大学 | Ionic liquid-reversed micelle drug-loading delivery system for epidermal desensitization treatment and preparation method and application thereof |
-
2018
- 2018-05-23 JP JP2018099129A patent/JP2019202957A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113975224A (en) * | 2021-11-01 | 2022-01-28 | 中国药科大学 | Ionic liquid-reversed micelle drug-loading delivery system for epidermal desensitization treatment and preparation method and application thereof |
| CN113975224B (en) * | 2021-11-01 | 2023-10-24 | 中国药科大学 | Ionic liquid-reversed micelle drug-loaded delivery system for epidermis desensitization treatment, and preparation method and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109464395B (en) | Gel emulsion in oil-in-water, preparation method and application thereof | |
| Tretiakova et al. | Liposomes as adjuvants and vaccine delivery systems | |
| Giddam et al. | Liposome-based delivery system for vaccine candidates: constructing an effective formulation | |
| JP5981997B2 (en) | Sustained release lipid initial preparation of pharmacologically active substance and pharmaceutical composition containing the same | |
| Slütter et al. | Adjuvant effect of cationic liposomes and CpG depends on administration route | |
| JP2018008964A (en) | Liposome composition comprising adjuvant that activates or increases activity of tlr2 and use thereof | |
| FR2726764A1 (en) | ADDITIVE FOR VACCINE COMPOSITION | |
| AU780054B2 (en) | Oil adjuvant vaccine | |
| US20190275145A1 (en) | Particulate vaccine formulations | |
| JP2003500365A (en) | Stability, biocompatibility optimized adjuvant (SBA) to enhance humoral and cellular immune responses | |
| JP2017522287A (en) | Surfactant-free oil-in-water emulsion and use thereof | |
| CN108743939A (en) | Cationic phospholipid-polymer hybrid nanoparticle vaccine adjuvant and preparation method and the application of antigen, MPLA and IMQ are carried altogether | |
| CN108324938B (en) | Granular adjuvant and preparation method and application thereof | |
| US10245319B2 (en) | Lymph node-targeting nanoparticles | |
| JP6487850B2 (en) | Adjuvant composition, vaccine composition containing the same, and method for producing them | |
| KR20170063780A (en) | Stable formulations of lipids and liposomes | |
| CN110430868A (en) | Include the nanoemulsions of material and application thereof based on imidazoquinolie | |
| KR20230004444A (en) | Microemulsion-based vaccine delivery system and manufacturing method and use thereof | |
| JP2019512551A (en) | Thin shell type polymer nanoparticles and use thereof | |
| KR102069670B1 (en) | Multi domain vesicle, preparing method of the same, and immunomodulatory compostion comprising the same | |
| Gogoll et al. | Solid nanoemulsion as antigen and immunopotentiator carrier for transcutaneous immunization | |
| JP2019202957A (en) | Immune composition | |
| CN108403659A (en) | A kind of hard emulsion receives microballoon and its preparation method and application | |
| EP4046650A1 (en) | Transdermal absorption-type patch | |
| KR101929973B1 (en) | Trisaccharide derivates, and their use as adjuvants |