JP2019180308A - Measuring method using nicking enzyme - Google Patents

Abstract

To provide a homogeneous assay method having a signal amplification system, using a nicking enzyme.SOLUTION: The present invention provides a measuring method for a measuring object using a probe A having an association site with a measuring object and a single-strand DNA, and a probe B having an association site with a measuring object and a single-strand DNA, wherein a double strand forming sequence is included in the single-strand DNAs of the probe A and probe B.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、ニッキングエンザイムを利用した測定方法に関するものである。   The present invention relates to a measurement method using a nicking enzyme.

酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）の原理を用いた測定法は、臨床診断や基礎研究の分野で広く用いられている。しかし、ＥＬＩＳＡによる測定では、標識化合物の非特異吸着を除去するための洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、操作に時間がかかること、また洗浄操作に耐えることのできない弱い相互作用のホスト分子は使用できないなどの問題があった。そのため、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスアッセイ方法が、生物医学研究の現場でのハイスループットスクリーニングに用いられる（非特許文献１）。従来のホモジニアスアッセイにおける検出方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）などの手法を用いて検出される。これらの検出系は、ＥＬＩＳＡなどの酵素を用いた検出系と異なり、反応系中でシグナルの増幅が行われないため、検出感度が問題となることがあった。   Measurement methods using the principle of enzyme immunoassay (ELISA) are widely used in the fields of clinical diagnosis and basic research. However, the measurement by ELISA requires a washing step (B / F separation) to remove non-specific adsorption of the labeled compound, and it takes time for the operation, and weak interaction that cannot withstand the washing operation. There was a problem that the host molecule could not be used. Therefore, a homogeneous assay method that does not require B / F separation is used for high-throughput screening in the field of biomedical research (Non-patent Document 1). Detection methods in conventional homogeneous assays are detected using techniques such as fluorescence resonance energy transfer (FRET), time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET), and fluorescence polarization (FP). These detection systems, unlike detection systems using enzymes such as ELISA, do not amplify signals in the reaction system, so detection sensitivity sometimes becomes a problem.

例えば非特許文献２では、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）の抗原結合領域近傍に修飾した蛍光分子がタンパク中のトリプトファンによる消光を受けることを利用して、抗原結合により蛍光回復するプローブを開発している。また非特許文献３では、ホスト分子と蛍光色素のピレンで修飾された２つのＤＮＡ鎖が、ゲスト分子との会合により二重鎖形成をして、結果としてピレンが近接位にくることで、ピレン由来の発光のスイッチングが起こるプローブを開発している。これらの測定方法は、どちらもＢ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスな系で機能するが、シグナル増幅系を有する測定系ではなかった。   For example, Non-Patent Document 2 developed a probe that recovers fluorescence by antigen binding by utilizing the fact that a fluorescent molecule modified in the vicinity of the antigen binding region of a single-chain antibody (ScFv) is quenched by tryptophan in the protein. Yes. In Non-Patent Document 3, two DNA strands modified with a host molecule and pyrene of a fluorescent dye form a double strand by association with a guest molecule, and as a result, pyrene comes close to the pyrene. We are developing probes that cause luminescence switching. Both of these measurement methods function in a homogeneous system that does not require B / F separation, but were not measurement systems having a signal amplification system.

シグナル増幅可能な、ホモジニアス測定系として特許文献１に記載の方法があげられる。特許文献１に記載の方法は分子間の会合をＲＮＡの増幅にのみ変換する方法であったが、一般的にＲＮＡはＤＮＡと比較して安定性が低いことが知られている。そのため、特許文献１に記載の測定方法を、ＲＮＡ分解酵素を多量に含む血液成分の測定に適応することは困難であると考えられた。   An example of a homogeneous measurement system capable of signal amplification is the method described in Patent Document 1. The method described in Patent Document 1 is a method that converts the association between molecules only to amplification of RNA, but it is generally known that RNA is less stable than DNA. Therefore, it was considered difficult to apply the measurement method described in Patent Document 1 to the measurement of blood components containing a large amount of RNase.

特開２０１７−１１８８６０号公報JP 2017-118860 A

化学と生物 Ｖｏｌ．３８ Ｎｏ．８， ２０００．５５５Chemistry and Biology Vol. 38 No. 8, 200.555 Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１，１３３（４３），１７３８６J. et al. Am. Chem. Soc. , 2011, 133 (43), 17386 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００８，１９，１１３２Bioconjugate Chem. , 2008, 19, 1132

本発明の目的は、シグナルの増幅が可能な、ホモジニアス測定方法を提供することである。   An object of the present invention is to provide a homogeneous measurement method capable of amplifying a signal.

上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＡ、及び
測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＢ、
を用いた測定対象の測定方法であって、
二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
ニッキングエンザイム認識配列と増幅配列は、それぞれプローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の工程を含む方法：
（ｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させる工程、
（ｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡの二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｖ）ニッキングエンザイムにより、下流の増幅配列の前にニックを形成する工程、
（ｖ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼよるニックからのＤＮＡ伸長反応により、一本鎖ＤＮＡの遊離、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖形成、及びニッキングエンザイムによるニック形成を繰り返し行う工程、
（ｖｉ）増幅したＤＮＡを検出する工程。
（２）（１）で遊離した一本鎖ＤＮＡと二重鎖形成可能な第二の二重鎖形成配列を有するプローブＣを用いた測定方法であって、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む方法：
（ｉ）遊離一本鎖ＤＮＡと第二の二重鎖形成配列による二重鎖形成させる工程、
（ｉｉ）（ｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ＲＮＡプロモーター配列、第二の二重鎖配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより第二の増幅配列を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成する工程、
（ｉｖ）増幅したＲＮＡを検出する工程。
（３）ホモジニアス系で行われる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）一定温度条件下で行われる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。 This invention made | formed in view of the said subject includes the following aspects.
(1) Probe A having an association site with a measurement target and single-stranded DNA, and Probe B having an association site with the measurement target and single-stranded DNA,
A measuring method of a measuring object using
A double-stranded forming sequence is contained in the single-stranded DNA of probe A and probe B;
The nicking enzyme recognition sequence and the amplification sequence are each contained in single-stranded DNA of probe A or probe B, and include the following steps (i) to (vi):
(I) a step of associating an association site of probe A and an association site of probe B with a measurement target;
(Ii) a step of hybridizing the double strand forming sequence of probe A and the double strand forming sequence of probe B to form a double strand of DNA;
(Iii) a step of forming a double strand of a nicking enzyme recognition sequence by extending DNA with a DNA polymerase starting from the double strand formed in (ii),
(Iv) forming a nick before the downstream amplified sequence by a nicking enzyme;
(V) a step of repeatedly performing release of single-stranded DNA, double-strand formation of a nicking enzyme recognition sequence, and nick formation by a nicking enzyme by a DNA extension reaction from a nick by strand-displacing DNA polymerase;
(Vi) A step of detecting the amplified DNA.
(2) A measurement method using a probe C having a second double-strand forming sequence capable of forming a double strand with the single-stranded DNA released in (1), wherein the following (i) to (iv) A method comprising the steps of:
(I) a step of forming a double strand by a free single-stranded DNA and a second double strand forming sequence;
(Ii) a step of forming a double strand of an RNA promoter sequence and a second double strand sequence by extending the DNA with a DNA polymerase starting from the double strand formed in (i),
(Iii) a step of repeatedly synthesizing RNA with RNA polymerase using the second amplified sequence as a template,
(Iv) A step of detecting the amplified RNA.
(3) The method according to (1) or (2), which is performed in a homogeneous system.
(4) The method according to any one of (1) to (3), which is performed under a constant temperature condition.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

（１）測定方法
本発明の測定方法は、測定対象の有無を測定する定性測定であってもよく、また測定対象の量を測定する定量測定であってもよい。本発明の測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、いわゆるホモジニアス系で行われることが好ましい。 (1) Measurement method The measurement method of the present invention may be qualitative measurement for measuring the presence or absence of a measurement target, or may be quantitative measurement for measuring the amount of the measurement target. The measurement method of the present invention is preferably carried out in a so-called homogeneous system that does not require B / F separation.

（２）プローブ
本発明に用いられるプローブＡ及びプローブＢは、測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するものである。会合部位とＤＮＡ鎖の結合は３’末端側、５’末端側のどちらで行っても良く、反応原理に応じて適宜選択すればよい。例えばプローブＡとプローブＢにおいて、一方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しており、他方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合しているものをあげることができ、これは例えば後述の測定原理に用いることができる。 (2) Probe The probe A and the probe B used in the present invention have an association site with a measurement target and single-stranded DNA. The association site and the DNA strand may be bound at either the 3 ′ end side or the 5 ′ end side, and may be appropriately selected according to the reaction principle. For example, in probe A and probe B, one probe binds to the association site and the 5 ′ end side of the single-stranded DNA, and the other probe binds to the association site and the 3 ′ end side of the single-stranded DNA. This can be used for the measurement principle described later, for example.

会合部位と一本鎖ＤＮＡとは直接結合されていてもよく、またスペーサー等を介して間接的に結合されていてもよい。その結合方法は特に限定されないが、例えば、非特許文献３に記載のように、会合部位をホスホロアミダイト化して、ＤＮＡ固相合成に組み込むことで一本鎖ＤＮＡと結合させてもよいし、固相合成により一本鎖ＤＮＡ鎖中にアミノ基、チオール基などの反応性の官能基を導入し、会合部位と反応させてもよい。スペーサーの種類も特に限定されないが、例えばポリオキシエチレン（ＰＥＧ）鎖をスペーサーとして用いてもよいし、ＤＮＡ鎖をスペーサーとして用いてもよい。このスペーサーとして用いられるＤＮＡ鎖は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は会合部位と結合している側のＤＮＡ鎖に二重鎖形成配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合していてもよく、また反対に会合部位と結合しているＤＮＡ鎖の相補鎖側に二重鎖形成配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合していてもよい。   The association site and the single-stranded DNA may be directly bound, or may be indirectly bound via a spacer or the like. The binding method is not particularly limited. For example, as described in Non-Patent Document 3, the association site may be phosphoramidite and incorporated into DNA solid phase synthesis to bind to single-stranded DNA. A reactive functional group such as an amino group or a thiol group may be introduced into a single-stranded DNA strand by solid-phase synthesis and reacted with an association site. The type of the spacer is not particularly limited, but for example, a polyoxyethylene (PEG) chain may be used as the spacer, or a DNA chain may be used as the spacer. The DNA strand used as the spacer may be single-stranded or double-stranded. In the case of a double strand, a single-stranded DNA having a double-strand forming sequence may be bound to the DNA strand that is bound to the association site, and conversely the DNA strand that is bound to the association site. A single-stranded DNA having a double-stranded forming sequence may be bound to the complementary strand side.

（３）会合部位
会合部位は、プローブＡとプローブＢに含まれるものであり、測定対象と会合しうるものであればよく特に限定されない。例えば、会合部位としては、ホスト分子として用いられる小分子（シクロデキストリン、クラウンエーテル、ボロン酸など）や、測定対象と親和性を有するタンパク（レクチン、抗体など）または親和性を有する核酸（アプタマーなど）、アビジン又はビオチン等を用いればよい。プローブＡとプローブＢが共に測定対象に会合した状態をとることができる限り、プローブＡとプローブＢの会合部位は同一のものであっても異なっていてもよい。またプローブＡとプローブＢの会合部位は、測定対象に対してどちらを先に会合させてもよく、また同時に会合させてもよい。会合部位の修飾方法は特に限定されない。例えば小分子を修飾する際には、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２００５（３８）４７８０に記載の方法を用いることが可能である。ＤＮＡ固相合成時に３’末端にアミノ基を修飾しておき、スクシニミジルエステル化した小分子と反応させてもよいし、ホスホロアミダイト化した小分子を用いてＤＮＡ固相合成時に５’末側を修飾してもよい。 (3) Association site The association site is not particularly limited as long as it is included in the probe A and the probe B and can associate with the measurement target. For example, as an association site, a small molecule (cyclodextrin, crown ether, boronic acid, etc.) used as a host molecule, a protein (lectin, antibody, etc.) having affinity with a measurement object or an affinity nucleic acid (aptamer, etc.) ), Avidin or biotin may be used. As long as the probe A and the probe B can both be associated with the measurement target, the association sites of the probe A and the probe B may be the same or different. Moreover, as for the association site | part of the probe A and the probe B, whichever may be made to associate previously with respect to a measuring object, you may make it associate simultaneously. The method for modifying the association site is not particularly limited. For example, when modifying small molecules, Chem Commun. 2005 (38) 4780 can be used. An amino group may be modified at the 3 ′ end during DNA solid-phase synthesis and reacted with a succinimidyl esterified small molecule, or 5 ′ during DNA solid-phase synthesis using a phosphoramididized small molecule. The terminal side may be modified.

（４）二重鎖形成配列
本発明における二重鎖形成配列は、プローブＡとプローブＢの一本鎖ＤＮＡ中にそれぞれ存在するものであるが、それぞれの一本鎖ＤＮＡ中の位置は特に限定されるものではない。それらは互いに相補的な配列を有するものであり、そのＤＮＡ鎖長は特に限定されないが、好ましくは３〜１０塩基、さらに好ましくは４〜６塩基である。 (4) Double-strand forming sequence The double-strand forming sequence in the present invention is present in the single-stranded DNA of probe A and probe B, respectively, but the positions in the single-stranded DNA are particularly limited. Is not to be done. They have sequences complementary to each other, and their DNA chain length is not particularly limited, but is preferably 3 to 10 bases, more preferably 4 to 6 bases.

（５）ニッキングエンザイム認識配列
本発明においてニッキングエンザイム配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ニッキングエンザイムに認識される配列であればよい。 (5) Nicking enzyme recognition sequence In the present invention, the nicking enzyme sequence is contained in the single-stranded DNA of probe A or probe B, but the position thereof is not particularly limited. The sequence is not particularly limited as long as it is a sequence recognized by a nicking enzyme.

（６）増幅配列
本発明における増幅配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列はＤＮＡポリメラーゼの鋳型となるアンチセンス鎖又はセンス鎖であればよく、特に限定されない。 (6) Amplified sequence The amplified sequence in the present invention is contained in the single-stranded DNA of probe A or probe B, but the position thereof is not particularly limited. The sequence is not particularly limited as long as it is an antisense strand or a sense strand that serves as a template for DNA polymerase.

（７）検出
本発明におけるシグナルの検出は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって遊離されたＤＮＡ鎖を検出することで行えばよく、特に限定されない。例えばＤＮＡの検出にはモレキュラービーコンやＩＮＡＦプローブなどの配列特異的に結合し、蛍光変化する検出系を用いてもよいし、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどインターカレーター性の蛍光色素を用いてもよい。また、合成されるＤＮＡ配列がＤＮＡｚｙｍｅ活性を有するように配列を設計し、その酵素活性を測定することでシグナルの検出を行なってもよい。また核酸クロマトの方法を用いて、目視による検出を行ってもよい。 (7) Detection The detection of the signal in the present invention may be performed by detecting the DNA strand released by the strand displacement type DNA polymerase, and is not particularly limited. For example, for detection of DNA, a detection system that binds specifically to a molecule such as a molecular beacon or an INAF probe and changes fluorescence may be used, or an intercalator fluorescent dye such as SYBRgreen may be used. Alternatively, the signal may be detected by designing the sequence so that the synthesized DNA sequence has DNAzyme activity and measuring the enzyme activity. Further, visual detection may be performed using a nucleic acid chromatography method.

検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてよい。また本実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０ 東ソー製）を用いてもよい。   If a detection device is required, a real-time PCR device may be used. In addition, a TRCR real-time monitor (TRCRapid-160 manufactured by Tosoh Corporation) used in this example may be used.

（８）酵素
本発明の測定方法に用いる酵素として、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ニッキングエンザイム活性を有する酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いることができる。測定原理１（図１に例示）においての必須酵素は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、及びニッキングエンザイム活性を有する酵素である。測定原理２（図２に例示）においての必須酵素は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ニッキングエンザイム活性を有する酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である。ニッキングエンザイムは２本鎖ＤＮＡの１本のＤＮＡだけを切断するニッキングエンドヌクレアーゼを用いればよい。例えばＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、Ｔ４などを用いてよく、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｃｓａ、９６−７などを用いてよく、ニッキングエンザイムとしては、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩなどを用いてよく、ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、ＳＰ６などを用いてよい。特に本発明では、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとしては９６−７を、ニッキングエンザイムとしてはＮｔ．ＡｌｗＩを、ＲＮＡポリメラーゼとしてはＴ７を用いることが好ましい。 (8) Enzyme As the enzyme used in the measurement method of the present invention, an enzyme having DNA polymerase activity, an enzyme having strand displacement DNA polymerase activity, an enzyme having nicking enzyme activity, and an enzyme having RNA polymerase activity can be used. . Essential enzymes in measurement principle 1 (illustrated in FIG. 1) are an enzyme having strand displacement type DNA polymerase activity and an enzyme having nicking enzyme activity. Essential enzymes in measurement principle 2 (illustrated in FIG. 2) are an enzyme having a strand displacement type DNA polymerase activity, an enzyme having a nicking enzyme activity, and an enzyme having an RNA polymerase activity. The nicking enzyme may be a nicking endonuclease that cleaves only one DNA of double-stranded DNA. For example, T7, T4, etc. may be used as the DNA polymerase, phi29, Bst, Csa, 96-7, etc. may be used as the strand displacement type DNA polymerase, and Nt. AlwI, Nt. BspQI, Nt. BstNBI or the like may be used, and T7, SP6, or the like may be used as the RNA polymerase. In particular, in the present invention, 96-7 is used as a strand displacement DNA polymerase, and Nt. It is preferable to use AlwI and T7 as the RNA polymerase.

（９）測定原理１
本発明の測定原理の一例を模式図（図１）に示す。プローブＡは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの５’側に向かって二重鎖形成配列、ニッキングエンザイム認識配列、増幅配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。なお（９−３）で用いられるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有していてもいなくてもよく、例えば（９−５）で用いられる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと同一でもよい。
（９−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（９−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（９−３）（９−２）で形成されたＤＮＡ二重鎖を起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（９−４）ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖が形成されたことで、ニッキングエンザイムにより、下流の２本鎖ＤＮＡの１本のＤＮＡが切断される。
（９−５）１本のＤＮＡが切断された箇所（ニック）から、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こり、ニックより下流の１本鎖ＤＮＡが遊離する。
（９−６）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によりニッキングエンザイム認識配列が再び形成される。
（９−７）９−５，９−６が繰り返し行われ、繰り返し一本鎖ＤＮＡが遊離され、遊離したＤＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。
（１０）測定原理２
本発明の測定感度を上昇させるために、遊離するＤＮＡをプライマーにして、ＲＮＡプロモーター配列を含むプローブＣと二重鎖を形成させ、ＲＮＡ増幅反応を行うことも可能である。その測定原理の一例を模式図（図２）に示す。図２において、プローブＡ、プローブＢは（９）に記載ものを用い、プローブＣは一本鎖ＤＮＡの５’側末端から遊離ＤＮＡとの第二の二重鎖形成配列、ＲＮＡプロモーター配列、第二の増幅配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１０−１）（９−１）〜（９−７）に記載の方法で一本鎖ＤＮＡが繰り返し遊離される。
（１０−２）遊離した一本鎖ＤＮＡとプローブＣ上の第二の二重鎖形成配列の間で二重鎖が形成される。
（１０−３）（１０−２）で形成されたＤＮＡ二重鎖を起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、ＲＮＡプロモーター配列の二重鎖、第二の増幅配列の二重鎖が形成される。
（１０−４）ＲＮＡプロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼによって、第二の増幅配列を鋳型としてＲＮＡ増幅が繰り返し行われる。
（１０−５）増幅したＲＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。
（１１）第二の二重鎖形成配列
本発明において第二の二重鎖形配列は測定感度を増幅するため、プローブＣを用いる測定原理２において必要な配列となる。第二の二重鎖形成配列は測定原理１により繰り返し合成される一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に相補的な配列を有すればよい。
（１２）第二の増幅配列
本発明において第二の増幅配列は測定感度を増幅するため、プローブＣを用いる測定原理２において必要な配列となる。第二の増幅配列はプローブＣのＲＮＡプロモーター配列の下流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによって増幅される配列の鋳型の配列であればよい。
（１３）ＲＮＡプロモーター配列
本発明においてプロモーター配列は、測定感度を増幅するため、プローブＣを用いる測定原理２において必要な配列となる。プロモーター配列はプローブＣに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーターであればよい。具体的には、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。 (9) Measurement principle 1
An example of the measurement principle of the present invention is shown in a schematic diagram (FIG. 1). Probe A has an association site bound to the 5 ′ end of single-stranded DNA, contains a double-stranded forming sequence on the 3 ′ side of single-stranded DNA, and probe B associates with the 3′-end of single-stranded DNA. The case where the site is bound and includes a double-stranded forming sequence, a nicking enzyme recognition sequence, and an amplification sequence toward the 5 ′ side of the single-stranded DNA will be described as an example. It is not limited. The DNA polymerase used in (9-3) may or may not have strand displacement activity, and may be the same as the strand displacement type DNA polymerase used in (9-5), for example.
(9-1) The association site of probe A and probe B is associated with the substance to be measured.
(9-2) As a result, the double strand forming sequences in the probe A and the probe B are arranged at close positions, and a DNA double strand is formed.
(9-3) Starting from the DNA double strand formed in (9-2), DNA is extended by DNA polymerase. As a result, the double strand of the nicking enzyme recognition sequence and the duplex of the amplified sequence are obtained. A chain is formed.
(9-4) By forming the double strand of the nicking enzyme recognition sequence, one DNA of the downstream double-stranded DNA is cleaved by the nicking enzyme.
(9-5) The elongation reaction by the strand displacement type DNA polymerase occurs from the position (nick) where one DNA is cut, and the single-stranded DNA downstream from the nick is released.
(9-6) The nicking enzyme recognition sequence is formed again by the extension reaction with DNA polymerase.
(9-7) 9-5 and 9-6 are repeatedly performed, single-stranded DNA is repeatedly released, and the released DNA is detected with a molecular beacon or the like.
(10) Measurement principle 2
In order to increase the measurement sensitivity of the present invention, it is also possible to form a double strand with the probe C containing the RNA promoter sequence using the liberated DNA as a primer, and perform an RNA amplification reaction. An example of the measurement principle is shown in a schematic diagram (FIG. 2). In FIG. 2, probe A and probe B are the same as those described in (9), and probe C is a second double-stranded forming sequence with the free DNA from the 5 ′ end of the single-stranded DNA, an RNA promoter sequence, Although the case where two amplification sequences are included will be described as an example, the configuration of each probe and the sequence order are not limited thereto.
(10-1) Single-stranded DNA is repeatedly released by the method described in (9-1) to (9-7).
(10-2) A duplex is formed between the released single-stranded DNA and the second duplex-forming sequence on probe C.
(10-3) Starting from the DNA double strand formed in (10-2), DNA is extended by DNA polymerase. As a result, the double strand of the RNA promoter sequence and the second amplified sequence A duplex is formed.
(10-4) When the double strand of the RNA promoter sequence is formed, RNA amplification is repeatedly performed by RNA polymerase using the second amplified sequence as a template.
(10-5) The amplified RNA is detected with a molecular beacon or the like.
(11) Second double-stranded forming sequence In the present invention, the second double-stranded sequence is a necessary sequence in the measurement principle 2 using the probe C in order to amplify the measurement sensitivity. The second double-stranded forming sequence may have a complementary sequence at the 3 ′ end of the single-stranded DNA sequence synthesized repeatedly according to measurement principle 1.
(12) Second Amplified Sequence In the present invention, the second amplified sequence is a sequence necessary for the measurement principle 2 using the probe C in order to amplify the measurement sensitivity. The second amplification sequence may be a template sequence that is located downstream of the RNA promoter sequence of probe C and that is amplified by RNA polymerase.
(13) RNA promoter sequence In the present invention, the promoter sequence is a sequence required in the measurement principle 2 using the probe C in order to amplify the measurement sensitivity. The promoter sequence is contained in probe C, but its position is not particularly limited. The sequence is not particularly limited as long as it is a promoter capable of transcription to RNA in the presence of RNA polymerase. Specific examples include T7 promoter, SP6 promoter, T3 promoter and the like. In particular, in the present invention, it is preferable to use a T7 promoter.

ホモジニアス系で行われる測定においても、シグナル増幅ができないために、目標の感度に達しないことがある。本発明の測定法では、ＤＮＡポリメラーゼ、及びニッキングエンザイムより合成、遊離された核酸を測定するため、シグナルを増幅して検出することが可能である。このため、高感度な測定が可能である。   Even in a measurement performed in a homogeneous system, the target sensitivity may not be reached because signal amplification is not possible. In the measurement method of the present invention, a nucleic acid synthesized and released from a DNA polymerase and a nicking enzyme is measured, so that the signal can be amplified and detected. For this reason, highly sensitive measurement is possible.

本発明の測定原理１の概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the measurement principle 1 of this invention. 本発明の測定原理２の概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the measurement principle 2 of this invention. 実施例１でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化Fluorescence intensity change per hour when streptavidin was detected in Example 1

実施例１
以下、本発明の実施例を測定原理２（図２）における測定系において詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Example 1
Hereinafter, examples of the present invention will be described in detail in the measurement system in the measurement principle 2 (FIG. 2), but the present invention is not limited to these.

（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号１）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号２）の３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢ、プローブＣ（配列番号３）は、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＤＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号１の５〜１０位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号２の２６〜３１位）、ニッキングエンザイム認識配列（配列番号２の２１〜２５位）、増幅配列（配列番号２の１〜１６位）を含むよう設計し、プローブＣにおけるＤＮＡ配列は、第二の増幅配列（配列番号３の１〜２０位）、ＲＮＡプロモーター配列（配列番号３の２１〜４８位）、第二の増幅配列（配列番号３の３７〜４８位）を含むよう設計した。
（２）蛍光プローブの作製
配列番号３のＤＮＡ配列の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾した蛍光プローブ（配列番号４）は、グライナー社による受託合成により作製した。 (1) Probe preparation Probe A modified with biotin (association site) at the 5 ′ end of single-stranded DNA (SEQ ID NO: 1), and biotin (association site) modified at the 3 ′ end of single-stranded DNA (SEQ ID NO: 2) Probe B and probe C (SEQ ID NO: 3) were prepared by contract synthesis by Greiner. The DNA sequence in probe A is designed to include a double strand forming sequence (positions 5 to 10 in SEQ ID NO: 1), and the DNA sequence in probe B is a double strand forming sequence (positions 26 to 31 in SEQ ID NO: 2), Designed to include a nicking enzyme recognition sequence (positions 21-25 of SEQ ID NO: 2) and an amplification sequence (positions 1-16 of SEQ ID NO: 2), the DNA sequence in probe C is the second amplification sequence (SEQ ID NO: 3) 1 to 20 positions), an RNA promoter sequence (positions 21 to 48 of SEQ ID NO: 3), and a second amplification sequence (positions 37 to 48 of SEQ ID NO: 3).
(2) Preparation of fluorescent probe A fluorescent probe (SEQ ID NO: 4) in which the 5 'end of the DNA sequence of SEQ ID NO: 3 was modified with FAM and the 3' end with BHQ1 was prepared by contract synthesis by Greiner.

（３）ストレプトアビジンの測定
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、プローブＣ、蛍光プローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。 (3) Measurement of streptavidin Streptavidin known to be associated with biotin was measured using probe A, probe B, probe C, and fluorescent probe. Details such as enzyme concentration and substrate concentration in the measurement solution are shown below.

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）１４４Ｕ／ａｓｓａｙ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン製）８Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ １０Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）、ＤＴＴ ５ｍＭ、ＮＴＰ ３ｍＭ、ｄＮＴＰ ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２Ｕ／ｕＬ、プローブＡ ２００ｎＭ、プローブＢ ２００ｎＭ、プローブＣ ２００ｎＭ、蛍光プローブ ３００ｎＭ。反応温度４２℃。   T7 RNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) 144 U / assay, 96-7 DNA polymerase (manufactured by Nippon Gene) 8 U / assay, Nt. AlwI 10 U / assay, T7 RNA polymerase Buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), DTT 5 mM, NTP 3 mM, dNTP 0.25 mM, RNase Inhibitor 0.2 U / uL, probe A 200 nM, probe B 200 nM, probe C 200 nM, fluorescent probe 300 nM. Reaction temperature 42 ° C.

上記測定溶液中に図３に示す濃度のストレプトアビジンを添加し、蛍光プローブ由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図３に示す。その結果、ストレプトアビジン濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるニッキングエンザイム認識配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。   Streptavidin with the concentration shown in FIG. 3 was added to the measurement solution, and the fluorescence intensity derived from the fluorescent probe was measured using TRCRapid-160 (manufactured by Tosoh Corp.) every time. The results are shown in FIG. As a result, it was confirmed that the amplification of fluorescence intensity per hour was increased according to the streptavidin concentration. This is presumably because the amount of double strands of the nicking enzyme recognition sequence formed by the association of streptavidin and biotin in each probe increased.

以上の結果から、本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。   From the above results, it was confirmed that the measurement object can be measured by the method of the present invention.

本発明の測定原理１の概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the measurement principle 1 of this invention. 本発明の測定原理２の概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the measurement principle 2 of this invention. 実施例１でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化Fluorescence intensity change per hour when streptavidin was detected in Example 1

Claims (4)

測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＡ、及び
測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＢ、
を用いた測定対象の測定方法であって、
二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
ニッキングエンザイム認識配列と増幅配列は、それぞれプローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の工程を含む方法：
（ｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させる工程、
（ｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡの二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｖ）ニッキングエンザイムにより、下流の増幅配列の前にニックを形成する工程、
（ｖ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼよるニックからのＤＮＡ伸長反応により、一本鎖ＤＮＡの遊離、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖形成、及びニッキングエンザイムによるニック形成を繰り返し行う工程、
（ｖｉ）増幅したＤＮＡを検出する工程。 A probe A having an association site with a measurement object and single-stranded DNA, and a probe B having an association site with the measurement object and single-stranded DNA,
A measuring method of a measuring object using
A double-stranded forming sequence is contained in the single-stranded DNA of probe A and probe B;
The nicking enzyme recognition sequence and the amplification sequence are each contained in single-stranded DNA of probe A or probe B, and include the following steps (i) to (vi):
(I) a step of associating an association site of probe A and an association site of probe B with a measurement target;
(Ii) a step of hybridizing the double strand forming sequence of probe A and the double strand forming sequence of probe B to form a double strand of DNA;
(Iii) a step of forming a double strand of a nicking enzyme recognition sequence by extending DNA with a DNA polymerase starting from the double strand formed in (ii),
(Iv) forming a nick before the downstream amplified sequence by a nicking enzyme;
(V) a step of repeatedly performing release of single-stranded DNA, double-strand formation of a nicking enzyme recognition sequence, and nick formation by a nicking enzyme by a DNA extension reaction from a nick by strand-displacing DNA polymerase;
(Vi) A step of detecting the amplified DNA. 請求項１で遊離した一本鎖ＤＮＡと二重鎖形成可能な第二の二重鎖形成配列を有するプローブＣを用いた測定方法であって、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む方法：
（ｉ）遊離一本鎖ＤＮＡと第二の二重鎖形成配列による二重鎖形成させる工程、
（ｉｉ）（ｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ＲＮＡプロモーター配列、第二の二重鎖配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより第二の増幅配列を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成する工程、
（ｉｖ）増幅したＲＮＡを検出する工程。 A measurement method using a probe C having a second double-strand forming sequence capable of forming a double strand with the single-stranded DNA released in claim 1, comprising the following steps (i) to (iv): Including:
(I) forming a double strand by a free single-stranded DNA and a second double strand-forming sequence;
(Ii) a step of forming a double strand of an RNA promoter sequence and a second double strand sequence by extending DNA with a DNA polymerase starting from the double strand formed in (i),
(Iii) a step of repeatedly synthesizing RNA with RNA polymerase using the second amplified sequence as a template,
(Iv) A step of detecting the amplified RNA. ホモジニアス系で行われる、請求項１又は２に記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, which is carried out in a homogeneous system. 一定温度条件下で行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the method is performed under a constant temperature condition.

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