JP2019163283A - Tlr5アゴニストタンパク質の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
従って、新たな概念のエントリモド及びその生産方法が開発される必要がある。
本ステップは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップである。遺伝子の結合及びベクター製造などは、当業界に広く知られている技術が利用できるので、これについての具体的な記載は省略する。
本ステップにおいて、前記融合遺伝子は、一例として、配列番号7の核酸配列を有するものであってよい。
本ステップにおいて、前記精製用タグは、様々な精製用タグを用いることができ、一例としては、ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合して形成されたリシンタグを用いることができる。
本ステップは、前記で製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップである。
本ステップは、融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップである。
本ステップにおいては、融合タンパク質の融合されている精製用タグを利用して分離精製を遂行することができるが、精製用タグが結合するカラム(レジン)を用いて目的とする融合タンパク質だけを結合させ、残りの物質は溶出させて分離精製が可能なものである。
本ステップは、前記で回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、TLR5アゴニストタンパク質を回収するステップである。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素の処理は、一例として、融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することができ、また、融合タンパク質をカラムから溶離(elution)させた後、処理することもできる。
本ステップにおいて、前記ユビキチン切断酵素は、様々なものがあるが、一例として、USPまたはUCHであってよい。
(1)K6UbKMRC011の遺伝子合成
配列番号2のアミノ酸配列(配列番号1の核酸配列により暗号化)を有するポリペプチドと、配列番号4のアミノ酸配列(配列番号3の核酸配列により暗号化)を有するポリペプチドとは、配列番号6のアミノ酸配列(配列番号5により暗号化)を有するポリペプチド(リンカー)を媒介として結合された後、折りたたまれるようになると、TLR5に結合できるD0ドメイン及びD1ドメインを形成することとなる。
増幅されたK6UbKMRC011遺伝子を、IPTGにより発現調節され、tacプロモーターを含有しているpAP(AP Technology社保有)発現プラスミドのNdeIとBamHI制限酵素位置に挿入して、pAP−K6UbKMRC011プラスミドを作製した(図4参照)。
pAP−K6UbKMRC011プラスミドで大腸菌TG1(Escherichia coli TG1)を形質転換して、K6UbKMRC011を発現する大腸菌TG1/pAP−K6UbKMRC011(Escherichia coli TG1/pAP−K6UbKMRC011)を最終的に作製した。
前記実施例において作製した大腸菌TG1/pAP−K6UbKMRC011を利用してK6UbKMRC011の生産能を確認することを試みた。培養のために、酵母抽出物5g/L、トリプトン10g/L、塩化ナトリウム10g/L組成の培地を利用した。500mLバッフル付きフラスコ(baffled flask)を利用して、37℃、200rpmで600nmの吸光度が0.5〜1.0になるまで培養した後、IPTGを1mMになるように添加してK6UbKMRC011の発現を誘導後、4時間培養した。
大腸菌で発現されたK6UbKMRC011は、不溶性内包体で発現されたので、生物学的活性回復のために固相リフォールディング(solid−phase refolding)を遂行した。超音波破砕機で破砕された大腸菌を遠心分離(12,000rpm、20分)した後、得られたK6UbKMRC011の内包体を緩衝液A(pH7.0、50mM Sodium phosphate、8M urea)で可溶化させ、その後、緩衝液Aで平衡化されたカチオン交換樹脂SP Sepharose FF(GE Healthcare)が充填されたカラムに仕込んで、可溶化されたK6UbKMRC011が静電気的引力によりカチオン交換樹脂に結合されるようにした。緩衝液B(pH7.0、50mM Sodium phosphate)を前記カラムに仕込んで尿素(urea)を除去することにより、カチオン交換樹脂に結合されたK6UbKMRC011のリフォールディングを誘導した。緩衝液C(pH7.0、50mM Sodium phosphate、1M NaCl)を前記カラムに仕込んで、リフォールディングK6UbKMRC011がカチオン交換樹脂から溶出され得るようにし、各分画をSDS−PAGEで分析した(図6参照)。
また、分離されたKMRC011タンパク質のN−末端配列を「N−末端シークエンシング」を通して確認した結果、KMRC011タンパク質のN−末端アミノ酸配列「A−Q−V−I−N」が完全に維持されたままK6Ubが分離されて離れることを確認することができた。
目的タンパク質から融合パートナーを除去する場合は、除去に用いられた酵素が目的タンパク質の構造に影響してはならないが、本発明においてユビキチン切断酵素は、目的タンパク質であるKMRC011の構造に全く影響を与えないことが確認された。
固相リフォールディングされたK6UbKMRC011を溶出せず、カチオン交換樹脂に静電気的結合された状態でUSP1溶液(10mg/L)を循環させることで、KMRC011のみ分離及び精製することを試みた(図8参照)。
本実施例においては、前記実施例3に記載のUSP1の他に様々な種類のユビキチン切断酵素をK6UbKMRC011に適用し、目的タンパク質であるKMRC011が完全にK6Ubから分離されるかを確認することを試みた。
Claims (21)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質にユビキチンが結合されていることを特徴とする、融合タンパク質。
- 前記TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質は、
配列番号2に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号6に記載のリンカーを媒介として結合されたことを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチンは、
TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質のアミノ末端に結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項4に記載の融合タンパク質。 - 前記ユビキチン切断酵素は、
USPまたはUCHであることを特徴とする、請求項4に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、
ユビキチンのアミノ末端に精製用タグがさらに結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記精製用タグは、
ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合して形成されたリシンタグであることを特徴とする、請求項7に記載の融合タンパク質。 - 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが結合されて形成されたTLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子に、ユビキチンを暗号化する遺伝子が結合されており、前記ユビキチン暗号化遺伝子に精製用タグを暗号化する遺伝子が結合されて形成された融合遺伝子を含むベクターを製造するステップ(a);
前記製造したベクターでホストを形質転換した後、前記融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を生産するステップ(b);
前記融合タンパク質に融合されている精製用タグが結合するカラムに、前記で生産された融合タンパク質を結合させて融合タンパク質を回収するステップ(c);及び
前記回収した融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理し、ユビキチンが結合した部位を切断した後、TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を回収するステップ(d);を含むことを特徴とする、TLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質は、
配列番号2に記載のアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとが配列番号6に記載のリンカーを媒介として結合されたことを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチンを暗号化する遺伝子は、TLR5アゴニスト(agonist)タンパク質を暗号化する遺伝子の5’末端に結合し、
前記精製用タグを暗号化する遺伝子は、前記ユビキチンを暗号化する遺伝子の5’末端に結合することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ホストは、
大腸菌であることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(d)のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムに結合させた状態で処理することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(d)のユビキチン切断酵素の処理は、
融合タンパク質をカラムから溶離(elution)させた後、処理することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記融合遺伝子は、
配列番号7の核酸配列を有することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチンは、
ユビキチンの一部分であり、ユビキチン切断酵素により切断されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記精製タグは、
ヒスチジンタグ(His−tag)またはリシン(lysine)が6個連続的に結合したリシンタグであることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(c)は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディング(unfolding)した後、カラムに結合させてリフォールディング(refolding)することで融合タンパク質を回収することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ステップ(c)は、
生産された融合タンパク質をアンフォールディング(unfolding)し、リフォールディング(refolding)した後、カラムに結合させて融合タンパク質を回収することを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。 - 前記ユビキチン切断酵素は、
USPまたはUCHであることを特徴とする、請求項9に記載のTLR5アゴニストタンパク質の生産方法。
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