JP2019154314A - キャピラリーチップ及びこれを備える装置、並びに細胞への外来物質の導入方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップを提供すること。【解決手段】キャピラリーチップ20は、細胞30と外来物質32とを含む分散液36の供給部に接続される接続部20Aと、細胞30を変形することによって細胞30の内部に外来物質を導入する変形部20Cと、を備える。キャピラリーチップ20は、接続部20Aから変形部20Cに向かって分散液が流通する流路22を備える。変形部20Cでは、流路22の内壁22Aに細胞30を接触させて細胞30を変形させる。【選択図】図2
Description
本開示は、キャピラリーチップ及びこれを備える装置、並びに細胞への外来物質の導入方法に関する。
細胞に遺伝子又は高分子等の外来物質を導入する技術としては、例えば、ウイルスベクターを用いる方法と、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の非ウイルスベクター系の方法が知られている。ウイルスベクターを用いる方法はウイルスが有している細胞侵入機構を利用するものである。具体的には標的となる細胞内に導入する遺伝子が組み込まれたウイルスベクターを作製し、細胞を感染させる。このようにして、標的細胞内に遺伝子等の外来物質を導入する。
一方、リポフェクション法では、リポソームが細胞膜と結合して細胞内に取り込まれるエンドサイトーシス現象によって標的細胞内に外来物質を導入する。エレクトロポレーション法は、高電圧パルスを細胞に印加し、細胞膜に形成された小孔から外来物質を導入する方法である。マイクロインジェクション法は、ガラス針を細胞に直接穿刺して標的細胞内に外来物質を注入する方法である。
外来物質を導入する別の技術として、非特許文献1では、高分子シートにレーザー光でマイクロ流路を形成し、当該マイクロ流路に細胞と外来物質である蛍光分子とを含む分散液を流通させることによってシェア応力を付与する技術が提案されている。
"Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics", Biotechnol Bioeng. 2008 March 1; 99(4): 846-854.doi:10.1002/bit.21651.
ウイルスベクターを用いる従来の外来物質の導入技術は、例えば、導入できる外来物質が遺伝子に限られる場合もあるし、導入効率が低くなる場合もある。また、従来の非ウイルスベクター系の方法は、例えば、導入操作に手間を要したり、熟練を必要としたりするものが多く、細胞生存率が低くなる場合もある。また、上記非特許文献1の技術は、装置構成が複雑であるうえに、導入効率を十分に高くすることができない。このため、シンプルな装置構成でありながら、細胞に簡便に外来物質を導入する技術を実現することが望まれる。
そこで、本開示は、一つの側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップを提供することを目的とする。本開示は、別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な装置を提供することを目的とする。本開示は、また別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な方法を提供することを目的とする。
本開示は、一つの側面において、細胞と外来物質とを含む分散液の供給部に接続される接続部と、細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する変形部と、を備えるキャピラリーチップを提供する。
上記キャピラリーチップは、供給部に接続される接続部と外来物質を導入する変形部とを備える。このようなキャピラリーチップは、複雑な構造にする必要がなく、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
本開示は、別の側面において、細胞を含む第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合するキャピラリーチップであって、第1分散液の供給部に接続される接続部と、細胞を変形する変形部と、を備え、第1分散液を第2分散液に配合して、変形部で変形した細胞の内部に外来物質を導入するキャピラリーチップを提供する。
細胞は変形部で変形した後も、暫くの間は細胞膜の透過性が高い状態が継続する。したがって、変形部で変形した後に、細胞を含む第1分散液を、外来物質を含む第2分散系に配合すると、細胞の内部に外来物質を導入することができる。このようなキャピラリーチップも、複雑な構造にする必要がなく、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
上記キャピラリーチップは、接続部から変形部に向かって分散液が流通する流路を備え、変形部では、流路の内壁に細胞が接触して細胞を変形してもよい。これによって、十分円滑に細胞内に外来物質を導入することができる。
上記キャピラリーチップの変形部は、細胞が同時に接触する対向面を備えており、細胞は変形部において当該対向面に接触して変形してもよい。キャピラリーチップの変形部がこのような対向面を備えることによって、細胞を大きく変形させることが可能となり、外来物質の導入効率を十分に高くすることができる。対向面の間隔は30μm以下であってもよい。これによって、様々な細胞を十分に変形させ、外来物質の導入効率を十分に高くすることができる。
上記キャピラリーチップは、接続部から変形部に向かって細くなるようにテーパー状に形成された流路を有していてもよい。このようにテーパー状に形成された流路を有することによって、分散液が流路を流通しやすくなり、細胞を一層円滑に変形することができる。
上記キャピラリーチップは一つの管体で構成されてもよい。これによって、キャピラリーチップ及びこれを備える装置の構造を一層簡素化することができる。また、キャピラリーチップと供給部との接続を容易にすることができる。
本開示は、別の側面において、上述のいずれかのキャピラリーチップと、分散液の供給部と、を備え、細胞に外来物質を導入する装置を提供する。このような装置は、複雑な構造にしなくても、細胞に簡便に外来物質を導入することができる。
本開示は、また別の側面において、キャピラリーチップに細胞と外来物質とを含む分散液を供給して流通させる工程、を有し、分散液を流通させながら細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する、外来物質の導入方法を提供する。この方法によれば、分散液を流通させながら細胞の内部に外来物質を導入することができる。このように、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
本開示は、また別の側面において、キャピラリーチップに細胞を含む第1分散液を供給し流通させながら細胞を変形する第1工程と、キャピラリーチップを流通した第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合して、第1工程で変形した細胞の内部に外来物質を導入する第2工程と、を有する、外来物質の導入方法を提供する。
細胞は第1工程で変形した後も、暫くの間は細胞膜の透過性が高い状態が継続する。したがって、第1工程で変形した後に、第2工程で細胞を含む第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合すると、細胞の内部に外来物質を導入することができる。このように、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
本開示では、一つの側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップを提供することができる。本開示では、別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な装置を提供することができる。本開示では、また別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な方法を提供することができる。
以下、場合により図面を参照して、幾つかの実施形態を説明する。ただし、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には同一符号を用い、場合により重複する説明は省略する。また、上下左右等の位置関係は、特に断らない限り、図面に示す位置関係に基づくものとする。更に、各要素の寸法比率は図示の比率に限られるものではない。
図1は、本開示の一実施形態に係るキャピラリーチップ20とこれを備える装置100を示す模式図である。装置100は、細胞30に外来物質を導入する装置である。キャピラリーチップ20は、基端部側にある接続部20Aにおいて、細胞30と外来物質とを含む分散液36の供給部10と接続されている。キャピラリーチップ20は供給部10に着脱可能に取り付けられている。キャピラリーチップ20は、着脱可能に供給部10と接続されていることから、容易に交換することができる。キャピラリーチップ20はディスポーザブルタイプであってもよい。キャピラリーチップ20の流路22は、先端部20Bの方が接続部20Aよりも細くなっている。
供給部10は、所定量の分散液36が導入されるシリンジ14と、シリンジ14の先端側において、シリンジ14に分散液36を導入するとともに、シリンジ14に導入された分散液36をキャピラリーチップ20側に流出する流路をなす連結部16と、シリンジ14内に分散液を吸引するとともに、分散液36をキャピラリーチップ20側に吐出するプランジャ12と、を備える。
プランジャ12の先端12Aには、シリンジ14とプランジャ12の間の気密性を保つため、例えばゴム部材を有していてもよい。この場合、プランジャ12を駆動してシリンジ14に対するプランジャ12の挿入長さを変えると、ゴム部材の側部がプランジャ12の内壁面上を摺動する。このようにして、シリンジ14への分散液36の導入及びキャピラリーチップ20の先端部20Bの吐出口からの分散液36の吐出の操作を行うことができる。プランジャ12の駆動は、例えばマイクロシリンジポンプを用いてもよい。
供給部10は、シリンジ14のように分散液36の量を精密に計量するものに限定されない。例えばスポイトのように、所定の範囲で分散液36を計量する計量部であってもよい。供給部10は、供給部10の内部において分散液36を収容するものに限定されず、供給部10に接続される別の部材に分散液36を収容して分散液36を計量するものであってもよい。供給部10は、分散液36を吸引及び吐出する機能を有していてもよい。これによって、装置100の構造を十分にシンプルなものにすることができる。
キャピラリーチップ20と供給部10における連結部16との接続は、特に限定されず、例えばねじ接合で双方が直接接続されていてもよいし、図示しない継ぎ手又は接続冶具を介して接続されていてもよい。シリンジ14への分散液36の導入は、連結部16からキャピラリーチップ20を取り外した状態で連結部16の先端を分散液中に入れ、プランジャ12を連結部16側とは反対側に移動させることによって行うことができる。その後、キャピラリーチップ20の接続部20Aと連結部16の先端とを接続して、プランジャ12を連結部16側に移動させる。これによって、シリンジ14内の分散液36が連結部16及びキャピラリーチップ20内の流路22における変形部20Cを流通した後、キャピラリーチップ20の先端部20Bから吐出される。
図2は、キャピラリーチップ20を用いて細胞30に外来物質32を導入する方法を説明するための図である。図1においてシリンジ14に導入された分散液36は、溶媒34と溶媒34中に分散された細胞30及び外来物質32とを含む。分散液36は、プランジャ12の連結部16側への移動に伴って、図2の流路22内を下方に向かって流通する。流路22は、基端部側にある接続部20Aから先端部20B側に向かって細くなるようにテーパー状に形成された部分を有する。
流路22内を下方に向かって移動した細胞30Aは、変形部20Cにおいて、流路22を形成する内壁22Aに接触して変形する。内壁22Aは、細胞30Aと同時に接触する対向面25,25を備える。細胞30Aは対向面25,25に接触することによって大きく変形する。細胞30Aは変形に伴って、細胞膜42に可逆的な損傷が生じ、損傷部分から外来物質32が細胞30A(細胞30B)内に導入される。
外来物質32が導入された細胞30Bは、キャピラリーチップ20の先端部20Bから外部に吐出される。外部に吐出された細胞30Cの細胞膜42の損傷は、時間の経過とともに回復する。キャピラリーチップ20の先端部20Bから外部に吐出された後も、細胞膜42の損傷が回復するまでは、細胞30Cの内部に外来物質32の導入が継続されてもよい。このようにして、外来物質32が導入された細胞40が得られる。
外来物質32は、細胞30とは異なるものであり、細胞30に元々含まれていないものを用いることができる。外来物質32としては、例えば、タンパク質等の高分子化合物、RNA及びDNA等が挙げられる。細胞30も特に限定されず、例えば、ヒト、動植物及び微生物に含まれる細胞が挙げられる。細胞30は、例えばガン細胞であってもよい。
上述のように、細胞30に外来物質32を導入する技術は、再生医療に用いられる細胞の作製(iPS細胞の作製等)、遺伝子操作技術によるバイオ医薬品の生産、農業分野における遺伝子組み換え作物の作製、付加機能を持った細胞(例えば、特定の物質に対して発光する細胞等)の作製による新規産業の創生等に活用することができる。
図3は、キャピラリーチップ20を用いて細胞30に外来物質32を導入する別の方法(変形例)を説明するための図である。図3のキャピラリーチップ20も、図1に示すように接続部20Aにおいて供給部10と接続されている。ただし、供給部10からは、細胞30を含む第1分散液36aが供給される点で、図2で説明した方法とは異なっている。すなわち、第1分散液36aは、溶媒34と溶媒34中に分散された細胞30を含む。第1分散液は外来物質を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。第1分散液36aは、プランジャ12の連結部16側への移動に伴って、図3の流路22内を下方に向かって流通する。
流路22内を下方に向かって移動した細胞30Aは、変形部20Cにおいて、流路22を形成する内壁22Aに接触して変形する。変形した細胞30Bは変形に伴って、細胞膜42に可逆的な損傷が生じる。変形した細胞30Bを含む第1分散液36aは、溶媒34と溶媒34中に分散された外来物質32を含む第2分散液37に配合される。配合後も、暫くの間は、細胞30Bは変形に伴って生じた損傷部分を有している。このため、配合後に、第2分散液37に含まれる外来物質32が、損傷部分から細胞30B内に導入される。
外来物質32が導入された細胞30Cの細胞膜42の損傷は、時間の経過とともに回復する。このようにして、外来物質32が導入された細胞40が得られる。なお、第1分散液36aと第2分散液37における溶媒は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
図4(A)は円管を加工して得られたキャピラリーチップ20を、中心軸を通るように長手方向に沿って切断したとき断面図であり、図4(B)はキャピラリーチップ20を先端部20B側からみたときの図である。キャピラリーチップ20は、接続部20A側に一定の内径φ2を有する円筒部21と、接続部20A側から先端部20B側に向かって細くなるように流路22の内壁22Aがテーパー状に形成されているテーパー部23とを有する。テーパー部23を有することによって、細胞30の変形を円滑に行うことができる。テーパー部23の長さLは特に限定されず、10μm〜1mmであってもよいし、50〜500μmであってもよい。
従来のキャピラリーチップの先端部における流路の内径φ1は、閉塞を防止するために、細胞30の直径φ3よりも大きくする必要があった。しかしながら、キャピラリーチップ20の先端部20Bにおける流路22の内径φ1は、細胞30の直径φ3よりも小さくなっている。接続部20Aにおける流路22の内径φ2は、細胞30の内径φ3よりも大きくなっている。すなわち、キャピラリーチップ20の内径φ1及び内径φ2と、細胞30の直径φ3には以下の関係式(1)が成立する。
φ1<φ3<φ2 (1)
内径φ1は、様々な細胞30を十分に変形させ、外来物質32の導入効率を十分に高くする観点から、例えば30μm以下であってもよく、25μm以下であってもよい。内径φ1は、細胞30の生存率を高くする観点から、5μm以上であってもよく、7μm以上であってもよい。内径φ2は、例えば0.1〜5mmであってもよく、0.5〜3mmであってもよい。細胞の生存率及び外来物質の導入効率の双方を高くする観点から、内径φ1に対する直径φ3の比率(φ3/φ1)は、例えば1.1〜3であってもよく、1.2〜2.5であってもよい。本開示では、細胞30が真球形状ではない場合、細胞30を同一体積の真球に換算し、当該真球の直径を直径φ3とすることができる。
内径φ1は、様々な細胞30を十分に変形させ、外来物質32の導入効率を十分に高くする観点から、例えば30μm以下であってもよく、25μm以下であってもよい。内径φ1は、細胞30の生存率を高くする観点から、5μm以上であってもよく、7μm以上であってもよい。内径φ2は、例えば0.1〜5mmであってもよく、0.5〜3mmであってもよい。細胞の生存率及び外来物質の導入効率の双方を高くする観点から、内径φ1に対する直径φ3の比率(φ3/φ1)は、例えば1.1〜3であってもよく、1.2〜2.5であってもよい。本開示では、細胞30が真球形状ではない場合、細胞30を同一体積の真球に換算し、当該真球の直径を直径φ3とすることができる。
流路22における分散液36の流通方向に垂直な断面の形状が真円形状ではない場合、間隔φ1及びφ2は、それぞれ、先端部20B及び接続部20Aにおける開口における対向面の間隔のうち、最小の間隔と定義される。この場合も、上記関係式(1)が成立する。例えば、流路22の分散液36の流通方向に垂直な断面の形状が楕円形状である場合、間隔φ1及びφ2は、それぞれ、先端部20B及び接続部20Aにおける開口の短軸の長さに相当する。間隔φ1及びφ2の数値範囲及び比率(φ3/φ1)の数値範囲は、上述の内径φ1及びφ2と同じであってよい。
細胞30は、流路22の変形部20Cを通過する際に流路22の内壁22Aの対向面に接触して変形すると、細胞30の細胞膜42に可逆的な損傷が生じ、損傷部分から外来物質32が細胞30内に導入される。したがって、標的となる細胞30の種類に応じて、内径φ1及びφ2(間隔φ1及びφ2)の大きさを設定してもよい。分散液36は、キャピラリーチップ20の流路22を接続部20Aから先端部20Bに向かう方向にのみ流通し、その反対方向には流通しない。これによって、細胞30による先端部20Bの閉塞を抑制することができる。
キャピラリーチップ20は、一つの管体で構成されていてもよい。細胞30に外来物質32を導入する装置100は、供給部10と、接続部20A側において供給部10と接続されるキャピラリーチップ20とを備える。このように、キャピラリーチップ20と装置100は、シンプルな装置構成を有している。供給部10を操作してキャピラリーチップ20の先端部20Bから分散液を吐出するという簡便な操作で、細胞30の内部に外来物質32を導入することができる。キャピラリーチップ20を供給部10と着脱可能に接続する構成とすれば、キャピラリーチップ20及び装置100は、様々な細胞及び外来物質を用いて実験を繰り返し行う際に極めて有用である。
キャピラリーチップ20の形状は図4のものに限定されない。例えば、接続部20Aと先端部20Bが、内径が長手方向に沿って一定である円筒部で構成され、接続部20Aと先端部20Bとの間に接続部20Aから先端部20Bに向かって流路が細くなるテーパー部23を有していてもよい。
図5は、別の実施形態に係るキャピラリーチップ20aとこれを備える装置200を示す模式図である。装置200は、供給部10aと、供給部10aに着脱可能に接続されるキャピラリーチップ20aとを備える。キャピラリーチップ20aは、先端部20B側の流路22が、接続部20A側の流路22よりも細くなっている。供給部10は、例えばマイクロピペットであり、細胞と外来物質とを含む分散液を所定量計量する。
装置200では、次の手順で外来物質を細胞内に導入することができる。まず、供給部10aの先端に細胞の直径よりも大きい内径を有する流路が形成された通常のチップ70を装着する。そして、チップ70の先端を分散液中に浸漬した後、供給部10aを操作して所定量の分散液をチップ70内に吸入する。その後、チップ70にかぶせるようにしてキャピラリーチップ20aを装着する。その後、図5に示すように供給部10aを操作して、キャピラリーチップ20aから分散液を吐出する。
キャピラリーチップ20aから分散液を吐出する際、少なくとも先端部20Bにおける流路22の内壁に細胞が接触して細胞が変形する。これによって、細胞膜に可逆的な損傷が生じ、細胞膜の損傷部分から外来物質が細胞の内部に導入される。
装置200は、通常用いられるマイクロピペットの先端にキャピラリーチップ20aを取り付けたシンプルな構造にすることができる。このような装置200は、実験者にとって利便性が高く、極めて高い汎用性を有する。
本開示のマイクロピペット及びこれを備える装置は上述の実施形態に限定されない。本開示のマイクロピペット及びこれを備える装置によれば、標的となる細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。また、外来物質を導入する際の細胞の生存率及び外来物質の導入効率を十分に高くすることもできる。細胞の生存率は、例えば30%以上であってもよく、50%以上であってもよく、70%以上であってもよい。外来物質の導入効率は、例えば20%以上であってもよく、50%以上であってもよく、60%以上であってもよい。
本開示の一実施形態に係る外来物質の導入方法は、装置100又は装置200を用いて行うことができる。この導入方法は、キャピラリーチップ20(20a)の接続部20Aに接続された供給部10(10a)を用いて、細胞と外来物質とを含む分散液を計量する計量工程と、キャピラリーチップ20(20a)の接続部から先端部に向かって分散液を流通させ、キャピラリーチップ20(20a)の先端部から分散液を吐出する吐出工程と、を有する。
吐出工程では、キャピラリーチップ20(20a)の流路の内壁に細胞を接触させ細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する。この導入方法は、吐出工程において、分散液36を流通させながら細胞を変形させて細胞の内部に外来物質を導入する。したがって、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
外来物質の導入方法は、上述のキャピラリーチップ20(20a)、及び装置100(200)の説明内容に基づいて行うことができる。したがって、上述のキャピラリーチップ20(20a)、及び装置100(200)の説明内容は、外来物質の導入方法に適用することができる。例えば、吐出工程では、流路の内壁における対向面に細胞を同時に接触させて細胞を変形し、細胞の内部に外来物質を導入することができる。
本開示の別の実施形態に係る外来物質の導入方法は、装置100又は装置200を用いて行うことができる。この導入方法は、キャピラリーチップ20(20a)の接続部20Aに接続された供給部10(10a)を用いて、細胞を含む第1分散液を計量する計量工程と、キャピラリーチップ20(20a)に細胞を含む第1分散液を供給し、流路22を流通させながら細胞を変形する変形工程と、キャピラリーチップ20(20a)を流通した第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合して、変形工程で変形した細胞の内部に外来物質を導入する導入工程と、を有する。
変形工程では、キャピラリーチップ20(20a)の流路の内壁に細胞を接触させ細胞を変形させて細胞膜に損傷を与える。その後、導入工程において、損傷した細胞を含む第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合し、細胞の内部に外来物質を導入する。したがって、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
この外来物質の導入方法も、上述のキャピラリーチップ20(20a)、及び装置100(200)の説明内容に基づいて行うことができる。したがって、上述のキャピラリーチップ20(20a)、及び装置100(200)の説明内容は、外来物質の導入方法に適用することができる。例えば、変形工程では、流路の内壁における対向面に細胞を同時に接触させて細胞を変形することができる。
以上、幾つかの実施形態を説明したが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。例えば、キャピラリーチップの吐出口側から分散液を吸引することによって、分散液を流通させ、変形部において外来物質を細胞に導入してもよい。
実施例を参照して本発明の内容をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
(実施例1)
10%ウシ胎児血清(FBS,Gibco)及び100Unit/mlのペニシリンと100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco)を含む最小必須培地(MEM,Gibco)を用いて、ヒト前立腺ガン細胞株(PC−3)を直径100mmの組織培養皿(Falcon)において培養した。空気と二酸化炭素を、95体積%:5体積%の割合で含む加湿雰囲気中において、37℃で培養してコンフルエントに達した細胞を、0.05重量%のトリプシンと0.053mMのEDTA・4Naを含む溶液(Gibco)を用いて剥離及び分散させた。細胞を遠心沈殿して上清を廃棄した後、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液(HBSS,Gibco)に懸濁し、細胞を含む懸濁液を得た。
10%ウシ胎児血清(FBS,Gibco)及び100Unit/mlのペニシリンと100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco)を含む最小必須培地(MEM,Gibco)を用いて、ヒト前立腺ガン細胞株(PC−3)を直径100mmの組織培養皿(Falcon)において培養した。空気と二酸化炭素を、95体積%:5体積%の割合で含む加湿雰囲気中において、37℃で培養してコンフルエントに達した細胞を、0.05重量%のトリプシンと0.053mMのEDTA・4Naを含む溶液(Gibco)を用いて剥離及び分散させた。細胞を遠心沈殿して上清を廃棄した後、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液(HBSS,Gibco)に懸濁し、細胞を含む懸濁液を得た。
懸濁液中の細胞の濃度を3〜5×105個/mlに調製した。調製した懸濁液に、ヨウ化プロピジウム(668ダルトン)を含む溶液(ヨウ化プロピジウム濃度:1μg/ml)を添加し、細胞と外来物質としてヨウ化プロピジウムを含む分散液を得た。
図6は、分散液に含まれる細胞の直径の度数分布図である。位相差顕微鏡を用いて位相差画像を観察し、その写真を用いて251個の生存細胞を選択してそれぞれの直径を測定した。その結果、平均直径は18.49μmであり、標準偏差は2.16μmであった。位相差画像では、生存細胞の形状はほぼ球状(画像において円状)であった。
次に、分散液を用いて、標的細胞に外来物質を導入する実験を以下の手順で行った。株式会社 成茂科学器械研究所製のガラス管(型番:GC−1.5,円管形状,外径:1.5mm,内径:0.9mm,長さ:90mm)を、マイクロピペットプーラー(株式会社 成茂科学器械研究所製、製品名:PC−10)を用いて引っ張り加工して、キャピラリーチップを作製した。加工前、加工中、及び加工後の写真を図7の(a),(b),(c)にそれぞれ示す。ガラス管を引っ張り加工することによって得られるキャピラリーチップは、図7の(c)に示すとおり、先端部側の方が、接続部側よりも細くなっている。
加工して得られたキャピラリーチップを、デジタルマイクロスコープ(株式会社キーエンス製、商品名:VHX−1000)で1000倍に拡大して撮影し、流路の形状及び先端部における流路の開口サイズを確認した。その結果、キャピラリーチップの流路は、図4(A)に示すような接続部20Aから先端部20Bに向かって細くなるようにテーパー状に形成された部分を有していた。また、先端部20Bにおける流路22の開口は円形を呈しており、その内径φ1は10±0.2μmであった。
このようにして作製したキャピラリーチップ20を、市販のシリンジ(テルモ株式会社製)の先端側に、チューブ51、一対の翼55及び注射針56を備える翼付静注針50(テルモ株式会社製、商品名:SV−23DLK)を用いて取り付けた。具体的には、図8に示すように注射針56をキャピラリーチップ20の接続部20A側から装入してパラフィンフィルム54(Bemis製)を用いて仮止めし、漏れ防止剤52でキャピラリーチップ20と翼付静注針50との接続部を密封した。このようにして図9に示すような、細胞に外来物質を導入する装置を作製した。キャピラリーチップ20の先端部20Bを、Falcon社製の培養皿80(容量:35ml)の側壁に設けたドリル穴82に挿通させ、先端部20Bから吐出される分散液を培養皿80に回収できるようにした。
吸入口19を開放し、プランジャ12を引き出して、シリンジ14に細胞とヨウ化プロピジウムを含む分散液を導入した。マイクロシリンジポンプ((株)三商、商品名:IC3210)を用いて、プランジャ12を駆動した。当初は先端部20Bからの吐出量が100μL/分となるようにプランジャ12を駆動して内部に残存する空気を排出した。その後、吐出量が10μL/分となるようにプランジャ12を駆動してキャピラリーチップ20の先端部20Bから分散液を吐出した。分散液の吐出を約10分間継続して行って、約100μlの分散液(実験サンプル)を培養皿に回収した。回収したサンプルは、室温で約2分間静置した後、細胞膜を回復させるために37℃で30分間インキュベートした。
生存細胞を緑色蛍光で標識する生存プローブとして、1μLのカルセイン−AM(1μg/mL,Molecular Probes)を、上述のサンプルに加えた。次いで、当該サンプルを再び30分間インキュベートして、カルセイン−AMの吸収及び蛍光発光を可能にした。
ヨウ化プロピジウムとカルセイン−AMによる蛍光を検出するために蛍光観察セット付き位相差顕微鏡(株式会社ニコン製、装置名:ECLIPSE TE300)を用いて各サンプルを観察した。10倍の倍率対物レンズを用い、各サンプルについて6つの視野領域を写真撮影した。図10に示す位相差顕微鏡画像(倍率:20倍)では、生存細胞40と死細胞33(細胞破片)が確認された。
図11(a)は、TRITCフィルタ(蛍光:582〜637nm)の画像の写真を二値化画像処理したものである。この画像では、ヨウ化プロピジウムが取り込まれた細胞が確認された。ヨウ化プロピジウムの赤色の蛍光を発光する細胞は、キャピラリーチップによってヨウ化プロピジウムが取り込まれた生存細胞と死亡細胞の両方を含んでいた。
図11(b)は、FITCフィルタ(蛍光: 512〜558nm)の画像の写真を二値化画像処理したものである。この画像では、カルセイン−AMによる緑色の蛍光を発光する細胞が確認された。カルセイン−AMは、細胞内に拡散し、細胞内のエステラーゼと結合して、緑色の蛍光を発光する。このため、緑色の蛍光を発光する細胞は生存していることを意味する。
6つの視野領域における位相差顕微鏡画像の写真(例えば、図10の写真)を用いて、細胞の総数(A)を計測した。6つの視野領域におけるFITCフィルタの画像の写真(例えば、図11(b)の二値化画像処理前の写真)を用いて、生存する細胞の個数(B)を計測した。6つの視野領域におけるTRITCフィルタの画像の写真(例えば、図11(a)の二値化画像処理前の写真)を用いて、ヨウ化プロピジウムが取り込まれた細胞の個数(C)を計測した。
6つの視野領域におけるFITCフィルタの画像及びTRITCフィルタの画像を、画像処理ソフトウェア(ImageJ、パブリックドメインライセンス、アメリカ国立衛生研究所)を使用して、合成画像を得た。図11(c)は、当該合成画像の写真を二値化画像処理したものである。この合成画像の写真(例えば、図11(c)の二値化画像処理前の写真)を用いて、赤と緑の両方の蛍光を発光する細胞の個数(D)を求めた。この細胞の個数(D)は、ヨウ化プロピジウムが導入された生存細胞の個数に相当する。
6つの視野領域のそれぞれにおける細胞の総数(A)、死細胞の個数、生存細胞の個数(B)、ヨウ化プロピジウムが取り込まれた細胞の個数(C)、及び、ヨウ化プロピジウムが導入された生存細胞の個数(D)は、表1に示すとおりであった。表1には、以下の式で求められる細胞の生存率(%)及び外来物質の導入効率(%)も合わせて示した。
細胞の生存率(%)=生存細胞の個数(B)/細胞の総数(A)×100
外来物質の導入効率(%)=細胞の個数(D)/細胞の総数(A)×100
外来物質の導入効率(%)=細胞の個数(D)/細胞の総数(A)×100
同様の実験を及び計測を、合計4つの実験サンプルについて行った。結果は表1に示すとおりであった。表1に示す4つの実験サンプルの計測値に基づいて、細胞の生存率(%)及び外来物質の導入効率(%)を求めた。その結果、細胞の生存率(%)は39.4%であり、外来物質の導入効率は27.9%であった。
(実施例2)
実施例1と同様にして、先端部20Bにおける流路22の開口の内径φ1が15±0.2μmであるキャピラリーチップを作製した。このキャピラリーチップを用いたこと以外は、実施例1と同様にして細胞にヨウ化プロピジウムを導入する操作を行い、実施例1と同様にして計測を行った。
実施例1と同様にして、先端部20Bにおける流路22の開口の内径φ1が15±0.2μmであるキャピラリーチップを作製した。このキャピラリーチップを用いたこと以外は、実施例1と同様にして細胞にヨウ化プロピジウムを導入する操作を行い、実施例1と同様にして計測を行った。
実施例2では、合計3つの実験サンプルについて実験を及び計測を行った。結果は表2に示すとおりであった。表2に示す3つの実験サンプルの計測値に基づいて、細胞の生存率(%)及び外来物質の導入効率(%)を求めた。その結果、細胞の生存率(%)は77.0%であり、外来物質の導入効率は61.7%であった。
図12に、実施例1及び実施例2における細胞の生存率(%)及び外来物質の導入効率(%)の結果を示す。図12に示すとおり、実施例1においては20%以上の確率で、実施例2においては60%以上の確率で生存細胞に外来物質を導入することができた。
本開示によれば、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップが提供される。また、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な装置が提供される。また、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な方法が提供される。
10,10a…供給部、12…プランジャ、12A…先端、14…シリンジ、16…連結部、19…吸入口、20…キャピラリーチップ、20,20a…キャピラリーチップ、20A…接続部、20B…先端部、20C…変形部、21…円筒部、22…流路、22A…内壁、23…テーパー部、25…対向面、30,30A,30B,30C,40…細胞(生存細胞)、32…外来物質、34…溶媒、36…分散液、42…細胞膜、50…翼付静注針、54…パラフィンフィルム、56…注射針、52…漏れ防止剤、70…チップ、100,200…装置。
Claims (10)
- 細胞と外来物質とを含む分散液の供給部に接続される接続部と、
細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する変形部と、を備えるキャピラリーチップ。 - 細胞を含む第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合するキャピラリーチップであって、
第1分散液の供給部に接続される接続部と、細胞を変形する変形部と、を備え、
第1分散液を第2分散液に配合して、変形部で変形した細胞の内部に前記外来物質を導入するキャピラリーチップ。 - 接続部から変形部に向かって分散液が流通する流路を備え、
変形部では、流路の内壁に細胞が接触して細胞が変形する、請求項1又は2に記載のキャピラリーチップ。 - 変形部は細胞が同時に接触する対向面を備えており、
細胞は当該対向面に接触して変形する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキャピラリーチップ。 - 対向面の間隔は30μm以下である、請求項4に記載のキャピラリーチップ。
- 接続部から変形部に向かって細くなるようにテーパー状に形成された流路を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のキャピラリーチップ。
- 一つの管体で構成される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のキャピラリーチップ。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のキャピラリーチップと、分散液の供給部と、を備え、細胞に外来物質を導入する装置。
- キャピラリーチップに細胞と外来物質とを含む分散液を供給して流通させる工程、を有し、
分散液を流通させながら細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する、外来物質の導入方法。 - キャピラリーチップに細胞を含む第1分散液を供給し流通させながら細胞を変形する第1工程と、
前記キャピラリーチップを流通した第1分散液を、外来物質を含む第2分散液に配合して、第1工程で変形した細胞の内部に外来物質を導入する第2工程と、を有する、外来物質の導入方法。
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