JP2019144218A - Biomarker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、不安定プラークを有する被験者を同定するため、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーおよびその検査方法を提供する The present invention provides a biomarker for identifying a subject having unstable plaque, or for predicting the presence of unstable plaque in a subject, and a test method thereof
内頚動脈起始部は、アテローム性動脈硬化の好発部位である。アテローム（プラーク）は動脈の内膜に生じた動脈硬化性の肥厚であり、長い時間をかけて無症候性に進展するが、その経過中に繊維性被膜に覆われ安定化に向かうものと、不安定プラーク（脂質コアの増大、繊維性被膜の菲薄化、プラークへの炎症細胞浸潤、血管新生およびプラーク内出血を示すプラーク）に移行するものとに分かれる。この不安定プラークが破綻することにより、アテローム血栓性脳梗塞を起こす（塞栓性、血栓性、血行力学的）。アテローム血栓性脳梗塞は、元来、欧米人に多く、日本人には少ないとされていたが、近年の食生活の欧米化などに伴い、日本人にも増加傾向にある。一旦、脳梗塞を発症すれば、後遺症を残すことが多く、脳梗塞発症前に不安定プラークの患者を同定し、適切な治療を開始することが必要である。従来、プラークの性状を判別する為には、頚動脈エコー、核磁気共鳴断層撮影（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ、ＭＲＩ）および核磁気共鳴血管撮影（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ、ＭＲＡ）などが用いられてきたが、いずれの検査も、手技的、時間的および費用的にも負担が大きく、一般検診レベルで不安定プラーク患者を簡便に同定する方法の確立が望まれる。 The origin of the internal carotid artery is a common site of atherosclerosis. Atherosclerosis (plaque) is an arteriosclerotic thickening that occurs in the intima of the arteries and develops asymptomatically over a long period of time. Dividing into vulnerable plaques (plaque showing increased lipid cores, thinning of the fibrous cap, inflammatory cell infiltration into plaques, angiogenesis and intra-plaque hemorrhage). When this unstable plaque breaks down, it causes atherothrombotic cerebral infarction (embolism, thrombosis, hemodynamics). Atherothrombotic cerebral infarction was originally prevalent in Westerners and rare in Japanese, but it is also increasing in Japanese with the recent westernization of eating habits. Once cerebral infarction develops, it often leaves sequelae, and it is necessary to identify patients with vulnerable plaque and initiate appropriate treatment before the onset of cerebral infarction. Conventionally, carotid echo, Magnetic Resonance Imaging (MRI), Magnetic Resonance Angiography (MRA), etc. have been used to determine plaque properties. Examination is also burdensome in terms of technique, time and cost, and it is desirable to establish a method for easily identifying vulnerable plaque patients at the general examination level.
ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）は、ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔを持つタンパク質であり、ＴＧＦ−β／ＴＧＦ−β受容体の複合体と相互作用することによりＴＧＦ−βシグナル伝達を調整し、血管新生や肺線維化を促進することが報告されている（非特許文献１および２）。血液中のＬＲＧは、種々の疾患のバイオマーカーとして有用であることが報告されている。例えば、関節リウマチ（非特許文献３〜５）、スチル病（非特許文献６）、クローン病（非特許文献３）および潰瘍性大腸炎（非特許文献７）に対する疾患活動性バイオマーカーとしての有用性、また心不全患者を同定するバイオマーカーとしての有用性（非特許文献８）が報告されている。さらに、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する指標（特許文献１）、膵臓がん診断用マーカーとしての有用性（特許文献２）および、ベーチェット病、クローン病または関節リウマチの検査用バイオマーカー（特許文献３）についても報告されている。しかしながら、動脈硬化性疾患における不安定プラークに対するバイオマーカーとしてのＬＲＧの有用性については報告されていない。 Leucine-rich α2 glycoprotein (Leucin-rich alpha-2-glycoprotein, LRG) is a protein having a leucine-rich repeat, and interacts with the complex of TGF-β / TGF-β receptor to interact with TGF-β. It has been reported to regulate signal transduction and promote angiogenesis and lung fibrosis (Non-patent Documents 1 and 2). It has been reported that LRG in blood is useful as a biomarker for various diseases. For example, useful as a disease activity biomarker for rheumatoid arthritis (Non-patent Documents 3 to 5), Still's disease (Non-patent document 6), Crohn's disease (Non-patent document 3) and ulcerative colitis (Non-patent document 7) Sexuality and usefulness as a biomarker for identifying heart failure patients (Non-patent Document 8) have been reported. Furthermore, an index for evaluating the presence or absence of abnormal skin barrier function (Patent Document 1), usefulness as a marker for pancreatic cancer diagnosis (Patent Document 2), and a biomarker for testing Behcet's disease, Crohn's disease or rheumatoid arthritis ( Patent Document 3) has also been reported. However, the usefulness of LRG as a biomarker for vulnerable plaque in arteriosclerotic diseases has not been reported.
本発明は、一般検診レベルで施行可能な、無症候性不安定プラークを有する被験者を同定するため、または被験者における不安定プラークの存在を予測するための末梢血バイオマーカーとその測定方法を提供する。 The present invention provides peripheral blood biomarkers and methods for measuring them to identify subjects with asymptomatic unstable plaque or to predict the presence of unstable plaque in a subject that can be performed at a general screening level .
無症候性不安定プラークを有する被験者の末梢血を用いて、二次元電気泳動法を用いた網羅的プロテオミクス解析を行った。その結果、統計学的に優位に変動のあるタンパク質スポットを１８個特定した。この１８個のスポットを、質量分析法を用いてタンパク質の同定を行い、１６個のスポットのタンパク質を同定した。これらのタンパク質には、ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）、補体Ｃ９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ９）、アンジオテンシノーゲン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ）、ビタミンＤ結合タンパク質（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチトロンビンＩＩＩ（Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ）、ゲルゾリン（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ヘモペキシン（Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ）、凝固第ＸＩＩ因子（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩ）、グルタチオン・ペルオキシダーゼ３（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ３）およびセルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）が含まれる。これらのタンパク質は、いずれもバイマーカーとなり得る。 A comprehensive proteomic analysis using two-dimensional electrophoresis was performed using the peripheral blood of subjects with asymptomatic unstable plaques. As a result, 18 protein spots with statistically significant fluctuations were identified. Proteins were identified from these 18 spots using mass spectrometry, and 16 spots of proteins were identified. These proteins include leucine-rich α2 glycoprotein (Leucin-rich alpha-2-glycoprotein, LRG), complement C9 (Complement C9), angiotensinogen (Angiotensinogen), vitamin D-binding protein (Vitamin D-binding Protein). Antithrombin III, gelsolin, hemopexin, coagulation factor XII, glutathione peroxidase 3 and ceruloplasmin. Any of these proteins can be a bimarker.
同定したタンパク質の中で、不安定プラーク被験者群において二次元電気泳動にて最大の変動（１．５倍以上）を示したＬＲＧに関しては、酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を用いて多数例で解析を行い、簡便に不安定プラークを有する被験者を同定することができることを確認した。また、頚動脈内膜剥離術を施行された不安定プラークを有する患者のプラーク組織を用いて免疫染色を行い、ＬＲＧは、不安定プラーク内に浸潤したマクロファージが産生していることを確認した。 Among the identified proteins, LRG that showed the largest fluctuation (more than 1.5 times) by two-dimensional electrophoresis in a group of unstable plaque subjects was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ), It was confirmed that subjects having unstable plaque can be easily identified. In addition, immunostaining was performed using the plaque tissue of a patient having unstable plaque subjected to carotid endarterectomy, and LRG confirmed that macrophages infiltrating into unstable plaque were produced.
これらの知見に基づき、本発明は無症候性不安定プラークを有する被験者の同定、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーとその測定法を提供する。試験実施にあたっては、被験者よりインフォームド・コンセントを得た。本発明は以下の通りである。 Based on these findings, the present invention provides biomarkers and methods for measuring the identification of subjects having asymptomatic unstable plaques or predicting the presence of unstable plaques in subjects. In conducting the study, informed consent was obtained from the subjects. The present invention is as follows.
（１）被験者から得られた試料について、ロイシンリッチα２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎ−ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＲＧ）の発現量を測定することを含む、被験者における不安定プラークの存在を予測する方法。
（２）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、無症候性不安定プラークを有する被験者の同定方法。
（３）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、当該被験者におけるアテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測する方法。
（４）試料が、体組織、血液、血漿または血清である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）試料が血清である、（４）に記載の方法。
（６）不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、被験者における不安定プラークの存在を予測する、（１）に記載の方法。
（７）不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、被験者が無症候性不安定プラークを有することを決定する、（２）に記載の方法。
（８）不安定プラークを有さない被験者の適切な母集団の正常値を基準とし、当該基準と比較してＬＲＧが高値であることより、アテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測する、（３）に記載の方法。
（９）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定するセンサー。
（１０）被験者から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定するための試薬を含むキット。
（１１）個人から得られた試料について、ＬＲＧの発現量を測定することを含む、アテローム血栓性脳梗塞または急性冠症候群の発症を予測又は診断する方法。(1) A method for predicting the presence of unstable plaque in a subject, comprising measuring the expression level of leucine-rich alpha-2-glycoprotein (LRG) for a sample obtained from the subject.
(2) A method for identifying a subject having asymptomatic unstable plaque, comprising measuring the expression level of LRG for a sample obtained from the subject.
(3) A method for predicting the onset of atherothrombotic cerebral infarction or acute coronary syndrome in the subject, comprising measuring the expression level of LRG for a sample obtained from the subject.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the sample is body tissue, blood, plasma or serum.
(5) The method according to (4), wherein the sample is serum.
(6) Predict the presence of unstable plaque in the subject based on the normal value of an appropriate population of subjects not having unstable plaque, and LRG is higher than that in the reference (1 ) Method.
(7) Based on the normal value of an appropriate population of subjects who do not have unstable plaque, and the LRG is higher than that of the reference, it is determined that the subject has asymptomatic unstable plaque The method according to (2).
(8) Predicting the onset of atherothrombotic cerebral infarction or acute coronary syndrome based on the normal value of an appropriate population of subjects not having unstable plaque and having a higher LRG value than the standard The method according to (3).
(9) A sensor that measures the expression level of LRG for a sample obtained from a subject.
(10) A kit containing a reagent for measuring the expression level of LRG for a sample obtained from a subject.
(11) A method for predicting or diagnosing the onset of atherothrombotic cerebral infarction or acute coronary syndrome, comprising measuring the expression level of LRG for a sample obtained from an individual.
本発明では、ＬＲＧが無症候性安定プラークを有する被験者の同定、または被験者における不安定プラークの存在を予測するためのバイオマーカーとして有用であること、またＬＲＧはＥＬＩＳＡなどを用いて簡便に測定可能であり、一般検診レベルでの施行が可能であることを示した。
不安定プラークの治療に関しては、薬物療法、頚動脈内膜剥離術、頚動脈ステント留置術など有効な治療法がある。しかしながらこれらの治療法は脳梗塞発症後では遅く、発症前に患者を同定し、いかに早く治療を開始するかが十分な治療効果を得る上で重要となる。検診や人間ドックなどにおいて施行可能なＬＲＧの測定を行うことにより、無症候性の不安定プラークを有する患者を同定し、速やかに治療を開始することでできれば、脳梗塞の発症を予防することができ、患者のクオリティ・オブ・ライフに貢献するとともに、医療経済的にも意義があると期待される。In the present invention, LRG is useful as a biomarker for identifying subjects having asymptomatic stable plaques or predicting the presence of unstable plaques in subjects, and LRG can be easily measured using ELISA or the like It was shown that it can be performed at the general screening level.
For treatment of vulnerable plaque, there are effective treatments such as drug therapy, carotid endarterectomy, and carotid stenting. However, these treatment methods are late after the onset of cerebral infarction, and it is important to identify a patient before the onset and start treatment early to obtain a sufficient therapeutic effect. By measuring LRG that can be performed at medical checkups and medical checkups, patients with asymptomatic unstable plaque can be identified and treated promptly to prevent the development of cerebral infarction. In addition to contributing to the patient's quality of life, it is expected to be meaningful in medical economics.
（１）血清タンパク質の収集
一般診療においてＭＲＩ／ＭＲＡ／プラークイメージングを施行した被験者の中で、無症候性に偶然発見された不安定プラークを有する被験者（ｎ＝１７）に対して、同意書を取得のもと、一般採血時に、１ｍＬ余分に採血し、この血清を−８０℃で冷凍保存した。不安定プラークは、プラークイメージング（Ｂｌａｃｋ−ｂｌｏｏｄ法）により、隣接する胸鎖乳突筋（ｓｔｅｒｎｏｃｌｅｉｄｏｍａｓｔｏｉｄ ｍｕｓｃｌｅ）と比較して、５０％以上信号強度が増強しているものと定義した。同様に、不安定プラークを認めなかった被験者（ｎ＝１６）を対照群として、同意書の取得後同様な採血を行い、−８０℃で血清を冷凍保存した。図１は、不安定プラークを有する被験者のＭＲＡ画像とその元画像（矢印は低信号となったプラークを示す）、およびプラーク画像（矢印は高信号となったプラークを示す）である。不安定プラークを有する被験者（ｎ＝１７）と不安定プラークを有さない対照被験者（ｎ＝１６）の背景を表１に示す。(1) Serum protein collection Among subjects who underwent MRI / MRA / plaque imaging in general practice, a consent form was given to subjects (n = 17) who had asymptomatically discovered unstable plaques Under acquisition, 1 mL of extra blood was collected at the time of general blood collection, and this serum was stored frozen at −80 ° C. Unstable plaque was defined as having a signal intensity enhanced by 50% or more by plaque imaging (Black-blood method) as compared to the adjacent sternocleidomastoid muscle. Similarly, the subject (n = 16) who did not recognize unstable plaque was used as a control group, blood was collected in the same manner after obtaining the consent form, and the serum was stored frozen at −80 ° C. FIG. 1 shows an MRA image of a subject having unstable plaque and its original image (an arrow indicates a plaque with a low signal) and a plaque image (an arrow indicates a plaque with a high signal). Table 1 shows the background of subjects with unstable plaque (n = 17) and control subjects without unstable plaque (n = 16).
（２）二次元電気泳動を用いた網羅的プロテオミクス解析
二次元電気泳動を用いた解析は、不安定プラークを有する被験者６例および不安定プラークを有さない対照被験者６例の血清を用いて行った。
〔試料の調製〕
二次元電気泳動により微量タンパク質の解析を行うためには、血清中に多量に存在するアルブミンやグロブリンなどを除去する必要がある。そこで、マルチプルアフィニティーカートリッジ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、Ｈｕｍａｎ １４ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、アジレント社）を用いて以下のタンパク質を血清試料から除去し、二次元電気泳動用の試料を調製した。タンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ、アンチトリプシン、ＩｇＡ、トランスフェリン、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、α２マクログロブリン、α１−酸性糖タンパク質、ＩｇＭ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、補体Ｃ３およびトランスサイレチンである。
〔二次元電気泳動〕
二次元電気泳動は、二次元ディファレンスゲル電気泳動（Ｔｏｗ−ｄｅｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２Ｄ−ＤＩＧＥ）法を用いて行った（発明者らが以前に報告した論文に記載の方法と同様な方法を用いた。Ｙａｔａ Ｋ，Ｏｉｋａｗａ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２０１１ １４１０：１２−２３）。血清中に多量に混在するタンパク質を除去した後の試料を、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ８．５）に溶解した。それぞれ５０μｇの血清タンパク質を、２００ｐｍｏｌ ＣｙＤｙｅ Ｆｌｕｏｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｙｅｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、製品プロトコールに基づきタンパク質の蛍光標識を行った。一枚のゲルに不安定プラーク患者、コントロール患者およびゲル間の比較を行うための内部標準の３種類のタンパク質を添加し、ｐＨと分子量に基づき、タンパク質の泳動を行った。図２は、電気泳動後の図を示す。右下挿入図は、ＬＲＧのスポットを示す。不安定プラークを有する被験者のスポットを赤色で示し、不安定プラークを認めなかった対照被験者のスポットを緑色で示す。発現量が等量の場合、二群のスポットをマージ（Ｍｅｒｇｅ）させると黄色になる。発現量の差異に基づき、蛍光は緑色側や赤色側に触れることになる。図２の場合、不安定プラークを有する被験者でＬＲＧが増加しているので、スポットは赤色を呈している。
〔二次元電気泳動の画像解析〕
電気泳動後のゲルは、イメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００、ＧＥヘルスケア社）を用いて撮影を行った。撮影された各タンパク質スポットの解析は、ＤｅＣｙｄｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。同定されたすべてのスポットの蛍光強度について、不安定プラークを有する被験者に由来するスポットと不安定プラークを認めなかった対照被験者に由来するスポットとの間で二群間比較（スチューデントｔ検定）を行った。その結果 有意差のあるスポットとして、図２においてに赤丸で囲った１８個のスポットが確認された。各スポットの発現量の差異とＰ値を表２に示した。
〔スポットのタンパク質の同定〕
各スポットのタンパク質を同定するために、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色し、各スポットを切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（アプライドバイオシステムズ社、フレイミングハム、米国マサチューセッツ州）を用いてタンパク質を同定した。タンパク質データベース検索は、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（登録商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）を用いたＰａｒａｇｏｎ（登録商標）法により行った。１８個のスポットのうち、１６個のスポットでタンパク質を同定することが可能であった。同定されたタンパク質の名称を表２に示した。同定されたタンパク質の中で、不安定プラークを有する被験者において発現が亢進し（この場合、Ａｖ．Ｒａｔｉｏ値は正の値を示す）、かつ最も変動が大きいタンパク質はＬＲＧであることが示された。(2) Comprehensive proteomic analysis using two-dimensional electrophoresis Analysis using two-dimensional electrophoresis was performed using sera from six subjects with unstable plaques and six control subjects without unstable plaques. It was.
(Sample preparation)
In order to analyze a trace amount of protein by two-dimensional electrophoresis, it is necessary to remove albumin, globulin and the like that are present in a large amount in serum. Therefore, the following proteins were removed from the serum sample using a multiple affinity cartridge (multiple affinity cartridge, Human 14 Multiple Affinity Removable Spin Cartridges, Agilent) to prepare a sample for two-dimensional electrophoresis. Proteins include albumin, immunoglobulin (Ig) G, antitrypsin, IgA, transferrin, haptoglobin, fibrinogen, α2 macroglobulin, α1-acid glycoprotein, IgM, apolipoprotein AI, apolipoprotein A-II, complement C3 And transthyretin.
[Two-dimensional electrophoresis]
Two-dimensional electrophoresis was performed using a two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) method (a method similar to the method described in the paper previously reported by the inventors). Yata K, Oikawa S et al. Brain Res 2011 1410: 12-23). A sample after removing a large amount of protein mixed in serum was prepared as a lysis buffer (lysis buffer, 30 mM Tris-HCl, 7 M urea, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, protease inhibitor cocktail, pH 8.5). ). Each 50 μg of serum protein was fluorescently labeled with a protein based on a product protocol using 200 pmol CyDye Fluor minimal dyes (GE Healthcare). Three types of proteins, internal standard for comparison between unstable plaque patients, control patients and gels, were added to one gel, and proteins were migrated based on pH and molecular weight. FIG. 2 shows the diagram after electrophoresis. The lower right inset shows the LRG spot. Spots for subjects with unstable plaques are shown in red, and spots for control subjects that did not have unstable plaques are shown in green. When the expression levels are equal, the two groups of spots become yellow when they are merged. Based on the expression level difference, the fluorescence touches the green side or the red side. In the case of FIG. 2, since the LRG is increased in a subject having unstable plaque, the spot is red.
[Image analysis of two-dimensional electrophoresis]
The gel after electrophoresis was photographed using an image analyzer (Typhoon 9400, GE Healthcare). Each protein spot photographed was analyzed using DeCyder Differential Analysis Software (GE Healthcare). For the fluorescence intensity of all identified spots, a two-group comparison (Student t test) was performed between spots derived from subjects with unstable plaques and spots derived from control subjects without unstable plaques. It was. As a result, 18 spots surrounded by red circles in FIG. 2 were confirmed as spots having a significant difference. Table 2 shows the difference in the expression level of each spot and the P value.
[Identification of spot protein]
To identify the protein in each spot, the gel was stained with Coomassie brilliant blue, each spot was excised, and the protein was identified using a MALDI-TOF / TOF mass spectrometer (Applied Biosystems, Framingham, Mass., USA) did. The protein database search was performed by the Paragon (registered trademark) method using ProteinPilot (registered trademark) software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Of the 18 spots, it was possible to identify proteins in 16 spots. The names of the identified proteins are shown in Table 2. Among the identified proteins, expression was increased in subjects with vulnerable plaque (in this case, Av.Ratio value is positive), and the most variable protein was shown to be LRG. .
（３）プラークの組織学的検索
不安定プラークを有する患者であって、頚動脈内膜剥離術を施行された患者の摘出プラーク組織を用いて組織学的検索を行った。ホルマリン固定した摘出標本を、血管が冠状断になる様にパラフィン包埋し、切片を作成した。この切片を用いてＨＥ染色ならびにＬＲＧおよびＣＤ６８（マクロファージのマーカー）の免疫染色を行った（図３および４）。
図３において、左図はＨＥ染色を示す。矢印はプラークを示す。星印（＊）は血管内腔の位置を示す。中央図は、ＬＲＧのＤＡＢ染色の結果を示す。この結果より、ＬＲＧはプラーク内に広範に発現していることが示された。右図は、ＣＤ６８のＤＡＢ染色の結果を示す。この結果より、プラーク内に広範にマクロファージが浸潤していることが示された。
図４は、ＬＲＧとＣＤ６８の蛍光免疫染色像を示す。マージ（ｍｅｒｇｅ）させた図より、ＬＲＧとＣＤ６８の発現はほぼ一致しており、浸潤したマクロファージがＬＲＧを産生していることが確認された。(3) Histological Search for Plaque A histological search was performed using the extracted plaque tissue of a patient with unstable plaque who had undergone carotid endarterectomy. The formalin-fixed excised specimen was embedded in paraffin so that the blood vessel had a coronal section, and a section was prepared. This section was used for HE staining and immunostaining for LRG and CD68 (macrophage marker) (FIGS. 3 and 4).
In FIG. 3, the left figure shows HE staining. Arrow indicates plaque. An asterisk (*) indicates the position of the blood vessel lumen. The center figure shows the results of DAB staining of LRG. From this result, it was shown that LRG is widely expressed in plaques. The right figure shows the result of DAB staining of CD68. From this result, it was shown that macrophages infiltrated extensively in the plaque.
FIG. 4 shows fluorescent immunostaining images of LRG and CD68. From the merged figure, the expression of LRG and CD68 almost coincided, and it was confirmed that the infiltrated macrophages produced LRG.
（４）ＥＬＩＳＡを用いた多数例での解析
不安定プラークを有する被験者において、血清中でのＬＲＧの発現亢進をより確実に、かつ簡便に検査する方法を確立するため、ＥＬＩＳＡを用いた測定を行った。不安定プラークを有する被験者１７例、不安定プラークを認めなかった対照被験者１６例について解析を行った。ＥＬＩＳＡキットは市販のキット（ヒトＬＲＧアッセイキット、株式会社免疫生物研究所）を用いた。測定は、キットに添付されたアッセイプロトコールに従って行った。図５は、２群の各被験者におけるＬＲＧ発現量を示す。不安定プラークを認めなかった対照被験者群のＬＲＧ量は５７５００．０５±１０９８８．２ｎｇ／ｍＬであるのに対し、不安定プラークを有する被験者群のＬＲＧ量は９９６４３．８±４３４６８．５９ｎｇ／ｍＬであり、有意なＬＲＧ発現亢進が確認された（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。血清中のＬＲＧ量を測定することにより、不安定プラークを有する被験者の同定が可能であることが示された。(4) Analysis in a large number of cases using ELISA In order to establish a method for more surely and simply testing the increased expression of LRG in serum in subjects with unstable plaque, measurement using ELISA was conducted. went. Analysis was performed on 17 subjects with unstable plaques and 16 control subjects with no unstable plaques. As an ELISA kit, a commercially available kit (human LRG assay kit, Immunobiological Laboratories Inc.) was used. The measurement was performed according to the assay protocol attached to the kit. FIG. 5 shows the LRG expression level in each subject of the two groups. The LRG amount in the control subject group that did not have unstable plaque was 57500.05 ± 10988.2 ng / mL, whereas the LRG amount in the subject group with unstable plaque was 99643.8 ± 43468.59 ng / mL. There was a significant increase in LRG expression (P <0.05, Student's t test). By measuring the amount of LRG in serum, it has been shown that it is possible to identify subjects with unstable plaque.
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