JP2019135954A - 網目状シートを含む細胞培養容器 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、簡便で低コストに高密度の細胞培養が可能な細胞培養容器を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、撹拌棒付きスピナーフラスコ内に接着性細胞の足場となる網目状シートが収納された細胞培養容器であって、前記網目状シートは前記撹拌棒と干渉しないように前記撹拌棒の周囲に筒状および／または渦巻状に配置された、細胞培養容器である。【選択図】なし

Description

本発明は、接着性細胞の足場となる網目状シートを含む細胞培養容器に関する。

再生医療・細胞移植治療に用いる細胞の製造、あるいはバイオ医薬品の製造において、細胞を低コストで効率よく培養することは高度の要求事項となっている。例えば、再生医療において体性幹細胞を用いる場合は、患者の脂肪組織や骨髄から採取した体性幹細胞（間葉系幹細胞）を必要な細胞数まで体外で増幅させて治療に用いるのが一般的であるが、多くの人がこうした治療を受けるようになるためには細胞の製造コストを現状よりも抑える必要がある。また、バイオ医薬品の例では、ヒト型モノクローナル抗体の医薬品は製造コストが高いため薬価が高く、そのため治療費は高額となり、患者及び国の医療費負担が大きいのが現状である。

こうした課題を解決するため、細胞を効率よく増殖させる様々な手法やデバイスが開発されてきた。例えば、人工透析に用いられる限外ろ過膜からなるモジュールを細胞培養用に転用した形態のもの、あるいは、平面フラスコを多層に重ねた形態のものなどが利用されている。

特許文献１には、細胞の増殖及び成長用の中空糸型バイオリアクターであって、細胞空間（中空糸膜中空部）および無細胞空間（中空糸膜外側部）にそれぞれ異なる培地を循環するための液流回路を有するバイオリアクタシステムが開示されている。しかし、中空糸膜をモジュール化するには煩雑な工程を経る必要があり、簡便・低コスト化することは困難である。

また、多層型フラスコは培養面積に限界があり、多層化することによる重量増で取り扱いにも支障があることが問題となっている。更に、細胞をビーズのような小さな粒子担体に接着させ、これを浮遊させて攪拌培養を行うことで接着細胞を浮遊細胞と同様に培養することが可能である。これを利用した高密度培養システム（例えば、特許文献２）もあるが、攪拌される際に、細胞がダメージを受けたり、細胞回収時にビーズの破片が混入するなどの問題があり、これは特に細胞そのものを治療に使用する再生医療においては問題となる。

特表２００３−５１００６８号公報 特開昭６２−２７４号公報

本発明は、簡便で低コストに高密度の細胞培養が可能な細胞培養容器を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．撹拌棒付きスピナーフラスコ内に接着性細胞の足場となる網目状シートが収納された細胞培養容器であって、前記網目状シートは前記撹拌棒と干渉しないように前記撹拌棒の周囲に筒状および／または渦巻状に配置された、細胞培養容器。
２．前記接着性細胞は、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞または前駆細胞である、１に記載の細胞培養容器。
３．前記網目状シートは、線維径が１００〜２０００μｍである、１または２に記載の細胞培養容器。
４．前記網目状シートは、網目のサイズが１０〜１０００μｍである、１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。

本発明により、簡便で低コストに高密度の細胞培養や物質生産を行うことが可能となる。

網目状シートの一例を示す模式図である。 渦巻状に巻かれた網目状シートを入れた細胞培養容器の一例を示す模式図である。 細胞培養装置の一例を示す模式図である。

（網目状織物シート）
本発明において、網目状シートの素材については、細胞を網目状シートの表面に保持できるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等の水不溶性担体が好適に利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、網目状シートはこれらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されていてもよい。親水化処理することにより、培養細胞の網目状シート表面への接着が容易になる。また、使用する細胞に応じて、網目状シートへの接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコーティングしたものでも良い。

本発明において、網目状シートの線維径は、好ましくは１００〜２０００μｍ、より好ましくは２００〜１５００μｍ程度のものが利用される。線維径は、網目状シートが適度な強度を保ち、かつ網目間の培養液等の物質の通過に大きな支障がない範囲であればよく、例えば３００〜８００μｍ程度が好ましい。網目状シート上に細胞を播種し、細胞培養を行う場合は、網目状シートの線維径は、細胞の増殖する面積、細胞密度や培地との接触度合い、培地の流れなどに影響することから、本発明のメリットを活かす要件となる。

本発明において、網目状シートの網目のサイズ（線維と線維の間隔）は、多少のばらつきがあっても構わないが出来るだけ一定であることが望ましい。線維と線維の間隔は、特に限定されるものではないが、細胞の増殖や培養液の流れを妨げない距離を有する方が望ましく、例えば、線維と線維の平均距離が１０〜１０００μｍ程度であることが好ましく、２０〜８００μｍ程度の通孔を有するものであればさらに好ましい。さらに、線維と線維の間隔は、培養に伴う各種生体成分の目詰まり等の影響も受ける可能性もあり、最適な設計は、これらの物質との相互作用を鑑みて実施されるべきものである。

（細胞培養容器）
本発明において、細胞培養容器は、例えば、撹拌棒付きスピナーフラスコに二重〜数十重に円筒状および／または渦巻状に巻いた網目状シートを格納することにより簡単に作製することができる。また、複数のシートを同様に重ねて巻いたものを用いても構わない。なお、撹拌棒には先端付近にマグネットバーが内蔵されており、市販のマグネティックスターラーを用いることにより、撹拌棒を回転させることができるようになっている。このような細胞培養容器は、容積あたりの培養面積を格段に大きくすることができるため細胞培養容器として適している。また、培養操作も簡便化することが出来、効率よく細胞培養を実施することが出来る。例として網目状シートを円筒状に巻いたものをスピナーフラスコ内に収納した模式図を図２に示す。

このような網目状シートを用いた細胞培養容器の形態は特に限定されないが、例えば図２に示すように、上方の１つの蓋４と側部に２つの出入口を有する培養容器２に網目状シート１が適宜必要な枚数重ねられた状態で巻かれて内挿された形態が挙げられる。前記導入口３ａから導入された培養液が細胞培養容器内を通って排出口３ｂから排出されるように構成されている。前記導入口３ａまたは排出口３ｂには、エアベントフィルタや酸素および／または二酸化炭素などのガスを供給するための流路を設けてもよい。

このような形態の細胞培養容器を用いることにより、容器内の細胞へ随時、新鮮な培養液やガス等を連続的または断続的に供給することができるため、細胞培養容器としてシャーレや多段フラスコ等を用いる際に必要な培養液等の交換作業は不要となり、作業者の手間や拘束時間を減らすことができる。

（培養の対象となる細胞）
本発明において、培養の対象となる細胞としては、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。また、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞や、さらに胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。また、タンパク質生産に用いる細胞であっても良いし、ウイルスを感染させるための細胞であっても良い。

（細胞培養装置）
図３は、本発明に用いる細胞培養装置の一例を示している。図３には、網目状シートをスピナーフラスコ内に収納した細胞培養容器２を例示している。細胞培養容器２の内部に連通する導入口３ａには、容器５から接着性細胞を含む細胞懸濁液または細胞培養液を送液するための流路が接続（挿入）されている。また、前記流路の途中に送液ポンプ６が設けられている。また、前記細胞培養容器の内部に連通する排出口３ｂには、細胞培養液または培養後の細胞（懸濁液）を排出するための流路が設けられ（挿入され）ており、容器９に接続されている。また、流路の途中には送液ポンプ７が設けられている。なお、導入口３ａおよび排出口３ｂにはエアベントフィルタが装着されている。

（細胞培養）
図３を参照して、細胞培養容器２に細胞懸濁液を適量加えた後、マグネティックスターラー１０を起動して細胞懸濁液中の接着性細胞を細胞培養容器２内の網目状シート１に接着させる。網目状シート１に細胞が接着した後、送液ポンプ６を起動して容器５から細胞培養液を細胞培養容器２に送液する。また、送液ポンプ７を起動して細胞培養容器２から細胞培養液を排出する。このとき、細胞培養液の送液と排出は連続で行っても、断続的に行ってもよいが、細胞培養容器内の液量がほぼ一定に保たれるように送液ポンプの送液量と排出量を調節するのが好ましい。なお、少なくとも細胞培養容器２、容器５およびそれらを繋ぐ流路は、温度およびＣＯ_２濃度の制御機構を備えたインキュベータ内に設置するのが好ましい。

（培養液の流量）
本発明において、細胞培養液の流量は、用いるスピナーフラスコの容量や細胞数にもよるが、流量が少なすぎると細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流量が多すぎると細胞周囲の環境変化が激しく、細胞が周りの環境に馴染めず、細胞が増殖しにくくなる。このように、細胞培養容器内を流れる、あるいは循環する培養液の流量は、細胞増殖度合いや環境に応じて、調整することが好ましい。細胞増殖度合いを調べる方法は、特に限定されないが、培養液中のグルコースや乳酸塩の濃度等の測定結果をもとに行うことが出来る。

（細胞の回収）
培養終了後は、送液ポンプ６を停止し、容器５内の細胞培養液を排出する。細胞培養液を排出した後、容器５を洗浄液である二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に変更し、再度送液ポンプ６を起動して送液する。洗浄が終了した後、送液ポンプ６を停止し、細胞培養容器２内の洗浄液を排出する。洗浄液の排出が終了した後、容器５をトリプシン等のプロテアーゼ溶液に変更して、再度送液ポンプ６を起動し、送液ポンプ７を停止する。細胞培養容器２内にプロテアーゼ溶液が充填された後、送液ポンプ６、７を停止し、一定時間インキュベートして培養細胞を網目状シート表面から剥離させる。その後、容器９を細胞回収用の容器に交換し、送液ポンプ７を起動して剥離した細胞をプロテアーゼ溶液とともに排出し、容器９に回収する。

以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下に代表的な細胞培養装置の培養実施方法を記載する。

（網目状シートの線維径、網目のサイズの測定）
網目状シートをＮｉｋｏｎ製顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ ＬＶ１００）のステージに設置した後、ＣＣＤカメラ（ＤＳ−Ｒｉ１）および画像処理装置（ＤＩＧＩＴＡＬ ＳＩＧＨＴ ＤＳ−Ｕ２）を用いて網目状シートの撮影および画像の取り込みを行った。得られた画像について、画像解析ソフト（ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｄ３．００ ＳＰ６）を用い、前記解析ソフトの計測機能を用いて測定することで網目状シートの線維径および網目の面積を算出した。各５点測定し、それらの平均値を線維径および網目の面積とした。また、得られた網目の面積を正方形と仮定して一辺の長さを算出し、網目のサイズとした。

［実施例１］
（網目状シートの準備）
ポリプロピレン製の網目状シート（ハギテック社製、型式２５５３−２５１８−０４、線径１５３μｍ、網目のサイズ３７６μｍ、厚み２８５μｍ）を、幅１５０ｍｍ、長さ１０００ｍｍに切ったものを１枚用意した。これを超純水で洗浄した後、０．０５％ウシコラーゲン溶液に２０分間浸し、その後、再び超純水ですすぎ、クリーンベンチ内で自然乾燥させた。

（細胞培養容器の準備）
細胞培養容器を以下のように準備した。
前述の網目状シートをガンマ線照射により滅菌した後、渦巻状になるように巻き、オートクレーブ滅菌した容量１０００ｍＬのスピナーフラスコ（コーニング製、コード：００５７０４４−０００）内に入れた。これをマグネティックスターラー１０に設置し、細胞培養容器内の培養液を撹拌出来るようにした。容器５にウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）添加したダルベッコ改変イーグル培地を入れ、送液ポンプ６を起動して、細胞培養容器内に培養液を５００ｍＬ注入した。

（細胞培養実験）
準備した細胞培養容器を用い、図３に示すような細胞培養装置を構成した。ウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）添加したダルベッコ改変イーグル培地に、プライマリーのヒト間葉系幹細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．製）を懸濁し、細胞培養容器内に導入した後、前記培地を加えて全量を５００ｍＬとし、２時間静置し、網目状シート表面に細胞を接着させた。次いで、ポンプ６および７を作動させ、容器５から細胞培養容器への流量を１００μＬ／ｍｉｎに調整して培養を開始した。培養開始２４時間後から、マグネティックスターラー１０により培養液を攪拌しながら培養を実施した。培養開始から４８時間後に流量を２００μＬ／ｍｉｎ、７２時間後にポンプ６の流量を３５０μＬ／ｍｉｎにして培養を実施した。本細胞培養実験は、ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃、７日間行った。

（細胞培養容器からの細胞回収）
７日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の灌流を停止した後、細胞培養容器内の培養液を除去し、替わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入し、５分間静置した。次に、ＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を細胞培養容器内へ静かに注入し、室温で１分間インキュベートした後、０．２５％トリプシン溶液を除去した。更に室温で５〜１５分間静置して、細胞を網目状シート表面から剥離させた後、ウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）添加したダルベッコ改変イーグル培地を細胞培養容器内へ流し入れ、剥離した細胞を培養液と共に回収した。回収した細胞について、生細胞数および細胞増殖率を計測した。

（細胞回収数の測定）
細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１０ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ^２エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算法：
Ｃ＝Ｎ×１０^４
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０^４：１ｍｍ^２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量

（細胞増殖率の測定）
培養終了後の細胞培養容器より回収した生細胞数と初期の播種細胞数（３．１５×１０^６）を用いて以下の式により細胞増殖率を算出した。
細胞増殖率（％）＝（回収した生細胞数−播種細胞数）／播種細胞数×１００

実施例１と同様の実験を８回繰り返し、回収された間葉系幹細胞数および細胞増殖率を求めた（表１）。

［実施例２］
ポリエチレン製の網目状シート（ハギテック社製、型式２５５３−３０６８−０４、線径１２２μｍ、網目のサイズ１７７μｍ、厚み２６０μｍ）を、幅１５０ｍｍ、長さ１０００ｍｍに切ったものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。

［実施例３］
ナイロン製の網目状シート（ハギテック社製、型式２５５３−３０６９−１９、線径１６０μｍ、網目のサイズ２６３μｍ、厚み２９０μｍ）を、幅１５０ｍｍ、長さ１０００ｍｍに切ったものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。

［実施例４］
ポリプロピレン製の網目状シート（セミテック社製、型式０５−１０００／４５、線径５００μｍ、網目のサイズ１０００μｍ、厚み１０２０μｍ）を、幅１５０ｍｍ、長さ１０００ｍｍに切ったものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。

本発明により、簡便で低コストに高密度の細胞培養が可能な細胞培養容器を提供することができる。

１ 網目状シート
２ 細胞培養容器
３ａ 導入口
３ｂ 排出口
４ 細胞培養容器の上蓋
５、９ 容器
６、７ 送液ポンプ
８ エアベントフィルター
１０ マグネティックスターラー
１１ 撹拌棒

Claims (4)

1. 撹拌棒付きスピナーフラスコ内に接着性細胞の足場となる網目状シートが収納された細胞培養容器であって、前記網目状シートは前記撹拌棒と干渉しないように前記撹拌棒の周囲に筒状および／または渦巻状に配置された、細胞培養容器。
2. 前記接着性細胞は、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞または前駆細胞である、請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 前記網目状シートは、線維径が１００〜２０００μｍである、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
4. 前記網目状シートは、網目のサイズが１０〜１０００μｍである、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。