JP2019128371A

JP2019128371A - 倒立型顕微鏡および標本観察方法

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Publication number: JP2019128371A
Application number: JP2018007796A
Authority: JP
Inventors: 島田　佳弘; Yoshihiro Shimada; 佳弘島田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2018-01-22
Publication date: 2019-08-01
Also published as: US10859807B2; US20190227294A1

Abstract

【課題】シンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察する。【解決手段】マルチウエルプレート３を支持するＸＹステージ５と、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに先端レンズ１９を対向させて配置される液浸対物レンズ７と、照準部９と、注液装置１１と、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａと先端レンズ１９とが先端レンズ１９上に形成可能な液滴の高さよりも光軸方向に大きい間隔をあけて配置された状態で先端レンズ１９上に液滴を形成することを目的として注液装置１１を制御し、その後、マルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７とを近接させて先端レンズ１９上の液滴を下面１７ａに接触させることにより液柱を形成した後、その液柱を維持しながら液浸対物レンズ７を移動させることを目的として、照準部９を制御する制御器１３とを備える倒立型顕微鏡１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、倒立型顕微鏡および標本観察方法に関するものである。

近年、スフェロイドやオルガノイド等の３次元培養細胞の顕微鏡画像データを得て、画像解析技術を用いてスクリーニングを行い、薬効を評価する方法が注目されている。また、近年、３次元培養細胞を構成する個々の細胞の細胞内小器官を解析することが求められ、必然的に解像度の高い画像が要求されている。この高解像化への要求を満たすために、大きなＮＡを有し、かつ、３次元培養細胞の全体を観察可能な大きな作動距離を有する液浸対物レンズの利用が強く望まれている。また、スクリーニングの実現には、サンプルが収容されるマイクロプレート等の容器の下面と液浸対物レンズの先端レンズとの間の注液の自動化が必須である。そのため、高ＮＡ、大作動距離の液浸対物レンズとともに顕微鏡システムの総合的な自動化が強く要求されている。

従来、液浸対物レンズの利用と注液の自動化とを実現する技術が知られている（例えば、特許文献１〜４参照。）。しかしながら、特許文献１〜３の技術は、観察対象としているサンプルが単層培養細胞等の薄いサンプルであり、また、液浸対物レンズの先端レンズとサンプル容器の下面との間に形成する液が「immersion film」である。そのため、これら特許文献１〜３の技術が、例えばオルガノイド等の大きな厚さのあるサンプルの全体を観察可能な大きな作動距離を有する液浸対物レンズの使用を意図していないことは明らかである。また、特許文献１〜３には、液浸対物レンズの先端レンズとサンプル容器の底部の下面との間に高さが高い液柱を形成する手段についてなんら述べられていない。

また、特許文献４には、先端レンズ上に液体を供給した後に、試料を収容した容器に液浸対物レンズを近づけることが記載されているが、この方法だけでは先端レンズ上に形成する液滴の高さよりも高い位置に焦点位置を有する対物レンズを使用することはできない。
これに対し、先端レンズ上の液滴の高さよりも高い位置に焦点位置を有する液浸対物レンズを利用する技術が知られている（例えば、特許文献５参照。）。

米国特許第７９６１３８４号明細書米国特許出願公開第２０１５／００１５９４３号明細書特許第５５９７８６８号公報特許第４２５３５９２号公報米国特許第７３２７５１４号明細書

しかしながら、特許文献５の技術は、装置の構造が複雑で漏水を防ぐための工夫が必用であり、また、照準部において液を封入している蛇腹状の部材（ダイアフラム）を対物レンズ先端で押さなければならない。そのため、特許文献５の技術は、照準部に負担がかかり、目的の照準精度が得られない可能性があるという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、シンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができる倒立型顕微鏡および標本観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、光学的に透明で平坦な平坦部材を支持して該平坦部材の上方に標本を保持可能な保持部と、該保持部により支持された前記平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置される液浸対物レンズと、前記保持部および前記液浸対物レンズの少なくとも一方を該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に移動させる照準部と、前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端との間に液体を注入する注液部と、前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端とが該先端上に形成可能な液滴の高さよりも前記光軸方向に大きい間隔をあけて配置された状態で、前記先端上に前記液体を注入することにより前記液滴を形成することを目的として前記注液部を制御し、その後、前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に近接させて、前記先端上の前記液滴を前記平坦部材の前記下面に接触させることにより、前記液体が前記先端および前記下面に接触した状態からなる液柱を形成した後、前記液柱を維持しながら前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させることを目的として、前記照準部を制御する制御部とを備える倒立型顕微鏡である。

本態様によれば、制御部により照準部および注液部が制御されて、平坦部材と液浸対物レンズとが液浸対物レンズの先端上に形成する液滴の高さよりも光軸方向に大きい間隔をあけて配置された状態で、液浸対物レンズの先端上に液滴が形成されると、その先端上の液滴が平坦部材の下面に接触することによって液柱が形成されるまで平坦部材と液浸対物レンズとが相対的に光軸方向に近接させられた後、その液柱が維持されながら保持部と液浸対物レンズとが相対的に光軸方向に移動させられる。

これにより、保持部により平坦部材の上方に保持される標本上で液浸対物レンズの焦点位置を合わせ、標本における液浸対物レンズの焦点位置から発せられる光を平坦部材と液浸対物レンズとの間に充填されている液柱を介して液浸対物レンズにより集光して、標本を観察することができる。したがって、照準部により保持部と液浸対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させるとともに注液部により平坦部材と液浸対物レンズとの間に液体を注入するだけのシンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができる。

本発明の第２態様は、光学的に透明で平坦な平坦部材を支持して該平坦部材の上方に標本を保持可能な保持部と、該保持部により支持された前記平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置される液浸対物レンズと、前記保持部および前記液浸対物レンズの少なくとも一方を該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に移動させる照準部と、前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端との間に液体を注入する注液部と、前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端とが該先端上に形成可能な液滴の高さよりも前記光軸方向に小さい間隔をあけて配置された状態で、前記先端上に前記液体を注入することにより前記液体が前記先端および前記下面に接触した状態からなる液柱を形成することを目的として前記注液部を制御し、その後、前記液柱を維持しながら前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させることを目的として前記照準部を制御する制御部とを備える倒立型顕微鏡である。

本態様によれば、制御部により照準部および注液部が制御されて、平坦部材と液浸対物レンズとが液浸対物レンズの先端上に形成する液滴の高さよりも光軸方向に小さい間隔をあけて配置された状態で、液浸対物レンズの先端上に平坦部材の下面に接触する液柱が形成されると、その液柱が維持されながら保持部と液浸対物レンズとが相対的に光軸方向に移動させられる。

また、液浸対物レンズの先端と平坦部材の下面の両方で保持しながら液柱を形成することができ、液浸対物レンズの先端だけで保持される液滴を形成する場合よりも大きい保持力が得られる。したがって、液浸対物レンズの先端上に注入する液体の量を増やすことにより、平坦部材と液浸対物レンズとの間に十分な量の液柱を形成することができる。

上記第１、第２態様においては、前記制御部が、前記照準部により、前記液柱を維持したまま前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させる前にまたは移動させながら、前記先端上に前記液体を補充することを目的として前記注液部を制御することとしてもよい。

液浸対物レンズの先端上の液滴が平坦部材の下面に接触した状態では、液浸対物レンズの先端だけで液滴を保持する場合よりも保持力が増大することによって、液柱に含ませることができる液量が増加する。したがって、上記構成によって、平坦部材と液浸対物レンズとの間に十分な量の液柱を確保して標本を観察することができる。

上記第１、第２態様においては、前記液浸対物レンズの前記先端と前記平坦部材の前記下面との間に貯留されている前記液体を排出する排液部を備え、前記制御部が、前記照準部により、前記液柱を維持しながら、前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させて前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを近接させる場合は、前記先端上の前記液体を減量させることを目的として前記排液部を制御し、前記照準部により、前記液柱を維持しながら、前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させて前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを離間させる場合は、前記先端上に前記液体を補充することを目的として前記注液部を制御することとしてもよい。

平坦部材と液浸対物レンズとが相対的に近接する方向や離間する方向に移動すると、これらの間に保持されている液柱が崩れて本来保持可能な液量よりも減ってしまい、液柱を保持する信頼性が低下することがある。上記構成によって、標本における観察位置に応じて保持部と液浸対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させる場合において、注液部および排液部により平坦部材と液浸対物レンズとの間に適当な量の液柱を維持することができ、液柱を保持する信頼性を向上することができる。

上記態様においては、前記注液部および前記排液部が、互いに共通の駆動源により駆動することとしてもよい。
この構成によって、注液部と排液部の駆動源が１つで済み、排液部を備える場合であっても構造が複雑になるのを抑えることができる。前記駆動源がペリスタルティックポンプであってもよい。

上記第１、第２態様においては、前記保持部が、前記光軸方向に交差する交差方向に移動可能に設けられ、前記制御部が、前記液柱が形成されている状態で、前記保持部を前記交差方向に移動させて前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記交差方向にずらす場合に、前記先端上に前記液体を補充することを目的として前記注液部を制御することとしてもよい。

液浸対物レンズと平坦部材との間に液柱が形成されている状態で平坦部材と液浸対物レンズとを相対的に交差方向にずらすと、平坦部材の下面に引きずられて液浸対物レンズの先端上の液柱の液量が減少することがある。上記構成によって、標本における観察位置に応じて保持部を交差方向に移動させる場合において、注液部により平坦部材と液浸対物レンズとの間に適当な量の液柱を維持することができる。

上記第１、第２態様においては、前記液浸対物レンズの前記先端から焦点位置までの距離が、前記先端上に形成可能な前記液滴の高さよりも長くてもよい。
この構成によって、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞の全体を観察することができる。前記液浸対物レンズの前記先端から焦点位置までの距離が１．５ｍｍ以上であってもよい。

本発明の第３態様は、上方に標本が保持された光学的に透明で平坦な平坦部材と該平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置された液浸対物レンズとを該液浸対物レンズの前記先端上に形成可能な液滴の高さよりも大きい間隔をあけて配置した状態で、前記先端上に液体を注入して前記液滴を形成する液滴形成工程と、前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に近接させて、前記先端上に形成された前記液滴を前記平坦部材の前記下面に接触させることにより、前記液体が前記先端および前記下面に接触した状態からなる液柱を形成する液柱形成工程と、前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させ、前記平坦部材の上方に保持されている前記標本上で前記液浸対物レンズの焦点位置を調整する焦点位置調整工程とを含む標本観察方法である。

本態様によれば、液滴形成工程により平坦部材と液浸対物レンズとが液浸対物レンズの先端上に形成する液滴の高さよりも光軸方向に大きい間隔をあけて配置された状態で、液浸対物レンズの先端上に液滴が形成され、その後、液柱形成工程により、液浸対物レンズの先端上の液滴が平坦部材の下面に接触することによって液柱が形成されるまで平坦部材と液浸対物レンズとが相対的に光軸方向に近接される。そして、焦点位置調整工程により、平坦部材の上方に保持されている標本上で液浸対物レンズの焦点位置が合わせられるまで、液柱が維持されながら平坦部材と液浸対物レンズとが相対的に光軸方向に移動される。

これにより、標本における液浸対物レンズの焦点位置から発せられる光を平坦部材と液浸対物レンズとの間に充填されている液柱を介して液浸対物レンズにより集光して、標本を観察することができる。したがって、平坦部材と液浸対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させるとともに平坦部材と液浸対物レンズとの間に液体を注入するだけのシンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができる。

本発明の第４態様は、上方に標本が保持された光学的に透明で平坦な平坦部材と該平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置された液浸対物レンズとを該液浸対物レンズの前記先端上に形成可能な液滴の高さよりも小さい間隔をあけて配置した状態で、前記先端上に液体を注入することにより、該液体が前記先端および前記平坦部材の前記下面に接触した状態からなる液柱を形成する液柱形成工程と、前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に移動させ、前記平坦部材の上方に保持されている前記標本上で前記液浸対物レンズの焦点位置を調整する焦点位置調整工程とを含む標本観察方法である。

本態様によれば、液柱形成工程により、平坦部材と液浸対物レンズとが液浸対物レンズの先端上に形成する液滴の高さよりも光軸方向に小さい間隔をあけて配置された状態で、液浸対物レンズの先端上に平坦部材の下面に接触する液柱が形成された後、焦点位置調整工程により、平坦部材の上方に保持されている標本上で液浸対物レンズの焦点位置が合わせられるまで、液柱が維持されながら平坦部材と液浸対物レンズとが相対的に光軸方向に移動される。

これにより、標本における液浸対物レンズの焦点位置から発せられる光を平坦部材と液浸対物レンズとの間に充填されている液柱を介して液浸対物レンズにより集光して、標本を観察することができる。したがって、平坦部材と液浸対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させるとともにこれらの間に液体を注入するだけのシンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができる。

上記第３、第４態様においては、前記焦点位置調整工程により前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させる前にまたは移動させながら、前記液浸対物レンズの前記先端上に前記液体を補充することとしてもよい。

液浸対物レンズと平坦部材との間に液柱が形成されている状態では、液浸対物レンズの先端だけで液滴を保持する場合よりも保持力が増大することによって、液柱に含ませることができる液量が増加する。したがって、上記構成によって、平坦部材と液浸対物レンズとの間に十分な量の液柱を確保して標本を観察することができる。

上記第３、第４態様においては、前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に近接させる方向に移動させる場合に前記先端上の前記液体を減量し、前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に離間させる方向に移動させる場合に前記先端上に前記液体を補充することとしてもよい。

この構成によって、標本における観察位置に応じて平坦部材と液浸対物レンズとを相対的に近接する方向や離間する方向に移動させる場合において、平坦部材と液浸対物レンズとの間に適当な量の液柱を維持することができ、液柱を保持する信頼性を向上することができる。

上記第３、第４態様においては、前記液柱が形成されている状態で、前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に交差する交差方向にずらす場合に、前記平坦部材の前記先端上に前記液体を補充することとしてもよい。

この構成によって、標本における観察位置に応じて保持部と液浸対物レンズとを相対的に交差方向に移動させる場合において、注液部により平坦部材と液浸対物レンズとの間に適当な量の液柱を維持することができる。

本発明によれば、シンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る倒立型顕微鏡の概略構成図である。本発明の第１実施形態に係る標本観察方法を説明するフローチャートである。図１のマルチウエルプレートの底部と液浸対物レンズとを光軸方向に離間させて配置して、先端レンズ上に液滴を形成した状態を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。図３の状態からマルチウエルプレートと液浸対物レンズとを近接させて、先端レンズ上の液滴をマルチウエルプレートの底部の下面に接触させることにより液柱を形成した状態を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。図４の状態から液柱を維持しながらマルチウエルプレートから液浸対物レンズを離間させることにより、焦点位置を調整する様子を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。本発明の第２実施形態に係る標本観察方法を説明するフローチャートである。マルチウエルプレートの底部と液浸対物レンズとを光軸方向に近接させて配置した状態を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。図７の状態から液浸対物レンズの先端レンズ上にマルチウエルプレートの底部の下面に接触する液柱を形成した状態を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。図８の状態から液柱を維持しながらマルチウエルプレートから液浸対物レンズを離間させることにより、焦点位置を調整する様子を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。マルチウエルプレートと液浸対物レンズとを近接させながら先端レンズ上の液柱を減量する様子を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。マルチウエルプレートと液浸対物レンズとを離間させながら先端レンズ上に液体を補充する様子を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。マルチウエルプレートと液浸対物レンズとを交差方向にずらしながら先端レンズ上に液体を補充する様子を示すマルチウエルプレートおよび液浸対物レンズの縦断面図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る倒立型顕微鏡および標本観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る倒立型顕微鏡１は、マルチウエルプレート３を支持するＸＹステージ（保持部）５と、ＸＹステージ５により支持されたマルチウエルプレート３の下方に配置される液浸対物レンズ７と、液浸対物レンズ７をその光軸に沿う方向（光軸方向）に移動させる照準部９と、マルチウエルプレート３と液浸対物レンズ７との間に液体を注入する注液装置（注液部）１１と、ＸＹステージ５、照準部９および注液装置１１を制御する制御器（制御部）１３とを備えている。以下、液浸対物レンズ７の光軸に沿う方向をＺ方向とし、Ｚ方向に直交しかつ互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。

マルチウエルプレート３は、例えば、直線状に配列された複数のウエル１５を有する直方体の箱状の形態を有している。このマルチウエルプレート３は、各ウエル１５内に透明化溶液Ｗとともに標本Ｓを収容することができるようになっている。また、マルチウエルプレート３は、少なくとも底部（平坦部材）１７が光学的に透明で平坦な材質により形成されている。この底部１７は、各ウエル１５の底部を構成している。
標本Ｓとしては、スフェロイドやオルガノイド等の任意の３次元培養細胞を採用することができる。

ＸＹステージ５は、ウエル１５に標本Ｓが収容されたマルチウエルプレート３を支持することによって、マルチウエルプレート３の底部１７の上方に標本Ｓを保持することができる。このＸＹステージ５は、図示しないモータおよびボールネジ等の直動機構によって、ＸＹ方向の任意の位置に移動することができるようになっている。ＸＹステージ５がＸＹ方向に移動することによって、ＸＹステージ５により支持されているマルチウエルプレート３がＸＹ方向に移動する。ＸＹステージ５は、手動で移動させることができるようになっていてもよい。

液浸対物レンズ７は、多数のレンズを組み合わせて構成されており、これら多数のレンズを保持する筒状の筐体２１を備えている。本実施形態では、多数のレンズの内の先端レンズ１９を図示して説明する。

筐体２１は、光軸方向の先端に先端レンズ１９を保持している。先端レンズ１９のレンズ面が液浸対物レンズ７の先端となる。この筐体２１は、光軸方向の先端側に先端レンズ１９に向かって次第に先細になるテーパ面２１ａを有している。テーパ面２１ａには、フッ素樹脂コート等の撥水性の表面処理が施されている。

また、液浸対物レンズ７は、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに先端レンズ１９を対向させて鉛直上方に向けて配置されている。液浸対物レンズ７は、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａと先端レンズ１９との間に液体（イマージョン液）を表面張力によって保持することができるようになっている。

また、液浸対物レンズ７は、先端レンズ１９から焦点位置までの距離が、先端レンズ１９上に形成される液滴Ｆ（図３参照。）の高さよりも長く、例えば、先端レンズ１９から焦点位置までの距離が１．５ｍｍ以上の長さを有している。

また、液浸対物レンズ７には、筐体２１のテーパ面２１ａに薄い板部材からなる環状のキャップ２３が被せられている。キャップ２３は、筐体２１のテーパ面２１ａを覆うカバー部２５と、カバー部２５から筐体２１の外周面に沿って光軸方向に延びる中間部２７と、中間部２７から筐体２１の基端側に傾斜しながら径方向外方に向かって張り出す張り出し部２９とを備えている。

カバー部２５は、中央に先端レンズ１９を露出させる開口２５ａを有している。また、カバー部２５は、筐体２１のテーパ面２１ａに沿って傾斜する内面を有し、カバー部２５の内面とテーパ面２１ａとの間に僅かに隙間をあけて配置されている。カバー部２５の内面は、筐体２１のテーパ面２１ａと同様に、撥水性の表面処理が施されている。

中間部２７の内周面と筐体２１の外周面との間にはＯリング３１が配置されており、Ｏリング３１によって中間部２７の内周面と筐体２１の外周面との間が全周にわたって液密状態に密封されている。中間部２７には、Ｏリング３１よりも上方に厚さ方向に貫通する注水口２７ａが形成されている。

張り出し部２９は、全周に亘って光軸方向に立ち上がる外縁部２９ａを有し、先端レンズ１９上から溢れてカバー部２５の外面を通って流れてくる液体を外縁部２９ａによって受け止めることができるようになっている。また、張り出し部２９には、外縁部２９ａにより受け止めた液体を排出する排水口２９ｂが外縁部２９ａの近傍に設けられている。排水口２９ｂから排出された液体は排水タンク３３に貯留されるようになっている。

注液装置１１は、液体を貯留する注水タンク３５と、注水タンク３５に貯留されている液体を吸い上げるペリスタルティックポンプ（駆動源）３７と、一端がキャップ２３の注水口２７ａに接続され、他端がペリスタルティックポンプ３７に接続されたチューブ３９とを備えている。

この注液装置１１は、ペリスタルティックポンプ３７により注水タンク３５から吸い上げた液体をチューブ３９の一端から吐出することができるようになっている。これにより、注液装置１１は、キャップ２３の注水口２７ａからカバー部２５の内面と筐体２１のテーパ面２１ａとの隙間を通して液浸対物レンズ７の先端レンズ１９上に注水し、先端レンズ１９上に液滴Ｆを形成することができるようになっている。

筐体２１のテーパ面２１ａおよびカバー部２５の内面に撥水性の表面処理が施されていることによって、先端レンズ１９の上方に空間的な制約がなければ、先端レンズ１９上に大きな液滴Ｆを形成することができる。また、注液装置１１は、ペリスタルティックポンプ３７を注水する運転とは逆に運転することにより、先端レンズ１９上の液体をチューブ３９の一端から吸引して注水タンク３５に戻すこともできるようになっている。

制御器１３は、例えば、ＣＰＵ(Central Processing Unit）と、ＲＯＭ（Read Only Memory）およびＲＡＭ（Random Access Memory）等の主記憶部と、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）等の補助記憶部と、データを出力する出力部と、外部機器との間で種々のデータのやりとりを行う外部インタフェース等（いずれも図示略）を備えている。補助記憶部には各種プログラムが格納されており、ＣＰＵが補助記憶部からプログラムをＲＡＭ等の主記憶部に読み出して、そのプログラムを実行することにより、種々の処理が実現されるようになっている。

具体的には、制御器１３は、注水プログラムの実行により、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａと液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とを先端レンズ１９上に形成可能な液滴Ｆの高さよりも光軸方向に大きい間隔をあけて配置することを目的として照準部９を制御した後、先端レンズ１９上に液体を注入して液滴Ｆを形成することを目的として注液装置１１を制御するようになっている。

また、制御器１３は、焦点位置調整プログラムの実行により、マルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とを相対的に光軸方向に近接させて、先端レンズ１９上の液滴Ｆをマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触させることによって、液体が先端レンズ１９および下面１７ａに接触した状態からなる液柱を形成した後、先端レンズ１９と下面１７ａとの間のその液柱を維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させることを目的として、照準部９を制御するようになっている。さらに、制御器１３は、先端レンズ１９および下面１７ａに接触する液柱を維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させる間、先端レンズ１９上に液体を補充することを目的として注液装置１１を制御するようになっている。以下、液体が先端レンズ１９および下面１７ａに接触した状態からなる液柱に液滴Ｆと同じ符号Ｆを付すこととする。

次に、本実施形態に係る標本観察方法は、図２のフローチャートに示すように、液浸対物レンズ７の光軸方向の位置を調整し、各ウエル１５に標本Ｓを収容したマルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７とを液浸対物レンズ７の先端レンズ１９上に形成可能な液滴Ｆの高さよりも大きい間隔をあけて配置する間隔調整工程（液滴形成工程）ＳＡ１と、間隔調整工程ＳＡ１により液浸対物レンズ７の光軸方向の位置が調整された状態で、先端レンズ１９上に液体を注入して液滴Ｆを形成する液体注水工程（液滴形成工程）ＳＡ２と、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａと液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とを相対的に光軸方向に近接させて、先端レンズ１９上に形成された液滴Ｆをマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触させることにより、液柱Ｆを形成する液柱形成工程ＳＡ３と、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させて、ウエル１５に収容されている標本Ｓ上で液浸対物レンズ７の焦点位置を調整する焦点位置調整工程ＳＡ４とを含んでいる。

このように構成された倒立型顕微鏡１および標本観察方法の作用について、図２のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る倒立型顕微鏡１および標本観察方法により標本Ｓを観察する場合は、まず、制御器１３により照準部９が制御され、液浸対物レンズ７が光軸方向に移動して、図３に示すように、観察対象の標本Ｓが収容されているマルチウエルプレート３のウエル１５の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とが先端レンズ１９上に形成する液滴Ｆの高さよりも大きい間隔をあけて配置される（ステップＳＡ１）。

次いで、制御器１３により注液装置１１が制御され、ペリスタルティックポンプ３７によって注水タンク３５から吸い上げられた液体がチューブ３９の一端から吐出される。チューブ３９の一端から吐出された液体は、キャップ２３の注水口２７ａからカバー部２５の内面と筐体２１のテーパ面２１ａとの隙間を通って先端レンズ１９上に注入される。これにより、先端レンズ１９上に液滴Ｆが形成される（ステップＳＡ２）。この段階では、先端レンズ１９上に形成された液滴Ｆは、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触していない。

次いで、制御器１３により照準部９が制御され、図４に示すように、先端レンズ１９上に形成された液滴Ｆがマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触することによって液柱Ｆが形成されるまで、液浸対物レンズ７がマルチウエルプレート３に近接する方向に移動する（ステップＳＡ３）。

次いで、先端レンズ１９上の液滴Ｆがマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触することによって液柱Ｆが形成されたら、制御器１３により照準部９および注液装置１１が制御され、図５に示すように、キャップ２３の注水口２７ａから先端レンズ１９上に液体が補充されながら液浸対物レンズ７がマルチウエルプレート３から離間する方向に移動する。そして、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆが維持されながら、液浸対物レンズ７がマルチウエルプレート３から離間する方向や近接する方向に移動して、液浸対物レンズ７の光軸方向の位置が調整され、ウエル１５に収容されている標本Ｓ上で液浸対物レンズ７の焦点位置が合わせられる（ステップＳＡ４）。これにより、標本Ｓにおける液浸対物レンズ７の焦点位置から発せられる光がマルチウエルプレート３の底部１７と先端レンズ１９との間に充填されている液柱Ｆを透過して液浸対物レンズ７により集光され、標本Ｓが観察される。

以上説明したように、本実施形態に係る倒立型顕微鏡１および標本観察方法によれば、照準部９により液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させるとともに注液装置１１によりマルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９との間に液体を注入するだけのシンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができる。

また、先端レンズ１９上の液滴Ｆがマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触した状態では、先端レンズ１９だけで液滴Ｆを保持する場合よりも保持力が増大することにより、液柱Ｆに含ませることができる液量が増加することから、液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させながら先端レンズ１９上に液体を補充することによって、マルチウエルプレート３の底部１７と先端レンズ１９との間に十分な量の液柱Ｆを確保して標本Ｓを観察することができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る倒立型顕微鏡および標本観察方法について説明する。
本実施形態に係る倒立型顕微鏡１および標本観察方法は、図１に示すように第１実施形態と同様の構成であり、第１実施形態とは制御器１３による照準部９および注液装置１１の制御の仕方が異なる。
以下、第１実施形態に係る倒立型顕微鏡１および標本観察方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態において、制御器１３は、注水プログラムの実行により、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａと液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とを液滴Ｆの高さよりも光軸方向に小さい間隔をあけて配置することを目的として照準部９を制御した後、先端レンズ１９上に液体を注入することによって液柱Ｆを形成することを目的として、注液装置１１を制御するようになっている。

また、制御器１３は、焦点位置調整プログラムの実行により、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させることを目的として、照準部９を制御するようになっている。さらに、制御器１３は、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させる間、先端レンズ１９上に液体を補充することを目的として注液装置１１を制御するようになっている。

次に、本実施形態に係る標本観察方法は、図６のフローチャートに示すように、液浸対物レンズ７の光軸方向の位置を調整し、標本Ｓが収容されているマルチウエルプレート３のウエル１５の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とを先端レンズ１９上に形成可能な液滴Ｆの高さよりも小さい間隔をあけて配置する間隔調整工程（液滴形成工程）ＳＢ１と、間隔調整工程ＳＢ１により液浸対物レンズ７の光軸方向の位置が調整された状態で、先端レンズ１９上に液体を注入することにより、液体が先端レンズ１９およびマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触した状態からなる液柱Ｆを形成する液体注水工程（液柱形成工程）ＳＢ２と、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させて、ウエル１５に収容されている標本Ｓ上で液浸対物レンズ７の焦点位置を調整する焦点位置調整工程ＳＢ３とを含んでいる。

このように構成された倒立型顕微鏡１および標本観察方法の作用について図６のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る倒立型顕微鏡１および標本観察方法により標本Ｓを観察する場合は、まず、制御器１３により照準部９が制御され、図７に示すように、液浸対物レンズ７が光軸方向に移動して、標本Ｓが収容されているマルチウエルプレート３のウエル１５の底部１７と液浸対物レンズ７とが先端レンズ１９上に形成可能な液滴Ｆの高さよりも小さい間隔をあけて配置される（ステップＳＢ１）。

次いで、制御器１３により注液装置１１が制御され、ペリスタルティックポンプ３７によって注水タンク３５から吸い上げられた液体がチューブ３９の一端から吐出される。チューブ３９の一端から吐出された液体は、図８に示すように、キャップ２３の注水口２７ａからカバー部２５の内面と筐体２１のテーパ面２１ａとの隙間を通って先端レンズ１９上に注入される。これにより、先端レンズ１９上にマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに接触する液柱Ｆが形成される（ステップＳＢ２）。

次いで、制御器１３により照準部９および注液装置１１が制御され、図９に示すように、キャップ２３の注水口２７ａから先端レンズ１９上に液体が補充されながら液浸対物レンズ７がマルチウエルプレート３から離間する方向に移動する。そして、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆが維持されながら、液浸対物レンズ７がマルチウエルプレート３から離間する方向や近接する方向に移動して、液浸対物レンズ７の光軸方向の位置が調整され、ウエル１５に収容されている標本Ｓ上で液浸対物レンズ７の焦点位置が合わせられる（ステップＳＢ３）。これにより、標本Ｓにおける液浸対物レンズ７の焦点位置から発せられる光がマルチウエルプレート３の底部１７と先端レンズ１９との間に充填されている液柱Ｆを介して液浸対物レンズ７により集光され、標本Ｓが観察される。

以上説明したように本実施形態に係る倒立型顕微鏡１および標本観察方法によれば、液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させるとともにマルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９との間に液体を注入するだけのシンプルな構造かつ簡易な操作で所望の照準精度を得て、スフェロイドやオルガノイド等の大きな厚さを有する３次元培養細胞を観察することができる。

また、液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａの両方で保持しながら液柱Ｆを形成することができ、先端レンズ１９だけで保持される液滴Ｆを形成する場合よりも大きい保持力が得られる。したがって、先端レンズ１９上に注入する液体の量を増やし、マルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７との間に十分な量の液柱Ｆを形成することができる。さらに、液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させながら先端レンズ１９上に液体を補充することによって、マルチウエルプレート３の底部１７と先端レンズ１９との間に十分な量の液柱Ｆを確保して標本Ｓを観察することができる。

上記各実施形態においては、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させる間、先端レンズ１９上に液体を補充することとしたが、液体の補充は必ずしも必須というわけではなく、液体を補充せずにマルチウエルプレート３から液浸対物レンズ７を離間させて表面張力により液柱Ｆを光軸方向に引き伸ばすこととしてもよい。液体の補充の必要性は、液浸対物レンズ７の作動距離や液体の表面張力、先端レンズ１９周辺の部材表面やキャップ２３の先端部表面の液体との濡れ性等により決定される。

なお、液浸対物レンズ７を移動させながら液体を補充するのではなく、液浸対物レンズ７を移動させる前に先端レンズ１９上に液体を補充しておくこととしてもよいし、液浸対物レンズ７を移動させる前に先端レンズ１９上に液体を補充しておき、さらに、液浸対物レンズ７を移動させながらも液体を補充することとしてもよい。

また、上記各実施形態においては、先端レンズ１９上の液体の排水は重力により行うが、キャップ２３の排水口２９ｂに排水のためのポンプを接続することとしてもよい。また、先端レンズ１９上から液体を吸引して、吸引した液体を排水する排水装置を注液装置１１とは別に設けることとしてもよい。

上記各実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例は、制御器１３が、照準部９により、図１０に示すように、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させてマルチウエルプレート３の底部１７と先端レンズ１９とを近接させる場合は、制御器１３が注液装置１１を制御して吸引し、液浸対物レンズ７の光軸方向の位置に応じて先端レンズ１９上の液柱Ｆを減量することとしてもよい。

また、制御器１３が、照準部９により、図１１に示すように、先端レンズ１９と下面１７ａとの間の液柱Ｆを維持しながら液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させてマルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９とを離間させる場合は、制御器１３が注液装置１１を制御して注水し、液浸対物レンズ７の光軸方向の位置に応じて先端レンズ１９上に液体を補充することとしてもよい。

液浸対物レンズ７とマルチウエルプレート３の底部１７とが相対的に近接する方向や離間する方向に移動すると、これらの間に保持されている液柱Ｆが崩れて本来保持可能な液量よりも減ってしまい、液柱Ｆを保持する信頼性が低下することがある。本変形例によれば、標本Ｓの上部を観察したり下部を観察したりするなど、標本Ｓにおける観察位置に応じて液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させる場合において、注液装置１１により先端レンズ１９とマルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａとの間に液浸対物レンズ７の光軸方向の位置に応じた適当な量の液柱Ｆを維持し、液柱Ｆを保持する信頼性を向上することができる。

第２変形例は、制御器１３が、図１２に示すように、液浸対物レンズ７と下面１７ａとの間に液柱Ｆが形成されている状態で、Ｚ方向に交差する交差方向、例えば、ＸＹ方向にＸＹステージ５を移動させることによって、マルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７とを相対的にＸＹ方向にずらす場合に、制御器１３が注液装置１１を制御して注水し、ＸＹステージ５の交差方向の移動量に応じて先端レンズ１９上に液体を補充することとしてもよい。

先端レンズ１９と下面１７ａとの間に液柱Ｆが形成されている状態でマルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７とを相対的に交差方向にずらすと、マルチウエルプレート３の底部１７の下面１７ａに引きずられて先端レンズ１９上の液柱Ｆの量が減少することがある。本変形例によれば、標本ＳのＸＹ方向に異なる位置を観察したり観察対象を他のウエル１５に収容されている他の標本Ｓに切り替えたりするなど、標本Ｓにおける観察位置や観察する標本Ｓが配置されている位置に応じてＸＹステージ５を交差方向に移動させる場合において、注液装置１１によりマルチウエルプレート３の底部１７と液浸対物レンズ７の先端レンズ１９との間に適当な量の液柱Ｆを維持することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、例えば、上記各実施形態においては、照準部９により液浸対物レンズ７を光軸方向に移動させることとしたが、照準部９により、ＸＹステージ５を液浸対物レンズ７の光軸方向に移動させることとしてもよいし、ＸＹステージ５および液浸対物レンズ７の両方を光軸方向に移動させることとしてもよい。

また、上記各実施形態においては、複数のウエル１５が直線状に配列されたマルチウエルプレート３を例示して説明したが、複数のウエル１５の配列はこれに限定されるものではない。また、マルチウエルプレート３に代えて、１つのウエル１５により構成される容器を採用することとしてもよい。

また、上記各実施形態にいては、平坦部材としてマルチウエルプレート３の底部１７を例示して説明したが、これに代えて、平坦部材として、マルチウエルプレート３等の容器を載置可能なガラスプレート等を採用することとしてもよい。この場合、例えば、ＸＹステージ５が、支持したガラスプレートの下面を下方に露出させる開口部を有することとすればよい。

１倒立型顕微鏡
５ＸＹステージ（保持部）
７液浸対物レンズ
９照準部
１１注液装置（注液部、排液部）
１３制御器
１９先端レンズ（先端）
ＳＡ１，ＳＢ１間隔調整工程（液滴形成工程）
ＳＡ２液体注水工程（液滴形成工程）
ＳＡ３、ＳＢ２液柱形成工程
ＳＡ４、ＳＢ３焦点位置調整工程

Claims

光学的に透明で平坦な平坦部材を支持して該平坦部材の上方に標本を保持可能な保持部と、
該保持部により支持された前記平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置される液浸対物レンズと、
前記保持部および前記液浸対物レンズの少なくとも一方を該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に移動させる照準部と、
前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端との間に液体を注入する注液部と、
前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端とが該先端上に形成可能な液滴の高さよりも前記光軸方向に大きい間隔をあけて配置された状態で、前記先端上に前記液体を注入することにより前記液滴を形成することを目的として前記注液部を制御し、その後、前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に近接させて、前記先端上の前記液滴を前記平坦部材の前記下面に接触させることにより、前記液体が前記先端および前記下面に接触した状態からなる液柱を形成した後、該液柱を維持しながら前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させることを目的として、前記照準部を制御する制御部とを備える倒立型顕微鏡。
光学的に透明で平坦な平坦部材を支持して該平坦部材の上方に標本を保持可能な保持部と、
該保持部により支持された前記平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置される液浸対物レンズと、
前記保持部および前記液浸対物レンズの少なくとも一方を該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に移動させる照準部と、
前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端との間に液体を注入する注液部と、
前記平坦部材の前記下面と前記液浸対物レンズの前記先端とが該先端上に形成可能な液滴の高さよりも前記光軸方向に小さい間隔をあけて配置された状態で、前記先端上に前記液体を注入することにより該液体が前記先端および前記下面に接触した状態からなる液柱を形成することを目的として前記注液部を制御し、その後、前記液柱を維持しながら前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させることを目的として前記照準部を制御する制御部とを備える倒立型顕微鏡。
前記制御部が、前記照準部により、前記液柱を維持したまま前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させる前にまたは移動させながら、前記先端上に前記液体を補充することを目的として前記注液部を制御する請求項１または請求項２に記載の倒立型顕微鏡。
前記液浸対物レンズの前記先端と前記平坦部材の前記下面との間に貯留されている前記液体を排出する排液部を備え、
前記制御部が、前記照準部により、前記液柱を維持しながら、前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させて前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを近接させる場合は、前記先端上の前記液体を減量させることを目的として前記排液部を制御し、前記照準部により、前記液柱を維持しながら、前記保持部と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させて前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを離間させる場合は、前記先端上に前記液体を補充することを目的として前記注液部を制御する請求項１から請求項３のいずれかに記載の倒立型顕微鏡。
前記注液部および前記排液部が、互いに共通の駆動源により駆動する請求項４に記載の倒立型顕微鏡。
前記駆動源がペリスタルティックポンプである請求項５に記載の倒立型顕微鏡。
前記保持部が、前記光軸方向に交差する交差方向に移動可能に設けられ、
前記制御部が、前記液柱が形成されている状態で、前記保持部を前記交差方向に移動させて前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記交差方向にずらす場合に、前記先端上に前記液体を補充することを目的として前記注液部を制御する請求項１から請求項６のいずれかに記載の倒立型顕微鏡。
前記液浸対物レンズの前記先端から焦点位置までの距離が、前記先端上に形成可能な前記液滴の高さよりも長い請求項１から請求項７のいずれかに記載の倒立型顕微鏡。
前記液浸対物レンズの前記先端から焦点位置までの距離が１．５ｍｍ以上である請求項１から請求項８のいずれかに記載の倒立型顕微鏡。
上方に標本が保持された光学的に透明で平坦な平坦部材と該平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置された液浸対物レンズとを該液浸対物レンズの前記先端上に形成可能な液滴の高さよりも大きい間隔をあけて配置した状態で、前記先端上に液体を注入して前記液滴を形成する液滴形成工程と、
前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に近接させて、前記先端上に形成された前記液滴を前記平坦部材の前記下面に接触させることにより、前記液体が前記先端および前記下面に接触した状態からなる液柱を形成する液柱形成工程と、
前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させ、前記平坦部材の上方に保持されている前記標本上で前記液浸対物レンズの焦点位置を調整する焦点位置調整工程とを含む標本観察方法。
上方に標本が保持された光学的に透明で平坦な平坦部材と該平坦部材の下面に先端を対向させて鉛直上方に向けて配置された液浸対物レンズとを該液浸対物レンズの前記先端上に形成可能な液滴の高さよりも小さい間隔をあけて配置した状態で、前記先端上に液体を注入することにより、該液体が前記先端および前記平坦部材の前記下面に接触した状態からなる液柱を形成する液柱形成工程と、
前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に該液浸対物レンズの光軸に沿う光軸方向に移動させ、前記平坦部材の上方に保持されている前記標本上で前記液浸対物レンズの焦点位置を調整する焦点位置調整工程とを含む標本観察方法。
前記焦点位置調整工程により前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に移動させる前にまたは移動させながら、前記液浸対物レンズの前記先端上に前記液体を補充する請求項１０または請求項１１に記載の標本観察方法。
前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に近接させる方向に移動させる場合に前記先端上の前記液体を減量し、前記液柱を維持しながら前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に離間させる方向に移動させる場合に前記先端上に前記液体を補充する請求項１０から請求項１２のいずれかに記載の標本観察方法。
前記液柱が形成されている状態で、前記平坦部材と前記液浸対物レンズとを相対的に前記光軸方向に交差する交差方向にずらす場合に、前記平坦部材の前記先端上に前記液体を補充する請求項１０から請求項１３のいずれかに記載の標本観察方法。