JP2019105456A - Biomarker Search Method for Urinary Metabolites - Google Patents
Biomarker Search Method for Urinary Metabolites Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019105456A JP2019105456A JP2017236306A JP2017236306A JP2019105456A JP 2019105456 A JP2019105456 A JP 2019105456A JP 2017236306 A JP2017236306 A JP 2017236306A JP 2017236306 A JP2017236306 A JP 2017236306A JP 2019105456 A JP2019105456 A JP 2019105456A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urinary
- metabolite
- metabolites
- discriminant analysis
- analysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明は、尿中代謝物マーカーを探索するための方法、システム及びプログラムに関する。具体的には、本発明は、特定の疾患又は状態、特にがんと関連した尿中代謝物マーカーを探索するための方法、システム及びプログラムに関する。 The present invention relates to a method, system and program for searching for urinary metabolite markers. In particular, the present invention relates to methods, systems and programs for searching for urinary metabolite markers associated with particular diseases or conditions, in particular cancer.
従来のがんの検査法として、例えば患者由来の代謝物を使用したがんの検査方法（特許文献１）の報告があり、これは、血液中の代謝物の変動を解析することによって、がん検査を迅速かつ容易に行うというものである。具体的な工程は、(1)質量分析（MS）解析にて患者由来の代謝物のマススペクトルデータを取得する工程、(2)患者由来の代謝物、外科的切除後の患者由来の代謝物のマススペクトルデータを比較してマススペクトルの変動を検出する工程、(3)変動の検出より、患者由来の試料ががん患者由来の試料であるかを判定する工程、からなる。 As a conventional test for cancer, for example, there is a report of a test for cancer (Patent Document 1) using a metabolite derived from a patient, which can be obtained by analyzing the fluctuation of the metabolite in blood. To conduct medical examinations quickly and easily. Specific steps are: (1) obtaining mass spectrum data of a metabolite derived from a patient by mass spectrometry (MS) analysis, (2) a metabolite derived from a patient, a metabolite derived from a patient after surgical resection And (3) determining whether the sample derived from the patient is a sample derived from a cancer patient based on the detection of the variation.
従来法の特徴は、がんの検査法が1つのバイオマーカーによるものではなく、マルチマーカーによる検査を主体としたものであり、患者の病態をより詳しく反映しようとしている。マススペクトルデータの解析法では、得られたマススペクトルデータ中における特定のマススペクトルの消失、出現時間、保持時間、ピーク強度の上昇若しくは減少を解析することによってがんの判定を行う。この場合の解析モデルは、OPLS-DA等の多変量解析によって求めるとしている。 The characteristic of the conventional method is that the cancer test is not based on one biomarker, but is mainly based on multi-marker test, and it is intended to reflect the patient's condition in more detail. In mass spectral data analysis, cancer is determined by analyzing the disappearance, appearance time, retention time, and increase or decrease of peak intensity of a specific mass spectrum in the obtained mass spectrum data. The analysis model in this case is determined by multivariate analysis such as OPLS-DA.
一般的に、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS: Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer）による尿中代謝物解析のワークフローでは、まず、複数の分析モードによるLC/MSにより尿中代謝物の網羅的解析を行い、その中から群間（例えば、健常者とがん患者）で有意差のある代謝物を抽出する。複数の分析モードは、液体クロマトグラフにおける逆相モードと親水性相互作用モード、質量分析計における正負イオン化モードを組み合わせとなる。 Generally, in the workflow of urinary metabolite analysis by liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS: Liquid Chromatograph / Mass Spectrometer), firstly, comprehensive analysis of urinary metabolites by LC / MS in multiple analysis modes And extract metabolites that differ significantly among the groups (eg, healthy people and cancer patients). A plurality of analysis modes are combinations of reverse phase mode and hydrophilic interaction mode in liquid chromatograph, and positive and negative ionization modes in mass spectrometer.
LC/MSにより得られるデータは、液体クロマトグラフにおける各代謝物の溶出時間、質量分析計における各代謝物のイオンの質量とイオン強度の3次元データである（図２の上段参照）。これらのデータを前処理後、2群間（例えば、健常者とがん患者）で有意な差がある代謝物を検定で確認しながら、多変量解析（主成分解析法（PCA: Principal Component Analysis）、部分最小二乗判別法(PLS判別法: PLS-DA: Partial Least Squares Discriminant Analysis)、OPLS判別分析法(OPLS-DA: Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis)、カーネル判別分析法など）を実施して、2群を識別するのに有効なバイオマーカー候補を抽出し、（がん）検査モデルを構築するというものである。このような方法により、これまで、農作物や食品の甘味成分や機能性成分の解析、あるいは血液を用いた大腸がん検査などに有用なバイオマーカーが見出されている。 Data obtained by LC / MS are three-dimensional data of elution time of each metabolite in liquid chromatograph, mass and ion intensity of ion of each metabolite in mass spectrometer (see the upper part of FIG. 2). After pre-processing these data, multivariate analysis (principal component analysis (PCA: Principal Component Analysis) while confirming metabolites that are significantly different between the two groups (for example, healthy people and cancer patients) after the test. ), Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA: Partial Least Squares Discriminant Analysis), OPLS discriminant analysis (OPLS-DA: Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis), kernel discriminant analysis, etc. , Extract biomarker candidates effective to identify the two groups, and (cancer) to construct a test model. According to such a method, biomarkers useful for analysis of sweetness components and functional components of agricultural products and foods, and for colon cancer tests using blood and the like have been found so far.
しかしながら、例えば、尿中代謝物を用いたがん検査の場合、OPLS判別分析法を用いても、バイオマーカーの抽出に有効でない場合がある。一般に、OPLS判別分析法によるバイオマーカーの抽出では、Sプロットを用いる。Sプロットは、LC/MSによる網羅的解析により検出された代謝物について、横軸に群間におけるピーク強度差の絶対値（値が大きいほど群間で差が大きく、バイオマーカー候補となる）、縦軸に信頼性（繰り返し精度、群間の差と群内誤差の相関係数で、1に近いほど個体差がなく群間で差がある）としてプロットされた図で、バイオマーカー候補探索によく使用される。がんの解析の場合、尿中代謝物では、群間の強度差がそれほど大きくなく、群内誤差も大きい場合があり、加えて、バイオマーカー候補の代謝物が数千にものぼり構造も多岐にわたるので、Sプロットでバイオマーカー候補を絞り込むことは非常に難しい。 However, for example, in the case of a cancer test using a urinary metabolite, the OPLS discriminant analysis method may not be effective in extracting a biomarker. In general, S-plots are used in the extraction of biomarkers by OPLS discriminant analysis. The S plot is the absolute value of the peak intensity difference between the groups (the larger the value, the larger the difference between the groups becomes a biomarker candidate) for metabolites detected by exhaustive analysis by LC / MS. The graph plotted on the vertical axis as reliability (repetition accuracy, correlation coefficient between differences between groups and errors within groups, there is no individual difference as there is an individual difference closer to 1), and the biomarker candidate search Frequently used. In the case of cancer analysis, urinary metabolites may not have large differences in intensity between groups, and may have large intra-group errors, and in addition, there may be thousands of biomarker candidate metabolites and various structures. It is very difficult to narrow down biomarker candidates by S-plot.
したがって、本発明は、尿中代謝物のバイオマーカーを探索するための改善方法を提供することを課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide an improved method for searching for biomarkers of urinary metabolites.
上記課題を踏まえ、尿検体を用いたがん検査モデル構築におけるワークフローの変更を検討した。すなわち、OPLS判別分析法のSプロットにより重要なバイオマーカー候補を直接抽出するのではなく、以下の解析フローとする：
(a) LC/MSによる網羅的解析結果について、場合によりウィルコクソンの順位和検定により、健常者に対してがん患者で有意な差がある尿中代謝物に対して、p値による絞込みを行う。通常、このときの有意水準は5％とする。
(b) 上記の検定では重要なバイオマーカー候補の代謝物の絞込みは行うことができるものの定量的な評価が難しいため、絞り込んだ代謝物に対して、機械学習のひとつであるランダムフォレスト（RF：Random Forest）法を用いて、代謝物の重要度の評価を定量的に行う。重要度という数値が高いほど重要な代謝物となり、上位にランク付けされる。
(c) 抽出したバイオマーカー群を用いて、判別分析法（例えばOPLS/カーネル判別分析法）により健常者とがん患者を識別するための判別式を計算し、がん検査モデルを構築する。
(d) 場合によっては、バイオマーカー数を変えた複数のがん検査モデルを準備する。例えば、重要度の高い順から、バイオマーカーを2個、10個、30個とするがん検査モデルを構築する。
Based on the above problems, we examined changes in the workflow in cancer test model construction using urine samples. That is, instead of directly extracting important biomarker candidates by S-plot of OPLS discriminant analysis method, the analysis flow is as follows:
(a) Perform comprehensive analysis by LC / MS, in some cases by Wilcoxon rank sum test, narrow down by p value to urinary metabolites that are significantly different in cancer patients versus healthy ones . Usually, the significance level at this time is 5%.
(b) In the above test, although narrowing down of metabolites of important biomarker candidates can be performed, quantitative evaluation is difficult, so random forest (RF: The importance of metabolites is assessed quantitatively using the Random Forest method. The higher the importance value, the more important the metabolite and the higher it is ranked.
(c) Using the extracted biomarker group, the discriminant analysis method (for example, OPLS / kernel discriminant analysis method) is used to calculate a discriminant for discriminating between a healthy person and a cancer patient, and a cancer test model is constructed.
(d) In some cases, prepare multiple cancer testing models with different numbers of biomarkers. For example, a cancer test model having two, ten, and thirty biomarkers is constructed in descending order of importance.
一態様において、本発明は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、
（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップ
を含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法を提供する。
In one aspect, the invention provides
(A) applying a urine sample to a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) to analyze urinary metabolites in the urine sample;
(B) quantitatively evaluating the importance of the urinary metabolite by the random forest method based on the analysis data of the urinary metabolite, and selecting the highly important urinary metabolite;
(C) performing a discriminant analysis method using analysis data of the selected urinary metabolite;
(D) A method of searching for urinary metabolite markers is provided, including the step of determining urinary metabolites associated with a specific disease or condition as marker candidates based on the results of the discriminant analysis.
一態様において、本発明は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして、判別分析法による検査モデルを構築するステップ、
（d）場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップ
を含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法を提供する。
In one aspect, the invention provides
(A) applying a urine sample to a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) to analyze urinary metabolites in the urine sample;
(B) Based on the analysis data of urinary metabolites, urinary metabolites that are significantly increased or decreased in patients with specific diseases or conditions in some cases are narrowed down by Wilcoxon rank sum test in some cases. Evaluating the importance of the urinary metabolite quantitatively by the random forest method, and selecting the highly important urinary metabolite,
(C) constructing a test model by discriminant analysis using the selected urinary metabolite as a biomarker;
(D) Optionally, there is provided a method of searching for urinary metabolite markers, comprising the step of constructing a plurality of test models with different numbers of biomarkers based on the discriminant analysis results.
別の態様において、本発明は、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物の解析データを用いた判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定する、尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムを提供する。
In another aspect, the present invention
A counting unit to which analysis data of metabolites in urine by a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) is input;
A calculation unit that performs numerical analysis using the analysis data of the urinary metabolite;
A determination unit that selects a metabolite in urine and / or determines a metabolite in urine as a marker candidate based on the result of the analysis;
And an output processing unit that processes the determination result by the determination unit for output.
The calculation unit quantitatively evaluates the importance of the urinary metabolite by the random forest method using the analysis data of the urinary metabolite, and a discriminant analysis method using the analysis data of the urinary metabolite Do,
The determination unit selects urinary metabolites with high importance based on the result of evaluation by the random forest method, and determines urinary metabolites as marker candidates based on the results of the discriminant analysis method. Provided is a system for searching for metabolite markers.
別の態様において、本発明は、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いて、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定し、場合により判別分析法により検査モデルを構築する、尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムを提供する。
In another aspect, the present invention
A counting unit to which analysis data of metabolites in urine by a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) is input;
A calculation unit that performs numerical analysis using the analysis data of the urinary metabolite;
A determination unit that selects a metabolite in urine and / or determines a metabolite in urine as a marker candidate based on the result of the analysis;
And an output processing unit that processes the determination result by the determination unit for output.
The calculation unit uses the analysis data of the urinary metabolite, and optionally narrows down biomarker candidates by Wilcoxon rank sum test, and then quantitatively determines the importance of the urinary metabolite by the random forest method. Evaluating, and performing the discriminant analysis method using the urinary metabolite as a biomarker,
The determination unit selects urinary metabolites with high importance based on the result of evaluation by the random forest method, determines urinary metabolites as marker candidates based on the results of the discriminant analysis method, and Provided is a system for searching for urinary metabolite markers, which constructs a test model by discriminant analysis.
また別の態様において、本発明は、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップと、
前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップと
を実行させる、尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムを提供する。
In another aspect, the present invention provides:
On the computer
Based on the analysis data of urinary metabolites by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), the importance of the urinary metabolites is quantitatively evaluated by the random forest method, and the highly significant urinary metabolites Step of selecting
Performing a discriminant analysis method using analysis data of the selected urinary metabolite;
A program for searching for urinary metabolite markers is provided, which comprises the steps of determining urinary metabolites associated with a specific disease or condition as marker candidates based on the result of the discriminant analysis.
別の態様において、本発明は、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップと、
場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップと
を実行させる、尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムを提供する。
In another aspect, the present invention
On the computer
Based on the analysis data of urinary metabolites by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), urinary metabolites that are significantly increased or decreased in patients with specific diseases or conditions in some cases with respect to healthy persons Narrowing down by Wilcoxon rank sum test, quantitatively evaluating the importance of the urinary metabolite by random forest method, and selecting a highly significant urinary metabolite;
Constructing a test model by discriminant analysis using the selected urinary metabolite as a biomarker;
In some cases, there is provided a program for searching for a urinary metabolite marker, which comprises: executing a plurality of test models having different numbers of biomarkers based on the result of the discriminant analysis.
本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明らかになるものである。 Further features related to the present invention will become apparent from the description of the present specification and the accompanying drawings.
本発明によれば、尿中代謝物バイオマーカーの探索において、バイオマーカー候補の絞り込みを効果的に行うことができ、特定の疾患又は状態と有意に関連性のある尿中代謝物を迅速かつ確実に決定することができる。そのため、本発明は、疾患の検査モデル、特にがん検査モデルの構築に有用である。また本発明は、疾患又は状態の早期発見、治療薬の開発などの分野にも有用である。 According to the present invention, in the search for urinary metabolite biomarkers, narrowing down of biomarker candidates can be effectively performed, and urinary metabolites that are significantly associated with a specific disease or condition can be rapidly and reliably determined. It can be decided. Therefore, the present invention is useful for constructing a test model of a disease, particularly a cancer test model. The present invention is also useful in the fields of early detection of a disease or condition, development of a therapeutic agent and the like.
本発明は、尿中代謝物のバイオマーカーを探索するための方法、システム及びプログラムを提供する。本発明の解析フローの一例を図１に示す。図１の解析フローで得られる結果の表示例を図２に示す。また、図４に、がん検査モデルのための詳細な解析フロー（上側）を、構造未知代謝物に対する解析プロセス（下側）と併せて示す。解析フローでは、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の網羅的解析のあと、データ前処理を実施し、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト法により重要度を定量的に評価し、上位に位置するバイオマーカーを用いて、多変量解析のひとつである判別分析法（例えばOPLS判別分析法又はカーネル判別分析法）により、特定の疾患又は状態を識別するための予測式を計算し、検査モデルを構築する。そして特定の疾患又は状態に関連した尿中代謝物をバイオマーカー候補として決定する。このとき、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築し、検査精度と価格の点から、どの検査モデルを使用するか選択できるようにすることも好ましい。 The present invention provides methods, systems and programs for searching for biomarkers of urinary metabolites. An example of the analysis flow of the present invention is shown in FIG. A display example of results obtained by the analysis flow of FIG. 1 is shown in FIG. Further, FIG. 4 shows a detailed analysis flow (upper side) for a cancer test model together with an analysis process (lower side) for a structural unknown metabolite. In the analysis flow, after comprehensive analysis of urinary metabolites by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), data pretreatment is performed, and in some cases, biomarker candidates are narrowed down by Wilcoxon rank sum test. Evaluate the importance quantitatively by the random forest method, and use a biomarker located at the top to specify a specific one by the discriminant analysis method (eg OPLS discriminant analysis method or kernel discriminant analysis method) which is one of multivariate analysis. Calculate a prediction equation to identify the disease or condition, and construct a test model. Urinary metabolites associated with the particular disease or condition are then determined as biomarker candidates. At this time, it is also preferable to construct a plurality of examination models having different numbers of biomarkers, and to select which examination model to use in terms of examination accuracy and price.
したがって、本開示の尿中代謝物マーカーを探索する方法は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、
（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップ
を含む。
Thus, the method of searching for urinary metabolite markers of the present disclosure is:
(A) applying a urine sample to a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) to analyze urinary metabolites in the urine sample;
(B) quantitatively evaluating the importance of the urinary metabolite by the random forest (RF) method based on the analysis data of the urinary metabolite, and selecting the highly important urinary metabolite;
(C) performing a discriminant analysis method using analysis data of the selected urinary metabolite;
(D) determining the urinary metabolite associated with a specific disease or condition as a marker candidate based on the result of the discriminant analysis.
より具体的な実施形態において、本開示の尿中代謝物マーカーを探索する方法は、
（a）尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）に供し、該尿検体中の尿中代謝物を解析するステップ、
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして、判別分析法による検査モデルを構築するステップ、
（d）場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップ
を含む。
In more specific embodiments, the method of searching for urinary metabolite markers of the present disclosure comprises
(A) applying a urine sample to a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) to analyze urinary metabolites in the urine sample;
(B) Based on the analysis data of urinary metabolites, urinary metabolites that are significantly increased or decreased in patients with specific diseases or conditions in some cases are narrowed down by Wilcoxon rank sum test in some cases. Evaluating the importance of the urinary metabolite quantitatively by the random forest (RF) method, and selecting the highly important urinary metabolite,
(C) constructing a test model by discriminant analysis using the selected urinary metabolite as a biomarker;
(D) Optionally, the step of constructing a plurality of test models with different numbers of biomarkers based on the discriminant analysis result.
まず、図１及び４に示されるように、尿検体を液体クロマトグラフ質量分析計に供し、網羅的に解析する。尿検体とは、対象から採取した尿、及び当該尿を処理して得られるサンプル（例えば、メタノールによる除蛋白したもの、あるいはトルエン、キシレン、塩酸などの保存料添加した尿）を意味する。尿検体が由来する対象は、特定の疾患又は状態を有する対象、健常対象、過去に特定の疾患又は状態を有していたが現在は健常である対象、特定の疾患又は状態となるリスクの高い（家族歴のある）対象などを含む。また対象となる種は、ヒト、及びその他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）などであり、ヒトが好ましい。 First, as shown in FIGS. 1 and 4, a urine sample is subjected to a liquid chromatograph mass spectrometer and comprehensively analyzed. The urine sample means urine collected from a subject and a sample obtained by processing the urine (eg, deproteinized with methanol, or urine to which a preservative such as toluene, xylene, hydrochloric acid or the like is added). The subject from which the urine sample originates is a subject with a specific disease or condition, a healthy subject, a subject who had a specific disease or condition in the past but is now healthy, or is at high risk of becoming a specific disease or condition. Including subjects (with family history). Target species include humans and other mammals, such as primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock animals (cows, horses, pigs, sheep, etc.), pet animals (dogs, cats, etc.), experimental animals (Mouse, rat, rabbit, etc.) and the like, preferably human.
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）の解析は、慣用的な液体クロマトグラフ質量分析装置を使用して行うことができる。分析モードは特に限定されるものではなく、液体クロマトグラフにおける逆相モード又は親水性相互作用モード、そして質量分析計における正負イオン化モードのいずれを使用してもよい。複数の分析モードで網羅的解析を行うことで、尿中代謝物を網羅的に検出することができる。 Analysis of a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) can be performed using a conventional liquid chromatograph mass spectrometer. The analysis mode is not particularly limited, and any of reverse phase mode or hydrophilic interaction mode in liquid chromatograph and positive / negative ionization mode in mass spectrometer may be used. By performing exhaustive analysis in a plurality of analysis modes, urinary metabolites can be detected exhaustively.
この解析から、尿中代謝物の解析データを取得する。解析データには、例えば、各尿中代謝物において測定された、マススペクトル（液体クロマトグラフにおける保持時間、質量、イオン強度、ピークの面積値など）、各尿検体が由来する対象の診療情報が含まれる。さらに、尿中代謝物に関する情報（構造未知と構造既知代謝物）、LC/MSによる測定条件（分析モード）に関する情報などが含まれてもよい。この解析データは、グラフ（例えば図２の上段）や表（例えば図６）などの形式で表示されてもよい。 From this analysis, analysis data of urinary metabolites are obtained. Analysis data includes, for example, mass spectra (retention time, mass, ionic strength, peak area value in liquid chromatograph, etc.) and medical information of the target from which each urine sample originates, measured in each urine metabolite. included. Furthermore, information on urinary metabolites (structural unknown and known metabolites), information on measurement conditions by LC / MS (analytical mode), etc. may be included. This analysis data may be displayed in the form of a graph (for example, the upper part of FIG. 2) or a table (for example, FIG. 6).
得られた解析データは、後続のステップのために前処理することが好ましい。例えば、LC/MSにより測定されたイオン強度を考えた場合、まず欠損値を各物質データ内の最小値で代替し、測定日が複数に渡る場合は各代謝物の中央値を基準として測定日間差を修正する。その後凝固点降下法による浸透圧値を用いて尿濃縮による検体間差を標準化し、中央値を1.0として物質間のデータ分布差を規格化する、などである。また、尿検体は対象の身体状況によってその濃度が異なることが予想される。これを補正するため、尿中クレアチニンの定量による補正法、又は凝固点降下により測定された尿中溶質の濃度による補正法、例えばオスモラリティ計測を利用した補正法を適用し得る。上記補正により、正規化済みの解析データを取得し得る。 The resulting analytical data is preferably preprocessed for subsequent steps. For example, when considering the ionic strength measured by LC / MS, first replace the missing value with the minimum value in each substance data, and if there are multiple measurement days, measure days based on the median value of each metabolite. Correct the difference. Thereafter, the difference between the samples due to urine concentration is normalized using the osmotic pressure value by the freezing point depression method, and the data distribution difference between substances is normalized with the median value being 1.0, and so on. Urine samples are also expected to have different concentrations depending on the physical condition of the subject. In order to correct this, a correction method by quantitative determination of creatinine in urine, or a correction method by concentration of a solute in urine measured by freezing point depression, for example, a correction method using osmolality measurement can be applied. By the above correction, normalized analysis data can be obtained.
続いて、尿中代謝物について判別分析法を行う前に、尿中代謝物の絞込みを行う。すべての代謝物をランダムフォレスト法に供し、その重要度を定量的に評価するということも可能ではあるが、計算の負荷を軽減するために、ウィルコクソンの順位和検定を行って、代謝物を絞り込むことは有効である。この検定法は、得られた群間のデータに有意差があるかどうかについて検定する方法であるが、有意水準を5％（p < 0.05）とすることが多い。この検定結果は、尿中代謝物とそのp値を示す表（例えば図７）などの形式で表示されてもよい。これにより、特定の疾患又は状態と関連して有意に変化する尿中代謝物を選択して、尿中代謝物を絞り込んでから、次のステップであるランダムフォレスト法による評価に進むことができる。 Subsequently, the urinary metabolites are narrowed down before performing the discriminant analysis method for urinary metabolites. Although it is possible to subject all metabolites to the random forest method and quantitatively evaluate their importance, in order to reduce the computational load, Wilcoxon rank sum test is performed to narrow down the metabolites It is effective. This test is a method of testing whether there is a significant difference in data among the obtained groups, but the level of significance is often 5% (p <0.05). The test results may be displayed in the form of a table showing urinary metabolites and their p values (eg, FIG. 7). In this way, urinary metabolites that significantly change in association with a specific disease or condition can be selected to narrow down urinary metabolites before proceeding to the next step of evaluation by the random forest method.
ランダムフォレスト（Random Forest：RF）法は、機械学習法の一種で特徴量の重要度が計算できることが大きな特徴となっている。この評価データは、重要度の順に示したグラフ（例えば図８）や表（例えば図９）などの形式で表示されてもよい。重要度という数値が高い代謝物、すなわち解析結果で上位にある代謝物がバイオマーカーとなる可能性が大きい。 The Random Forest (RF) method is a kind of machine learning method and is characterized in that it can calculate the importance of feature quantities. The evaluation data may be displayed in the form of a graph (for example, FIG. 8) or a table (for example, FIG. 9) in the order of importance. It is highly possible that a metabolite with a high value of importance, that is, a metabolite higher in the analysis result, will be a biomarker.
選択したバイオマーカーを用いて判別分析法により判別式を計算する。判別分析法として、例えばOPLS判別分析法、カーネル判別分析法などを利用することができる。OPLS判別分析法は、特定の疾患又は状態に応じて群間の差を識別する場合に有効で、各検体をひとつの点としてプロットしたスコアプロットでは、横軸で分離されていればグループ間で差があることを示し（縦軸ではグループ内の差を表す）、視覚的理解を大いに助ける（例えば図２の下に示すグラフ）。 Discriminants are calculated by discriminant analysis using the selected biomarkers. As the discriminant analysis method, for example, OPLS discriminant analysis method, kernel discriminant analysis method, etc. can be used. The OPLS discriminant analysis method is effective in identifying differences between groups according to a specific disease or condition, and in a score plot in which each sample is plotted as one point, if separated along the horizontal axis, between groups It indicates that there is a difference (the vertical axis represents the difference within the group) and greatly aids the visual understanding (eg, the graph shown at the bottom of FIG. 2).
本明細書では、OPLS判別分析法を中心に説明するが、これは線形なデータ解析を行う方法である。しかし、臨床例が多くなってデータが複雑になってくると、カーネル判別分析法のように、高次元の特徴空間に移してから線形解析を行う方法が有効な場合もあり、OPLS判別分析法に限定されるものではない。 In the present specification, the OPLS discriminant analysis method is mainly described, but this is a method of performing linear data analysis. However, as the number of clinical cases increases and the data becomes complicated, it may be effective to use a method of performing linear analysis after transferring to a high-dimensional feature space, such as kernel discriminant analysis. It is not limited to
特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別式を計算する場合、選択するバイオマーカー数により、その判別式は異なる。バイオマーカーは1個選択してもよいし、複数を組み合わせて選択してもよい。複数組み合わせることで、特定の疾患又は状態の識別力が高まり、結果として検査の精度が高まる。このようにして、特定の疾患又は状態についての検査モデルが構築される。ここまでの解析データ、分析結果、検査モデルなどは纏めて表形式で表示されてもよい（例えば図５）。 When the discriminant is calculated using the urinary metabolite associated with a specific disease or condition as a biomarker, the discriminant differs depending on the number of biomarkers selected. One biomarker may be selected, or a plurality of biomarkers may be selected in combination. Multiple combinations increase the ability to identify a particular disease or condition, which in turn increases the accuracy of the test. In this way, a test model for a particular disease or condition is constructed. The analysis data, the analysis result, the inspection model, etc. up to this point may be collectively displayed in the form of a table (for example, FIG. 5).
ここで、特定の疾患又は状態は、バイオマーカーを探索しようとする疾患又は状態、すなわち診断、判定、リスク判定などが望まれる疾患又は状態であれば特に限定されるものではない。好ましくは、疾患又は状態はがんである。がんとは、悪性腫瘍又は悪性新生物とも呼ばれる疾患を意味し、自律性増殖、浸潤と転移、及び悪液質を特徴としている。がんとしては、特に限定されるものではないが、固形がん（乳がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、膀胱がん、小児がんなど）、肉腫（骨肉腫、軟骨肉腫など）、血液のがん（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫など）が挙げられる。がんには、原発性、転移性、再発性のものがあり、がんの種類によって悪性度が異なり、またその進行度と広がりの程度からステージに分類されている。この原発性、転移性又は再発性の違いや、悪性度・ステージの違いに応じて、またがんの種類に応じて、必要な処置（治療方法）も異なる。そのため、特定のがんの種類及び／又は状態に関連した尿中代謝物マーカーを探索できれば、尿中代謝物マーカーを利用して必要な処置を決定したり、早期診断を行うことが可能となる。特定の疾患又は状態としては、がんの有無、がんの種類、がんの進行度、がんの悪性度、がんのステージ、がんの予後、がんに対する治療効果、及び抗がん剤に対する感受性が挙げられるが、これに限定されるものではない。 Here, the specific disease or condition is not particularly limited as long as it is a disease or condition for which a biomarker is to be searched, that is, a disease or condition for which diagnosis, determination, risk determination and the like are desired. Preferably, the disease or condition is cancer. Cancer means a disease also called malignancy or malignant neoplasm and is characterized by autonomous growth, invasion and metastasis, and cachexia. The cancer is not particularly limited, but solid cancer (breast cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, stomach cancer, colorectal cancer, pancreas cancer, kidney cancer, ovarian cancer, esophagus Cancer, liver cancer, biliary tract cancer, bladder cancer, childhood cancer etc.), sarcoma (osteosarcoma, chondrosarcoma etc.), blood cancer (leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma etc.) . There are primary, metastatic, and recurrent cancers. Malignant malignancy varies depending on the type of cancer, and is classified into stages according to its degree of progression and spread. Necessary treatments (therapeutic methods) also differ depending on the difference in primary, metastatic or relapse, difference in malignancy and stage, and in accordance with the type of cancer. Therefore, if urinary metabolite markers related to a specific cancer type and / or condition can be searched, urinary metabolite markers can be used to determine necessary treatment or perform early diagnosis. . Specific diseases or conditions include presence or absence of cancer, type of cancer, degree of cancer progression, degree of malignancy of cancer, stage of cancer, prognosis of cancer, therapeutic effect on cancer, and anticancer It includes, but is not limited to, the sensitivity to the agent.
また、上述したような尿中代謝物マーカーを探索する方法は、適当なシステム又はプログラムを用いて簡便かつ効率的に実施することができる。本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムは、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物の解析データを用いた判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト（RF）法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定するものである。
Also, the method for searching for urinary metabolite markers as described above can be carried out conveniently and efficiently using a suitable system or program. The system for searching for urinary metabolite markers of the present disclosure is:
A counting unit to which analysis data of metabolites in urine by a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) is input;
A calculation unit that performs numerical analysis using the analysis data of the urinary metabolite;
A determination unit that selects a metabolite in urine and / or determines a metabolite in urine as a marker candidate based on the result of the analysis;
And an output processing unit that processes the determination result by the determination unit for output.
The calculation unit quantitatively evaluates the importance of the urinary metabolite by the random forest (RF) method using the analysis data of the urinary metabolite, and uses the analysis data of the urinary metabolite Perform discriminant analysis,
The determination unit selects urinary metabolites with high importance based on the result of evaluation by the random forest (RF) method, and determines urinary metabolites as marker candidates based on the results of the discriminant analysis method. It is a thing.
より具体的な実施形態において、本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムは、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される計数部と、
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いて、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト（RF）法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定し、場合により判別分析法により検査モデルを構築するものである。
In more specific embodiments, a system for searching for urinary metabolite markers of the present disclosure comprises
A counting unit to which analysis data of metabolites in urine by a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) is input;
A calculation unit that performs numerical analysis using the analysis data of the urinary metabolite;
A determination unit that selects a metabolite in urine and / or determines a metabolite in urine as a marker candidate based on the result of the analysis;
And an output processing unit that processes the determination result by the determination unit for output.
The calculation unit uses the analysis data of the urinary metabolite, and optionally narrows down biomarker candidates by Wilcoxon rank sum test, and then determines the importance of the urinary metabolite by a random forest (RF) method. Evaluating quantitatively, and performing the discriminant analysis method using the urinary metabolite as a biomarker,
The determination unit selects urinary metabolites with high importance based on the results of evaluation by the random forest (RF) method, and determines urinary metabolites as marker candidates based on the results of the discriminant analysis method. In some cases, a test model is constructed by discriminant analysis.
本開示のシステムにおいて、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてウィルコクソンの順位和検定を行い、
前記判定部は、前記ウィルコクソンの順位和検定の結果に基づいて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物を絞り込むものであってもよい。
In the system of the present disclosure,
The calculation unit performs Wilcoxon rank sum test using the analysis data of the urinary metabolite,
The determination unit may narrow down urinary metabolites that are significantly increased or decreased in a patient having a specific disease or condition relative to a healthy person based on the result of the Wilcoxon rank sum test.
また本開示のシステムにおいて、
前記算出部は、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法を行い、
前記判定部は、前記判別分析法による検査モデルを構築するものであってもよい。
In the system of the present disclosure,
The calculation unit performs a discriminant analysis method using the selected urinary metabolite as a biomarker,
The determination unit may construct an inspection model by the discriminant analysis method.
本開示のシステムは、好ましくは、上述したような方法を実施することができるように、メモリにおいて上記の計数部、算出部、判定部及び出力処理部が互いに動作可能なように連結された又は通信接続されたシステムである。本開示のシステムは、通信装置、入力装置、出力装置、及び／又は記憶装置と連結又は通信接続されていてもよい。具体的な解析システムの構成例を図３に示す。 The system of the present disclosure is preferably such that the counting unit, the calculating unit, the determining unit and the output processing unit described above are operatively linked to each other in the memory so that the method as described above can be implemented. It is a system connected by communication. The system of the present disclosure may be coupled or in communication connection with a communication device, an input device, an output device, and / or a storage device. A specific configuration example of the analysis system is shown in FIG.
計数部には、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データが入力される。解析データは、連結された入力装置を介して入力されてもよいし、通信装置を介して入力されてもよい。あるいは、液体クロマトグラフ質量分析計に連結されて、そこから解析データが入力されてもよい。入力される解析データは、液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）により測定された尿中代謝物のマススペクトル（液体クロマトグラフにおける保持時間、質量、イオン強度、ピークの面積値など）、各尿検体が由来する対象の診療情報を含む。解析データはさらに尿中代謝物に関する情報（構造未知と構造既知代謝物）、LC/MSによる測定条件（分析モード）などを含んでもよい。この解析データは、出力装置を介してグラフ（例えば図２の上段）や表（例えば図６）などの形式で表示されてもよい。またこの解析データは、記憶装置に総代謝物テーブルとして格納されてもよい（図３）。 In the counting section, analysis data of urinary metabolites by a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) is input. The analysis data may be input through the connected input device or may be input through the communication device. Alternatively, it may be coupled to a liquid chromatograph mass spectrometer from which analytical data may be input. Analytical data to be input is the mass spectrum of urine metabolite measured by liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) (retention time, mass, ionic strength, peak area value, etc. in liquid chromatograph), It contains the medical treatment information of the subject from which the urine sample is derived. The analysis data may further include information on urinary metabolites (structural unknown and known metabolites), measurement conditions by LC / MS (analytical mode), and the like. This analysis data may be displayed in the form of a graph (for example, the upper part of FIG. 2) or a table (for example, FIG. 6) via an output device. Also, this analysis data may be stored as a total metabolite table in the storage device (FIG. 3).
算出部は、計数部に入力された又は記憶装置から読み出された解析データを処理する。具体的には、尿中代謝物の解析データを用いて、場合によりウィルコクソンの順位和検定によりバイオマーカー候補を絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により重要度を定量的に評価する及び／又は判別分析法を行う。また、ランダムフォレスト法により重要度を定量的に評価し抽出したバイオマーカーにより特定の疾患又は状態を識別するために、判別分析法により、バイオマーカー数の異なる判別式を複数計算する。これらの結果は、出力装置を介してグラフや表などの形式で表示されてもよい。またこれらの結果は、記憶装置にそれぞれランダムフォレスト（RF）テーブル、判別分析結果（テーブル）、及び検定テーブルとして格納されてもよい（図３）。 The calculation unit processes analysis data input to the counting unit or read from the storage device. Specifically, using the analysis data of urinary metabolites, optionally narrowing down biomarker candidates by Wilcoxon rank sum test, and quantitatively evaluating the importance by the random forest (RF) method and / Or perform discriminant analysis. Also, in order to evaluate the importance quantitatively by the random forest method and identify a specific disease or condition by the extracted biomarker, a discriminant analysis method calculates a plurality of discriminants having different numbers of biomarkers. These results may be displayed in the form of graphs, tables, etc. via the output device. Also, these results may be stored in the storage device as a random forest (RF) table, a discriminant analysis result (table), and a verification table, respectively (FIG. 3).
判定部は、算出部で行われた解析の結果に基づいて、尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する。算出部においてウィルコクソンの順位和検定を行う場合には、判定部は、ウィルコクソンの順位和検定の結果に基づいて尿中代謝物を絞り込むものであってもよい。さらに判定部は、未知試料に対して、前記判別式により計算された予測値が設定された閾値より高いか低いかによって、特定の疾患又は状態について（例えば、特定の疾患又は状態の有無について）判定することが可能である。 The determination unit selects the urinary metabolite and / or determines the urinary metabolite as a marker candidate based on the result of the analysis performed by the calculation unit. When the Wilcoxon rank sum test is performed in the calculation unit, the determination unit may narrow down the urinary metabolite based on the result of the Wilcoxon rank sum test. Furthermore, the determination unit determines the specific disease or condition (for example, the presence or absence of a specific disease or condition) depending on whether the predicted value calculated by the discriminant is higher or lower than the set threshold value for the unknown sample. It is possible to determine.
出力処理部は、判定部による判定結果を出力のために処理する。例えば、選択した尿中代謝物、及び／又はマーカー候補として決定した尿中代謝物、及び／又は構築した検査モデルを、ディスプレイなどの出力装置に視覚的表示するために処理される。具体的には、表やグラフの形式に処理される（例えば、図８、９、１２及び１４）。あるいは、スピーカーなどの出力装置に音声出力するために処理されてもよい。 The output processing unit processes the determination result by the determination unit for output. For example, selected urinary metabolites and / or urinary metabolites determined as marker candidates and / or constructed test models are processed for visual display on an output device such as a display. Specifically, it is processed in the form of a table or a graph (for example, FIGS. 8, 9, 12 and 14). Alternatively, it may be processed to output sound to an output device such as a speaker.
記憶装置には、総代謝物テーブル（各解析にて検出された代謝物一覧）、検定テーブル（ウィルコクソンの順位和検定による検定結果で、p値によりランク付けされている）、RFテーブル（重要度の高い順に並べた代謝物テーブル）、判別分析結果（スコアプロット）、及び検査モデル（判別分析法により求められた判別式）のうち1以上が格納される。どのような検査を行うか、すなわちどの疾患又は状態について判定する検査を行うかで、どの検査モデルを用いるかが決まる。なお、スコアプロットは、2グループ間を横軸で最大限に分離するもので、横軸で分離されていれば2グループ間に差があることを示し、一方縦軸はグループ内の差となる（例えば図２の下に示したグラフ）。 The storage device includes a total metabolite table (list of metabolites detected in each analysis), a test table (ranked by p value according to the test result by Wilcoxon rank sum test), an RF table (importance degree One or more of the metabolite table (arranged in descending order), the discriminant analysis result (score plot), and the examination model (discriminant determined by discriminant analysis) are stored. The type of test to be performed, that is, the type of test to determine for which disease or condition, determines which test model to use. The score plot divides the two groups maximally along the horizontal axis, and indicates that there is a difference between the two groups if separated along the horizontal axis, while the vertical axis is the difference within the groups (For example, the graph shown below FIG. 2).
さらに本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムは、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップと、
前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップと
を実行させる。
Furthermore, a program for searching for urinary metabolite markers of the present disclosure is
On the computer
Based on the analysis data of urinary metabolites by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), the importance of the urinary metabolites is quantitatively evaluated by the random forest (RF) method, and the urine of high importance is evaluated. Selecting the middle metabolite, and
Performing a discriminant analysis method using analysis data of the selected urinary metabolite;
And determining the urinary metabolite associated with the specific disease or condition as a marker candidate based on the result of the discriminant analysis.
具体的な実施形態において、本開示の尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラムは、
コンピュータに、
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、場合により健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップと、
場合により、前記判別分析結果に基づいて、バイオマーカー数の異なる複数の検査モデルを構築するステップと
を実行させる。
In a specific embodiment, a program for searching for urinary metabolite markers of the present disclosure is:
On the computer
Based on the analysis data of urinary metabolites by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), urinary metabolites that are significantly increased or decreased in patients with specific diseases or conditions in some cases with respect to healthy persons Narrowing down by Wilcoxon rank sum test, quantitatively evaluating the importance of the urinary metabolite by the random forest (RF) method, and selecting the highly significant urinary metabolite;
Constructing a test model by discriminant analysis using the selected urinary metabolite as a biomarker;
Optionally, based on the result of the discriminant analysis, the steps of constructing a plurality of test models having different numbers of biomarkers are performed.
本開示のプログラムにおいて、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップは、前記尿中代謝物の解析データを用いて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物をウィルコクソンの順位和検定により絞り込んだ上で、ランダムフォレスト（RF）法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するものであってもよい。 In the program of the present disclosure, the step of selecting highly significant urinary metabolites may be significantly increased or decreased in patients having a specific disease or condition with respect to healthy subjects using the urinary metabolite analysis data. Specific urine metabolites are narrowed down by Wilcoxon's rank sum test, the importance of the above urine metabolites is quantitatively evaluated by the random forest (RF) method, and highly important urine metabolites are selected. It may be
本開示のプログラムは、コンピュータに、前記選択した尿中代謝物をバイオマーカーとして判別分析法による検査モデルを構築するステップをさらに実行させるものであってもよい。 The program of the present disclosure may further cause the computer to further execute the step of constructing a test model by discriminant analysis using the selected urinary metabolite as a biomarker.
本開示のプログラムは、コンピュータにおいて読み出されて実行されると、尿中代謝物マーカーを探索する方法を実施することができ、また尿中代謝物マーカーを探索するためのシステムを動作させることができる。 The program of the present disclosure, when read and executed in a computer, can implement a method of searching for urinary metabolite markers, and operate a system for searching for urinary metabolite markers. it can.
プログラムは、例えば磁気記録媒体（ハードディスクドライブ）、CD-ROM、CD-R、RAMなどのコンピュータ可読媒体に格納されてコンピュータに供給することができ、あるいは有線又は無線通信を介してコンピュータに供給することができる。 The program can be stored in a computer readable medium such as, for example, a magnetic recording medium (hard disk drive), a CD-ROM, a CD-R, a RAM, and supplied to a computer, or supplied to a computer via wired or wireless communication. be able to.
以下に実施例を例示し、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のために提供するものであり、本発明の範囲を限定したり制限したりするものではない。 The invention will now be illustrated by way of the following examples, which are provided solely for the purpose of illustrating the invention and do not limit or restrict the scope of the invention. Absent.
[実施例１]
本発明の尿中代謝物の探索方法を適用した具体的な計算例を示す（図６〜１５）。
これは、コーカソイドの健常者（15例）及び乳がん患者（15例）由来の尿検体を用いた結果である。まず、LC/MSにより尿中代謝物の網羅的解析を行う。例えば、LC/MSにより尿中代謝物を解析すると、図１０に示すような結果が得られる。すなわち、脂肪酸、リン脂質、糖、アミノ酸、ペプチド、アミン、有機酸、核酸など、構造既知、構造未知を含めて1325種の代謝物が検出される。ここで、構造未知代謝物というのは、公共データベースを用いたマススペクトル検索でヒットしなかった代謝物である。解析結果は、総代謝物データベース構造例（図６）に示すように表示することができる。
Example 1
The specific calculation example which applied the search method in the urine metabolite of this invention is shown (FIGS. 6-15).
This is the result of using urine samples derived from healthy Caucasian subjects (15 cases) and breast cancer patients (15 cases). First, comprehensive analysis of urinary metabolites is performed by LC / MS. For example, when urinary metabolites are analyzed by LC / MS, results as shown in FIG. 10 are obtained. That is, 1325 types of metabolites including known and unknown structures such as fatty acids, phospholipids, sugars, amino acids, peptides, amines, organic acids and nucleic acids are detected. Here, the structurally unknown metabolite is a metabolite that has not been hit by mass spectrum search using a public database. The analysis results can be displayed as shown in the total metabolite database structure example (FIG. 6).
これらすべての代謝物をランダムフォレスト法に供し、その重要度を定量的に評価するということも可能ではあるが、ランダムフォレスト法における計算の負荷を軽減するために、ウィルコクソンの順位和検定を行って、代謝物を絞り込むことは有効である。この検定法は、得られた群間のデータ（この解析では、健常者と乳がん患者に対応）に有意差があるかどうかについて検定する方法であるが、有意水準を5％とする場合、374種に絞り込むことができる（図１１）。通常、この検定結果は、図７に示すような尿中代謝物とp値の表で提示される。 Although it is possible to use all of these metabolites for the random forest method and quantitatively evaluate their importance, in order to reduce the computational load in the random forest method, the Wilcoxon rank sum test is performed Narrowing down the metabolites is effective. This test is a method to test whether there is a significant difference in the data among the obtained groups (in this analysis, it corresponds to healthy people and breast cancer patients), but when the level of significance is 5%, 374 The species can be narrowed down (Fig. 11). Usually, the test results are presented in a table of urinary metabolites and p-values as shown in FIG.
しかし、まだ数が多く、しかも検定だけでは個々の代謝物の重要性が定量的に評価できないので、ランダムフォレスト法による重要度の評価を実施する。ランダムフォレスト法は、機械学習法の一種で特徴量の重要度が計算できることが大きな特徴となっている。ランダムフォレスト法による解析結果を図８に示す。図８の横軸は重要度であるが、縦軸は個々の代謝物に相当し、その対応表を図９に示す。図９の中でXとあるのは構造未知代謝物を示している。図９で示す代謝物がバイオマーカー候補であるが、外因性物質（例えば薬）の代謝物はバイオマーカー候補から排除することが望ましい。例えば、マススペクトルから判断して、上位3種はグルクロナイドという抱合体であることがわかるので、最有力バイオマーカーはXCとなる。 However, because the number is still large and the importance of each metabolite can not be quantitatively evaluated by the assay alone, the evaluation of importance by the random forest method is performed. The random forest method is a kind of machine learning method and is characterized in that the importance of the feature can be calculated. The analysis result by the random forest method is shown in FIG. The horizontal axis in FIG. 8 indicates the degree of importance, while the vertical axis corresponds to each metabolite, and the correspondence table is shown in FIG. X in FIG. 9 indicates a structural unknown metabolite. Although the metabolite shown in FIG. 9 is a biomarker candidate, it is desirable to exclude the metabolite of the exogenous substance (eg, drug) from the biomarker candidate. For example, judging from the mass spectrum, it can be seen that the top three are glucuronide conjugates, so the dominant biomarker is XC.
次に、バイオマーカーを用いてOPLS判別分析法により判別式を算出する。OPLS判別分析法は、特定の疾患又は状態に応じて群間の差を識別する場合に有効な方法である。以上の考察をもとに、XCをバイオマーカーとして、OPLS判別分析法による1次元のスコアプロットを行うと、図１２に示すようになる。グラフの左15例が健常者で、右15例が乳がん患者である。スコアにおける健常者と乳がん患者を識別するための閾値を0.65とした場合の判別結果を図１３に示す。健常者15例を健常者と推定できるのが14例でこのときの誤り率が6.7％であるのに対し、乳がん患者15例を乳がんと推定できるのが15例で誤り率は0％である。これは、図１に示す解析フローにより、有力なバイオマーカーが抽出できていることを示している。 Next, a discriminant is calculated by OPLS discriminant analysis using a biomarker. OPLS discriminant analysis is an effective method for identifying differences between groups according to a particular disease or condition. Based on the above consideration, one-dimensional score plot by OPLS discriminant analysis is performed using XC as a biomarker, as shown in FIG. The left 15 cases of the graph are normal subjects and the right 15 cases are breast cancer patients. The discrimination result in the case where the threshold for discriminating a healthy person and a breast cancer patient in the score is 0.65 is shown in FIG. The error rate at this time is 6.7% when 14 healthy subjects can be estimated as 15 healthy subjects, whereas the error rate is 0% when 15 breast cancer patients can be estimated as breast cancer. . This indicates that a powerful biomarker can be extracted by the analysis flow shown in FIG.
加えて、例えば、ランダムフォレスト法における結果で上位4位、5位、8位、9位及び11位の代謝物（XC、XD、XH、XE、XI、XG）を用いて同様な解析を行ってみると、図１４に示すような結果となる。スコアにおける健常者と乳がん患者を識別するための閾値を0.5とすると、健常者15例を健常者と推定できるのが15例、乳がん患者15例を乳がんと推定できるのが15例で、ともに誤り率は0％と解析精度は上がる。尿中代謝物によるがん検査は、最終的にマルチバイオマーカーにすることができることが大きな特徴でありメリットでもある。このマルチバイオマーカーも図１に示す解析フローにより簡単に抽出できる。 In addition, similar analysis is performed using, for example, upper 4th, 5th, 8th, 9th and 11th metabolites (XC, XD, XH, XE, XI, XG) in the result of the random forest method. The result is as shown in FIG. Assuming that the threshold for identifying healthy subjects and breast cancer patients in the score is 0.5, 15 can be estimated as 15 healthy subjects and 15 can be estimated as breast cancer patients in 15 cases. The analysis accuracy goes up with a rate of 0%. Cancer testing with urinary metabolites is a major feature and merit that it can ultimately be a multi-biomarker. This multibiomarker can also be easily extracted by the analysis flow shown in FIG.
最終的に、シングルバイオマーカーにするか、マルチバイオマーカーにするかは、検査側が解析コストと解析精度の双方のデータを提示して、被験者側が選択することになる。 Finally, whether to use a single biomarker or a multibiomarker, the test side presents data of both analysis cost and analysis accuracy, and the subject side selects it.
このがん検査モデルを使用して、未知の尿検体について網羅的解析を行い、学習データで求めた判別式（バイオマーカーに相当するイオンの強度にある係数をかけた数値の和（定数を含む））の数値を判定することによって、その未知の尿検体が健常者由来かがん患者由来かについて判別することになる。あるいは、特にがん患者と健常者で有意差のある尿中代謝物をバイオマーカーとして用いて、尿中代謝物のLC/MS解析データから、尿検体が健常者由来かがん患者由来かについて判別することも可能である。 Using this cancer test model, exhaustive analysis is performed on unknown urine samples, and the discriminant calculated from the learning data (sum of values multiplied by a coefficient to the intensity of the ion corresponding to the biomarker (including a constant) By determining the numerical value of)), it is determined whether the unknown urine sample is from a healthy person or a cancer patient. Alternatively, whether the urine sample is derived from a healthy person or a cancer patient is determined from the urinary metabolite LC / MS analysis data, using a urinary metabolite that is significantly different between cancer patients and healthy people as a biomarker. It is also possible.
Claims (15)
（b）前記尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップ、
（c）前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップ、
（d）前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップ
を含む、尿中代謝物マーカーを探索する方法。 (A) applying a urine sample to a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) to analyze urinary metabolites in the urine sample;
(B) quantitatively evaluating the importance of the urinary metabolite by the random forest method based on the analysis data of the urinary metabolite, and selecting the highly important urinary metabolite;
(C) performing a discriminant analysis method using analysis data of the selected urinary metabolite;
(D) A method of searching for urinary metabolite markers, comprising the step of determining urinary metabolites associated with a specific disease or condition as marker candidates based on the results of the discriminant analysis.
前記尿中代謝物の解析データを用いて数値解析を行う算出部と、
前記解析の結果により尿中代謝物を選択する及び／又は尿中代謝物をマーカー候補として決定する判定部と、
前記判定部による判定結果を出力のために処理する出力処理部と
を備え、
前記算出部は、前記尿中代謝物の解析データを用いてランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価する、及び前記尿中代謝物の解析データを用いた判別分析法を行い、
前記判定部は、前記ランダムフォレスト法による評価の結果に基づいて重要度の高い尿中代謝物を選択し、前記判別分析法の結果に基づいて尿中代謝物をマーカー候補として決定する、尿中代謝物マーカーを探索するためのシステム。 A counting unit to which analysis data of metabolites in urine by a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS) is input;
A calculation unit that performs numerical analysis using the analysis data of the urinary metabolite;
A determination unit that selects a metabolite in urine and / or determines a metabolite in urine as a marker candidate based on the result of the analysis;
And an output processing unit that processes the determination result by the determination unit for output.
The calculation unit quantitatively evaluates the importance of the urinary metabolite by the random forest method using the analysis data of the urinary metabolite, and a discriminant analysis method using the analysis data of the urinary metabolite Do,
The determination unit selects urinary metabolites with high importance based on the result of evaluation by the random forest method, and determines urinary metabolites as marker candidates based on the results of the discriminant analysis method. System for searching for metabolite markers.
前記判定部が、前記ウィルコクソンの順位和検定の結果に基づいて、健常者に対して特定の疾患又は状態にある患者で有意に増減している尿中代謝物を絞り込むものである、請求項７に記載のシステム。 The calculation unit performs Wilcoxon rank sum test using the analysis data of the urinary metabolite;
8. The method according to claim 7, wherein the determination unit narrows down urine metabolites that are significantly increased or decreased in patients with a specific disease or condition with respect to healthy persons based on the result of the Wilcoxon rank sum test. The system described in.
前記判定部が、前記判別分析法による検査モデルを構築する、請求項７に記載のシステム。 The calculation unit performs a discriminant analysis method using the selected urinary metabolite as a biomarker;
The system according to claim 7, wherein the determination unit constructs an inspection model by the discriminant analysis method.
液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）による尿中代謝物の解析データに基づいて、ランダムフォレスト法により前記尿中代謝物の重要度を定量的に評価し、重要度の高い尿中代謝物を選択するステップと、
前記選択した尿中代謝物の解析データを用いて判別分析法を行うステップと、
前記判別分析の結果に基づいて、特定の疾患又は状態と関連した尿中代謝物をマーカー候補として決定するステップと
を実行させる、尿中代謝物マーカーを探索するためのプログラム。 On the computer
Based on the analysis data of urinary metabolites by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), the importance of the urinary metabolites is quantitatively evaluated by the random forest method, and the highly significant urinary metabolites Step of selecting
Performing a discriminant analysis method using analysis data of the selected urinary metabolite;
A program for searching for urinary metabolite markers, which comprises the steps of: determining urinary metabolites associated with a specific disease or condition as marker candidates based on the result of the discriminant analysis.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017236306A JP6857597B2 (en) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Biomarker search method for urinary biotransformers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017236306A JP6857597B2 (en) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Biomarker search method for urinary biotransformers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019105456A true JP2019105456A (en) | 2019-06-27 |
| JP6857597B2 JP6857597B2 (en) | 2021-04-14 |
Family
ID=67062572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017236306A Active JP6857597B2 (en) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Biomarker search method for urinary biotransformers |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6857597B2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020246522A1 (en) | 2019-06-05 | 2020-12-10 | セントラル硝子株式会社 | Nonaqueous electrolyte solution, and nonaqueous electrolyte battery |
| WO2022014098A1 (en) * | 2020-07-15 | 2022-01-20 | 株式会社日立製作所 | Cancer screening device and cancer screening method |
| CN114216835A (en) * | 2021-11-16 | 2022-03-22 | 华南农业大学 | Method for screening biological metabolism markers of algal polysaccharide for resisting colon cancer activity and application |
| WO2023233945A1 (en) * | 2022-06-03 | 2023-12-07 | 株式会社日立ハイテク | Biliary tract cancer testing method |
-
2017
- 2017-12-08 JP JP2017236306A patent/JP6857597B2/en active Active
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020246522A1 (en) | 2019-06-05 | 2020-12-10 | セントラル硝子株式会社 | Nonaqueous electrolyte solution, and nonaqueous electrolyte battery |
| WO2022014098A1 (en) * | 2020-07-15 | 2022-01-20 | 株式会社日立製作所 | Cancer screening device and cancer screening method |
| CN114216835A (en) * | 2021-11-16 | 2022-03-22 | 华南农业大学 | Method for screening biological metabolism markers of algal polysaccharide for resisting colon cancer activity and application |
| CN114216835B (en) * | 2021-11-16 | 2023-08-04 | 华南农业大学 | Method for screening biological metabolism marker of seaweed polysaccharide colon cancer resistance activity and application |
| WO2023233945A1 (en) * | 2022-06-03 | 2023-12-07 | 株式会社日立ハイテク | Biliary tract cancer testing method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6857597B2 (en) | 2021-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Metabolomics in noninvasive breast cancer | |
| Zimmerli et al. | Urinary proteomic biomarkers in coronary artery disease | |
| US10006925B2 (en) | Methods and systems for metabolite and/or lipid-based detection of colorectal cancer and/or adenomatous polyps | |
| JP6857597B2 (en) | Biomarker search method for urinary biotransformers | |
| Eisner et al. | Learning to predict cancer-associated skeletal muscle wasting from 1 H-NMR profiles of urinary metabolites | |
| JP6692422B2 (en) | Diagnosis of diseases by metabolites in urine | |
| JP4950993B2 (en) | System and method for comparing and editing metabolite data from multiple samples using a computer system database | |
| JP7288283B2 (en) | Urinary metabolite marker for pediatric cancer screening | |
| CN104204798A (en) | Biomarkers for bladder cancer and methods using the same | |
| JP2011506995A (en) | Methods and biomarkers for diagnosing and monitoring mental disorders | |
| JP2016520192A (en) | Biomarkers associated with renal function and methods of using the same | |
| Tran et al. | Metabolomics in the study of spontaneous animal diseases | |
| CN103814295A (en) | Means and methods for assessing kidney toxicity | |
| Nevedomskaya et al. | Cross-platform analysis of longitudinal data in metabolomics | |
| JP2009175141A (en) | Method for screening compound | |
| JP7226732B2 (en) | Cancer detection method, kit and device using urinary tumor marker | |
| KR101552011B1 (en) | Composition comprising lysophosphatidylcholine and homocysteic acid for ovarian cancer diagnosis and method using the same | |
| US20050079099A1 (en) | Generation of biochemical images and methods of use | |
| US20120330558A1 (en) | Identification of biomarkers | |
| KR102519775B1 (en) | Biomarkers for evaluating rheumatoid arthritis | |
| US8969022B2 (en) | Method and system for detecting lymphosarcoma in cats using biomarkers | |
| US20240036052A1 (en) | Cancer test method using metabolite list | |
| KR102475008B1 (en) | Pancreatic cancer evaluation method, calculation method, evaluation device, calculation device, evaluation program, calculation program, evaluation system, and terminal device for pancreatic cancer in diabetic patients | |
| Holbrook et al. | Investigating the effects of storage conditions on urinary volatilomes for their reliability in disease diagnosis | |
| KR20230119901A (en) | Method and device for classifcation of nflammatory disease using raman spectroscopic analysis based on machine learning |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200317 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210309 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210322 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6857597 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |