JP2019099492A - Anti-human IL-26 antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、中和活性を有する抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体及びこれを含有する医薬に関する。 The present invention relates to an anti-human IL-26 monoclonal antibody having neutralizing activity and a medicament containing the same.
インターロイキン（ＩＬ）−２６はＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉに感染したＴ細胞から初めて同定されたサイトカインで、ヒトＩＬ−２６は１７１アミノ酸から成り、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４を含むＩＬ−１０ ｆａｍｉｌｙに分類される。ＩＬ−２６遺伝子はヒト第１２染色体１２ｑ１５領域の、インターフェロン（ＩＦＮ）−γとＩＬ−２２の遺伝子の間に位置し、様々な脊椎動物種でも保存されているが、マウスやラット等の齧歯類では欠損している。ＩＬ−２６はＴｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、ＮＫ細胞のほか、関節リウマチ患者の滑膜細胞やエンドトキシン刺激を受けた肺胞マクロファージなどから産生され、ＩＬ−２０ＲＡとＩＬ−１０ＲＢで構成される特異的な細胞表面受容体に結合することで、ＳＴＡＴ３のリン酸化を介して細胞を活性化させる。ＩＬ−１０ＲＢが様々な細胞種に広範に発現しているのに対し、ＩＬ−２６受容体からの細胞内シグナル伝達の鍵となるＩＬ−２０ＲＡの発現は、ケラチノサイトと腸管上皮細胞で報告されているが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞などの血液細胞には認められない。ＩＬ−２６はケラチノサイトと腸管上皮細胞に作用して、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αの産生や細胞接着分子ＩＣＡＭ−１の発現を亢進する。また、本発明者らは、ＩＬ−２６受容体がヒト及びマウスの線維芽細胞にも発現しており、ＩＬ−２６がＩＬ−２０ＲＡを介して線維芽細胞を活性化させ、コラーゲン産生を増加させることを見出した（非特許文献１）。血液細胞にはＩＬ−２０ＲＡの発現は認められないとの過去の報告に反して、近年、ＩＬ−２６の単球、好中球及びＮＫ細胞への作用も報告された。ＩＬ−２６はヒト単球のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＣＣＬ２０の産生を誘導し、Ｔｈ１７細胞の発生を促進する（非特許文献２）。また、ＩＬ−２６はＩＬ−８や細菌性ホルミルペプチド（ｆＭＬＰ）によって誘導されるヒト好中球の細胞遊走を増強させる（非特許文献３）。さらに、ヒトＣＤ１６陰性ＣＤ５６強陽性のＮＫ細胞膜上のＴＲＡＩＬ発現を亢進し、ＮＫ細胞のＩＬ−１β、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α産生を促進する（非特許文献４）。 Interleukin (IL) -26 is a cytokine identified for the first time from Herpesvirus saimiri-infected T cells, and human IL-26 consists of 171 amino acids, and IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL It is classified into IL-10 family including -24. The IL-26 gene is located between the interferon (IFN) -γ and IL-22 genes of the human chromosome 12 12q15 region and is conserved in various vertebrate species, but it is a rodent such as mouse or rat. Are lost in the species. IL-26 is produced from Th1 cells, Th17 cells, NK cells, synovial cells from rheumatoid arthritis patients, alveolar macrophages that are endotoxin-stimulated, etc., and is composed of IL-20RA and IL-10RB. Binding to cell surface receptors activates the cells through STAT3 phosphorylation. While IL-10RB is widely expressed in a variety of cell types, expression of IL-20RA, which is key for intracellular signaling from the IL-26 receptor, has been reported in keratinocytes and intestinal epithelial cells However, it is not found in blood cells such as T cells, B cells, NK cells, monocytes and dendritic cells. IL-26 acts on keratinocytes and intestinal epithelial cells to enhance the production of IL-10, IL-8, TNF-α and the expression of cell adhesion molecule ICAM-1. In addition, the present inventors also express the IL-26 receptor in human and mouse fibroblasts, and IL-26 activates fibroblasts via IL-20RA to increase collagen production. We found that it was made to do (nonpatent literature 1). Contrary to past reports that expression of IL-20RA was not observed in blood cells, recently, actions of IL-26 on monocytes, neutrophils and NK cells have also been reported. IL-26 induces the production of IL-1β, IL-6, TNF-α and CCL20 in human monocytes and promotes the development of Th17 cells (Non-patent Document 2). In addition, IL-26 enhances cell migration of human neutrophils induced by IL-8 and bacterial formyl peptide (fMLP) (Non-patent Document 3). Furthermore, TRAIL expression on NK cell membrane of human CD16 negative CD56 strong positive is enhanced, and IL-1 beta, IFN-beta, IFN-gamma and TNF-alpha production of NK cell are promoted (nonpatent literature 4).
ＩＬ−２６は、ＩＬ−１７を産生するＣＤ４ヘルパーＴ細胞であるＴｈ１７細胞が特に産生するサイトカインである。Ｔｈ１７細胞は、関節リウマチや炎症性腸疾患、多発性硬化症や乾癬など様々な難治性自己免疫疾患の病態への関与が動物実験で示され、ＩＬ−１７ＡやＴｈ１７分化を促進するＩＬ−２３を標的とした治療薬は、様々な免疫疾患に対して臨床試験が行われている（非特許文献５）。ＩＬ−２６はマウスやラット等の齧歯類で欠損しているため、ヒト検体を用いての報告が主であり、炎症病態における役割に関してまだ解明されていない点が多い。炎症性腸疾患であるクローン病患者では、大腸でのＩＬ−２６のｍＲＮＡ発現が増加しており、クローン病の症状が強く表れているときに大腸でのＩＬ−２６陽性Ｔ細胞数が増加していることが報告されている（非特許文献６）。ＩＬ−２６はＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−１０ＲＢを発現する腸管上皮細胞に作用して、ＩＬ−８とＴＮＦ−αの発現を増強させる。関節リウマチ患者では、健常者よりも血清中のＩＬ−２６濃度が高値を示し、滑液中にはさらに高濃度で存在する。関節リウマチ患者の滑膜細胞はＩＬ−２６を産生し、ＩＬ−２６はＣＤ１４陽性単球のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α産生を非常に強く増強することで、Ｔｈ１７細胞分化やＩＬ−１７Ａ産生をより促進する（非特許文献２）。本発明者らは、重度の免疫不全マウスであるＮＯＧマウスを亜致死量の放射線で前処理し、ヒト臍帯血単核球を移植する慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルを確立し、肺の線維化に決定的なエフェクターサイトカインとしてＩＬ−２６を見出した（非特許文献１）。さらに、ＩＬ−２６がヒト及びマウスの線維芽細胞に作用してコラーゲン産生を顕著に亢進すること、急性リンパ芽球性白血病患者で同種末梢血幹細胞移植後にＧＶＨＤを発症した肺においても、多数のＩＬ−２６陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が浸潤しており、気管支周囲や血管周囲に顕著なコラーゲン堆積が認められることを明らかにした。このことから、ＩＬ−２６は、炎症性腸疾患や関節リウマチ、慢性肺ＧＶＨＤの病態に深く関与していることが示唆される。また、乾癬患者の皮膚病変部位でＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２２といったＴｈ１７サイトカインとともにＩＬ−２６のｍＲＮＡ発現も上昇していること（非特許文献７）、多発性硬化症の患者の血清中ＩＬ−２６濃度が健常者よりも高値を示すことも報告されており（非特許文献８）、炎症病態における役割の詳細は不明ながら、それらの疾患の病態にもＩＬ−２６が関係していることが示唆されている。
また、ＩＬ−２６は免疫疾患だけでなく、がんの病態への関与も示唆されている。胃がん組織では、隣接した正常組織よりもＩＬ−２６のｍＲＮＡ発現が高く、胃がん浸潤細胞のうちＴｈ１７細胞とＮＫ細胞がＩＬ−２６の主な産生源であること、胃がん患者では血清中ＩＬ−２６濃度が健常者よりも高いことが報告されている（非特許文献９）。ＩＬ−２６は胃がん細胞株の増殖を促進するとともに、ＳＴＡＴ３シグナル依存的に抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌ、ｃ−ｍｙｃの発現を上昇させることで、シスプラチンによるアポトーシス誘導を阻害し、がん細胞の生存促進に作用する。
IL-26 is a cytokine specifically produced by Th17 cells, which are CD4 helper T cells that produce IL-17. Th17 cells have been shown in animal experiments to be involved in the pathogenesis of various intractable autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis and psoriasis, and IL-23 promotes IL-17A and Th17 differentiation Therapeutic agents targeted to have been clinically tested for various immune diseases (Non-patent Document 5). Since IL-26 is deficient in rodents such as mice and rats, reports using human specimens are mainly, and there are many points that have not been elucidated yet as to its role in inflammatory pathological conditions. In Crohn's disease patients with inflammatory bowel disease, IL-26 mRNA expression in the large intestine is increased, and the number of IL-26 positive T cells in the large intestine is increased when symptoms of Crohn's disease appear strongly Have been reported (Non-Patent Document 6). IL-26 acts on intestinal epithelial cells that express IL-20RA / IL-10RB to enhance the expression of IL-8 and TNF-α. In rheumatoid arthritis patients, the IL-26 concentration in serum is higher than in healthy individuals, and it is present in synovial fluid at a higher concentration. The synovial cells of patients with rheumatoid arthritis produce IL-26, which strongly enhances IL-1β, IL-6, and TNF-α production of CD14-positive monocytes, leading to Th17 cell differentiation and IL -Promotes 17A production more (Non-patent Document 2). We have established a chronic graft-versus-host disease (GVHD) model in which severe immunodeficient mice, NOG mice, are pretreated with sublethal doses of radiation, and human cord blood mononuclear cells are transplanted, and lungs Found the IL-26 as an effector cytokine that is critical for the fibrosis of (Non-patent Document 1). In addition, IL-26 acts on fibroblasts in humans and mice to significantly enhance collagen production, and in lungs that develop GVHD after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation in patients with acute lymphoblastic leukemia, It was revealed that IL-26 positive CD4 T cells were infiltrated, and remarkable collagen deposition was observed around the bronchus and blood vessels. This suggests that IL-26 is deeply involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, and chronic lung GVHD. In addition, the expression of IL-26 mRNA is also elevated along with Th17 cytokines such as IL-17A, IL-17F, and IL-22 at the skin lesion site of psoriatic patients (Non-Patent Document 7), in patients with multiple sclerosis It has also been reported that serum IL-26 levels are higher than in healthy individuals (Non-patent Document 8), and while the details of the role in inflammatory pathogenesis are unknown, IL-26 is also involved in the pathogenesis of those diseases It is suggested that
In addition, IL-26 has been suggested to be involved not only in immune diseases but also in the pathogenesis of cancer. In gastric cancer tissues, expression of IL-26 mRNA is higher than that in adjacent normal tissues, and among gastric cancer infiltrating cells, Th17 cells and NK cells are the main sources of IL-26, and in gastric cancer patients, serum IL-26 It has been reported that the concentration is higher than that of healthy people (Non-patent Document 9). IL-26 inhibits the induction of apoptosis by cisplatin by promoting the growth of gastric cancer cell lines and increasing the expression of anti-apoptotic genes Bcl-2, Bcl-xl and c-myc in a STAT3 signal-dependent manner Works to promote the survival of cancer cells.
関節リウマチや炎症性腸疾患、乾癬、多発性硬化症、慢性ＧＶＨＤなどの難治性免疫異常症の治療薬として、ステロイド剤や免疫抑制剤、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａなどを分子標的とした生物学的製剤が用いられているが、作用する細胞の特異性の低さや免疫系の抑制効果の強さが原因となり、日和見感染に代表される副作用が問題となっている。そこで、免疫系による本来の生体防御反応を過剰に抑制しない、疾患の病態に即した有効かつ副作用のリスクを改善した治療法の開発が望まれている。また、現時点で有効な治療薬が開発されていない難治性がんに対しても、有効かつ安全な新しい分子標的治療薬の開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、難治性免疫異常症及び難治性がんの治療薬を提供することにある。
As therapeutic agents for intractable immune disorders such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, multiple sclerosis, chronic GVHD, etc., molecules of steroids, immunosuppressants, TNF-α, IL-6, IL-17A etc. Although targeted biological agents have been used, the side effects represented by opportunistic infections have become a problem due to the low specificity of the acting cells and the strong suppressive effect of the immune system. Therefore, it is desired to develop a therapeutic method that is effective in accordance with the condition of the disease and that has an improved risk of side effects, without excessively suppressing the inherent biological defense reaction by the immune system. In addition, for intractable cancers for which a currently effective therapeutic drug has not been developed, development of a new molecule-targeted therapeutic drug that is effective and safe is desired.
Therefore, an object of the present invention is to provide a therapeutic drug for intractable immune disorders and intractable cancers.
そこで本発明者は、難治性免疫異常症や難治性がんに関与しているＩＬ−２６に着目し、市販されている抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体の作用について検討したところ、これらの抗体はＩＬ−２６には結合するものの、中和活性がないことが判明した。そこで、本発明者は数多くのＩＬ−２６に対する抗体を製造し、その中からヒトＩＬ−２６に対する中和活性を有する抗体を選択することに成功した。さらに、抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体の作用を検討したところ、ＩＬ−２６が関与する種々の疾患に対して優れた治療効果を示すことを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventors focused on IL-26 involved in intractable immune disorders and intractable cancers, and examined the action of commercially available anti-human IL-26 monoclonal antibodies. Although it bound to IL-26, it turned out that there is no neutralization activity. Therefore, the present inventors produced many antibodies against IL-26 and succeeded in selecting an antibody having neutralizing activity against human IL-26 among them. Furthermore, when the action of the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody was examined, it was found that it showed excellent therapeutic effect on various diseases involving IL-26, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。 That is, the present invention provides the following [1] to [9].
〔１〕ヒトＩＬ−２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔２〕ヒトＩＬ−２６の活性を阻害するものである〔１〕記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔３〕受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２５７７、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２５７８、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２５７９、又は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５８０として寄託されたハイブリドーマが産生する、ヒトＩＬ−２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含有する医薬。
〔５〕ＩＬ−２６関連性疾患治療薬である〔４〕記載の医薬。
〔６〕ＩＬ−２６が関与する難治性免疫異常症治療薬又はＩＬ−２６が関与する難治性がん治療薬である〔４〕又は〔５〕記載の医薬。
〔７〕ＩＬ−２６が関連する疾患を治療するための、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔８〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、ＩＬ−２６が関連する疾患治療薬製造のための使用。
〔９〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の有効量を投与することを特徴とするＩＬ−２６が関連する疾患の治療方法。
[1] A neutralizing monoclonal antibody against human IL-26 or an antigen-binding fragment thereof.
[2] The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1], which inhibits the activity of human IL-26.
[3] A neutralizing monoclonal antibody against human IL-26 or an antigen thereof produced by the hybridoma deposited under Accession No. NITE P-02577, Accession No. NITE P-02578, Accession No. NITE P-02579, or Accession No. NITE P 02580 Binding fragment.
[4] A medicament comprising the monoclonal antibody according to any one of [1] to [3] or an antigen-binding fragment thereof.
[5] The medicament according to [4], which is a therapeutic agent for IL-26 related disease.
[6] The medicament according to [4] or [5], which is a therapeutic agent for intractable immune disorders associated with IL-26 or a therapeutic agent for intractable cancer associated with IL-26.
[7] The monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any of [1] to [3] for treating a disease associated with IL-26.
[8] Use of the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any of [1] to [3] for producing a therapeutic agent for a disease associated with IL-26.
[9] A method for treating a disease associated with IL-26, which comprises administering an effective amount of the monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [3].
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いれば、ＩＬ−２６が関与する種々の難治性免疫異常症やがんを治療することができる。 By using the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, various intractable immune disorders and cancers involving IL-26 can be treated.
本発明の抗体は、ヒトＩＬ−２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。 The antibody of the present invention is a neutralizing monoclonal antibody against human IL-26 or an antigen-binding fragment thereof.
本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。好ましくは、ＩｇＧであり、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ２である。 The monoclonal antibody of the present invention may be of any class such as IgG, IgA or IgM (or a subclass thereof), and is not limited to a particular class. Preferably, it is an IgG, such as IgG1 or IgG2.
抗原結合性断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。 The antigen-binding fragment is not particularly limited as long as it is a functional or structural fragment of the antibody and retains binding to an antigen to which the antibody can bind. Examples of antigen-binding fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fv, single chain (ScFv), variants thereof, fusion proteins containing an antibody portion, and immunity containing an antigen recognition site. Other modified constructs of globulin molecules and the like can be mentioned.
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ−２６に特異的に結合し、ヒトＩＬ−２６の活性を阻害することを特徴とする。 The monoclonal antibody of the present invention is characterized by specifically binding to human IL-26 and inhibiting the activity of human IL-26.
「特異的に結合する」とは、抗体の抗原やエピトープに対して特異的な結合することを意味する。例えば、特異的にＩＬ−２６のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片は、他のエピトープ又は非エピトープ部分に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、及び/又は、より長時間持続して、このＩＬ−２６エピトープに結合可能である。しかしながら、第１の標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片は、第２の標的に特異的に結合することを排除しない。 "Specifically binding" means binding specifically to an antibody antigen or epitope. For example, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of IL-26 has greater affinity, avidity, more rapidly, and / or more than binding to other epitopes or non-epitopic moieties. Alternatively, it can bind to this IL-26 epitope for a longer time. However, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a first target does not exclude specifically binding to a second target.
「中和モノクローナル抗体」とは、抗原と結合することで、抗原とその受容体との結合を阻害することが可能なモノクローナル抗体を意味する。すなわち、ヒトＩＬ−２６と結合してヒトＩＬ−２６の活性を阻害するモノクローナル抗体である。 By "neutralizing monoclonal antibody" is meant a monoclonal antibody capable of inhibiting the binding of an antigen to its receptor by binding to the antigen. That is, they are monoclonal antibodies that bind to human IL-26 and inhibit the activity of human IL-26.
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、又は、それらの抗原結合性断片が挙げられる。キメラ抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変領域だけを取ってきて、ヒト抗体の定常領域に導入した抗体であって、可変領域は非ヒト由来、定常領域はヒト由来の抗体とすればよい。ヒト化抗体は、抗原と直接結合する部分である超可変領域（相補性決定領域ともいう）だけを非ヒト（例えば、マウス）型にした抗体である。ヒト抗体は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン遺伝子をノックアウトした非ヒト動物（例えば、マウス）と、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した非ヒト動物どうしを交配させて、ヒト免疫グロブリンだけを産生する非ヒト動物を作製し、かかるヒト免疫グロブリンを産生する非ヒト動物から調製した抗体である。
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、場合により、単量体、二量体又は多量体の形態であってよい。
The anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention includes a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, a non-human mammal (eg, mouse, rat, rabbit, cow, horse, goat, etc.) Or the antigen-binding fragments thereof. A chimeric antibody is an antibody which takes in only the variable region of a non-human (eg, mouse) antibody and introduces it into the constant region of a human antibody, wherein the variable region is a non-human derived antibody and the constant region is a human-derived antibody. Just do it. A humanized antibody is an antibody in which only a hypervariable region (also referred to as a complementarity determining region), which is a portion directly binding to an antigen, is made non-human (for example, mouse). Human antibodies are produced by mating non-human animals (eg, mice) knocked out with non-human (eg, mouse) immunoglobulin genes with non-human animals introduced with human immunoglobulin genes to produce only human immunoglobulins. It is an antibody prepared from a non-human animal producing a non-human animal and producing such human immunoglobulin.
The anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may optionally be in the form of a monomer, dimer or multimer.
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体は、種々の方法で製造することができる。モノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野で当業者に周知である（例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照）。
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体は、当業者に周知の、例えば、「Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495」に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して製造することができる。ハイブリドーマ法においては、例えば、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、抗原であるヒトＩＬ−２６又はその断片等で免疫することにより、当該宿主動物に、当該抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）を作らせる。抗体力価を高めるために、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、脂質系アジュバント、グルカン多糖系アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、又は、合成コポリマー系アジュバント等を添加してもよい。抗体産生細胞は脾臓に多く存在するため、一般的には、脾臓から脾細胞を取り出した後に、脾細胞を腫瘍細胞（例えば、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）酵素を欠損した９−アザグアニン耐性株であるミエローマ細胞）と細胞融合させることで不死化させて、ハイブリドーマを作製する。細胞融合は、センダイウイルス、ポリエチレングリコール又は電気刺激等により行ってよい。ハイブリドーマを作製後、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより、脾細胞と腫瘍細胞のハイブリドーマを選択できる。選択したハイブリドーマを１個／ウェルで播種し直すことで、抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。培養上清は、さらに、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、又は、プロテインＡ／Ｇクロマト法等を用いて精製することで、例えば、ＩｇＧ画分（ＩｇＧ抗体）へと精製してもよい。
The anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody of the present invention can be produced by various methods. Methods for producing monoclonal antibodies are well known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
The anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody of the present invention can be produced using a hybridoma method known to those skilled in the art, for example, as described in "Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495". it can. In the hybridoma method, for example, an antibody that specifically binds to the host animal by immunizing a mouse, a hamster or other suitable host animal with the antigen such as human IL-26 or a fragment thereof Cells to produce (antibody-producing cells). For example, complete Freund's adjuvant (CFA), lipid-based adjuvant, glucan polysaccharide-based adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, synthetic copolymer-based adjuvant, or the like may be added to increase antibody titer. Since antibody-producing cells are abundant in the spleen, generally, after removing the splenocytes from the spleen, 9-azaguanine lacking the splenocytes from the tumor cells (eg, HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) enzyme) The cells are immortalized by cell fusion with a resistant strain (myeloma cell) to produce a hybridoma. Cell fusion may be performed by Sendai virus, polyethylene glycol or electrical stimulation and the like. After producing hybridomas, hybridomas of splenocytes and tumor cells can be selected, for example, by culturing in HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) medium. By reseeding the selected hybridomas at 1 / well, hybridomas producing an anti-human IL-26 monoclonal antibody can be obtained. The culture supernatant is further purified, for example, to an IgG fraction (IgG antibody) by further purification using ammonium sulfate salting out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, protein A / G chromatography method or the like. It may be purified.
本発明においては、抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体のうち、中和活性を有するモノクローナル抗体であるから、前記のハイブリドーマ中からＩＬ−２６中和活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する必要がある。その選択法としては、例えば、ヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ−１の発現は、ＩＬ−２６刺激により増強されるので、このＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ−１発現増強阻害作用を検討することにより評価できる。また、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣの細胞増殖および管形成能は、ＩＬ−２６刺激により促進されるので、このＨＵＶＥＣの細胞増殖および管形成能促進阻害作用を検討することにより評価できる。 In the present invention, among the anti-human IL-26 monoclonal antibodies, since it is a monoclonal antibody having a neutralizing activity, it is necessary to select a hybridoma producing a monoclonal antibody having an IL-26 neutralizing activity from the aforementioned hybridomas. is there. As the selection method, for example, since the expression of ICAM-1 on the cell membrane of human colon cancer cell line COLO 205 is enhanced by IL-26 stimulation, the ICAM-1 expression enhancement inhibition on the cell membrane of COLO 205 is inhibited. It can be evaluated by examining the action. In addition, since the cell proliferation and tube formation ability of human umbilical vein endothelial cell HUVEC is promoted by IL-26 stimulation, it can be evaluated by examining the cell proliferation and tube formation ability promoting inhibitory action of this HUVEC.
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの具体例としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２５７７として寄託されたハイブリドーマ（６９−１０）、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５７８として寄託されたハイブリドーマ（２０−３）、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２５７９として寄託されたハイブリドーマ（３１−４）、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５８０として寄託されたハイブリドーマ（２−２）が挙げられる。ここでハイブリドーマの寄託機関は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターである。 As a specific example of a hybridoma producing the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody of the present invention, a hybridoma (69-10) deposited under Accession No. NITE P-02577, a hybridoma deposited under Accession No. NITE P02578 (20 -3) The hybridoma (31-4) deposited under Accession No. NITE P-02579, and the hybridoma (2-2) deposited under Accession No. NITE P02580. Here, the facility for depositing hybridomas is the Patent Microorganisms Depositary Foundation, National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation 2-5-8, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
また、本発明のモノクローナル抗体には、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって認識（結合）されるエピトープに結合する抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であってよい。これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、当該抗体によって認識されるエピトープに結合する抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とは、実質的に又は完全に同一のエピトープを認識し結合するのが好ましい。実質的に同一のエピトープとは、抗体又はその抗原結合性断片の結合性には影響を与えないアミノ酸の修飾、置換、付加、欠失等を有するエピトープを指してもよい。あるいは、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を有する抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片も、本発明の範囲内に含まれる。これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、当該抗体の相補性決定領域を有する抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とは、実質的に又は完全に同一の相補性決定領域を有するのが好ましい。実質的に同一の相補性決定領域とは、抗体又はその抗原結合性断片の結合性には影響を与えないアミノ酸の修飾、置換、付加、欠失等を受けている相補性決定領域を指してもよい。 In addition, the monoclonal antibody of the present invention may be an anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to an epitope recognized (bound) by the monoclonal antibodies produced by these hybridomas. The monoclonal antibody produced by these hybridomas and the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the epitope recognized by the antibody recognize substantially or completely the same epitope. It is preferred to bond. Substantially the same epitope may refer to an epitope having modifications, substitutions, additions, deletions and the like of amino acids that do not affect the binding properties of the antibody or its antigen-binding fragment. Alternatively, an anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof having a complementarity-determining region of a monoclonal antibody produced by these hybridomas is also included in the scope of the present invention. The monoclonal antibody produced by these hybridomas and the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody having the complementarity-determining region of the antibody or an antigen-binding fragment thereof have substantially or completely identical complementarity-determining regions It is preferable to have Substantially identical complementarity determining regions refer to complementarity determining regions that have undergone modification, substitution, addition, deletion, etc. of amino acids that do not affect the binding properties of the antibody or its antigen-binding fragment. It is also good.
あるいは、本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような、遺伝子組換え技術により作製されてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号及び第６，２６５，１５０号）。本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用といった、従来的な方法を使用することで、単離し、配列決定することができる。当該ＤＮＡを単離後に発現ベクターに組み込んで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、当該発現ベクターが導入されない限り免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞に遺伝子導入することにより、本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を産生させてもよい。 Alternatively, the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be produced by genetic engineering, as described, for example, in US Pat. No. 4,816,567. . Alternatively, they may be prepared using phage display technology (e.g., U.S. Patent Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743 and 6,265,150). . The DNA encoding the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present invention uses oligonucleotide probes capable of specifically binding to the gene encoding the heavy chain or light chain of the monoclonal antibody And can be isolated and sequenced using conventional methods. The DNA is incorporated into an expression vector after isolation, and the gene is introduced into E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or host cells such as myeloma cells which do not produce immunoglobulin proteins unless the expression vector is introduced. By introduction, the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof may be produced.
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、所望により、修飾してもよい。抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又はヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性の状態；又は、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等）によって達成してよい。
本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。
例えば、天然に存在するアミノ酸残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失又は置換を適宜行ってもよい。
また、抗体の適切な立体構造を維持するのには関与しない任意のシステイン残基を置換することにより（通常はセリンと置換する）、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋形成を防いでもよい。逆に、抗原結合性断片がＦｖ断片等の抗体断片である場合、システイン結合を抗原結合性断片に付加することにより、抗原結合性断片の安定性を向上させることができる。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化又は修飾であってもよく、可変領域等の領域の完全な再設計であってもよい。可変領域における変化は、結合親和性及び/又は特異性を変化させ得る。一実施態様において、１〜５個以下の保存的なアミノ酸置換をＣＤＲ上で行ってよい。他の実施態様において、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲ３上で行ってよい。さらなる別の実施態様において、ＣＤＲはＣＤＲＨ３及び/又はＣＤＲＬ３であってよい。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化又はリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、及び、アスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体又はその抗原結合性断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ−結合型グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又は、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリン又はスレオニン）への結合であってよく、場合により、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。
The anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be optionally modified. Substantial modifications in the biological properties of the antibody include (a) the three-dimensional structure of the amino acid sequence in the modified region, eg sheet or helix conformation; (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site Or may be achieved by modification (eg, substitution, deletion, addition of an amino acid residue, etc.) that alters the sexual state; or (c) the effect of the modification on maintenance of the side chain volume.
In the present specification, the amino acid is used in its broadest sense, and natural amino acids such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine (Ala) ), Tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine ( Non-naturally occurring amino acids are also included, such as amino acid variants and derivatives as well as Cys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), proline (Pro). Those skilled in the art, in view of this broad definition, as amino acids in the present specification, for example, L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and amino acid derivatives; norleucine, β-alanine, It is naturally understood that ornithine and the like, amino acids which do not constitute a protein constituent material in vivo; and chemically synthesized compounds having characteristics of amino acids known to those skilled in the art. Examples of non-natural amino acids include α-methyl amino acids (α-methyl alanine etc.), D-amino acids (D-aspartic acid, D-glutamic acid etc.), histidine-like amino acids (2-amino-histidine, β-hydroxy-histidine) , Homo-histidine, α-fluoromethyl-histidine, α-methyl-histidine, etc., amino acids having an extra methylene in the side chain ("homo" amino acids) and carboxylic acid functional amino acids in the side chain are substituted with sulfonic acid groups Amino acids such as cysteic acid and the like.
For example, naturally occurring amino acid residues can be classified into the following groups based on their general side chain properties:
(1) Hydrophobicity: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Neutral hydrophilicity: Cys, Ser, Thr;
(3) Acidic: Asp, Glu;
(4) Basicity: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Residues that affect chain orientation: Gly, Pro; and (6) Aromatics: Trp, Tyr, Phe.
Non-conservative substitution of the amino acid sequences that make up the antibody or antigen binding fragment thereof may be performed by replacing an amino acid belonging to one of these groups with an amino acid belonging to the other group. More conservative substitutions may be made by replacing an amino acid belonging to one of these groups with another amino acid from the same group. Similarly, deletion or substitution of the amino acid sequence may be appropriately performed.
It also improves the oxidative stability of the molecule and prevents abnormal cross-link formation by replacing any cysteine residue that is not involved in maintaining the proper conformation of the antibody (usually by replacing it with serine). May be. Conversely, when the antigen binding fragment is an antibody fragment such as an Fv fragment, the stability of the antigen binding fragment can be improved by adding a cysteine bond to the antigen binding fragment.
The modification of the amino acids constituting the antibody or antigen binding fragment thereof may be a change or modification of one or more amino acids, or a complete redesign of a region such as a variable region. Changes in the variable region can alter binding affinity and / or specificity. In one embodiment, no more than 1 to 5 conservative amino acid substitutions may be made on the CDRs. In other embodiments, no more than one to three conservative amino acid substitutions may be made on CDR3. In yet another embodiment, the CDRs may be CDRH3 and / or CDRL3.
Modification of amino acids constituting the antibody or antigen-binding fragment thereof may be, for example, post-translational modification such as glycosylation with sugar, acetylation or phosphorylation. An antibody can be glycosylated at a conserved position in its constant region. Glycosylation of antibodies is usually either N-linked or O-linked. N-linked refers to the attachment of the carbohydrate moiety to the side chain of an asparagine residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine, asparagine-X-threonine, and asparagine-X-cysteine (wherein X is any amino acid except proline) It is a recognition sequence to be added. The presence of any of these tripeptide sequences in the antibody or antigen binding fragment thereof provides a potential glycosylation site. O-linked glycosylation may be the attachment of either N-acetylgalactosamine, galactose or xylose to a hydroxy amino acid (eg serine or threonine), optionally 5-hydroxyproline or 5- It may be a bond to hydroxylysine. Those skilled in the art can appropriately select glycosylation conditions (for example, types of host cells and cell culture medium, pH, etc. when glycosylation is carried out using biological methods) according to the purpose. .
本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、後記実施例に示すように、ヒトＩＬ−２６の活性を阻害し、ＩＬ−２６活性が増強することによって生じる種々の疾患の治療薬として有用である。ここで、ＩＬ−２６が関連する疾患としては、難治性免疫異常症及びがんが挙げられる。具体的な対象疾患としては、急性又は慢性移植片対宿主病、移植後拒絶反応、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、がん、特発性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、閉塞性細気管支炎、ウイルス性肝炎、肝硬変、腎硬化症、慢性糸球体腎炎及び特発性ネフローゼ症候群から選ばれる疾患が挙げられる。ここで自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎症候群、混合性結合組織病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、類天疱瘡、習慣性流産、原因病及び自己免疫性視神経炎から選ばれる疾患が挙げられる。また、がんとしては、例えば、頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、子宮頚癌、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。 The anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present invention inhibits the activity of human IL-26 and enhances the activity of IL-26, as described in the examples below. It is useful as a therapeutic drug for diseases. Here, diseases associated with IL-26 include intractable immune disorders and cancer. Specific target diseases include acute or chronic graft versus host disease, rejection after transplantation, autoimmune disease, atopic dermatitis, cancer, idiopathic pulmonary hypertension, chronic obstructive pulmonary disease, idiopathic pulmonary fibers And diseases selected from obstructive bronchiolitis, viral hepatitis, cirrhosis, nephrosclerosis, chronic glomerulonephritis and idiopathic nephrotic syndrome. As the autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, psoriatic arthritis, polymyositis, dermatomyositis, scleroderma, Sjögren's syndrome, vasculitis syndrome, mixed connective tissue disease, autoimmune hepatitis, Primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune pancreatitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune neutropenia, Diseases selected from type I diabetes, pemphigus, pemphigus, addictive abortion, causative disease and autoimmune optic neuritis are included. Moreover, cancer includes, for example, head and neck cancer, esophagus cancer, gastric cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder and cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, bone and Examples include soft tissue sarcoma, malignant lymphoma, leukemia, multiple myeloma, cervical cancer, skin cancer, brain tumor and the like.
本発明の医薬は、抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有するが、これらの有効成分及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物として提供するのが好ましい。 The medicament of the present invention comprises an anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, and is provided as a pharmaceutical composition comprising these active ingredients and a pharmaceutically acceptable carrier. Is preferred.
そのような医薬組成物としては、注射剤、経口剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が挙げられるが、注射剤がより好ましい。 Such pharmaceutical compositions include injections, oral preparations, suppositories, patches, ointments and the like, and injections are more preferred.
注射剤を調製する場合は、本発明の抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内又は静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、それぞれ、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。 When preparing an injection, a pH regulator, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic and the like are added to the anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention. Subcutaneous, intramuscular or intravenous injections can be prepared by conventional methods. As a pH regulator and a buffer in this case, sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate etc. are mentioned, respectively. As the stabilizer, sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like can be mentioned. The local anesthetic includes procaine hydrochloride, lidocaine hydrochloride and the like. Examples of tonicity agents include sodium chloride and glucose.
本発明の医薬、疾患、患者の症状などにより相違するか、注射剤の場合、有効成分として通常成人１回当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。 It differs depending on the medicine of the present invention, the disease, the condition of the patient, etc. In the case of injections, the active ingredient is usually 0.01 mg to 100 mg per adult once daily or divided into about 2 to 4 times. Is preferred.
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。 The present invention will now be described in more detail by way of examples.
１．研究方法
（１）細胞
ヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５はＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）より購入し、マウスリンパ腫細胞Ａ２０に、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞（Ａ２０−ｌｕｃ）は、Ｄｒ．Ｘｉａｏ Ｃｈｅｎ （Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）の好意により提供された（Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（１９）：３９７０−８０．）。ＣＯＬＯ２０５とＡ２０−ｌｕｃは、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と１０％ＦＢＳ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣはＬＯＮＺＡ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）より購入し、ＥＧＭ培地（ＬＯＮＺＡ）で培養した。細胞培養は全て５％ ＣＯ２、３７℃の環境で行った。ヒト臍帯血単核球は、ヒト臍帯血からフィコール密度勾配法で単離した単核球をＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入した。
1. research method
(1) Cell Human colon cancer cell line COLO 205 was purchased from RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan), and mouse lymphoma cell A20 was transfected with firefly luciferase (A20-luc) as described in Dr. Provided courtesy of Xiao Chen (Medical College of Wisconsin, Milwaukee, Wis., USA) (Blood. 2013; 121 (19): 3970-80.). COLO 205 and A20-luc are in RPMI-1640 medium (Wako, Osaka, Japan) supplemented with 1% penicillin / streptomycin (Thermo Fisher scientific, Waltham, Mass., USA) and 10% FBS (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) Cultured. Human umbilical vein endothelial cells HUVEC were purchased from LONZA (Walkersville, MD, USA) and cultured in EGM medium (LONZA). All cell cultures were performed in a 5% CO 2 , 37 ° C. environment. Human umbilical cord blood mononuclear cells were purchased from RIKEN BioResource Center, mononuclear cells isolated by Ficoll density gradient method from human umbilical cord blood.
（２）研究に用いた抗ヒトＩＬ−２６抗体および組換えヒトＩＬ−２６
新たに樹立したＩＬ−２６モノクローナル抗体の比較対照として、市販されているＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）のマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＬＬ０７，カタログ番号ｓｃ−８０５２３）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ５１０４１４，カタログ番号ＭＡＢ１３７５１）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのヤギ抗ヒトＩＬ−２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１３７５）を用いた。用いたＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＩＬ−２６ポリクローナル抗体は、これまでに複数の論文でＩＬ−２６の活性を阻害することが報告されている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（３２）：３３３４３−５１．；Ｇｕｔ．２０１５；６４（９）：１４６６−７５．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（８）：３６９７−７１２．）。アイソタイプ対照抗体としてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のマウスＩｇＧ1,κモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＧ１−４５，カタログ番号４０１４０４）を用いた。マウスに免疫する組換えヒトＩＬ−２６はＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＩＬ−２６モノマー（カタログ番号１３７５−ＩＬ−０２５／ＣＦ）を、細胞を刺激するための組換えヒトＩＬ−２６はＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＩＬ−２６ダイマー（カタログ番号１８７０−ＩＬ−０１０／ＣＦ）を用いた。
(2) Anti-human IL-26 antibody and recombinant human IL-26 used in the study
A commercially available mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody (clone LL07, catalog number sc-80523) of Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), which is commercially available, as a comparison control of a newly established IL-26 monoclonal antibody, R & D Mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody (clone 510414, catalog no. MAB 13751) from Systems (Minneapolis, MN, USA) and goat anti-human IL-26 polyclonal antibody (catalog no. AF 1375) from R & D Systems were used. The goat anti-human IL-26 polyclonal antibody used by R & D Systems has been previously reported to inhibit the activity of IL-26 in several articles (J Biol Chem. 2004; 279 (32): 33343 Gut. 2015; 64 (9): 1466-75. J Immunol. 2015; 194 (8): 3697-712.). As an isotype control antibody, mouse IgG1 ,モ ノ ク ロ ー ナ ル monoclonal antibody (clone MG1-45, catalog number 401404) of BioLegend (San Diego, CA, USA) was used. Recombinant human IL-26 to immunize mice is from R & D Systems IL-26 monomer (Catalog No. 1375-IL-025 / CF), recombinant human IL-26 to stimulate cells is from R & D Systems IL-26 The dimer (catalog number 1870-IL-010 / CF) was used.
（３）マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス、♀は日本クレア（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６を遺伝子背景とした、ヒトＩＬ２６及びＩＦＮＧ遺伝子を含む１９０ｋｂのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）遺伝子導入（ｈＩＬ２６−ＩＦＮＧ Ｔｇ）マウスならびにＩＦＮＧ転写開始部位の７７ｋｂ上流に位置する保存された非コード配列（ＣＮＳ）を欠損しているＢＡＣ Ｔｇ（ΔＣＮＳ−７７ Ｔｇ）マウスは、Ｔｈｏｍａｓ Ａｕｎｅの研究室で開発された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８５（３）：１４９２−５０１．；Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２０１２；１３（６）：４８１−８．）。ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ Ｊｉｃ（Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃ）マウス（以下、ＮＯＧマウス）、♀は、実験動物中央研究所（Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｊａｐａｎ）から購入した。すべてのマウスは特定病原体除去施設においてマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。マウスは８−１４週齢を使用した。動物実験は施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）で承認されたプロトコルに従って行った。
(3) Mouse BALB / c mouse and rabbit were purchased from CLEA Japan (Tokyo, Japan). A 190 kb bacterial artificial chromosome (BAC) transgenic (hIL26-IFNG Tg) mouse containing human IL26 and IFNG genes, with C57BL / 6 as gene background, and a conserved noncoding sequence located 77 kb upstream of the IFNG transcription start site BAC Tg (ΔCNS-77 Tg) mice deficient in (CNS) were developed at Thomas Aune's laboratory (J Immunol. 2010; 185 (3): 1492-501 .; Genes Immun. 2012; 13 (6): 481-8.). NOD / Shi-scid, IL-2Rγ KO Jic (Cg-PrkdcscidIl2 rgtm1 Sug / Jic) mice (hereinafter referred to as NOG mice) and rabbits were purchased from the Central Research Institute for Experimental Animals (Kawasaki, Japan). All mice were housed in microisolator cages at specific pathogen removal facilities. The mice used 8-14 weeks old. Animal experiments were conducted according to the protocol approved by the Institutional Animal Care and Use Committee.
（４） マウスへの免疫とハイブリドーマの作製
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの組換えヒトＩＬ−２６タンパク（ヒトＩＬ−２６の２２番目から１７１番目のアミノ酸残基を大腸菌に発現させたもの）４０μｇ／５０μＬと、合成コポリマー系アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）５０μＬとを混合して、１匹あたり１００μＬ／ｄｏｓｅでＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。２週間ごとに合計５回皮下注射を行い、最後に尾静脈に上記の半量である５０μＬを静脈注射した。３日後にマウスを解剖して得た粗精製脾細胞と、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とを、１：１で混合し、ポリエチレングリコールで細胞融合してハイブリドーマを作製した。細胞を洗浄した後、５％ ＢｒｉＣｌｏｎｅ（ＮＩＣＢ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ，カタログ番号ＢＲＢＲ００１）とＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加したＧＩＴ培地（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で当該細胞を懸濁してから、９６ウェル平底プレートに播種した。生育したハイブリドーマの培養上清を回収し、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗ヒトＩＬ−２６抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行い、陽性であったハイブリドーマを選出した後、中和活性の検討を行った。中和活性を有する抗体を産生するハイブリドーマを９６ウェル平底プレートに１個／ウェルで播種し直し、複数の単クローンを選出した。目的の抗体を含む細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｇＧ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてＩｇＧ画分を精製した。
(4) Immunization to mice and preparation of hybridomas Recombinant human IL-26 protein from R & D Systems (having amino acid residues 22 to 171 of human IL-26 expressed in E. coli) 40 μg / 50 μL and synthetic BALB / c mice were injected subcutaneously with 100 μL / dose per animal, mixed with 50 μL of the copolymer-based adjuvant, TiterMax Gold (TiterMax USA, Norcross, GA, USA). A total of 5 subcutaneous injections were given every 2 weeks, and finally the tail vein was intravenously injected with the above half amount, 50 μL. The crude purified splenocytes obtained by dissecting the mouse after 3 days and P3U1 myeloma cells were mixed 1: 1 and fused with polyethylene glycol to prepare a hybridoma. After washing the cells, GIT medium (Wako Pure Chemicals, supplemented with 5% BriClone (NICB, Dublin, Ireland, Catalog No. BRBR001) and HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The cells were suspended in Osaka, Japan) and then seeded in 96 well flat bottom plates. Culture supernatants of grown hybridomas are collected, and anti-human IL-26 antibody-producing hybridomas are screened by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) to select hybridomas that were positive, and then the neutralization activity is examined. went. Hybridomas producing an antibody having neutralizing activity were replated at 1 / well in a 96-well flat bottom plate, and multiple single clones were selected. The IgG fraction was purified from cell culture supernatant containing the desired antibody using Protein A IgG Purification Kit (Pierce, Rockford, IL, USA).
（５） ＥＬＩＳＡ
抗ヒトＩＬ−２６抗体産生ハイブリドーマの最初のスクリーニングでは、組換えヒトＩＬ−２６モノマーを炭酸塩／重炭酸塩バッファー（ＣＢＢ）に希釈し、５０ｎｇ／ｗｅｌｌでイムノプレート（ＮＵＮＣ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に添加して４℃で一晩静置した。陰性コントロールとしてＣＢＢのみをプレートに添加し、ヒトＩＬ−２６をコートしない群を用意した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加して室温で１時間静置することでプレートをブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、一次抗体としてＰＢＳで２倍に希釈したハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号５５４００２）をＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を添加して発色させた後、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。培養上清から精製したＩｇＧ画分のＩＬ−２６への結合性の検討では、組換えヒトＩＬ−２６モノマーまたは組換えヒトＩＬ−１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をＣＢＢに希釈し、２−１００ｎｇ／ｗｅｌｌでイムノプレートに添加して４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅを添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、一次抗体として精製した新規マウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体をＲＰＭＩ−１６４０培地で１０μｇ／ｍＬに調整した溶液を添加し、室温で１時間静置した。以降の手順は上記と同様の方法で行い、４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。データはＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で解析した。
(5) ELISA
In the first screening of anti-human IL-26 antibody-producing hybridomas, recombinant human IL-26 monomer is diluted in carbonate / bicarbonate buffer (CBB) and applied to immunoplates (NUNC, Roskilde, Denmark) at 50 ng / well. It was added and allowed to stand overnight at 4 ° C. As a negative control, CBB alone was added to the plate to prepare a group not coated with human IL-26. After washing with phosphate buffered saline (PBS-T) containing 0.05% Tween 20, the plate was blocked by adding 2% BlockAce (DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan) and leaving at room temperature for 1 hour . After washing with PBS-T, a hybridoma culture supernatant diluted 2-fold with PBS as a primary antibody was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. 500-fold diluted solution of HRP-conjugated goat anti-mouse Ig antibody (BD Biosciences, San Jose, Calif., USA, Catalog No. 554002) as a secondary antibody after washing with PBS-T (concentration is not described in the product) ) Was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing with PBS-T, TMB peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA) is added for color development, 2N H 2 SO 4 is added to stop the reaction, and microplate reader (Bio-Rad, The absorption wavelength of 450 nm and the reference wavelength of 570 nm were measured by Hercules, CA, USA). For examination of the binding of IgG fractions purified from culture supernatants to IL-26, recombinant human IL-26 monomer or recombinant human IL-10 (BioLegend) was diluted in CBB, at 2-100 ng / well The immunoplates were added and allowed to stand overnight at 4 ° C. After washing with PBS-T, 2% BlockAce was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing with PBS-T, a solution prepared by adjusting as a primary antibody a novel mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody or a mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody of R & D Systems at 10 μg / mL in RPMI-1640 medium is added, Let stand at room temperature for 1 hour. The subsequent procedure was performed in the same manner as described above, and the absorption wavelength of 450 nm and the reference wavelength of 570 nm were measured. Data were analyzed with Microplate Manager 6 (Bio-Rad).
（６） ＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ−１発現解析
ＣＯＬＯ ２０５を９６ウェル平底プレートに５×１０4個／ウェルとなるよう播種し、対照マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体の存在下、不存在下で組換えヒトＩＬ−２６ダイマー（２０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間培養後に細胞を回収し、１％ＦＢＳと０．１％アジ化ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳ（ＦＣＭバッファー）で洗浄した。その後、Ｂａｙ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）のＰＥ標識マウス抗ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ １５．２，カタログ番号５０−０５４９−Ｔ１００）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＰＥ標識マウスＩｇＧ1,κアイソタイプ対照モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＯＰＣ−２１，カタログ番号４００１１４）をＦＣＭバッファーで５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／サンプルで添加し、４℃で２５分静置した。その後、細胞を氷冷ＦＣＭバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で解析した。
(6) Analysis of ICAM-1 expression of COLO 205 Seed COLO 205 at 5 × 10 4 cells / well in a 96-well flat bottom plate, in the absence of control mouse IgG or anti-human IL-26 monoclonal antibody. Stimulated with recombinant human IL-26 dimer (20 ng / mL). After culture for 24 hours, cells were harvested and washed with ice cold PBS (FCM buffer) containing 1% FBS and 0.1% sodium azide. Then, PE labeled mouse anti-human ICAM-1 monoclonal antibody (clone 15.2, catalog number 50-0549-T100) of Bay bioscience (Kobe, Japan) or PE labeled mouse IgG 1,ア イ ソ タ イ プ isotype control monoclonal antibody (clone of BioLegend (clone) A solution in which MOPC-21, catalog number 400114) was diluted to 5 μg / mL with FCM buffer was added at 50 μL / sample, and allowed to stand at 4 ° C. for 25 minutes. Thereafter, the cells were washed with ice-cold FCM buffer and then measured by FACSCalibur (BD Biosciences), and the obtained data were analyzed by FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA).
（７） ＨＵＶＥＣの細胞増殖試験
ＨＵＶＥＣを、増殖因子を半減した２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地中に９６ウェル平底プレートに５×１０3個／ウェルとなるよう播種し、３７℃で１２時間培養した。その後、培地を吸引し、増殖因子を含まない２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地で、組換えヒトＩＬ−２６ダイマーを最終濃度３ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、組換えヒトＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整して、細胞に添加した。ＩＬ−２６の中和試験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで添加した。刺激を開始して４８時間の細胞増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）によって成育可能面積中の細胞の割合を算出することで評価した。
(7) HUVEC Cell Proliferation Test HUVEC was seeded at 5 × 10 3 cells / well in a 96-well flat bottom plate in EGM medium containing 2% FBS in which growth factors were halved, and cultured at 37 ° C. for 12 hours. Thereafter, the medium is aspirated, and in a growth factor-free EGM medium containing 2% FBS, the recombinant human IL-26 dimer has a final concentration of 3 ng / mL or 10 ng / mL and a recombinant human VEGF has a final concentration of 10 ng / mL Adjusted and added to the cells. In the IL-26 neutralization test, control mouse IgG, newly established anti-human IL-26 monoclonal antibody was added alone or in combination. Cell growth for 48 hours at the start of stimulation was assessed by calculating the percentage of cells in the viable area by IncuCyte ZOOM (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA).
（８） ＨＵＶＥＣの管形成試験
培養ディッシュ中でＨＵＶＥＣの培地を、増殖因子を半減した２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地に置換して３７℃で一晩培養した。その後、９６ウェル平底プレートにＣｕｌｔｒｅｘ ＰａｔｈＣｌｅａｒ増殖因子減量基底膜抽出物（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３４３３−００５−０１）を５０μＬ／ウェルで添加し、増殖因子を含まない２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地中にＨＵＶＥＣを１．５×１０4個／ウェルとなるよう播種した。同じ培地で組換えヒトＩＬ−２６ダイマーを最終濃度３ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、組換えヒトＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整し、細胞に添加した。ＩＬ−２６の中和試験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで添加した。刺激を開始して９時間の管形成を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭを用いて評価した。管形成の長さをＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で解析した。
(8) Tube formation test of HUVEC In the culture dish, the medium of HUVEC was replaced with EGM medium containing 2% FBS in which the growth factor was halved and cultured overnight at 37 ° C. Thereafter, 50 μL / well of Cultrex PathClear growth factor-reduced basement membrane extract (R & D Systems, Catalog No. 3433-005-01) is added to a 96-well flat bottom plate, and HUVEC in 2% FBS-containing EGM medium without growth factor Were seeded at 1.5 × 10 4 cells / well. Recombinant human IL-26 dimer was adjusted to a final concentration of 3 ng / mL or 10 ng / mL, and recombinant human VEGF was adjusted to a final concentration of 10 ng / mL in the same medium, and added to the cells. In the IL-26 neutralization test, control mouse IgG, newly established anti-human IL-26 monoclonal antibody was added alone or in combination. Nine hours of tube formation was assessed using the IncuCyte ZOOM after stimulation was initiated. The length of tube formation was analyzed with MetaMorph image analysis system (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA).
（９） イミキモド誘導性乾癬モデル
ｈＩＬ２６−ＩＦＮＧ Ｔｇマウス及びΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスの背中の毛を剃り、５％イミキモド含有クリーム（ベセルナクリーム；Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）２０ｍｇを背中の皮膚に５日連続で（０日目から４日目まで）塗布した。抗体による治療実験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで０日目、２日目、４日目に１日おきに投与した。抗体溶液は無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）腹腔内注射した。背中の皮膚の炎症の重症度を、臨床のＰｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）に基づき毎日スコア化した。皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚それぞれに対し、「正常」をスコア０、「やや悪化」をスコア１、「中程度に悪化」をスコア２、「顕著に悪化」をスコア３、「極めて顕著に悪化」をスコア４とした０−４までのスコアを付け、累計スコア（０−１２）とともに示した（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１１７２４．）。
(9) The back hair of imiquimod-induced psoriasis model hIL26-IFNG Tg mice and ΔCNS-77 Tg mice is shaved and cream containing 5% imiquimod (Beselna cream; Mochida Pharmaceutical, Tokyo, Japan) 20 mg on the back skin for 5 days It applied continuously (from day 0 to day 4). In antibody treatment experiments, control mouse IgG, newly established anti-human IL-26 monoclonal antibody was administered alone or in combination every other day on days 0, 2, 4 days. The antibody solution was adjusted to a concentration of 1 mg / mL with sterile PBS and injected intraperitoneally with 200 μL (200 μg) per animal. The severity of back skin inflammation was scored daily based on the clinical Psoriasis Area and Severity Index (PASI). For each of skin erythema, scaling, and thickening, score "normal" is 0, score "slightly worse" score 1, score "moderately worse" score 2, score "significantly worse" score 3, "very significantly worse" The score up to 0-4 was assigned a score of 4 and indicated together with the cumulative score (0-12) (Nat Commun. 2016; 7: 11724.).
（１０） 皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及び免疫蛍光染色
イミキモド含有クリームを塗布したｈＩＬ２６−ＩＦＮＧ Ｔｇマウス及びΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスを解剖した後、背中の皮膚を切除して１０％ホルマリン溶液（Ｗａｋｏ）の中で室温で固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍ厚の切片を作製し、スライドガラスに載せてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色を行った。光学顕微鏡の画像はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。免疫蛍光染色では、背中の皮膚を４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で４℃で一晩静置した。固定した組織を２０％スクロース（Ｗａｋｏ）に置換して４℃で一晩静置し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋して、−８０℃で保存した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて５μｍ厚の凍結切片を作製した。１％パラホルムアルデヒドに室温で１０分間浸し、風乾させた後、１０％正常ロバ血清を添加して室温で１時間静置することでブロッキングした。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体としてＤａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でウサギ抗マウス、ヒト、ブタＣＤ３１ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，カタログ番号ａｂ２８３６４）を３０倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、またはラット抗マウスＬｙ６ｇモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，ｃｌｏｎｅ ＲＢ６−８Ｃ５，カタログ番号ａｂ２５３７７）を１００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてＤａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈液でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ａ−２１２０６）を２００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，カタログ番号ａｂ１５０１５３）を３００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、スライドカラスにＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用封入剤ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、カバーガラスをのせてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
(10) H & E staining of skin section and immunofluorescent staining After dissectioning hIL26-IFNG Tg mice and ΔCNS-77 Tg mice coated with imiquimod containing cream, the skin on the back is excised and in 10% formalin solution (Wako) After fixing at room temperature and embedding in paraffin, a 5 μm-thick section was prepared, mounted on a slide glass, and stained with hematoxylin and eosin (H & E). Light microscopy images were taken with a Zeiss Axioplan 2 microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). For immunofluorescent staining, the skin on the back was allowed to stand overnight at 4 ° C. in 4% paraformaldehyde (Thermo Fisher scientific). The fixed tissues were replaced with 20% sucrose (Wako), allowed to stand at 4 ° C. overnight, embedded in a Tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetek, Tokyo, Japan), and stored at -80 ° C. Frozen sections of 5 μm thickness were prepared using a cryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). It was immersed in 1% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, air-dried, and blocked by adding 10% normal donkey serum and standing at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, a 30-fold diluted solution of rabbit anti-mouse, human and porcine CD31 polyclonal antibodies (Abcam, Cambridge, UK, Catalog No. ab28364) with Dako REAL antibody diluent (Dako, Tokyo, Japan) as primary antibody (concentration) Add a 100-fold diluted solution of rat anti-mouse Ly6g monoclonal antibody (Abcam, clone RB6-8C5, catalog number ab25377) (concentration is not described in the product), and allow to stand overnight at 4 ° C. Placed. After washing with PBS, a 200-fold diluted solution of Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG polyclonal antibody (Thermo Fisher Scientific, Catalog No. A-21206) with Dako REAL antibody dilution as secondary antibody (concentration not described in the product) A 300-fold diluted solution of Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rat IgG polyclonal antibody (Abcam, Catalog No. ab150153) (concentration not described in the product) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, the slide crows were added with the fluorescent fading-preventing mounting medium ProLong Gold (Thermo Fisher Scientific) containing DAPI, mounted with a cover glass, and photographed with a Zeiss Axioplan 2 fluorescence microscope.
（１１） 異種慢性ＧＶＨＤモデル
−１日目に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施した。０日目に、ＮＯＧマウスの尾静脈からヒト臍帯血単核球５×１０6個を移植した。ＧＶＨＤを発症しない比較対照として、ヒト臍帯血単核球からＨｕｍａｎ ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，カタログ番号１３０−０４６−７０３）を用いてＣＤ３４+ 細胞（造血幹細胞画分）を精製し、ＮＯＧマウスの尾静脈から１×１０5個を移植した。マウスの生存評価は毎日行い、体重は週に２回測定した。抗体による治療実験では、対照マウスＩｇＧ、または新たに樹立した抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体（クローン６９−１０）を、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目から投与した。抗体溶液は無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）ずつ週に２回、腹腔内注射した。レシピエント（ＮＯＧマウス）体内でのドナー白血球の生着を計測するため、マウスの尻尾から５０−１００μＬ採血し、遠心して血漿を分離した後、血球懸濁液５０μＬにＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ８ａ，カタログ番号５５５６３４）を４０倍希釈（濃度は製品に記載なし）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識マウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ−Ｔ４，カタログ番号３００５３０）を５０倍希釈（濃度は製品に記載なし）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅ ＨＩ３０，カタログ番号３０４０１２）を４０倍希釈（濃度は製品に記載なし）で直接添加し、ヒトリンパ球セブセットマーカーの染色を行い、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して赤血球を溶解した後、フローサイトメトリーにて解析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏで解析した。
(11) Heterogeneous Chronic GVHD Model On day -1, NOG mice were irradiated with a sublethal dose (200 cGy). On day 0, 5 × 10 6 human umbilical cord blood mononuclear cells were transplanted from the tail vein of NOG mice. As a comparison control that does not develop GVHD, CD34 + cells (hematopoietic stem cell fraction) are purified from human umbilical cord blood mononuclear cells using Human CD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec, Catalog No. 130-046-703), and NOG mouse 1 × 10 5 were transplanted from the tail vein. The mice were assessed for survival daily and body weights were measured twice weekly. In antibody treatment experiments, control mouse IgG, or a newly established anti-human IL-26 monoclonal antibody (clone 69-10) was administered from grafting + day 28 when mild clinical signs / symptoms of GVHD began to be seen . The antibody solution was adjusted to a concentration of 1 mg / mL with sterile PBS and injected intraperitoneally twice a week with 200 μL (200 μg) per animal. In order to measure engraftment of donor leukocytes in the recipient (NOG mouse), 50 to 100 μL of blood is collected from the tail of the mouse and centrifuged to separate plasma, and FITC-labeled mouse anti-human CD8 monoclonal is prepared in 50 μL of blood cell suspension. A 40-fold dilution of antibody (BD Biosciences, clone HIT8a, catalog number 555634) (concentration not described in the product), PerCP-Cy5.5 labeled mouse anti-human CD4 monoclonal antibody (Bio Legend, clone RPA-T4, catalog number 300530) 50-fold dilution (concentration not described in the product), APC-labeled mouse anti-human CD45 monoclonal antibody (Bio Legend, clone HI30, catalog No. 304012) directly added in the 40-fold dilution (concentration not described in the product) Staining of lymphocyte sphereset marker was performed, and BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences) was added to lyse erythrocytes, and then analyzed by flow cytometry. The measurement was performed with FACSCalibur, and the obtained data was analyzed with FlowJo.
（１２） 組織学的評価
マウスを解剖した後、背中の皮膚、肺、肝臓、腸管を切除して１０％ホルマリン溶液（Ｗａｋｏ）の中で室温で固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍ厚の切片を作製し、スライドガラスに載せてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色を行った。光学顕微鏡の画像は、ＯｌｙｍｐｕｓデジタルカメラＤＰ２５接続Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影し、ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを用いた。
(12) Histological evaluation After dissecting the mouse, the skin, lung, liver and intestine of the back are excised, fixed at room temperature in 10% formalin solution (Wako) and embedded in paraffin, then 5 μm thick Sections were mounted on a slide glass and stained with hematoxylin and eosin (H & E). Images of the optical microscope were taken with an Olympus digital camera DP25 connected Olympus BX41 microscope (OLYMPUS, Tokyo, Japan) and CellSens software was used.
（１３） ＧＶＴ効果及び生物発光イメージング
−１日目に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施した。０日目に、ＮＯＧマウスの尾静脈からヒト臍帯血単核球５×１０6個を移植した。移植後＋２８日目に尾静脈からＮＯＧマウスと同じ遺伝的背景（Ｈ−２d）のマウスリンパ腫細胞Ａ２０−ｌｕｃ細胞１×１０5個を播種した。その翌日＋２９日目から、無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した対照マウスＩｇＧ、またはＩＬ−２６モノクローナル抗体（クローン６９−１０）を、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）ずつ週に２回、腹腔内注射した。生体内生物発光イメージングを用いて腫瘍細胞の測定を週２回行った。イソフルランガス麻酔下で、無菌ＰＢＳで１５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したＤ−ルシフェリンカリウム（Ｗａｋｏ，カタログ番号１２６−０５１１６）を、１匹あたり２００μＬずつ腹腔内注射した。基質となるルシフェリンを注射して５分後、１０分後の生体内生物発光をＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて撮影した。Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて画像データの発光強度を定量化し、Ｔｏｔａｌ Ｆｌｕｘ（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ）として示した。
(13) GVT effect and bioluminescence imaging On day 1, NOG mice were irradiated with a sublethal dose (200 cGy). On day 0, 5 × 10 6 human umbilical cord blood mononuclear cells were transplanted from the tail vein of NOG mice. On the 28th day after transplantation, 1 × 10 5 mouse lymphoma cells A20-luc cells in the same genetic background (H-2 d ) as NOG mice were seeded from the tail vein. From the next day +29, control mouse IgG adjusted to a concentration of 1 mg / mL with sterile PBS, or IL-26 monoclonal antibody (clone 69-10), 200 μL (200 μg) per mouse twice weekly Internally injected. Tumor cells were measured twice weekly using in vivo bioluminescence imaging. Under isoflurane gas anesthesia, 200 μL of D-luciferin potassium (Wako, catalog number 126-05116) adjusted to a concentration of 15 mg / mL with sterile PBS was intraperitoneally injected per animal. Five minutes after injection of luciferin as a substrate and 10 minutes after, in vivo bioluminescence was photographed using a Caliper IVIS Lumina II In Vivo Imaging System (Perkin-Elmer, Waltham, Mass., USA). The luminescence intensity of the image data was quantified using Caliper Living Image software (Perkin-Elmer) and shown as Total Flux (photons / second).
（１４） 統計
データは、２群比較では両側スチューデントｔ検定によって、多重比較ではＡＮＯＶＡ検定とそれに続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホック検定によって解析した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。生存率はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いてログランク検定によって解析した。エクセル統計（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して計算を実施し、グラフを作成した。
(14) Statistical data were analyzed by two-tailed Student's t-test for 2-group comparisons and ANOVA test followed by Tukey-Kramer post-hoc test for multiple comparisons. A p value <0.05 was considered statistically significant. Survival rates were analyzed by log rank test using Kaplan-Meier method. Calculations were performed using Excel statistics (Microsoft, Redmond, WA, USA) to generate graphs.
２．結果
（１） 新規モノクローナル抗体のＩＬ−２６に対する結合性
上述のとおり、組換えヒトＩＬ−２６を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの粗精製脾細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞とをポリエチレングリコールで細胞融合させ、生育したハイブリドーマからマウス抗ヒトＩＬ−２６抗体を含む培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによる一次スクリーニングを行った。その結果、抗ヒトＩＬ−２６抗体を安定して産生する９０クローンを得た（データ未掲載）。次に、ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いて上記９０クローンのＩＬ−２６の中和活性評価を行い、部分的にＩＬ−２６の活性を阻害できる７クローンを得た（データ未掲載）。その中でも、組み合わせることでＩＬ−２６の活性を相加的に阻害できる４クローン（クローン２−２，２０−３，３１−４，６９−１０）を見出した。
そこで、それら４クローンの培養上清からＩｇＧ画分を精製し、ヒトＩＬ−２６に対する結合性をＥＬＩＳＡで検討した。図１Ａに示すように、本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体では、プレートに固相化したＩＬ−２６濃度依存的な吸光値の上昇が見られた。なかでも、クローン２０−３とクローン６９−１０は、ＥＬＩＳＡにおいてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体よりもＩＬ−２６に対する結合性が非常に高いことが示された。ＩＬ−２６はＩＬ−１０ ｆａｍｉｌｙに属するサイトカインであり、ヒトＩＬ−２６はヒトＩＬ−１０と２４．７％のアミノ酸相同性を示す（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（８）：３８８１−７．）。そこで、ヒトＩＬ−２６に特異的に結合することの確認として、ヒトＩＬ−１０に対する結合性をＥＬＩＳＡで検討した結果、すべての抗体でいずれの濃度でもＩＬ−１０に対する結合は認められないことが示された（図１Ｂ）。これらの結果から、樹立した４クローンはヒトＩＬ−２６に特異的なモノクローナル抗体であることが示された。
2. result
(1) Binding of Novel Monoclonal Antibody to IL-26 As described above, crude purified splenocytes of BALB / c mice immunized with recombinant human IL-26 and P3U1 myeloma cells were fused with polyethylene glycol and grown The culture supernatant containing mouse anti-human IL-26 antibody was recovered from the hybridoma and subjected to primary screening by ELISA. As a result, 90 clones stably producing anti-human IL-26 antibody were obtained (data not shown). Next, the above-mentioned 90 clones were evaluated for neutralization activity of IL-26 using COLO 205 cells, and 7 clones capable of partially inhibiting the activity of IL-26 were obtained (data not shown). Among them, 4 clones (clone 2-2, 20-3, 31-4, 69-10) capable of additively inhibiting the activity of IL-26 by combination were found.
Therefore, IgG fractions were purified from the culture supernatants of those 4 clones, and their binding to human IL-26 was examined by ELISA. As shown in FIG. 1A, in the mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody established by the present inventors and the mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody of R & D Systems, the IL-26 concentration dependent on the plate was dependent on the plate. An increase in absorbance was observed. Among them, clones 20-3 and 69-10 were shown to have much higher binding to IL-26 in ELISA than mouse anti-human IL-26 monoclonal antibody from R & D Systems. IL-26 is a cytokine belonging to the IL-10 family, and human IL-26 shows 24.7% amino acid homology with human IL-10 (J Virol. 2000; 74 (8): 3887-7.). . Therefore, as a result of examining binding to human IL-10 by ELISA as confirmation of specific binding to human IL-26, no binding to IL-10 is observed at any concentration with any of the antibodies. Shown (Figure 1 B). From these results, it was shown that the four established clones were monoclonal antibodies specific to human IL-26.
（２） 新規モノクローナル抗体のＣＯＬＯ ２０５細胞に対するＩＬ−２６の中和活性
次に、樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体の中和活性評価を行った。これまでに、ＩＬ−２６がヒト単球とＮＫ細胞の活性化やヒト好中球の細胞遊走、ケラチノサイトのＩＬ−８産生を顕著に促進することが報告されているが、本発明者らが検討したところ、血液提供者によってＩＬ−２６に対する応答が大きく異なる試験や、ＩＬ−２６で刺激をしても報告されているほど著明な変化が認められない試験が多かった（データ未掲載）。そのなかで、ＩＬ−２６によるヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ−１発現亢進に関しては、実験回ごとの結果の誤差が非常に小さく再現性が極めて高いうえ、簡便かつ２４時間の短期間で抗体の中和活性を評価でき、初代培養の血球細胞と比較して細胞株は細胞調製も容易であることから、多数のモノクローナル抗体の中和活性評価に適したスクリーニング系であることを見出した。
図２Ａに示すように、ＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ−１の発現は、ＩＬ−２６刺激によって増強し、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体クローン２−２，２０−３，３１−４，６９−１０はいずれも部分的にＩＣＡＭ−１の発現増強を阻害した（＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。一方で、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社のマウス抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体は、対照マウスＩｇＧ抗体と同様にＩＬ−２６刺激によるＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ−１発現増強を全く阻害しなかった（図２Ａ）。これまでに複数の論文で研究用の中和抗体として使用されているＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＩＬ−２６ポリクローナル抗体は、ＩＬ−２６の活性を完全に阻害した。
ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いた試験では、樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体はいずれも１クローンではＩＬ−２６の活性を完全には阻害できなかったため、樹立した４クローンの中で最も中和活性が強いクローン６９−１０と、その他の３クローンとを組み合わせることでＩＬ−２６の中和効果が増加するかを検討した。その結果、図２Ｂに示すように、ＩＬ−２６刺激によって増強するＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ−１の発現は、クローン６９−１０単独で部分的に阻害され、さらに６９−１０とクローン２−２，２０−３， ３１−４の２クローンを組み合わせることで、いずれの組み合わせでも阻害効果が有意に増加した（＊対応するクローン６９−１０単独添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、クローン６９−１０単独と比較して、２クローン組み合わせ、３クローン組み合わせ、４クローン組み合わせの効果を検討した結果、クローンを組み合わせるほどより阻害効果が増加することが示された（図２Ｃ）。抗体濃度を高用量の４０μｇ／ｍＬまで上げた場合でも、クローン６９−１０単独ではＩＬ−２６刺激によるＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ−１発現増強を完全には阻害できなかったが、樹立した４クローンの組み合わせによりほぼ完全に阻害できることが示された（図２Ｄ，２Ｅ）。
(2) Neutralizing activity of IL-26 against COLO 205 cells by novel monoclonal antibody Next, the neutralizing activity of the established novel anti-human IL-26 monoclonal antibody was evaluated. To date, it has been reported that IL-26 significantly promotes activation of human monocytes and NK cells, cell migration of human neutrophils, and IL-8 production of keratinocytes. As a result of examination, there were many tests in which the response to IL-26 was largely different depending on the blood donor, and in which no significant change was recognized as reported even when stimulated with IL-26 (data not shown) . Among them, with regard to the enhancement of ICAM-1 expression of the human colon cancer cell line COLO 205 by IL-26, the error in the result of each experiment is very small and the reproducibility is extremely high, and it is simple and short for 24 hours Since it is possible to evaluate the neutralizing activity of the antibody and the cell line is easier to prepare as compared with the blood cells in primary culture, it was found that it was a screening system suitable for evaluating the neutralizing activity of many monoclonal antibodies. The
As shown in FIG. 2A, the expression of ICAM-1 on the cell membrane of COLO 205 was enhanced by IL-26 stimulation, and we established a novel anti-human IL-26 monoclonal antibody clone 2-2, 20- All 3, 31-4 and 69-10 partially inhibited the enhancement of ICAM-1 expression (* p <0.01 relative to the corresponding control mouse IgG addition group). On the other hand, mouse anti-human IL-26 monoclonal antibodies from R & D Systems and Santa Cruz did not inhibit the IL-26-stimulated enhancement of ICAM-1 expression of COLO 205 as well as the control mouse IgG antibody (FIG. 2A). ). Goat anti-human IL-26 polyclonal antibody from R & D Systems, which has been used as a neutralizing antibody for research in several papers so far, completely inhibited the activity of IL-26.
In the test using COLO 205 cells, none of the established novel anti-human IL-26 monoclonal antibodies was able to completely inhibit the activity of IL-26 in one clone, so the most neutralizing activity among the four established clones. Was examined to see if the neutralization effect of IL-26 is increased by combining the strong clone 69-10 with the other three clones. As a result, as shown in FIG. 2B, expression of ICAM-1 in COLO 205 cells enhanced by IL-26 stimulation is partially inhibited by clone 69-10 alone, and 69-10 and clone 2-2, By combining two clones 20-3 and 31-4, the inhibitory effect was significantly increased in any combination (* p <0.01 with respect to the corresponding clone 69-10 alone addition group). Furthermore, as a result of examining the effects of the 2 clone combination, the 3 clone combination and the 4 clone combination as compared with the clone 69-10 alone, it was shown that the inhibitory effect increases more as the clones are combined (FIG. 2C). Even when the antibody concentration was raised to a high dose of 40 μg / mL, clone 69-10 alone was not able to completely inhibit IL-26 stimulation of ICAM-1 expression enhancement of COLO 205, but the combination of the established 4 clones Showed almost complete inhibition (Fig. 2D, 2E).
（３） 新規モノクローナル抗体のＨＵＶＥＣに対するＩＬ−２６の中和活性
本発明者らは、ＩＬ−２６の新たな機能として、血管内皮細胞の増殖及び管形成を顕著に亢進することを見出した。そこで、ＣＯＬＯ ２０５細胞での評価系に加え、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣを用いての新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体の中和活性評価を行った。図３Ａに示すように、ＩＬ−２６刺激によってＨＵＶＥＣの増殖は用量依存的に促進され、代表的な血管新生促進因子の一つであるＶＥＧＦと同程度であった（図３Ａ中、水色線・青色線・緑色線）。ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いた評価系において、１クローン単独でのＩＬ−２６の中和活性が最も強かったクローン６９−１０を添加することで、ＩＬ−２６刺激によって促進されるＨＵＶＥＣの増殖が顕著に抑制されることが示された（図３Ａ中、赤色線；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、樹立した４クローンの組み合わせにより、ＩＬ−２６の活性は完全に阻害されることが示された（図３Ａ中、オレンジ色線）。
さらにＩＬ−２６は、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦの存在下で基底膜抽出物中に播種した場合と同程度の明らかな管形成を誘導することを見出した（図３Ｂ−ｉ，３Ｂ−ｉｉ）。このＨＵＶＥＣの管形成においても、クローン６９−１０単独で顕著に抑制され、さらに４クローンの組み合わせではＩＬ−２６の阻害効果がより増加することが示された（図３Ｂ−ｉｉｉ，３Ｂ−ｉｖ；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。
このことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＬＯ ２０５細胞とＨＵＶＥＣを用いたモノクローナル抗体のＩＬ−２６中和活性評価試験において、クローン６９−１０単独でもＩＬ−２６の中和効果は認められ、さらに４クローンを組み合わせることでほぼ完全にＩＬ−２６の活性を阻害できることが示された。
(3) Neutralizing activity of IL-26 against HUVEC by novel monoclonal antibody The inventors of the present invention have found that the growth and tube formation of vascular endothelial cells are significantly enhanced as a novel function of IL-26. Therefore, in addition to the evaluation system in COLO 205 cells, the neutralizing activity of a novel anti-human IL-26 monoclonal antibody was evaluated using human umbilical vein endothelial cells HUVEC. As shown in FIG. 3A, the proliferation of HUVEC was promoted in a dose-dependent manner by IL-26 stimulation, and was comparable to that of VEGF, which is a representative pro-angiogenic factor (in FIG. Blue and green lines). In the evaluation system using COLO 205 cells, the addition of clone 69-10 in which the neutralization activity of IL-26 was the strongest in one clone alone significantly enhanced the proliferation of HUVEC promoted by IL-26 stimulation. It was shown to be suppressed (red line in FIG. 3A; * p <0.01 for the corresponding control mouse IgG added group). Furthermore, it was shown that the combination of four established clones completely inhibited the activity of IL-26 (orange line in FIG. 3A).
Furthermore, it was found that IL-26 induces as well as clear tube formation when HUVECs were seeded in basement membrane extract in the presence of VEGF (FIG. 3B-i, 3B-ii). Also in this tube formation of HUVECs, clone 69-10 alone was significantly suppressed, and the combination of 4 clones was shown to further increase the inhibitory effect of IL-26 (FIG. 3B-iii, 3B-iv; * P <0.01 for the corresponding control mouse IgG addition group.
From this, in the in vitro IL-26 neutralizing activity evaluation test of the monoclonal antibody using COLO 205 cells and HUVEC, even with clone 69-10 alone, the neutralizing effect of IL-26 was observed, and four more clones were It was shown that the combination can almost completely inhibit the activity of IL-26.
（４） イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規モノクローナル抗体の治療効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性評価試験により、中和活性を示す新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体を得ることができたため、これらの抗体を用いて難治性免疫異常症及びがんに対する動物実験での治療効果を検討した。ＩＬ−２６はその機能や標的細胞、産生細胞などまだ解明されていない点が多い新規炎症性サイトカインだが、炎症性腸疾患や関節リウマチ、慢性ＧＶＨＤや乾癬、多発性硬化症などの病態への関与が示唆されている。
イミキモドはマウスではトール様受容体７の、ヒトではトール様受容体７と８の強力なアゴニストとして作用し、尖圭コンジローマや日光角化症、表在型基底細胞がんの治療薬として臨床で使われている。イミキモド服用の副作用として、乾癬様の皮膚炎症が報告されており、ヒト乾癬を研究するためのイミキモド誘導性乾癬様マウスモデルが確立された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２（９）：５８３６−４５．）。イミキモドを塗布したマウスの皮膚は、表皮肥厚、不全角化、乳頭腫症、炎症性細胞浸潤、皮膚の血管増生など多くの乾癬患者の皮膚の特徴を示す。そのため、このイミキモド含有クリームをマウスの皮膚に塗布するモデルは、初期の乾癬病態を研究するための、迅速かつ簡便で費用も効率的なモデルとして、現在、世界中で広く用いられている（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８（１）：４６２−９．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２（９）：４３６１−９．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（１１）：５０９４−１０２．；Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１１７２４．）。ＩＬ−２６はマウスやラット等の齧歯類では欠損しているため、ヒトＩＬ−２６遺伝子を含むバクテリア人工染色体遺伝子導入（ｈＩＬ−２６Ｔｇ）マウスと、ＩＬ−２６を発現しない対照遺伝子導入（ΔＣＮＳ−７７ Ｔｇ）マウスを用いて、イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるＩＬ−２６の役割と、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体の治療効果を検討した。
図４Ａに示すように、ｈＩＬ−２６ＴｇマウスではΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスと比較して、イミキモドクリームの塗布を開始して２日目から皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚が見られ、３日目以降でいずれの症状も顕著に悪化することが示された。このｈＩＬ−２６Ｔｇマウスに、モノクローナル抗体６９−１０を単独で、または新規モノクローナル抗体４クローンを組み合わせで投与すると、対照マウスＩｇＧ投与群と比較して、乾癬様皮膚症状の進行が顕著に抑制された。ＰＡＳＩスコアによって背中の皮膚の炎症の重症度を評価した結果、ｈＩＬ−２６ＴｇマウスはΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスと比較して、皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚のいずれも悪化が見られるが（図４Ｂ中、青色線・赤色線）、モノクローナル抗体抗体６９−１０を単独で投与した群、ならびに４クローンを組み合わせて投与した群では、ＩＬ−２６を発現しないΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスと同程度まで、皮膚症状の顕著な改善が認められた（図４Ｂ中、ピンク色線・オレンジ色線）。そこで次に、イミキモドクリームを塗布したΔＣＮＳ−７７ ＴｇマウスとｈＩＬ−２６Ｔｇマウス、さらにモノクローナル抗体６９−１０を単独で投与した群、ならびに４クローンを組み合わせて投与した群の背中の皮膚を採取して、病理学的解析を行った。図４Ｃに示すように、ΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスと比較してｈＩＬ−２６Ｔｇマウスでは、顕著な炎症性細胞の浸潤と血管浸潤、表皮層の肥厚が観察され、モノクローナル抗体６９−１０の単独投与群、ならびに４クローン組み合わせ投与群は、ΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスの皮膚と同等のレベルであった。炎症性細胞浸潤と血管増生をより詳細に検討するため、好中球マーカーのＬｙ６ｇと内皮細胞マーカーのＣＤ３１とで皮膚組織の免疫蛍光染色を行った。図４Ｄ，４Ｅに示すように、ΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスと比較してｈＩＬ−２６Ｔｇマウスでは、Ｌｙ６ｇ陽性の好中球ならびにＣＤ３１陽性の血管の著明な増加が観察され、新規抗ヒトＩＬ−２６中和抗体投与群ではΔＣＮＳ−７７ Ｔｇマウスと同等のレベルまで抑制されていた。背中の皮膚を採取して、皮下の血管形成を観察した場合においても、同様の結果が認められた（図４Ｆ）。
これらの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでのイミキモド誘導性乾癬モデルにおいて血管新生および好中球浸潤を抑制し、乾癬様皮膚症状の進行を顕著に抑制することが示された。イミキモド誘導性乾癬モデルでは、クローン６９−１０単独でも新規モノクローナル抗体４クローンの組み合わせと同程度の優れた治療効果を示した。
(4) Therapeutic effect of novel monoclonal antibodies in imiquimod-induced psoriasis model In vitro neutralization activity evaluation test was able to obtain novel anti-human IL-26 monoclonal antibodies exhibiting neutralizing activity. We examined the therapeutic effect in intractable immune disorders and animal experiments with cancer. Although IL-26 is a novel inflammatory cytokine whose function, target cells, and production cells have not been clarified in many aspects yet, it has been implicated in pathological conditions such as inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, chronic GVHD, psoriasis, and multiple sclerosis. Is suggested.
Imiquimod acts as a potent agonist of toll-like receptor 7 in mice and toll-like receptors 7 and 8 in humans, and is clinically used as a treatment for conjunctivitis of the eyelid, actinic keratosis and superficial basal cell carcinoma It is used. Psoriasis-like skin inflammation has been reported as a side effect of taking imiquimod, and an imiquimod-induced psoriasis-like mouse model has been established to study human psoriasis (J Immunol. 2009; 182 (9): 5836-45. ). The skin of imiquimod-coated mice exhibits skin characteristics of many psoriatic patients, such as epidermal hypertrophy, parakeratosis, papillomatosis, inflammatory cell infiltration, and vascularization of the skin. Therefore, a model for applying this imiquimod-containing cream to the skin of mice is currently widely used all over the world as a rapid, simple, cost-effective model for studying the early pathogenesis of psoriasis (J Immunol. 2012; 188 (1): 462-9 .; J Immunol 2014; 192 (9): 4361-9 .; J Immunol. 2015; 194 (11): 5094-102 .; Nat Commun. 11724.). Since IL-26 is deleted in rodents such as mice and rats, bacterial artificial chromosome gene transfer (hIL-26Tg) mice containing human IL-26 gene and control gene transfer (ΔCNS that does not express IL-26) -77 Tg) The mouse was used to examine the role of IL-26 in the imiquimod-induced psoriasis model and the therapeutic effect of the novel anti-human IL-26 monoclonal antibody established by the present inventors.
As shown in FIG. 4A, compared with ΔCNS-77 Tg mice, hIL-26 Tg mice show erythema, scale and thickening of the skin from the second day after the start of application of imiquimod cream, and from the third day onwards Both symptoms were shown to be significantly worse. Administration of monoclonal antibody 69-10 alone or in combination with a novel monoclonal antibody 4 clone to this hIL-26 Tg mouse significantly suppressed the progression of psoriasis-like skin symptoms as compared to the control mouse IgG administration group . As a result of evaluating the severity of inflammation of the back skin by PASI score, hIL-26Tg mice show deterioration in all of skin erythema, scaling and thickening compared with ΔCNS-77 Tg mice (Fig. 4B in). , Blue line / red line), group to which monoclonal antibody 69-10 was administered alone, and group to which 4 clones were administered in combination, skin symptoms to the same extent as ΔCNS-77 Tg mice not expressing IL-26 The remarkable improvement of was observed (pink line / orange line in FIG. 4B). Therefore, next, the skin of the back of the group to which the ΔCNS-77 Tg mouse and the hIL-26 Tg mouse coated with imiquimod cream alone, and the group to which the monoclonal antibody 69-10 alone was administered alone, and the group to which 4 clones were administered in combination were collected , Pathological analysis was performed. As shown in FIG. 4C, significant inflammatory cell infiltration, vascular infiltration, and thickening of the epidermal layer were observed in hIL-26Tg mice as compared to ΔCNS-77 Tg mice, and monoclonal antibody 69-10 was administered alone. , And the 4-clonal combination administration group were at the same level as the skin of ΔCNS-77 Tg mice. In order to examine inflammatory cell infiltration and vascular hypertrophy in more detail, immunofluorescent staining of skin tissue was performed with a neutrophil marker Ly6g and an endothelial cell marker CD31. As shown in FIGS. 4D and 4E, significant increases in Ly6g positive neutrophils and CD31 positive blood vessels were observed in hIL-26 Tg mice compared to ΔCNS-77 Tg mice, and a novel anti-human IL-26 The neutralizing antibody administration group was suppressed to the level equivalent to that of ΔCNS-77 Tg mice. Similar results were observed when the skin on the back was collected and subcutaneous angiogenesis was observed (FIG. 4F).
From these results, the novel anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody established by the present inventors suppresses angiogenesis and neutrophil infiltration in an imiquimod-induced psoriasis model in vivo, and causes psoriasis-like skin conditions. It was shown to significantly suppress the progression. In the imiquimod-induced psoriasis model, clone 69-10 alone showed the same excellent therapeutic effect as the combination of 4 novel monoclonal antibodies.
（５） 異種慢性ＧＶＨＤモデルにおける新規モノクローナル抗体の治療効果
本発明者らは、重度の免疫不全マウスであるＮＯＧマウスに亜致死量の放射線を照射した後、含まれるＴ細胞のほとんどが抗原感作されていないナイーブであるヒト臍帯血単核球を移植する異種慢性ＧＶＨＤモデルを確立し、ＩＬ−２６が線維芽細胞のコラーゲン産生を増強させ、肺の線維化に極めて重要であることを明らかにした（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（８）：３６９７−７１２．）。そこで同モデルを用いて、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６モノクローナル抗体６９−１０を、被毛の乱れや体重減少など軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植２８日目から投与開始し、慢性ＧＶＨＤに対する治療効果を検討した。
図５Ａ、図５Ｂに示すように、対照マウスＩｇＧ投与群では移植４週目から体重減少が始まり、５週から９週にかけて全てのマウスが死亡した（青色線）。一方で、ＩＬ−２６中和抗体６９−１０投与群では、体重減少が明白に軽減し、生存日数の著明な延長が見られた（図５ＡＢ中、オレンジ色線）。レシピエント（マウス）体内のドナー（ヒト）リンパ球の生着を解析した結果、ＩＬ−２６抗体投与群でも対照マウスＩｇＧ投与群と同程度の生着が認められた（図５Ｃ中、青色線・オレンジ色線）。また、生着したヒトＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の比率に関しても、対照マウスＩｇＧ投与群とＩＬ−２６抗体投与群で大きな違いは見られなかった（データ未掲載）。このことから、ＩＬ−２６抗体投与による著明な生存日数の延長や体重減少の軽減は、ドナーリンパ球の生着を阻害したことによるものではないことが示された。
次に、ＧＶＨＤ標的器官の組織病理学的評価を行った。図５Ｄに示すように、ヒト臍帯血造血幹細胞のみを移植したＧＶＨＤ非発症群と比較して、臍帯血単核球移植後に対照マウスＩｇＧを投与した群では、移植８週目には脱毛や皮膚萎縮、背骨の歪曲、運動量の低下などが外観で観察され、皮膚組織学では炎症性細胞浸潤、表皮層の肥厚、皮膚萎縮、脂肪減少および毛嚢脱落を示し、肺では上皮下線維組織の拡大と気管支周囲の炎症性細胞浸潤、細気管支の閉塞が認められ、肝臓では胆管を取り囲む組織において炎症性細胞による脈管周囲浸潤が観察された。急性ＧＶＨＤの主な標的器官の一つである腸管（小腸および結腸）は、本モデルでは顕著な病変所見は見られなかった（データ未掲載）。一方で、ＩＬ−２６モノクローナル抗体６９−１０を投与した群では、外観でも被毛の乱れが軽度に抑えられ、細気管支、脈管および胆管周囲の炎症性細胞浸潤も明白に減少しており、ＧＶＨＤ非発症群に近いレベルであることが示された（図５Ｄ）。
これらの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体は、慢性ＧＶＨＤ発症初期の新規治療アプローチとしても有用であることが示唆された。
(5) Therapeutic effect of novel monoclonal antibodies in heterologous chronic GVHD model We irradiated sublethal doses of NOG mice, which are severe immunodeficient mice, and then most of the T cells contained were antigen-sensitized. We established a xenogeneic chronic GVHD model for transplanting unabated naive human umbilical cord blood mononuclear cells and revealed that IL-26 enhances fibroblast collagen production and is extremely important for lung fibrosis (J Immunol. 2015; 194 (8): 3697-712.). Therefore, using the same model, a new anti-human IL-26 monoclonal antibody 69-10 established by the present inventors was used to demonstrate clinical signs / symptoms of mild GVHD such as hair disorder and weight loss. Dosing was started on the day, and the therapeutic effect on chronic GVHD was examined.
As shown in FIGS. 5A and 5B, in the control mouse IgG administration group, weight loss began at 4 weeks of transplantation, and all mice died from 5 weeks to 9 weeks (blue line). On the other hand, in the IL-26 neutralizing antibody 69-10 administration group, the weight loss was clearly reduced and a remarkable prolongation of the survival days was observed (orange line in FIG. 5 AB). As a result of analysis of engraftment of donor (human) lymphocytes in the recipient (mouse) body, engraftment similar to that of the control mouse IgG administration group was observed in the IL-26 antibody administration group as well (blue line in FIG. 5C).・ Orange line). Also, regarding the ratio of engrafted human CD4 T cells to CD8 T cells, no significant difference was observed between the control mouse IgG administration group and the IL-26 antibody administration group (data not shown). From this, it was shown that the significant prolongation of the survival day and the reduction of the body weight loss by the administration of the IL-26 antibody were not due to the inhibition of the engraftment of donor lymphocytes.
Next, histopathological evaluation of GVHD target organs was performed. As shown in FIG. 5D, in the group receiving control mouse IgG after cord blood mononuclear cell transplantation, hair loss or skin was observed at 8 weeks of transplantation compared with the non-GVHD-incidence group transplanted with only human umbilical cord blood hematopoietic stem cells. Atrophy, spine distortion, loss of physical activity, etc. are observed in appearance. In skin histology, inflammatory cell infiltration, epidermal layer thickening, skin atrophy, fat loss and hair follicle loss are shown, and in the lungs, subepithelial fibrous tissue is enlarged Inflammatory cell infiltration around the bronchus and obstruction of bronchioles were observed, and perivascular infiltration by inflammatory cells was observed in the tissue surrounding the bile duct in the liver. The intestinal tract (small intestine and colon), which is one of the main target organs of acute GVHD, showed no significant lesion findings in this model (data not shown). On the other hand, in the group to which the IL-26 monoclonal antibody 69-10 was administered, the appearance of hair disorder was mildly suppressed and the inflammatory cell infiltration around bronchioles, vessels and bile ducts was also clearly reduced. It was shown that the level was close to the GVHD non-occurrence group (FIG. 5D).
From these results, it was suggested that the novel anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody established by the present inventors is also useful as a novel therapeutic approach in the early onset of chronic GVHD.
（６） 新規モノクローナル抗体によるＧＶＨＤ治療処置はレシピエントのＧＶＴ能力を損なわない
ＧＶＨＤとＧＶＴ効果は高度に関連する免疫反応であるため（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１５（１４）：４５１５−１７．）、ＩＬ−２６中和抗体によるＧＶＨＤ治療処置がレシピエントのＧＶＴ効果に与える潜在的影響を解析した。前述の慢性ＧＶＨＤモデルと同様に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施し、翌日にヒト臍帯血単核球を移植した。ドナー（ヒト）リンパ球がレシピエント体内に十分に生着し、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目に、レシピエントマウスと同じ遺伝的背景（Ｈ−２d）のマウスリンパ腫細胞にルシフェラーゼをトランスフェクトしたＡ２０−ｌｕｃ細胞を尾静脈から播種し、その翌日＋２９日目から対照マウスＩｇＧ、またはＩＬ−２６抗体投与を行った。図６Ａ、図６Ｂに示すように、ヒト臍帯血単核球移植をせずにＡ２０−ｌｕｃ細胞だけを播種した、ドナーＴ細胞によるＧＶＴ効果が得られないマウスは、腫瘍が非常に強い勢いで増殖し、腫瘍播種後３週間以内に全て死亡した。一方で、ヒト臍帯血単核球を移植して対照マウスＩｇＧを投与したマウスは、Ａ２０−ｌｕｃ細胞だけを播種したマウスと比較して、腫瘍の増殖が顕著に抑制されていたが（図６Ａ中、青色線）、日数の経過にともない体重減少や被毛の乱れなどのＧＶＨＤ症状の進行が見られた（図６Ｂ）。これに対し、ＩＬ−２６モノクローナル抗体６９−１０を投与したマウスでは、対照マウスＩｇＧ投与群と同程度のレベルで腫瘍の増殖が抑えられていると同時に、ＧＶＨＤ症状もほとんど見られなかった（図６Ａ中、オレンジ色線・図６Ｂ）。
これまでの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ−２６中和モノクローナル抗体は、慢性ＧＶＨＤにおける肺の線維化やＧＶＨＤ標的器官への炎症性細胞浸潤を顕著に抑制し、ＧＶＨＤ症状の進行の制御に有用であると同時に、移植の恩恵であるドナーリンパ球によるＧＶＴ効果も保持されていることが示された。
(6) GVHD therapeutic treatment with novel monoclonal antibodies does not impair the GVT ability of the recipient GVHD and GVT effects are highly related immune responses (Clin Cancer Res. 2009; 15 (14): 4515-17.) The potential impact of GVHD therapeutic treatment with IL-26 neutralizing antibodies on the GVT effect of recipients was analyzed. Similar to the chronic GVHD model described above, NOG mice were given a sublethal dose (200 cGy) and transplanted with human umbilical cord blood mononuclear cells the following day. The same genetic background (H-2 d ) as recipient mice on the day of transplantation + 28 days when donor (human) lymphocytes fully engrafted in the recipient body and clinical signs / symptoms of mild GVHD began to be seen The mouse lymphoma cells were seeded with luciferase-transfected A20-luc cells from the tail vein, and the following day +29, control mouse IgG or IL-26 antibody was administered. As shown in FIG. 6A and FIG. 6B, in mice that did not obtain GVT effect by donor T cells, in which only A20-luc cells were seeded without human cord blood mononuclear cell transplantation, the tumor was very powerful. It grew and all died within 3 weeks after tumor dissemination. On the other hand, in mice treated with human umbilical cord blood mononuclear cells and administered with control mouse IgG, tumor growth was significantly suppressed compared to mice inoculated only with A20-luc cells (FIG. 6A). Progression of GVHD symptoms such as weight loss and hair disorder was observed with the passage of days, blue lines, and days (FIG. 6B). On the other hand, in mice treated with the IL-26 monoclonal antibody 69-10, while the growth of the tumor was suppressed to the same level as the control mouse IgG administration group, GVHD symptoms were hardly observed (Fig. In 6A, orange line, Fig. 6B).
From the results so far, the novel anti-human IL-26 neutralizing monoclonal antibody established by the present inventors significantly suppresses lung fibrosis in chronic GVHD and inflammatory cell infiltration into target organs of GVHD, and causes GVHD symptoms. It has been shown that the GVT effect by donor lymphocytes, which is a benefit of transplantation, is also maintained while being useful for controlling the progression of
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016069314A (en) * | 2014-09-29 | 2016-05-09 | 学校法人順天堂 | Immunosuppressant |
| WO2017009392A1 (en) * | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) | Il-26 inhibitors |
| WO2017091512A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-06-01 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for engineering immunity |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016069314A (en) * | 2014-09-29 | 2016-05-09 | 学校法人順天堂 | Immunosuppressant |
| WO2017009392A1 (en) * | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) | Il-26 inhibitors |
| WO2017091512A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-06-01 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for engineering immunity |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| PLOS BIOLOGY, vol. Vol.10, No.9, e1001395, JPN6021038736, 2012, pages 1 - 15, ISSN: 0004607056 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 279, no. 32, JPN6021038733, 2004, pages 33343 - 33351, ISSN: 0004607057 * |
| 臨床血液, vol. 56, no. 9, JPN6021038737, 2015, pages 1408 - 292, ISSN: 0004607055 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021251340A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | ワイズ・エー・シー株式会社 | Agent for reversing resistance to anticancer drugs |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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