JP2019088279A - Cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells, method for producing the same, and pharmaceutical composition - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
Description
本発明は、血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団に関する。本発明はさらに、血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法、並びに前記細胞集団を含む医薬組成物に関する。 The present invention relates to cell populations comprising vascular endothelial (progenitor) cells. The invention further relates to methods of producing cell populations comprising vascular endothelial (progenitor) cells, as well as pharmaceutical compositions comprising said cell populations.
移植治療等において血管内皮（前駆）細胞を併用すると治療効果を増進できることが期待できることから、ヒト由来血管内皮（前駆）細胞は、再生医療における治療ツールとして期待されている。ヒト由来血管内皮（前駆）細胞を臍帯静脈又は大血管から回収する方法としては、血管内腔に細胞分散用酵素液を満たし、血管内皮（前駆）細胞を回収し播種することで、容易に血管内皮（前駆）細胞を回収、純化及び培養することが可能であり、その方法は確立している。しかし、血管を、再生医療の細胞源として採取することは難しいことから、臍帯静脈又は大血管から回収した血管内皮（前駆）細胞は、基礎研究のみで利用されており、治療ツールとしては利用されていない。 Human-derived vascular endothelial (precursor) cells are expected as therapeutic tools in regenerative medicine because it can be expected that the therapeutic effect can be enhanced if vascular endothelial (precursor) cells are used in combination in transplantation treatment and the like. As a method of recovering human-derived vascular endothelial (precursor) cells from umbilical vein or large blood vessels, the lumen of the blood vessel is filled with an enzyme solution for cell dispersion, and the vascular endothelial (progenitor) cells are recovered and disseminated easily. It is possible to recover, purify and culture endothelial (progenitor) cells, and the method is established. However, because it is difficult to collect blood vessels as a cell source for regenerative medicine, vascular endothelial (progenitor) cells collected from umbilical vein or large blood vessels are used only in basic research and are used as a therapeutic tool. Not.
一方、大量に存在し採取に伴う犠牲や侵襲が小さい皮下脂肪組織には、大量（脂肪組織１ｇあたり約１００万個）の血管内皮（前駆）細胞が存在するが、その単離及び純化は困難である。なぜなら、血管内皮（前駆）細胞は、脂肪幹細胞などの他の細胞との混合物（間質血管細胞群、以下SVF（Stromal Vascular Fraction)）として分離・回収され、その後の培養過程において、血管内皮（前駆）細胞は、脂肪幹細胞により駆逐されてしまうためである。 On the other hand, a large amount (approximately 1 million cells / g of adipose tissue) of a large amount of subcutaneous adipose tissue with a small amount of sacrifice or invasiveness associated with the collection has a large amount of vascular endothelial (progenitor) cells, but its isolation and purification are difficult It is. Because, vascular endothelial (progenitor) cells are separated and collected as a mixture with other cells such as adipose stem cells (interstitial vascular cell group, hereinafter SVF (Stromal Vascular Fraction)), and in the subsequent culture process, Progenitor cells are destroyed by adipose stem cells.
特許文献１には、脂肪組織から内皮細胞を調製する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法は、脂肪吸引処置患者から得られた脂肪組織を洗浄する工程；洗浄された脂肪組織から細胞を回収する工程；精製されたコラゲナーゼ調製物で細胞を酵素的に処理する工程であって、該調製物はペプシン、トリプシン、およびサーモリシンを欠失している工程；ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４４、およびＣＤ１４６からなる第一の群より選択される抗原、またはＣＤ１４、ＣＤ４５、およびＦ１９からなる第二の群より選択される抗原に特異的な第一の抗体を含む磁気ビーズと接触させることにより、処理された細胞を選別する工程；もし抗体が第一の群の抗原に特異的であれば、該磁気ビーズに結合している細胞を回収し、もし抗体が第二の群に特異的であれば、該磁気ビーズに結合していない細胞を回収する工程を含む方法である。 Patent Document 1 describes a method of preparing endothelial cells from adipose tissue. The method described in Patent Document 1 comprises the steps of washing adipose tissue obtained from a liposuction treated patient; recovering cells from the washed adipose tissue; enzymatically treating the cells with a purified collagenase preparation The process wherein the preparation lacks pepsin, trypsin and thermolysin; an antigen selected from the first group consisting of CD31, CD34, CD144 and CD146, or CD14, CD45 and F19. Sorting the treated cells by contacting with magnetic beads comprising a first antibody specific for an antigen selected from the second group consisting of: if the antibody is specific for the first group of antigens Recovering the cells bound to the magnetic beads, and recovering the cells not bound to the magnetic beads if the antibody is specific to the second group The method comprising.
上記の通り、脂肪組織から血管内皮（前駆）細胞を製造することは、脂肪幹細胞などの他の細胞が混入することにより血管内皮（前駆）細胞が駆逐されてしまうという問題があった。特許文献１に記載の方法においては、ＣＤ３１マイクロビーズによる正の選択を用いて細胞を精製しているが、濃縮後の内皮（前駆）細胞比率は１７．２％〜８６．７％であり（特許文献１の段落００３１の表１を参照）、内皮細胞の純度は十分とは言えない。 As described above, production of vascular endothelial (precursor) cells from adipose tissue has a problem that vascular endothelial (progenitor) cells are destroyed by contamination with other cells such as adipose stem cells. In the method described in Patent Document 1, although the cells are purified using positive selection with CD31 microbeads, the percentage of endothelial (progenitor) cells after concentration is 17.2% to 86.7% ( See Table 1 in paragraph 0031 of Patent Document 1), the purity of endothelial cells is not sufficient.
本発明は、脂肪組織から製造される血管内皮（前駆）細胞の含有率が高い細胞集団、並びに血管内皮（前駆）細胞の含有率が高い細胞集団を脂肪組織から製造するための方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記した細胞集団を含む医薬組成物を提供することを解決すべき課題とした。 The present invention provides a cell population having a high content of vascular endothelial (progenitor) cells produced from adipose tissue, and a method for producing a cell population having a high content of vascular endothelial (progenitor) cells from adipose tissue. It was an issue to be solved. Furthermore, this invention made it the issue which should be solved to provide the pharmaceutical composition containing the cell population mentioned above.
吸引及び破砕した脂肪組織から酵素処理を通して分散・採取される細胞集団には、血管内皮（前駆）細胞の他に脂肪幹細胞、線維芽細胞等の他の細胞が多く含まれており、血管内皮（前駆）細胞の割合は１〜数％程度である。このような細胞集団の中から血管内皮（前駆）細胞のみを単離するために、本発明者らは２種類の表面抗原（ＣＤ４５及びＣＤ３１）の発現に注目して、磁気ビーズを用いたフローサイトメトリーを行うことにより、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得した。その後、得られた細胞集団を一定期間だけ培養した後に、ＣＤ３１陽性細胞を、磁気ビーズを用いたフローサイトメトリーで回収することを試みた。その結果、上記の方法を用いることで、血管内皮（前駆）細胞の含有率が９２％以上である細胞集団を取得することが可能であることが見いだされた。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。 The cell population dispersed and collected from the aspirated and crushed adipose tissue through enzyme treatment contains a large number of other cells such as adipose stem cells and fibroblasts in addition to vascular endothelial (progenitor) cells. The proportion of precursor) cells is about 1 to several percent. In order to isolate only vascular endothelial (precursor) cells from such a cell population, the present inventors focused on the expression of two surface antigens (CD45 and CD31), and flow using magnetic beads. By performing cytometry, a cell population containing CD45 negative and CD31 positive cells was obtained. Thereafter, after culturing the obtained cell population for a certain period, CD31 positive cells were tried to be collected by flow cytometry using magnetic beads. As a result, it was found that by using the above method, it is possible to obtain a cell population in which the content of vascular endothelial (progenitor) cells is 92% or more. The present invention has been completed based on these findings.
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団におけるＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の血管内皮（前駆）細胞の割合が９２％以上であり、前記細胞集団における脂肪幹細胞の割合が８％以下である、細胞集団。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
<1> A cell population comprising vascular endothelial (precursor) cells and adipose stem cells, wherein the percentage of CD45 negative and CD31 positive vascular endothelial (precursor) cells in the cell population is 92% or more, and fat in the cell population A cell population in which the percentage of stem cells is 8% or less.
＜２＞ （１）脂肪組織を酵素で処理して、少なくとも血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団を取得する工程；
（２）前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
（３）前記（２）の工程で得たＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を１時間〜７．０日間培養する工程；及び
（４）前記（３）の工程で得た細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
を含む、血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法。
≪ 2 > (1) A step of processing a fatty tissue with an enzyme to obtain a cell population comprising at least vascular endothelial (progenitor) cells and adipose stem cells;
(2) obtaining a cell population containing CD31 positive cells by sorting out CD31 positive cells from the cell population obtained in the step (1);
(3) culturing the cell population containing the CD31 positive cells obtained in the step of (2) for 1 hour to 7.0 days; and (4) CD31 positive from the cell population obtained in the step of (3) above Obtaining a cell population containing CD31 positive cells by sorting out the cells of
A method of producing a cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells, comprising
＜３＞ 前記の（２）の工程が、前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程であり、前記の（３）の工程が、前記（２）の工程で得たＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を２．０〜６．０日間（又は３．０〜６．０日間）培養する工程である、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記の（１）の工程と前記の（２）の工程との間に、前記（１）の工程で取得した細胞集団を１．０時間〜５．０日間（１．０〜４．０日間でもよい）培養する工程を含む、＜２＞に記載の方法。
＜５＞ 血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団が、血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団であって、前記細胞集団における血管内皮（前駆）細胞の割合が９２％以上であり、前記細胞集団における脂肪幹細胞の割合が８％以下である、細胞集団である、＜２＞〜＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 前記（１）の工程において、酵素がコラゲナーゼである、＜２＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞ 前記（１）の工程における酵素処理の際のコラゲナーゼ濃度が０．０２％〜０．５％である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞ 前記（１）の工程における酵素処理に使用する酵素処理液が、ＤＮａｓｅＩをさらに含む、＜６＞又は＜７＞に記載の方法。
＜９＞ 前記（１）の工程における酵素処理に使用する酵素処理液が、ポロキサマー及びプロナーゼを含有しない、＜６＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
<3> The step of (2) above obtains a cell population containing CD45 negative and CD31 positive cells by selecting CD45 negative and CD31 positive cells from the cell population obtained in the step (1). The step (3) is performed for 2.0 to 6.0 days (or 3.0 to 6 days) a cell population containing CD45 negative and CD31 positive cells obtained in the step (2). The method according to <2>, which is a step of culturing for 0 days.
<4> Between the step of (1) and the step of (2), the cell population obtained in the step of (1) is 1.0 hour to 5.0 days (1.0 to 4 days) The method according to <2>, which comprises the step of culturing for 0 days.
<5> A cell population comprising vascular endothelial (precursor) cells is a cell population comprising vascular endothelial (precursor) cells and adipose stem cells, wherein the percentage of vascular endothelial (precursor) cells in the cell population is 92% or more The method according to any one of <2> to <4>, which is a cell population, wherein the percentage of adipose stem cells in the cell population is 8% or less.
<6> The method according to any one of <2> to <5>, wherein in the step (1), the enzyme is collagenase.
<7> The method according to <6>, wherein the collagenase concentration in the enzyme treatment in the step (1) is 0.02% to 0.5%.
<8> The method according to <6> or <7>, wherein the enzyme treatment liquid used for the enzyme treatment in the step (1) further comprises DNase I.
<9> The method according to any one of <6> to <8>, wherein the enzyme treatment solution used for the enzyme treatment in the step (1) does not contain poloxamer and pronase.
＜１０＞ 前記（２）の工程において、抗ＣＤ４５抗体で標識した磁気ビーズと、抗ＣＤ３１抗体で標識した磁気ビーズとを用いて、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を選別する、＜２＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ 前記（４）の工程において、抗ＣＤ３１抗体で標識した磁気ビーズを用いて、ＣＤ３１陽性の細胞を選別する、＜２＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法。
＜１２＞ 前記（４）の工程において選別されたＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、＜２＞から＜１１＞の何れか一に記載の方法。
＜１３＞ ＜１＞に記載の細胞集団、又は＜２＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法により製造される細胞集団を含む、医薬組成物。
<10> In the step of (2) above, CD45-negative and CD31-positive cells are sorted using <2> using magnetic beads labeled with anti-CD45 antibody and magnetic beads labeled with anti-CD31 antibody. The method according to any one of 9>.
<11> The method according to any one of <2> to <10>, wherein in the step (4), CD31-positive cells are sorted using magnetic beads labeled with an anti-CD31 antibody.
<12> The method according to any one of <2> to <11>, further comprising the step of culturing a cell population containing CD31 positive cells sorted in the step (4).
<13> A pharmaceutical composition comprising the cell population according to <1>, or the cell population produced by the method according to any one of <2> to <12>.
［１４］ 医薬組成物の製造のための、＜１＞に記載の細胞集団、又は＜２＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法により製造される細胞集団の使用。
［１５］ 疾患の治療において使用するための、＜１＞に記載の細胞集団、又は＜２＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法により製造される細胞集団。
［１６］ ＜１＞に記載の細胞集団、又は＜２＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法により製造される細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
[14] Use of the cell population according to <1>, or the cell population produced by the method according to any one of <2> to <12>, for the production of a pharmaceutical composition.
[15] A cell population according to <1>, or a cell population produced by the method according to any one of <2> to <12>, for use in the treatment of a disease.
[16] A disease comprising administering the cell population according to <1> or the cell population produced by the method according to any one of <2> to <12> to a patient in need of treatment Treatment method.
本発明によれば、皮下脂肪組織から、血管内皮（前駆）細胞の含有率が高い細胞集団を製造することができる。本発明の細胞集団は、血管内皮（前駆）細胞の含有率が高いことから、培養した場合に他の細胞により血管内皮（前駆）細胞が駆逐されることがなく、血管内皮（前駆）細胞を安定的に大量に培養することができる。 According to the present invention, a cell population having a high content of vascular endothelial (progenitor) cells can be produced from subcutaneous adipose tissue. Since the cell population of the present invention has a high content rate of vascular endothelial (progenitor) cells, vascular endothelial (progenitor) cells are not destroyed by other cells when cultured, It can be stably cultured in large quantities.
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［１］血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団
本発明は、血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団であって、前記細胞集団におけるＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の血管内皮（前駆）細胞の割合が９２％以上であり、前記細胞集団における脂肪幹細胞の割合が８％以下である、細胞集団に関する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be specifically described.
[1] A cell population comprising vascular endothelial (precursor) cells and adipose stem cells The present invention relates to a cell population comprising vascular endothelial (precursor) cells and adipose stem cells, wherein the cell population is CD45 negative and CD31 positive in the cell population. The present invention relates to a cell population in which the percentage of endothelial (progenitor) cells is 92% or more and the percentage of adipose stem cells in the cell population is 8% or less.
血管内皮（前駆）細胞とは、血管の内表面を構成する細胞であり、血液の循環する内腔と接している細胞である。血管内皮（前駆）細胞とは、血管内皮細胞及び血管内皮前駆細胞とを包含する概念である。本発明における血管内皮（前駆）細胞は、脂肪組織に由来する血管内皮（前駆）細胞であり、***増殖する能力を保持している。血管内皮（前駆）細胞は、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性を指標として同定することができ、ＣＤ１４６陽性およびＣＤ１４４陽性としても同定することができる。 Vascular endothelial (progenitor) cells are cells that constitute the inner surface of a blood vessel and are cells in contact with the circulating lumen of blood. Vascular endothelial (progenitor) cells are a concept including vascular endothelial cells and vascular endothelial precursor cells. The vascular endothelial (precursor) cells in the present invention are vascular endothelial (progenitor) cells derived from adipose tissue, and retain the ability to proliferate. Vascular endothelial (progenitor) cells can be identified using CD45 negative and CD31 positive as an index, and can also be identified as CD146 positive and CD144 positive.
血管内皮（前駆）細胞は、血管の新生を通して、あらゆる臓器の虚血性疾患の治療に利用できるとともに、臓器（器官、組織）の再生医療として臓器構成細胞、臓器特異的前駆細胞、幹細胞（胎性幹細胞、ｉＰＳ細胞を含む）や幹細胞から誘導された細胞とともに臓器を体外もしくは体内で再生させるために必要な細胞である。本発明による血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団は、広範囲の疾患の治療に利用できる価値がある細胞医薬品として有用である。 Endothelial (progenitor) cells can be used to treat ischemic diseases of any organ through angiogenesis, and organ constituent cells, organ-specific precursor cells, stem cells (fetal) as regenerative medicine for organs (organ, tissue) Stem cells (including iPS cells) and cells derived from stem cells are cells required to regenerate organs in vitro or in the body. The cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells according to the invention is useful as a valuable cellular medicament that can be used to treat a wide range of diseases.
脂肪幹細胞は、脂肪に由来する多分化能を有する細胞であり、脂肪細胞、骨母細胞、軟骨母細胞、筋線維母細胞、骨母細胞、筋肉細胞又は神経細胞などに分化することができる細胞である。 An adipose stem cell is a pluripotent cell derived from fat, and can be differentiated into an adipocyte, an osteocyte, a chondrocyte, a myocyte, a myocyte, a muscle cell or a nerve cell, etc. It is.
細胞集団とは、１種又は２種以上の多数の細胞を含む集団を意味する。細胞集団は、一般的には、１種類の優勢な細胞タイプと１種類以上の少数の細胞タイプとを含む、純粋ではない細胞集団である。本発明においては、血管内皮（前駆）細胞が、優勢な細胞タイプに該当し、脂肪幹細胞が、少数の細胞タイプに該当する。 By cell population is meant a population comprising one or more multiple cells. A cell population is generally a non-pure cell population comprising one predominant cell type and one or more minor cell types. In the present invention, vascular endothelial (progenitor) cells correspond to the predominant cell types, and adipose stem cells correspond to a few cell types.
ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性とは、ＣＤ４５の発現が陰性であり、ＣＤ３１の発現が陽性であることを意味する。ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞は、ＣＤ４５抗体及びＣＤ３１抗体を用いて後記する磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）等により回収することができる。 CD45 negative and CD31 positive means that the expression of CD45 is negative and the expression of CD31 is positive. CD45 negative and CD31 positive cells can be recovered by magnetic cell separation (MACS) described later using CD45 antibody and CD31 antibody.
本発明の細胞集団においては、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の血管内皮（前駆）細胞の割合が９２％以上であり、好ましくは９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であり、１００％でもよい。ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の血管内皮（前駆）細胞の割合は、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）により測定することができる。 In the cell population of the present invention, the proportion of CD45 negative and CD31 positive vascular endothelial (progenitor) cells is 92% or more, preferably 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more , 98% or more, or 99% or more, and may be 100%. The percentage of CD45 negative and CD31 positive vascular endothelial (precursor) cells can be measured by FACS (fluorescence activated cell sorting).
本発明の細胞集団においては、脂肪幹細胞の割合は８％以下であり、好ましくは７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下であり、０％でもよい。脂肪幹細胞の割合は、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性で、ＣＤ９０が陽性の細胞として確認することが可能である。脂肪幹細胞の割合は、さらに、ＣＤ４５陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ１３陽性として確認することができる。上記のマーカーは、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）により測定することができる。 In the cell population of the present invention, the percentage of adipose stem cells is 8% or less, preferably 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less Yes, it may be 0%. The percentage of adipose stem cells can be confirmed as CD31 negative and CD146 negative cells and CD90 positive cells. The percentage of adipose stem cells can be further confirmed as CD45 negative, CD44 positive, CD29 positive, CD13 positive. The above markers can be measured by FACS (fluorescence activated cell sorting).
［２］血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明は、
（１）脂肪組織を酵素で処理して、少なくとも血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団を取得する工程；
（２）前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
（３）前記（２）の工程で得たＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を１時間〜７．０日間培養する工程；及び
（４）前記（３）の工程で得た細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
を含む、血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
工程（２）における「ＣＤ３１陽性の細胞を選別する」としては、ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋で選別すること（即ち、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を選別すること）でもよいし、ＣＤ３１＋で選別すること（即ち、ＣＤ３１陽性のみで細胞を選別すること）でもよい。
本発明の一例としては、
（１）脂肪組織を酵素で処理して、少なくとも血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団を取得する工程；
（２）前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
（３）前記（２）の工程で得たＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を２．０〜６．０日間（又は３．０〜６．０日間）培養する工程；及び
（４）前記（３）の工程で得た細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
を含む、血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
また、前記の（１）の工程と前記の（２）の工程との間に、前記（１）の工程で取得した細胞集団を１．０時間〜５．０日間（または１．０〜４．０日間）培養する工程を含めてもよい。
[2] A method for producing a cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells
(1) treating adipose tissue with an enzyme to obtain a cell population comprising at least vascular endothelial (progenitor) cells and adipose stem cells;
(2) obtaining a cell population containing CD31 positive cells by sorting out CD31 positive cells from the cell population obtained in the step (1);
(3) culturing the cell population containing the CD31 positive cells obtained in the step of (2) for 1 hour to 7.0 days; and (4) CD31 positive from the cell population obtained in the step of (3) above Obtaining a cell population containing CD31 positive cells by sorting out the cells of
And a method of producing a cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells.
As “selecting CD31 positive cells” in step (2), it may be sorting by CD45 − / CD 31 + (ie, sorting of CD45 negative and CD 31 positive cells) or sorting by CD 31 + That is, cells may be sorted only by CD31 positive).
One example of the present invention is
(1) treating adipose tissue with an enzyme to obtain a cell population comprising at least vascular endothelial (progenitor) cells and adipose stem cells;
(2) obtaining a cell population containing CD45 negative and CD31 positive cells by selecting CD45 negative and CD31 positive cells from the cell population obtained in the step (1);
(3) culturing the cell population containing CD45 negative and CD31 positive cells obtained in the above step (2) for 2.0 to 6.0 days (or 3.0 to 6.0 days); A) obtaining a cell population containing CD31 positive cells by selecting CD31 positive cells from the cell population obtained in the step (3);
And a method of producing a cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells.
In addition, between the step (1) and the step (2), the cell population obtained in the step (1) may be 1.0 hour to 5.0 days (or 1.0 to 4 days). The step of culturing may be included.
本発明による血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法は、再生医療に有用な細胞である血管内皮（前駆）細胞を、脂肪組織（皮下脂肪組織）から分離し、純化し、培養する方法に関するものである。 The method for producing a cell population containing vascular endothelial (precursor) cells according to the present invention separates, purifies and culture vascular endothelial (progenitor) cells which are cells useful for regenerative medicine from adipose tissue (subcutaneous adipose tissue) It relates to the method.
本発明において血管内皮（前駆）細胞の分離源となる脂肪組織とは、脂肪細胞を主成分とする全身にわたる組織であり、主に皮下に存在し、エネルギー貯蔵のほか、外界からの物理的衝撃や温度変化に対する身体の保護、ホルモンやサイトカインなどを分泌する働きを有する。 In the present invention, adipose tissue which is a separation source of vascular endothelial (precursor) cells is a whole-body tissue mainly composed of fat cells, which is mainly present subcutaneously, has energy storage, and physical impact from the outside world. And protect the body against temperature changes, and secrete hormones and cytokines.
脂肪組織は、例えばヒト、又はヒト以外の哺乳類又は鳥類などから外科的切除することにより得ることができる。ヒト以外の哺乳類としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、フェレット、ウサギ、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター等を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等を挙げることができる。外科的切除の際には、局所麻酔をしてもよい。脂肪組織は、カニューレを腹部、大腿部、臀部、又は全身の皮下脂肪組織に挿管することによって、吸引により得ることもできる。得られる脂肪組織の量は、例えば１ｇ〜１０００ｇであり、好ましくは１ｇ〜５００ｇ、１ｇ〜１００ｇ、２ｇ〜５０ｇ、又は２ｇ〜４０ｇであるが、これらに限定されない。 Adipose tissue can be obtained, for example, by surgical excision from human or non-human mammals or birds. Examples of non-human mammals include dogs, cats, cattle, horses, pigs, goats, sheep, monkeys, ferrets, rabbits, mice, rats, gerbils, guinea pigs, hamsters and the like. As birds, a chicken etc. can be mentioned. During surgical resection, local anesthesia may be performed. Adipose tissue can also be obtained by aspiration by intubating a cannula into the abdomen, thighs, buttocks, or whole body subcutaneous adipose tissue. The amount of fat tissue obtained is, for example, 1 g to 1000 g, preferably 1 g to 500 g, 1 g to 100 g, 2 g to 50 g, or 2 g to 40 g, but is not limited thereto.
得られた脂肪組織は、肉眼で、腫瘍性病変や汚染がないことを確認することが好ましい。脂肪組織は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、及びＴＰＨＡ／ＲＰＲがいずれも陰性であることを確認してもよい。脂肪組織は、マイコプラズマが１２８倍未満（ＰＡ法）、単純ヘルペスが３２０倍未満（ＣＦ法）であることを確認してもよい。 Preferably, the obtained adipose tissue is visually confirmed to be free from neoplastic lesions and contamination. Adipose tissue may confirm that HBV, HCV, HIV, HTLV-1 and TPHA / RPR are all negative. Adipose tissue may be confirmed to have less than 128 times mycoplasma (PA method) and less than 320 times herpes simplex (CF method).
吸引脂肪組織を使用する場合には、吸引脂肪組織を静置しておき、脂肪層と水層を分離させることが好ましい。また、吸引脂肪組織を遠心分離器により分離して、脂肪層、水層を分離することもできる。脂肪層と水層とが分離した後に、水層を回収除去することにより脂肪層のみを単離することができる。
得られた脂肪組織は、例えば生理食塩水などで洗浄してから酵素処理に供してもよい。
When using suctioned fat tissue, it is preferable to allow the suctioned fat tissue to stand and separate the fat layer and the water layer. Also, the aspirated fat tissue can be separated by a centrifuge to separate the fat layer and the water layer. After the fat layer and the aqueous layer are separated, only the fat layer can be isolated by recovering and removing the aqueous layer.
The obtained adipose tissue may be washed with, for example, physiological saline and then subjected to the enzyme treatment.
酵素処理に供する前の脂肪組織は、酵素処理の前に室温または３７℃ウォーターバスで５分〜１５分間温めておくことが好ましい。 It is preferable to warm the adipose tissue before being subjected to the enzyme treatment for 5 minutes to 15 minutes in a room temperature or 37 ° C. water bath before the enzyme treatment.
＜工程（１）について＞
本発明における工程（１）は、脂肪組織を酵素で処理して、少なくとも血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞とを含む細胞集団を取得する工程である。
<About the step (1)>
The step (1) in the present invention is a step of treating the adipose tissue with an enzyme to obtain a cell population comprising at least vascular endothelial (progenitor) cells and adipose stem cells.
酵素処理は、チューブ中の脂肪組織に適量の酵素反応液を加え、恒温振とう機にチューブを固定して、振盪させることによって行うことができる。酵素処理の温度は、酵素反応が進行する限り特に限定されないが、一般的には２５℃〜５０℃であり、好ましくは３０〜４５℃であり、例えば、３７℃である。振盪は、往復振盪でも旋回振盪でもよい。往復振盪の場合、往復振盪速度は特に限定されないが、一般的には１０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍであり、好ましくは５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍであり、例えば、１２０ｒｐｍである。反応時間は特に限定されないが、一般的には１０分間〜３時間であり、好ましくは１５分間から１時間であり、例えば、３０分間である。 The enzyme treatment can be carried out by adding an appropriate amount of the enzyme reaction solution to fat tissue in a tube, fixing the tube on a constant temperature shaker, and shaking. The temperature of the enzyme treatment is not particularly limited as long as the enzyme reaction proceeds, but is generally 25 ° C to 50 ° C, preferably 30 to 45 ° C, for example, 37 ° C. The shaking may be reciprocating shaking or rotational shaking. In the case of reciprocating shaking, the reciprocating shaking speed is not particularly limited, but generally 10 rpm to 300 rpm, preferably 50 rpm to 200 rpm, for example, 120 rpm. The reaction time is not particularly limited, but is generally 10 minutes to 3 hours, preferably 15 minutes to 1 hour, for example, 30 minutes.
酵素としては、少なくともコラゲナーゼを使用することが好ましい。
コラゲナーゼとは、動物組織細胞、炎症細胞、腫瘍細胞又はClostridium histolyticum等のバクテリアなどが産生する、又は、遺伝子組換え技術により人工的に産生される組換え蛋白質であり、Ｉ型、II型、III型コラーゲンを分解する酵素をいう。
Preferably, at least collagenase is used as the enzyme.
Collagenase is a recombinant protein produced by animal tissue cells, inflammatory cells, tumor cells, bacteria such as Clostridium histolyticum etc., or artificially produced by genetic recombination technology, and is type I, type II, III Refers to an enzyme that degrades type collagen.
酵素処理液におけるコラゲナーゼ濃度は、好ましくは０．０２％〜０．５％であり、より好ましくは０．１％〜０．５％であり、さらに好ましくは０．１％〜０．４％であり、さらに好ましくは０．１％〜０．３％であり、最も好ましくは０．２％である。 The collagenase concentration in the enzyme treatment solution is preferably 0.02% to 0.5%, more preferably 0.1% to 0.5%, and still more preferably 0.1% to 0.4%. More preferably, it is 0.1% to 0.3%, and most preferably 0.2%.
酵素処理に使用する酵素処理液は、コラゲナーゼに加えてＤＮａｓｅＩをさらに含むことも好ましい。ＤＮａｓｅＩを使用する場合、酵素処理液におけるＤＮａｓｅＩの濃度は、好ましくは１００〜１００００Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２００〜５０００Ｕ／ｍＬであり、さらに好ましくは５００〜２０００Ｕ／ｍＬである。 It is also preferable that the enzyme treatment solution used for the enzyme treatment further contains DNase I in addition to collagenase. When DNase I is used, the concentration of DNase I in the enzyme treatment solution is preferably 100 to 10000 U / mL, more preferably 200 to 5000 U / mL, and still more preferably 500 to 2000 U / mL.
酵素処理に使用する酵素処理液は、ポロキサマー及びプロナーゼを含有しないことが好ましい。 It is preferable that the enzyme treatment solution used for enzyme treatment does not contain poloxamer and pronase.
酵素処理に使用する酵素処理液はさらにＣａＣｌ２を含むことが好ましい。酵素処理液におけるＣａＣｌ２の濃度は、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭであり、より好ましくは２ｍＭ〜５ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜４ｍＭであり、例えば、３ｍＭである。 It is preferable that the enzyme treatment solution used for the enzyme treatment further contains CaCl 2 . The concentration of CaCl 2 in the enzyme-treated solution is preferably 1 mM to 10 mM, more preferably 2 mM to 5 mM, still more preferably 2 mM to 4 mM, for example, 3 mM.
酵素処理に使用する酵素処理液は、緩衝液であることが好ましく、ＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt Solution）であることがより好ましい。 The enzyme treatment solution used for the enzyme treatment is preferably a buffer, and more preferably HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution).
酵素処理に使用する酵素処理液の組成の好ましい具体例は、０．２％コラゲナーゼ、ＨＢＳＳ、３ ｍＭ ＣａＣｌ２、１０００Ｕ／ｍｌ−ＤＮａｓｅＩである。 Preferred specific examples of the composition of the enzyme treatment solution used for the enzyme treatment are 0.2% collagenase, HBSS, 3 mM CaCl 2 , and 1000 U / ml-DNase I.
＜工程（２）について＞
本発明における工程（２）は、前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程である。
本発明における工程（２）は、前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程であってもよい。
<About step (2)>
Step (2) in the present invention is a step of obtaining a cell population containing CD31-positive cells by selecting CD31-positive cells from the cell population obtained in the step (1).
Step (2) in the present invention is a step of obtaining a cell population containing CD45 negative and CD31 positive cells by selecting CD45 negative and CD31 positive cells from the cell population obtained in the above step (1). May be
ＣＤ３１陽性の細胞、またはＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞を選別する方法は特に限定されず、抗体を用いてマーカータンパク質を発現する細胞又はマーカータンパク質を発現しない細胞を選別及び分離する方法を使用すればよい。 There is no particular limitation on the method of selecting CD31 positive cells or CD45 negative and CD31 positive cells, and antibodies may be used to select and separate cells expressing marker proteins or cells not expressing marker proteins. Good.
本発明においては、ＣＤ３１に対して特異的に結合し得る抗体、更に所望によりＣＤ４５に対して特異的に結合し得る抗体を用いて細胞の選別及び分離を行うことができる。抗体は、上記のマーカータンパク質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。また抗体は、上記のマーカータンパク質に特異的に結合し得る限り断片であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)等が挙げられる。 In the present invention, cells can be sorted and separated using an antibody capable of specifically binding to CD31, and further optionally an antibody capable of specifically binding to CD45. The antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to the above marker protein, and may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody may also be a fragment as long as it can specifically bind to the above marker protein. Examples of antibody fragments include Fab fragments, F (ab ') 2 fragments, single chain antibodies (scFv) and the like.
抗体を用いてマーカータンパク質を発現する細胞又はマーカータンパク質を発現しない細胞を選別及び分離する方法としては、例えば、蛍光細胞分離法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）等が挙げられ、上記の中でもＭＡＣＳが好ましい。 As a method of selecting and separating cells expressing marker protein or cells not expressing marker protein using an antibody, for example, fluorescence activated cell sorting (FACS), magnetic activated cell sorting (Magnetic activated cell sorting) : MACS) etc., and among the above, MACS is preferable.
ＭＡＣＳは、マーカータンパク質に対する抗体を磁気ビーズに固定化し、強力な磁石を利用して円筒形容器（カラム）の内壁又は、単にチューブ内で目的とする細胞を分離することができる。固定化する磁気ビーズ試薬としては、一般的なものを用いることができる。例えば、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、ＩＭａｇ（日本ＢＤ社製）等が挙げられる。 MACS can immobilize an antibody against a marker protein on magnetic beads, and use a strong magnet to separate target cells in the inner wall of a cylindrical container (column) or simply in a tube. As a magnetic bead reagent to be immobilized, a general one can be used. For example, MACS (made by Miltenyi Biotec), IMag (made by Japan BD) etc. are mentioned.
前記（２）の工程においては、抗ＣＤ３１抗体で標識した磁気ビーズと、所望により抗ＣＤ４５抗体で標識した磁気ビーズとを用いて、ＣＤ３１陽性の細胞、またはＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の細胞をＭＡＣＳにより選別することができる。 In the step (2), CD31-positive cells or CD45-negative and CD31-positive cells are subjected to MACS by using magnetic beads labeled with anti-CD31 antibody and magnetic beads optionally labeled with anti-CD45 antibody. It can be sorted out.
ＦＡＣＳにおいては、セルソーター機能を有するフローサイトメーターを用いれば、指定した蛍光を発する特定の細胞のみを分取することが可能である。このような機器として、例えばＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（日本ＢＤ社製）、ＪＳＡＮ（ベイバイオサイエンス社製）、ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（ベックマン・コールター社製）等が挙げられる。 In FACS, using a flow cytometer having a cell sorter function, it is possible to sort out only specific cells that emit designated fluorescence. As such an apparatus, for example, FACSAria II (manufactured by Japan BD), JSAN (manufactured by Bay Biosciences), MoFlo XDP (manufactured by Beckman Coulter), etc. may be mentioned.
＜工程（３）について＞
本発明における工程（３）は、前記（２）の工程で得たＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を１時間〜７．０日間（３．０〜６．０日間でもよい）培養する工程である。
<About step (3)>
The step (3) in the present invention is a step of culturing the cell population containing the CD31 positive cells obtained in the step (2) for 1 hour to 7.0 days (may be 3.0 to 6.0 days). is there.
工程（２）で得た細胞集団を培養する期間が１時間〜７．０日間であること、特には３．０〜６．０日間であることは本発明の特徴の一つである。工程（２）で得た細胞集団を培養する期間は、好ましくは３．５〜５．５日間であり、より好ましくは３．５〜５．０日間であり、特に好ましくは４．０〜４．５日間である。 It is one of the features of the present invention that the culture period of the cell population obtained in step (2) is 1 hour to 7.0 days, particularly 3.0 to 6.0 days. The culture period of the cell population obtained in step (2) is preferably 3.5 to 5.5 days, more preferably 3.5 to 5.0 days, and particularly preferably 4.0 to 4 .5 days.
工程（２）で得た細胞集団を培養する際の培養条件は、通常の動物細胞（好ましくは血管内皮（前駆）細胞）の培養に適した条件に準じて設定することができる。 The culture conditions for culturing the cell population obtained in step (2) can be set according to the conditions suitable for culturing normal animal cells (preferably vascular endothelial (progenitor) cells).
培地は、血管内皮（前駆）細胞を培養できる培地であれば特に限定されず、ＥＧＭ−２（Lonza）、αＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質、各種ホルモン、各種増殖因子等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。培地としては特に好ましくは、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）、又はＥＧＭ−２ＭＶ （Ｌｏｎｚａ）などを使用することができる。 The medium is not particularly limited as long as it can culture vascular endothelial (progenitor) cells, and EGM-2 (Lonza), αMEM, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Dulbecco's modified Eagle's medium / ham F-12 mixed medium DMEM / F12), RPMI 1640 and the like can be mentioned. Usually, various additives applicable to ordinary cell culture, such as serum, various vitamins, various antibiotics, various hormones, various growth factors, etc. may be added to these culture solutions. As the medium, particularly preferably, EGM-2 medium (Lonza), EGM-2MV (Lonza) or the like can be used.
培養は、フラスコ等の培養容器を用いて、５％ＣＯ２、３７℃で行うことが好ましい。培地交換は、例えば２日おきに行えばよい。 The culture is preferably performed at 37 ° C., 5% CO 2 , using a culture vessel such as a flask. Medium exchange may be performed, for example, every two days.
＜工程（４）について＞
工程（４）は、工程（３）で得た細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程である。
<About the step (4)>
Step (4) is a step of obtaining a cell population containing CD31 positive cells by selecting CD31 positive cells from the cell population obtained in step (3).
ＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を選別する方法は特に限定されず、工程（２）の場合と同様に、抗体を用いてマーカータンパク質であるＣＤ３１を発現する細胞を選別及び分離する方法を使用すればよい。具体的には、工程（２）の場合と同様に、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等が挙げられ、上記の中でもＭＡＣＳが好ましい。
工程（４）においては、抗ＣＤ３１抗体で標識した磁気ビーズを用いて、ＣＤ３１陽性の細胞を選別することができる。
There are no particular limitations on the method for selecting cell populations containing CD31 positive cells, and as in step (2), a method for selecting and separating cells expressing the marker protein CD31 using an antibody may be used. Just do it. Specifically, as in the case of the step (2), FACS, MACS and the like can be mentioned, and among the above, MACS is preferable.
In step (4), CD31 positive cells can be sorted using magnetic beads labeled with an anti-CD31 antibody.
＜工程（４）の後について＞
本発明の方法は、前記（４）の工程において選別されたＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含んでいてもよい。
<After Step (4)>
The method of the present invention may further include the step of culturing a cell population containing the CD31 positive cells selected in the step (4).
工程（４）で得た細胞集団を培養する際の培養条件は、通常の動物細胞（好ましくは血管内皮（前駆）細胞）の培養に適した条件に準じて設定することができる。 The culture conditions for culturing the cell population obtained in the step (4) can be set according to the conditions suitable for culturing a normal animal cell (preferably, vascular endothelial (progenitor) cell).
培地は、血管内皮（前駆）細胞を培養できる培地であれば特に限定されず、ＥＧＭ−２（Lonza）、αＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質、各種ホルモン、各種増殖因子等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。培地としては特に好ましくは、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）、又はＥＧＭ−２ＭＶ （Ｌｏｎｚａ）などを使用することができる。 The medium is not particularly limited as long as it can culture vascular endothelial (progenitor) cells, and EGM-2 (Lonza), αMEM, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Dulbecco's modified Eagle's medium / ham F-12 mixed medium DMEM / F12), RPMI 1640 and the like can be mentioned. Usually, various additives applicable to ordinary cell culture, such as serum, various vitamins, various antibiotics, various hormones, various growth factors, etc. may be added to these culture solutions. As the medium, particularly preferably, EGM-2 medium (Lonza), EGM-2MV (Lonza) or the like can be used.
培養は、フラスコ等の培養容器を用いて、５％ＣＯ２、３７℃で行うことが好ましい。培地交換は、例えば２日おきに行えばよい。
培養期間は特に限定されないが、例えば、１日〜１４日間の培養を行うことができる。日〜６日間の培養を行った後に、細胞を継代して、例えば、３日〜６日間の培養を再度行ってもよい。工程（４）の後における継代の回数及び培養の回数は特に限定されない。
The culture is preferably performed at 37 ° C., 5% CO 2 , using a culture vessel such as a flask. Medium exchange may be performed, for example, every two days.
The culture period is not particularly limited, and for example, culture can be performed for 1 day to 14 days. After culturing for 1 to 6 days, cells may be passaged, and for example, culture for 3 to 6 days may be performed again. The number of passages and the number of cultures after step (4) are not particularly limited.
細胞懸濁液の播種は特に限定されないが、一例としては、１ｘ１０４個生存有核細胞／ｃｍ２、培地量は１ｍＬ／５ｃｍ２程度で実施可能である。継代培養が安定して可能になったＰ３以降においては、一例としては、２５００個生存有核細胞／ｃｍ２、培地量は１ｍＬ／５ｃｍ２とすることができる。 Although the seeding of the cell suspension is not particularly limited, for example, it can be performed with 1 × 10 4 viable nucleated cells / cm 2 and a medium volume of about 1 mL / 5 cm 2 . From P3 on which subculture has become stable and possible, for example, 2500 viable nucleated cells / cm 2 and the amount of medium can be 1 mL / 5 cm 2 .
［３］医薬組成物
本発明は、本発明による細胞集団、又は本発明の製造方法により製造される細胞集団（以下、これらをまとめて本発明の細胞集団とも言う）を含む、医薬組成物に関する。
[3] Pharmaceutical composition The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the cell population according to the present invention or the cell population produced by the production method of the present invention (hereinafter collectively referred to as the cell population of the present invention) .
本発明の細胞集団は、血管内皮（前駆）細胞を含むものであり、生体組織や臓器の損傷、変性、障害や機能不全の治療や美容を目的とした移植材料として用いることができる。 The cell population of the present invention contains vascular endothelial (precursor) cells, and can be used as a graft material for treatment or cosmetic treatment of damage, degeneration, injury or malfunction of living tissues and organs.
本発明の細胞集団は、単独で、あるいは幹細胞及び／又は体細胞と組み合わせて使用することによって、血流に問題のある様々な病的組織に血管新生を促すことができる。
本発明の細胞集団は、幹細胞と組み合わせて使用することによって、様々な臓器や組織を効率的に再生させ、移植先に生着させることができる。
本発明の細胞集団は、脂肪組織と組み合わせて使用することによって、豊胸、乳がん切除後の***再建、目元や頬のシワやハリの低下の改善等を目的とした移植を行うことができる。
本発明の細胞集団は、骨芽細胞と組み合わせて使用することによって、骨折の治療、低身長・骨変形・脚長差を改善するための骨延長術等を目的とした移植を行うことができる。
本発明の細胞集団は、軟骨細胞と組み合わせて使用することによって、関節軟骨の退化・変性・変形その他の異常に関連する疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、肩関節周囲炎、顎関節症など）の治療を目的とした移植を行うことができる。
本発明の細胞集団は、平滑筋細胞と組み合わせて使用することによって、平滑筋細胞の傷害や異常に起因する疾患（例えば、排尿障害（尿漏れ、頻尿、尿閉など）、平滑筋腫、平滑筋肉腫等）の治療を目的とした移植を行うことができる。
The cell population of the present invention can promote angiogenesis in various pathological tissues having blood flow problems by using alone or in combination with stem cells and / or somatic cells.
By using the cell population of the present invention in combination with stem cells, various organs and tissues can be efficiently regenerated and engrafted at the transplantation destination.
By using the cell population of the present invention in combination with adipose tissue, it is possible to perform transplantation for the purpose of breast augmentation, breast reconstruction after removal of breast cancer, improvement of wrinkles and firmness of eyes and cheeks, and the like.
The cell population of the present invention can be used in combination with osteoblasts for transplantation for the treatment of bone fracture, bone distraction for the purpose of improving short stature, bone deformation, and leg length difference.
The cell population of the present invention can be used in combination with chondrocytes to treat diseases associated with degeneration, degeneration, deformation or other abnormalities of articular cartilage (eg, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, shoulder joint arthritis, temporomandibular joint, etc. Transplants for the purpose of treatment of
The cell population of the present invention can be used in combination with smooth muscle cells to treat diseases caused by smooth muscle cell injury or abnormalities (eg, voiding disorder (eg, urine leak, frequent urination, urinary retention, etc.), leiomyoma, smooth Transplantation can be performed for the purpose of treatment of myeloma and the like.
本発明の医薬組成物は、本発明の細胞集団を、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤、又は培養液により希釈したものでもよい。輸液製剤としては特に限定されないが、例えば、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。希釈する際の細胞数は特に限定されないが、例えば、１×１０３〜１×１０７個／ｍＬとすることができる。 The pharmaceutical composition of the present invention may be obtained by diluting the cell population of the present invention with an infusion preparation used as a pharmaceutically acceptable medium, or a culture solution. The infusion preparation is not particularly limited. For example, physiological saline, 5% glucose solution, Ringer solution, Ringer's lactate, Ringer's lactate, Ringer's acetate, starting solution (No. 1), dehydrated replacement solution (No. 2), maintenance infusion (No. 3) Solution), post-operative recovery solution (No. 4 solution), etc. can be mentioned. The number of cells upon dilution is not particularly limited, and can be, for example, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 cells / mL.
本発明の医薬組成物は、保存安定性、無菌性、等張性、吸収性及び／又は粘性を増加するための種々の添加剤、例えば、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤等を含んでもよい。増粘剤としては、例えば、ＨＥＳ、デキストラン、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。 The pharmaceutical composition of the present invention can be added to various additives for increasing storage stability, sterility, isotonicity, absorption and / or viscosity, such as emulsifiers, dispersants, buffers, preservatives, wetting agents. It may contain an antibacterial agent, an antioxidant, a chelating agent, a thickener, a gelling agent, a pH adjuster and the like. Examples of the thickener include, but not limited to, HES, dextran, methylcellulose, xanthan gum, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl cellulose and the like.
本発明の医薬組成物のｐＨは、中性付近のｐＨ、例えば、ｐＨ６．５以上又はｐＨ７．０以上とすることができ、またｐＨ８．５以下又はｐＨ８．０以下とすることができるが、これらに限定されない。 The pH of the pharmaceutical composition of the present invention can be around neutral pH, for example, pH 6.5 or more or pH 7.0 or more, and can be pH 8.5 or less or pH 8.0 or less. It is not limited to these.
本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。本発明の医薬組成物を患者又は被験者に投与する際には、３７℃で急速に解凍して使用することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be stored in a frozen state until immediately before use. When administering the pharmaceutical composition of the present invention to a patient or a subject, it can be used by rapidly thawing at 37 ° C.
本発明の医薬組成物の投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。血管内皮（前駆）細胞の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０４個／ｋｇ体重以上、１０５個／ｋｇ体重以上又は１０６個／ｋｇ体重以上である。また、血管内皮（前駆）細胞の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０９個／ｋｇ体重以下、１０８個／ｋｇ体重以下又は１０７個／ｋｇ体重以下である。 The dose of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately determined depending on the administration form, administration method, purpose of use, age, body weight, symptoms and the like of the patient or subject. The dose of vascular endothelial (progenitor) cells is not particularly limited, and is, for example, 10 4 cells / kg body weight or more, 10 5 cells / kg body weight or more, or 10 6 cells / kg body weight or more. The dose of vascular endothelial (progenitor) cells is not particularly limited, and is, for example, 10 9 cells / kg body weight or less, 10 8 cells / kg body weight or less, or 10 7 cells / kg body weight or less.
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射でもよいし、又はカテーテルなどにより局所に直接移植することなどが挙げられる。 The administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and for example, subcutaneous injection, intralymphatic injection, intravenous injection, intraarterial injection, intraperitoneal injection, intrathoracic injection, or direct local injection may be used. Or directly implanted locally by a catheter or the like.
また本発明の医薬組成物は、細胞懸濁液として投与することに限定されず、
（１）脂肪や皮膚などほかの組織に付着、もしくは混合して投与する；
（２）他の細胞や足場に付着、もしくは混合して、投与する；
（３）他の細胞や足場に付着、もしくは混合して、投与して、作成した細胞加工物として、投与する；
などの投与形態も可能である。
Also, the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to administration as a cell suspension,
(1) Adhere to or mix with other tissues such as fat and skin;
(2) Adhere or mix with other cells or scaffolds and administer;
(3) Adhering to or mixing with other cells or scaffolds, and administering it as a fabricated cell product;
Other forms of administration are also possible.
本発明の医薬組成物の投与対象は、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、哺乳類又は鳥類などが挙げられる。哺乳類としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、フェレット、ウサギ、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター等を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等を挙げることができる。 The administration target of the pharmaceutical composition of the present invention is typically a human but may be other animals. Other animals include mammals or birds. Examples of mammals include dogs, cats, cattle, horses, pigs, goats, sheep, monkeys, ferrets, rabbits, mice, rats, gerbils, guinea pigs, hamsters and the like. As birds, a chicken etc. can be mentioned.
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited by the examples.
＜試薬、使用機器など＞
HBSS without Ca++, without Mg++ (Gibco, #14175-095)
コラナゲーゼ粗精製、Clostridium histolyticum由来(Wako, #032-22364)
遠沈管 (500 mL, Corning, #431123; 250 mL, Corning #430776; 50 mL, Falcon, #352070,15 mL, FALCON #352096)
卓上遠心機 (Kubota, 本体#S700T, 支柱#RS-7504M, バケット#053-0100)
恒温振盪機 (Yamato, #100)
電子秤
カルスピペット10 mL (Iwaki, #K-PIPET-LT10)
ピペット滅菌器角型 (三商, #92-0655-4)
スポイトシリコンゴム10 mL用 (アズワン, #6-356-04)
Cell culture dish (Falcon, #353025, 150mm dish, growth area 156.36 cm2)
セルストレーナーφ100 μm, FALCON #352360
セルストレーナーφ40 μm, FALCON # 352340
DNaseＩ粗精製(Worthington, #LS002138)
Blood cell lysis kit (ミルテニー, #130-094-183)
BSA fatty acid free, low endotoxin, lyophilized powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≧96% (agarose gel electrophoresis) (Sigma, #A8806)
EDTA-2Na （Dojindo, #N001）
MS column （ミルテニー, #120-000-472）
MACS separator（ミルテニー）
CD45 Microbeads (ミルテニー, #130-045-801)
CD31 Microbeads kit (human) (ミルテニー, #130-091-935)
Culture sure CaCl2(wako, #037-24031, MW110.98)
0.22 μmφシリンジフィルター (ミリポア、Millex-GV, #2LGV-33RS)
血管内皮（前駆）細胞培地（EGM-2, Lonza #CC-3162）
TrypLE express (Gibco, #12604-021)
ジメチルスルホキシド分子生物学用（DMSO）（和光純薬, #047-29353）
非働化Fetal Bovine Serum (FBS)
凍結保存ユニット（Thermo Fisher Scientific, #5100-0001）
-80℃ディープフリーザー、気相式液体窒素極低温フリーザー
ソニケーター（ブランソン, #M2800J）
ディスポーザブルピペット（コーニング、コースター、5 mL #4487, 10 mL #4488, 25 mL #4489, 50 mL #4490）
マトリゲル基底膜マトリックス フェノールレッドフリー （Corning, #356237）
96 wellプレート、SpectraPlate-96 TC（パーキンエルマー, #6005650）
4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬, #163-20145）
グリシン（和光純薬, #077-00735）
Triton-X100（和光純薬,#591-12191）
Human CD31抗体（R&D, #BBA7）
Normal mouse IgG抗体 （Santa cruz, # sc-2025）
Alexa-488 Goat anti-mouse IgG1抗体（Invitrogen, #A21121）
DAPI (Dojindo, #340-07971)
4ウェルチャンバースライド（Iwaki, # 5722-004）
VECTA shield mounting medium (VECTOR Laboratories, #H-1000)
共焦点顕微鏡（OLYMPUS, FV1000）
カバーグラス（Matsunami, 24x50 mm, No.1, 0.12-0.17）
<Reagent, equipment used>
HBSS without Ca ++, without Mg ++ (Gibco, # 14175-095)
Coranagenase crude purified, from Clostridium histolyticum (Wako, # 032-22364)
Centrifuge tube (500 mL, Corning, # 431123; 250 mL, Corning # 430776; 50 mL, Falcon, # 352070, 15 mL, FALCON # 352096)
Desktop centrifuge (Kubota, main unit # S700T, post # RS-7504M, bucket # 053-0100)
Isothermal shaker (Yamato, # 100)
Electronic scale Callus pipette 10 mL (Iwaki, # K-PIPET-LT10)
Pipette sterilizer square type (Sanyo, # 92-0655-4)
For dropper silicone rubber 10 mL (As One, # 6-356-04)
Cell culture dish (Falcon, # 353025, 150 mm dish, growth area 156.36 cm2)
Cell strainer φ100 μm, FALCON # 352360
Cell strainer φ 40 μm, FALCON # 352340
DNase I crude purification (Worthington, # LS 0021 38)
Blood cell lysis kit (Milteny, # 130-094-183)
BSA fatty acid free, low endotoxin, lyophilized powder, BioReagent, suitable for cell culture, 96 96% (Agarose gel electrophoresis) (Sigma, # A8806)
EDTA-2Na (Dojindo, # N001)
MS column (Milteny, # 120-000-472)
MACS separator (Milteny)
CD45 Microbeads (Milteny, # 130-045-801)
CD31 Microbeads kit (human) (Milteny, # 130-091-935)
Culture sure CaCl 2 (wako, # 037-24031, MW 110. 98)
0.22 μmφ Syringe Filter (Millipore, Millex-GV, # 2LGV-33RS)
Endothelial (progenitor) cell culture medium (EGM-2, Lonza # CC-3162)
TrypLE express (Gibco, # 12604-021)
Dimethyl sulfoxide for molecular biology (DMSO) (Wako Pure Chemical Industries, # 047-29353)
Nonfunctional Fetal Bovine Serum (FBS)
Freeze storage unit (Thermo Fisher Scientific, # 5100-0001)
-80 ° C deep freezer, vapor phase liquid nitrogen cryogenic freezer sonicator (Branson, # M2800J)
Disposable Pipettes (Corning, Coaster, 5 mL # 4487, 10 mL # 4488, 25 mL # 4489, 50 mL # 4490)
Matrigel basement membrane matrix phenol red free (Corning, # 356237)
96 well plate, SpectraPlate-96 TC (Perkin Elmer, # 6005650)
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution (Wako Pure Chemical Industries, # 163-20145)
Glycine (Wako Pure Chemical Industries, # 077-00735)
Triton-X100 (Wako Pure Chemical Industries, # 591-12191)
Human CD31 antibody (R & D, # BBA7)
Normal mouse IgG antibody (Santa cruz, # sc-2025)
Alexa-488 Goat anti-mouse IgG1 antibody (Invitrogen, # A21121)
DAPI (Dojindo, # 340-07971)
4-well chamber slide (Iwaki, # 5722-004)
VECTA shield mounting medium (VECTOR Laboratories, # H-1000)
Confocal microscope (OLYMPUS, FV1000)
Cover glass (Matsunami, 24x50 mm, No. 1, 0.12-0.17)
＜試薬の調製＞
（1M CaCl2 stockの調製）
Culture sure CaCl2 (wako, #037-24031, MW110.98) 11.1 g
MiliQ water 100 mL
上記を良く混合し、 オートクレーブ （121℃, 20分）した。
<Preparation of Reagents>
(Preparation of 1M CaCl2 stock)
Culture sure CaCl2 (wako, # 037-24031, MW 110.98) 11.1 g
MiliQ water 100 mL
The above was mixed well and autoclaved (121 ° C., 20 minutes).
（Collagenase basal 2x mixの調製）
Collagenaseを0.4%になるようにHBSSで溶解した。完全に溶かし切るため、ローテーターで15分溶解した。安全キャビネット内で、0.4% collagenase/HBSSをシリンジフィルターに掛けて、滅菌濾過した。その後、1 M CaCl2を添加して、6 mM CaCl2を含むCollagenase basal 2x mixを調製した。 The collagenase was dissolved in HBSS to 0.4%. In order to completely dissolve and dissolve, it was dissolved by a rotator for 15 minutes. In the safety cabinet, 0.4% collagenase / HBSS was applied to a syringe filter and sterile filtered. Thereafter, 1 M CaCl2 was added to prepare a collagenase basal 2x mix containing 6 mM CaCl2.
（酵素反応液の調製）
実施例3の酵素反応液の調製
条件Ｂの酵素反応液については、コラゲナーゼ濃度を、０．０％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％、０．８％、１．０％又は２．０％に変更した酵素反応液も調製した。
Preparation of Enzyme Reaction Solution of Example 3 With regard to the enzyme reaction solution under condition B, the collagenase concentration was 0.0%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.4%, 0.8. An enzyme reaction solution was also prepared which was changed to 10%, 1.0% or 2.0%.
カルスピペットは、滅菌管に入れて、乾熱滅菌（180℃、2時間）した。 The callus pipette was placed in a sterile tube and dried by heat (180 ° C., 2 hours).
（100 mM EDTA stockの調製）
EDTA-2Na 0.37 gを10 mL MiliQ waterに溶解した。シリンジフィルター0.22μmφで滅菌濾過した。
(Preparation of 100 mM EDTA stock)
0.37 g of EDTA-2Na was dissolved in 10 mL of MiliQ water. It was sterile filtered with a syringe filter of 0.22 μmφ.
（MACS bufferの調製）
0.5% BSA/2 mM EDTA/HBSSで溶解し、シリンジフィルター0.22μmφで滅菌濾過した。脱気のためソニケーターに10分間掛けて、4℃で保存した。
(Preparation of MACS buffer)
It was dissolved in 0.5% BSA / 2 mM EDTA / HBSS, and sterile filtered with a syringe filter 0.22 μmφ. Store for 10 minutes in a sonicator at 4 ° C. for degassing.
実施例１：酵素処理
＜吸引脂肪組織の分注＞
コニカルチューブ重さを秤量した。
吸引脂肪組織を静置しておき、脂肪層と水層を分離させる。分離したところで、ディスポーザブルピペットをスポイトシリコンゴムを用いて陽圧の状態で水層まで差し込み静かに水層を回収除去した。
10 mLディスポーザブルピペットの先端を折り、口を広くした。
上記ピペットで吸引脂肪組織をかき混ぜて、組織を可能な限り均一な状態にして、コニカルチューブに分注した。
Example 1: Enzymatic treatment <dilution of aspirated adipose tissue>
The conical tube weight was weighed.
Allow the aspirated adipose tissue to settle and allow the fat and water layers to separate. After separation, the disposable pipette was inserted into the water layer under positive pressure using a dropper silicone rubber, and the water layer was gently recovered and removed.
The tip of the 10 mL disposable pipette was folded to widen the mouth.
The aspirated adipose tissue was stirred with the above pipette to make the tissue as homogeneous as possible and dispensed into conical tubes.
コニカルチューブ分注量：
50 mLコニカルチューブ：吸引脂肪5 g前後（小スケール）
250 mLコニカルチューブ：吸引脂肪25 g前後（中スケール）
500 mLコニカルチューブ：吸引脂肪50 g前後（大スケール）
Conical tube dispensing volume:
50 mL conical tube: around 5 g of suctioned fat (small scale)
250 mL conical tube: around 25 g of suctioned fat (medium scale)
500 mL conical tube: around 50 g of suctioned fat (large scale)
以下により、吸引脂肪の重量を秤量した。
「吸引脂肪の重量」＝「組織分注後の重さ」−「 空のコニカルチューブの重さ」
The weight of the aspirated fat was weighed according to the following.
"Weight of suctioned fat" = "weight after tissue dispensing"-"weight of empty conical tube"
分注した吸引脂肪組織は、事前に37℃ウォーターバスで5分〜30分温める、もしくは室温の状態で置いた。 The aspirated adipose tissue which had been dispensed was previously warmed in a 37 ° C. water bath for 5 minutes to 30 minutes, or left at room temperature.
＜酵素処理＞
酵素反応液を上述の条件で用意し、事前に37℃で10分間温めたか、もしくは室温の状態で置いた。
吸引脂肪組織に等量の酵素反応液（条件Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ）を加えた。恒温振とう機にコニカルチューブを横倒しに固定して、37℃ 120rpm 30分間振盪し、酵素反応させた。コニカルチューブのキャップは、パラフィルムを巻き、コンタミを防いだ。チューブを取り出して、800G 10分間で遠心した。遠心後の組織-酵素反応液は、遠沈管上部から、オイル層、残存脂肪層、エマルジョン層、水層、細胞ペレットに分離した状態になった。チューブから、オイル層、脂肪層、エマルジョン層を除去した。中・大スケールの場合は、カルスピペット、小スケールの場合は、50 mL のディスポーザブルピペットで除去した。沈殿した細胞塊が崩れないように注意した。水層はパスツールピペットを用いてアスピレーターで吸引除去した。チューブ内の細胞ペレットは、大中小スケール共に50 mLディスポーザブルピペットを用いて、45 mLのHBSS (４℃)で穏やかに懸濁し、細胞懸濁液を得た。
<Enzyme treatment>
The enzyme reaction solution was prepared under the conditions described above, and was previously warmed at 37 ° C. for 10 minutes or left at room temperature.
An equal volume of enzyme reaction solution (conditions A, B, C, D, E or F) was added to aspirated adipose tissue. The conical tube was fixed sideways on a thermostat and shaken at 37 ° C. and 120 rpm for 30 minutes for enzyme reaction. The conical tube cap wrapped parafilm to prevent contamination. The tube was removed and centrifuged at 800G for 10 minutes. The tissue-enzyme reaction solution after centrifugation was separated from the top of the centrifuge tube into an oil layer, a residual fat layer, an emulsion layer, an aqueous layer, and a cell pellet. The oil layer, fat layer and emulsion layer were removed from the tube. The medium and large scale was removed with a callus pipette, and the small scale with a 50 mL disposable pipette. Care was taken that the precipitated cell mass did not collapse. The aqueous layer was aspirated off with an aspirator using a Pasteur pipette. The cell pellet in the tube was gently suspended in 45 mL of HBSS (4 ° C.) using a 50 mL disposable pipette for both large and medium scale to obtain a cell suspension.
新品の50 mLコニカルチューブにφ100umセルストレイナーを置き、乳白色の繊維質の塊を細胞懸濁液（約10 mL）と共にピペットでセルストレーナー上に移動させて細胞懸濁液を通した。セルストレーナー上にトラップされた繊維質の塊を5 mLディスポーザーブルピペットの先端でしごいて繊維質に付着している細胞を回収した。残りの細胞懸濁液（約35 mL）をセルストレーナーに通した。50 mLディスポーザブルピペット（コーニング##4490のピペット先端の内径3.15 mm）で、細胞懸濁を十分に行った（15回）。（3.15 mm内径の穴に15回通して細胞懸濁した）。 The φ100 um cell strainer was placed in a new 50 mL conical tube, and the milky fiber mass was pipetted along with the cell suspension (about 10 mL) onto the cell strainer to pass the cell suspension. The fibrous mass trapped on the cell strainer was scraped with a 5 mL disposable pipette tip to recover the cells adhering to the fibrous material. The remaining cell suspension (about 35 mL) was passed through a cell strainer. The cell suspension was sufficiently performed (15 times) with a 50 mL disposable pipette (3.15 mm internal diameter of the pipette tip of Corning # 4490). (The cells were suspended 15 times through a hole of 3.15 mm internal diameter).
新品の50 mLコニカルチューブにφ40umセルストレーナーを置き、100μmφのセルストレーナーに通した細胞懸濁液をさらにφ40umセルストレーナーに通した。 The φ40 um cell strainer was placed in a new 50 mL conical tube, and the cell suspension passed through a 100 μm cell strainer was further passed through a φ40 um cell strainer.
遠心分離操作、800G 5分間、4℃で遠心した。上清を吸引してHBSS (4℃)で45 mLまでメスアップ、再懸濁した。800G、5分間、4℃で遠心した。上清を吸引してHBSS (4℃)に再懸濁した。脂肪1 g当たり0.5 mLで懸濁した。 Centrifugation operation, it was centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes at 800G. The supernatant was aspirated and re-suspended to 45 mL with HBSS (4 ° C.). Centrifuge at 800 ° C for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant was aspirated and resuspended in HBSS (4 ° C.). Suspended at 0.5 mL / g of fat.
有核生細胞数をLuna-stemを用いて計測した。有核生細胞数の判定は、Acridine Orange (AO)とPropidium Iodide(PI)の共染色で行った。この有核生細胞数をSVF (stromal vascular fraction)の細胞数とした。 The number of nucleated viable cells was counted using a Luna-stem. The number of nucleated viable cells was determined by co-staining with Acridine Orange (AO) and Propidium Iodide (PI). This nucleated viable cell number was defined as the number of cells of SVF (stromal vascular fraction).
ミルテニーred blood cell lysis solution kitで溶血操作した（全てキットのプロトコールどおりに行なった）。上清を吸引してHBSS (4℃)で再懸濁した。脂肪5 g当たり1 mLで懸濁した。有核生細胞数をLuna-stemで計測した。この有核生細胞数を溶血処理後SVFの細胞数とした。 Hemolysis was performed with a Miltenyi red blood cell lysis solution kit (all were performed according to the protocol of the kit). The supernatant was aspirated and resuspended in HBSS (4 ° C.). Suspended at 1 mL per 5 g of fat. The number of nucleated viable cells was counted by Luna-stem. The number of nucleated viable cells was taken as the number of SVF cells after hemolysis treatment.
溶血処理後SVFに関して、FACSによる溶血処理後SVFに含まれる細胞集団の比率調査（実施例２）、MACS による溶血処理後SVFに含まれる細胞集団の比率調査（実施例３）、及びMACSによる脂肪組織由来血管内皮（前駆）細胞（EC細胞）の純化（実施例４）を行なった。 With respect to SVF after hemolysis treatment, the ratio investigation of cell population included in SVF after hemolysis treatment by FACS (Example 2), ratio investigation of cell population included in SVF after hemolysis treatment by MACS (Example 3), and fat by MACS Purification of tissue-derived vascular endothelial (precursor) cells (EC cells) (Example 4) was performed.
実施例２：FACSによる溶血処理後SVFに含まれる細胞集団の比率調査
条件Ｂの酵素反応液において、コラゲナーゼ濃度を、０．０％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．４％、０．８％、１．０％又は２．０％に変更した酵素反応液を用いて酵素処理した場合について、CD45、CD34、CD31の比率をFACSにより確認した。
Example 2: Ratio investigation of cell population included in SVF after hemolytic treatment by FACS In the enzyme reaction solution under condition B, collagenase concentration is 0.0%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, The ratio of CD45, CD34 and CD31 was confirmed by FACS for the case where the enzyme reaction was carried out using 0.4%, 0.8%, 1.0% or 2.0% of the enzyme reaction solution.
（FACS bufferの調製）
0.5% BSA/2 mM EDTA/DPBSで溶解し、シリンジフィルター0.22μmφで滅菌濾過した。脱気のためソニケーターに10分間掛けて、4℃で保存した。
(Preparation of FACS buffer)
It was dissolved in 0.5% BSA / 2 mM EDTA / DPBS, and sterile filtered with a syringe filter 0.22 μmφ. Store for 10 minutes in a sonicator at 4 ° C. for degassing.
（FcR block反応液の調製）
BD Fc blockTMReagent for Human (BD, #564220)を2.5μg/mLの濃度でFACS bufferに添加してFcR block反応液とした。
４×１０5個の溶血処理後SVFをFcR block反応液80 μLで懸濁して、氷中で10分間インキュベートした。下記の実験系列に従って抗体又はFACS bufferを添加し、十分に混和し、氷中で10分間インキュベートした。抗体反応後、0.5 mLのFACS bufferを添加し、氷中で待機させ順じFACSに掛けた。系列#01-05で、Voltage設定とCompensation設定を行い、設定条件を固定してサンプル群系列＃06-13をFACSに掛けてデータ取得した。
(Preparation of FcR block reaction solution)
BD Fc block TM Reagent for Human ( BD, # 564220) was FcR block reaction solution was added to FACS buffer at a concentration of 2.5 [mu] g / mL.
After 4 × 10 5 hemolytic treatments, SVF was suspended in 80 μL of FcR block reaction solution and incubated in ice for 10 minutes. The antibody or FACS buffer was added according to the following experimental sequence, mixed well, and incubated in ice for 10 minutes. After antibody reaction, 0.5 mL of FACS buffer was added, allowed to stand in ice, and subjected to sequential FACS. In the series # 01-05, the Voltage setting and the Compensation setting were performed, the setting conditions were fixed, and the sample group series # 06-13 was applied to FACS to acquire data.
実験系列
APC-IgG1抗体 (BD, #550854)
PE-IgG1抗体 (BD, #555749)
FITC-IgG1抗体 (BD, #555748)
APC-CD45抗体 (BD, #555485)
PE-CD31抗体 (BD, #555446)
FITC-CD34抗体 (BD, #564221)
その結果を図１に示す。 コラゲナーゼ濃度と細胞数との関係を図２に示す。
APC-IgG 1 antibody (BD, # 550854)
PE-IgG 1 antibody (BD, # 555749)
FITC-IgG 1 antibody (BD, # 555748)
APC-CD45 antibody (BD, # 555485)
PE-CD31 antibody (BD, # 555446)
FITC-CD34 antibody (BD, # 564221)
The results are shown in FIG. The relationship between collagenase concentration and cell number is shown in FIG.
Populationの判断：
CD45-/CD34+/CD31+： 血管内皮（前駆）細胞を多数含むpopulation
CD45-/CD34+/CD31-： 脂肪幹細胞を多数含むpopulation
CD45+: 血球系細胞を多数含むpopulation
Population judgment:
CD45- / CD34 + / CD31 +: population containing a large number of vascular endothelial (progenitor) cells
CD45- / CD34 + / CD31-: population containing a large number of adipose stem cells
CD45 +: population containing a large number of blood cells
また、各酵素反応液（条件Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ）について、CD45、CD34、CD31の比率をFACSにより確認した。FACSの方法は、実施例２中の上記と同様の方法で行った。下に実験系列を示す。 Moreover, the ratio of CD45, CD34, and CD31 was confirmed by FACS about each enzyme reaction liquid (conditions A, B, C, D, E, or F). The method of FACS was performed in the same manner as described above in Example 2. The experimental sequence is shown below.
（実験系列）
その結果を図３に示す。酵素組成により、回収できる細胞集団の比率が変わることが分かった。条件Ｂが最も、血管内皮（前駆）細胞の比率が高かった。 The results are shown in FIG. The enzyme composition was found to change the proportion of recoverable cell populations. Condition B had the highest ratio of vascular endothelial (progenitor) cells.
実施例３：MACS による溶血処理後SVFに含まれる細胞集団の比率調査
＜実施例３の酵素反応液の調製＞
表１（Collagenase basal 2x mixの調製）に従って、Collagenase basal 2x mixを調製した。
下記条件A-Dの酵素反応液を調製した。
Example 3: Probing ratio of cell population included in SVF after hemolytic treatment by MACS <Preparation of enzyme reaction solution of Example 3>
According to Table 1 (Preparation of Collagenase basal 2x mix), Collagenase basal 2x mix was prepared.
An enzyme reaction solution was prepared under the following conditions AD.
その結果を以下の表に示す。
FACSの場合と同様に、血管内皮（前駆）細胞の比率（MACS:CD45陰性かつCD31陽性細胞の比率）は、条件Bが高かった。 As in the case of FACS, the ratio of vascular endothelial (progenitor) cells (MACS: CD45 negative and CD31 positive cells) was higher in condition B.
実施例４：MACSによる脂肪組織由来血管内皮（前駆）細胞（EC細胞）の純化
実施例１に記載した酵素処理条件を以下の条件とした場合のSVFを用いて、MACSによる脂肪組織由来血管内皮（前駆）細胞（EC細胞）の純化を行った。SVF回収時をPassage number P0とする。
Example 4 Purification of Adipose Tissue-Derived Vascular Endothelial (Progenitor) Cells (EC Cells) by MACS A Fat Tissue-Derived Vascular Endothelium by MACS Using SVF When the Enzyme Treatment Conditions Described in Example 1 Are Under the Following Conditions Purification of (progenitor) cells (EC cells) was performed. The SVF recovery time is Passage number P0.
SVF回収時をPassage number P0とする。
（１）MACSによるCD45-/CD31+細胞集団回収
ミルテニー社MACSのプロトコールどおりに以下の通り行なった。
有核細胞数をカウント後、MACSに掛ける細胞を15 mLコニカルチューブに分注した。1x10^7個生存有核細胞を1カラムに掛けることを目安とした。遠心分離（300G, 3分, 4℃）を行った。細胞ペレットを80 μLのMACS bufferに穏やかに懸濁した。20μLのCD45マイクロビーズを添加し、穏やかにピペッティングした。CD45抗体との反応を15分、4℃で行った。1 mLのMACS bufferを添加し、タッピングにより液体混和をした。遠心分離（300G, 3分, 4℃）を行った。細胞ペレットを0.5 mLのMACS bufferに再懸濁し、4℃で待機させた。ミルテニー社のMSカラムをセパレーターにセットし、カラムを0.5 mL MACS bufferで1回洗浄した。カラム洗浄後すぐにCD45マイクロビーズ処理した細胞懸濁液をカラムに添加した。フロースルー分画をCD45-細胞集団として回収した。磁気カラムに補足され、セパレーターからのカラム離脱後にフラッシュで溶出される分画をCD45+細胞集団として回収した。
The SVF recovery time is Passage number P0.
(1) Recovery of CD45- / CD31 + Cell Populations by MACS The following procedure was performed according to the protocol of Milteny MACS.
After counting the number of nucleated cells, cells to be subjected to MACS were aliquoted into 15 mL conical tubes. As a guide, 1 × 10 ^ 7 viable nucleated cells were applied to one column. Centrifugation (300 G, 3 minutes, 4 ° C.) was performed. The cell pellet was gently suspended in 80 μL of MACS buffer. 20 μL of CD45 microbeads were added and gently pipetted. The reaction with CD45 antibody was performed at 4 ° C. for 15 minutes. 1 mL of MACS buffer was added and mixed by tapping. Centrifugation (300 G, 3 minutes, 4 ° C.) was performed. The cell pellet was resuspended in 0.5 mL MACS buffer and allowed to stand at 4 ° C. The Milteny MS column was set as a separator, and the column was washed once with 0.5 mL MACS buffer. Immediately after column washing, CD45 microbead treated cell suspension was added to the column. Flow-through fractions were collected as CD45- cell populations. Fractions that were captured on a magnetic column and flashed out after separation from the separator were collected as a CD45 + cell population.
CD45-細胞集団を遠心分離（300G, 3分, 4℃）した。細胞ペレットを60μLのMACS bufferに穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液に20μLのFc receptor (FcR) block reagentを添加し、2-3秒ボルテックスした。20μLのCD31マイクロビーズを添加して、穏やかにピペッティングした。CD31抗体反応を15分、4℃で行った。1 mLのMACS bufferを添加、タッピングにより液体混和をした。遠心分離（300G, 3分, 4℃）を行った。細胞ペレットを0.5 mLのMACS bufferに再懸濁し、4℃で待機させた。ミルテニー社の新品のMSカラムをセパレーターにセットし、カラムを0.5 mL MACS bufferで1回洗浄した。カラム洗浄後すぐにCD31マイクロビーズ処理した細胞懸濁液をカラムに添加した。0.5 mLのMACS bufferを3回カラムに通した。フロースルーをCD45-/CD31-細胞集団として回収した（脂肪幹細胞を多く含む）。磁気カラムに補足され、セパレーターからのカラム離脱後にフラッシュで溶出される分画をCD45-/CD31+細胞集団として回収した（血管内皮（前駆）細胞を多く含む）。CD45-/CD31+細胞集団を遠心分離（300G, 3分, 4℃）した。 The CD45-cell population was centrifuged (300 G, 3 min, 4 ° C.). The cell pellet was gently resuspended in 60 μL of MACS buffer. To the cell suspension, 20 μL of Fc receptor (FcR) block reagent was added and vortexed for 2-3 seconds. Add 20 μL of CD31 microbeads and pipet gently. The CD31 antibody reaction was performed at 4 ° C. for 15 minutes. Add 1 mL of MACS buffer and mix by tapping. Centrifugation (300 G, 3 minutes, 4 ° C.) was performed. The cell pellet was resuspended in 0.5 mL MACS buffer and allowed to stand at 4 ° C. A new Miltenyi MS column was set on the separator, and the column was washed once with 0.5 mL MACS buffer. Immediately after column washing, the cell suspension treated with CD31 microbeads was added to the column. 0.5 mL of MACS buffer was passed through the column three times. The flow through was collected as a CD45- / CD31- cell population (rich in adipose stem cells). The fractions that were captured on the magnetic column and eluted in the flash after separation from the separator were collected as a CD45- / CD31 + cell population (containing a large number of vascular endothelial (progenitor) cells). The CD45- / CD31 + cell population was centrifuged (300 G, 3 minutes, 4 ° C.).
MACS操作の直後に下記3種類の細胞集団をCD45/CD31/CD34でFACSし、各細胞集団のpopulationの違い、特に血管内皮（前駆）細胞と脂肪幹細胞の比率を確認した。
（細胞集団）
1. 溶血処理後（MACS未処理）SVF
2. CD45-/CD31+細胞集団
3. CD45-/CD31+細胞集団
FACSの方法、実施例2と同様のプロトコールで行った。
以下に実験系列を示す。
（実験系列）
Immediately after the MACS operation, the following three cell populations were subjected to FACS with CD45 / CD31 / CD34 to confirm differences in the population of each cell population, in particular, the ratio of vascular endothelial (progenitor) cells to adipose stem cells.
(Cell population)
1. Post hemolysis treatment (MACS not processed) SVF
2. CD45- / CD31 + cell population
3. CD45- / CD31 + cell population
It carried out by the method of FACS and the same protocol as Example 2.
The experimental sequence is shown below.
(Experimental series)
上記したMACSによる純化の効果をFACSで確認した結果を、図４に示す。 The result of having confirmed the effect of the above-mentioned purification by MACS by FACS is shown in FIG.
（２）細胞の培養
EGM-2培地に、上記で得たCD45-/CD31+細胞集団を再懸濁し、カウントした。Luna-stemで有核細胞数および細胞生存率をカウントした。1x10４個生存有核細胞/0.25 mL EGM-2培地/cm2で細胞懸濁し、播種した。CD45-/CD31+細胞集団の細胞懸濁液の一部を表９条件Bとして、FACSした。以下、条件A-Hは、表９に示す培養スケジュール条件に該当する。培養（EGM-2培地）（P0）は、４日間、又は７日間、37℃、5% CO2、培地交換2日おきに行った。また、溶血処理後SVFの細胞懸濁液の一部を条件Aとして、FACSした。
細胞培養のスケジュールを下記の表に示す。
(2) Cell culture
The CD45- / CD31 + cell population obtained above was resuspended in EGM-2 medium and counted. The number of nucleated cells and cell viability were counted with Luna-stem. The cells were suspended and seeded at 1 × 10 4 viable nucleated cells / 0.25 mL EGM-2 medium / cm 2 . A portion of the cell suspension of the CD45- / CD31 + cell population was FACS as Table 9 Condition B. Hereinafter, the condition AH corresponds to the culture schedule conditions shown in Table 9. Culturing (EGM-2 medium) (P0) was performed at 37 ° C., 5% CO 2, medium change every 2 days for 4 days or 7 days. In addition, a part of the cell suspension of SVF after hemolysis treatment was subjected to FACS as Condition A.
The cell culture schedule is shown in the table below.
2回目のMACSを培養4日目と培養７日目で行うため、培養4日目と培養７日目で下記の細胞剥離、分散操作を行った。細胞を、HBSS（37℃）で洗浄後、1x TrypLE express (37℃)を適量（3 mL TrypLE express/25 cm2）添加し、37℃、5% CO25分間で細胞剥離させた。EGM-2培地で反応停止、遠心分離（300G, 5分、4℃）で細胞ペレットを得た。有核細胞数をLuna stemでカウントした。培養4日目の細胞懸濁液の一部を条件Cとして、培養7日目の細胞懸濁液の一部を条件FとしてFACSした。 In order to perform the second MACS on the 4th and 7th culture days, the following cell detachment and dispersion operations were performed on the 4th and 7th culture days. After washing the cells with HBSS (37 ° C.), an appropriate amount (3 mL TrypLE express / 25 cm 2 ) of 1 × TrypLE express (37 ° C.) was added, and cell detachment was carried out at 37 ° C., 5% CO 2 for 5 minutes. The cell pellet was obtained by quenching with EGM-2 medium and centrifugation (300 G, 5 minutes, 4 ° C.). The number of nucleated cells was counted by Luna stem. Part of the cell suspension on day 4 of culture was subjected to condition C, and part of the cell suspension on day 7 of culture was subjected to FACS as condition F.
（３）MACS によるCD31+の細胞集団回収
細胞懸濁液を遠心分離（300G, 3分, 4℃）した。細胞ペレットを60μLのMACS bufferに穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液に20μLのFc receptor (FcR) block reagentを添加し、2-3秒ボルテックスした。20μLのCD31マイクロビーズを添加して、穏やかにピペッティングした。CD31抗体反応を15分、4℃で行った。1 mLのMACS bufferを添加、タッピングによる液体混和をした。遠心分離（300G, 3分, 4℃）を行った。細胞ペレットを0.5 mLのMACS bufferに再懸濁し、4℃で待機させた。ミルテニー社のMSカラムをセパレーターにセットし、カラムを0.5 mL MACS bufferで1回洗浄した。カラム洗浄後すぐにCD31マイクロビーズ処理した細胞懸濁液をカラムに添加した。0.5 mLのMACS bufferを3回カラムに通した。フロースルーをCD31-細胞集団として回収した（脂肪幹細胞を多く含む）。磁気カラムに補足され、セパレーターからのカラム離脱後にフラッシュで溶出される分画をCD31+細胞集団として回収した（血管内皮（前駆）細胞を多く含む）。CD31+細胞集団を遠心分離（300G, 3分, 4℃）した。培養4日目の細胞懸濁液をMACSした細胞懸濁液を条件Dとして、培養7日目の細胞懸濁液の一部を条件GとしてFACSした。
(3) Recovery of CD31 + Cell Population by MACS The cell suspension was centrifuged (300 G, 3 minutes, 4 ° C.). The cell pellet was gently resuspended in 60 μL of MACS buffer. To the cell suspension, 20 μL of Fc receptor (FcR) block reagent was added and vortexed for 2-3 seconds. Add 20 μL of CD31 microbeads and pipet gently. The CD31 antibody reaction was performed at 4 ° C. for 15 minutes. Add 1 mL of MACS buffer and mix by tapping. Centrifugation (300 G, 3 minutes, 4 ° C.) was performed. The cell pellet was resuspended in 0.5 mL MACS buffer and allowed to stand at 4 ° C. The Milteny MS column was set as a separator, and the column was washed once with 0.5 mL MACS buffer. Immediately after column washing, the cell suspension treated with CD31 microbeads was added to the column. 0.5 mL of MACS buffer was passed through the column three times. The flow through was collected as a CD31- cell population (rich in adipose stem cells). Fractions captured on a magnetic column and eluted in a flash after separation from the separator were collected as a CD31 + cell population (rich in vascular endothelial (progenitor) cells). The CD31 + cell population was centrifuged (300 G, 3 minutes, 4 ° C.). The cell suspension obtained by MACS of the cell suspension on day 4 of culture was subjected to FACS as a condition D, and part of the cell suspension on day 7 of the culture was subjected to condition G.
（４）細胞培養
2500個生存有核細胞/0.2 mL EGM2培地/cm２で細胞懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P1）を6日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換は2日おきに行った。80-90%コンフルエントまで培養した。培養4日目の細胞懸濁液をMACSした条件Dを培養した細胞集団を条件Eとして、培養7日目の細胞懸濁液をMACSした条件Gを培養した細胞集団を条件Hとして図5に検鏡像を示す。条件Eでは、血管内皮（前駆）細胞の純化は完了している。一方、条件Hでは、脂肪幹細胞の増加が確認でき、血管内皮（前駆）細胞は駆逐される傾向にあった。したがって、条件Eとなる培養スケジュールでのみ、血管内皮（前駆）細胞の純化が完了することを示す。
(4) Cell culture
The cells were suspended and seeded at 2500 viable nucleated cells / 0.2 mL EGM2 medium / cm 2 . The culture (EGM-2 medium) (P1) was performed for 6 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. It was cultured to 80-90% confluence. Cell population obtained by culturing condition D with MACS cell suspension on the 4th day is defined as condition E, and cell population obtained by culturing condition G obtained by MACS cell suspension on the 7th day is defined as condition H in FIG. The mirror image is shown. Under condition E, purification of vascular endothelial (progenitor) cells is complete. On the other hand, under condition H, an increase in adipose stem cells could be confirmed, and vascular endothelial (progenitor) cells tended to be destroyed. Therefore, it is shown that purification of vascular endothelial (precursor) cells is completed only in the culture schedule that results in condition E.
条件A-D及び条件F, Gの時点でのFACSによる解析結果及び、条件E及びHでの細胞の写真を図５に示す。 The analysis results by FACS at the time points of the conditions A to D and the conditions F and G and the photographs of the cells at the conditions E and H are shown in FIG.
比較例１：
比較のために、上記の実施例４において、酵素処理条件BでSVFの細胞集団を回収後、1回目のMACSを実施しなかった場合における細胞の写真を図６に示す。
Comparative Example 1:
For comparison, FIG. 6 shows a photograph of cells in the case where the first MACS was not performed after recovering the SVF cell population under the enzyme treatment condition B in Example 4 described above.
比較例２：
比較のために、上記の実施例４において、酵素処理条件BでSVFの細胞集団を回収後、1回目のMACSにより回収したCD45-/CD31+の細胞集団について、2回目のMACSを実施しなかった場合における細胞の写真を図７に示す。
Comparative example 2:
For comparison, in Example 4 above, after recovering the SVF cell population under the enzyme treatment condition B, the second MACS was not performed on the CD45 − / CD 31 + cell population recovered by the first MACS. A picture of the cells in the case is shown in FIG.
実施例５：
実施例５は、純化したEC細胞を細胞増殖し大量に獲得するための細胞培養および継代ステップである。
Example 5:
Example 5 is a cell culture and passaging step to proliferate and obtain large amounts of purified EC cells.
実施例４条件Eの細胞を、上記と同様に、細胞を剥離分散した。2500個生存有核細胞/0.2 mL EGM2培地/cm2で細胞懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P2）を5-6日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換2日おきに行った。80-90%コンフルエントまで培養した。 Example 4 Condition E cells were exfoliated and dispersed as described above. The cells were suspended and seeded at 2500 viable nucleated cells / 0.2 mL EGM2 medium / cm 2 . The culture (EGM-2 medium) (P2) was performed for 5-6 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. It was cultured to 80-90% confluence.
上記と同様に、細胞を剥離分散した。2500個生存有核細胞/0.2 mL EGM2培地/cm2で細胞懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P3）を5-6日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換2日おきに行った。80-90%コンフルエントまで培養した。 The cells were detached and dispersed as described above. The cells were suspended and seeded at 2500 viable nucleated cells / 0.2 mL EGM2 medium / cm 2 . Culture (EGM-2 medium) (P3) was performed for 5-6 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. It was cultured to 80-90% confluence.
これにより得られた酵素処置条件Ｂについての細胞の写真を図８Aに示す。 A photograph of the cells for the enzyme treatment condition B thus obtained is shown in FIG. 8A.
（結果）
上記の結果から、溶血処理後SVF回収直後に、MACSによりCD45-/CD31+細胞集団を回収すること及び、2回目のMACSを培養4日で掛けることが好ましいことが判明した。
(result)
From the above results, it was found that it is preferable to recover the CD45- / CD31 + cell population by MACS and multiply the second MACS in culture for 4 days immediately after SVF recovery after hemolytic treatment.
実施例６
細胞保存液（80% EGM-2, 10% 非働化済FBS, 10% DMSO）に、実施例５で得られた細胞ペレットを懸濁した。凍結保存ユニットに入れて、-80℃ディープフリーザーで凍結した。さらに、気相式液体窒素タンクに移動し、極低温保存した。ここで保存した細胞は、極低温保存容器から取り出した直後に37℃ウォーターバスにて2分間温め、事前に温めておいたEGM-2培地に2500個生存有核細胞/0.2 mL EGM2培地/cm2で細胞懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P4）を5-6日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換を2日おきに行った。80-90%コンフルエントまで培養した。実施例4、5と同様に、細胞を剥離分散した。2500個生存有核細胞/0.25 mL EGM2培地/cm2で細胞懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P5）を5-6日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換2日おきに行った。80-90%コンフルエントまで培養した。以上の、純化された血管内皮（前駆）細胞の凍結、保存、起眠の工程を図８Ｂに示す。
Example 6
The cell pellet obtained in Example 5 was suspended in a cell preservation solution (80% EGM-2, 10% inactivated FBS, 10% DMSO). It was placed in a cryopreservation unit and frozen in a -80 ° C deep freezer. Further, it was moved to a gas phase liquid nitrogen tank and stored at cryogenic temperature. The cells stored here are warmed in a 37 ° C. water bath for 2 minutes immediately after removal from the cryopreservation container, and 2500 viable nucleated cells / 0.2 mL EGM2 medium / cm in prewarmed EGM-2 medium The cells were suspended at 2 and seeded. The culture (EGM-2 medium) (P4) was performed for 5-6 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. It was cultured to 80-90% confluence. The cells were exfoliated and dispersed in the same manner as in Examples 4 and 5. The cells were suspended and seeded at 2500 viable nucleated cells / 0.25 mL EGM2 medium / cm 2 . The culture (EGM-2 medium) (P5) was performed for 5-6 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. It was cultured to 80-90% confluence. The above steps of freezing, storage and sleep of the purified vascular endothelial (progenitor) cells are shown in FIG. 8B.
細胞を融解し、2500個の生存有核細胞/0.2 mL EGM2培地/cm2で細胞を懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P4）を、5-6日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換は2日おきに行った。上記により、様々な用途に使用可能な血管内皮（前駆）細胞を得た。 The cells were thawed and suspended and seeded at 2500 viable nucleated cells / 0.2 mL EGM2 medium / cm 2 . Culture (EGM-2 medium) (P4) was performed for 5-6 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. By the above, vascular endothelial (progenitor) cells usable for various applications were obtained.
凍結保存後の細胞特性解析の結果を図９及び図１０に示す。
血管内皮（前駆）細胞の特徴的な性質の1つとして、マトリゲル上での培養によりチューブ状のネットワーク構造を形成することが知られている。これは、臍帯静脈血管内皮（前駆）細胞などの細胞特性解析に一般的に用いられる方法である。そこで、脂肪組織由来血管内皮（前駆）細胞（P5）がネットワーク構造を形成するかをnetwork formation assayにより確認した。比較条件として、ネットワーク構造を形成する臍帯静脈血管内皮（前駆）細胞（HUVEC）とやや弱くネットワーク構造を形成することが報告されている脂肪幹細胞を設定した。脂肪幹細胞は、SVFとして回収し、DMEM/F12/ペニシリンストレプトマイシン/10％非働化済FBS培地で継代培養することにより得られた細胞を使用した。
The results of cell property analysis after cryopreservation are shown in FIG. 9 and FIG.
As one of the characteristic properties of vascular endothelial (progenitor) cells, it is known that culture on Matrigel forms a tubular network structure. This is a commonly used method for cell characterization of umbilical vein endothelial (progenitor) cells and the like. Therefore, it was confirmed by network formation assay whether adipose tissue-derived vascular endothelial (progenitor) cells (P5) form a network structure. As a comparison condition, a fatty stem cell that has been reported to form a weak network structure with umbilical vein endothelial (precursor) cells (HUVEC) forming a network structure was set. Adipose stem cells were recovered as SVF, and cells obtained by subculturing in DMEM / F12 / penicillin streptomycin / 10% inactivated FBS medium were used.
下記にnetwork formation assayの方法を示す。
マトリゲルを4℃で一晩かけて融解した。氷上で冷やした96ウェルプレートにマトリゲルを50 mL/wellになるように添加した。37℃、5% CO2のインキュベーター内で30分以上静置し、マトリゲルをゲル化した。実施例6で得られた脂肪由来血管内皮（前駆）細胞（P4）、臍帯静脈血管内皮（前駆）細胞（P4）、及び脂肪幹細胞(P3)を実施例4、5と同様に細胞分散した。脂肪由来血管内皮（前駆）細胞及び臍帯静脈血管内皮（前駆）細胞は、5x103 viable cells/50 mL EGM-2/wellになるように細胞懸濁液を調製し、マトリゲル上に添加しP5とした。脂肪幹細胞（P2）は、5x103 viable cells/50 mL DMEM/F12/ペニシリンストレプトマイシン/10％非働化済FBS培地/wellになるように細胞懸濁液を調製し、マトリゲル上に添加しP3とした。37℃、5% CO2のインキュベーター内で、6時間培養後に倒立位相差顕微鏡で撮像した写真を図９に示す。
The method of network formation assay is shown below.
The Matrigel was thawed at 4 ° C. overnight. Matrigel was added to a 96-well plate cooled on ice so as to be 50 mL / well. The Matrigel was gelled by standing for 30 minutes or more in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . The adipose-derived vascular endothelial (precursor) cells (P4), umbilical vein endothelial (precursor) cells (P4), and adipose stem cells (P3) obtained in Example 6 were dispersed in the same manner as in Examples 4 and 5. Prepare cell suspension of fat-derived vascular endothelial (precursor) cells and umbilical vein vascular endothelial (precursor) cells at 5 × 10 3 viable cells / 50 mL EGM-2 / well, add on Matrigel, and did. A cell suspension was prepared so that the adipose stem cells (P2) were 5 × 10 3 viable cells / 50 mL DMEM / F12 / penicillin streptomycin / 10% inactivated FBS medium / well, and added onto Matrigel to obtain P3. . A photograph taken with an inverted phase contrast microscope after 6 hours of culture in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator is shown in FIG.
（結果）
脂肪組織由来血管内皮（前駆）細胞（P5）は、臍帯静脈血管内皮（前駆）細胞と同等のチューブ状のネットワーク構造を形成した。
(result)
Adipose tissue-derived vascular endothelial (precursor) cells (P5) formed a tubular network structure equivalent to umbilical vein vascular endothelial (progenitor) cells.
細胞蛍光免疫染色の手順を以下に示す。
PBSの調製：137 mM NaCl/2.7 mM KCl/10 mM Na2HPO4/1.8 mM KH2PO4/MiliQ水になるように調製した。10 mM グリシン/PBSになるように調製した。0.1% Triton X-100/PBSになるように調製した。3% BSA/PBS、1% BSA/PBS、及び0.1% BSA/PBSを調製した。サンプル群としてCD31抗体、及びコントロール群としてNormal Mouse IgG抗体を 10 μg/mLの濃度で1% BSA/PBSに希釈し、1次抗体反応液を調製した。Alexa-488 goat anti-mouse IgG1抗体を% BSA/PBSで1000倍希釈し、2次抗体反応液を調製した。DAPIをPBSで2000倍希釈し、核染色反応液を調製した。
The procedure of cytofluorescent immunostaining is shown below.
Preparation of PBS: It was prepared to be 137 mM NaCl / 2.7 mM KCl / 10 mM Na 2 HPO 4 /1.8 mM KH 2 PO 4 / MiliQ water. It was prepared to be 10 mM glycine / PBS. It was prepared to be 0.1% Triton X-100 / PBS. 3% BSA / PBS, 1% BSA / PBS, and 0.1% BSA / PBS were prepared. A primary antibody reaction solution was prepared by diluting CD31 antibody as a sample group and Normal Mouse IgG antibody as a control group at a concentration of 10 μg / mL in 1% BSA / PBS. Alexa-488 goat anti-mouse IgG1 antibody was diluted 1000 times with% BSA / PBS to prepare a secondary antibody reaction solution. DAPI was diluted 2000-fold with PBS to prepare a nuclear staining reaction solution.
実施例７
実施例６と同様に血管内皮（前駆）細胞（P4）及び臍帯静脈内皮細胞（P4）を細胞分散後、4ウェルチャンバースライドに2500個生存有核細胞/0.2 mL EGM2培地/cm2で細胞懸濁し、播種した。培養（EGM-2培地）（P5）を4日間、37℃、5% CO2で行った。培地交換を2日おきに行った。培地を除去して、4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液0.4 mL/wellで10分間、室温で細胞固定した。10 mM グリシン/PBS液、1 mL/wellで5分間、3回、室温で洗浄した。10 mM グリシン/PBS液を除去し、0.1% Triton X-100/PBS 0.4 mL/wellで5分間、室温で透過処理した。PBS 1 mL/wellで5分間、3回、室温で洗浄した。PBSを除去し、3% BSA/PBS 0.4 mL/wellで10分間、室温でブロッキング処理した。3% BSA/PBSを除去し、PBS 1 mL/wellで5分間、室温で洗浄した。1次抗体反応液のサンプル群及びコントロール群を 0.25 mL/well添加し、4℃、一晩、湿潤下、遮光でインキュベートした。0.1% BSA/PBS 1mL/wellで5分間、3回、室温で洗浄した。2次抗体反応液を0.25 mL/well添加し、20分間、室温、湿潤下、遮光でインキュベートした。0.1% BSA/PBS 1mL/wellで5分間、3回、室温で洗浄した。核染色反応液を0.25 mL/well添加し、5分間、室温、湿潤下、遮光でインキュベートした。PBS 1mL/wellで5分間、1回、室温で洗浄した。VECTA shieldを封入し、24時間、室温で封入剤を固化した。共焦点顕微鏡で撮像した。撮像の結果を図１０に示す。
Example 7
After dispersing the vascular endothelial (progenitor) cells (P4) and umbilical vein endothelial cells (P4) in the same manner as in Example 6, the cells were suspended in 2500 viable nucleated cells / 0.2 mL EGM2 medium / cm 2 in a 4-well chamber slide. It became cloudy and sowed. The culture (EGM-2 medium) (P5) was performed for 4 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Medium change was performed every two days. The medium was removed and cells were fixed with 0.4 mL / well of 4% paraformaldehyde phosphate buffer for 10 minutes at room temperature. The cells were washed 3 times with 10 mM glycine / PBS solution, 1 mL / well for 5 minutes at room temperature. The 10 mM glycine / PBS solution was removed and permeabilized with 0.1% Triton X-100 / PBS 0.4 mL / well for 5 minutes at room temperature. Washed 3 times with PBS 1 mL / well for 5 minutes at room temperature. The PBS was removed and blocked with 3% BSA / PBS 0.4 mL / well for 10 minutes at room temperature. The 3% BSA / PBS was removed and washed with 1 mL PBS / well for 5 minutes at room temperature. A sample group of the primary antibody reaction solution and a control group were added at 0.25 mL / well, and incubated at 4 ° C. overnight in the dark, protected from light. The cells were washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA / PBS 1 mL / well at room temperature. The secondary antibody reaction solution was added at 0.25 mL / well, and incubated for 20 minutes at room temperature, moist, and protected from light. The cells were washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA / PBS 1 mL / well at room temperature. The nuclear staining reaction solution was added at 0.25 mL / well, and incubated for 5 minutes at room temperature, moist, and protected from light. The plate was washed once with PBS 1 mL / well for 5 minutes at room temperature. The VECTA shield was sealed and the mounting medium was allowed to solidify at room temperature for 24 hours. Images were taken with a confocal microscope. The results of imaging are shown in FIG.
（結果）
細胞蛍光免疫染色法による細胞特性解析。血管内皮（前駆）細胞マーカーであるCD31と核染色により、継代培養を繰り返した血管内皮（前駆）細胞（P5）の細胞形態を確認した。
(result)
Cell characterization by cytofluorescent immunostaining. The cellular morphology of vascular subendothelial (progenitor) cells (P5) subjected to repeated passage was confirmed by nuclear staining with CD31, which is a vascular endothelial (precursor) cell marker.
実施例８：ヒト脂肪組織由来の血管内皮前駆細胞を純化する培養方法（新方式）
吸引および破砕した皮下脂肪組織25〜200 gを回収した。
酵素処理（酵素組成1：0.2% コラゲナーゼ+1000 U/mL DNase1＋3 mM CaCl2+HBSS）、及び遠心により脂肪組織から間質血管細胞群（SVF、血管内皮前駆細胞に加え、脂肪幹細胞など他の細胞も含む混合物）を調製した。この時、SVFは、脂肪1g当たり2〜10×105有核細胞を取得する。
細胞を培養用プラスチック容器（培養フラスコ等）に播種した。播種密度は、5x104有核細胞/cm2（5×103 〜5×105 有核細胞/ cm2）とし、培地としては、0.2 mL/cm2（0.02〜20 mL/cm2）の血管内皮細胞培養用培地（例えばEGM-2またはEGM2MV、ロンザ社）を使用した。
SVFを血管内皮細胞培養用培地で2日間（1.0時間から5日間であればよい）培養した。
Example 8 Culture Method for Purifying Vascular Endothelial Progenitor Cells Derived from Human Adipose Tissue (New Method)
Twenty-five to two hundred grams of aspirated and crushed subcutaneous adipose tissue was collected.
Enzyme treatment (enzyme composition 1: 0.2% collagenase + 1000 U / mL DNase 1 + 3 mM CaCl 2 + HBSS), and centrifugation from adipose tissue to interstitial vascular cell group (SVF, vascular endothelial progenitor cells, other cells such as adipose stem cells) (A mixture that also contains At this time, SVF obtains 2 to 10 × 10 5 nucleated cells per 1 g of fat.
The cells were seeded in a culture plastic container (culture flask etc.). The seeding density is 5 × 10 4 nucleated cells / cm 2 (5 × 10 3 to 5 × 10 5 nucleated cells / cm 2 ), and the culture medium is 0.2 mL / cm 2 (0.02 to 20 mL / cm 2 ) A culture medium for vascular endothelial cell culture (eg, EGM-2 or EGM2MV, Lonza) was used.
SVF was cultured in the vascular endothelial cell culture medium for 2 days (1.0 to 5 days may be sufficient).
培養SVFは細胞分散液を用いて培養容器から分散させ、SVF細胞集団の細胞懸濁液を得た。SVF細胞集団から、MACSによりCD31陽性の細胞を選別することによりCD31陽性の細胞を含む細胞集団（CD31陽性細胞集団）を取得した。このとき、MACS操作は、CD31マイクロビーズによる選別を2回繰り返し行うことで純度をさらにあげることができる（CD31+/CD31+細胞を回収する。） Culture SVF was dispersed from the culture vessel using a cell dispersion to obtain a cell suspension of the SVF cell population. From the SVF cell population, a cell population containing CD31 positive cells (CD31 positive cell population) was obtained by sorting CD31 positive cells by MACS. At this time, the MACS operation can further increase the purity by repeating selection with CD31 microbeads twice (CD31 + / CD31 + cells are recovered).
CD31陽性細胞集団を培養用プラスチック容器（培養フラスコ等）に播種した。播種密度は、5×104有核細胞/cm2（5×103〜5×105 有核細胞/ cm2）とし、培地としては、0.2 mL/cm2（0.02〜20 mL/cm2）の血管内皮細胞培養用培地（例えばEGM-2またはEGM2MV、ロンザ社）を使用した。CD31陽性細胞集団を血管内皮細胞培養用培地で3日間（1時間 から 7日間であればよい）培養した。 The CD31 positive cell population was seeded in a plastic container for culture (such as a culture flask). The seeding density is 5 × 10 4 nucleated cells / cm 2 (5 × 10 3 to 5 × 10 5 nucleated cells / cm 2 ), and the culture medium is 0.2 mL / cm 2 (0.02 to 20 mL / cm 2). Medium for endothelial cell culture (eg, EGM-2 or EGM2MV, Lonza) was used. The CD31 positive cell population was cultured in the vascular endothelial cell culture medium for 3 days (one hour to 7 days may be sufficient).
培養CD31陽性細胞集団は細胞分散液を用いて、培養容器から分散させ、CD31陽性細胞集団の細胞懸濁液を得た。MACSにより更にCD31陽性の細胞を選別することによりCD31陽性の細胞を高効率で含む細胞集団（高純度CD31陽性細胞集団）を取得した。このとき、MACS操作は、CD31マイクロビーズによる選別を2回繰り返し行うことで純度をさらに上げることもできる。このとき、フローサイトメトリ解析によりCD45陰性・CD31陽性・CD146陽性細胞の比率が90%以上である細胞集団を高純度CD31陽性細胞集団（血管内皮前駆細胞）とした。 The cultured CD31 positive cell population was dispersed from the culture vessel using a cell dispersion to obtain a cell suspension of the CD31 positive cell population. By further sorting CD31 positive cells by MACS, a cell population (high purity CD31 positive cell population) containing CD31 positive cells with high efficiency was obtained. At this time, the MACS operation can further increase the purity by repeating the selection with CD31 microbeads twice. At this time, a cell population in which the ratio of CD45 negative / CD31 positive / CD146 positive cells is 90% or more by flow cytometry analysis was defined as a high purity CD31 positive cell population (blood vessel endothelial precursor cells).
増幅するために、高純度CD31陽性細胞集団を培養用プラスチック容器（培養フラスコ等）に播種した。播種密度は、5x104有核細胞/cm2（5×103〜5×105 有核細胞/ cm2）とし、培地としては、0.2 mL/cm2（0.02〜20 mL/cm2）の血管内皮細胞培養用培地（例えばEGM-2またはEGM2MV、ロンザ社）を使用した。5日間（2日〜10日間であればよい）培養し、高純度CD31陽性細胞集団を継代した。播種密度は、2.5×103有核細胞/cm2（2.5×102 〜2.5×105 有核細胞/ cm2）とし、培地としては、0.2 mL/cm2（0.02〜20 mL/cm2）の血管内皮細胞培養用培地（例えばEGM-2またはEGM2MV、ロンザ社）を使用した。
以上により、純化された脂肪組織由来血管内皮（前駆）細胞を取得した（図１１）。
For amplification, high purity CD31 positive cell populations were seeded in culture plastic containers (such as culture flasks). The seeding density is 5 × 10 4 nucleated cells / cm 2 (5 × 10 3 to 5 × 10 5 nucleated cells / cm 2 ), and the culture medium is 0.2 mL / cm 2 (0.02 to 20 mL / cm 2 ) A culture medium for vascular endothelial cell culture (eg, EGM-2 or EGM2MV, Lonza) was used. The cells were cultured for 5 days (only 2 days to 10 days), and the high purity CD31 positive cell population was passaged. The seeding density is 2.5 × 10 3 nucleated cells / cm 2 (2.5 × 10 2 to 2.5 × 10 5 nucleated cells / cm 2 ), and the culture medium is 0.2 mL / cm 2 (0.02 to 20 mL / cm 2). Medium for endothelial cell culture (eg, EGM-2 or EGM2MV, Lonza) was used.
Thus, the purified adipose tissue-derived vascular endothelial (progenitor) cells were obtained (FIG. 11).
Claims (13)
であって、前記細胞集団におけるＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性の血管内皮（前駆）細胞の割合が９２％以上であり、前記細胞集団における脂肪幹細胞の割合が８％以下である、細胞集団。 A cell population comprising vascular endothelial (precursor) cells and fat stem cells, wherein the percentage of CD45 negative and CD31 positive vascular endothelial (precursor) cells in the cell population is 92% or more, and fat stem cells in the cell population A cell population whose proportion is 8% or less.
（２）前記（１）の工程で取得した細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
（３）前記（２）の工程で得たＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を１時間〜７．０日間培養する工程；及び
（４）前記（３）の工程で得た細胞集団からＣＤ３１陽性の細胞を選別することによりＣＤ３１陽性の細胞を含む細胞集団を取得する工程；
を含む、血管内皮（前駆）細胞を含む細胞集団の製造方法。 (1) treating adipose tissue with an enzyme to obtain a cell population comprising at least vascular endothelial (progenitor) cells and adipose stem cells;
(2) obtaining a cell population containing CD31 positive cells by sorting out CD31 positive cells from the cell population obtained in the step (1);
(3) culturing the cell population containing the CD31 positive cells obtained in the step of (2) for 1 hour to 7.0 days; and (4) CD31 positive from the cell population obtained in the step of (3) above Obtaining a cell population containing CD31 positive cells by sorting out the cells of
A method of producing a cell population comprising vascular endothelial (progenitor) cells, comprising
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