JP2019085376A - 犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移の予防のためのがんペプチドワクチン - Google Patents
犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移の予防のためのがんペプチドワクチン Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1] 配列番号4〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、犬のDLA-88抗原と結合して犬のがん細胞を標的とするCTLを誘導し得るペプチド。
[2] 特定のDLA-88型に結合し、そのDLA-88型を有する犬のがん細胞を標的とするCTLを誘導し得る、[1]のペプチド。
[3] がんが、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ(悪性黒色腫)、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫からなる群から選択される[1]または[2]のペプチド。
[4] [1]〜[3]のいずれかのペプチドを含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移予防のためのがんぺプチドワクチン。
[5] 罹患犬のDLA-88型を決定する工程、そのDLA-88型が提示することができるペプチドを配列番号4〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの中から選択する工程、および選択したペプチドを投与する工程を含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移を防止する方法。
[6] がんが、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ(悪性黒色腫)、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫からなる群から選択される[5]の方法。
MPREEAHFI (ml-01)(配列番号4)、
LLIACWYCR (ml-41)(配列番号5)、
LRGRCPHEG (ml-70)(配列番号6)、
FQESNCELV (ml-88)(配列番号7)、
LVVPNAPPA (ml-95)(配列番号8)、および
AEQSSPPYL (ml-109)(配列番号9)
MGAPTLPPA (sv-01)(配列番号10)、
WQPFLKDHR (sv-10)(配列番号11)、
ISTFKNWPF (sv-19)(配列番号12)、
FCFKELEGW (sv-59)(配列番号13)、
SVKKQFEEL (sv-58)(配列番号14)、および
KKQFEELTLG (sv-90)(配列番号15)
AMSPLGWGL (trp-1)(配列番号16)、
MAKECCPPL (trp-2)(配列番号17)、
WTGHDCNQR (trp-3)(配列番号18)、
LERDLQQLI (trp-4)(配列番号19)、
ARQDDPTLI (trp-5)(配列番号20)、
DDYNRRVTL (trp-6)(配列番号21)、
KDIQDCLSL (trp-7)(配列番号22)、
SQVMSLHNL (trp-8)(配列番号23)、
LHNLVHSFL (trp-9)(配列番号24)、
FPPVTNEEL (trp-10)(配列番号25)、
VLFFLQYRR (trp-11)(配列番号26)、および
LMETHLSDR (trp-12)(配列番号27)
MPREEAHFI (ml-01):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*508:01、*029:01、*nov25、*012:01、*028:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*017:01、*501:01、*005:01、*051:01、*nov24
LLIACWYCR (ml-41):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*029:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*012:01、*028:01、*nov8、*502:01、*nov17、*004:02、*032:01、*nov6
LRGRCPHEG (ml-70):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*nov25、*001:03、*005:01、*nov15、*nov17
FQESNCELV (ml-88):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01、*029:01、*nov15
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*nov25
LVVPNAPPA (ml-95):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*508:01、*006:01、*nov9
AEQSSPPYL (ml-109):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01、
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*001:03、*nov8、*502:01
MGAPTLPPA (sv-01):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*003:02、*017:01、*012:01、*029:01、*028:01、*nov37
低親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01、*006:01、*004:02、*nov3、*045:01、*038:01
WQPFLKDHR (sv-10):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*034:01、*006:01、*012:01、*029:01、*028:01、*004:02、*nov3
低親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01、*502:01、*012:02
ISTFKNWPF (sv-19):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*006:01、*nov25
低親和性のDLA-88型
DLA-88*002:01
FCFKELEGW (sv-59):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*003:02、*017:01、*029:01、*004:02
低親和性のDLA-88型
DLA-88*012:01、*028:01
SVKKQFEEL (sv-88):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*029:01、*028:01、*045:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*nov25、*nov18
KKQFEELTLG (sv-90):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*003:02、*017:01、*006:01、*012:01、*502:01、
低親和性のDLA-88型
DLA-88*nov25、*001:03、*nov4
AMSPLGWGL (trp-1):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*034:01
MAKECCPPL (trp-2):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*034:01、*045:01
WTGHDCNQR (trp-3):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*028:01、*001:03、*nov8、*012:01、*017:01
LERDLQQLI (trp-4):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*508:01、*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*012:01、*005:01、*501:01
ARQDDPTLI (trp-5):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*051:01、*001:03
低親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*029:01、*508:01、*028:01、*034:01
DDYNRRVTL (trp-6):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*508:01、*501:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*051:01、*006:01、*012:01
KDIQDCLSL (trp-7):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*001:03、*nov8
SQVMSLHNL (trp-8):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*508:01
LHNLVHSFL (trp-9):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*028:01、*nov8、*039:01
FPPVTNEEL (trp-10):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*nov8
VLFFLQYRR (trp-11):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01、*006:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*029:01、*051:01、*028:01、*003:02、*017:01、*005:01
LMETHLSDR (trp-12):
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*029:01、*508:01、*028:01、*039:01
低親和性のDLA-88型
DLA88*006:01、*001:03、*012:01、*003:02、*017:01、*nov19
1. 犬の末梢血液単核球(PBMC)
日本獣医生命科学大学付属動物医療センターにおける患畜犬の血液検査後の残量分(廃棄対象)を用いた。なお、患畜犬(罹患犬)血液の活用については、日本獣医生命科学大学付属動物医療センター倫理委員会において承認を得ている(H24.5/8)。犬血液(200〜800μL)からのPBMC分離は、血液分離溶液Lymphoprep(STEMCELL)2mLを入れた15mL用遠心チューブ(TrueLine)を用いて、密度勾配遠心(800G、15〜20分)後、単核球分画の回収によって得た。
GenBank登録上の犬melan-A(NM_001194968)、犬survivin(AY741504)、犬TRP-2(AB766380)情報からのアミノ酸配列を入手し、プロテアソーム活性による切断部位の検索サイト(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/cleavage.html)および各種MHC分子における提示されうるペプチドの検索サイト(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)を用いて、犬DLA-88型への提示に予測されるペプチド配列をデザインした。melan-Aについては表1に、survinvinについては表2に、TRP-2については表3に示す。これらのペプチド配列は受託サービス(Biologica)にて精製度95%以上で合成した。
PBMCにFITC標識抗犬CD8抗体(Serotec)を4℃、30分間反応させ、リン酸緩衝液(PBS)で洗浄後、同様にBiotin標識抗FITC抗体(BioLegend)を4℃、30分間反応させ、PBSで洗浄した。これらの細胞にStreptavidin標識磁気ビーズ抗体(BDIMag Particles Plus DM)を4℃、15分間反応させた後、RPMI培養液で600μLまでメスアップし、専用のマグネットスタンドに6分間作用させ、CD8+T細胞(精製度90%前後)を収集し、細胞数を調節した(3〜4x104/well x 6wellまたは12well)。
PBMCを得られた細胞数に応じて平底96wellプレート(Thermo)の6wellまたは12well分に分注し(105/well)、5%CO2、37℃で40〜60分間反応させ、プレート接着細胞(4〜5x104/well)を準備した。接着しなかった細胞は回収し、DNA精製後、凍結保存した。プレート接着細胞に犬リコンビナントGM-CSF 5ng/mL(PrimeGene)、犬リコンビナントIL-4 5ng/mL (Immunotechnology Co.)と各種合成ペプチド 10μg/mLとなるように各wellに添加して90〜120分間の培養により抗原提示細胞(APC)へと分化誘導させた。これらのAPC はX線照射 30 Gy(CP-160型 Faxitron X-ray)により増殖活性を消失させた。
増殖活性を消失させたAPCと精製したCD8+T細胞を混合培養し、10日前後で誘導されるCTL誘導の有無を経時的に鏡検し判定した(図4)。すなわち、犬末梢血は大学付属動物医療センターより検査後の余剰分を入手し、その末梢血単核球(PBMC)から磁気ビーズ抗体を用いてCD8+T細胞とプレート接着細胞に分離後、プレート接着細胞に犬リコンビナントGM-CSF/IL-4と合成ペプチドを添加して抗原提示細胞(APC)へと分化誘導させた。精製したCD8+T細胞とX線照射により増殖活性を消失させたAPCとを混合培養し、CD8+T細胞の活性化の有無を経時的に観察した。入手した検体の血液量および精製したCD8+T細胞の数に応じて、実施する項目数を調整した。
図5にCTL誘導を有するmelan-Aペプチドのスクリーニングの結果の例を示す。
DLA-12型は数種類しかないが、DLA-12領域においてDLA-88型が入り込むケースが検出された。そのため、DLA-88またはDLA-12領域のみを同時に増幅させるプライマーにより、それら遺伝子全領域(プロモーター領域から全てのエクソンとイントロンおよび非翻訳領域)を含む5.6〜5.7kbのPCR産物を得た。その後、DLA-88特異的プライマーならびにDLA-12特異的プライマーを用いて、PCR産物を鋳型として多型に富むエクソン2〜エクソン3を含む1.6kbをPCR法により増幅させた。得られるPCR産物の塩基配列をサンガー法により解読した。
Melan-Aペプチド提示DLA型の同定
現在まで692検体解析して、Melan-Aについては57検体に6種ペプチドの何れかに対してCTL誘導能があることを認めた。これらの活性のあった検体のDLA-88型のタイピングを実施した結果、DLA-88型アレルと6種ペプチドの活性を記載した表が完成した(表4)。3回以上の頻度で検出されたDLA-88型は、高親和性として003:02、017:01、501:01、028:01、029:01、508:01、nov15*、nov25*の8種と、2回検出されたDLA-88型は、低親和性として001:03、004:02、005:01、006:01、012:01、032:01、051:01、502:01、nov6*、nov8*、nov9*、nov17*、nov24*の13種が判明した。
現在まで692検体解析して、Survivinについては81検体に6種ペプチドの何れかに対してCTL誘導能があることを認めた。これらの活性のあった検体のDLA-88型のタイピングを実施した結果、DLA-88型アレルと6種ペプチドの活性を記載した表が完成した(表5)。3回以上の頻度で検出されたDLA-88型は、高親和性として003:02、004:02、006:01、012:01、017:01、028:01、029:01、034:01、501:01、502:01、508:01、nov25*、nov37*の13種と、2回検出されたDLA-88型は、低親和性として001:03、012:02、038:01、045:01、nov3*、nov4*、nov18*の7種が判明した。
現在まで692検体解析して、TRP-2については66検体に12種ペプチドの何れかに対してCTL誘導能があることを認めた。これらの活性のあった検体のDLA-88型のタイピングを実施した結果、DLA-88型アレルと12種ペプチドの活性を記載した表が完成した(表6)。3回以上の頻度で検出されたDLA-88型は、高親和性として001:03、003:02、004:02、006:01、017:01、028:01、029:01、039:01、051:01、501:01、508:01、nov8*の12種と、2回検出されたDLA-88型は、低親和性として005:01、012:01、034:01、045:01、nov19*の5種が判明した(*;新規については系統樹解析により明らかにされる予定である)。表6に示すように、TRP-2ペプチドtrp-1〜trp-12を抗原提示できるDLA-88型を特定することができた。この表の見方を例として示すと、DLA-88*004:02型とDLA-88*029:01型はこれら12種のうち8種のペプチドを提示でき、DLA-88*004:02型はtrp-4、trp-5、trp-6、trp-7、trp-9、trp-10、trp-11、trp-12を、DLA-88*029:01型はtrp-3、trp-5、trp-6、trp-7、trp-8、trp-9、trp-11、trp-12をがんワクチンとして用いることができる。
Claims (6)
- 配列番号4〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、犬のDLA-88抗原と結合して犬のがん細胞を標的とする細胞傷害性T細胞を誘導し得るペプチド。
- 特定のDLA-88型に結合し、そのDLA-88型を有する犬のがん細胞を標的とする細胞傷害性T細胞を誘導し得る、請求項1記載のペプチド。
- がんが、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ(悪性黒色腫)、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱移行上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫からなる群から選択される請求項1または2に記載のペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドを含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移予防のためのがんぺプチドワクチン。
- 罹患犬のDLA-88型を決定する工程、そのDLA-88型が提示することができるペプチドを配列番号4〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの中から選択する工程、および選択したペプチドを投与する工程を含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移を防止する方法。
- がんが、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ(悪性黒色腫)、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫からなる群から選択される請求項5に記載の方法。
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