JP2019085372A - Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを用いた多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 コアフコ−スの有無にかかわらず、３〜６本鎖といった多分岐糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を調製する方法を提供すること。【解決手段】 多分岐糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、以下の工程（１）、工程（２）、工程（３）のいずれかを行うことを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法。（１）糖鎖の非還元末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する２本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体に対してＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）を用いてＧｌｃＮＡｃを付加して分岐型糖鎖とする工程（２）工程（１）の後に少なくとも１種の修飾酵素を作用させることによって糖鎖を修飾する工程（３）工程（１）または（２）の後に最終生成物を分離する工程【選択図】図２

Description

本発明は、多分岐糖鎖を有することを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法に関する。本発明で表している多分岐糖鎖とは、複合型糖鎖において、キトビオースユニットに結合したマンノース（Ｍａｎ）からα１−３またはα１−６の結合様式で結合したマンノース残基（β１−２の結合様式でＮ−アセチルグルコサミン［ＧｌｃＮＡｃ］が結合している）にβ１−４結合、あるいはβ１−６結合したＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも１つ以上有する糖鎖である。

糖タンパク質のＮ結合型糖鎖には、高マンノース型糖鎖（ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）にマンノースのオリゴマーが結合している糖鎖）；複合型糖鎖（ジアセチルキトビオースにマンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース（Ｇａｌ）、シアル酸（Ｓｉａ）の少なくとも１つが結合した糖鎖）；並びに混合（ｈｙｂｒｉｄ）型糖鎖（ジアセチルキトビオースに高マンノース型糖鎖と複合型糖鎖が混成している糖鎖）が存在する。構成糖、鎖長、結合様式等の違いによって様々な種類の糖鎖が存在し得る。

Ｎ結合型糖鎖の中には、糖タンパク質の機能発現に関わるものがあり、特に、糖鎖構造の違いが機能発現に重大な影響を及ぼす場合がある。例えば、免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ， ＩｇＧ）抗体の場合、２９７番目のアスパラギン残基にＮ結合型糖鎖が付加しているが、このアスパラギン残基に直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに、コアフコースとよばれるα１−６結合したフコース（Ｆｕｃ）が付加していない複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体は、非常に高い抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ， ＡＤＣＣ）を示すが、コアフコースが付加した複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体は、低いＡＤＣＣ活性を示すことが報告されている（非特許文献１）。

通常、抗体分子には様々な糖鎖が不均一に結合している。現在、がんなどの疾患治療薬（抗体医薬品）として多くの抗体が開発されているが、糖鎖に由来する抗体分子の不均一性は、医薬品としての力価や安定性にも影響を及ぼすことが考えられ、医薬品として十分な品質管理をする上で問題である。

抗体の機能解明の観点から、ＩｇＧ抗体に均一の糖鎖を結合させる糖鎖リモデリング法が試みられている（非特許文献２，３、特許文献１）。この方法は、最初にＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合型糖鎖を、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの一種であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の糖鎖を特異的に切断する活性を有するＥｎｄｏＳという酵素（非特許文献４）を用いて切断する。この際、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位である２９７番目のアスパラギンにはＮ−アセチルグルコサミンが一残基、あるいはコアフコースが結合した二残基が結合している。次に、このＩｇＧ抗体をアクセプター基質として、糖鎖の還元末端をオキサゾリン体にした糖鎖オキサゾリンをドナー基質として、ＥｎｄｏＳの糖鎖切断活性を抑制し、かつ糖鎖転移活性を保持するグライコシンターゼ化した変異体（ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ａ変異体、またはＤ２３３Ｑ変異体）を作用させる事によって、ＩｇＧ抗体へ均一の糖鎖を付加させる。

抗体機能の増強や新規機能の付与などを目指して、上記方法のような糖鎖改変技術を利用して、既存の抗体とは異なる構造をした糖鎖をもつ抗体を創製する試みが行われている（非特許文献５）。例えば、抗体医薬品として利用されているＩｇＧ抗体は、おもに２本鎖複合型糖鎖が結合しているが、均一なコアフコースつき３本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体が調製されている（非特許文献６）。

この調製方法は、まずエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの一種であるＥｎｄｏＦ３をリツキシマブに作用させて、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの結合したＮ−アセチルグルコサミンが残ったＩｇＧ抗体を調製する。つぎに、このＩｇＧ抗体をアクセプター基質として、均一な３本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３の糖鎖切断活性を抑制し、かつ糖鎖転移活性を強化させたグライコシンターゼ化した変異体（ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体）を作用させて、３本鎖複合型糖鎖が結合したリツキシマブを調製している。

ＥｎｄｏＦ３やその変異体は、基質特異性としてコアフコースを有する糖鎖構造に選択的に作用する。したがって、ＥｎｄｏＦ３やその変異体を用いた上述の糖鎖改変方法では、コアフコースを有しない３本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体は調製することができない。ＡＤＣＣ活性は、コアフコースが付加していない糖鎖が結合したＩｇＧ抗体が高い活性を示すので（非特許文献１）、コアフコースが付加していない３本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体の調製方法の確立が望まれる。また、これまでに多分岐糖鎖として４本鎖以上の複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体の調製方法は報告されていない。

国際公開公報ＷＯ２０１３／１２００６６号 国際公開公報ＷＯ２０１４／０８０９９１号

Ｔｏｙｏｈｉｄｅ Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８， ３４６６−３４７３ （２００３） Ｗｅｉ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３４， １２３０８−１２３１８ （２０１２） Ｍａｓａｋｉ Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０， ｅ０１３２８４８ （２０１５） Ｍａｔｔｉａｓ Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２０， ３０４６−３０５５ （２００１） Ｆｅｎｇ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．ｐｒｏｔｏｃ． １２， １７０２−１７２１ （２０１７） Ｊｏｈｎ Ｐ． Ｇｉｄｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２９１， ９３５６−９３７０ （２０１６） Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｓｊｏｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ４５５， １０７−１１８ （２０１３） Ｋｉｙｏｔａｋａ Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ４３２， ４１−４９ （２００４） Ｙａｓｕｎａｒｉ Ｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０， ｅ０１３２８５９ （２０１５） Ｃｈｉｎ−Ｗｅｉ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １１２， １０６１１−１０６１６ （２０１５）

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、前記問題点を解決し、コアフコースの有無にかかわらず、３〜６本鎖といった多分岐糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を調製する方法を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、Ｇ０型の２本鎖複合型糖鎖（図１参照）が結合したＩｇＧ抗体に対し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体としてＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ）−ＩＶまたはＧｎＴ−Ｖを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に３本鎖複合型糖鎖が形成されることを見出した。さらに、最初にＧｎＴ−ＩＶを作用させた場合にはＧｎＴ−Ｖを、あるいは最初にＧｎＴ−Ｖを作用させた場合にはＧｎＴ−ＩＶを後から添加して作用させることにより、ＩｇＧ抗体上に４本鎖複合型糖鎖が形成されることを見出した。またこのようにしてＩｇＧ抗体上に３本鎖または４本鎖複合型糖鎖を形成させた際、ＥｎｄｏＳあるいはＥｎｄｏＳ２といったエンドグリコシダーゼを作用させる事によって、混在するＧ０型糖鎖を有するＩｇＧ抗体の糖鎖のみを選択的に切断除去することにより、３本鎖または４本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を容易に分離精製できることを見出して本発明を完成するに至った。

また、ＩｇＧ抗体上に４本鎖複合型糖鎖を形成させた後に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体としてＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）、またはＧｎＴ−ＶＩを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に５本鎖複合型糖鎖が形成されると考えられる。また、５本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を調製する際、ＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）を用いた場合には、つぎにＧｎＴ−ＶＩを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に６本鎖複合型糖鎖が形成されると考えられる。同様に、５本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を調製する際、ＧｎＴ−ＶＩを用いた場合には、つぎにＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）を作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に６本鎖複合型糖鎖が形成されると考えられる。また、Ｇ０型の２本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体に対し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体としてＧｎＴ−ＩＩＩを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上にｂｉｓｅｃｔｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ構造をもつ複合型糖鎖を形成することもできる。なお、各Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ）の反応経路は、図１に示すとおりである。

上記のようにＩｇＧ抗体上に３〜６本鎖の複合型糖鎖を形成させた後に、ＵＤＰ−Ｇａｌを糖供与体としてガラクトース（Ｇａｌ）転移酵素を作用させる事によって、糖鎖の非還元末端側に存在しているＧｌｃＮＡｃにＧａｌを結合させて糖鎖を伸長することができる。また、付加したＧａｌに対して、ＣＭＰ−シアル酸（Ｓｉａ）を糖供与体としてシアル酸転移酵素を作用させる事によって、糖鎖の非還元末端側に存在しているＧａｌにＳｉａを結合させて糖鎖を伸長することができる。さらに、アセチル基転移酵素や硫酸転移酵素を作用させることによって、伸長したシアル酸やガラクトースを修飾することもできる。また、ＧＤＰ−Ｆｕｃを糖供与体としてフコース（Ｆｕｃ）転移酵素を作用させる事によって、Ｆｕｃを結合させた糖鎖を伸長することができる。

すなわち、本発明は、多分岐糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、以下の工程（１）、工程（２）、工程（３）のいずれかを行うことを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法を提供するものである。
（１）糖鎖の非還元末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する２本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体に対してＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ）を用いてＧｌｃＮＡｃを付加して分岐型糖鎖とする工程
（２）工程（１）の後に少なくとも１種の修飾酵素を作用させることによって糖鎖を修飾する工程
（３）工程（１）または（２）の後に最終生成物を分離する工程
また、本発明は、上記ＩｇＧ抗体の調製方法によって調製した多分岐糖鎖を持つＩｇＧ抗体を提供するものである。

本発明によれば、前記問題点を解決し、酵素処理という簡単なステップにより、効率的かつ低コストで、コアフコースの有無にかかわらず、多分岐糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を調製することができる。また、このようにして調製されたＩｇＧ抗体は、「特定の糖鎖構造を有するＩｇＧ抗体の機能および安定性」等の検討に利用することができる。

Ｇ０型糖鎖に対し、各Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ）を作用させて多分岐糖鎖を形成させるスキームを示す図である。 多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法の概念図である。 Ｇ０−リツキシマブに対するＧｎＴ−ＩＶによるＧｌｃＮＡｃ転移の過程を質量分析で解析した結果を示した図である。ＧＮ３（３−）は３価イオンによるシグナルを示す。 Ｇ０−リツキシマブに対するＧｎＴ−ＶによるＧｌｃＮＡｃ転移の過程を質量分析で解析した結果を示した図である。 Ｇ０−リツキシマブに対して、ＧｎＴ−ＩＶ（Ａ）またはＧｎＴ−Ｖ（Ｂ）を作用させてＧｌｃＮＡｃを転移させたとき（０〜１３５時間）の基質（Ｇ０−リツキシマブ）および反応産物（ＧＮ３−リツキシマブ）量の変化を質量分析で解析し、定量した結果を示した図である。 Ｇ０−リツキシマブに対して、先にＧｎＴ−ＩＶを作用させ、次いでＧｎＴ−Ｖを作用させてＧｌｃＮＡｃを転移して４本鎖糖鎖を形成させた場合（Ａ）と、Ｇ０−リツキシマブに対して、先にＧｎＴ−Ｖを作用させ、次いでＧｎＴ−ＩＶを作用させてＧｌｃＮＡｃを転移して４本鎖糖鎖を形成させた場合（Ｂ）の、反応２７９時間における反応産物の質量分析による解析結果を示した図である。各糖ペプチド（Ｇ０、ＧＮ３、ＧＮ４）の割合はシグナル強度から算出した。 Ｇ０Ｆ−リツキシマブに対するＧｎＴ−ＩＶによるＧｌｃＮＡｃ転移の過程を質量分析で解析した結果を示した図である。Ｇ０Ｆ（３−）は３価イオンによるシグナルを示す。 Ｇ１ａＦ−リツキシマブに対するＧｎＴ−ＩＶによるＧｌｃＮＡｃ転移の過程を質量分析で解析した結果を示した図である。Ｇ１ａＦ（３−）は３価イオンによるシグナルを示す。 Ｇ１ａ−リツキシマブに対するＧｎＴ−ＩＶによるＧｌｃＮＡｃ転移の過程を質量分析で解析した結果を示した図である。 Ｇ０Ｆ−リツキシマブ（Ａ）、Ｇ１ａＦ−リツキシマブ（Ｂ）、またはＧ１ａ−リツキシマブ（Ｃ）に対して、ＧｎＴ−ＩＶを作用させてＧｌｃＮＡｃを転移させたとき（０〜１３５時間）の基質（２本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体）および反応産物（３本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体）量の変化を質量分析で解析し、定量した結果を示した図である。 Ｇ０−リツキシマブに対して、ＧｎＴ−ＩＶを作用させてＧｌｃＮＡｃを転移して３本鎖糖鎖を形成させた後（０〜１３４時間）、各種エンドグリコシダ−ゼを作用させ、糖鎖の切断状況をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果である。 Ｇ０−リツキシマブに対して、ＧｎＴ−ＩＶを作用させてＧｌｃＮＡｃを転移して３本鎖糖鎖を形成させた後、各種エンドグリコシダ−ゼ処理を施し、その反応産物を質量分析で解析し、定量した結果を示した図である。

以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものでなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。

＜本発明の多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法＞
本発明の多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法は、以下の工程（１）、工程（２）、工程（３）のいずれかを行うことを特徴とする。
（１）糖鎖の非還元末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する２本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体に対してＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）を用いてＧｌｃＮＡｃを付加して分岐型糖鎖とする工程
（２）工程（１）の後に少なくとも１種の修飾酵素を作用させることによって糖鎖を修飾する工程
（３）工程（１）または（２）の後に最終生成物を分離する工程

上記の多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法の例として、Ｇ０型糖鎖を有するＩｇＧ抗体に対し、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて３本鎖糖鎖を形成させ、さらにガラクト−ス転移酵素とＵＤＰ−Ｇａｌを用いて糖鎖を伸長したのち、最終生成物である３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体を分離精製する工程の概念図を図２に示すが、本発明はこの概念図の例に限定されるものではない。

本明細書中において、「多分岐糖鎖」とは、複合型糖鎖において、キトビオ−スユニットに結合したマンノ−スからα１−３またはα１−６の結合様式で結合したマンノ−ス残基（β１−２の結合様式でＧｌｃＮＡｃが結合している）にβ１−４結合、あるいはβ１−６結合したＮ−アセチルグルコサミンを少なくとも１つ以上有する糖鎖であり、特にことわりのない限り、全体の糖鎖構造については、構成糖、鎖長および結合様式の違いは問わない。

Ｇ０型糖鎖は２本鎖複合型糖鎖の一種であり、図１にその糖鎖構造の模式図を示す。ＩｇＧ抗体に結合する糖鎖としてＧ０型糖鎖のみを有するＩｇＧ抗体の調製法は、特許文献１、非特許文献２、３などに開示されている。

Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）とは、酵素番号ＥＣ２．４．１．１４５に分類される酵素で、糖ヌクレオチドであるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、アクセプタ−となる糖鎖にＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有する酵素である。本発明の多分岐糖鎖、特に３本鎖および４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製に用いるＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼは、ヒト由来の酵素であり、複合型糖鎖中のキトビオ−スユニットに結合したマンノ−スからα１−３の結合様式で結合したマンノ−ス（β１−２の結合様式でＧｌｃＮＡｃが結合している）に対して、β１−４の結合様式でＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＧｎＴ−ＩＶ、および複合型糖鎖中のキトビオ−スユニットに結合したマンノ−スからα１−６の結合様式で結合したマンノ−ス（β１−２の結合様式でＧｌｃＮＡｃが結合している）にβ１−６の結合様式でＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＧｎＴ−Ｖが特に好ましいが、同様の活性を示す酵素であれば、動植物や微生物由来の酵素を用いても構わない。

また、５本鎖および６本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製に用いるＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼとしては、ヒト由来の酵素では、複合型糖鎖中のキトビオ−スユニットに結合したマンノ−スからα１−３の結合様式で結合したマンノ−ス（β１−２の結合様式およびβ１−４の結合様式でＧｌｃＮＡｃが結合している）に対して、β１−６の結合様式でＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）、および複合型糖鎖中のキトビオ−スユニットに結合したマンノ−スからα１−６の結合様式で結合したマンノ−ス（β１−２の結合様式およびβ１−６の結合様式でＧｌｃＮＡｃが結合している）にβ１−４の結合様式でＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＧｎＴ−ＶＩが特に好ましいが、同様の活性を示す酵素であれば、動植物や微生物由来の酵素を用いても構わない。

さらに、ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ構造を有するＩｇＧ抗体の調製に用いるＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼは、ヒト由来の酵素であり、複合型糖鎖中のキトビオ−スユニットに結合したマンノ−スに対して、β１−４の結合様式でＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＧｎＴ−ＩＩＩが特に好ましいが、同様の活性を示す酵素であれば、動植物や微生物由来の酵素を用いても構わない。

本発明では、上記の工程（２）において、各種修飾酵素を作用させることによって糖鎖を修飾する場合がある。上記のようにしてＩｇＧ抗体上に３〜６本鎖の複合型糖鎖を形成させた後に、ＵＤＰ−ガラクト−ス（Ｇａｌ）を糖供与体としてガラクト−ス転移酵素を作用させる事によって、糖鎖の非還元末端側に存在しているＧｌｃＮＡｃにＧａｌを結合させて糖鎖を伸長することができる。また、このようにして付加したＧａｌに対して、ＣＭＰ−シアル酸（Ｓｉａ）を糖供与体としてシアル酸転移酵素を作用させる事によって、糖鎖の非還元末端側に存在しているＧａｌにＳｉａを結合させて糖鎖を伸長することができる。さらに、アセチル基転移酵素や硫酸転移酵素を作用させることによって、ガラクト−スやシアル酸を修飾することもできる。また、ＧＤＰ−フコ−ス（Ｆｕｃ）を糖供与体としてフコ−ス転移酵素を作用させる事によって、Ｆｕｃを結合させた糖鎖を伸長することができる。ここで用いる酵素はヒト由来の酵素でも構わないし、同様の活性を示す酵素であれば、動植物や微生物由来の酵素を用いても構わない。

本発明では、上記の工程（３）：最終生成物を分離する工程において、エンドグリコシダ−ゼを用いる場合がある。ここで表するエンドグリコシダ−ゼとは、酵素番号ＥＣ３．２．１．９６に分類されるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼであって、「『Ｎ−アセチルグルコサミン』に結合している糖鎖」を加水分解する酵素である。すなわち、「エンドグリコシダ−ゼ」とは、特定の糖鎖の構造を認識して、該糖鎖ごと切断することができる酵素である。

エンドグリコシダ−ゼの例としては、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−ＣＣなどがあり、それぞれ非特許文献４、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９に開示されている。このうち、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２は３本鎖や４本鎖といった分岐型構造を有するＩｇＧ抗体に結合した糖鎖を切断する活性がないが（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ構造は除く）、ＩｇＧ抗体に結合した分岐型構造を持たない糖鎖は切断できる。

基質由来の「分岐型糖鎖を持たないＩｇＧ抗体」と最終生成物である「分岐型糖鎖を持つＩｇＧ抗体」が、分岐構造を形成している糖鎖分（ＧｌｃＮＡｃ）しか違わない場合、両者をクロマトグラフィ−操作によって分離するのは困難である場合がある。しかし、基質特異性の高いエンドグリコシダ−ゼを作用させることによって、「分岐型糖鎖を持たないＩｇＧ抗体」の糖鎖を切断除去する事によって、その分子量やクロマトグラフィ−における挙動を大きく変化させて、分離を容易にすることができる。

本発明における工程（３）で使用するエンドグリコシダ−ゼとして、上記のような基質特異性を有するＥｎｄｏＳやＥｎｄｏＳ２が特に好ましいが、同様の活性を示す酵素であれば、他のエンドグリコシダ−ゼを用いても構わない。

このような他のエンドグリコシダ−ゼとしては、微生物や動植物由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼを遺伝子組換え技術により改変した酵素や、その酵素に各種のタグを付加した酵素などを挙げることができるが、これらはいずれも本発明の範囲に包含されるものである。

上記工程（３）において、最終生成物を分離する工程には、一般的なクロマトグラフィ−操作によって基質由来の「分岐型糖鎖を持たないＩｇＧ抗体」と最終生成物である「分岐型糖鎖を持つＩｇＧ抗体」を分離し、「分岐型糖鎖を持つＩｇＧ抗体」を精製取得する工程が含まれる。一般的なクロマトグラフィ−操作とは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロ−ス等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ−法、スルホプロピル（ＳＰ）セファロ−ス等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ−法、ブチルセファロ−ス、フェニルセファロ−ス等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ−法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティ−クロマトグラフィ−法、クロマトフォ−カシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法のことであり、これらを単独あるいは組み合わせて用い、最終生成物である「分岐型糖鎖を持つＩｇＧ抗体」の精製標品を得ることができる。

本発明で提供される調製方法により調製される多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体には、コアフコ−スを有さないＩｇＧ抗体およびコアフコ−スを有するＩｇＧ抗体が含まれる。また多分岐糖鎖が３本鎖糖鎖から６本鎖糖鎖であるＩｇＧ抗体、及びｂｉｓｅｃｔｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ構造をもつ糖鎖が結合したＩｇＧ抗体が含まれる。さらに上記抗体が非キメラ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であるＩｇＧ抗体が含まれる。さらに具体的には、トラスツズマブ、リツキシマブ、モガムリズマブといった抗体医薬品として利用されているＩｇＧ抗体が含まれる。

以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞コアフコ−スの付加していない３本鎖および４本鎖複合型糖鎖を有するリツキシマブの調製方法
リツキシマブはＣＤ２０陽性の非ホジキンリンパ腫などの治療に用いられる抗体医薬品である。リツキシマブに結合する糖鎖の大部分（９５％以上）にはコアフコ−スが付加している（ｗｗｗ．ａｆｉｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ．ｉｔ／ａｌｌ／ＢＥＲＮＡＲＥＧＧＩ ＳＥＳＳＩＯＮＥ ＩＩ．ｐｄｆ）。このコアフコ−スを有するリツキシマブに３本鎖複合型糖鎖を結合させる方法は公知であるが（非特許文献６）、コアフコ−スの付加していない３本鎖あるいは４本鎖の糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法は知られていない。本発明ではこの課題の克服のため、コアフコ−スの有無によらない多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法の確立に取り組んだ。

リツキシマブにＥｎｄｏＳとフコシダ−ゼを作用させて、コアフコ−スの付加していないリツキシマブの抗体アクセプタ−を調製する方法が開示されている（非特許文献１０）。この方法を参考にして、本発明者らもコアフコ−スの付加していないリツキシマブの抗体アクセプタ−を調製した。また従来技術（非特許文献２，３、特許文献１）を利用して、この抗体アクセプタ−にＧ０型の２本鎖複合型糖鎖を結合させ、コアフコ−スの付加していないＧ０型糖鎖のみを有するリツキシマブ（Ｇ０−リツキシマブ）を調製した。

ヒトのＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）−ＩＶおよびＧｎＴ−Ｖは、シスメックス株式会社に依頼して、Ｎ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加した形でカイコに生産させ、そのカイコの抽出物上清より、ＤＤＤＤＫ−ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＧＥＬ（ＭＢＬ）を用いてアフィニティ−精製した。

上記Ｇ０−リツキシマブ（１００μｇ）とＧｎＴ−ＩＶ（４．１５μｇ）、あるいはＧｎＴ−Ｖ（０．５６μｇ）を２５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌの溶液中（３０μＬ）で３７℃、１９２時間、振盪しながら反応させた。この際、反応状況を確認するため、０、２４、４８、１３５時間の各時間に５μＬずつサンプリングし、質量分析による解析を行った。質量分析による解析は、抗体（１５μｇ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３７．５μｌ）に溶かして、１００℃で１５分間加熱した後に、シ−クエンスグレ−ドのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ社製、０．５μｇ）を加えて、３７℃で１２時間反応させた。その反応溶液を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行い、ペプチド鎖（ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）及びそのペプチド鎖に糖鎖（Ｇ０及びＧＮ３）が結合した糖ペプチドのイオンをモニタリングしてイオン量より、各種のモル量を計算し、反応を追跡した。

その結果、ＧｎＴ−ＩＶとＧ０−リツキシマブを反応させた場合（反応液１）には、反応時間の経過とともに３本鎖糖鎖（ＧＮ３型糖鎖）を有するＩｇＧ抗体の割合が増加していくことが判明した。質量分析に供した抗体由来の全糖ペプチドの割合を１００％としたとき、反応１３５時間時には、３本鎖糖鎖を有する糖ペプチドの割合がそのうちの２５．３％になった（図３Ａ、図４）。また、ＧｎＴ−ＶとＧ０−リツキシマブを反応させた場合（反応液２）も反応時間の経過とともに３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の割合が増加していくことが判明した。質量分析に供した抗体由来の全糖ペプチドの割合を１００％としたとき、反応１３５時間時には、３本鎖糖鎖を有する糖ペプチドの割合がそのうちの５．８８％になった（図３Ｂ、図４）。

さらに、反応１９２時間時に、反応液１にＧｎＴ−Ｖ（０．５６μｇ）と０．２Ｍ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，１μＬを添加し、その後、２７９時間まで反応させた。また、同じく反応１９２時間時に、反応液２にＧｎＴ−ＩＶ（４．１５μｇ）と０．２Ｍ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，１μＬを添加し、その後、２７９時間まで反応させた。そして反応２７９時間時の反応産物について質量分析による解析を行った。質量分析による解析は、抗体（１５μｇ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３７．５μｌ）に溶かして、１００℃で１５分間加熱した後に、シ−クエンスグレ−ドのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ社製、０．５μｇ）を加えて、３７℃で１２時間反応させた。その反応溶液を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行い、ペプチド鎖（ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）及びそのペプチド鎖に糖鎖（Ｇ０，ＧＮ３及びＧＮ４）が結合した糖ペプチドのイオンをモニタリングしてイオン量より、各種のモル量を計算し、反応を追跡した。

その結果、質量分析に供した抗体由来の全糖ペプチドの割合を１００％としたとき、反応液１における４本鎖糖鎖を有する糖ペプチド（ＧＮ４）の割合は６．１３％、３本鎖糖鎖を有する糖ペプチド（ＧＮ３）の割合は２７．３５％、未反応のＧ０型糖鎖を有する糖ペプチドの割合は６６．３９％、糖鎖が切断されてＧｌｃＮＡｃのみが結合したペプチド（Ｐｅｐ＋Ｇｎ）の割合は０．２％であった（図５Ａ）。また、反応液２における４本鎖糖鎖（ＧＮ４）を有する糖ペプチドの割合は４．９％、３本鎖糖鎖（ＧＮ３）を有する糖ペプチドの割合は３６．８８％、未反応のＧ０型糖鎖を有する糖ペプチドの割合は５８．１８％、糖鎖が切断されてＧｌｃＮＡｃのみが結合したペプチド（Ｐｅｐ＋Ｇｎ）の割合は０．２７％であった（図５Ｂ）。以上の結果から、いずれの反応液においても４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の存在が確認できたといえる。

上記のようにして調製した３本鎖糖鎖あるいは４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体に対し、さらにＧｎＴ−ＶＩ、ＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）を作用させて分岐鎖を増やすことや、ガラクト−ス転移酵素、シアル酸転移酵素、フコ−ス転移酵素などを作用させて糖鎖を伸長させることや、アセチル基転移酵素、硫酸転移酵素といった修飾酵素を作用させて糖鎖にアセチル基や硫酸基を導入することも可能であり、多分岐糖鎖の構造バリエ−ションを増やすことができる。

＜実施例２＞Ｇ０Ｆ、Ｇ１ａＦまたはＧ１ａ型の２本鎖複合型糖鎖が結合したリツキシマブから３本鎖複合型糖鎖を有するリツキシマブを調製する方法
多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法として、図１と図２にはコアフコ−スが付加していないＧ０型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を出発材料とした方法を例示している。また実施例１ではコアフコ−スが付加していないＧ０型糖鎖が結合したリツキシマブを出発材料とした３本鎖および４本鎖複合型糖鎖を有するリツキシマブの調製方法を示した。実施例２では、コアフコ−スが付加しているＧ０型糖鎖を有するＩｇＧ抗体、およびＧ０型糖鎖以外の糖鎖を有するＩｇＧ抗体を出発材料とした３本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法を示す。

リツキシマブにＥｎｄｏＳを作用させて、コアフコ−スの付加しているリツキシマブの抗体アクセプタ−を調製した。また従来技術（非特許文献２，３、特許文献１）を利用して、この抗体アクセプタ−にＧ０型の２本鎖複合型糖鎖を結合させ、コアフコ−スの付加しているＧ０型糖鎖のみを有するリツキシマブ（Ｇ０Ｆ−リツキシマブ）を調製した。

コアフコ−スの付加しているリツキシマブの抗体アクセプタ−とコアフコ−スの付加していないリツキシマブの抗体アクセプタ−を上記の方法で調製し、従来技術（非特許文献２，３、特許文献１）を利用して、これらの抗体アクセプタ−にＧ１ａ型の２本鎖複合型糖鎖を結合させ、コアフコ−スの付加しているＧ１ａ型糖鎖のみを有するリツキシマブ（Ｇ１ａＦ−リツキシマブ）、およびコアフコ−スの付加していないＧ１ａ型糖鎖のみを有するリツキシマブ（Ｇ１ａ−リツキシマブ）を調製した。

上記Ｇ０Ｆ−リツキシマブ、Ｇ１ａＦ−リツキシマブ、Ｇ１ａ−リツキシマブ（各１００μｇ）とＧｎＴ−ＩＶ（各抗体に対しそれぞれ４．１５μｇ使用）を２５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌの溶液中（３０μＬ）で３７℃、１３５時間、振盪しながら反応させた。この際、反応状況を確認するため、０、２４、４８、１３５時間の各時間に５μＬずつサンプリングし、質量分析による解析を行った。質量分析による解析は、抗体（１５μｇ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３７．５μｌ）に溶かして、１００℃で１５分間加熱した後に、シ−クエンスグレ−ドのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ社製、０．５μｇ）を加えて、３７℃で１２時間反応させた。その反応溶液を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行い、ペプチド鎖（ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）及びそのペプチド鎖に糖鎖（Ｇ０及びＧＮ３）が結合した糖ペプチドのイオンをモニタリングしてイオン量より、各種のモル量を計算し、反応を追跡した。

その結果、ＧｎＴ−ＩＶとＧ０Ｆ−リツキシマブを反応させた場合には、反応時間の経過とともに３本鎖糖鎖（ＧＮ３Ｆ型糖鎖）を有するＩｇＧ抗体の割合が増加していくことが判明した。質量分析に供した抗体由来の全糖ペプチドの割合を１００％としたとき、反応１３５時間時には、３本鎖糖鎖を有する糖ペプチドの割合がそのうちの４．５３％になった（図６、図９Ａ）。また、ＧｎＴ−ＩＶとＧ１ａＦ−リツキシマブを反応させた場合も反応時間の経過とともに３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の割合が増加していくことが判明した。質量分析に供した抗体由来の全糖ペプチドの割合を１００％としたとき、反応１３５時間時には、３本鎖糖鎖を有する糖ペプチドの割合がそのうちの２．９５％になった（図７、図９Ｂ）。さらに、ＧｎＴ−ＩＶとＧ１ａ−リツキシマブを反応させた場合も反応時間の経過とともに３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の割合が増加していくことが判明した。質量分析に供した抗体由来の全糖ペプチドの割合を１００％としたとき、反応１３５時間時には、３本鎖糖鎖を有する糖ペプチドの割合がそのうちの１０．８２％になった（図８、図９Ｃ）。以上の結果から、いずれの反応液においても３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の存在が確認できたといえる。

上記のようにして調製した３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体に対し、さらにＧｎＴ−Ｖ、ＧｎＴ−ＶＩ、ＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）を作用させて分岐鎖を増やすことや、ガラクト−ス転移酵素、シアル酸転移酵素、フコ−ス転移酵素などを作用させて糖鎖を伸長させることや、アセチル基転移酵素、硫酸転移酵素といった修飾酵素を作用させて糖鎖にアセチル基や硫酸基を導入することも可能であり、多分岐糖鎖の構造バリエ−ションを増やすことができる。

＜実施例３＞最終生成物である分岐型糖鎖を有するＩｇＧ抗体から基質由来の分岐型糖鎖を有しないＩｇＧ抗体を除去する方法
３本鎖糖鎖や４本鎖糖鎖といった分岐構造のある糖鎖が結合したＩｇＧ抗体の溶液中に、基質に由来する２本鎖複合型糖鎖のような分岐構造のない糖鎖が結合したＩｇＧ抗体が混入していると、最終生成物である分岐型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を精製単離する際に妨げとなる可能性がある。そこで、最終生成物である分岐型糖鎖を有するＩｇＧ抗体をより容易に精製できるようにするため、基質由来の分岐構造を有しないＩｇＧ抗体を除去する方法を開発した。

上記と同様にして、Ｇ０−リツキシマブ（５９０μｇ）とＧｎＴ−ＩＶ（１６．６μｇ）、を２５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌの溶液中（７０μＬ）で３７℃、１３４時間、振盪しながら反応させた。質量分析により反応産物の解析を行ったところ、反応１３４時間時には３本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体由来の糖ペプチドの割合が４８．３％、未反応のＧ０型糖鎖を有するＩｇＧ抗体由来の糖ペプチドの割合が５１．７％であった。

この反応産物２μＬに対して、ＥｎｄｏＳ（３．５μｇ）を加え、反応液量を水で１０μＬにして、３７℃、４時間反応させた。また、ＥｎｄｏＳ２、Ｅｎｄｏ−ＣＣ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、ＥｎｄｏＦ３についても同様の反応液を調製して（ただし、Ｅｎｄｏ−Ｍ、ＥｎｄｏＦ３については１００ｍＭリン酸緩衝液［ｐＨ６．５］を使用してｐＨ６．５に調整した）、酵素反応を実施した。反応終了後、反応液０．５μＬ分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、残りの反応液を質量分析によって解析した。

図１０にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す。図の５０ｋＤａ近傍に見られるバンドが抗体重鎖であり、２５ｋＤａ近傍に見られるバンドが抗体軽鎖である。ＥｎｄｏＳあるいはＥｎｄｏＳ２と反応させた場合、明瞭な２本の抗体重鎖バンドが認められる。このうち、分子量が大きいバンドは糖鎖が結合したままの抗体重鎖であり、分子量が小さいバンドは糖鎖が切断された抗体重鎖のものであると考えられる。またＥｎｄｏ−ＣＣあるいはＥｎｄｏ−Ｍと反応させた場合も、ＥｎｄｏＳあるいはＥｎｄｏＳ２と反応させた場合と比べると少ないものの、糖鎖が切断された抗体由来のバンドが認められた。一方、ＥｎｄｏＦ３と反応させた場合は、糖鎖が切断された抗体由来のバンドは、泳動パタ−ンからは認められなかった。

酵素処理により切断された糖鎖と切断されなかった糖鎖の質量分析による定量的な解析結果を図１１に示す。ＥｎｄｏＳあるいはＥｎｄｏＳ２と反応させた場合、Ｇ０型糖鎖はほとんど切断され（Ｇ０型糖鎖の残存１．４〜１．５％）、糖鎖が切断された抗体（ｐｅｐ＋Ｇｎ）（約４９％）に変換されたが、量的に３本鎖糖鎖（ＧＮ３）は切断されずに抗体に結合したままであった。またＥｎｄｏ−ＣＣあるいはＥｎｄｏ−Ｍと反応させた場合、Ｇ０型糖鎖の一部（〜１５％）が切断されて糖鎖が切断された抗体（ｐｅｐ＋Ｇｎ）（約１５％）に変換された結果、Ｇ０型糖鎖をもつ抗体（Ｇ０）：３本鎖糖鎖をもつ抗体（ＧＮ３）：糖鎖が切断された抗体（ｐｅｐ＋Ｇｎ）の割合は、３５：５０：１５程度の割合になった。なおＥｎｄｏＦ３は、コアフコ−スを有する糖鎖を選択的に切断するという基質特異性を有している為、質量分析による定量的な解析において糖鎖が切断された抗体（ｐｅｐ＋Ｇｎ）の検出もされず、Ｇ０型とＧＮ３型の両方共に糖鎖の切断は検出されなかった。

上記のように、３本鎖糖鎖のような分岐型糖鎖を有するＩｇＧ抗体とＧ０型糖鎖のような分岐型糖鎖を有しないＩｇＧ抗体が共存する場合、反応性が高く基質特異性のあるＥｎｄｏＳあるいはＥｎｄｏＳ２で処理することにより、分岐型糖鎖を有しないＩｇＧ抗体から糖鎖を効率よく切断除去することができる。これによって、基質由来の分岐型糖鎖を有しないＩｇＧ抗体と最終生成物である分岐型糖鎖を有するＩｇＧ抗体の分子量の違いが広がるとともに、糖鎖に由来するカラム担体との相互作用にも違いが生じ、カラムクロマトグラフィ−において両者をより容易に分離できると予想される。

本発明は、３〜６本鎖糖鎖といった多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体を調製、製造することができる。したがって、特定構造の多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の機能や安定性の検討、およびそれらの改善、純品の標品としての使用が可能になるので、医薬品業界等において利用可能である。

Claims (9)

1. 多分岐糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、以下の工程（１）、工程（２）、工程（３）のいずれかを行うことを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法。
   （１）糖鎖の非還元末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する２本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体に対してＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）を用いてＧｌｃＮＡｃを付加して分岐型糖鎖とする工程
   （２）工程（１）の後に少なくとも１種の修飾酵素を作用させることによって糖鎖を修飾する工程
   （３）工程（１）または（２）の後に最終生成物を分離する工程
2. 上記糖鎖の非還元末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する２本鎖複合型糖鎖がコアフコ−スを有さない、またはコアフコ−スを有する請求項１に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
3. 上記多分岐糖鎖が３本鎖、４本鎖、５本鎖、または６本鎖である請求項１または請求項２に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
4. 上記多分岐糖鎖がｂｉｓｅｃｔｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ構造を含む請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
5. 上記工程（２）で上記少なくとも１種の修飾酵素がガラクト−ス転移酵素であり、糖鎖の非還元末端にガラクト−スを結合して伸長する工程である請求項１ないし請求項４の何れかの請求項に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
6. 上記工程（２）で上記少なくとも１種の修飾酵素がガラクト−ス転移酵素とシアル酸転移酵素であり、糖鎖の非還元末端にガラクト−スを結合させた後、シアル酸を結合して伸長する工程である請求項１ないし請求項５の何れかの請求項に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
7. 上記ＩｇＧ抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
8. 上記ＩｇＧ抗体がトラスツズマブ、リツキシマブ、またはモガムリズマブである請求項１ないし請求項７の何れかの請求項に記載のＩｇＧ抗体の調製方法。
9. 請求項１ないし請求項８の何れかの請求項に記載のＩｇＧ抗体の調製方法によって調製した多分岐糖鎖を持つＩｇＧ抗体。
   

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