JP2019077629A - 抗がん剤及び新規医薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1. 以下の構造を有するポリプレノイン酸(Polyprenoic acid、PA)
2. がんが肝がんである、上記1記載の医薬。
3. 患者が前がん病変を有する患者である、上記1又は2記載の医薬。
4. 以下の構造を有する化合物:
5. 肝不全患者又は肝組織切除後の患者を対象として投与される、上記4記載の組織再生剤。
6. 肝細胞転写因子4α(HNF4α)活性化作用又は不活性化作用を有する薬剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ:
被験物質をin vitroにおいてHNF4α発現細胞と接触させるステップ、及び
被験物質とHNF4αとの結合に基づくHNF4αの活性化又は不活性化を検出するステップ
を含む、上記スクリーニング方法。
7. 活性化又は不活性化の検出が、HNF4α量の減少又は増加の検出である、上記6記載の方法。
8. HNF4α量の減少又は増加を、抗HNF4α抗体を用いて検出する、上記7記載の方法。
9. HNF4α発現細胞が、HNF4αをコードするポリヌクレオチドの導入によってHNF4αの発現を誘導した細胞である、上記6〜8のいずれか記載の方法。
10. HNF4αを、検出のためのマーカーと結合して発現させる、上記9記載の方法。
11. 活性化の陽性対照として以下の構造を有するポリプレノイン酸(PA)
また、本発明により、HNF4αの発現を制御する化合物を探索するスクリーニングシステムを得ることができ、HNF4αを標的とした新たな創薬の創出が可能となる。
また、PAの溶媒和物としては、水、又は生理的に許容されるエタノール等との溶媒和物、例えば水和物が挙げられる。
当業者であれば、PAの製剤化において、保存中の安定性や投与形態、安全性等を考慮して、好適な塩として調製し、使用することができる。
また、M-26の溶媒和物としては、水、又は生理的に許容されるエタノール等との溶媒和物、例えば水和物が挙げられる。
当業者であれば、M-26の製剤化において、保存中の安定性や投与形態、安全性等を考慮して、好適な塩として調製し、使用することができる。
本発明は更に、肝細胞転写因子4α(HNF4α)活性化作用又は不活性化作用を有する薬剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ:
被験物質をin vitroにおいてHNF4α発現細胞と接触させるステップ、及び
被験物質とHNF4αとの結合に基づくHNF4αの活性化又は不活性化を検出するステップ
を含む、上記スクリーニング方法を提供する。
また、HNF4αの「不活性化作用を有する」とは、HNF4α合成の促進、細胞増殖亢進等の作用を発揮することができることを意味する。
被験物質とHNF4α発現細胞との接触は、限定するものではないが、6〜48時間の範囲、例えば約12時間、約24時間等の時間とすることが好ましい。
ヒト肝がん由来細胞株であるHLF細胞(JCRB細胞バンク)にpCMV6-HNF4A-Myc-DDKプラスミド(RC217835、OriGene Technologies)およびpCMV6-RXRA-Myc-DDKプラスミド(RC210311,OriGene Technologies)をトランスフェクションし、組換えRXRαおよびHNF4αを発現させた。
その結果、図1aに示すように、LA及びPAのいずれもが、RXRαと比較してHNF4αに有意に多量に結合していることが示された。
V255M変異
フォワードプライマー:5'-ATGAGCCGGATGTCCATACGCATCCTTGAC-3'(配列番号3)
リバースプライマー:5'-GCGTATGGACATCCGGCTCATCTCCGCC-3'(配列番号4)
E285Q変異
フォワードプライマー:5'-GATGACAATCAGTATGCCTACCTCAAAGCC-3'(配列番号5)
リバースプライマー:5'-GTAGGCATACTGATTGTCATCGATCTGCAG-3'(配列番号6)
I314F変異
フォワードプライマー:5'-GAGGACTACTTCAACGACCGCCAGTATGAC-3'(配列番号7)
リバースプライマー:5'-GCGGTCGTTGAAGTAGTCCTCCAAGCTCAC-3'(配列番号8)
本発明者等は、ガドリニウムエトキシベンジルジエチレントリアミン五酢酸(Gd-EOB-DTPA)の取り込み能を示す初発性肝細胞がん(HCC)組織由来の培養細胞としてKH#3細胞を確立している(Hepatology 60, 1674-1685 (2014))。内因性脂肪酸の影響を最小限にするために、本実施例では脂質除去培地を使用した。
PA添加と共に、プロテアソーム阻害剤であるMG132(Sigma Aldrich)を添加して培養したところ、図2bに示すように、PAによるHNF4αの分解が抑制された。
トランスサイレチン(TTR)は典型的なHNF4α標的遺伝子である。本実施例では、PA、並びにレチノイン酸シグナルを活性化するATRAによるTTRの発現誘導を定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)によって検討した。
HNF4α-GFP発現細胞を用いたタイムラプスイメージングを行った。HLF細胞(JCRB細胞バンク)にHNF4α及びGFPをコードするポリヌクレオチドを導入して発現させたHLF-HNF4α-GFP細胞(1×104個)を8ウェルのチャンバーガラススライドにまき、1%ウシ胎児血清含有脂質除去培地中で24時間培養した。これにPA(10μM)又はDMSO(添加量)を添加して更に培養し、5% CO2インキュベーター付きタイムラプス蛍光顕微鏡システム(Andor Technology)で10分毎にて24時間観察した。
この結果から、HNF4α-GFP発現細胞を用いた画像評価スクリーニングにより、HNF4αを活性化させる化合物を特異的に同定することが可能であることが示された。
KH#3細胞(5×105個/dish)を1%ウシ胎児血清含有脂質除去DMEM中で12時間培養後、PA(10μM)又はM-26(10μM)を添加して更に12時間培養し、実施例2と同様にしてウェスタンブロットによって、HNF4αタンパク質を検出した。
その結果、図5aに示すように、PA添加ではHNF4α量が減少するのに対して、PA代謝産物であるM-26の添加ではHNF4α量の増加が認められた。
PA及びM-26がHNF4α発現細胞の増殖にもたらす効果を検討した。
2×103個のKH#3細胞の単細胞懸濁液を96ウェルプレートに入れ、1%ウシ胎児血清含有脂質除去DMEM中で12時間培養後、PA若しくはM-26を10μM加えて更に培養し、24時間後にMTTアッセイを実施し、Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories)を用いて細胞の生存を確認した。
血小板増殖因子-C(PDGF-C)Tgマウス(Jean S. Campbell博士より供与)では、経時的に肝腫瘍が増大していくことが知られている。図7aに示すように、ガドリニウムエトキシベンジルジエチレントリアミン五酢酸(Gd-EOB-DTPA)造影剤を用いたMRIによって肝腫瘍の増大を評価したところ、32週齢(T1)、40週齢(T2)、60週齢(T3)と経時的に腫瘍が増大した。32週齢では非がん性の組織(L1)が認められた。
図8aは、32週齢又は52週齢のPDGF-C Tgマウスに対してPAを8週間投与した結果を示す。PAはダイズ油(Riken)中に分散し、8週間にわたり、週に5日間経口投与した(80mg/kg/日)。磁気共鳴画像は0.4 Tesla MRIシステム(日立製作所)を使用して取得した。
いずれも60週齢のPDGF-C TgマウスでのT3(実施例7、PA未処理)、T4及びT5(実施例8、PA処理)組織の細胞における遺伝子変異の数を全エクソン解析によって調べた。
10μMのPA又はM-26で12時間、1%ウシ胎児血清含有脂質除去DMEM中でKH#3細胞(5×105個/dish)を培養した後、DNA修復に関わるタンパク質の発現を確認するためにイムノブロット解析を行った。
本発明者等の知見により、前がん病変である腺腫様過形成(dysplastic nodule、DN)はHNF4αを発現するが、ヒトHCCの約40%ではHNF4α発現が消失していることが明らかとなっている(Hepatology 60, 1674-1685 (2014))。本発明者等は、HCCの発症及び進行を防止するためにPAを用いる場合の治療標的が、上記のDNのようなHNF4α発現細胞であるとの仮説に基づき、以下の検討を行った。
また、HNF4αの再活性化作用を有するM-26は、肝不全患者や、組織切除後の患者に対して、肝再生剤としての新たな医薬としての利用可能性を有する。
更に、本発明の知見により、従来知られていなかったメカニズムを利用して、HNF4αの発現を制御する化合物をスクリーニングすることができ、HNF4αを標的とした新たな創薬の創出が可能となる。
Claims (11)
- がんが肝がんである、請求項1記載の医薬。
- 患者が前がん病変を有する患者である、請求項1又は2記載の医薬。
- 肝不全患者又は肝組織切除後の患者を対象として投与される、請求項4記載の組織再生剤。
- 肝細胞転写因子4α(HNF4α)活性化作用又は不活性化作用を有する薬剤のスクリーニング方法であって、以下のステップ:
被験物質をin vitroにおいてHNF4α発現細胞と接触させるステップ、及び
被験物質とHNF4αとの結合に基づくHNF4αの活性化又は不活性化を検出するステップ
を含む、上記スクリーニング方法。 - 活性化又は不活性化の検出が、HNF4α量の減少又は増加の検出である、請求項6記載の方法。
- HNF4α量の減少又は増加を、抗HNF4α抗体を用いて検出する、請求項7記載の方法。
- HNF4α発現細胞が、HNF4αをコードするポリヌクレオチドの導入によってHNF4αの発現を誘導した細胞である、請求項6〜8のいずれか1項記載の方法。
- HNF4αを、検出のためのマーカーと結合して発現させる、請求項9記載の方法。
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Non-Patent Citations (4)
Title |
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CANCER RES., vol. Vol.70, Issue 19, JPN6021040031, 2010, pages 7640 - 7651, ISSN: 0004614627 * |
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