JP2019060869A - Factor related to cancer transfer forming ability and prognosis prediction method of cancer patient using the factor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）ならびに前記因子を用いたがん患者の予後予測方法に関する。 The present invention relates to factors involved in the metastatic potential of cancer (proteins and polynucleotides encoding the proteins) and methods for predicting prognosis of cancer patients using the factors.
近年、ゲノム薬理学の急速な進歩により、がん、糖尿病、高血圧といった各種疾患の分子レベルでの解明が可能となり、患者間の個体差（例えば、薬物の吸収、分布または代謝、ならびに病態および疾患に対する感受性の差異）に、遺伝子の変異が関与している場合があることが明らかとなってきている。 In recent years, rapid progress in genome pharmacology has made it possible to elucidate various diseases such as cancer, diabetes and hypertension at the molecular level, and individual differences among patients (for example, drug absorption, distribution or metabolism, disease state and diseases) It is becoming clear that in some cases, mutations in genes may be involved in differences in sensitivity to
特にがん関連分野において、遺伝子の変異はタンパク質の発現、構造ならびに機能に異常をきたし、正常細胞のがん化を誘引する原因である。現在までに、がん関連遺伝子変異は数多く報告されている。例えばセリン／スレオニンキナーゼやチロシンキナーゼ遺伝子における変異は、細胞の増殖を直接制御する重要な酵素をコードしていることから、アミノ酸配列の置換や欠失などによる自己リン酸化の亢進として検出されるキナーゼ活性の自発活性化により細胞をがん化に導くことが知られている。 Particularly in the cancer-related field, gene mutation causes abnormal expression, structure and function of protein and causes canceration of normal cells. To date, many cancer-related gene mutations have been reported. For example, since mutations in the serine / threonine kinase and tyrosine kinase genes encode important enzymes that directly control cell growth, such kinases are detected as enhanced autophosphorylation due to substitution or deletion of amino acid sequences, etc. It is known to lead cells to canceration by spontaneous activation of activity.
なかでも肺がんに関しては、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、上皮成長因子受容体）遺伝子（１０％から４０％）やＫＲＡＳ遺伝子（１０％から２０％）の変異、ＡＬＫ（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｋｉｎａｓｅ、未分化リンパ腫リン酸化酵素）遺伝子とＥＭＬ４（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｋｅ ４）遺伝子との融合やＡＬＫ遺伝子とＫＩＦ５Ｂ（Ｋｉｎｅｓｉｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ５Ｂ）遺伝子との融合等（５％）が生じていることも明らかとなっている（非特許文献１から５）。 Among them, for lung cancer, mutations of EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) gene (10% to 40%) and KRAS gene (10% to 20%), ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase, anaplastic lymphoma phosphorus, It has also become clear that fusion (5%) of the oxidation enzyme) gene with the EML4 (Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 4) gene, and fusion of the ALK gene with the KIF5B (Kinesin Family Member 5B) gene, etc. have occurred. (Non-Patent Documents 1 to 5).
前述した遺伝子変異やそれに伴う異常タンパク質（アミノ酸置換が生じたタンパク質）等を標的に、分子標的治療薬が開発されている。しかしながら多くの治療薬は集団内の特定のがん細胞には効果を示す一方、不均一性を示す残りのがん細胞やがん幹細胞（悪性がん細胞）には薬効を示さないため、残存した悪性がん細胞の増殖に伴う再発や転移が課題となっている。したがって、治療法もしくは治療薬の選定またはがん細胞の悪性度を測定可能な標的因子（標的タンパク質および標的遺伝子）が求められている。 Molecularly targeted therapeutic agents have been developed for targeting the aforementioned gene mutations and abnormal proteins associated therewith (proteins in which amino acid substitutions have occurred). However, while many therapeutic agents have an effect on specific cancer cells in the population, they do not show efficacy on the remaining cancer cells or cancer stem cells (malignant cancer cells) that show heterogeneity. Recurrence and metastasis associated with the proliferation of malignant cancer cells have become an issue. Therefore, there is a need for a target agent (target protein and target gene) capable of selecting a therapeutic method or a therapeutic agent or measuring the malignancy of cancer cells.
特にヒトのがんにおいて、がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を同定することは、前記因子を標的とした新規ながんの治療方法や検査方法、治療薬の開発に大きく寄与するため、強く望まれている。 In particular, in human cancer, identifying factors (proteins and polynucleotides encoding the protein) involved in cancer metastasis formation ability is a novel cancer treatment method and test method targeting the factor There is a strong demand for it, as it greatly contributes to the development of therapeutic agents.
本発明は、がんの転移形成能に関与する因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）および前記因子を用いたがん患者の予後予測方法を提供することにある。 The present invention is to provide factors involved in the metastatic potential of cancer (proteins and polynucleotides encoding the proteins) and methods for predicting prognosis of cancer patients using the factors.
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、がん細胞で発現するタンパク質のうち、特定の位置にアミノ酸置換が生じたＳＭＡＤ４（ＳＭＡＤ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ４）タンパク質、ＡＴＭ（ＡＴＭ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）タンパク質およびＰＩＫ３ＣＡ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｌｐｈａ）タンパク質、ならびにこれらタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、がんの転移形成能に関与する因子であることを見出し、本発明に到達した。 In order to solve the above problems, as a result of intensive studies, the present inventors have found that among the proteins expressed in cancer cells, SMAD4 (SMAD family member 4) protein in which amino acid substitution has occurred at a specific position, ATM ( The ATM serine / threonine kinase protein and the PIK3CA (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-Kinase Catalytic subunit Alpha) protein, as well as the polynucleotides encoding these proteins are factors involved in the ability to form a cancer metastasis The present invention has been reached.
すなわち本発明の第一の態様は、
採取された試料において、タンパク質のアミノ酸置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記アミノ酸置換が、以下の（１）から（４）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法である。
（１）配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換
（２）配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換
（３）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換
（４）配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換
That is, the first aspect of the present invention is
What is claimed is: 1. A method of predicting prognosis in cancer patients, comprising the step of detecting amino acid substitution of a protein in a collected sample,
It is the said prediction method that the said amino acid substitution is substitution of at least any one among the following (1) to (4).
(1) glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine (2) glutamine at position 2684 of SEQ ID NO: 2 is substituted with leucine (3) phenylalanine at position 2686 of SEQ ID NO: 2 is substituted with valine (4) SEQ ID NO: The 1066th alanine of 3 is substituted for threonine
また本発明の第二の態様は、第一態様に記載の予測方法において、前記採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞が発現するタンパク質のアミノ酸置換を検出する、予測方法に関する。 In a second aspect of the present invention, in the prediction method according to the first aspect, the method further comprises the step of recovering cancer cells from the collected sample, and the detection step is performed on a protein expressed by cancer cells. The present invention relates to a prediction method for detecting amino acid substitution.
また、本発明の第三の態様は、採取された試料において、ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記塩基置換が、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法である。
（Ｉ）配列番号１の２５６番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩ）配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドンがバリンに対応するコドンに置換
（ＩＶ）配列番号３の１０６６番目のアラニンに対応するコドンがスレオニンに対応するコドンに置換
Also, a third aspect of the present invention is a method of predicting prognosis in cancer patients, comprising the step of detecting base substitution of a polynucleotide in a collected sample,
In the above prediction method, the base substitution is a substitution of at least one of the following (I) to (IV):
(I) The codon corresponding to glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 is substituted with the codon corresponding to leucine (II) The codon corresponding to glutamine at position 2684 of SEQ ID NO: 2 is substituted for the codon corresponding to leucine (III) The codon corresponding to phenylalanine at position 2686 of No. 2 is substituted for the codon corresponding to valine (IV) The codon corresponding to the alanine at position 1066 of SEQ ID NO: 3 is substituted for the codon corresponding to threonine
また本発明の第四の態様は、採取された試料において、ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する工程を含む、がん患者における予後の予測方法であって、
前記塩基置換が、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法である。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
A fourth aspect of the present invention is a method of predicting prognosis in cancer patients, comprising the step of detecting base substitution of a polynucleotide in a collected sample,
The prediction method is such that the base substitution is a substitution of at least one of the following (i) to (iv).
(I) substitution of thymine for 1305th adenine of SEQ ID NO: 4 (ii) substitution of thymine for 8436th adenine of SEQ ID NO: 5 (iii) substitution of 8441th thymine for SEQ ID NO: 5 for guanine (iv) SEQ ID NO: 4 6 3353th guanine is replaced with adenine
また本発明の第五の態様は、第三態様及び第四態様の予測方法において、前記採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含み、前記検出工程が、がん細胞においてポリヌクレオチドの塩基置換を検出する、予測方法に関する。 Further, according to a fifth aspect of the present invention, in the prediction method of the third aspect and the fourth aspect, the method further comprises the step of recovering the cancer cells from the collected sample, and the detection step comprises a polynucleotide in cancer cells. The present invention relates to a prediction method for detecting base substitution of
また本発明の第六の態様は、採取された試料からがん細胞を回収する工程を、試料中に含まれるがん細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、前記第二又は第五の態様のいずれかに記載の予測方法である。 In the sixth aspect of the present invention, the step of recovering cancer cells from the collected sample is performed by using a cell holding means provided with a plurality of holding portions capable of holding the cancer cells contained in the sample and the dielectrophoretic force. It is a prediction method in any one of the said 2nd or 5th aspect performed using the cell collection | recovery apparatus provided with the means to generate | occur | produce.
また本発明の第七の態様は、前記試料が血液試料であり、がん細胞が血中循環がん細胞である、前記第一から第六の態様のいずれか１つに記載の方法である。 The seventh aspect of the present invention is the method according to any one of the first to sixth aspects, wherein the sample is a blood sample, and the cancer cell is a circulating cancer cell in blood. .
さらに本発明の第八の態様は、以下の（１）から（４）のいずれかのポリペプチドからなる、がんの転移形成能に関与するタンパク質である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換した前記ポリペプチド
（４）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換した前記ポリペプチド
Further, an eighth aspect of the present invention is a protein involved in cancer metastasis formation ability, which comprises the polypeptide of any one of the following (1) to (4).
(1) In the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the above polypeptide wherein at least the glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine (2) the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 wherein at least the 2684th glutamine at SEQ ID NO: 2 has been substituted with leucine, wherein at least the 2686th phenylalanine in SEQ ID NO: 2 has been substituted for valine Polypeptide (4), which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, wherein at least the 1066th alanine of SEQ ID NO: 3 is substituted for threonine
また本発明の第九の態様は、前記第八の態様に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。 A ninth aspect of the present invention is a polynucleotide encoding the protein according to the eighth aspect.
また本発明の第十の態様は、前記第九の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。 A tenth aspect of the present invention is an expression vector comprising the polynucleotide according to the ninth aspect.
また本発明の第十一の態様は、前記第八の態様に記載のタンパク質をコードする遺伝子である。 An eleventh aspect of the present invention is a gene encoding the protein according to the eighth aspect.
また本発明の第十二の態様は、配列番号４〜６のいずれか１つの塩基配列であって、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換を有する、遺伝子に関する。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
A twelfth aspect of the present invention relates to a gene having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 and having at least one of the following (i) to (iv):
(I) substitution of thymine for 1305th adenine of SEQ ID NO: 4 (ii) substitution of thymine for 8436th adenine of SEQ ID NO: 5 (iii) substitution of 8441th thymine for SEQ ID NO: 5 for guanine (iv) SEQ ID NO: 4 6 3353th guanine is replaced with adenine
また本発明の第十三の態様は、第十一の態様又は第十二の態様に記載される遺伝子の存在を測定するためのプローブに関する。 The thirteenth aspect of the present invention also relates to a probe for measuring the presence of the gene described in the eleventh aspect or the twelfth aspect.
また本発明の第十四の態様は、第八の態様に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体に関する。 The fourteenth aspect of the present invention also relates to an antibody that specifically recognizes the protein according to the eighth aspect.
また本発明の第十五の態様は、第十四の態様に記載される抗体が、前記置換を有さない配列からなる遺伝子から発現されるタンパク質を認識しない抗体に関する。 The fifteenth aspect of the present invention relates to the antibody described in the fourteenth aspect which does not recognize a protein expressed from a gene consisting of a sequence not having the above-mentioned substitution.
また本発明の第十六の態様は、第八の態様に記載のタンパク質を特異的に認識する低分子化合物に関する。 A sixteenth aspect of the present invention relates to a low molecular weight compound that specifically recognizes the protein according to the eighth aspect.
また本発明の第十七の態様は、第十六の態様に記載される低分子化合物が、前記置換を有さない配列からなる遺伝子から発現されるタンパク質を認識しない低分子化合物に関する。 A seventeenth aspect of the present invention relates to the low molecular weight compound wherein the low molecular weight compound described in the sixteenth aspect does not recognize a protein expressed from a gene consisting of a sequence not having the substitution.
また本発明の第十八の態様は、第八の態様に記載のタンパク質を用いた、がんワクチンの製造方法に関する。 An eighteenth aspect of the present invention relates to a method for producing a cancer vaccine, using the protein according to the eighth aspect.
また本発明の第十九の態様は、第八の態様に記載のタンパク質、第九の態様に記載のポリヌクレオチドおよび第十二の態様に記載の遺伝子のいずれかを用いた、細胞障害性Ｔ細胞が有するＴ細胞受容体の同定方法に関する。 In addition, according to a nineteenth aspect of the present invention, cytotoxic T using the protein according to the eighth aspect, the polynucleotide according to the ninth aspect and the gene according to the twelfth aspect The present invention relates to a method for identifying T cell receptors possessed by cells.
本発明の因子（タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）は、がんの転移形成能に関与する因子である。従って、前記因子を検出（具体的には、前記因子が有するアミノ酸置換または塩基置換を検出）することで、がん患者の予後予測、手術前後や遺伝子治療におけるがんの検査や、がんの再発検査などを高精度に実施できる。また前記因子を標的とする抗体医薬、核酸医薬、低分子化合物などの創薬を実施できる。 The factors (protein and polynucleotide encoding the protein) of the present invention are factors involved in the metastasis formation ability of cancer. Therefore, by detecting the factor (specifically, detecting the amino acid substitution or base substitution possessed by the factor), it is possible to predict the prognosis of cancer patients, to test for cancer before and after surgery, in gene therapy, and in cancer It is possible to carry out a recurrence check with high accuracy. In addition, drug discovery such as antibody drugs, nucleic acid drugs, low molecular weight compounds, etc. that target the above factors can be performed.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、がんの限定は特になく、例えば、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などの造血細胞悪性腫瘍、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、副腎がん、消化管間質腫瘍、中皮腫、口腔底がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がんなどの喉頭がん、口腔がん、頭頚部がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、骨肉腫、骨がん、前立腺がん、精巣腫瘍、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肛門がん、メラノーマが挙げられる。また原発性腫瘍であってもよいし転移性腫瘍であってもよい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the cancer is not particularly limited. For example, leukemia, lymphoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, hematopoietic cell malignancy such as multiple myeloma, brain tumor, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, Ovarian cancer, esophagus cancer, stomach cancer, appendix cancer, colon cancer, liver cancer, gallbladder cancer, cholangiocarcinoma, pancreas cancer, adrenal cancer, digestive tract interstitial tumor, mesothelioma, oral floor Cancer, gingival cancer, tongue cancer, laryngeal cancer such as buccal mucosa cancer, oral cancer, head and neck cancer, salivary gland cancer, sinus cancer, thyroid cancer, kidney cancer, lung cancer, bone These include sarcomas, bone cancer, prostate cancer, testicular cancer, kidney cancer, bladder cancer, skin cancer, anal cancer and melanoma. It may be a primary tumor or a metastatic tumor.
本発明の予後予測方法を適用するがん患者は、抗がん剤の投与をすでに受けた患者であってもよいし、当該抗がん剤の投与を現在受けている患者であってもよいし、当該抗がん剤の投与を受ける前の患者であってもよい。また、がんの疑いのある患者も本発明におけるがん患者に含まれる。 The cancer patient to which the prognostic method of the present invention is applied may be a patient who has already received an anti-cancer agent or a patient who is currently receiving an anti-cancer agent. And the patient prior to receiving the anti-cancer agent. In addition, patients suspected of having cancer are also included in cancer patients in the present invention.
本発明の予後予測方法において、採取された試料に特に限定はなく、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、***、糞便、痰、髄液、羊水、リンパ液、腹水、組織、器官（肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、リンパ節、動脈など）といった生体試料、ならびに前記生体試料中に含まれる細胞／組織の培養物や培養液（培養試料）が挙げられる。なお、がん患者から採取された試料は、その性状に応じて、予め希釈、混合、分散、懸濁などの処理を行なってもよい。前記生体試料のうち、血液試料（例えば、全血、血漿、血清などの血液検体や、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料）は、がん患者からの試料採取や試料中に含まれるがん細胞の回収が容易に行なえる点で、本発明における試料として好ましい。 In the prognosis prediction method of the present invention, the collected sample is not particularly limited. For example, urine, whole blood, plasma, serum, saliva, semen, feces, sputum, spinal fluid, amniotic fluid, lymph fluid, ascites fluid, tissue, organ ( And biological samples such as liver, lung, spleen, kidney, skin, lymph nodes, arteries, etc., and cultures / cultures (culture samples) of cells / tissues contained in the biological samples. The sample collected from the cancer patient may be subjected to treatment such as dilution, mixing, dispersion, suspension, etc. in advance according to the properties. Among the biological samples, a blood sample (eg, a blood sample such as whole blood, plasma, serum, or a sample obtained by diluting the blood sample with physiological saline or the like) is contained in a sample collected from a cancer patient or in a sample It is preferable as a sample in the present invention in that the cancer cells can be easily recovered.
本発明の予後予測方法では、対象から試料を採取する工程をさらに含んでもよい。試料の採取は、試料の種類に応じて異なるが、注射、穿刺、スワブ、分取などの方法により行われる。こうして採取された試料からがん細胞を回収する工程をさらに含んでもよい。こうして得られた試料は、がん細胞を含んでいることが好ましい。試料が全血、血漿、血清といった血液試料である場合、試料に含まれるがん細胞は、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）であることが好ましい。血中循環がん細胞は、例えば、血液試料を密度勾配遠心法（特開２０１５−００６１６９号公報）やフィルター法（特開２０１４−２３３２６７号公報）などに供して、ＣＴＣを含む（ＣＴＣが濃縮された）画分を取得し、当該画分からＣＴＣを回収できる。試料が、穿刺などにより取得された組織である場合、組織から細胞を分離し、がん細胞マーカーなどで識別してフローサイトメトリーを行うことにより、がん細胞を分離することもできる。 The prognosis prediction method of the present invention may further include the step of collecting a sample from the subject. Although the collection of the sample differs depending on the type of sample, it is carried out by a method such as injection, puncture, swab, or sorting. The method may further comprise the step of recovering the cancer cells from the sample thus collected. The sample thus obtained preferably contains cancer cells. When the sample is a blood sample such as whole blood, plasma or serum, cancer cells contained in the sample are preferably circulating cancer cells (CTC). Circulating cancer cells in the blood, for example, use a blood sample subjected to density gradient centrifugation (Japanese Patent Laid-Open No. 2015-006169), a filter method (Japanese Patent Laid-open No. 2014-233267), etc. Fractions can be obtained and CTCs can be recovered from the fractions. When the sample is a tissue obtained by puncture or the like, cancer cells can be separated by separating cells from the tissue, identifying the cells using a cancer cell marker or the like, and performing flow cytometry.
密度勾配遠心法によりがん細胞を含む画分を取得する場合には、密度勾配溶液に試料を重層した後、遠心分離を行なう。当該遠心分離により試料中に含まれる夾雑細胞（血液試料の場合、赤血球、白血球など）は下層（密度勾配溶液側）に移動する一方、がん細胞は上層（試料側）に残るため、当該上層を回収することでがん細胞を含む（がん細胞が濃縮された）画分を取得することができる。なお、前述したがん細胞を含む画分の取得を、前記上層と前記下層とが分離可能な容器（特開２０１５−００６１６９号公報）を用いて行なうと、がん細胞を含む画分の取得が容易となるため好ましい。さらに、試料が血液試料の場合には、当該試料を密度勾配溶液に重層する前に、当該試料を溶血させる工程（溶血操作）を行なうと、夾雑細胞である赤血球の細胞数を減少させることができ、前記上層への赤血球の混入数も減少するため好ましい。なお、前記溶血操作は密度勾配遠心分離後に実施してもよく、その場合は、再度遠心分離などによる夾雑細胞の除去操作を行なってもよい。 When a fraction containing cancer cells is obtained by density gradient centrifugation, the sample is overlaid on the density gradient solution and then centrifuged. Contamination cells (red blood cells, white blood cells, etc. in the case of blood samples) contained in the sample are moved to the lower layer (density gradient solution side) by the centrifugation, while cancer cells remain in the upper layer (sample side). Can be collected to obtain a fraction containing cancer cells (enriched with cancer cells). In addition, if acquisition of the fraction containing the cancer cell mentioned above is performed using the container (Unexamined-Japanese-Patent No. 2015-006169) which can separate the said upper layer and the said lower layer, acquisition of the fraction containing a cancer cell will be carried out. Is preferable because it becomes easy. Furthermore, when the sample is a blood sample, the step of hemolyzing the sample (hemolytic operation) before overlaying the sample on the density gradient solution can reduce the number of erythrocytes which are contaminating cells. It is preferable because the number of red blood cell contamination in the upper layer is also reduced. The hemolyzing operation may be performed after density gradient centrifugation, and in that case, the operation of removing contaminating cells by centrifugation may be performed again.
前述した方法で得られたがん細胞を含む画分は、凍結保存や化学固定による保存処理を行なってもよい。例えば、凍結保存する場合は、細胞保存溶液に溶液置換をした後、０℃以下の温度、好ましくは−２０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下の温度で保存すればよい。化学固定する場合は、細胞懸濁液に安定化剤を添加し、タンパク質を不溶化および／または不活性化する細胞固定処理を施すことで、前記細胞の劣化を長時間抑制すればよい。化学固定に用いる安定化剤としては、例えば、アルデヒド類、酸類、脱水剤・有機溶媒類、金属塩類などの細胞固定剤を含む溶液が挙げられる。 The fraction containing cancer cells obtained by the above-mentioned method may be subjected to preservation treatment by cryopreservation or chemical fixation. For example, in the case of cryopreservation, the cell storage solution may be subjected to solution substitution and then stored at a temperature of 0 ° C. or less, preferably −20 ° C. or less, more preferably −80 ° C. or less. In the case of chemical fixation, the cell suspension may be inhibited for a long time by adding a stabilizer to the cell suspension and performing a cell fixation treatment to insolubilize and / or inactivate the protein. Examples of the stabilizer used for chemical fixation include solutions containing cell fixing agents such as aldehydes, acids, dehydrating agents and organic solvents, and metal salts.
前述した方法で得られたがん細胞を含む画分には、がん細胞以外の夾雑細胞（血液試料の場合、特に白血球）がまだ多く含まれる。従って、前記画分中に存在するがん細胞を特異的に検出してから、がん細胞を回収すると好ましい。がん細胞を検出するには、例えば、がん細胞を含む画分をスライドに塗布するか、またはがん細胞を保持可能な装置にがん細胞を含む画分を導入してがん細胞を前記装置に保持させた後、顕微鏡や光学検出器などを利用して、前記がん細胞が有する特徴に基づき、がん細胞を検出すればよい。また、がん細胞を含む画分をフローサイトメーターに導入することでがん細胞を検出してもよい。 The fraction containing cancer cells obtained by the above-described method still contains a large amount of contaminating cells other than cancer cells (in the case of blood samples, particularly white blood cells). Therefore, it is preferable to recover the cancer cells after specifically detecting the cancer cells present in the fraction. In order to detect cancer cells, for example, a fraction containing cancer cells is applied to a slide, or a fraction containing cancer cells is introduced into a device capable of retaining cancer cells to carry out cancer cells. After being held in the device, cancer cells may be detected based on the characteristics of the cancer cells using a microscope, an optical detector, or the like. Alternatively, cancer cells may be detected by introducing a fraction containing cancer cells into a flow cytometer.
がん細胞を回収可能な細胞回収装置の一例を図１に示し、その正面図を図２に示す。
図１および図２に示す細胞回収装置１００は、
貫通孔１１ａを有する平板状の遮光部材１１と、
貫通孔１２ａを有する平板状の絶縁体１２と、
導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する平板状のスペーサー２０と、
遮光部材１１の下部およびスペーサー２０の上部と密着するよう設けた電極基板３１・３２と、
電極基板３１・３２同士を接続する導線４０と、
電極基板３１・３２に信号を印加する信号発生器５０と、
を備えている。
An example of a cell collection device capable of collecting cancer cells is shown in FIG. 1, and its front view is shown in FIG.
The cell recovery apparatus 100 shown in FIG. 1 and FIG.
A flat light shielding member 11 having a through hole 11a;
A flat insulator 12 having a through hole 12a;
A flat spacer 20 having an inlet 21, an outlet 22 and a penetration 23;
Electrode substrates 31 and 32 provided in close contact with the lower portion of the light shielding member 11 and the upper portion of the spacer 20;
Conductor wires 40 connecting the electrode substrates 31 and 32 with each other;
A signal generator 50 for applying a signal to the electrode substrates 31, 32;
Is equipped.
遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板３１により、細胞回収手段１０内に保持部６０が構成され、導入口２１から細胞を含む液体を導入すると、貫通部２３を通じて保持部６０へ細胞が導入される。電極基板３２はスペーサー２０上部に密着して設けており、導入口２１から導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部６０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極基板３２はスペーサー２０から取り外し可能な構造となっている。また電極基板３１・３２をＩＴＯ（酸化インジウムスズ）などの透明電極にすると、保持部６０に保持された細胞を、顕微鏡や光学検出器を用いて検出可能となるため好ましい。 The through hole 11a of the light shielding member 11 and the through hole 12a of the insulator 12 have the same size and shape, and the light shielding member 11 and the insulator 12 are provided such that the positions of the respective through holes coincide with each other. . The holding portion 60 is formed in the cell collection means 10 by the through holes 11 a, the through holes 12 a, and the electrode substrate 31 provided in close contact with the lower portion of the light shielding member 11. The cells are introduced into the holding unit 60 through the unit 23. The electrode substrate 32 is provided in close contact with the upper portion of the spacer 20 to prevent scattering and evaporation of the liquid containing cells introduced from the inlet 21. The electrode substrate 32 has a structure that can be removed from the spacer 20 in order to facilitate collection of the cells held by the holding unit 60. In addition, it is preferable to use a transparent electrode such as ITO (indium tin oxide) as the electrode substrates 31 and 32 because the cells held by the holding unit 60 can be detected using a microscope or an optical detector.
図１および図２に示す細胞回収装置１００にがん細胞を保持させる際は、がん細胞を含む画分をスペーサー２０に設けた導入口２１から導入後、信号発生器５０から導線４０を介して電極基板３１・３２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力を発生させ、がん細胞を保持させるとよい。がん細胞を含む画分を細胞回収装置１００に導入する際は、予め当該画分を遠心分離することでがん細胞を含むペレットを得た後、マンニトール、グルコ−ス、スクロ−スなどの糖を含む溶液に当該ペレットを懸濁させてから細胞回収装置１００に導入すると、がん細胞へのダメ−ジが少なくなるため好ましい。なお、前記ペレットの懸濁液として前述した糖の他に、ＢＳＡやカゼイン等のタンパク質、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含んでもよい。前記ペレットの懸濁液中に含まれる糖の濃度はがん細胞と等張になる濃度とすればよく、糖としてマンニトールを用いる場合は終濃度で２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とすればよい。電極基板３１・３２へ印加する交流電圧としては、ピ−ク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１０ｋＨｚから１０ＭＨｚ程度である、正弦波、矩形波、三角波、台形波が例示できる。具体例として、生きたがん細胞を保持部に１つずつ保持させたい場合は、周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚの矩形波を使用すると好ましい。 When holding the cancer cells in the cell recovery apparatus 100 shown in FIGS. 1 and 2, after introducing the fraction containing the cancer cells from the inlet 21 provided on the spacer 20, the fraction from the signal generator 50 through the conductor 40 The dielectrophoretic force may be generated by applying an alternating voltage to the electrode substrates 31 and 32 to hold the cancer cells. When a fraction containing cancer cells is introduced into the cell collection apparatus 100, a pellet containing the cancer cells is obtained by previously centrifuging the fraction, and then a mannitol, glucose, sucrose or the like is obtained. It is preferable to suspend the pellet in a solution containing sugar and then introduce the pellet into the cell collection apparatus 100, because damage to cancer cells is reduced. In addition to the sugar described above as the suspension of the pellet, a protein such as BSA or casein, or a protein bound with a hydrophilic polymer may be further included. The concentration of the sugar contained in the suspension of the pellet may be a concentration that is isotonic with the cancer cells, and when using mannitol as the sugar, the final concentration may be between 250 mM and 350 mM. As an AC voltage applied to the electrode substrates 31 and 32, a sine wave, a rectangular wave, a triangular wave, and a trapezoidal wave having a peak voltage of about 1 V to 20 V and a frequency of about 10 kHz to 10 MHz can be exemplified. As a specific example, when it is desired to hold living cancer cells one by one in the holding unit, it is preferable to use a rectangular wave with a frequency of 100 kHz to 3 MHz.
前述した通りがん細胞の検出は、当該がん細胞が有する特徴に基づき検出すればよい。例えば、血液試料中に含まれるがん細胞（ＣＴＣ）を検出する場合は、細胞核を有し、かつ白血球マーカー（ＣＤ４５など）を実質的に発現していない、および／またはがん細胞由来マーカーもしくは上皮系マーカー（サイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）など）を発現している細胞をＣＴＣとして検出する態様が挙げられる（Ｓ．Ｌ．Ｗｅｒｎｅｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｉｒｃ．Ｂｉｏｍａｒｋ．，４：３，ｄｏｉ：１０．５７７２／６０７２５（２０１５）参照）。なお、ＣＫにはＣＫ１からＣＫ２０まで２０種類のタンパク質が知られているが、そのいずれもが前記上皮系マーカーとして使用可能である。ここで「白血球マーカーを実質的に発現していない」とは、白血球マーカーの発現がほとんど確認できないことをいい、具体的には、対象細胞におけるマーカーの発現量が、白血球マーカーを発現する細胞（白血球など）の発現量の半分未満、好ましくは１／３未満、より好ましくは１／５未満、さらにより好ましくは１／１０未満である場合に「白血球マーカーを実質的に発現しない」と評価し得る。また、対象細胞におけるマーカーの発現量が、白血球マーカーを発現しないことが知られている陰性対照細胞（例えば、血管内皮細胞、間葉系幹細胞）と同等の発現量である場合も「白血球マーカーを実質的に発現しない」と評価し得る。 As described above, the cancer cells may be detected based on the characteristics of the cancer cells. For example, when detecting cancer cells (CTC) contained in a blood sample, it has a cell nucleus and does not substantially express a leukocyte marker (such as CD45), and / or a cancer cell-derived marker or There may be a mode in which cells expressing epithelial markers (cytokeratin (CK), EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), etc.) are detected as CTCs (S. L. Werner. Et al., J. Circ. Biomark) ., 4: 3, doi: 10.5772 / 60725 (2015)). In addition, although 20 types of proteins from CK1 to CK20 are known for CK, any of them can be used as the epithelial marker. Here, "substantially does not express leukocyte markers" means that expression of leukocyte markers can hardly be confirmed. Specifically, cells in which the expression amount of the marker in the target cell expresses the leukocyte marker ( If the expression level of white blood cells is less than half, preferably less than 1/3, more preferably less than 1/5, and even more preferably less than 1/10, it is evaluated as "substantially not express white blood cell markers" obtain. In addition, if the expression level of the marker in the target cell is equivalent to that of a negative control cell (for example, vascular endothelial cell, mesenchymal stem cell) known not to express the white blood cell marker, “white blood cell marker It can be evaluated as "not substantially expressed".
がん細胞の検出を当該がん細胞が有する光学的特徴に基づき検出する場合、細胞核の検出は、４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）などの細胞核染色試薬で染色して検出すればよい。また、マーカーの検出は、当該マーカーを直接呈色試薬や蛍光試薬で染色して検出してもよく、当該マーカーに対する標識化抗体又は当該マーカーに対する一次抗体と当該一次抗体に対する標識二次抗体を用いて検出してもよく、当該マーカーの遺伝子を特異的に増幅して検出してもよい。中でもマーカーの検出を当該マーカーに対する標識化抗体を用いて検出する方法は、当該マーカーを簡便、高感度、かつ特異的に検出できる方法であり好ましい。なお、抗体を標識する物質も特に限定はなく、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商品名）などの蛍光物質が挙げられる。 When detecting cancer cells based on the optical characteristics of the cancer cells, cell nuclei are detected by staining the cell nuclei such as 4 ', 6-DiAmidino-2-PhenylIndol (DAPI) or Hoechst 33342 (trade name) It may be stained with a reagent and detected. The marker may be detected by staining the marker directly with a coloring reagent or a fluorescent reagent, and a labeled antibody against the marker or a primary antibody against the marker and a labeled secondary antibody against the primary antibody may be used. The marker gene may be specifically amplified and detected. Above all, a method of detecting the detection of a marker using a labeled antibody against the marker is a method which can detect the marker simply, highly sensitively and specifically and is preferable. The substance for labeling the antibody is also not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and Alexa Fluor (trade name).
がん細胞検出の別の態様として、細胞の大きさに基づき検出する態様が挙げられる。がん細胞の多くは赤血球（直径７μｍから８μｍ、厚さが２μｍ程度の円盤形）や白血球（マクロファージを除けばおよそ直径６μｍから１５μｍの球状）と比較して径が大きい（ＣＴＣの場合、直径１０μｍから３０μｍ）ことが知られており（Ｒｏｓｔａｇｎｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１７（４Ａ），２４８１−２４８５（１９９７））、赤血球や白血球と比較して径が大きな細胞を指標とすることにより、がん細胞を精度よく検出できる。 Another embodiment of cancer cell detection includes detection based on cell size. Many cancer cells are larger in diameter (in the case of CTCs, diameter is larger than red blood cells (7 to 8 μm in diameter, 2 μm thick disc-like) and white blood cells (approximately 6 to 15 μm in diameter except for macrophages). 10 μm to 30 μm) (Rostagno P. et al., Anticancer Res., 17 (4A), 2481-2485 (1997)), and cells with larger diameter compared to erythrocytes and leukocytes are used as an index Thus, cancer cells can be detected with high accuracy.
がん細胞検出のさらに別の態様として、細胞核の大きさに基づき検出する態様が挙げられる。がん細胞の多くは正常細胞と比較して細胞核が大きいことが知られており、正常細胞と比較して細胞核が大きな細胞を抽出することにより、正常細胞とほぼ同じ径のがん細胞であっても精度よく検出することが可能となる（特開２０１３−５０８７２９号および特開２０１３−０２４７６８号参照）。細胞核の大きさの測定は、具体的には、前述した細胞核染色試薬で染色して測定すればよい。 Yet another embodiment of cancer cell detection includes detection based on the size of cell nuclei. Many cancer cells are known to have larger cell nuclei compared to normal cells, and by extracting cells with larger cell nuclei compared to normal cells, they are cancer cells of about the same diameter as normal cells. Even with this method, accurate detection is possible (see Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2013-508729 and 2013-024768). Specifically, measurement of the size of cell nuclei may be performed by staining with the above-mentioned cell nucleus staining reagent.
検出器によるがん細胞の検出は、例えば、カメラなどの撮像手段で撮像することで得られた画像（明視野像、蛍光画像、発光画像など）をパソコン等に取り込んだ後、ソフトウェアを用いてがん細胞か否かを判別すればよい。ソフトウェアを用いずに、目視によりがん細胞か否かを判別することもできる。 Detection of cancer cells by a detector is carried out, for example, by capturing an image (bright field image, fluorescent image, luminescent image, etc.) obtained by imaging with an imaging means such as a camera into a personal computer etc. and using software. It may be determined whether or not it is a cancer cell. It is also possible to visually judge whether or not a cancer cell is present without using software.
前述した方法で検出したがん細胞は、細胞を採取可能な採取手段を用いて回収すればよい。採取手段としては、例えば、ポンプや電気浸透流などを用いた吸引による採取手段が挙げられる。がん細胞がポリ−Ｌ−リジンなどの接着物質により比較的強く基板に接着されている場合、高流速で吸引する必要があるため、採取手段としてシリンジポンプを用いる場合は、流量を０．０１から５．０μＬ／ｓの間とすると好ましい。細胞の吸引で用いる細管の材質としては、ガラス、金属、樹脂等が挙げられるが、耐衝撃性および光透過性が高いガラスが好ましい。また、細管の内径は、吸引後の細管内での詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくすることが好ましい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、細管の内径を２５μｍから３５μｍの間とすることができる。 The cancer cells detected by the above-described method may be collected using a collection means capable of collecting cells. As the collecting means, for example, a collecting means by suction using a pump, an electroosmotic flow or the like can be mentioned. When cancer cells are relatively strongly adhered to the substrate by an adhesive substance such as poly-L-lysine, it is necessary to aspirate at a high flow rate, so when using a syringe pump as the collection means, the flow rate is 0.01 To 5.0 μL / s. Glass, metal, resin and the like can be mentioned as the material of the thin tube used for aspiration of cells, but glass having high impact resistance and light transmittance is preferable. The inner diameter of the capillary is preferably larger than the diameter of cells to be aspirated in order to prevent clogging in the capillary after aspiration. For example, in the case of aspirating cells introduced to a holder having a diameter of 30 μm (the distance between the holders is 50 μm), the inner diameter of the capillary can be between 25 μm and 35 μm.
本発明の予後予測方法では、回収したがん細胞が発現するタンパク質のうち、がんの転移形成能に関与する特定タンパク質、または当該特定タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に特定ポリヌクレオチドとも表記する）を検出することでがん患者の予後予測を行なう。 In the prognosis prediction method of the present invention, among the proteins expressed by the recovered cancer cells, a specific protein involved in the ability to form a cancer metastasis, or a polynucleotide encoding the specific protein (hereinafter simply referred to as a specific polynucleotide) Predict the prognosis of cancer patients by detecting
前記特定タンパク質は具体的には、以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つである。
（１）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００５３５０．１）に記載のアミノ酸配列を含むＳＭＡＤ４（ＳＭＡＤ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ４）タンパク質において、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号７のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（２）配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００００４２．３）に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭ（ＡＴＭ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）タンパク質のうち、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号８のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質において、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号９のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（４）配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６２０９．２）に記載のアミノ酸配列を含むＰＩＫ３ＣＡ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３−Ｋｉｎａｓｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｌｐｈａ）タンパク質において、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号１０のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
（５）配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００００４２．３）に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭ（ＡＴＭ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）タンパク質のうち、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換し、かつ少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換したポリペプチド又はタンパク質。かかるポリペプチド又はタンパク質の一例として、配列番号１５のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
Specifically, the specific protein is at least one of the following (1) to (5).
(1) In the SMAD 4 (SMAD family member 4) protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (GenBank No. NP — 005350.1), a polypeptide or protein wherein at least the 256th glutamine of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine. An example of such a polypeptide or protein is the polypeptide or protein of SEQ ID NO: 7.
(2) Among the ATM (ATM serine / threonine kinase) proteins containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (GenBank No. NP_000042.3), a polypeptide in which at least the 2684th glutamine in SEQ ID NO: 2 is substituted with leucine protein. An example of such a polypeptide or protein is the polypeptide or protein of SEQ ID NO: 8.
(3) In the ATM protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, a polypeptide or a protein in which at least phenylalanine at position 2686 in SEQ ID NO: 2 is substituted with valine. An example of such a polypeptide or protein is the polypeptide or protein of SEQ ID NO: 9.
(4) In PIK 3 CA (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (GenBank No. NP — 006209.2), at least the 1066th alanine of SEQ ID NO: 3 A threonine-substituted polypeptide or protein. One example of such a polypeptide or protein is the polypeptide or protein of SEQ ID NO: 10.
(5) Of the ATM (ATM serine / threonine kinase) protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (GenBank No. NP_000042.3), at least the 2684th glutamine in SEQ ID NO: 2 is substituted with leucine, and A polypeptide or protein, wherein phenylalanine at position 2686 of SEQ ID NO: 2 is substituted with valine. An example of such a polypeptide or protein is the polypeptide or protein of SEQ ID NO: 15.
また前記特定ポリヌクレオチドは具体的には、以下の（Ｉ）から（Ｖ）のうち少なくともいずれか１つである。
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＳＭＡＤ４タンパク質をコードするヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンに対応するコドン（ＣＡＡまたはＣＡＧ）がロイシンに対応するコドン（ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換したポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドン（ＴＴＴまたはＴＴＣ）がバリンに対応するコドン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
（ＩＶ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＰＩＫ３ＣＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンに対応するコドン（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧのいずれか）がスレオニンに対応するコドン（ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
（Ｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＡＴＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換し、かつ少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドン（ＴＴＴまたはＴＴＣ）がバリンに対応するコドン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧのいずれか）に置換したポリヌクレオチド
Specifically, the specific polynucleotide is at least one of the following (I) to (V).
(I) In a nucleotide encoding SMAD4 protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, at least the codon (CAA or CAG) corresponding to glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 corresponds to leucine (TTA, TTG, Polynucleotide (II) which is substituted for CTT, CTC, CTA or CTG) (II) In a polynucleotide encoding an ATM protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, at least corresponding to glutamine at position 2684 in SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding an ATM protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 wherein the codon is replaced with a codon corresponding to leucine (III) Polynucleotide (TTT or TTC) is substituted for a codon (GTT, GTC, GTA, or GTG) corresponding to valine (IV) In a polynucleotide encoding a PIK3CA protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 A polynucleotide (one of GCT, GCC, GCA, GCG) corresponding to alanine at position 1066 of SEQ ID NO: 3 is replaced with a codon (any of ACT, ACC, ACA, ACG) corresponding to threonine V) In a polynucleotide encoding an ATM protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, at least the codon corresponding to glutamine at position 2684 of SEQ ID NO: 2 is substituted for the codon corresponding to leucine, and Phenix at 2686 Codon codon corresponding to alanine (TTT or TTC) corresponds to valine polynucleotides substituted (GTT, GTC, GTA, either GTG)
前記（Ｉ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉ）配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００５３５９．５）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１３０５番目のアデニンがチミンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１１で表される。
前記（ＩＩ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉｉ）配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００００５１．３）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも８４３６番目のアデニンがチミンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１２で表される。
前記（ＩＩＩ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉｉｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも８４４１番目のチミンがグアニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１３で表される。
前記（ＩＶ）のポリヌクレオチドの一態様として、
（ｉｖ）配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６２１８．２）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも３３５３番目のグアニンがアデニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１４で表される。
（Ｖ）配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００００５１．３）に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも８４３６番目のアデニンがチミンに置換し、かつ少なくとも８４４１番目のチミンがグアニンに置換したポリヌクレオチド、があげられる。かかるポリヌクレオチドの一例は、配列番号１６で表される。
As one aspect of the polynucleotide of (I),
(I) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (GenBank No. NM — 005359.5), a polynucleotide in which at least the 1305th adenine is substituted with thymine. An example of such a polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 11.
As one embodiment of the polynucleotide (II),
(Ii) Among the polynucleotides comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 (GenBank No. NM — 000051.3), a polynucleotide in which at least the 8436th adenine is replaced with thymine is mentioned. An example of such a polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 12.
As one aspect of the polynucleotide of (III),
(Iii) Among the polynucleotides comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a polynucleotide wherein at least the 8441 th thymine has been replaced by guanine is mentioned. An example of such a polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 13.
As one aspect of the polynucleotide of (IV),
(Iv) Among the polynucleotides comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (GenBank No. NM — 006218.2), a polynucleotide in which at least the 3353rd guanine is substituted with adenine is mentioned. An example of such a polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 14.
(V) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 (GenBank No. NM_000051.3), wherein at least the 8436th adenine is replaced with thymine and the at least 8441th thymine is replaced with guanine Can be mentioned. An example of such a polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 16.
本発明のさらなる態様では、がんの転移形成能に関与する限りにおいて、本発明の遺伝子の配列（配列番号１１〜１４、及び１６）に対し少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の配列同一性を有する配列の遺伝子に関していてもよい。但し、本発明の遺伝子が有する変異の位置、すなわち配列番号１１の場合は１３０５位、配列番号１２の場合は８４３６位、配列番号１３の場合は８４４１位、配列番号１４の場合は３３５３位、においては、置換、欠失、及び／又は付加はされない。 In a further aspect of the present invention, it is at least 90%, preferably 95%, more preferably 98% of the sequence of the gene of the present invention (SEQ ID NOS: 11 to 14 and 16) as far as it is involved in the metastatic potential of cancer. It may be related to a gene of sequence having% sequence identity. However, the position of the mutation possessed by the gene of the present invention, ie, at position 1305 in the case of SEQ ID NO: 11, at position 8436 in the case of SEQ ID NO: 12, at position 8441 in the case of SEQ ID NO: 13, at position 3353 in the case of SEQ ID NO: 14 Is not substituted, deleted and / or added.
本発明のさらなる態様では、がんの転移形成能に関与する限りにおいて、本発明のタンパク質の配列（配列番号７〜１０、及び１５）において、１又は複数の置換、欠失、及び／又は付加を含む改変タンパク質に関していてもよい。改変タンパク質において、置換、欠失、及び／又は付加は、１又は数個であることが好ましい。別の態様では、改変タンパク質は、本発明の改変タンパク質の配列に対し少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の配列同一性を有する配列のタンパク質に関していてもよい。但し、かかる改変タンパク質は、本発明のタンパク質が有する変異の位置、すなわち配列番号７の場合は２５６位、配列番号８の場合は２６８４位、配列番号９の場合は２６８６位、配列番号１０の場合は１０６６位、配列番号１５の場合は２６８４位及び２６８６位においては、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加はされない。 In a further aspect of the present invention, one or more substitutions, deletions, and / or additions are made in the sequence (SEQ ID NOS: 7 to 10, and 15) of the protein of the present invention as long as they are involved in the metastatic potential of cancer. It may be related to a variant protein containing In the variant protein, substitution, deletion and / or addition is preferably one or several. In another aspect, the variant protein may relate to a protein of a sequence having at least 90%, preferably 95%, more preferably 98% sequence identity to the sequence of the variant protein of the invention. However, such a variant protein is the position of the mutation possessed by the protein of the present invention, ie, position 256 in the case of SEQ ID NO: 7, position 2684 in the case of SEQ ID NO: 8, position 2686 in the case of SEQ ID NO: 9, and in the case of SEQ ID NO: 10. No amino acid substitutions, deletions and / or additions are made at position 1066 and at positions 2684 and 2686 in the case of SEQ ID NO: 15.
前記特定タンパク質を検出するには、例えば前記特定タンパク質が有するアミノ酸置換（具体的には、配列番号１の２５６番目のロイシン、配列番号２の２６８４番目のロイシン、配列番号２の２６８６番目のバリン、配列番号３の１０６６番目のスレオニンのうち少なくともいずれか１つ）を特異的に認識可能な抗体、もしくはそのフラグメントを用いた抗原抗体反応、または低分子化合物の結合により検出すればよい。特異的に認識可能な抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物とは、特定の配列を有するタンパク質に対してのみ結合できる抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物をいう。より具体的に、特定タンパク質が有するアミノ酸置換を特異的に認識可能な抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物とは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質に対しては結合できない一方で、配列番号１の２５６番目のロイシン、配列番号２の２６８４番目のロイシン、配列番号２の２６８６番目のバリン、配列番号３の１０６６番目のスレオニンのうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むタンパク質に対しては結合できる抗体、もしくはそのフラグメント、または低分子化合物をいう。また、抗体、またはそのフラグメントには、抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有し、目的のタンパク質に特異的に結合できる物質であれば任意のもの、例えば抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有するスキャフォールドなどが含まれるものとする。 In order to detect the specific protein, for example, amino acid substitution of the specific protein (specifically, leucine at position 256 of SEQ ID NO: 1, leucine at position 2684 of SEQ ID NO: 2, valine at position 2686 of SEQ ID NO: 2, The detection may be performed by an antigen-antibody reaction using an antibody capable of specifically recognizing at least any one of threonine at position 1066 of SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof, or binding of a low molecular weight compound. Specifically recognizable antibodies, or fragments thereof, or low molecular weight compounds refer to antibodies, or fragments thereof, or low molecular weight compounds that can bind only to a protein having a specific sequence. More specifically, an antibody capable of specifically recognizing an amino acid substitution possessed by a specific protein, or a fragment thereof, or a low molecular weight compound is an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. Among the leucine at position 256 of SEQ ID NO: 1, the leucine at position 2684 of SEQ ID NO: 2, the valine at position 2686 of SEQ ID NO: 2, and the threonine at position 1066 of An antibody, or a fragment thereof, or a low molecular weight compound capable of binding to a protein comprising an amino acid sequence having at least any one amino acid substitution. In addition, the antibody, or a fragment thereof has any of the substances that have complementarity determining regions (CDRs) of the light chain and heavy chain of the antibody, and can be any substance that can specifically bind to the target protein, such as the light of the antibody It is intended to include, for example, scaffolds having chain and heavy chain complementarity determining regions (CDRs).
本発明の抗体、またはそのフラグメントは、前記特定タンパク質が有するアミノ酸置換（具体的には、配列番号１の２５６番目のロイシン、配列番号２の２６８４番目のロイシン、配列番号２の２６８６番目のバリン、配列番号３の１０６６番目のスレオニンのうち少なくともいずれか１つ）を特異的に認識することから、本発明の抗体、またはそのフラグメントは、前記アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドをエピトープとする。このようなエピトープは、置換されたアミノ酸と、およびその上流（Ｎ末側）、および／または下流（Ｃ末側）のそれぞれ１〜１０個の連続するアミノ酸とから構成されうる。 The antibody of the present invention, or a fragment thereof is an amino acid substitution of the specific protein (specifically, leucine at position 256 of SEQ ID NO: 1, leucine at position 2684 of SEQ ID NO: 2, valine at position 2686 of SEQ ID NO: 2, Since the antibody of the present invention, or a fragment thereof specifically recognizes at least one of threonine at position 1066 of SEQ ID NO: 3, the peptide consisting of the amino acid sequence having the above amino acid substitution is an epitope. Such an epitope can be composed of a substituted amino acid and 1 to 10 consecutive amino acids upstream (N-terminal side) and / or downstream (C-terminal side) thereof.
採取された試料において、タンパク質のアミノ酸置換を検出する工程は、一例として免疫染色が行われてもよい。より具体的に、免疫染色では、前記アミノ酸置換を有するタンパク質と、抗体とを反応させることで検出をすることができる。このような抗体を金コロイドや蛍光物質で直接標識していてもよいし、標識を有する二次抗体を用いてかかる抗体を検出してもよい。免疫染色法としては、本技術分野に既知の手法を用いることができるが、ウエスタンブロット法や蛍光免疫染色法が用いられてもよい。 The step of detecting the amino acid substitution of the protein in the collected sample may be immunostained as an example. More specifically, in immunostaining, detection can be performed by reacting a protein having the amino acid substitution with an antibody. Such an antibody may be directly labeled with gold colloid or a fluorescent substance, or such an antibody may be detected using a secondary antibody having a label. As the immunostaining method, techniques known in the art can be used, but Western blotting or fluorescence immunostaining may be used.
前記特定ポリヌクレオチドを検出する方法の一例として、前記特定ポリヌクレオチドが有する塩基置換を特異的に認識するプローブを用いて検出する方法や、前記ポリヌクレオチドが有する塩基置換を含むプライマーを用いた特異的増幅により検出する方法や、がん細胞を直接遺伝子変異解析して検出する方法があげられる。がん細胞を直接遺伝子変異解析することで前記特定ポリヌクレオチドを検出する場合、解析対象のがん細胞は、前述した方法で回収したがん細胞を用いてもよいが、培養試料など試料中に含まれるがん細胞が多い場合および／または夾雑細胞が少ないときは、前述した密度勾配遠心法やフィルター法などにより得られたがん細胞を含む画分（がん細胞が濃縮された画分）をそのまま遺伝子変異解析に供してもよい。遺伝子変異解析手法に関しては特に限定はなく、例えば、回収したがん細胞から、遺伝子を抽出した後、遺伝子解析をすればよい。その際に抽出した遺伝子の増幅反応を行なってもよい。遺伝子（ポリヌクレオチド）の増幅法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法や、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを用いることができる。遺伝子変異解析においては、サンガー法、サイクルシークエンス法、次世代シークエンシングなどの手法により、抽出した遺伝子（またはその増幅産物）の塩基配列を決定すればよい。 As an example of a method of detecting the specific polynucleotide, a method of detecting using a probe that specifically recognizes a base substitution of the specific polynucleotide, or a specific method of using a primer including a base substitution of the polynucleotide There are a method of detection by amplification and a method of direct cancer gene mutation analysis for detection. When the specific polynucleotide is detected by direct gene mutation analysis of cancer cells, the cancer cells to be analyzed may use the cancer cells recovered by the method described above, but it is possible to use a sample such as a culture sample. When many cancer cells are contained and / or there are few contaminating cells, a fraction containing cancer cells obtained by density gradient centrifugation or filter method described above (fraction in which cancer cells are concentrated) May be subjected to gene mutation analysis as it is. There is no particular limitation on the gene mutation analysis method, and for example, genes may be extracted from recovered cancer cells and then gene analysis may be performed. At that time, amplification reaction of the extracted gene may be performed. As a gene (polynucleotide) amplification method, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, TRC (Transcription Reverse-transcription Concerted reaction) method, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method or the like can be used. In gene mutation analysis, the base sequence of the extracted gene (or its amplification product) may be determined by a method such as Sanger method, cycle sequencing method, next-generation sequencing or the like.
前述した方法で得られた、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの検出結果に基づき、対象患者（前記試料を採取した患者）における予後を予測することができる。本発明による予後の予測方法は、医師が行なわずに、医療補助者などが行なうことができるし、装置およびソフトウェア上で自動的に関連付けすることができる。したがって、本発明の方法は、医師による治療効果判断のための予備的方法、または医師によるがん患者の予後予測のための情報を得る方法ということもできる。 Based on the detection result of the specific protein or the specific polynucleotide obtained by the method described above, it is possible to predict the prognosis in a target patient (patient from which the sample is collected). The prediction method of prognosis according to the present invention can be performed by a medical assistant or the like without being performed by a doctor, and can be automatically associated on a device and software. Therefore, the method of the present invention can also be referred to as a preliminary method for determining the therapeutic effect by a doctor or a method for obtaining information for predicting prognosis of a cancer patient by a doctor.
本発明では、がん患者から採取したがん細胞が発現するタンパク質のうち、がんの転移形成能に関与する特定タンパク質または特定ポリヌクレオチドを検出することで、当該がん患者における予後を予測するが、前記検出に基づく予後予測は定性的に、すなわち前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの有無に基づき行なってもよいし、定量的に、すなわち前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの量に基づき行なってもよい。また予後の判断基準も特に限定はなく、例えば、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドが少しでもあれば予後が悪化していると予測してもよく、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドが一定の閾値以上存在しているとき予後が悪化していると予測してもよく、前記特定タンパク質または前記特定ポリヌクレオチドの量と予後とを相関させてもよい。予後予測の一例として、アミノ酸置換またはヌクレオチド置換を検出したがん細胞の割合に基づいて、予後を決定することができ、割合が高くなるにともない予後が不良であると決定することができる。また、４種類の置換のうち、２つ以上の組み合わせを有するがん細胞の存在または割合に基づいて予後を決定することができる、例えば置換の組み合わせが多いがん細胞が存在する場合、またはそのようながん細胞の割合が多くなるほど、予後が不良であると決定することができる。予後が不良であると決定された場合には、さらに治療を継続することが好ましい。本発明の置換を有するがん細胞は、いわゆるがん幹細胞でありうる。したがって、本発明で予後を不良と決定された対象に対しては、がん幹細胞を治療標的とする治療が行われうる。がん幹細胞を治療標的とする治療としては、薬剤排出を抑制する薬剤などを用いることが挙げられる。がん幹細胞は、一般に、薬剤排出により薬剤耐性を発揮するため、薬剤排出を抑制する薬剤を併用することでがん幹細胞を効果的に減少しうる。 In the present invention, among proteins expressed by cancer cells collected from a cancer patient, a specific protein or polynucleotide involved in cancer metastasis formation is detected to predict the prognosis in the cancer patient. However, the prognosis based on the detection may be performed qualitatively, that is, based on the presence or absence of the specific protein or the specific polynucleotide, or quantitatively based on the amount of the specific protein or the specific polynucleotide. May be Further, there is no particular limitation on the criteria for determining the prognosis, for example, if the specific protein or the specific polynucleotide is too small, it may be predicted that the prognosis is deteriorated, and the specific protein or the specific polynucleotide is constant. It may be predicted that the prognosis is worse when the threshold value or more is present, and the amount of the specific protein or the specific polynucleotide may be correlated with the prognosis. As an example of prognosis, the prognosis can be determined based on the proportion of cancer cells that have detected amino acid substitution or nucleotide substitution, and the prognosis can be determined to be poor as the proportion becomes higher. In addition, the prognosis can be determined based on the presence or proportion of cancer cells having two or more combinations among four types of substitution, for example, when cancer cells having many combinations of substitutions exist, or The higher the proportion of such cancer cells, the worse the prognosis can be determined. If the prognosis is determined to be poor, it is preferable to continue the treatment further. The cancer cells having a substitution of the present invention may be so-called cancer stem cells. Therefore, treatment targeting cancer stem cells can be performed on a subject determined to have a poor prognosis in the present invention. Examples of treatments that target cancer stem cells include the use of drugs that suppress drug excretion. Since cancer stem cells generally exert drug resistance by drug efflux, cancer stem cells can be effectively reduced by using a drug that suppresses drug efflux in combination.
がん幹細胞は、細胞増殖がほとんど起こらない静止期と呼ばれる状態にとどまっているため、細胞***を阻害する一般的な抗癌剤の奏効性は低いことが知られている。したがって、細胞***抑制に関わる因子の機能を阻害する薬剤と抗癌剤を併用することで、静止期から増殖期に移行させ、がん幹細胞を効果的に減少しうる。また、がん幹細胞が有する抗酸化システムを阻害する薬剤を用いることで、酸化作用によるがん幹細胞の効率的な減少を可能にする。更には、がんの転移形成能に関与する遺伝子の存在を認識するポリヌクレオチド、または遺伝子から発現されるたんぱく質を特異的に認識する抗体に対し、抗癌剤を結合した複合体を使用することで、がん幹細胞をより効果的に死滅しうる。 Since cancer stem cells remain in a state called stationary phase in which cell proliferation hardly occurs, it is known that the response of general anticancer agents that inhibit cell division is low. Therefore, by combining an agent that inhibits the function of a factor involved in cytostatic action and an anticancer agent, it is possible to shift from the stationary phase to the proliferative phase and effectively reduce cancer stem cells. In addition, the use of a drug that inhibits the antioxidant system possessed by cancer stem cells enables efficient reduction of cancer stem cells by oxidation. Furthermore, by using a complex in which an anticancer agent is bound to a polynucleotide that recognizes the presence of a gene involved in the ability to form a cancer metastasis, or an antibody that specifically recognizes a protein expressed from the gene, It can kill cancer stem cells more effectively.
本発明の好ましい態様の一つとして、前記特定タンパク質もしくは前記特定ポリヌクレオチドの有無またはその量を指標とすることに加えて、がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数を指標とすることで、がん患者の予後を予測する方法が挙げられる。がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数と予後とは関連性があり、当該がん細胞数が多いほど予後が悪い（血液試料中に含まれるがん細胞の場合は特表２０１１−５０５０１２号参照）。このことから、がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数を計測することで、患者の予後を予測することができる。従って、前記特定タンパク質もしくは前記特定ポリヌクレオチドに基づく本発明の予後予測方法に加え、がん原発組織およびがん転移組織以外の試料由来のがん細胞数を計測することで、がん患者の予後予測をより精度高く行なうことができる。なお、がん細胞数を指標とする場合においては、単に採取した試料中に一定のしきい値以上のがん細胞が存在するかを評価してもよく、試料を複数回採取し、当該採取した各試料中に含まれるがん細胞数の経時変化を評価してもよい。 In a preferred embodiment of the present invention, in addition to using the specific protein or the specific polynucleotide as the indicator, the number of cancer cells derived from samples other than primary cancer tissues and cancer metastasis tissues. There is a method to predict the prognosis of cancer patients by using The number of cancer cells derived from samples other than cancer primary tissue and cancer metastasis tissue is associated with prognosis, and the prognosis is worse as the number of cancer cells is larger (in the case of cancer cells contained in a blood sample) Is Japanese Patent Publication No. 2011-50512). From this, it is possible to predict the prognosis of a patient by measuring the number of cancer cells derived from samples other than cancer primary tissue and cancer metastasis tissue. Therefore, in addition to the prognostic prediction method of the present invention based on the specific protein or the specific polynucleotide, the prognosis of cancer patients can be obtained by measuring the number of cancer cells derived from samples other than cancer primary tissue and cancer metastasis tissue. The prediction can be made more accurately. In the case where the number of cancer cells is used as an index, it may be evaluated whether cancer cells above a certain threshold value are present in the collected sample, and the sample is collected multiple times, and the collection is performed. The time course of the number of cancer cells contained in each sample may be evaluated.
以下、試料として血液試料を、試料からがん細胞を回収する装置として図１および図２に示す細胞回収装置１００をそれぞれ用い、本発明の予後予測をがんの転移形成能に関与する特定ポリヌクレオチドの検出により行なう場合を例に説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
［１］がん患者（がんの疑いのある患者も含む）から血液を採取する。なお、血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
［２］採取した血液（または希釈した血液）を密度勾配遠心法に供し、当該血液中に含まれる夾雑細胞（赤血球、白血球など）を除去する。密度勾配遠心法は、物質をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体（密度勾配溶液）上に採取した血液（または希釈した血液）を重層した後、遠心分離を行なうことにより、夾雑細胞やごみを除去し、がん細胞（ＣＴＣ）を含む画分（上層）を回収することができる。なお、前記遠心分離を行なう前に、採取した血液（または希釈した血液）に、夾雑細胞（赤血球、白血球など）と結合可能な結合剤（例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を添加することもできる。前記結合剤は、赤血球、白血球および／またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心法によるＣＴＣの分離を容易にする。密度勾配遠心法により夾雑細胞やごみが除去されたＣＴＣを含む画分は、速やかに後続の操作を行なうことが好ましいが、後続の操作を速やかに行なえない場合は、凍結保存による保存処理を行なってもよい。凍結保存する際は、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２（日本全薬工業社製）などの細胞保存溶液にＣＴＣを含む画分を懸濁させた後、−８０℃で凍結保存すればよい。
［３］［２］で得られたＣＴＣを含む画分に塩化アンモニウムを含む溶液を添加して撹拌することで、当該画分に混入した赤血球を溶血させる。本操作により、分離回収したＣＴＣの観察が良好になる。
［４］［３］で得られた溶血処理後のＣＴＣを含む溶液を遠心分離することで血液成分を除去することでＣＴＣをペレット状にした後、適切な溶液を用いてＣＴＣを懸濁させる。
［５］［４］で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。なお、必要に応じ、前記回収したペレットを溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
［６］［５］で得られたＣＴＣを、図１に示す細胞回収装置１００に設けた細胞保持手段１０上に展開後、誘電泳動力８０により細胞７０を保持部６０へ保持させる（図３（１））。
［７］接着物質９０を細胞回収装置１００に導入し、ＣＴＣを保持部６０に接着する（図３（２））。接着物質９０としては、例えばポリ−Ｌ−リジンを用いることができ、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とするとよい。
［８］保存処理剤および細胞膜透過処理剤を細胞回収装置１００に導入し、ＣＴＣの保存および膜透過処理を施す。保存処理剤としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドドナー化合物（加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出可能な化合物）、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、メタノール、エタノールなどのアルコール類、および重金属を含む溶液が例示できる。細胞膜透過処理剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、サポニンなどの界面活性剤が例示できる。
［９］抗体による非特異的な反応を防ぐため、保存および膜透過処理後の標的細胞を保持した保持部に対してタンパク質によるブロッキング処理を施す。
［１０］ブロッキング処理した後、白血球が発現するタンパク質（白血球マーカー）、上皮系細胞が発現するタンパク質（上皮系マーカー）、もしくはがん細胞が発現するタンパク質（がん細胞由来マーカー）に対する蛍光標識抗体、または細胞核を蛍光染色させる試薬を用いて細胞を標識し（図３（３））、洗浄後、蛍光顕微鏡２００などで細胞の蛍光像および明視野像を観察する（図３（４））。白血球が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗ＣＤ４５抗体を用いることができる。また、上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗ＣＫ抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体などを用いることができる。細胞核を蛍光染色させる試薬としては、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）などを用いることができる。
［１１］観察した蛍光像および明視野像を基に標的細胞（ＣＴＣ）７１を検出する（図３（４））。ＣＴＣの検出は例えば、細胞核が染色されており、抗ＣＤ４５抗体では標識されず、かつ上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体（抗ＣＫ抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体など）またはがん細胞が発現するタンパク質に対する抗体で標識された細胞をＣＴＣとして検出すればよい。また細胞核が染色されており、抗ＣＤ４５抗体では標識されず、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞をＣＴＣとして検出してもよい。
［１２］蛍光顕微鏡２００で検出したＣＴＣ７１を回収するために、電極基板３２をスペーサー２０から取り外した後、回収装置３００で吸引することでＣＴＣ７１を回収する（図３（５））。電極基板３２を取り外す際は、スペーサー２０を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサー２０が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、ＣＴＣ７１が破壊されるからである。回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引は、前記（１１）で検出したＣＴＣ７１が保持されている保持部６０に回収装置３００を移動させ、回収装置３００により液を吸引することでＣＴＣ７１を回収する。なお、回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引位置を、ＣＴＣ７１を標本化した保持部６０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、ＣＴＣ７１の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的にはＣＴＣ７１の吸引位置を、保持部６０の中心から水平方向に保持部６０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部６０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部６０の高さから垂直方向に保持部６０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。また、回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引操作の前に、ＣＴＣ７１と保持部６０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。
［１３］回収装置３００による吸引で回収したＣＴＣ７１を回収チュ−ブ４００へ吐出する（図３（６））。回収チュ−ブ４００へＣＴＣ７１が吐出されたかどうかを光学検出器２００で検出してもよい。
［１４］回収チュ−ブ４００に回収されたＣＴＣ７１中の核酸を抽出し、ＰＣＲ法により抽出した核酸に含まれる特定ポリヌクレオチドを増幅した後、サンガー法により特定ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することで、特定ポリヌクレオチドの塩基置換を検出する。ＰＣＲ増幅産物の配列解析には、次世代シーケンサーと呼称されるハイスループットな解析が可能な装置を使用してもよい。次世代シーケンサーとしては、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ＨｉＳｅｑ／Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ（ＧＡＩＩｘ）／ ＭｉＳｅｑ（イルミナ社）及びＩｏｎ ＰＧＭシーケンサー（Ｉｏｎ ＰＧＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）があげられる。
Hereinafter, using the cell collection device 100 shown in FIG. 1 and FIG. 2 as a blood sample as a sample and a device for collecting cancer cells from the sample, the prognostic prediction of the present invention is performed using a specific poly Although the case of detection by nucleotide is described as an example, the present invention is not limited to the contents of the present description.
[1] Collect blood from cancer patients (including those suspected of having cancer). When blood is collected, an anticoagulant such as citric acid, heparin or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) may be added. If necessary, the collected blood may be diluted with physiological saline or the like.
[2] The collected blood (or diluted blood) is subjected to density gradient centrifugation to remove contaminating cells (red blood cells, white blood cells, etc.) contained in the blood. Density gradient centrifugation is a method of separating substances based on their specific gravity, in which a blood (or diluted blood) collected on a medium (density gradient solution) having a density gradient formed thereon is subjected to centrifugation. Thus, it is possible to remove contaminating cells and debris, and collect fractions (upper layers) containing cancer cells (CTC). In addition, before performing the centrifugation, a binding agent (for example, RosetteSep (manufactured by StemCell Technologies)) capable of binding to contaminating cells (red blood cells, white blood cells, etc.) is added to the collected blood (or diluted blood). You can also. The binding agent can form cell aggregates by binding to red blood cells, white blood cells and / or surface antigens of these cells, and the density of these cells can be increased, so that it is easy to separate CTCs by density gradient centrifugation. Make it It is preferable that the fraction containing CTCs from which contaminating cells and debris have been removed by density gradient centrifugation be immediately subjected to the subsequent operation, but if the subsequent operation can not be carried out promptly, preservation processing by cryopreservation is performed May be In the case of cryopreservation, a fraction containing CTCs may be suspended in a cell preservation solution such as CELLBANKER 2 (manufactured by Nippon Zenkyaku Co., Ltd.) and then cryopreserved at -80 ° C.
[3] A solution containing ammonium chloride is added to a fraction containing CTC obtained in [2] and stirred to hemolyze red blood cells mixed in the fraction. This operation improves the observation of the separated and recovered CTCs.
[4] [3] pellet the CTC by removing the blood component by centrifuging the solution containing CTC after hemolysis treatment, and then suspending CTC using an appropriate solution .
[5] The suspension containing CTC prepared in [4] is centrifuged again, and the pellet containing CTC is recovered. If necessary, a step of resuspending the recovered pellet in a solution and centrifuging may be added.
After the CTC obtained in [6] and [5] are expanded on the cell holding means 10 provided in the cell recovery apparatus 100 shown in FIG. 1, the cell 70 is held in the holding unit 60 by the dielectrophoretic force 80 (FIG. 3) (1)).
[7] The adhesive substance 90 is introduced into the cell collection device 100, and the CTC is adhered to the holder 60 (FIG. 3 (2)). As the adhesive substance 90, for example, poly-L-lysine can be used, and its concentration may be 0.01 (w / v)% or less.
[8] A preservation treatment agent and a cell membrane permeabilization agent are introduced into the cell recovery apparatus 100, and CTC preservation and membrane permeation treatment are performed. Examples of the preservative include a solution containing formaldehyde, a formaldehyde donor compound (a compound capable of releasing formaldehyde upon hydrolysis), an aldehyde such as glutaraldehyde, an alcohol such as methanol and ethanol, and a heavy metal. Examples of cell membrane permeabilizing agents include alcohols such as methanol and ethanol, and surfactants such as saponin.
[9] In order to prevent nonspecific reaction with the antibody, the retention portion holding the target cell after storage and permeabilization treatment is subjected to protein blocking treatment.
[10] A fluorescently labeled antibody to a protein expressed by white blood cells (leukocyte marker), a protein expressed by epithelial cells (epithelial marker), or a protein expressed by cancer cells (cancer cell-derived marker) after blocking treatment Alternatively, the cells are labeled with a reagent that causes the cell nuclei to be fluorescently stained (FIG. 3 (3)), and after washing, the fluorescent image and bright field image of the cells are observed with a fluorescent microscope 200 or the like (FIG. 3 (4)). Anti-CD45 antibodies can be used as antibodies against proteins expressed by leukocytes. Further, as an antibody against a protein expressed by epithelial cells, an anti-CK antibody, an anti-EpCAM antibody or the like can be used. As a reagent for fluorescently staining cell nuclei, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), Hoechst 33342 (trade name) or the like can be used.
[11] A target cell (CTC) 71 is detected based on the observed fluorescence image and bright field image (FIG. 3 (4)). For detection of CTC, for example, a cell nucleus is stained, is not labeled with an anti-CD45 antibody, and an antibody against a protein expressed by epithelial cells (such as an anti-CK antibody or an anti-EpCAM antibody) or a protein expressed by a cancer cell Cells labeled with the antibody may be detected as CTCs. Alternatively, the cell nucleus may be stained, not labeled with an anti-CD45 antibody, and a cell having a larger cell shape in bright field as compared to red blood cells and white blood cells may be detected as CTC.
[12] In order to recover the CTC 71 detected by the fluorescence microscope 200, after removing the electrode substrate 32 from the spacer 20, the CTC 71 is recovered by suction with the recovery device 300 (FIG. 3 (5)). When removing the electrode substrate 32, it is necessary to remove the spacer 20 so as not to remove it. If the spacer 20 is detached from the insulator 12, the solution held in the apparatus will flow out of the system, and the CTC 71 will be destroyed. In the suction of the CTC 71 by the collection device 300, the collection device 300 is moved to the holding unit 60 in which the CTC 71 detected in (11) is held, and the CTC 71 is collected by sucking the liquid by the collection device 300. It is preferable that the suction position of the CTC 71 by the collection device 300 be a position shifted by a fixed distance in the horizontal direction from the center of the holding unit 60 where the CTC 71 is sampled, because suction of the CTC 71 can be easily performed. Specifically, the suction position of the CTC 71 is 0.1 to 2 times the diameter of the holding portion 60 in the horizontal direction from the center of the holding portion 60 (however, however, it is two minutes of the distance between adjacent holding portions 60). It is preferable that the position is shifted from the height of the holding portion 60 by a height of 0.01 times to 2 times the height of the holding portion 60 in the vertical direction. In addition, before the suction operation of the CTC 71 by the collection device 300, an operation of adding a solution containing an enzyme that weakens the adhesion between the CTC 71 and the holding unit 60 may be performed.
[13] The CTC 71 collected by suction by the collection device 300 is discharged to the collection tube 400 (FIG. 3 (6)). The optical detector 200 may detect whether the CTC 71 has been discharged to the collection tube 400.
[14] Extract the nucleic acid in CTC71 collected in the collection tube 400, amplify the specific polynucleotide contained in the nucleic acid extracted by the PCR method, and determine the base sequence of the specific polynucleotide by the Sanger method To detect base substitution of a specific polynucleotide. For sequence analysis of PCR amplification products, an apparatus capable of high-throughput analysis called next-generation sequencer may be used. As next-generation sequencers, for example, Genome Sequencer FLX system (Roche Diagnostics), HiSeq / Genome Analyzer IIx (GAIIx) / MiSeq (Illumina) and Ion PGM sequencer (Ion PGM) (Thermo Fisher) can give.
本発明の好ましい態様の一つとして、配列番号４〜６のいずれか１つの塩基配列であって、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換を有する、塩基配列からなるがんの転移形成予測のための遺伝子に関する：
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換
As one of the preferred embodiments of the present invention, it consists of a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 6, which has at least one of the following substitutions (i) to (iv): Related genes for cancer metastasis prediction:
(I) substitution of thymine for 1305th adenine of SEQ ID NO: 4 (ii) substitution of thymine for 8436th adenine of SEQ ID NO: 5 (iii) substitution of 8441th thymine for SEQ ID NO: 5 for guanine (iv) SEQ ID NO: 4 6 3353th guanine is replaced with adenine
これらの置換を有する塩基配列からなる遺伝子は、がんの転移形成能に関与することが明らかにされていることから、かかる遺伝子の存在を認識するプローブ、またはかかる遺伝子から発現されるタンパク質を特異的に認識する抗体は、予後の予測に有用である。また、かかる遺伝子から発現されるタンパク質の機能を活性化、もしくは抑制することで細胞周期もしくは増殖制御、細胞死、免疫シグナル伝達または炎症シグナル伝達などを制御する低分子化合物や活性を中和することができる抗体は、がんの治療、または転移の抑制に有用でありうる。また、がんの転移形成能に関与することから、かかる遺伝子の発現を抑制できる核酸医薬、例えばデコイ核酸、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなども、がんの治療、または転移の抑制に有用でありうる。さらに別の態様では、かかる遺伝子を有するがん細胞、より好ましくはがん幹細胞を用いたスクリーニング系を用いることで、候補薬剤のがん転移抑制作用を評価することができる。 Since a gene consisting of a nucleotide sequence having these substitutions has been shown to be involved in the ability to form cancer metastasis, a probe that recognizes the presence of such a gene, or a protein expressed from such a gene is specific Antibodies that positively recognize are useful for prognosis prediction. In addition, to neutralize low molecular weight compounds and activities that control cell cycle or growth control, cell death, immune signaling or inflammatory signaling by activating or suppressing the function of a protein expressed from such a gene. Antibodies that can be used to treat cancer or to suppress metastasis. In addition, nucleic acid drugs capable of suppressing the expression of such genes, such as decoy nucleic acids, antisense nucleic acids, siRNA, miRNA, ribozymes and the like, which are involved in the ability to form cancer metastasis, are also useful for treating cancer or suppressing metastasis. It may be useful. In yet another embodiment, the cancer metastasis inhibitory action of a candidate drug can be evaluated by using a screening system using cancer cells, more preferably cancer stem cells, having such a gene.
本発明の特定タンパク質は、がん特異的抗原として、がんワクチン等の製造、およびそれを用いた治療への適用が可能である。がん特異的抗原は、がん細胞を認識して死滅させるのに有効なＴ細胞の発生を誘導できる。一例として、本発明の特定タンパク質（がん特異的抗原）の部分配列を含むがん抗原ペプチドを人工的に合成し、当該ペプチドを皮下または皮内に注射して体内の樹状細胞に前記特定タンパク質（前記特異的抗原）を認識させ、当該樹状細胞からＴ細胞に情報が伝達されることで細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、それを用いてがんを治療するペプチドワクチン療法への適用が挙げられる。別の例として、末梢血から採取した単球をサイトカインによって分化させ、抗原提示能力が強い樹状細胞にした後、本発明の特定タンパク質（がん特異的抗原）を認識させる、または本発明の特定ポリヌクレオチド（がん特異的抗原をコードするポリヌクレオチド）を樹状細胞に直接導入することで細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、がんを治療する樹状細胞ワクチン療法への適用も可能である。さらに別の例として、前記特異的抗原を認識した樹状細胞とリンパ球とを共培養することによって誘導、増殖させた細胞障害性Ｔ細胞を用いた活性化リンパ球療法への利用も可能である。また近年では、リンパ球に特定の抗原に対する抗原受容体遺伝子（例えば、がん特異的抗原を認識するＴ細胞受容体（Ｔ−Ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ［ＴＣＲ］）や、がん細胞表面に発現している標的抗原に対するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ［ＣＡＲ］））を遺伝子導入／発現させ、がん抗原特異的に改変した細胞障害性Ｔ細胞を利用する治療法の開発が進められている。
なお本発明の特定タンパク質および特定ポリヌクレオチドは、細胞障害性Ｔ細胞が有するＴ細胞受容体の同定にも利用可能であり、これにより、抗腫瘍効果が向上した遺伝子導入Ｔ細胞を作製できる。
The specific protein of the present invention can be applied as a cancer-specific antigen to the production of a cancer vaccine and the like and treatment using it. Cancer specific antigens can induce the generation of T cells that are effective to recognize and kill cancer cells. As an example, a cancer antigen peptide containing a partial sequence of a specific protein (cancer specific antigen) of the present invention is artificially synthesized, and the peptide is injected subcutaneously or intradermally into the dendritic cells in the body by the subcutaneous or intradermal injection. Application to peptide vaccine therapy that recognizes a protein (the above-mentioned specific antigen), induces cytotoxic T cells by transmitting information from the dendritic cells to T cells, and is used to treat cancer using it Can be mentioned. As another example, monocytes collected from peripheral blood are differentiated by cytokines to become dendritic cells with strong antigen presentation ability, and then recognize specific proteins (cancer specific antigens) of the present invention, or It is also possible to apply dendritic cell vaccine therapy to induce cytotoxic T cells by directly introducing specific polynucleotides (polynucleotides encoding cancer specific antigens) into dendritic cells, thereby treating cancer. is there. As yet another example, it is also possible to use activated T cell therapy using cytotoxic T cells induced and expanded by co-culturing dendritic cells and lymphocytes that have recognized the specific antigen. is there. Furthermore, in recent years, antigen receptor genes for specific antigens in lymphocytes (for example, T cell receptors (T-Cell receptor [TCR] that recognize cancer specific antigens), and cancer cells are expressed on the surface) A therapeutic method using cytotoxic T cells, which is specifically modified with cancer antigens, has been under development by gene transfer / expression of a chimeric antigen receptor (Chimeric Antigen Receptor [CAR]) for a target antigen.
The specific protein and the specific polynucleotide of the present invention can also be used to identify T cell receptors possessed by cytotoxic T cells, whereby transgenic T cells with improved anti-tumor effect can be prepared.
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail using Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１ 肺がん、胃がん、扁平上皮がん（口腔がん）、大腸がん、乳がん患者からの血中循環がん細胞（ＣＴＣ）の検出および、がん関連遺伝子変異の解析
（１）インフォームドコンセントを得たステージＩＶの各がん患者から、血液を採取した。
（２）（１）で採取した血液に、生理食塩水、白血球・血小板結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加することで、希釈血液試料を調製した。
（３）調製した希釈血液試料を、密度１．０８４ｇ／ｍＬの密度勾配溶液に重層し、２０００×ｇで１０分間、室温にて遠心後、上清を回収した。
（４）（３）で回収した上清に、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムと含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収した細胞の観察が良好になる。
（５）上清を除去後、分離回収した細胞を含むペレットを、３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁し、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離後、上清を除去した。再度３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した後、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。当該操作は、血液成分を除去し、標的細胞を濃縮するための操作である。
（６）（５）で上清を除去した細胞を含む懸濁液を図１および２に示す細胞回収装置１０００に展開し、交流電圧を３分間印加することで前記装置が有する保持部６０に細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞回収装置１００は、直径３０μｍで深さ４０μｍの微細孔からなる微細孔を複数有した絶縁体１２と前記絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）とからなる保持部６０を、厚さ１ｍｍのスペーサー２０と下部電極基板３１とで挟んだ構造であり、スペーサー２０を上部電極基板３１と下部電極基板３２とで挟んだ構造である。
（７）（６）の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（８）５０％（ｖ／ｖ）エタノールと１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、細胞膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部６０に導入した細胞を標本化した。
（９）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（１０）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ（同仁化学研究所社））を含む水溶液（以下、標識試薬）を導入し、３０分間静置した。なお前記標識された抗体として、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と、上皮系細胞の細胞質内で発現しているＣＫ（サイトケラチン）に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いている。
（１１）標識試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
（１２）（１１）で標識した細胞を含む細胞回収装置１００を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持部６０に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部６０全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＥＭＣＣＤ、ＦＬＯＶＥＬ社製ＡＤＴ−１００）を装備した蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いた。
（１３）（１２）で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されている細胞（ＤＡＰＩ陽性）であり、
白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体で染色されていない細胞（ＣＤ４５陰性）であり、
上皮系の性質を有していることを示すＣＫに対する抗体で染色されていない細胞（ＣＫ陰性）であり、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞を標的細胞（がん細胞）として計数した。
（１４）細胞回収装置１００の上部電極基板３２を取り外した後、蛍光顕微鏡のステージ上へ載置し、保持部６０内に保持された、（１３）で計数済の標的細胞を円筒状の細管により吸引し、ＰＣＲチューブ内へ標的細胞を吐出した。
（１５）標的細胞の遺伝子ホットスポット解析を、当該標的細胞における変異を同定するために実行した。具体的には前記標的細胞から抽出したゲノムＤＮＡを１細胞全ゲノム増幅キット（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ａｍｐｌｉ１）により増幅し、得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｏｎＰＧＭシーケンサーおよびＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２キット（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）によって５０種のがん関連遺伝子における変異を解析した。
Example 1 Detection of circulating cancer cells (CTC) in lung cancer, stomach cancer, squamous cell carcinoma (oral cancer), colon cancer, breast cancer patients and analysis of cancer-related gene mutations (1) Infor Blood was collected from each stage IV cancer patient who obtained unrequited consent.
(2) A diluted blood sample was prepared by adding saline and a leukocyte / platelet binder (RosetteSep, manufactured by StemCell Technologies) to the blood collected in (1).
(3) The prepared diluted blood sample was overlaid on a density gradient solution with a density of 1.084 g / mL and centrifuged at 2000 × g for 10 minutes at room temperature to recover a supernatant.
(4) In the supernatant recovered in (3), make up to 30 mL with blood containing 0.9% (w / v) ammonium chloride and 0.1% (w / v) potassium bicarbonate, Centrifugated at room temperature for 10 minutes at g. By this operation, erythrocytes mixed in the supernatant are destroyed, and the observation of the separated and collected cells becomes good.
(5) After removing the supernatant, the pellet containing the separated and collected cells was resuspended in 30 mL of a solution containing 300 mM mannitol, centrifuged at 300 × g for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was removed. After resuspending with 30 mL of a solution containing 300 mM mannitol again, centrifugation was performed at 300 × g for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was removed. The operation is an operation for removing blood components and concentrating target cells.
(6) The suspension containing the cells from which the supernatant has been removed in (5) is expanded to the cell collection device 1000 shown in FIGS. 1 and 2, and an alternating voltage is applied for 3 minutes to the holding unit 60 of the device. The cells were allowed to retain. The cell recovery apparatus 100 used in this example is an insulator 12 having a plurality of micropores consisting of micropores having a diameter of 30 μm and a depth of 40 μm, and a light shielding chromium film disposed between the insulator and the lower electrode substrate. A structure in which a holding portion 60 formed of (light shielding member 11) is sandwiched between a spacer 20 having a thickness of 1 mm and a lower electrode substrate 31, and a structure in which the spacer 20 is sandwiched between an upper electrode substrate 31 and a lower electrode substrate 32. is there.
(7) While applying an alternating voltage under the conditions of (6), introduce a 300 mM mannitol aqueous solution containing 0.01 (w / v)% of poly-L-lysine and, after standing for 3 minutes, The application was stopped and the aqueous solution was removed by suction.
(8) Introduce an aqueous solution containing 50% (v / v) ethanol and 1% (w / v) formaldehyde (hereinafter referred to as a cell membrane permeation reagent), and allow the cell membrane to permeate by holding for 10 minutes to obtain a holding portion 60 The cells introduced into E. coli were sampled.
(9) The cell membrane permeation reagent was aspirated and removed, and PBS (Phosphate buffered saline) was introduced to wash away the remaining cell membrane permeation reagent.
(10) A fluorescently labeled antibody capable of specifically binding to a protein inside or outside the cell membrane, and a fluorescent reagent (DAPI: 4 ', 6-DiAmidino-2-PhenylIndol (Dojindo Laboratories)) for labeling the cell nucleus An aqueous solution (hereinafter, labeled reagent) was introduced and allowed to stand for 30 minutes. As the labeled antibody, an antibody against CD45 expressed on the surface of leukocytes (Beckman-Coulter) and an antibody against CK (cytokeratin) expressed in the cytoplasm of epithelial cells (Miltenyi Biotec) It is used.
(11) The labeled reagent was removed by aspiration, and PBS was introduced to remove the remaining labeled reagent.
(12) After placing the cell collection device 100 including the cells labeled in (11) on the stage of the fluorescence microscope, imaging of the entire holding unit 60 to observe all the cells captured by the plurality of holding units 60 Did. For this, a fluorescence microscope (IX71 manufactured by Olympus) equipped with a computer-controlled motorized stage and an electron multiplying cooled CCD camera (EMCCD, ADT-100 manufactured by FLOVEL) was used. LabVIEW (National Instruments) was used for image acquisition and analysis software.
(13) From the cells imaged in (12),
It is a cell (DAPI positive) that is stained with DAPI indicating that it has a cell nucleus,
Cells not stained with antibodies against CD45 expressed on leukocytes (CD45 negative),
Cells that are not stained with an antibody to CK (CK negative) indicating that they have epithelial system properties, and target cells with larger cell shape in bright field as compared to red blood cells and white blood cells It counted as (cancer cells).
(14) After removing the upper electrode substrate 32 of the cell collection device 100, the target cell already placed in the holding unit 60 is placed on the stage of the fluorescence microscope, and the target cells counted in (13) are cylindrical tubules And aspirated the target cells into the PCR tube.
(15) Gene hotspot analysis of target cells was performed to identify mutations in the target cells. Specifically, the genomic DNA extracted from the target cells is amplified with a 1-cell whole genome amplification kit (Ampli manufactured by Silicon Biosystems), and the obtained PCR product is gel purified, and an IonPGM sequencer and Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 kit Mutations in 50 cancer-related genes were analyzed by (All Thermo Fisher Inc.).
検出されたがん関連遺伝子変異は、既知のもの、および未知のものが混在していた。なお、がん細胞株を用いたシークエンス結果の質が担保されていることを確認した遺伝子変異を、解析した個々のＣＴＣが有しているがん関連遺伝子変異とした。その遺伝子変異より、後述の比較例１および２で得られた遺伝子変異を除いたものが、ＣＴＣ固有の遺伝子変異であると同定した。それらは全て未知の遺伝子変異であり、当該遺伝子変異が形質に与える影響は未知であった。変異のタイプはミスセンス変異あるいはインフレーム変異であり、タンパクレベルで影響を与える変異である可能性が示唆された。また、ＳＩＦＴアルゴリズムに基づく同遺伝子変異のタンパク機能への影響予測（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．、４（２００９）、１０７３−１０８１）では、タンパク機能に影響を与える遺伝子変異である事が示唆された。 Known and unknown cancer-related gene mutations were mixed. In addition, the gene mutation which confirmed that the quality of the sequencing result using a cancer cell line was ensured was made into the cancer related gene mutation which each CTC analyzed has. From those gene mutations, those obtained by removing the gene mutations obtained in Comparative Examples 1 and 2 described later were identified as CTC-specific gene mutations. All of them were unknown gene mutations, and the influence of the gene mutations on the trait was unknown. The type of mutation was a missense mutation or an in-frame mutation, which suggested that it might be a mutation that affects the protein level. In addition, prediction of the effect of the same gene mutation on protein function based on the SIFT algorithm (Nat Protoc., 4 (2009), 1073-1081) suggested that it is a gene mutation that affects protein function.
本例で取得した遺伝子変異（塩基置換）および当該変異に相当するタンパク質変異（アミノ酸置換）の位置を表１に示す。表１に示す変異（塩基置換およびアミノ酸置換）はいずれもステージＩＶのがん患者特有の変異であることから、前記変異を検出することでがん患者の予後予測が可能であることが示唆される。
比較例１ がん原発組織およびがん転移組織における遺伝子変異
実施例１（１）において採血したがん患者からがん原発組織を採取した。
がん原発組織および転移組織の切除検体、あるいはホルマリン固定パラフィン包埋組織検体より、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを、上述のＩｏｎＰＧＭ（サーモフィッシャー）Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑTM Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２によって５０種のがん関連遺伝子変異を解析した。
Comparative Example 1 Gene Mutation in Cancer Primary Tissue and Cancer Metastatic Tissue A cancer primary tissue was collected from a cancer patient whose blood was collected in Example 1 (1).
Genomic DNA extracted from resected specimens of cancer primary tissue and metastatic tissue or from formalin fixed paraffin embedded tissue specimens using QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (manufactured by Qiagen) is the above-mentioned IonPGM (Thermo Fisher) Ion AmpliSeq TM Fifty cancer-related gene mutations were analyzed by Cancer Hotspot Panel v2.
比較例２ 正常の血球（白血球）における遺伝子変異
実施例１（１）において採血したがん患者から白血球を採取した。
患者末梢血よりＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを、上述のＩｏｎＰＧＭ（サーモフィッシャー）Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑTM Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２によって５０種のがん関連遺伝子変異を解析した。
Comparative Example 2 Gene Mutation in Normal Blood Cells (Leukocytes) Leukocytes were collected from the cancer patients collected in Example 1 (1).
The DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen Company) extracted genomic DNA using from patient peripheral blood, were analyzed 50 kinds of cancer-associated mutations by the above IonPGM (Thermo Fisher) Ion AmpliSeq TM Cancer Hotspot Panel v2 .
実施例２ 抗体・プローブ作成
本発明の因子に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、マウス、ラットなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし抗体産生細胞を作製する際の細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
Example 2 Preparation of Antibody and Probe The protein or fragment thereof used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody against the factor of the present invention is not limited to the animal species from which it is derived, such as human, mouse, rat and the like. However, it is preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion in producing antibody-producing cells, and in general, proteins of mammalian origin are preferable, and proteins of human origin are particularly preferable. .
まず公知の方法にしたがい、感作抗原を動物に免疫した。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに免疫応答の増強に有用なアジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）を適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。続いて、免疫した哺乳動物の血清中に所望の抗体が上昇するのを確認した後、哺乳動物から免疫細胞を採取するが、好ましい免疫細胞としては、特に脾臓細胞由来のＢ細胞が挙げられる。 免疫細胞懸濁液は、脾臓内から注射針とピンセットを用いてＲＰＭＩ１６４０培地に取り出して調製した。 First, animals were immunized with a sensitizing antigen according to a known method. As a general method, the sensitizing antigen is injected by intraperitoneal or subcutaneous injection of a mammal. Specifically, the sensitization antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc. and suspended in an appropriate amount of an adjuvant (Adjuvant) useful for enhancing the immune response mixed and emulsified. Administer to mammals several times every 4 to 21 days. Subsequently, after confirming that the desired antibody is elevated in the serum of the immunized mammal, immune cells are collected from the mammal. Preferred immune cells include B cells particularly derived from spleen cells. The immune cell suspension was prepared by removing it from the spleen into RPMI 1640 medium using a needle and tweezers.
続いて、前記免疫細胞とミエローマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを作製した。具体的には、前記細胞融合は、細胞融合促進剤の存在下で実施される。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用される。免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他には細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。 Subsequently, the above immune cells and myeloma cells were fused to prepare a hybridoma that produces the desired antibody. Specifically, the cell fusion is performed in the presence of a cell fusion promoter. As a fusion promoter, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used. The mixing ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily. For example, it is preferable to use 1 to 10 times as many immune cells as myeloma cells. As a culture solution used for the cell fusion, for example, RPMI 1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other common culture solutions used for cell culture can be used, and cattle Serum supplements such as fetal serum (FCS) can also be used in combination.
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって融合細胞を作製する。続いて、適当な培養液を添加した後、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより融合細胞の洗浄を行う。次に前記融合細胞をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培養液）に懸濁し、１ウェルあたり２００μＬとなるように９６ウエルプレートに播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ２環境にて培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。 For cell fusion, a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are well mixed in the culture solution, and a PEG solution (for example, about 1000 to 6000 average molecular weight) preheated to about 37 ° C. Fusion cells are made by adding and mixing at a concentration of w / v). Subsequently, after adding an appropriate culture solution, the fused cells are washed by repeating the operation of removing the supernatant by centrifugation. Next, the fused cells were suspended in HAT medium (hypoxanthine, aminopterin, thymidine medium), and seeded in a 96 well plate at 200 μl per well. By culturing in a 5% CO 2 environment at 37 ° C. for 7 days, a hybridoma in which spleen cells and myeloma cells were fused was obtained.
前記ハイブリドーマから得られた抗体は、モノクローナル抗体である。転移形成能を有するがん細胞の検出において、抗体は直接的または間接的に標識される。直接的な標識には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンおよびフィコエリスリンなど蛍光色素を抗体に結合させる。抗体と蛍光色素との結合には、抗体のアミノ基と反応する活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル）を導入した化合物や、ＳＨ基を標識に利用する場合は、マレイミド基を導入した低分子を使用する。別の手法として、検出可能なシグナルをもたらす蛍光タンパク質および酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）を抗体に結合してもよい。間接的な標識には、抗体に特異的な第２の抗体もしくは特異的な結合対（ビオチン−アビジン等）を用いて標識することで目的の細胞を検出する。 The antibody obtained from the hybridoma is a monoclonal antibody. In the detection of cancer cells capable of forming a metastasis, the antibody is directly or indirectly labeled. For direct labeling, fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine and phycoerythrin are attached to the antibody. For binding of an antibody to a fluorescent dye, a compound into which an active ester (N-hydroxysuccinimide active ester) that reacts with the amino group of the antibody is introduced, or a low molecular weight into which a maleimide group is introduced when the SH group is used for labeling Use Alternatively, fluorescent proteins and enzymes (eg, β-galactosidase, luciferase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) that provide a detectable signal may be attached to the antibody. For indirect labeling, a target cell is detected by labeling with a second antibody specific to the antibody or a specific binding pair (biotin-avidin etc.).
実施例３ 予後予測
（１）インフォームドコンセントを得た癌患者から、治療経過に合わせて血液を数回採取した。
（２）（１）で採取した血液を溶血法、比重分離法、磁気ビーズ分離法等の１つ、もしくいずれかの組合せを用いることにより、血液内のＣＴＣを濃縮した。
（３）濃縮後の細胞群を、生理食塩水、（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、マンニトール等の細胞を等張に調整された糖溶媒に懸濁した。
（４）前記懸濁液をガラススライド、もしくは細胞と同サイズのマイクロウェルが多数配置されたようなマイクロウェルチップに展開した標本を作製した。
（５）ホルムアルデヒドやエタノール等に例示される細胞固定液、膜透過液を導入し、約１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。
（６）細胞固定、膜透過液を吸引除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した細胞固定、膜透過液を洗浄した。
（７）がんの転移形成に関与する因子に結合する蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む水溶液を導入し、３０分間静置した。なお、混入した白血球の標識には、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体を用いた。
（８）標識液を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識液を除去した。
（９）標識後の標本（ガラススライド、マイクロウェルチップ）を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持孔に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部全体の撮像を行なった。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＥＭＣＣＤ；ＦＬＯＶＥＬ，ＡＤＴ−１００）を装備した蛍光顕微鏡（ＩＸ７１； Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた。
（１０）（９）で撮像した細胞の中から、
細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されている細胞（ＤＡＰＩ陽性）であり、
白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体で染色されていない細胞（ＣＤ４５陰性）であり、がん転移形成に関与する因子の対する抗体で染色された標的細胞（ＤＡＰＩ陽性／ＣＤ４５陰性／がん転移因子陽性細胞）を計数した。
予後予測の閾値は、健常者からの偽陽性数（ベースライン）、ＣＴＣ数と無増悪生存期間および全生存期間の評価にて決定する。
Example 3 Prognosis (1) From cancer patients who obtained informed consent, blood was collected several times in accordance with the progress of treatment.
(2) CTC in blood was concentrated by using one or any combination of hemolytic method, specific gravity separation method, magnetic bead separation method, etc. for the blood collected in (1).
(3) The concentrated cell group was suspended in physiological saline, (Phosphate-Buffered Saline), or a sugar solvent in which cells such as mannitol were adjusted to be isotonic.
(4) A sample was prepared in which the above suspension was spread on a glass slide or a microwell chip in which a large number of microwells of the same size as the cells were arranged.
(5) A cell fixative exemplified by formaldehyde, ethanol and the like and a membrane permeate were introduced and allowed to stand for about 10 minutes to allow cell membranes to permeate and the cells introduced into the holding part were sampled.
(6) Cell Fixation, The membrane permeate was aspirated and removed, and PBS (Phosphate buffered saline) was introduced to wash the remaining cell fix, the membrane permeate.
(7) Introduce an aqueous solution containing a fluorescently labeled antibody that binds to a factor involved in the formation of cancer metastasis, and a fluorescent reagent (DAPI: 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) that labels cell nuclei; Let stand for a minute. In addition, an antibody against CD45 expressed on the surface of leukocytes was used for the labeling of the mixed leukocytes.
(8) The labeling solution was aspirated and removed, and the remaining labeling solution was removed by introducing PBS.
(9) After placing the labeled specimen (glass slide, micro well chip) on the stage of the fluorescence microscope, the entire holder was imaged to observe all the cells captured in the plurality of holding holes. . For this, a fluorescence microscope (IX71; Olympus) equipped with a computer-controlled motorized stage and an electron multiplying cooled CCD camera (EMCCD; FLOVEL, ADT-100) was used. LabVIEW (National Instruments) was used for image acquisition and analysis software.
(10) From the cells imaged in (9),
It is a cell (DAPI positive) that is stained with DAPI indicating that it has a cell nucleus,
Target cells not stained with antibodies against CD45 expressed on leukocytes (CD45 negative) and stained with antibodies against factors involved in cancer metastasis (DAPI positive / CD45 negative / cancer metastasis factor Positive cells were counted.
The prognostic threshold is determined by the number of false positives (baseline) from healthy individuals, the number of CTCs and the assessment of progression free survival and overall survival.
例えば、進行性乳がん、前立腺がん、大腸がんにて米国ＦＤＡ認可を取得しているＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムでは、ベースライン若しくは処置終了時の患者において５以上ＣＴＣが検出された場合、無増悪生存期間および全生存期間の中央値が短く、ＣＴＣ数が５個未満の患者は最長の無増悪生存期間および全生存期間の中央値を示した。加えて、処置前のＣＴＣ数が５個以上の患者において、処置後に５個未満に低下した群は、５個以上のＣＴＣ数を維持した患者より長い無増悪および全生存期間の中央値を有した（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５１（２００４）、７８１−７９１）。 For example, with the CellSearch system that has received US FDA approval for advanced breast cancer, prostate cancer, and colon cancer, progression-free survival and if at least 5 CTCs are detected in patients at baseline or at the end of treatment, Patients with a short median overall survival and fewer than 5 CTCs had the longest progression-free survival and a median overall survival. In addition, in patients with 5 or more CTCs before treatment, groups that dropped to less than 5 after treatment have longer median progression-free and overall survival than patients with 5 or more CTCs. (Cristofanilli M et al., N Engl J Med, 351 (2004), 781-791).
実施例４ がん細胞株への遺伝子導入
（１）実施例１で取得した遺伝子変異のうち、ＳＭＡＤ４遺伝子およびＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を選択し、それぞれ野生型（ＳＭＡＤ４遺伝子：配列番号４、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子：配列番号６）と変異型（ＳＭＡＤ４遺伝子：配列番号１１、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子：配列番号１４）のｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成したｃＤＮＡはシーケンスにより配列を確認した。なおこれらの操作はユニーテック社に委託した。
（２）レトロウイルスベクターの骨格としてｐＭＸｓ−Ｎｅｏベクターを用い、（１）で合成したｃＤＮＡをそれぞれ挿入したベクターを作製した。また、ｐＭＸ−Ｎｅｏを基に、Ｎｅｏ（ネオマイシン）遺伝子を緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子に置換した空ベクターを作製した。作製したベクターは、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により前記配列が挿入されていることを確認した。また、シーケンスにより挿入した配列を確認した。なおこれらの操作はユニーテック社に委託した。
（３）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社）を用い、（２）で作製したベクターをそれぞれパッケージング細胞である２９３Ｔ細胞に形質導入し、４８時間培養後に採取した培養液上清をフィルターろ過することにより、各種レトロウイルス液を得た。
（４）ヒト大腸がん細胞株ＷｉＤＲに対しレトロウイルス感染を行ない、前記遺伝子をそれぞれ形質導入した。レトロウイルス感染は、ＷｉＤＲ細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間後に（３）で取得したレトロウイルス液をそれぞれ２倍希釈となるようウェルに加え、そのまま４８時間培養することにより行なった。前記方法により、５種の遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞（野生型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞、変異型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞、野生型ＳＭＡＤ４遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞、変異型ＳＭＡＤ４遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞およびＥＧＦＰ遺伝子（空ベクター）導入ＷｉＤＲ細胞）を取得した。
Example 4 Gene Transfer to Cancer Cell Lines (1) Among the gene mutations obtained in Example 1, the SMAD4 gene and PIK3CA gene were selected, and wild type (SMAD4 gene: SEQ ID NO: 4, PIK3CA gene: SEQ ID NO: 6) and the mutant (SMAD4 gene: SEQ ID NO: 11, PIK3CA gene: SEQ ID NO: 14) cDNAs were synthesized respectively. The synthesized cDNAs were sequenced by sequencing. These operations were outsourced to Unitech.
(2) Using pMXs-Neo vector as a backbone of a retrovirus vector, vectors into which cDNAs synthesized in (1) were inserted were prepared. Also, based on pMX-Neo, an empty vector was prepared in which the Neo (neomycin) gene was replaced with a green fluorescent protein (EGFP) gene. The generated vector was confirmed to be inserted by 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis. Moreover, the inserted sequence was confirmed by the sequence. These operations were outsourced to Unitech.
(3) Using the Retrovirus Packaging Kit Ampho (Takara Bio Inc.), transfect the vectors prepared in (2) into 293T cells, which are packaging cells, and filter the culture supernatant collected after 48 hours of culture Thus, various retrovirus solutions were obtained.
(4) The human colon cancer cell line WiDR was retrovirally infected and transduced with the gene. Retrovirus infection was carried out by seeding WiDR cells in a 6-well plate, adding 24 hours later the retrovirus solution obtained in (3) to each well so as to be 2-fold dilution, and culturing as it is for 48 hours. According to the method described above, five types of transgenic WiDR cells (wild-type PIK3CA transgenic WiDR cells, mutant PIK3CA transgenic WiDR cells, wild-type SMAD4 transgenic WiDR cells, mutated SMAD4 transgenic WiDR cells and EGFP gene (empty vector) Transfected WiDR cells were obtained.
実施例５ 遺伝子導入細胞の形態観察
実施例４で取得した５種の遺伝子導入ＷｉＤＲ細胞と、ネガティブコントロールとして遺伝子導入未実施のＷｉＤＲ細胞をそれぞれ接着細胞培養用２４ウェルプレートに播種し、９６時間培養後、正立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いて細胞形態を観察した。
Example 5 Morphological Observation of Transfected Cells The five transgenic WiDR cells obtained in Example 4 and untransfected WiDR cells as negative controls were respectively seeded on a 24-well plate for adherent cell culture, and cultured for 96 hours. Thereafter, cell morphology was observed using an upright microscope (Olympus IX71).
取得した細胞形態画像を図４に示す。ネガティブコントロールである遺伝子導入未実施のＷｉＤＲ細胞は、敷石状に隣接して増殖していた（腫瘍組織で主に観察される上皮細胞様形態、図４（１））。ＥＧＦＰ遺伝子（空ベクター）（図４（２））、野生型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子（図４（３））および変異型ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子（図４（４））を導入したＷｉＤＲ細胞は、いずれもネガティブコントロール（図４（１））と同様に上皮細胞様形態を取っていた。また、野生型ＳＭＡＤ４遺伝子（図４（５））および変異型ＳＭＡＤ４遺伝子（図４（６））を導入したＷｉＤＲ細胞は、ともに丸く浮遊系の形態となって増殖していた。ＳＭＡＤ４は腫瘍組織から血管内へ浸潤する際、上皮間葉転換により間葉系細胞へ形態変化させる因子であることが示唆された。 The acquired cell morphology image is shown in FIG. The negative control, untransduced WiDR cells, were proliferating adjacent to the cobblestone (epithelial cell-like morphology mainly observed in tumor tissue, FIG. 4 (1)). All WiDR cells into which EGFP gene (empty vector) (Fig. 4 (2)), wild type PIK3CA gene (Fig. 4 (3)) and mutant PIK 3 CA gene (Fig. 4 (4)) have been introduced are negative controls (Fig. 4). Similar to 4 (1), it had an epithelial cell-like morphology. In addition, WiDR cells into which the wild-type SMAD4 gene (FIG. 4 (5)) and the mutant SMAD 4 gene (FIG. 4 (6)) were introduced were both proliferating in the form of a floating suspension. It has been suggested that SMAD4 is a factor that causes morphological transformation to mesenchymal cells by epithelial-mesenchymal transition when infiltrating tumor tissue into blood vessels.
１００：細胞回収装置
１０：細胞保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ・１２ａ：貫通孔
２０：スペーサー
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：細胞
７１：標的細胞（ＣＴＣ）
８０：誘電泳動力
９０：接着物質
２００：蛍光顕微鏡
３００：回収装置
４００：回収チューブ
100: cell collection device 10: cell holding means 11: light shielding member 12: insulator 11a · 12a: through hole 20: spacer 21: inlet 22: outlet 23: through portion 31 · 32: electrode substrate 40: conducting wire 50: Signal generator 60: Retaining part 70: Cell 71: Target cell (CTC)
80: dielectrophoretic force 90: adhesive substance 200: fluorescence microscope 300: recovery device 400: recovery tube
Claims (15)
前記アミノ酸置換が、以下の（１）から（４）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法。
（１）配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換
（２）配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換
（３）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換
（４）配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換 What is claimed is: 1. A method of predicting prognosis in cancer patients, comprising the step of detecting amino acid substitution of a protein in a collected sample,
The above prediction method, wherein the amino acid substitution is substitution of at least one of the following (1) to (4):
(1) glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine (2) glutamine at position 2684 of SEQ ID NO: 2 is substituted with leucine (3) phenylalanine at position 2686 of SEQ ID NO: 2 is substituted with valine (4) SEQ ID NO: The 1066th alanine of 3 is substituted for threonine
前記塩基置換が、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法。
（Ｉ）配列番号１の２５６番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩ）配列番号２の２６８４番目のグルタミンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンに対応するコドンがバリンに対応するコドンに置換
（ＩＶ）配列番号３の１０６６番目のアラニンに対応するコドンがスレオニンに対応するコドンに置換 A method for predicting prognosis in cancer patients, comprising the step of detecting base substitution of a polynucleotide in a collected sample,
The prediction method, wherein the base substitution is a substitution of at least one of the following (I) to (IV):
(I) The codon corresponding to glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 is substituted with the codon corresponding to leucine (II) The codon corresponding to glutamine at position 2684 of SEQ ID NO: 2 is substituted for the codon corresponding to leucine (III) The codon corresponding to phenylalanine at position 2686 of No. 2 is substituted for the codon corresponding to valine (IV) The codon corresponding to the alanine at position 1066 of SEQ ID NO: 3 is substituted for the codon corresponding to threonine
前記塩基置換が、以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つの置換である、前記予測方法。
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換 A method for predicting prognosis in cancer patients, comprising the step of detecting base substitution of a polynucleotide in a collected sample,
The prediction method, wherein the base substitution is a substitution of at least one of the following (i) to (iv):
(I) substitution of thymine for 1305th adenine of SEQ ID NO: 4 (ii) substitution of thymine for 8436th adenine of SEQ ID NO: 5 (iii) substitution of 8441th thymine for SEQ ID NO: 5 for guanine (iv) SEQ ID NO: 4 6 3353th guanine is replaced with adenine
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号１の２５６番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８４番目のグルタミンがロイシンに置換した前記ポリペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号２の２６８６番目のフェニルアラニンがバリンに置換した前記ポリペプチド
（４）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、少なくとも配列番号３の１０６６番目のアラニンがスレオニンに置換した前記ポリペプチド A protein involved in cancer metastasis formation ability, comprising a polypeptide of any one of the following (1) to (4):
(1) In the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the above polypeptide wherein at least the glutamine at position 256 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine (2) the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 wherein at least the 2684th glutamine at SEQ ID NO: 2 has been substituted with leucine, wherein at least the 2686th phenylalanine in SEQ ID NO: 2 has been substituted for valine Polypeptide (4), which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, wherein at least the 1066th alanine of SEQ ID NO: 3 is substituted for threonine
（ｉ）配列番号４の１３０５番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉ）配列番号５の８４３６番目のアデニンがチミンに置換
（ｉｉｉ）配列番号５の８４４１番目のチミンがグアニンに置換
（ｉｖ）配列番号６の３３５３番目のグアニンがアデニンに置換 The gene of the base sequence which has a substitution of at least any one among the following (i) to (iv) in the base sequence of any one of SEQ ID NO: 4 to 6.
(I) substitution of thymine for 1305th adenine of SEQ ID NO: 4 (ii) substitution of thymine for 8436th adenine of SEQ ID NO: 5 (iii) substitution of 8441th thymine for SEQ ID NO: 5 for guanine (iv) SEQ ID NO: 4 6 3353th guanine is replaced with adenine
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