JP2019060609A - Medium for cell evaluation using terahertz wave - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、テラヘルツ波を用いた細胞評価用の媒質に関する。 The present invention relates to a medium for cell evaluation using terahertz waves.
細胞内における多くの生体分子プロセスに不可欠な細胞内の水は、これら細胞活動に関連して大いに着目されてきた。その理由は、生細胞の内側の水が細胞内拡散速度、立体構造の遷移、酵素触媒活性などのプロセスを媒介すると予測されるからである。そのため、細胞内の水の状態を観測する試みがなされてきた。 Intracellular water, which is essential for many biomolecular processes in cells, has received much attention in relation to these cell activities. The reason is that water inside living cells is predicted to mediate processes such as intracellular diffusion rate, conformational transition, and enzyme catalytic activity. Therefore, attempts have been made to observe the state of water in cells.
テラヘルツ波は、半導体やアミノ酸結晶などの固体試料の評価のみならず、水溶液のイオン濃度や水の温度変化に対しても感度を有することから、水溶液や水を多く含む生体試料の測定技術の分野でも注目されている。 Terahertz waves are sensitive not only to the evaluation of solid samples such as semiconductors and amino acid crystals, but also to the ion concentration of aqueous solution and temperature change of water, so the field of measurement techniques of biological samples containing a large amount of aqueous solution and water. But it is being watched.
例えば、非特許文献１には、全反射減衰テラヘルツ分光法を用いて、生細胞中の水分子の動態を観測することが記載されている。 For example, Non-Patent Document 1 describes that the behavior of water molecules in living cells is observed using total reflection attenuation terahertz spectroscopy.
通常、全反射減衰測定においてテラヘルツ電場の局在の深さは細胞の厚みよりも大きいため、測定結果は細胞外の媒質の影響を受ける。非特許文献１の方法では、細胞外の媒質に含まれる水によってテラヘルツ波の多くが吸収されるため、細胞中の水の情報を充分に得ることができない場合がある。しかしながら、テラヘルツ電場の局在の深さをより小さくして、細胞外の媒質の影響をより低減するためには、技術的な限界がある。 Usually, the measurement result is influenced by the extracellular medium, since the localization depth of the terahertz electric field in total reflection attenuation measurement is larger than the thickness of the cell. In the method of Non-Patent Document 1, much of the terahertz wave is absorbed by the water contained in the extracellular medium, so there are cases where sufficient information on water in cells can not be obtained. However, there are technical limitations to further reduce the influence of the extracellular medium by reducing the depth of localization of the terahertz electric field.
また、近年、細胞診断を含む生体試料の状態評価の技術分野において、生物組織由来試料に含まれる細胞の、より微細な特徴を検出することに対する要求が高まっている。 In recent years, in the technical field of condition evaluation of biological samples including cytodiagnosis, there is an increasing demand for detecting finer features of cells contained in biological tissue-derived samples.
上記課題に鑑み、本発明の一態様は、テラヘルツ波を用いた細胞評価において細胞内の水に関する情報をより多く検出し得る技術を提供することを目的とする。 In view of the above problems, it is an object of the present invention to provide a technology capable of detecting more information on water in cells in cell evaluation using terahertz waves.
上記の課題を解決するために、本発明の一態様は、以下のとおりである。
１）無極性の液体を含んでなる、テラヘルツ波を用いた細胞評価用の媒質。
２）上記無極性の液体は、フルオロカーボン類及び鉱物油類からなる群より選択される少なくとも一種である、１）に記載の媒質。
３）上記無極性の液体は、パーフルオロカーボン類である、１）又は２）に記載の媒質。
４）上記１）〜３）の何れかに記載の媒質中にある細胞と相互作用する領域に、テラヘルツ波を伝達する工程を含む、細胞の評価方法。
５）さらに、上記細胞とテラヘルツ波との相互作用を検出する工程を含む、４）に記載の方法。
６）検出する上記工程で得た結果を、基準と比較する工程を含む、５）に記載の方法。
７）評価対象である上記細胞とは異なる細胞であって、上記媒質中にある細胞とテラヘルツ波との相互作用を検出した結果を、上記基準とする、６）に記載の方法。
In order to solve the above-mentioned subject, one mode of the present invention is as follows.
1) A medium for cell evaluation using terahertz waves, comprising a nonpolar liquid.
2) The medium according to 1), wherein the nonpolar liquid is at least one selected from the group consisting of fluorocarbons and mineral oils.
3) The medium according to 1) or 2), wherein the nonpolar liquid is a perfluorocarbon.
4) A method for evaluating cells, which comprises the step of transmitting terahertz waves to a region in the medium described in any of 1) to 3) that interacts with cells.
5) The method according to 4), further comprising the step of detecting the interaction between the cell and the terahertz wave.
6) The method according to 5), which comprises the step of comparing the result obtained in the above step of detection with a reference.
7) The method according to 6), which is a cell different from the cell to be evaluated, and the result of detecting the interaction between the cell in the medium and the terahertz wave is the above-mentioned standard.
本発明の一態様によれば、テラヘルツ波を用いた細胞評価において細胞内の水に関する情報をより多く検出し得る技術を提供することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to provide a technology capable of detecting more information on water in cells in cell evaluation using terahertz waves.
〔１．細胞へテラヘルツ波を伝達するための媒質〕
本実施形態に係るテラヘルツ波を用いた細胞評価用の媒質は、無極性の液体を含んでなる。
[1. Medium for transmitting terahertz waves to cells]
The medium for cell evaluation using the terahertz wave according to the present embodiment includes a nonpolar liquid.
本書において「液体」は、細胞の評価条件下の少なくとも一点において液体であるものを指す。典型的には、０℃以上で４０℃以下の範囲内の温度（好ましくは１０℃以上で３８℃以下の範囲内の温度）と、０．５ａｔｍ以上で１．５ａｔｍ以下の範囲内の気圧（好ましくは０．８ａｔｍ以上で１．２ａｔｍ以下の範囲内の気圧）とから選択される、温度と気圧との組み合わせ条件下の少なくとも一つで、液体の形態をとるものが好ましい。テラヘルツ波を用いた細胞評価の具体的な説明は、後述の〔２．細胞の評価方法〕に記載のとおりである。本書において「テラヘルツ波」とは、周波数が約０．１ＴＨｚ〜１０ＴＨｚの電磁波を指す。 As used herein, "liquid" refers to one that is liquid at at least one point under the evaluation conditions of the cells. Typically, temperatures within the range of 0 ° C. or more and 40 ° C. or less (preferably temperatures within the range of 10 ° C. or more and 38 ° C. or less) and pressures within the range of 0.5 atm or more and 1.5 atm or less Preferably, it is in the form of a liquid under at least one of a combination of temperature and pressure, which is selected from pressures in the range of 0.8 atm to 1.2 atm). A specific description of cell evaluation using terahertz waves is described later in [2. Method for Evaluating Cells]. In this document, the term "terahertz wave" refers to an electromagnetic wave having a frequency of about 0.1 THz to 10 THz.
無極性の液体は、細胞に対して毒性が低いか、又は有さないことが好ましい。好ましい一例において、無極性の液体に浸漬してから２４時間後の細胞生存率は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上である。 Preferably, the nonpolar liquid has low or no toxicity to cells. In a preferred example, the cell viability after 24 hours of immersion in the nonpolar liquid is 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 40% or more.
無極性の液体は、密度が水より高いことが好ましい。培養培地、生理食塩水、又はPhosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）等と交換された際に、残った水相が無極性の液体相の上に移動するため、特に接着細胞において、容易に細胞の周りに無極性の液体を配することができる。 The nonpolar liquid is preferably higher in density than water. As the remaining aqueous phase moves onto the nonpolar liquid phase when exchanged with culture medium, physiological saline, or Phosphate Buffered Saline (PBS), etc., it is easily around the cells, especially in adherent cells. Non-polar liquid can be disposed.
無極性の液体として具体的には、パーフルオロカーボン類（パーフルオロカーボン、パーフルオロ−Ｎ−アルキルモルホリン、パーフルオロ（２−ブチル−テトラヒドロフロン）、及びパーフルオロトリペンチルアミン等）等のフルオロカーボン類；シリコーンオイル、及びライトミネラルオイル等の鉱物油（ミネラルオイル）類などが挙げられる。フルオロカーボン類の具体的な製品として、フロリナートが挙げられる。無極性の液体は、なかでも、フルオロカーボン類及び鉱物油類からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、フルオロカーボン類であることがより好ましく、パーフルオロカーボン類であることがさらに好ましく、主成分がＣ９パーフルオロカーボンであるパーフルオロカーボン（例えば、フロリナート FC-3283（３Ｍ社製）が挙げられる）、Ｃ５〜１８パーフルオロカーボン（例えば、フロリナート FC-72（３Ｍ社製）が挙げられる）、及びパーフルオロ−Ｎ−アルキルモルホリン（例えば、フロリナート FC-770（３Ｍ社製）が挙げられる）からなる群より選択される少なくとも一種であることが特に好ましい。フルオロカーボン類は、培養液を含まない直接暴露状態における細胞生存率がより良好である（後述の実施例も参照）。 Specific examples of the nonpolar liquid include fluorocarbons such as perfluorocarbons (perfluorocarbon, perfluoro-N-alkylmorpholine, perfluoro (2-butyl-tetrahydroflon), perfluorotripentylamine and the like); silicone Oil, and mineral oil such as light mineral oil (mineral oil) and the like. Specific products of fluorocarbons include Fluorinert. The nonpolar liquid is preferably at least one selected from the group consisting of fluorocarbons and mineral oils, more preferably fluorocarbons, and still more preferably perfluorocarbons, among others. Perfluorocarbons whose components are C9 perfluorocarbons (for example, Fluorinert FC-3283 (manufactured by 3M)), C5-18 perfluorocarbons (for example, Fluorinert FC-72 (manufactured by 3M)), and par It is particularly preferable to be at least one selected from the group consisting of fluoro-N-alkyl morpholine (for example, Fluorinert FC-770 (manufactured by 3M)). Fluorocarbons have better cell viability under direct exposure without culture fluid (see also the examples below).
無極性の液体は、テラヘルツ波の吸収が水よりも小さい（後述の実施例も参照）。そのため、テラヘルツ波を用いた細胞評価における媒質として無極性の液体を用いた場合に、細胞内の水に関する情報をより多く検出することを可能にする。 Non-polar liquids have lower terahertz wave absorption than water (see also the examples below). Therefore, when a nonpolar liquid is used as a medium in cell evaluation using terahertz waves, it is possible to detect more information on water in cells.
〔２．細胞の評価方法〕
本実施形態における細胞の評価方法は、上述の媒質中にある細胞と相互作用する領域に、テラヘルツ波を伝達する工程を含む。さらに、この細胞とテラヘルツ波との相互作用を検出する工程を含むことが好ましい。
[2. Evaluation method of cell]
The evaluation method of the cell in this embodiment includes the step of transmitting the terahertz wave to the area in the medium that interacts with the cell. Furthermore, it is preferable to include the step of detecting the interaction between this cell and the terahertz wave.
細胞とテラヘルツ波との相互作用の検出とは、細胞の存在によってテラヘルツ波電場に生じる変化を検出することを広く指し、例えば、細胞内での誘電応答の検出、具体的には細胞内水分子の誘電応答の検出が挙げられる。当該のテラヘルツ波電場に対する誘電応答は、複素誘電率として数値化され得、特には水分子の動態及び水素結合状態を反映する複素誘電率実部並びに複素誘電率虚部として数値化され得る。 The detection of the interaction between the cell and the terahertz wave refers broadly to detecting a change in the terahertz wave electric field caused by the presence of the cell, for example, detection of a dielectric response in the cell, specifically, intracellular water molecules Detection of the dielectric response of The dielectric response to the terahertz wave electric field can be quantified as the complex dielectric constant, and in particular, can be quantified as the complex permittivity real part and the complex permittivity imaginary part reflecting the movement of the water molecule and the hydrogen bonding state.
このような検出結果に基づき、細胞内の状態として、細胞内の水分子含有率、ストレス状態（例えば酸化ストレス）、細胞の悪性腫瘍度などを評価することができる。 Based on such detection results, it is possible to evaluate the water molecule content in cells, stress state (for example, oxidative stress), degree of malignant tumor of cells, and the like as the state in cells.
上記伝達する工程と、相互作用を検出する工程とを含む評価方法は、特に限定されないが、例えば、テラヘルツ波の反射又は透過を利用する（反射又は透過波の変化を検出する）方法や、共振を利用する（テラヘルツ波を伝達後の共振の変化を検出する）方法等、テラヘルツ波の誘電率測定に用いられている方法が挙げられる。好ましい方法として、例えば、以下の（１）の方法、（２）の方法、及び、これら（１）と（２）とを組み合わせた方法が挙げられる。 Although the evaluation method including the step of transmitting and the step of detecting an interaction is not particularly limited, for example, a method using reflection or transmission of a terahertz wave (detection of a change in the reflection or transmission wave), resonance, Methods used to measure the dielectric constant of the terahertz wave, such as a method of detecting the change in resonance after transmitting the terahertz wave. Preferred methods include, for example, the following method (1), the method (2), and the method combining these (1) and (2).
（１）ＡＴＲ法（Attenuated Total Reflection Spectroscopy：全反射減衰分光法）
参考文献：APPLIED PHYSICS LETTERS 102, 053702(2013)。参考文献：Ｊ Infrared Milli Terahz Waves (2014) 35: 493-502。実施例及び図３も参照のこと。
(1) ATR method (Attenuated Total Reflection Spectroscopy: total reflection attenuation spectroscopy)
Reference: APPLIED PHYSICS LETTERS 102, 053702 (2013). Reference: J Infrared Milli Terahz Waves (2014) 35: 493-502. See also Example and FIG.
ＡＴＲ法においては、テラヘルツ波用のプリズムの一面から底面に対して臨界角度以上でテラヘルツ波を入射し、プリズムの底面の外側にしみ出たエバネセント波と評価対象物（細胞）とを相互作用させる。そして、プリズムの底面側からの反射波を計測することによって、エバネセント波と評価対象物との相互作用を検出する。エバネセント波と評価対象物との相互作用は、減衰全反射率の変化として検出される。減衰全反射率の変化は、テラヘルツ波の吸収を反映している。なお、テラヘルツ波を用いたＡＴＲ法は、テラヘルツ時間領域分光法と組み合わせて用いることが好ましい場合がある（いわゆる、ＴＨｚ ＴＤ-ＡＴＲ分光法）。この場合、フェムト秒レーザー励起で発生したテラヘルツ波パルスは、例えばピコ秒程度の幅をもつパルスとして上記プリズムに入射され、プリズムの底面からの反射波の波形を時間分解計測する。エバネセント波と評価対象物との相互作用は、減衰全反射率の変化（テラヘルツ波の吸収を反映）と、パルス波形の時間遅延（位相変化を反映）として検出される。テラヘルツ波を用いたＡＴＲ法は、周波数可変なテラヘルツ波の発生源を用いた、テラヘルツ周波数領域分光等と組み合わせて用いてもよい。 In the ATR method, a terahertz wave is incident from the one surface of the terahertz wave prism to the bottom surface at a critical angle or more, and an evanescent wave exuded to the outside of the bottom surface of the prism interacts with the object to be evaluated (cells). . Then, the interaction between the evanescent wave and the object to be evaluated is detected by measuring the reflected wave from the bottom side of the prism. The interaction between the evanescent wave and the object to be evaluated is detected as a change in the attenuated total reflectance. The change of the attenuated total reflectance reflects the absorption of the terahertz wave. In some cases, it is preferable to use the ATR method using terahertz waves in combination with terahertz time domain spectroscopy (so-called THz TD-ATR spectroscopy). In this case, a terahertz wave pulse generated by femtosecond laser excitation is incident on the prism as a pulse having a width of about picoseconds, for example, and time-resolved measurement of the waveform of the reflected wave from the bottom of the prism. The interaction between the evanescent wave and the evaluation object is detected as a change in the attenuated total reflectance (reflecting the absorption of the terahertz wave) and a time delay of the pulse waveform (reflecting the phase change). The ATR method using terahertz waves may be used in combination with terahertz frequency domain spectroscopy or the like using a variable frequency terahertz wave generation source.
評価対象物である細胞は、プリズムの底面の外側におけるエバネセント波の照射範囲内に配され、好ましくはプリズムの底面の外側に接触するように配される。細胞の周囲は、本発明の一形態に係る、細胞評価用の媒質（無極性の液体を含んでなる媒質）によって満たされている。細胞の周囲が上記媒質で満たされていることによって、プリズムの底面側からの反射波は、細胞内の水の状態をよりよく反映する。なお、テラヘルツ波用のプリズムの底面上に、細胞を格納可能なチャンバーを取り付けることによって、評価対象となる細胞の周囲を上記媒質で満たした構成を実現することが出来る。 The cells to be evaluated are placed in the evanescent wave irradiation area outside the bottom of the prism, and preferably placed in contact with the outside of the bottom of the prism. The surroundings of the cells are filled with a medium for cell evaluation (a medium comprising non-polar liquid) according to one embodiment of the present invention. Since the surrounding of the cell is filled with the above medium, the reflected wave from the bottom side of the prism better reflects the state of water in the cell. Note that by attaching a chamber capable of storing cells on the bottom surface of the terahertz wave prism, it is possible to realize a configuration in which the periphery of the cells to be evaluated is filled with the above medium.
テラヘルツ波用のプリズム、テラヘルツ波の発生源、テラヘルツ波の検出素子等は、テラヘルツ波を用いたＡＴＲ法の分野において公知のものを適宜利用することができる。テラヘルツ波用のプリズムの材質に関すれば、ＴＰＸ製、シリコン製、ダイヤモンド製、及びＭｇＯ製等が挙げられる。 As the prism for terahertz wave, the terahertz wave generation source, the terahertz wave detection element and the like, those known in the field of the ATR method using terahertz waves can be appropriately used. With regard to the material of the prism for terahertz wave, TPX, silicon, diamond, MgO and the like can be mentioned.
なお、この方法の利点としては、例えば、確立された理論計算を用いた数値解析を通じた最適が容易であることと、所定の帯域のスペクトルを一度に取得できること（特に、ＴＨｚ ＴＤ-ＡＴＲ分光法の場合は、広帯域のスペクトルを一度に取得できる）とが挙げられる。 As an advantage of this method, for example, it is easy to optimize through numerical analysis using an established theoretical calculation, and it is possible to obtain a spectrum of a predetermined band at one time (in particular, THz TD-ATR spectroscopy) In the case of (1), a broad spectrum can be obtained at one time).
（２）ＣＭＯＳ（complementary metal oxide semiconductor）素子を用いる方法
参考文献：T. Mitsunaka et al., IEEE J. Solid-State Circuits, vol. 51, no. 11, 2016。
(2) Method using a complementary metal oxide semiconductor (CMOS) device Reference: T. Mitsunaka et al., IEEE J. Solid-State Circuits, vol. 51, no. 11, 2016.
一例において、ＣＭＯＳ素子として、テラヘルツ波発信器に接続された、パッシベーション層で覆われた回路を有するセンサを用いる（図１の（ａ））。各回路はＬＣ回路と等価で表現され、その共振周波数は回路直上の複素誘電率に影響を受けるため、センサの周囲に水がある場合、水の量に応じて周波数が変化する（この変化は、テラヘルツ波と水との相互作用を反映する）。具体的には、水が多くなるにつれて、周波数が低くなる。そのため、この周波数を測定することによって、当該水を評価することができる。本実施形態では、パッシベーション層の上に上述の媒質中にある細胞を配置し、テラヘルツ波の周波数を測定することで、細胞内の水の情報を得る（すなわち、細胞とテラヘルツ波との相互作用を検出する）ことができる。 In one example, a sensor having a circuit covered with a passivation layer connected to a terahertz wave transmitter is used as a CMOS element ((a) in FIG. 1). Each circuit is expressed as equivalent to an LC circuit, and its resonant frequency is affected by the complex dielectric constant immediately above the circuit, so if there is water around the sensor, the frequency changes according to the amount of water (this change is , Reflect the interaction between terahertz wave and water). Specifically, the frequency decreases as the amount of water increases. Therefore, the water can be evaluated by measuring this frequency. In this embodiment, cells in the medium described above are disposed on the passivation layer, and the frequency of terahertz waves is measured to obtain information on water in the cells (ie, interaction between the cells and the terahertz waves) Can be detected).
ＣＭＯＳ素子をアレイ化したチップを用いてもよい（図１の（ｂ））。１つのＣＭＯＳ素子で１つのサンプルを測定する。サンプルには、１個又は複数個の細胞が含まれ、当該細胞は上述の媒質中に存在する。 A chip in which CMOS elements are arrayed may be used ((b) in FIG. 1). One sample is measured by one CMOS device. The sample comprises one or more cells, which are present in the medium described above.
発信する周波数は特に限定されない。上記（１）の方法と異なり、（２）の方法では、発信する周波数は１つである。好ましい一例では、上記（１）のＡＴＲ法によって、後述の基準に用いる２種類以上の細胞同士での差異がより大きくなる周波数を決定（スクリーニング）し、当該周波数を（２）の方法において発信するテラヘルツ波の周波数として採用し得る。これにより、例えば、多数のサンプルについて評価したい場合に、理論計算が可能で最適化がより容易な（１）の方法で好ましい周波数を探し、次いでこの周波数を用いて、安価で且つ短時間での測定が可能な（２）の方法で多数のサンプルを効率的に評価することができる。したがって、本実施形態における細胞の評価方法は、ＡＴＲ法によってテラヘルツ波の周波数をスクリーニングする工程を含んでいてもよい。本実施形態における細胞の評価方法では、ＣＭＯＳ素子を用いて当該周波数のテラヘルツ波を細胞に伝達してもよい。 The frequency to transmit is not particularly limited. Unlike the above method (1), in the method (2), only one frequency is transmitted. In a preferred example, the frequency at which the difference between two or more types of cells used as the criteria described later becomes larger (screened) by the ATR method of (1) above, and the frequency is transmitted in the method of (2) It can be adopted as the frequency of terahertz wave. Thus, for example, when it is desired to evaluate a large number of samples, it is possible to find a preferred frequency by the method (1) in which theoretical calculation is possible and optimization is easier, and then using this frequency, inexpensive and in a short time A large number of samples can be efficiently evaluated by the method of (2) which can be measured. Therefore, the cell evaluation method in the present embodiment may include the step of screening the frequency of the terahertz wave by the ATR method. In the method of evaluating a cell in the present embodiment, a terahertz wave of the frequency may be transmitted to the cell using a CMOS device.
細胞の由来生物は、特に限定されない。単細胞生物であってもよいし、多細胞生物の細胞であってもよい。例えば、原核生物細胞、菌類細胞、及び高等真核細胞などが挙げられる。高等真核細胞としては、例えば、植物細胞、動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、ヒト及び非ヒト動物が挙げられ、より具体的には、昆虫細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ及びネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等の家畜；並びにヒトが挙げられる。また、多細胞生物の細胞である場合、体細胞であってもよいし、生殖細胞であってもよい。また、上皮組織、筋組織、神経組織、結合組織など、あらゆる組織に由来し得る。 The origin of cells is not particularly limited. It may be a unicellular organism or a cell of a multicellular organism. Examples include prokaryotic cells, fungal cells, and higher eukaryotic cells. Higher eukaryotic cells include, for example, plant cells and animal cells. Animal cells include human and non-human animals, and more specifically, insect cells, amphibian cells, reptile cells, avian cells, fish cells, mammalian cells and the like. As mammals, experimental animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs and primates excluding humans; companion animals such as dogs and cats (pets); livestock such as pigs, cows, goats, sheep and horses; It can be mentioned. Moreover, when it is a cell of a multicellular organism, it may be a somatic cell or a germ cell. It can also be derived from any tissue, such as epithelial tissue, muscle tissue, neural tissue, connective tissue and the like.
また、細胞は、生体から直接取得した細胞であってもよいし、培養細胞であってもよいし、生体における細胞であってもよい。生体から直接取得した細胞の場合、生体から単離した試料に対象の細胞が含有された状態でもよいし、また当該試料から対象の細胞を単離した状態のものでもよい。また、生体における細胞は、例えば、生体の皮膚の細胞であり得る。一例において、細胞の評価方法は、細胞を培養する工程を含んでいてもよい。培養は、評価に用いる基体（上記（１）で用いるプリズム又は上記（２）で用いるセンサのパッシベーション層など）上で行うことが好ましい。また、一例において、細胞の評価方法は、細胞の培養に用いた培養培地を本実施形態に係る媒質と交換する工程を含んでいてもよい。また、一例において、細胞の評価方法は、当該交換する工程において、培養培地を洗浄する工程を含んでいてもよい。また、対象の細胞は、単一の細胞であってもよいし、細胞集団であってもよい。 Further, the cells may be cells obtained directly from a living body, may be cultured cells, or may be cells in a living body. In the case of cells obtained directly from a living body, the cells isolated from the living body may contain the cells of interest, or the cells isolated from the samples may be isolated. Also, the cells in the living body may be, for example, cells of the skin of the living body. In one example, the method of evaluating cells may include the step of culturing the cells. The culture is preferably performed on a substrate used for evaluation (such as a prism used in (1) above or a passivation layer of a sensor used in (2) above). In one example, the method of evaluating cells may include the step of replacing the culture medium used for culturing the cells with the medium according to the present embodiment. In one example, the method of evaluating cells may include the step of washing the culture medium in the step of replacing. Also, the cell of interest may be a single cell or a cell population.
細胞の接着性も特に限定されない。一例において、細胞は接着細胞であることが好ましい。接着細胞である場合、培養培地と細胞評価用の媒質との交換が容易である。また、接着細胞は基材（例えばＡＴＲプリズム）に接触しているため、容易にテラヘルツ波を伝達することができる。一方、浮遊細胞の場合には、例えば、誘電泳動（例えば、T. P. Hunt et al., Biomed Microdevices, 8:227-230, 2006）、膜タンパク又は糖鎖などと結合するリンカー物質による拘束、マニピュレーターなどを用いた細胞操作又は細胞押し付け、サイトスピンによる細胞接着等の方法で細胞を基材に接近（接触）させ、テラヘルツ波を伝達させればよい。 The adhesion of cells is also not particularly limited. In one example, the cells are preferably adherent cells. In the case of adherent cells, exchange of the culture medium with the medium for cell evaluation is easy. In addition, since the adherent cells are in contact with the substrate (for example, ATR prism), the terahertz wave can be easily transmitted. On the other hand, in the case of suspension cells, for example, dielectrophoresis (for example, TP Hunt et al., Biomed Microdevices, 8: 227-230, 2006), restraint by a linker substance that binds to a membrane protein or a sugar chain or the like, a manipulator etc. The cells may be brought close to (contacted with) the substrate by a method such as cell manipulation or cell pressing using cell adhesion, cell adhesion by cytospin, etc. to transmit terahertz waves.
本実施形態に係る評価方法は、上記検出する工程で得た結果を基準と比較する工程をさらに含んでいてもよい。基準は、対象細胞と同一細胞であってもよいし、対象細胞とは別の細胞であってもよい。別の細胞である場合、対象細胞と同一種類の細胞であってもよいし、対象細胞と異なる種類の細胞であってもよい。なお、「種類」とは、由来生物、由来組織、由来個体、性質（接着性、又は増殖性など）などのうちの少なくとも１つを指す。 The evaluation method according to the present embodiment may further include the step of comparing the result obtained in the detecting step with a reference. The reference may be the same cell as the target cell or a different cell from the target cell. When it is another cell, it may be the same type of cell as the target cell or may be a different type of cell from the target cell. In addition, "type" refers to at least one of a derived organism, a derived tissue, a derived individual, properties (such as adhesiveness or proliferation), and the like.
対象細胞と同一細胞である場合、例えば、ある時点における検出結果を基準として、別の１つ以上の時点における検出結果と比較する。これにより、同一細胞における経時的な変化を評価することができる。例えば、ある時点において検出を行い、次いで細胞に薬剤を適用し、一定時間経過後に再度検出を行う。そして両者を比較することによって、薬剤に対する細胞の応答を評価することができる。 When the cells are the same as the target cell, for example, the detection results at one time point are compared with the detection results at one or more other time points. Thereby, temporal changes in the same cell can be evaluated. For example, detection is performed at a certain time point, then a drug is applied to the cells, and detection is performed again after a predetermined time has elapsed. And by comparing the two, the cellular response to the drug can be evaluated.
対象細胞とは別の細胞である場合、例えば、上記媒質中にある細胞と相互作用する領域にテラヘルツ波を伝達し、当該細胞とテラヘルツ波との相互作用を検出して得られる結果を、基準とすることができる。なお、この場合、対象細胞と、基準となる細胞とは、実質的に同じ条件下で、テラヘルツ波を伝達し当該テラヘルツ波との相互作用を検出することが好ましい。 In the case of a cell different from the target cell, for example, the terahertz wave is transmitted to a region in the medium that interacts with the cell, and the result obtained by detecting the interaction between the cell and the terahertz wave is used as a criterion. It can be done. In this case, it is preferable to transmit the terahertz wave and detect the interaction with the terahertz wave under substantially the same conditions as the target cell and the reference cell.
基準は１つであってもよいし、複数であってもよい。例えば、基準として、正常細胞及び進行度が異なる１つ以上の疾患関連細胞のうちの２つ以上の細胞についての結果を用いることによって、対象細胞が疾患関連細胞であるか否か、及び／又は、疾患関連細胞である場合の疾患の進行度を評価し得る。 The reference may be one or more than one. For example, by using the results for two or more cells of normal cells and one or more disease-related cells with different degrees of progression as a criterion, whether the target cell is a disease-related cell, and / or The degree of disease progression can be assessed if it is a disease associated cell.
一実施形態において、対象細胞は正常細胞である。他の実施形態において、対象細胞は疾患関連細胞である。疾患関連細胞とは、１つ以上の疾患に関連する細胞を指し、疾患を引き起こす細胞又は疾患によって生じた細胞であり得る。疾患としては、癌などが挙げられる。癌細胞又は腫瘍細胞は、正常細胞と比較して細胞内の水の量が多いと考えられている。 In one embodiment, the subject cell is a normal cell. In another embodiment, the subject cell is a disease associated cell. Disease-associated cells refer to cells associated with one or more diseases and may be cells causing a disease or cells generated by a disease. Diseases include cancer and the like. Cancer cells or tumor cells are considered to have a large amount of water in the cells as compared to normal cells.
癌又は腫瘍として、例えば、舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫（メラノーマ）、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌、原発性肺癌、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド、睾丸腫瘍、前立腺癌、乳癌（例えば、乳頭腺癌、面疱癌、粘液癌、髄様癌、小葉癌、硬癌肉腫、転移腫瘍）、***ペーシジェット病、***肉腫、骨腫瘍、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫（例えば、リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病など）、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症、小児性白血病、食道癌、胃癌、胃・大腸平滑筋肉腫、胃・腸悪性リンパ腫、膵・胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、原発性肝癌（例えば、肝細胞癌、胆管細胞癌など）、肝芽腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮腺扁平上皮癌、子宮体部腺類癌、子宮肉腫、子宮癌肉腫、子宮破壊性奇胎、子宮悪性絨毛上皮腫、子宮悪性黒色腫、卵巣癌、中胚葉性混合腫瘍、腎癌、腎盂移行上皮癌、尿管移行上皮癌、膀胱乳頭癌、膀胱移行上皮癌、尿道扁平上皮癌、尿道腺癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫、悪性中皮癌、転移性腺癌、転移性扁平上皮癌、転移性肉腫、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫など）、間葉系由来細胞を含む腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。 As cancer or tumor, for example, tongue cancer, gingival cancer, malignant lymphoma, malignant melanoma (melanoma), maxillary cancer, nasal cancer, nasal cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, glioma, meningioma, glioma, Neuroblastoma, thyroid papillary adenocarcinoma, follicular thyroid carcinoma, medullary thyroid carcinoma, primary lung cancer, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, alveolar epithelial carcinoma, large cell undifferentiated cancer, small cell undifferentiated cancer, carcinoid , Testicular cancer, prostate cancer, breast cancer (eg, papillary adenocarcinoma, comeback cancer, mucinous carcinoma, medullary carcinoma, lobular carcinoma, carcinosarcoma, metastatic tumor), breast paget disease, breast sarcoma, bone tumor, thyroid cancer , Gastric cancer, liver cancer, acute myeloid leukemia, acute promyelocytic leukemia, acute myelomonocytic leukemia, acute monocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute anaplastic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Adult T-cell leukemia, malignant lymphoma (eg, lymphosarcoma, reticular Tumor, Hodgkin's disease etc.), multiple myeloma, primary macroglobulinemia, childhood leukemia, esophageal cancer, gastric cancer, gastric and colon leiomyosarcoma, gastric and intestinal malignant lymphoma, pancreatic and gallbladder cancer, duodenal cancer, colon Cancer, primary liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma, cholangiocellular carcinoma, etc.), hepatoblastoma, carcinoma in uteroepithelium, cervical squamous cell carcinoma, uterine adenocarcinoma, uterine squamous cell carcinoma, uterine body adenocarcinoma , Uterine sarcoma, Uterine carcinosarcoma, Uterus destructive mole, Uterine malignant chorionoma, Uterine malignant melanoma, Ovarian cancer, Ovarian cancer, mesodermal mixed tumor, Renal cancer, Renal cell transitional cell carcinoma, Ureteral transitional cell carcinoma, Bladder papilla Cancer, bladder transitional cell carcinoma, urethral squamous cell carcinoma, urethral adenocarcinoma, Wilms tumor, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, synovial sarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, Ewing sarcoma, skin squamous epithelium Cancer, skin basal cell carcinoma, skin Bowen's disease, skin Paget's disease, skin Malignant melanoma, malignant mesothelial carcinoma, metastatic adenocarcinoma, metastatic squamous cell carcinoma, metastatic sarcoma, mesothelioma (eg, pleural mesothelioma, peritoneal mesothelioma, pericardial mesothelioma, etc.), mesenchymal system It includes, but is not limited to, tumors including derived cells.
基準は、対象細胞の検出工程と同時又は連続的に検出を行って得られた結果であってもよいし、予め検出されて得られた結果（例えば汎用的な基準）であってもよい。 The reference may be a result obtained by performing detection simultaneously or continuously with the detection step of the target cell, or may be a result detected in advance (for example, a universal reference).
一例において、細胞とテラヘルツ波との相互作用を反映した検出結果は、テラヘルツ波における細胞の分光特性である。具体的には、検出結果は、一定の範囲の周波数と反射又は透過との相関であり得、より具体的には、一定の範囲の周波数における反射又は透示を示すスペクトルであり得る。反射又は透過は反射率又は透過率（％）として示されるか、あるいは反射量又は透過量として示され得る（例えば、横軸に周波数、縦軸に反射率又は透過率あるいは反射量又は透過量）。比較は、グラフの形状又は特定の（範囲の）周波数における反射率又は透過率あるいは反射量又は透過量の数値などに基づいて行い得る。あるいは、検出結果は、特定の周波数における反射率又は透過率（％）又は反射量又は透過量であり得る。比較は、特定の周波数における反射率又は透過率あるいは反射量又は透過量の数値などに基づいて行い得る。あるいは、検出結果は、テラヘルツ波の周波数の変化、及び／又は、波長の変化であり得る。 In one example, the detection result reflecting the interaction between the cell and the terahertz wave is a spectral characteristic of the cell in the terahertz wave. Specifically, the detection result may be a correlation between a certain range of frequencies and reflection or transmission, and more specifically may be a spectrum showing reflection or transparency at a certain range of frequencies. Reflection or transmission can be expressed as reflectance or transmission (%) or can be expressed as reflectance or transmission (for example, frequency on the horizontal axis, reflectance or transmission or reflectance or transmission on the vertical axis) . The comparison may be made based on the shape of the graph or the reflectance or transmittance at a specific (range) frequency or the numerical value of the reflection amount or the transmission amount. Alternatively, the detection result may be reflectance or transmission (%) or amount of reflection or transmission at a particular frequency. The comparison may be made based on the reflectance or transmittance at a specific frequency or the numerical value of the amount of reflection or the amount of transmission. Alternatively, the detection result may be a change in frequency of the terahertz wave and / or a change in wavelength.
〔３．その他〕
上記〔２．細胞の評価方法〕の欄で説明した比較工程を行うことによって得られた結果は、医師による診断を行う際の診断資料の１つとして利用することができる。また、上記〔２．細胞の評価方法〕の欄で説明した比較工程を行うことによって、疾患を有している可能性ありという結果が得られた被験体については、必要に応じて医師による診断の結果を伴った上で、治療を行うことができる。ここで、治療の一例としては、医師、場合によっては医師以外の専門家が行う、化学療法、放射線治療、及び外科手術などを挙げることができる。
[3. Other]
Above [2. The result obtained by performing the comparison step described in the section of “Method for evaluating cells” can be used as one of diagnostic data at the time of diagnosis by a doctor. Also, the above [2. Method of Evaluating Cells] By performing the comparison step described in the section, the subject for which the result of having the possibility of having a disease was obtained was accompanied by the result of the diagnosis by the doctor as needed. Treatment can be done. Here, as an example of the treatment, chemotherapy, radiation therapy, and surgery performed by a doctor and sometimes by a specialist other than the doctor can be mentioned.
したがって、本発明はまた、本実施形態に係る細胞の評価方法を用いた疾患の診断方法を提供する。 Therefore, the present invention also provides a method for diagnosing a disease using the method for evaluating cells according to the present embodiment.
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。 Examples will be shown below, and the embodiment of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it is needless to say that various aspects are possible as to details. Furthermore, the present invention is not limited to the embodiments described above, and various modifications can be made within the scope of the claims, and embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also included. It is included in the technical scope of the invention. Also, all of the documents described in the present specification are incorporated by reference.
〔１．細胞の複素誘電率のモデル化〕
文献：K. Shiraga et al., J. Infrared Milli. Terahz. Waves, 35, 493, 2014の2. Principle及び3. Methodに記載されている方法に則り、まず、３７℃において水（培養培地）及びHeLa細胞単層の０．２〜４．０ＴＨｚにおける複素誘電率を実験的に導出した。次いで、この複素誘電率について、以下の理論式で最小二乗フィッティングを行った。なお、ωは角周波数であり、ｉは虚数単位である。
Literature: K. Shiraga et al., J. Infrared Milli. Terahz. Waves, 35, 493, 2014 First, according to the method described in 2.Principle and 3.Method of water, water at 37 ° C. (culture medium) The complex permittivity of 0.2 and 4.0 THz of HeLa cell monolayers was experimentally derived. Next, least squares fitting was performed on this complex dielectric constant according to the following theoretical formula. Here, ω is an angular frequency, and i is an imaginary unit.
ここで、右辺第１及び２項目は、Debye緩和（Δε1及びΔε2：緩和強度、τ1及びτ2：緩和時間）を表す。右辺第３項目は、Lorentz振動（ΔV：振動強度、ω0：共鳴周波数、γ：減衰定数）を表す。右辺第４項目は、誘電率実部の高周波極限を表す。このフィッティング計算によって、実験で得た複素誘電率をΔε及びω0等の数値パラメータで表すことができるため、測定試料の定量的な解釈が可能となる。 Here, the first and second items on the right side represent Debye relaxation (Δε 1 and Δε 2 : relaxation strength, τ 1 and τ 2 : relaxation time). The third item on the right side represents Lorentz vibration (ΔV: vibration intensity, ω 0 : resonance frequency, γ: damping constant). The fourth item on the right side represents the high frequency limit of the real part of the dielectric constant. By this fitting calculation, since the complex dielectric constant obtained in the experiment can be represented by numerical parameters such as Δε and ω 0 , quantitative interpretation of the measurement sample becomes possible.
この結果得られた各数値パラメータは以下の通りである：
ここで、これらの数値パラメータを式（１）に再び代入して得た理論上の複素誘電率が、それぞれ、図２のWater(culture-medium)及びCell Aに対応している。Cell AはHeLa細胞の複素誘電率の数値パラメータに基づいて計算したものであるため、以下では“ガン細胞”の複素誘電率モデルとして扱うこととする。また、一般的に正常細胞はガン細胞よりも細胞内水量は少ないと考えられているため、Cell Aの数値パラメータの一部を変化させることで未だ測定実績のない“正常細胞”の複素誘電率もモデル化できると考えられる。例えば緩和強度Δε1は自由水の分子数に比例するパラメータであるため、正常細胞はガン細胞より自由水量が２０％だけ少ないと仮定すれば、Δε1＝42.46×0.8＝33.97と計算される。ここで、Δε1＝33.97であり、他の数値パラメータがCell Aと同じである仮想細胞を想定すると、その複素誘電率は図２のCell Bとなる。以降は、このCell Bを“正常細胞”の複素誘電率と考えることとする。 Here, theoretical complex dielectric constants obtained by substituting these numerical parameters into equation (1) correspond to Water (culture-medium) and Cell A in FIG. 2, respectively. Since Cell A is calculated based on the numerical parameter of the complex permittivity of HeLa cells, it will be treated as a complex permittivity model of "cancer cells" below. In addition, since normal cells are generally considered to have less intracellular water content than cancer cells, changing the numerical parameters of Cell A changes the complex dielectric constant of "normal cells" that have not been measured yet. Can be modeled as well. For example, since the relaxation strength Δε 1 is a parameter proportional to the number of free water molecules, it can be calculated as Δε 1 = 42.46 × 0.8 = 33.97, assuming that the amount of free water in normal cells is smaller than that of cancer cells by 20%. Here, assuming a virtual cell where Δε 1 = 33.97 and the other numerical parameters are the same as Cell A, its complex dielectric constant is Cell B in FIG. Hereafter, this Cell B will be considered as the complex dielectric constant of “normal cells”.
また、水とは異なりフロリナート（FC-3283、FC-72、FC-770（いずれも３Ｍ社製））の複素誘電率は分散を持たず（すなわち一定であり）、実験結果に基づくとその複素誘電率は、下記のように表される（図２のFluorinert）。
〔２．反射率の導出過程〕
図３の左に示すように、測定プリズム（誘電率ε1）上に厚さｄのコンフルエントな細胞単層が形成されており、さらにその上には液体培養培地などの媒質が存在する３成分系を考える。ここでプリズムにシリコン単結晶（ε1＝11.77）を用い、入射角θ＝51.6°でテラヘルツ波がプリズム-細胞界面で反射すると、細胞側に局在する非伝搬性のエバネッセント波の局在深さｄｐは１THzで２０μｍ程度となり、これは細胞厚み（約７μｍ：HeLa細胞の場合）を上回るため、本測定法では細胞単層上部に位置する媒質による影響の寄与が避けられない。
[2. Derivation process of reflectance]
As shown on the left of FIG. 3, a three-component system in which a confluent cell monolayer of thickness d is formed on a measurement prism (dielectric constant ε 1 ), and on which a medium such as a liquid culture medium is present Think about the system. Here, when a silicon single crystal (ε 1 = 11.77) is used as a prism and the terahertz wave is reflected at the prism-cell interface at an incident angle of θ = 51.6 °, the localized depth of non-propagating evanescent wave localized on the cell side Since the d p is about 20 μm at 1 THz, which exceeds the cell thickness (about 7 μm: in the case of HeLa cells), the contribution of the influence of the medium located at the top of the cell monolayer can not be avoided in this measurement method.
このようなエバネッセント波の局在深さよりも薄い試料を含む３成分系の場合、図３の右のように“プリズム-細胞”間及び“細胞-媒質”間で反射成分が存在すると考えると、“プリズム-細胞-媒質”からなる３成分系のマクロな反射係数は、以下の式（２）で与えられる（文献：K. Shiraga et al., Appl. Phys. Lett., 102, 053702, 2013）。
なお、λは波長であり、角周波数とはλ＝ｃ／２πω（cは光速）の関係で結ばれる。ここで、入射テラヘルツ波がｐ偏光の場合、“プリズム-細胞”間及び“細胞-媒質”間の反射係数はそれぞれ、以下の式（３）及び式（４）である。
このとき、反射率Ｒは、以下の式（５）で求められる。
上記１．で求めたCell A又はCell Bの複素誘電率を、
次に、上記１．で求めたCell A又はCell Bの複素誘電率を
〔３．フロリナート中における細胞のタイムラプス観察〕
フロリナート（FC-3283（３Ｍ社製））中における細胞の生存状態を確認するために、タイムラプス観察を行った。５.０×１０４cells/mLの胃がん細胞（MKN7:RCB0999）をibidi μ-dish 35mm, high (#81156)上に播種し、培養培地（D-MEM (High Glucose with L-Glutamine, Phenol Red and HEPES)(#048-30275)+10% FBS (#S1820-500)）中で、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。次いで、培養培地をアスピレーターで吸引除去し、D-PBS(-) (Calcium Chloride free, Magnesium Chloride free)でWashし、２ｍＬのフロリナートを添加した。このdishを３７℃、５％ＣＯ２下に静置し、０、６、１２、１８、２０、２４時間後における細胞の画像を、光学顕微鏡（NIKON Biostation）を用いて取得した。
[3. Time-lapse observation of cells in Fluorinert]
Time-lapse observation was performed to confirm the cell survival state in Fluorinert (FC-3283 (manufactured by 3M)). Stomach cancer cells (MKN7: RCB 0999) of 5.0 × 10 4 cells / mL are seeded on ibidi μ-dish 35 mm, high (# 81156), and culture medium (D-MEM (High Glucose with L-Glutamine, Phenol Red) and HEPES) (# 048-30275) + 10% FBS (# S1820-500)) at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Then, the culture medium was aspirated off with an aspirator, washed with D-PBS (-) (Calcium Chloride free, Magnesium Chloride free), and 2 mL of florinate was added. The dish was allowed to stand at 37 ° C., 5% CO 2 , and images of cells after 0, 6, 12, 18, 20 and 24 hours were obtained using a light microscope (NIKON Biostation).
結果を図６に示す。オルガネラの流動性が消失した場合又は細胞内容物が漏出した場合に、死細胞であると認定される。図６からわかるとおり、２４時間経過後においても、ほとんどの細胞が生存していた。このように、フロリナートは細胞に対する毒性が低く、テラヘルツ波を用いた細胞評価用の媒質としてより好適であることを見出した。 The results are shown in FIG. A dead cell is identified when the organelle's fluidity is lost or the cell contents have leaked. As can be seen from FIG. 6, most of the cells were still alive after 24 hours. Thus, it has been found that Fluorinate has low toxicity to cells and is more suitable as a medium for cell evaluation using terahertz waves.
〔４．各種媒質中における細胞の生存率の評価〕
上記のフロリナートに加え、他の媒質として鉱物油及びレモゾールについても細胞の生存状態に及ぼす影響についての確認の試験を行った。細胞培養用３５ｍｍ ｉｂｉｄｉディッシュ（フロリナート試験時）又はガラスボトムディッシュ（鉱物油、レモゾール試験時）に１×１０５個のＮＨＤＦ細胞又はＭＫＮ７細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した（鉱物油及びレモゾールはｉｂｉｄｉディッシュ腐食性があるためガラスボトムディッシュを使用）。培養から４８〜７２時間後、培養培地を各種の媒質に置換し、その直後から５分間隔で２５時間目までＢｉｏｓｔａｔｉｏｎで細胞を観察して細胞死の有無を評価した。細胞死の評価項目として、（１）細胞膜破壊による細胞膨化又は細胞質の漏出、（２）核の破壊、（３）細胞質における流動性の消失、を指標とし、そのいずれか１つにでも当てはまる細胞を死細胞とみなした。
[4. Evaluation of cell viability in various media]
In addition to the above-mentioned Fluorinert, mineral oil and remosol as other media were also tested for their effect on the cell survival state. Seed 1 × 10 5 NHDF cells or MKN 7 cells in DMEM + 10% FBS in 35 mm ibidi dishes for cell culture (in the Fluorinert test) or in glass bottom dishes (in the mineral oil, remosol test), 37 ° C., 5% CO 2 Cultivated under (mineral oil and remozole use a glass bottom dish as it is ibidi dish corrosive). After 48 to 72 hours from the culture, the culture medium was replaced with various media, and immediately thereafter, cells were observed on the Biostation at 5 minutes intervals until 25 hours to evaluate the presence or absence of cell death. As endpoints for cell death, (1) cell swelling or cytoplasmic leakage due to cell membrane destruction, (2) nuclear destruction, (3) loss of fluidity in cytoplasm, as a marker, cells applicable to any one of them Were considered dead cells.
結果を図７に示す。その結果、フロリナートでは置換から１２時間が経過した後でも９０％近い生存率が確認され、テラヘルツ波を用いた細胞評価用の媒質として最適であることがわかった。また、鉱物油の場合では、置換から１２時間が経過するまでは４０％以上の生存率が認められ、テラヘルツ波を用いた細胞評価用の媒質として利用できることが分かった。なお、レモゾールでは置換から５分以内に細胞がほぼ全滅しており、細胞評価用の媒質として用いることはできなかった。 The results are shown in FIG. As a result, in the case of florinate, a survival rate close to 90% was confirmed even after 12 hours from the substitution, and it was found that it is optimal as a medium for cell evaluation using terahertz waves. Moreover, in the case of mineral oil, the survival rate of 40% or more was recognized until 12 hours passed from substitution, and it turned out that it can be used as a medium for cell evaluation using a terahertz wave. In Remozole, the cells were almost completely destroyed within 5 minutes after the substitution, and it could not be used as a medium for cell evaluation.
本発明は、例えば、各種の研究用途、並びに、診断及び治療等の医学用途において利用することができる。 The present invention can be used, for example, in various research applications and medical applications such as diagnostics and therapeutics.
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