JP2019041675A - Nash liver carcinogenic model nonhuman animal and its use - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、NASH肝発がんモデル非ヒト動物及びその使用に関する。具体的には、本発明は、NASH肝発がんモデル非ヒト動物、NASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット及び肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a NASH liver carcinogenesis model non-human animal and its use. Specifically, the present invention relates to a NASH liver carcinogenesis model non-human animal, a kit for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal, and a method for screening a compound for treatment or prevention of liver cancer.
「脂肪肝」は、飲酒によって発症するアルコール性脂肪肝(alcoholic fatty liver;AFL)と、飲酒によらず発症する非アルコール性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver;NAFL)とに分類される。NAFLの発症による肝臓の脂肪化に伴い、炎症や線維化が進行した状態が非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis;NASH)である。このNAFL及びNASHは合わせて、非アルコール性脂肪性肝疾患(nonalcoholic fatty liver disease;NAFLD)と呼ばれる。NAFLDは、日本国において1000万人の患者が存在し、そのうち200万人はNASHであると推定されている(例えば、非特許文献1参照)。NASHは肝硬変を経て、肝癌に移行することが知られている(例えば、非特許文献2参照)。しかしながら、NASHから肝癌を発症するメカニズムについては、未だ明らかになっていない。 "Fatty liver" is classified into alcoholic fatty liver (AFL) that develops upon drinking and nonalcoholic fatty liver (NAFL) that develops without drinking. The state in which inflammation or fibrosis has progressed along with the fatification of the liver due to the onset of NAFL is nonalcoholic steatohepatitis (NASH). The NAFL and NASH together are called nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). In NAFLD, there are 10 million patients in Japan, of which 2 million are estimated to be NASH (see, for example, Non-Patent Document 1). NASH is known to shift to liver cancer via cirrhosis (see, for example, Non-patent Document 2). However, the mechanism by which NASH develops liver cancer is not yet clear.
現在、NASHモデルとして研究に用いられている実験動物としては、遺伝子改変モデル動物(例えば、特許文献1参照)、遺伝子改変−食事誘導性モデル動物(例えば、特許文献2参照)、食事誘導性モデル動物(例えば、非特許文献3参照)、食事−薬物誘導性モデル動物(例えば、特許文献3参照)等が挙げられる(例えば、非特許文献4参照)。 As experimental animals currently used for research as NASH models, genetically modified model animals (see, for example, Patent Document 1), genetically modified-meal-induced model animals (see, for example, Patent Document 2), diet-induced model Animals (see, for example, Non-Patent Document 3), diet-drug-induced model animals (see, for example, Patent Document 3), and the like can be mentioned (see, for example, Non-patent Document 4).
上記の従来のNASHモデル動物のうち、ヒトNASHに準じたインスリン抵抗性及び病理組織像を併せ持つモデル動物は存在せず、さらに、NASHから肝細胞がんを発症するモデル動物も存在しなかった。 Among the above-mentioned conventional NASH model animals, there is no model animal having both insulin resistance and histopathology according to human NASH, and furthermore, there is no model animal that develops hepatocellular carcinoma from NASH.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症するNASH肝発がんモデル非ヒト動物を提供する。また、ヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症するNASH肝発がんモデル非ヒト動物を簡便に得られるNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットを提供する。また、肝がんの治療用又は予防用化合物を簡便に得られる肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a NASH liver carcinogenesis model non-human animal that develops liver cancer from a background liver similar to human NASH. In addition, the present invention provides a kit for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal, which can be easily obtained from a NASH liver carcinogenesis model non-human animal that develops liver cancer from a background liver similar to human NASH. The present invention also provides a screening method for a compound for treating or preventing liver cancer, which can be conveniently obtained a compound for treating or preventing liver cancer.
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第1態様に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。
That is, the present invention includes the following aspects.
The NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to the first aspect of the present invention is a non-human animal obtained by administering a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high-fat diet.
前記LXRαアゴニストがT0901317であってもよい。
前記フリーラジカル発生剤が四塩化炭素であってもよい。
前記高脂肪食が、脂肪を40kcal%以上80kcal%以下含んでもよい。
The LXRα agonist may be T0901317.
The free radical generator may be carbon tetrachloride.
The high fat diet may contain 40 kcal% or more and 80 kcal% or less of fat.
上記第1態様に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、前記LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり1.0mg/kg体重以上3.0mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として10週間以上30週間以下投与してなってもよい。 In the NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to the first aspect, the LXRα agonist is administered in a dose of 1.0 mg / kg to 3.0 mg / kg body weight at a time, 1 to 4 times a week as the number of doses It may be administered once or 10 weeks to 30 weeks as an administration period.
上記第1態様に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、前記フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.05mL/kg体重以上1.0mL/kg体重未満、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として10週間以上30週間以下投与してなってもよい。 In the NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to the first aspect, the free radical generating agent is administered at a dose of 0.05 mL / kg body weight or more and 1.0 mL / kg body weight or less once, and once per week as the administration frequency. It may be administered up to 4 times, and 10 weeks or more and 30 weeks or less as an administration period.
前記非ヒト動物の肝臓は、以下の(a1)〜(c1)に示す病理学的形態を有してもよい。
(a1)肝細胞核内でのクロマチンの凝集
(b1)肝細胞核の大小不同
(c1)類洞構造の廃絶
The liver of the non-human animal may have the following pathological forms (a1) to (c1).
(A1) aggregation of chromatin in the nucleus of hepatocytes (b1) elimination of the structure of the nucleus of the nucleus of hepatocytes (c1)
前記非ヒト動物が哺乳動物であってもよい。
前記哺乳動物が齧歯類であってもよい。
The non-human animal may be a mammal.
The mammal may be a rodent.
本発明の第2態様に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、LXRαアゴニストと、フリーラジカル発生剤と、高脂肪食と、を備える。 A kit for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to a second aspect of the present invention comprises an LXRα agonist, a free radical generator, and a high fat diet.
前記LXRαアゴニストがT0901317であってもよい。
前記フリーラジカル発生剤が四塩化炭素であってもよい。
前記高脂肪食が、脂肪を40kcal%以上80kcal%以下含んでもよい。
The LXRα agonist may be T0901317.
The free radical generator may be carbon tetrachloride.
The high fat diet may contain 40 kcal% or more and 80 kcal% or less of fat.
上記第2態様に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、NASHモデル非ヒト動物を更に備え、前記NASHモデル非ヒト動物は、前記LXRαアゴニスト及び前記フリーラジカル発生剤を投与し、前記高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物であってもよい。 The kit for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to the second aspect further comprises a NASH model non-human animal, wherein the NASH model non-human animal administers the LXRα agonist and the free radical generator, and It may be a non-human animal obtained by rearing using a fat diet.
前記NASHモデル非ヒト動物は、前記LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり1.0mg/kg体重以上3.0mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として1週間以上15週間以下投与してなってもよい。 In the NASH model non-human animal, the LXRα agonist is administered at a dose of 1.0 mg / kg to 3.0 mg / kg body weight at a time, 1 to 4 times a week as an administration frequency, and as an administration period It may be administered for 1 week or more and 15 weeks or less.
前記NASHモデル非ヒト動物は、前記フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.05mL/kg体重以上1.0mL/kg体重未満、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として1週間以上15週間以下投与してなってもよい。 The NASH model non-human animal administers the free radical generator at a dose of 0.05 mL / kg body weight or more and 1.0 mL / kg body weight or less once, 1 to 4 times a week for administration, and It may be administered for 1 week to 15 weeks as a period.
前記NASHモデル非ヒト動物は、インスリン抵抗性を示し、且つ、肝臓は、以下の(a2)〜(d2)に示す病理学的形態を有してもよい。
(a2)大滴性脂肪
(b2)肝細胞の風船様変性
(c2)炎症性細胞の浸潤
(d2)線維化
The NASH model non-human animal exhibits insulin resistance, and the liver may have the pathological forms shown in (a2) to (d2) below.
(A2) macroscopic fat (b2) balloon-like degeneration of hepatocytes (c2) infiltration of inflammatory cells (d2) fibrosis
本発明の第3態様に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程(A1)及び(B1)を備える方法である。
(A1)請求項1〜9のいずれか一項に記載のNASH肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程
(B1)肝がんに対する治療効果を評価する工程
The screening method for a compound for treating or preventing liver cancer according to the third aspect of the present invention is a method comprising the following steps (A1) and (B1).
(A1) A step of administering a test substance to a NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to any one of claims 1 to 9 (B1) a step of evaluating the therapeutic effect on liver cancer
本発明の第4態様に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程(A2)〜(C2)を備える方法である。
(A2)LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより、NASHモデル非ヒト動物を作製する工程
(B2)前記NASHモデル非ヒト動物をLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程
(C2)肝がんの発症有無を評価する工程
The screening method for a compound for treating or preventing liver cancer according to a fourth aspect of the present invention is a method comprising the following steps (A2) to (C2).
(A2) A step of producing a NASH model non-human animal by administering a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high fat diet (B2) LXRα agonist and free radical generation of the NASH model non-human animal Of administering a drug and administering a test substance while rearing using a high-fat diet (C2) a step of evaluating the presence or absence of onset of liver cancer
上記態様のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、ヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症する非ヒト動物であり、NASHから肝がんを発症するメカニズムの解明に役立てることができる。また、上記態様のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットによれば、簡便にヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症するNASH肝発がんモデル非ヒト動物を得ることができる。上記態様の肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物を簡便にスクリーニングすることができる。 The NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the above aspect is a non-human animal that develops liver cancer from a background liver similar to human NASH, and can be useful for elucidating the mechanism of developing liver cancer from NASH. Moreover, according to the production kit for NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the above aspect, a NASH liver carcinogenesis model non-human animal that develops liver cancer from a background liver similar to human NASH can be obtained conveniently. According to the method of screening a compound for treatment or prevention of liver cancer of the above aspect, a compound effective for treatment or prevention of liver cancer can be conveniently screened.
≪NASH肝発がんモデル非ヒト動物≫
本発明の一実施形態に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。また、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis;NASH)から肝細胞がんを発症した非ヒト動物である。
«Nash liver carcinogenesis model non human animal»
A NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to an embodiment of the present invention is a non-human animal obtained by administering a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high-fat diet. In addition, the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment is a non-human animal that has developed hepatocellular carcinoma from nonalcoholic steatohepatitis (NASH).
従来の作製方法では、インスリン抵抗性及びヒトNASH病理像を有するNASHモデル非ヒト動物から肝細胞がんを発症するNASH肝発がんモデル非ヒト動物を作製できなかった。
これに対し、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物では、非ヒト動物に高脂肪食を摂取させ、LXRαアゴニストを投与することにより肝臓における脂肪の蓄積が誘発される。また、フリーラジカル発生剤を投与することにより、肝臓シトクロムP4502E1(CYP2E1)においてフリーラジカルを発生させて酸化ストレスが生じ、肝臓の線維化及び炎症が誘発される。さらに、この肝臓の炎症によりインスリン抵抗性が誘発される。以上のことから、肝臓における脂肪の蓄積、肝臓の線維化、炎症及びインスリン抵抗性が誘発されることで、インスリン抵抗性を示し、且つ、ヒトNASH病理像を有するNASHを発症した非ヒト動物(NASHモデル非ヒト動物)が得られる。さらに、このNASHモデル非ヒト動物に、高脂肪食、LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を継続的に与えることで、NASHから肝細胞がんを発症したNASH肝発がんモデル非ヒト動物が得られる。得られたNASH肝発がんモデル非ヒト動物において、後述の実施例に示すように、肝細胞がんを発症していることはその病理学的形態から確認されている。
According to the conventional preparation method, it has not been possible to prepare a NASH liver carcinogenesis model non-human animal that develops hepatocellular carcinoma from a NASH model non-human animal having insulin resistance and human NASH pathological image.
On the other hand, in the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment, accumulation of fat in the liver is induced by feeding a non-human animal with a high-fat diet and administering an LXRα agonist. In addition, administration of a free radical generator causes free radicals to be generated in liver cytochrome P4502E1 (CYP2E1) to cause oxidative stress and induce fibrosis and inflammation of the liver. Furthermore, this liver inflammation induces insulin resistance. From the above, non-human animals that exhibit insulin resistance and develop NASH having human NASH pathological image by showing accumulation of fat in the liver, fibrosis of the liver, inflammation and inflammation of the liver and induction of insulin resistance ( NASH model non-human animals are obtained. Furthermore, by continuously feeding a high-fat diet, an LXRα agonist and a free radical generator to this NASH model non-human animal, a NASH liver carcinogenic model non-human animal that has developed hepatocellular carcinoma from NASH can be obtained. In the obtained NASH liver carcinogenesis model non-human animal, as shown in the examples described later, the onset of hepatocellular carcinoma has been confirmed from its pathological form.
なお、本明細書において、「ヒトNASH病理像」とは、肝臓における以下の(a2)〜(d2)に示す病理学的形態を意味する。
(a2)大滴性脂肪
(b2)肝細胞の風船様変性
(c2)炎症性細胞の浸潤
(d2)線維化
In the present specification, "human NASH pathological image" means the pathological form shown in the following (a2) to (d2) in the liver.
(A2) macroscopic fat (b2) balloon-like degeneration of hepatocytes (c2) infiltration of inflammatory cells (d2) fibrosis
ここで、肝細胞の風船様変性について、風船様腫大が生じる場所は特に制限はない。中でも、風船様腫大が生じる場所としては、ヒトNASHの症状により類似しているという点から、中心静脈周囲に生じていることが好ましい。
また、肝臓の線維化を生じているNASHモデル非ヒト動物は、NASHの診断基準としてよく知られているMatteoniらの分類のNASH(Type 4)によく合致しており、より病態が進んだNASHモデルの非ヒト動物となり得る。また、線維化が生じる場所に特に制限はないが、ヒトNASHの症状に類似しているという点から、線維化は中心静脈周囲に生じていることが好ましい。
Here, with regard to balloon-like degeneration of hepatocytes, the place where balloon-like swelling occurs is not particularly limited. Above all, it is preferable that the balloon-like swelling occurs around the central vein, from the viewpoint of being more similar to the symptoms of human NASH.
In addition, NASH model non-human animals causing liver fibrosis are in good agreement with NASH (Type 4) classified by Matteoni et al., Which is well-known as diagnostic criteria for NASH, and NASH with more advanced disease state. It can be a model non-human animal. Also, there is no particular limitation on the place where fibrosis occurs, but it is preferable that fibrosis occurs around the central vein from the point of being similar to the human NASH symptom.
また、非ヒト動物におけるインスリン抵抗性については、血清生化学的検査を行うことで判断することができる。具体的には、例えば、非ヒト動物から採取した血液から血清を分離し、血清中のグルコース濃度(特に、空腹時の血糖)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST(GOT))、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT(GPT))、遊離脂肪酸(NEFA)及び中性脂肪(TG)からなる群から選ばれる1以上が通常飼料で飼育された非ヒト動物に比べて高い場合、インスリン抵抗性を有すると判断することができる。
より具体的には、例えば、グルコース濃度(空腹時の血糖)は、200mg/dL以上であってよく、300mg/dL以上であってよく、400mg/dL以上であってよい。例えば、ASTは、200U/L以上であってよく、500U/L以上であってよく、1000U以上であってよい。例えば、ALTは、300U/L以上であってよく、800U/L以上であってよく、1200U/L以上であってよい。例えば、遊離脂肪酸(NEFA)は1000μEq/L以上であってよく、1200μEq/L以上であってよい。中性脂肪は20mg/dL以上であってよく、30mg/dL以上であってよい。
ヒトNASH患者においても、上記の指標が健常人に比べて高いことが報告されており、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、その飼育過程において、ヒトNASHの症状に類似した病態を示すものである。
In addition, insulin resistance in non-human animals can be determined by serum biochemical examination. Specifically, for example, serum is separated from blood collected from non-human animals, and glucose concentration in serum (especially fasting blood glucose), aspartate aminotransferase (AST (GOT)), alanine aminotransferase (ALT) Judgment as having insulin resistance when one or more selected from the group consisting of (GPT), free fatty acid (NEFA) and neutral fat (TG) is higher than non-human animals fed with normal feed Can.
More specifically, for example, the glucose concentration (fasting blood glucose) may be 200 mg / dL or more, 300 mg / dL or more, and 400 mg / dL or more. For example, the AST may be 200 U / L or more, 500 U / L or more, and 1000 U or more. For example, ALT may be 300 U / L or more, 800 U / L or more, and 1200 U / L or more. For example, free fatty acids (NEFA) may be 1000 μEq / L or more and may be 1200 μEq / L or more. The neutral fat may be at least 20 mg / dL and may be at least 30 mg / dL.
Also in human NASH patients, it is reported that the above-mentioned index is higher than that of healthy people, and the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of this embodiment has a pathological condition similar to the human NASH symptoms in its breeding process. It is shown.
本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、その飼育過程において、上記のヒトNASH病理像として示された病理学的形態の少なくとも一つ(好ましくは全て)を有し、且つ、インスリン抵抗性を有する。このことから、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、ヒトNASHに類似した背景肝を有するNASHモデル非ヒト動物から肝がんを発症したものであると判断できる。 The NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment has at least one (preferably all) of the pathological forms shown as the above-mentioned human NASH pathological image in its breeding process, and is insulin resistant Have. From this, it can be determined that the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment is the one that developed liver cancer from a NASH model non-human animal having a background liver similar to human NASH.
また、一般に「肝がん」とは、肝臓にできた「原発性肝がん」と別の臓器から転移した「転移性肝がん」に大別される。本明細書における「肝がん」としては、原発性肝がんを意味する。
また、一般に、「原発性肝がん」には、肝臓の細胞ががんになる「肝細胞がん」、胆汁を十二指腸に流す役割を担う胆管の細胞ががんになる「胆管細胞がん」、小児の肝がんである肝細胞芽腫、成人での肝細胞及び胆管細胞混合がん、未分化がん、胆管嚢胞腺がん、神経内分泌腫瘍等が存在する。本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物が発症する肝がんとしては、特に肝細胞がんを意味する。
Also, in general, "hepatic cancer" is roughly classified into "primary liver cancer" produced in the liver and "metastatic liver cancer" metastasized from another organ. As used herein, "liver cancer" refers to primary liver cancer.
In addition, in general, in "primary liver cancer", "hepatocellular carcinoma" in which the cells of the liver become cancer, and in the bile duct that plays a role of draining bile into the duodenum becomes "cancer. There are hepatocellular carcinoma which is liver cancer of children, mixed cancer of hepatocytes and cholangiocytes in adults, undifferentiated cancer, bile duct cystadenoma, neuroendocrine tumor and the like. The liver cancer developed by the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of this embodiment particularly means hepatocellular carcinoma.
また、本明細書における「肝細胞がんの病理学的形態」とは、肝臓における以下の(a1)〜(c1)に示す形態を意味する。
(a1)肝細胞核内でのクロマチンの凝集
(b1)肝細胞核の大小不同
(c1)類洞構造の廃絶
Moreover, the "pathological form of hepatocellular carcinoma" in the present specification means the forms shown in the following (a1) to (c1) in the liver.
(A1) aggregation of chromatin in the nucleus of hepatocytes (b1) elimination of the structure of the nucleus of the nucleus of hepatocytes (c1)
本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、上記肝細胞がんの病理学的形態として示された形態の少なくとも一つ(好ましくは全て)を有する。このことから、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、肝細胞がんを発症していると判断できる。また、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、従来の作製方法(例えば、発癌物質の投与)によって得られたNASH肝発がんモデル非ヒト動物と上記肝細胞がんの病理学的形態を示す点において構造的に区別される。 The NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment has at least one (preferably all) of the forms shown as the pathological form of hepatocellular carcinoma. From this, it can be determined that the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment has developed hepatocellular carcinoma. In addition, the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment includes the NASH liver carcinogenesis model non-human animal obtained by the conventional preparation method (for example, administration of a carcinogen) and the pathological form of the above hepatocellular carcinoma. It is structurally distinguished in the points shown.
本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物として用いられる動物は、ヒト以外の動物であって、通常、実験動物として一般的に使用される動物であれば特に制限されず、非ヒト脊椎動物であることが好ましく、非ヒト哺乳動物であることがより好ましく、齧歯類であることがさらに好ましい。
実験動物として具体的には、例えば、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。
実験動物としてマウスを用いる場合、通常のマウスであればよく、雑種でも系統種でもよいが、実験動物として用いられているマウスが好ましい。実験動物として用いられているマウスとして具体的には、例えば、C57BL/6系マウス、C3H系マウス、ICR系マウス、BALB/c系マウス等が挙げられる。
The animal used as the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment is a non-human animal and is not particularly limited as long as it is generally used as an experimental animal, and it is a non-human vertebrate It is preferable that there be some, more preferably a non-human mammal, and even more preferably a rodent.
Specific examples of experimental animals include monkeys, dogs, cats, chickens, rabbits, pigs, cows, mice, rats, guinea pigs, hamsters and the like.
When a mouse is used as an experimental animal, it may be a normal mouse, and may be a hybrid or a strain, but a mouse used as an experimental animal is preferable. Specific examples of mice used as experimental animals include C57BL / 6 mice, C3H mice, ICR mice, and BALB / c mice.
<NASH肝発がんモデル非ヒト動物の作製方法>
本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、以下に示す投与条件にてLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより作製することができる。換言すると、以下に示す投与条件にてLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育して得られる非ヒト動物は、NASH肝発がんモデル非ヒト動物として使用することができる。
<Method for producing NASH liver carcinogenesis model non-human animal>
The NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment can be prepared by administering an LXRα agonist and a free radical generator under the administration conditions shown below and rearing using a high fat diet. In other words, non-human animals obtained by administering a LXRα agonist and a free radical generator under the following administration conditions and rearing using a high-fat diet can be used as NASH liver carcinogenesis model non-human animals. .
[LXRαアゴニスト]
LXRαアゴニストとしては、核内転写因子である肝臓X受容体α(Liver X receptor α;LXRα)に結合し、直接的又は間接的に肝臓における脂肪の蓄積を誘導するものであれば、特に制限されない。LXRαアゴニストとして具体的には、例えば、T0901317、GW3965 hydrochloride、27−Hydroxycholesterol、WAY 252623等が挙げられる。中でも、LXRαアゴニストとしては、T0901317であることが好ましい。
[LXR alpha agonist]
The LXR alpha agonist is not particularly limited as long as it binds to the nuclear transcription factor liver X receptor alpha (Liver X receptor alpha; LXR alpha) and directly or indirectly induces fat accumulation in the liver . Specific examples of LXRα agonists include T0901317, GW3965 hydrochloride, 27-Hydroxycholesterol, WAY 252623 and the like. Among them, T0901317 is preferable as the LXRα agonist.
LXRαアゴニストの投与手段は、特に制限されず、例えば、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等が挙げられる。中でも、投与手段としては、腹腔投与が好ましい。 The administration method of the LXRα agonist is not particularly limited, and examples thereof include intraperitoneal administration, intravenous administration, oral administration, subcutaneous administration and the like. Among them, as administration means, intraperitoneal administration is preferable.
LXRαアゴニストの投与量としては、腹腔投与である場合、1回あたり1.0mg/kg体重以上3.0mg/kg体重以下であることが好ましく、1回あたり1.5mg/kg体重以上2.5mg/kg体重以下であることがより好ましく、1回あたり2.0mg/kg体重以上2.5mg/kg体重以下であることがさらに好ましい。
投与量が上記下限値以上であることにより、非ヒト動物の肝臓での脂肪の蓄積を誘導し、より高効率でヒトNASHに類似した背景肝から肝細胞がんを発症させることができる。一方、上記上限値以下であることにより、非ヒト動物の生存期間をより長く保つことができる。
The dose of the LXRα agonist is preferably 1.0 mg / kg or more and 3.0 mg / kg or less per dose, and 1.5 mg / kg or more per body weight or more per dose, for intraperitoneal administration. It is more preferable that it is not more than / kg body weight, and more preferably not less than 2.0 mg / kg body weight and not more than 2.5 mg / kg body weight per time.
When the dose is equal to or higher than the above lower limit, accumulation of fat in the liver of non-human animals can be induced, and hepatocellular carcinoma can be developed from background liver similar to human NASH with higher efficiency. On the other hand, the survival time of non-human animals can be kept longer by being below the above-mentioned upper limit.
LXRαアゴニストの投与回数としては、上記範囲の投与量によって適宜調整すればよい。LXRαアゴニストの投与回数として具体的には、1週間あたり1〜4回であることが好ましく、1週間あたり1〜3回であることがより好ましく、1週間あたり1〜2回であることがさらに好ましい。 The number of administrations of the LXRα agonist may be appropriately adjusted according to the dosage in the above range. Specifically, the administration frequency of the LXR α agonist is preferably 1 to 4 times per week, more preferably 1 to 3 times per week, and still more preferably 1 to 2 times per week. preferable.
LXRαアゴニストの投与期間としては、ヒトNASHと類似した背景肝から肝細胞がんを発症させるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。LXRαアゴニストの投与期間として具体的には、10週間以上30週間以下であることが好ましく、12週間以上28週間以下であることがより好ましく、15週間以上25週間以下であることがさらに好ましい。 The administration period of the LXRα agonist is not particularly limited as long as it is a period necessary for developing hepatocellular carcinoma from a background liver similar to human NASH, and is not particularly limited, and is appropriately adjusted according to the above dose and the above administration frequency. do it. Specifically, the administration period of the LXRα agonist is preferably 10 weeks to 30 weeks, more preferably 12 weeks to 28 weeks, and still more preferably 15 weeks to 25 weeks.
すなわち、本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり1.0mg/kg体重以上3.0mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として10週間以上30週間以下投与してなるものである。
本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり1.5mg/kg体重以上2.5mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜3回、及び、投与期間として12週間以上38週間以下投与してなるものである。
本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり2.0mg/kg体重以上2.5mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜2回、及び、投与期間として15週間以上25週間以下投与してなるものである。
That is, as a preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, an LXRα agonist is administered in a dose of 1.0 mg / kg to 3.0 mg / kg body weight at a time per dose, and the number of doses per week It is administered 1 to 4 times, and 10 weeks to 30 weeks as an administration period.
In a more preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, the LXR alpha agonist is administered at a dose of 1.5 mg / kg to 2.5 mg / kg body weight per dose, and the number of doses is 1 per week. It is administered three to three times and 12 weeks or more and 38 weeks or less as an administration period.
In a further preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, the LXRα agonist is administered in a dose of 2.0 mg / kg to 2.5 mg / kg body weight at a time, 1 times a week as the number of doses. The administration is carried out twice to twice a week and 15 weeks or less as an administration period.
[フリーラジカル発生剤]
フリーラジカル発生剤としては、肝臓においてフリーラジカルを発生させ、直接的又は間接的に肝臓における酸化ストレスを誘導するものであれば、特に制限されない。フリーラジカル発生剤として具体的には、例えば、四塩化炭素、(arachidonic acid;AA)、ジエチルニトロソアミン(Diethylnitrosamine;DEN)、2−アセチルアミノフルオレン(2−Acetylaminofluorene:2−AAF)、N−ニトロソモルホリン(N−Nitrosomopholine:NMOR)、1,2−ジクロロエタン(1,2−Dichloroethane;DCE)等が挙げられる。中でも、フリーラジカル発生剤としては、四塩化炭素であることが好ましい。
[Free radical generator]
The free radical generator is not particularly limited as long as it generates free radicals in the liver and directly or indirectly induces oxidative stress in the liver. Specific examples of free radical generators include carbon tetrachloride (arachidonic acid; AA), diethylnitrosamine (DEN), 2-acetylaminofluorene (2-Acetylaminofluorene: 2-AAF), and N-nitrosomorpholine. (N-Nitrosomopholine: NMOR), 1,2-dichloroethane (1,2-Dichloroethane; DCE), and the like. Among them, carbon tetrachloride is preferable as the free radical generator.
フリーラジカル発生剤の投与手段は、特に制限されず、例えば、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等が挙げられる。中でも、投与手段としては、腹腔投与が好ましい。 The administration means of the free radical generating agent is not particularly limited, and examples thereof include intraperitoneal administration, intravenous administration, oral administration, subcutaneous administration and the like. Among them, as administration means, intraperitoneal administration is preferable.
フリーラジカル発生剤の投与量としては、通常の酸化ストレスによる肝障害を生じさせる量である1.0ml/kg体重/よりも低用量であることが、ヒトNASHに類似した背景肝から肝細胞がんを発症させるために重要である。フリーラジカル発生剤の投与量として具体的には、腹腔投与である場合、1回あたり0.05mL/kg体重以上1.0mL/kg体重未満であることが好ましく、1回あたり0.05mL/kg体重以上0.5mL/kg体重以下であることがより好ましく、1回あたり0.1mL/kg体重以上0.25mL/kg体重以下であることがさらに好ましい。
投与量が上記下限値以上であることにより、非ヒト動物の肝臓での酸化ストレスを誘導し、より高効率でヒトNASHに類似した背景肝から肝細胞がんを発症させることができる。一方、上記上限値以下であることにより、非ヒト動物の肝臓において肝細胞がんを発症させる前に、より高効率でヒトNASHに類似した背景肝とすることができる。
The dose of the free radical generating agent is a dose lower than 1.0 ml / kg body weight /, which is the amount that causes liver damage due to normal oxidative stress. It is important for the onset of cancer. Specifically, in the case of intraperitoneal administration, the dose of the free radical generating agent is preferably 0.05 mL / kg body weight or more and 1.0 mL / kg body weight or less per dose, and 0.05 mL / kg per dose More preferably not less than body weight and not more than 0.5 mL / kg body weight, and still more preferably not less than 0.1 mL / kg and not more than 0.25 mL / kg body weight per dose.
When the dose is at least the above lower limit, oxidative stress in the liver of non-human animals can be induced, and hepatocellular carcinoma can be developed from a background liver similar to human NASH with higher efficiency. On the other hand, by setting the upper limit value or less, a background liver similar to human NASH can be obtained with higher efficiency before developing hepatocellular carcinoma in the liver of a non-human animal.
フリーラジカル発生剤の投与回数としては、上記範囲の投与量によって適宜調整すればよい。フリーラジカル発生剤の投与回数として具体的には、1週間あたり1〜4回であることが好ましく、1週間あたり1〜3回であることがより好ましく、1週間あたり1〜2回であることがさらに好ましい。
なお、LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤は、非ヒト動物に同時に投与してもよく、同日又は別日に異なるタイミングで投与してもよい。
The number of times of administration of the free radical generating agent may be appropriately adjusted according to the dosage in the above range. Specifically, the number of times of administration of the free radical generating agent is preferably 1 to 4 times per week, more preferably 1 to 3 times per week, and 1 to 2 times per week Is more preferred.
The LXRα agonist and the free radical generator may be simultaneously administered to a non-human animal, or may be administered at different times on the same day or another day.
フリーラジカル発生剤の投与期間としては、ヒトNASHと類似した背景肝から肝細胞がんを発症させるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。フリーラジカル発生剤の投与期間として具体的には、10週間以上30週間以下であることが好ましく、12週間以上28週間以下であることがより好ましく、15週間以上25週間以下であることがさらに好ましい。 The administration period of the free radical generating agent is not particularly limited as long as it is a period necessary to develop hepatocellular carcinoma from a background liver similar to human NASH, and is not limited, and it depends on the above dose and the above administration frequency. It may be adjusted appropriately. Specifically, the administration period of the free radical generating agent is preferably 10 weeks to 30 weeks, more preferably 12 weeks to 28 weeks, and still more preferably 15 weeks to 25 weeks. .
すなわち、本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.05mL/kg体重以上1.0mL/kg体重未満、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として10週間以上30週間以下投与してなるものである。
本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.05mL/kg体重以上0.5mL/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜3回、及び、投与期間として12週間以上38週間以下投与してなるものである。
本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.1mL/kg体重以上0.25mL/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜2回、及び、投与期間として15週間以上25週間以下投与してなるものである。
That is, as a preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, the free radical generating agent is administered at a dose of 0.05 mL / kg body weight or more and less than 1.0 mL / kg body weight at a time, 1 times as the number of administrations. It is administered 1 to 4 times a week and 10 weeks or more and 30 weeks or less as an administration period.
In a more preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, the free radical generating agent is administered at a dose of 0.05 mL / kg body weight or more and 0.5 mL / kg body weight or less once, and once a week as the administration frequency It is administered 1 to 3 times per dose, and 12 weeks to 38 weeks as a dosing period.
In a further preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, the free radical generating agent is administered at a dose of 0.1 mL / kg body weight or more and 0.25 mL / kg body weight or less once, and once a week as the administration frequency It is administered once or twice, and as a administration period for 15 weeks or more and 25 weeks or less.
[高脂肪食]
高脂肪食としては、脂肪を30kcal%以上含有する食餌であればよく、40kcal%以上80kcal%以下含有する食餌であることが好ましく、50kcal%以上70kcal%以下含有する食餌であることがより好ましく、60kcal%含有する食餌であることがさらに好ましい。ここで脂肪としては、動物性脂肪、植物性脂肪にかかわらず、あらゆる種類の脂肪を用いることができる。脂肪として具体的には、例えば、コーン油、大豆油、なたね油、牛脂、豚脂等を挙げられる。中でも、脂肪としては、牛脂又は豚脂が好ましい。また高脂肪食中の脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、例えば、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでもよい。
高脂肪食としてより具体的には、例えば、研究用動物飼料として市販されているHigh Fat Diet32(日本クレア社製)、D12492(リサーチダイエット社製)等が挙げられる。
[High-fat diet]
The high-fat diet may be any diet containing 30 kcal% or more of fat, preferably 40 kcal% to 80 kcal%, and more preferably 50 kcal% to 70 kcal%. More preferably, the diet contains 60 kcal%. Here, as fats, all kinds of fats can be used regardless of animal fats and vegetable fats. Specific examples of the fat include corn oil, soybean oil, rapeseed oil, beef tallow, pork fat and the like. Among them, beef fat or pork fat is preferred as the fat. Further, the components other than fat in the high fat diet may be ordinary dietary components, and may contain, for example, proteins, carbohydrates, minerals and the like.
More specific examples of the high fat diet include High Fat Diet 32 (manufactured by CLEA Japan, Inc.) and D12492 (manufactured by Research Diet), which are commercially available as animal feed for research.
高脂肪食の摂取期間としては、肥満が生じるのに必要な期間であればよく、特に制限されない。高脂肪食の摂取期間として具体的には、1週間以上が好ましく、4週間以上がより好ましく、10週間以上30週間以下がさらに好ましく、12週間以上28週間以下であることが特に好ましく、15週間以上25週間以下であることが最も好ましい。また、高脂肪食は、動物に毎日自由摂取させればよい。なお、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与期間中も高脂肪食は摂取し続けることが好ましい。 The intake period of the high-fat diet is not particularly limited as long as it is necessary for obesity to occur. Specifically, one week or more is preferable, 4 weeks or more is more preferable, 10 weeks to 30 weeks is more preferable, and 12 weeks to 28 weeks is particularly preferable as the intake period of the high fat diet, and 15 weeks It is most preferable that it is 25 weeks or less. Also, the high-fat diet may be freely given to animals daily. In addition, it is preferable to continue to ingest the high fat diet even during the administration period of the LXRα agonist and the free radical generator.
すなわち、本発明のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、高脂肪食を1週間以上摂取させた後、高脂肪食の摂取を続けつつ、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤を上記投与条件(投与量、投与回数及び投与期間)にて投与してなるものである。 That is, as a preferred embodiment of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present invention, the high-fat diet is taken for a week or more, and then the above-mentioned LXRα agonist and the above-mentioned free radical generator are The administration is carried out under the above-mentioned administration conditions (dose amount, administration frequency and administration period).
また、非ヒト動物への上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を開始するタイミングとしては、非ヒト動物がマウスである場合、2週齢以上10週齢以下であることが好ましく、4週齢以上8週齢以下であることがより好ましく、6週齢以上7週齢以下であることがさらに好ましい。また、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を同時に行ってもよい。又は、上記高脂肪食の摂取を1週間以上前に開始して飼育した後に、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与を開始してもよい。 Moreover, as a timing which starts administration of said LXR (alpha) agonist and said free radical generating agent to a non-human animal, and intake of the said high fat diet, when a non-human animal is a mouse, 2 weeks or more and 10 weeks of age It is preferable that it is the following, It is more preferable that it is 4 weeks old or more and 8 weeks old or less, It is more preferable that it is 6 weeks old or more and 7 weeks old or less. Also, administration of the LXRα agonist and the free radical generator, and intake of the high-fat diet may be performed simultaneously. Alternatively, administration of the LXRα agonist and the free radical generator may be started after the intake of the high-fat diet is started a week or more ago and bred.
≪NASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット≫
本発明の一実施形態に係るNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットは、LXRαアゴニストと、フリーラジカル発生剤と、高脂肪食と、を備える。
«Nash liver carcinogenesis model non-human animal production kit»
A kit for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to an embodiment of the present invention comprises an LXRα agonist, a free radical generator, and a high fat diet.
本実施形態の製造キットによれば、簡便にヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症するNASH肝発がんモデル非ヒト動物を得ることができる。 According to the production kit of the present embodiment, it is possible to easily obtain a NASH liver carcinogenesis model non-human animal that develops liver cancer from a background liver similar to human NASH.
本実施形態の製造キットが備えるLXRαアゴニスト、フリーラジカル発生剤及び高脂肪食としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、LXRαアゴニストとしては、T0901317であることが好ましい。フリーラジカル発生剤としては、四塩化炭素であることが好ましい。高脂肪食としては、脂肪を20kcal%以上含有する食餌であればよく、40kcal%以上80kcal%以下含有する食餌であることが好ましく、50kcal%以上70kcal%以下含有する食餌であることがより好ましく、60kcal%含有する食餌であることがさらに好ましい。
Examples of the LXRα agonist, the free radical generator and the high fat diet provided in the production kit of the present embodiment include the same as those exemplified for the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
Among them, T0901317 is preferable as the LXRα agonist. The free radical generator is preferably carbon tetrachloride. The high-fat diet may be a diet containing 20 kcal% or more of fat, preferably a diet containing 40 kcal% or more and 80 kcal% or less, and more preferably a diet containing 50 kcal% or more and 70 kcal% or less More preferably, the diet contains 60 kcal%.
また、本実施形態の製造キットを用いて、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物に記載の投与条件にて非ヒト動物を飼育して得られた非ヒト動物は、NASH肝発がんモデル非ヒト動物として使用することができる。
なお、本実施形態の製造キットが適用される非ヒト動物としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
A non-human animal obtained by rearing a non-human animal under the administration conditions described in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal using the production kit of the present embodiment is a NASH liver carcinogenesis model non-human animal. It can be used.
In addition, as a non-human animal to which the production kit of the present embodiment is applied, the same ones as exemplified in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal can be mentioned.
本実施形態の製造キットを用いて、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物の作製方法に記載の投与条件にて非ヒト動物を飼育することで、非ヒト動物の正常な肝臓にNASHを発症させ、さらに肝細胞がんを発症させて、NASH肝発がんモデル非ヒト動物を作製することができる。 By breeding a non-human animal under the administration conditions described in the method for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal described above using the production kit of the present embodiment, NASH is caused to develop in the normal liver of the non-human animal, Furthermore, hepatocellular carcinoma can be developed to produce NASH liver carcinogenesis model non-human animals.
また、本実施形態の製造キットは、NASHモデル非ヒト動物を更に備えてもよい。
このNASHモデル非ヒト動物は、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤を投与し、上記高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である。
また、本実施形態の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物は、インスリン抵抗性を示し、且つ、ヒトNASH病理像を有するものである。ここでいう「ヒトNASH病理像」とは、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において記載してものと同様のものである。
本実施形態の製造キットは、NASHモデル非ヒト動物を更に備えることで、より短期間でNASH肝発がんモデル非ヒト動物を作製することができる。
In addition, the production kit of the present embodiment may further include a NASH model non-human animal.
This NASH model non-human animal is a non-human animal obtained by administering the above-mentioned LXRα agonist and the above-mentioned free radical generator and rearing using the above-mentioned high fat diet.
In addition, a NASH model non-human animal included in the production kit of the present embodiment exhibits insulin resistance and has a human NASH pathological image. The "human NASH pathological image" referred to here is the same as that described in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
The production kit of the present embodiment can further comprise a NASH model non-human animal, thereby producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal in a shorter period of time.
<NASHモデル非ヒト動物の作製方法>
本実施形態の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物は、以下に示す投与条件にてLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより作製することができる。換言すると、以下に示す投与条件にてLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育して得られる非ヒト動物は、NASHモデル非ヒト動物として使用することができる。
<Method of producing NASH model non-human animal>
A NASH model non-human animal included in the production kit of the present embodiment can be prepared by administering an LXRα agonist and a free radical generator under the administration conditions shown below, and rearing using a high fat diet. In other words, non-human animals obtained by administering the LXRα agonist and the free radical generator under the following administration conditions and rearing using a high-fat diet can be used as NASH model non-human animals.
LXRαアゴニストとしては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。 Examples of LXRα agonists include those similar to those exemplified above in the NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
LXRαアゴニストの投与手段、投与量及び投与回数としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。 As the administration means, dosage amount and administration frequency of the LXRα agonist, the same ones as exemplified in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal can be mentioned.
LXRαアゴニストの投与期間としては、ヒトNASH特有の病理像が現れるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。LXRαアゴニストの投与期間として具体的には、1週間以上15週間以下であることが好ましく、5週間以上14週間以下であることがより好ましく、10週間以上12週間以下であることがさらに好ましい。 The administration period of the LXRα agonist is not particularly limited as long as it is a period necessary for the appearance of a pathological image unique to human NASH, and may be appropriately adjusted according to the dose and the number of administrations. Specifically, the administration period of the LXRα agonist is preferably 1 week to 15 weeks, more preferably 5 weeks to 14 weeks, and still more preferably 10 weeks to 12 weeks.
すなわち、本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり1.0mg/kg体重以上3.0mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として1週間以上15週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり1.5mg/kg体重以上2.5mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜3回、及び、投与期間として5週間以上14週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、LXRαアゴニストを、投与量として1回あたり2.0mg/kg体重以上2.5mg/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜2回、及び、投与期間として10週間以上12週間以下投与してなるものである。
That is, as a preferred embodiment of the NASH model non-human animal provided in the production kit of the present invention, the LXRα agonist is administered in a dose of 1.0 mg / kg to 3.0 mg / kg body weight at a time, 1 times as the number of administrations. It is administered 1 to 4 times a week and as a administration period for 1 week to 15 weeks.
In a more preferred embodiment of the NASH model non-human animal provided in the production kit of the present invention, the LXRα agonist is administered in a dose of 1.5 mg / kg to 2.5 mg / kg body weight at a time, for 1 week as the number of doses It is administered 1 to 3 times per, and 5 weeks or more and 14 weeks or less as an administration period.
In a further preferred embodiment of the NASH model non-human animal provided in the production kit of the present invention, the LXR alpha agonist is administered in a dose of 2.0 mg / kg to 2.5 mg / kg body weight at a time, for 1 week as the number of doses It is administered once or twice a day, and 10 weeks or more and 12 weeks or less as an administration period.
フリーラジカル発生剤としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。 Examples of the free radical generator include the same as those exemplified in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
フリーラジカル発生剤の投与手段、投与量及び投与回数としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。
なお、LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤は、非ヒト動物に同時に投与してもよく、同日又は別日に異なるタイミングで投与してもよい。
As the administration means, dosage amount and administration frequency of the free radical generating agent, the same ones as exemplified in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal can be mentioned.
The LXRα agonist and the free radical generator may be simultaneously administered to a non-human animal, or may be administered at different times on the same day or another day.
フリーラジカル発生剤の投与期間としては、ヒトNASH特有の病理像が現れるのに必要な期間であればよく、特に制限されず、上記投与量及び上記投与回数に応じて適宜調整すればよい。LXRαアゴニストの投与期間として具体的には、1週間以上15週間以下であることが好ましく、5週間以上14週間以下であることがより好ましく、10週間以上12週間以下であることがさらに好ましい。 The administration period of the free radical generating agent is not particularly limited as long as it is a period necessary for the appearance of a pathological image unique to human NASH, and may be appropriately adjusted according to the dose and the administration frequency. Specifically, the administration period of the LXRα agonist is preferably 1 week to 15 weeks, more preferably 5 weeks to 14 weeks, and still more preferably 10 weeks to 12 weeks.
すなわち、本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.05mL/kg体重以上1.0mL/kg体重未満、投与回数として1週間あたり1〜4回、及び、投与期間として1週間以上15週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物のより好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.05mL/kg体重以上0.5mL/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜3回、及び、投与期間として5週間以上14週間以下投与してなるものである。
本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物のさらに好ましい実施形態としては、フリーラジカル発生剤を、投与量として1回あたり0.1mL/kg体重以上0.25mL/kg体重以下、投与回数として1週間あたり1〜2回、及び、投与期間として10週間以上12週間以下投与してなるものである。
That is, as a preferred embodiment of the NASH model non-human animal provided in the production kit of the present invention, the free radical generating agent is administered in a dose of 0.05 mL / kg body weight or more and 1.0 mL / kg body weight or less, the number of times of administration It is administered as 1 to 4 times per week, and as a administration period for 1 week or more and 15 weeks or less.
In a more preferred embodiment of the NASH model non-human animal included in the production kit of the present invention, the free radical generating agent is used at a dose of 0.05 mL / kg body weight or more and 0.5 mL / kg body weight or less at one dose. It is administered 1 to 3 times a week and 5 weeks or more and 14 weeks or less as an administration period.
In a further preferred embodiment of the NASH model non-human animal provided in the production kit of the present invention, the free radical generating agent is administered in a dose of 0.1 mL / kg body weight or more and 0.25 mL / kg body weight or less per dose, as the administration frequency It is administered once or twice a week and as a administration period for 10 weeks or more and 12 weeks or less.
高脂肪食としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。 Examples of the high fat diet include the same as those exemplified in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
高脂肪食の摂取期間としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において例示されたものと同様のものが挙げられる。 The intake period of the high fat diet includes the same ones as exemplified in the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
すなわち、本発明の製造キットが備えるNASHモデル非ヒト動物の好ましい実施形態としては、高脂肪食を1週間以上摂取させた後、高脂肪食の摂取を続けつつ、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤を上記投与条件(投与量、投与回数及び投与期間)にて投与してなるものである。 That is, as a preferred embodiment of the NASH model non-human animal included in the production kit of the present invention, the above-mentioned LXRα agonist and the above-mentioned free radical generation are continued while taking the high fat diet after taking the high fat diet for one week or more. The agent is administered under the above-mentioned administration conditions (dose amount, administration frequency and administration period).
また、非ヒト動物への上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を開始するタイミングとしては、非ヒト動物がマウスである場合、2週齢以上10週齢以下であることが好ましく、4週齢以上8週齢以下であることがより好ましく、6週齢以上7週齢以下であることがさらに好ましい。また、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与、並びに、上記高脂肪食の摂取を同時に行ってもよい。又は、上記高脂肪食の摂取を1週間以上前に開始して飼育した後に、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与を開始してもよい。 Moreover, as a timing which starts administration of said LXR (alpha) agonist and said free radical generating agent to a non-human animal, and intake of the said high fat diet, when a non-human animal is a mouse, 2 weeks or more and 10 weeks of age It is preferable that it is the following, It is more preferable that it is 4 weeks old or more and 8 weeks old or less, It is more preferable that it is 6 weeks old or more and 7 weeks old or less. Also, administration of the LXRα agonist and the free radical generator, and intake of the high-fat diet may be performed simultaneously. Alternatively, administration of the LXRα agonist and the free radical generator may be started after the intake of the high-fat diet is started a week or more ago and bred.
≪肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法≫
<第1実施形態>
本発明の一実施形態に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程(A1)及び(B1)を備える方法である。
(A1)上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程
(B1)肝がんに対する治療効果を評価する工程
«Methods of screening compounds for treatment or prevention of liver cancer»
First Embodiment
A method of screening a compound for treatment or prevention of liver cancer according to one embodiment of the present invention is a method comprising the following steps (A1) and (B1).
(A1) A step of administering a test substance to the above-mentioned NASH liver carcinogenesis model non-human animal (B1) a step of evaluating the therapeutic effect on liver cancer
本実施形態のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物をスクリーニングすることができる。また、特に、本実施形態のスクリーニング方法によれば、発症した肝細胞がんの進行を抑制する、又は、肝細胞がんのみを死滅させて治療するために有用な化合物をスクリーニングすることができる。 According to the screening method of the present embodiment, compounds effective for treatment or prevention of liver cancer can be screened. Furthermore, in particular, according to the screening method of the present embodiment, it is possible to screen a compound that is useful for suppressing the progression of the developed hepatocellular carcinoma or for killing and treating only the hepatocellular carcinoma. .
[工程(A1)]
工程(A1)は、NASH肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程である。
NASH肝発がんモデル非ヒト動物は、非ヒト動物を上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物の作製方法に記載の投与条件にて飼育することで作製することができる。
[Step (A1)]
Step (A1) is a step of administering a test substance to a NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
A NASH liver carcinogenesis model non-human animal can be prepared by rearing a non-human animal under the administration conditions described in the method for preparing the NASH liver carcinogenesis model non-human animal above.
本実施形態のスクリーニング方法に用いられる被検物質としては、特に制限はない。被検物質として具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a to-be-tested substance used for the screening method of this embodiment. Specific examples of the test substance include, for example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins and peptides, compound libraries, expression products of gene libraries, cell extracts, cell culture supernatants, fermentations Microbial products, marine organism extracts, plant extracts and the like can be mentioned.
NASH肝発がんモデル非ヒト動物への被検物質の投与方法としては、特に制限はない。被検物質の投与方法として具体的には、例えば、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等が挙げられる。被検物質がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、NASH肝発がんモデル非ヒト動物へ該遺伝子を導入することも可能である。 There are no particular limitations on the method of administering the test substance to the NASH liver carcinogenesis model non-human animal. Specific examples of the method of administering the test substance include, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, oral administration, subcutaneous administration and the like. When the test substance is a protein, for example, a viral vector having a gene encoding the protein may be constructed, and the infectivity may be used to introduce the gene into a NASH liver carcinogenesis model non-human animal. It is possible.
[工程(B1)]
工程(B1)は、被検物質の肝がんに対する治療効果を評価する工程である。
具体的には、NASH肝発がんモデル非ヒト動物の呈する病理学的形態を検討することにより、肝細胞がんが改善しているか否かを判定することができる。より具体的には、例えば、被検物質が投与されたモデル動物において、肝細胞がんが消失している、又は、類洞構造が保たれている場合には、被検物質は肝細胞がんへの治療効果を有するものと判定される。
肝細胞がんの病理学的形態としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物に記載のものと同様のものが挙げられる。
また、本明細書における「肝細胞がんの改善」とは、肝細胞がんの増殖を抑制している、肝細胞がんのみが死滅している、又は、肝細胞がんの症状が緩和していることを指す。当業者であれば、本明細書に記載された肝細胞がんの病理学的形態を指標に、モデル非ヒト動物について適宜肝細胞がんが改善しているか否かを判定することができる。
[Step (B1)]
Step (B1) is a step of evaluating the therapeutic effect of the test substance on liver cancer.
Specifically, it is possible to determine whether or not the hepatocellular carcinoma is improved by examining the pathological morphology of the NASH liver carcinogenesis model non-human animal. More specifically, for example, in a model animal to which a test substance is administered, when the hepatocellular carcinoma has disappeared or the sinusoidal structure is maintained, the test substance is a hepatocyte. It is judged to have a therapeutic effect on cancer.
Pathological forms of hepatocellular carcinoma include those described above for the NASH liver carcinogenesis model non-human animal.
In addition, "improvement of hepatocellular carcinoma" in the present specification means that the growth of hepatocellular carcinoma is suppressed, only hepatocellular carcinoma is killed, or the symptoms of hepatocellular carcinoma are alleviated. Point to what you are doing. One of ordinary skill in the art can use the pathological form of hepatocellular carcinoma described herein as an indicator to determine whether or not hepatocellular carcinoma is appropriately improved for a model non-human animal.
工程(B1)において、改善効果を示す被検物質を肝細胞がんの治療用又は予防用物質として選択することができる。 In the step (B1), a test substance exhibiting an improvement effect can be selected as a therapeutic or prophylactic substance for hepatocellular carcinoma.
<第2実施形態>
本発明の他の実施形態に係る肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法は、以下の工程(A2)〜(C2)を備える肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法。
(A2)LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデル非ヒト動物を作製する工程
(B2)前記NASHモデル非ヒト動物をLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程
(C2)肝がんの発症有無を評価する工程
Second Embodiment
The screening method for a compound for treating or preventing liver cancer according to another embodiment of the present invention is a method for screening a compound for treating or preventing liver cancer comprising the following steps (A2) to (C2).
(A2) A step of preparing a non-alcoholic steatohepatitis (NASH) model non-human animal by administering a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high-fat diet (B2) the aforementioned NASH model non-human A step of administering a test substance while administering an animal to a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high-fat diet (C2) a step of evaluating the onset or absence of liver cancer
本実施形態の肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物をスクリーニングすることができる。また、特に、本実施形態のスクリーニング方法によれば、NASHからの肝細胞がんの発症を抑制する、又は、NASHを改善することで肝細胞がんの発症を予防するために有用な化合物をスクリーニングすることができる。 According to the method of screening a compound for treatment or prevention of liver cancer of the present embodiment, a compound effective for treatment or prevention of liver cancer can be screened. Further, in particular, according to the screening method of the present embodiment, a compound useful for preventing the onset of hepatocellular carcinoma from NASH or preventing the onset of hepatocellular carcinoma by improving NASH It can be screened.
[工程(A2)]
工程(A2)は、NASHモデル非ヒト動物を作製する工程である。
具体的な作製方法としては、上述のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットに記載の方法と同様の方法が挙げられる。
[Step (A2)]
Step (A2) is a step of producing a NASH model non-human animal.
As a specific production method, the same method as described in the above-mentioned production kit for NASH liver carcinogenesis model non-human animal can be mentioned.
[工程(B2)]
工程(B2)は、(A2)で得られたNASHモデル非ヒト動物をLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程である。
上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物において説明したように、工程(B2)において、NASHモデル非ヒト動物を、被検物質を投与せずに、LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育し続けることで、NASHから肝細胞がんの発症を誘導することができる。
被検物質及びその投与方法としては、上記第1実施形態に例示されたものと同様のものが挙げられる。また、被検物質を投与するタイミングとしては、上記LXRαアゴニスト及び上記フリーラジカル発生剤の投与と同じであってもよく、異なっていてもよい。
[Step (B2)]
Step (B2) is a step of administering a test substance while administering the NASR model non-human animal obtained in (A2) with a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high fat diet.
As described above in the NASH liver carcinogenesis model non-human animal, in the step (B2), the NASH model non-human animal is administered a LXRα agonist and a free radical generator without administering a test substance, and a high-fat diet Can be used to induce the onset of hepatocellular carcinoma from NASH.
As the test substance and the administration method thereof, the same ones as those exemplified in the first embodiment can be mentioned. In addition, the timing of administering the test substance may be the same as or different from the administration of the LXRα agonist and the free radical generator.
[工程(C2)]
工程(C2)は、モデル非ヒト動物における肝がんの発症有無を評価する工程である。
具体的には、モデル非ヒト動物の呈する病理学的形態を検討することにより、肝がんの発症有無を判定することができる。より具体的には、例えば、被検物質が投与されたモデル動物において、NASH(の病理学的形態)が改善している、又は、肝細胞がんの病理学的形態を呈さない場合には、被検物質は肝細胞がんへの治療効果を有するものと判定される。
NASH及び肝細胞がんの病理学的形態としては、上記NASH肝発がんモデル非ヒト動物に記載のものと同様のものが挙げられる。
また、本明細書における「NASHの改善」とは、NASHの症状が正常な状態へ回復している、又は、症状が緩和していることを指す。当業者であれば、本明細書に記載された病理学的形態を指標に、モデル非ヒト動物について適宜NASHの症状が改善しているか否かを判定することができる。
[Step (C2)]
Step (C2) is a step of evaluating the presence or absence of onset of liver cancer in a model non-human animal.
Specifically, the development of liver cancer can be determined by examining the pathological forms of model non-human animals. More specifically, for example, in a model animal to which a test substance is administered, (the pathological form of) NASH is improved or when it does not exhibit the pathological form of hepatocellular carcinoma. The test substance is determined to have a therapeutic effect on hepatocellular carcinoma.
Pathological forms of NASH and hepatocellular carcinoma include those described in the above NASH liver carcinogenesis model non-human animals.
Also, "amelioration of NASH" in the present specification refers to recovery of NASH symptoms to a normal state or relief of symptoms. One of ordinary skill in the art can use the pathological forms described herein as an indicator to determine whether the symptoms of NASH are appropriately improved for model non-human animals.
工程(C2)において、肝細胞がんの病理学的形態を呈さない被検物質を肝細胞がんの治療用又は予防用物質として選択することができる。また、NASHの症状に対する改善効果を示す被検物質はNASHの治療用又は予防用物質としても有用である。 In the step (C2), a test substance which does not exhibit the pathological form of hepatocellular carcinoma can be selected as a therapeutic or prophylactic substance for hepatocellular carcinoma. In addition, a test substance that exhibits ameliorating effect on the symptoms of NASH is also useful as a therapeutic or prophylactic substance for NASH.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described by way of examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[実施例1]
(1)NASHモデルマウスの作製
7週齢のC57BL/6雄性マウス12個体に対して、高脂肪食(脂肪含有量:60kcal%、ラード含有、D12492、Research Diets社製)を自由摂取させ、四塩化炭素(0.1mL/kg体重、和光純薬工業株式会社製)を週に2回腹腔内投与した。また、LXRアゴニストであるT0901317(2.5mg/kg体重、Cayman Chemical Co. Ann Arbor, Michigan. USA)を週に2回腹腔内投与した。なお、四塩化炭素及びT0901317は同日に投与した。
Example 1
(1) Preparation of NASH model mouse A 12-week-old 7-week-old C57BL / 6 male mouse was allowed to freely ingest a high-fat diet (fat content: 60 kcal%, lard-containing, D12492, Research Diets) and Carbon chloride (0.1 mL / kg body weight, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was intraperitoneally administered twice a week. In addition, LXR agonist T0901317 (2.5 mg / kg body weight, Cayman Chemical Co. Ann Arbor, Michigan. USA) was intraperitoneally administered twice a week. Carbon tetrachloride and T0901317 were administered on the same day.
(2)NASHモデルマウスの病理組織学的観察
(2−1)Hematoxylin−Eosin(HE)染色
飼育開始から12週目の一部のマウス(3個体)から肝臓を常法により切り出し、パラフィンで包埋した。次いで、パラフィンブロックを約4μmの厚さに薄切りし、Hematoxylin−Eosin(HE)染色キット(ヘマトキシリン:メルク社製、硫酸カリウムアルミニウム:和光純薬工業株式会社製、グリセリン:和光純薬工業株式会社製、ヨウ素酸ナトリウム:小宗化学薬品株式会社製)を用いて、HE染色を施した。次いで、光学顕微鏡(HS オールインワン蛍光顕微鏡 BZ−9000、Keyence社製)にて観察した(倍率:400倍)。結果を図2Aに示す。図2Aにおいて、矢印はマロリー小体を示し、矢頭は風船様細胞を示している。なお、ここでいう「マロリー小体」とは、肝細胞の核の周辺部に出現する、ユビキチン化タンパク質、中間径フィラメントであるケラチン8及18、p62等が不定形の構造物として蓄積した好酸性細胞質内封入体を意味する。マロリー小体は脂肪肝、肝がんや肝硬変を発症した肝細胞にて観察されることが知られている。
(2) Histopathological observation of NASH model mice (2-1) Hematoxylin-Eosin (HE) staining The liver is cut out from a part of mice (3 animals) at 12 weeks after the start of breeding by a normal method, and is wrapped in paraffin I buried it. Then, the paraffin block is sliced to a thickness of about 4 μm, and Hematoxylin-Eosin (HE) staining kit (Hematoxylin: manufactured by Merck, potassium aluminum sulfate: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., glycerin: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) HE staining was performed using sodium iodate: Kosoh Chemical Co., Ltd.). Subsequently, it observed with the optical microscope (HS all-in-one fluorescence microscope BZ-9000, Keyence company make) (magnification: 400 times). The results are shown in FIG. 2A. In FIG. 2A, arrows indicate Mallory bodies and arrowheads indicate balloon-like cells. The term "Mallory body" as used herein refers to the accumulation of ubiquitinated proteins, keratins 8 and 18 as intermediate diameter filaments, p62, etc. appearing in the periphery of the nucleus of hepatocytes as an irregular structure. By acidic intracytoplasmic inclusion body is meant. It is known that the Mallory body is observed in fatty liver, liver cancer that has developed liver cancer and cirrhosis.
(2−2)鍍銀染色
(2−1)で得られたパラフィンブロックを約4μmの厚さに薄切りし、銀アンモニア錯体(硝酸銀、水酸化カリウム、アンモニア水:全て和光純薬工業株式会社製)を用いて鍍銀染色を施した。次いで、光学顕微鏡(HS オールインワン蛍光顕微鏡 BZ−9000、Keyence社製)にて観察した(倍率:100倍)。結果を図2Bに示す。図2Bにおいて、「CV」は中心静脈(central vein)を示し、「G」はグリソン鞘(小葉間結合組織、Glisson sheath)を示す。また、矢印は、橋渡しするような線維化構造を示している。
(2-2) Silver plated silver The paraffin block obtained in (2-1) is sliced to a thickness of about 4 μm, and a silver ammonia complex (silver nitrate, potassium hydroxide, aqueous ammonia: all manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Silver stain was applied using. Subsequently, it observed with the optical microscope (HS all-in-one fluorescence microscope BZ-9000, Keyence company make) (magnification: 100 times). The results are shown in FIG. 2B. In FIG. 2B, “CV” indicates central vein and “G” indicates Gleason sheath (interlobular connective tissue, Glisson sheath). In addition, arrows indicate fibrotic structures that bridge.
(2−3)Oil−red染色
(2−1)で得られたパラフィンブロックを約4μmの厚さに薄切りし、オイルレッド(Oil−red)O染色キット(オイルレッドO:クローマ社製、2−プロパノール:和光純薬工業株式会社製)を用いてOil−red染色を施した。次いで、光学顕微鏡(HS オールインワン蛍光顕微鏡 BZ−9000、Keyence社製)にて観察した(倍率:200倍)。結果を図2Cに示す。
(2-3) Oil-red Stain The paraffin block obtained by (2-1) is sliced to a thickness of about 4 μm, and oil red (Oil-red) O staining kit (Oil red O: manufactured by KROMA, 2 -Propanol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used to perform Oil-red staining. Subsequently, it observed with the optical microscope (HS all-in-one fluorescence microscope BZ-9000, Keyence company make) (magnification: 200 times). The results are shown in FIG. 2C.
(2−4)観察結果
図2Aから、マロリー小体及び風船様細胞が観察された。また、類洞内好中球浸潤が確認され、炎症性細胞の浸潤が目立っていた。
図2Bから、グリソン鞘の周囲等に線維化が観察され、また、橋渡しするように線維化が認められた。
図2Cから、大滴性の脂肪滴が観察された。脂肪滴が小葉面積の30%以上を占めていた。
以上のことから、飼育開始から12週目のマウスの肝臓では、NASHの病理学的診断基準(参考文献1:Matteoni CA, et al., “Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity.”, Gastroenterology, Vol. 116, Issue 6, p1413-1419, 1999.)である、大滴性脂肪、肝細胞の風船様変性、炎症性細胞の浸潤及び線維化の全てが観察された。すなわち、飼育開始から12週目のマウスの肝臓は、ヒトNASHの病理像を有することが確かめられた。
(2-4) Observation results From FIG. 2A, Mallory bodies and balloon-like cells were observed. In addition, intrasinusoidal neutrophil infiltration was confirmed, and inflammatory cell infiltration was prominent.
From FIG. 2B, fibrosis was observed around the Grisson sheath, etc., and fibrosis was observed as bridging.
From FIG. 2C, large droplets of fat were observed. Fat droplets accounted for more than 30% of the leaflet area.
From the above, in the livers of mice at 12 weeks after the start of breeding, the pathological diagnostic criteria of NASH (Reference 1: Matteoni CA, et al., “Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. ", Gastroenterology, Vol. 116, Issue 6, p 1413-1419, 1999.), macroscopic fat, balloon-like degeneration of hepatocytes, inflammatory cell infiltration and fibrosis were all observed. That is, it was confirmed that the mouse liver at 12 weeks after the start of rearing had a pathological image of human NASH.
(3)NASH肝発がんモデルマウスの作製
さらに、(1)に示した条件と同じ条件にて、飼育開始から24週目までマウスを飼育した。なお、飼育開始から24週目まで生き残ったのは4個体であった。
(3) Preparation of NASH Hepatic Carcinogenesis Model Mouse Further, mice were bred from the start of breeding until the 24th week under the same conditions as shown in (1). In addition, 4 individuals survived until the 24th week from the start of breeding.
(4)NASH肝発がんモデルマウスの病理組織学的観察
(4−1)HE染色
飼育開始から24週目のマウス(4個体)から肝臓を常法により切り出したところ、全ての個体において多発性腫瘤を形成していた(図3参照、矢印は腫瘍部を示している)。次いで、摘出した肝臓の腫瘍部をパラフィンで包埋した。次いで、腫瘍部のパラフィンブロックを約4μmの厚さに薄切りし、Hematoxylin−Eosin(HE)染色キット(ヘマトキシリン:メルク社製、硫酸カリウムアルミニウム:和光純薬工業株式会社製、グリセリン:和光純薬工業株式会社製、ヨウ素酸ナトリウム:小宗化学薬品株式会社製)を用いて、HE染色を施した。次いで、光学顕微鏡(HS オールインワン蛍光顕微鏡 BZ−9000、Keyence社製)にて観察した(倍率:100倍(左)、200倍(右))。結果を図4Aに示す。図4Aにおいて、「CV」は中心静脈(central vein)を示し、「G」はグリソン鞘(小葉間結合組織、Glisson sheath)を示す。また、矢印は、クロマチンが凝集した細胞核を示しており、矢頭は風船様細胞を示している。
(4) Histopathological observation of NASH liver carcinogenesis model mice (4-1) HE staining When the liver is cut out from mice (4 individuals) at 24 weeks after the start of breeding by a standard method, multiple masses in all individuals (See FIG. 3, arrows indicate the tumor site). Then, the tumor site of the excised liver was embedded in paraffin. Then, paraffin blocks in the tumor area are sliced to a thickness of about 4 μm, and Hematoxylin-Eosin (HE) staining kit (Hematoxylin: manufactured by Merck, potassium aluminum sulfate: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., glycerin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) HE staining was performed using a sodium iodate manufactured by Kozo Chemical Co., Ltd.). Subsequently, it observed with the optical microscope (HS all-in-one fluorescence microscope BZ-9000, Keyence company make) (magnification: 100 times (left), 200 times (right)). The results are shown in FIG. 4A. In FIG. 4A, “CV” indicates central vein and “G” indicates Gleason sheath (interlobular connective tissue, Glisson sheath). Arrows indicate cell nuclei in which chromatin has aggregated, and arrowheads indicate balloon-like cells.
(4−2)鍍銀染色
(4−1)で得られた腫瘍部のパラフィンブロックを約4μmの厚さに薄切りし、銀アンモニア錯体(硝酸銀、水酸化カリウム、アンモニア水:全て和光純薬工業株式会社製)を用いて鍍銀染色を施した。次いで、光学顕微鏡(HS オールインワン蛍光顕微鏡 BZ−9000、Keyence社製)にて観察した(倍率:100倍(左)、400倍(右))。結果を図4Bに示す。図4Bにおいて、「CV」は中心静脈(central vein)を示し、「G」はグリソン鞘(小葉間結合組織、Glisson sheath)を示す。
(4-2) Silver plated silver The paraffin block in the tumorous part obtained by (4-1) was sliced to a thickness of about 4 μm, and a silver ammonia complex (silver nitrate, potassium hydroxide, aqueous ammonia: all Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Silver silver stain was applied using a product made in Japan. Subsequently, it observed with the optical microscope (HS all-in-one fluorescence microscope BZ-9000, Keyence company make) (magnification: 100 times (left), 400 times (right)). The results are shown in FIG. 4B. In FIG. 4B, "CV" indicates central vein (central vein) and "G" indicates Gleason sheath (interlobular connective tissue, Glisson sheath).
(4−3)観察結果
図4Aから、腫瘍部において正常構造は破壊され、門脈域や類洞構造が不明瞭となっていた。また、細胞のサイズばらつきがあり、核の大小不同が観察された。また、クロマチンが凝集している細胞核が散見された。さらに、脂肪による空胞が目立っていた。
図4Bから、腫瘍部では、類洞構造の廃絶が認められた。
以上のことから、飼育開始から24週目のマウスの肝臓の腫瘍部では、NASHから発症した肝細胞がんの病理学的所見である、細胞核におけるクロマチンの凝集、細胞核の大小不同及び類洞構造の廃絶が観察された。すなわち、飼育開始から24週目のマウスの肝臓の腫瘍部は、ヒトNASHを背景肝とした肝細胞がんの病理像を有することが確かめられた。また、飼育開始から24週目のマウス4個体全てにおいて、腫瘍が形成されており、ヒトNASHを背景肝とした肝細胞がんの病理像を有していた。
(4-3) Observation result From FIG. 4A, the normal structure was destroyed in the tumor part, and the portal vein area and the sinusoid structure became unclear. In addition, there were variations in cell size, and differences in nuclear size were observed. In addition, cell nuclei in which chromatin was aggregated were occasionally observed. In addition, fat vacuoles were noticeable.
From FIG. 4B, elimination of the sinusoid structure was observed in the tumorous part.
From the above, in the tumor area of the liver of mice at 24 weeks after the start of breeding, aggregation of chromatin in the cell nucleus, size unevenness of the cell nucleus and sinusoid structure, which are pathological findings of hepatocellular carcinoma developed from NASH The abolition of the That is, it was confirmed that the tumorous part of the liver of the mouse at 24 weeks after the start of breeding has a pathological image of hepatocellular carcinoma whose background is human NASH. In addition, tumors were formed in all four mice at 24 weeks after the start of breeding, and had a pathological image of hepatocellular carcinoma with human NASH as a background liver.
(5)NASH肝発がんモデルマウスの肝細胞中のタンパク質発現の評価
まず、飼育開始から24週目のマウスの肝臓の腫瘍部及び非腫瘍部を用いて、細胞破砕液を調製した。次いで、Jak/STAT3系、PI3−K/Akt系及びMAPK/Erk系に関与するタンパク質(具体的には、リン酸化Erk、Erk総量、リン酸化Akt、Akt総量、リン酸化STAT3、STAT3総量、Cyclin D1、リン酸化JNK及びJNK総量)をウエスタンブロッティングにより検出した。また、GAPDHはローディングコントロールである。結果を図5A及び図6Aに示す。さらに、ウエスタンブロッティングにおける各タンパク質の検出輝度から、Erk総量に対するリン酸化Erkの割合(p−Erk/t−Erk)(図5B)、Akt総量に対するリン酸化Aktの割合(p−Akt/t−Akt)(図5C)、STAT3総量に対するリン酸化STAT3の割合(p−STAT3/t−STAT3)(図5D)、Cyclin D1の発現量(図6B)及びJNK総量に対するリン酸化JNKの割合(p−JNK/t−JNK)(図6C)を算出した。
(5) Evaluation of protein expression in hepatocytes of NASH liver carcinogenesis model mice First, a cell lysate was prepared using the tumor area and non-tumor area of the mouse liver 24 weeks after the start of breeding. Next, proteins involved in the Jak / STAT3 system, PI3-K / Akt system and MAPK / Erk system (specifically, phosphorylated Erk, total Erk, total phosphorylated Akt, total Akt, total phosphorylated STAT3, STAT3 total, Cyclin D1, phosphorylated JNK and total amount of JNK) were detected by western blotting. In addition, GAPDH is a loading control. The results are shown in FIGS. 5A and 6A. Furthermore, from the detection brightness of each protein in Western blotting, the ratio of phosphorylated Erk to total Erk (p-Erk / t-Erk) (FIG. 5B), the ratio of phosphorylated Akt to total Akt (p-Akt / t-Akt) (FIG. 5C), Ratio of phosphorylated STAT3 to total STAT3 (p-STAT3 / t-STAT3) (FIG. 5D), expression level of Cyclin D1 (FIG. 6B) and ratio of phosphorylated JNK to total JNK (p-JNK) / T-JNK) (FIG. 6C) was calculated.
図5A〜図5D及び図6A〜図6Cから、腫瘍部では、各増殖シグナル系に関与するタンパク質のリン酸化の上昇が認められた。また、腫瘍部では非腫瘍部と比較して、Cyclin D1の発現量が有意に上昇していた。 From FIG. 5A to FIG. 5D and FIG. 6A to FIG. 6C, in the tumorous part, increased phosphorylation of proteins involved in each growth signal system was observed. In addition, the expression level of Cyclin D1 was significantly increased in the tumor site as compared to the non-tumor site.
ヒトの肝細胞がんでは、Erk、Akt、MEK、cmyc、BCL及びSTAT3のリン酸化の上昇することが知られている。また、Cyclin D1の発現量が上昇することが知られている。
以上のことから、飼育開始から24週目のマウスの肝臓の腫瘍部は、ヒトNASHを背景肝とした肝細胞がんのタンパク質発現を再現していることが確認された。
In human hepatocellular carcinoma, increased phosphorylation of Erk, Akt, MEK, cmyc, BCL and STAT3 is known. In addition, it is known that the expression level of Cyclin D1 is increased.
From the above, it was confirmed that the tumorous part of the mouse liver at 24 weeks after the start of breeding reproduces the protein expression of hepatocellular carcinoma with human NASH as the background liver.
本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物は、ヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症する非ヒト動物であり、NASHから肝がんを発症するメカニズムの解明に役立てることができる。また、本実施形態のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キットによれば、簡便にヒトNASHに類似した背景肝から肝がんを発症するNASH肝発がんモデル非ヒト動物を得ることができる。本実施形態の肝がんの治療用又は予防用化合物のスクリーニング方法によれば、肝がんの治療又は予防に有効な化合物を簡便にスクリーニングすることができる。 The NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment is a non-human animal that develops liver cancer from a background liver similar to human NASH, and can be useful for elucidating the mechanism of developing liver cancer from NASH. In addition, according to the production kit for NASH liver carcinogenesis model non-human animal of the present embodiment, a NASH liver carcinogenesis model non-human animal that develops liver cancer can be easily obtained from a background liver similar to human NASH. According to the method of screening a compound for treatment or prevention of liver cancer of the present embodiment, a compound effective for treatment or prevention of liver cancer can be conveniently screened.
Claims (19)
LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより得られるNASH肝発がんモデル非ヒト動物。 NASH liver carcinogenesis model non-human animal,
NASH liver carcinogenesis model non-human animal obtained by administering a LXR alpha agonist and a free radical generator and rearing using a high fat diet.
(a1)肝細胞核内でのクロマチンの凝集
(b1)肝細胞核の大小不同
(c1)類洞構造の廃絶 The NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to any one of claims 1 to 6, wherein the liver of the non-human animal has the following pathological forms (a1) to (c1).
(A1) aggregation of chromatin in the nucleus of hepatocytes (b1) elimination of the structure of the nucleus of the nucleus of hepatocytes (c1)
フリーラジカル発生剤と、
高脂肪食と、を備えるNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。 With an LXR alpha agonist
A free radical generator,
A kit for producing a NASH liver carcinogenesis model non-human animal comprising a high-fat diet.
前記NASHモデル非ヒト動物は、前記LXRαアゴニスト及び前記フリーラジカル発生剤を投与し、前記高脂肪食を用いて飼育することにより得られる非ヒト動物である請求項10〜13のいずれか一項に記載のNASH肝発がんモデル非ヒト動物の製造キット。 Further equipped with NASH model non-human animals,
The NASH model non-human animal is a non-human animal obtained by administering the LXRα agonist and the free radical generator and rearing using the high-fat diet. Production kit for NASH liver carcinogenesis model non-human animal as described.
(a2)大滴性脂肪
(b2)肝細胞の風船様変性
(c2)炎症性細胞の浸潤
(d2)線維化 The NASH model non-human animal exhibits insulin resistance, and the liver has a pathological form shown in (a2) to (d2) below: NASH according to any one of claims 14 to 16 Production kit for liver carcinogenesis model non-human animals.
(A2) macroscopic fat (b2) balloon-like degeneration of hepatocytes (c2) infiltration of inflammatory cells (d2) fibrosis
(A1)請求項1〜9のいずれか一項に記載のNASH肝発がんモデル非ヒト動物に被検物質を投与する工程
(B1)肝がんに対する治療効果を評価する工程 A screening method for a compound for treating or preventing liver cancer, comprising the following steps (A1) and (B1):
(A1) A step of administering a test substance to a NASH liver carcinogenesis model non-human animal according to any one of claims 1 to 9 (B1) a step of evaluating the therapeutic effect on liver cancer
(A2)LXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育することにより、NASHモデル非ヒト動物を作製する工程
(B2)前記NASHモデル非ヒト動物をLXRαアゴニスト及びフリーラジカル発生剤を投与し、高脂肪食を用いて飼育しながら、被検物質を投与する工程
(C2)肝がんの発症有無を評価する工程 A screening method for a compound for treating or preventing liver cancer, comprising the following steps (A2) to (C2).
(A2) A step of producing a NASH model non-human animal by administering a LXRα agonist and a free radical generator and rearing using a high fat diet (B2) LXRα agonist and free radical generation of the NASH model non-human animal Of administering a drug and administering a test substance while rearing using a high-fat diet (C2) a step of evaluating the presence or absence of onset of liver cancer
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WO2021043205A1 (en) * | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Crown Bioscience Inc. (Taicang) | Methods for generating animal models for nonalcoholic fatty liver disease |
CN117007806A (en) * | 2023-09-21 | 2023-11-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | Targeting LXR in liver macrophages for controlling slow hepatitis B progression |
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- 2017-09-01 JP JP2017168667A patent/JP2019041675A/en active Pending
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