JP2019038767A - 皮脂産生抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】竹水抽出物から、脂腺細胞の皮脂産生抑制能を有する皮脂産生抑制剤を得る。
【解決手段】皮脂産生抑制剤が竹の水性媒体による抽出物を、高速液体クロマトグラフィーにて次の分析条件で展開した場合にリテンションタイムが４０分以上５０分以下の成分を含有する。
・カラム Ｗａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）、・カラム温度：室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件：０〜１７０ｍｉｎ：移動相Ａ１００％、移動相Ｂ０％から移動相Ａ４０％、移動相Ｂ６０％へ直線的に変化、・移動相流速１ｍＬ／ｍｉｎ、・測定波長：２１４ｎｍ
【選択図】図１

Description

本発明は、竹の水抽出物を主成分とする皮脂産生抑制剤に関する。

外来植物である孟宗竹は、１９５０年代頃までは竹材や筍を得るために管理された竹林で栽培されていた。しかしながら、近年は竹林業が経済的に成立しなくなり、各地で竹林が放置されるようになった。孟宗竹は繁殖力が異常に強いため、放置された竹林では、竹の繁殖域が無秩序に周囲に広がり、既存の植生を破壊するいわゆる竹害が問題となっている。

一方、竹害の問題に対し、竹を有効利用するための研究が進められている。例えば、竹を常圧過熱水蒸気で処理して発生する蒸気を凝縮してられる竹の過加熱水蒸気抽出物（以下、竹ＳＨＳ(Super-Heated Stream)抽出物という）が、食中毒原因菌選択制抗菌剤として提案されている（特許文献１）。

特開２０１６−１３５７４９号公報

特許文献１に記載の竹ＳＨＳ抽出物も含めて、竹抽出物に抗菌作用があることや低分子量の有機酸（ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸など）が含まれることが知られているが、有機酸の物性から、竹抽出物を外用剤として皮膚疾患治療や美容の目的に利用する場合、皮膚刺激が懸念される。

これに対し、本発明は、竹抽出物から新たな有用成分とその薬剤としての用途を見出し、竹の有効利用を図ることを課題とする。

本発明者は、竹の水性媒体による抽出物であって、逆相クロマトグラフィーにより分離し、個々の成分を細胞に作用させることで、比較的疎水性度の高い成分が、細胞毒性とは区別される皮脂産生抑制作用を有することを見出し、本発明を想到した。

即ち、本発明は、竹の水性媒体による抽出物であって、高速液体クロマトグラフィーにて次の分析条件で展開した場合にリテンションタイムが４０分以上５０分以下の成分を含有してなる皮脂産生抑制剤を提供する。
高速液体クロマトグラフィーの分析条件
・カラム Ｗａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
・カラム温度 室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件
０〜１７０ｍｉｎ：移動相Ａ１００％、移動相０％から移動相Ａ４０％、移動相Ｂ６０％へ直線的に変化、
・移動相流速 １ｍＬ／ｍｉｎ
・測定波長 ２１４ｎｍ

本発明の皮脂産生抑制剤は、細胞毒性とは区別される皮脂産生抑制作用を有し、脂腺細胞の数が減少せず、皮脂の産生量を低減させることができる。そのため、本発明の皮脂産生抑制剤によれば、皮膚刺激の問題を引き起こすことなく、ニキビ、脂漏性湿疹、その他の皮脂の過産生による疾患等を予防ないし治療することが可能となる。また、皮膚産生抑制剤は、肌のべたつき、テカリ防止、化粧崩れ防止などの美容上効果を得るためにも使用することができる。

さらに、本発明の皮脂産生抑制剤は、竹を原材料とし、かつ水性媒体による抽出という簡便な方法により製造できるため、安価に提供することができる。

図１は、竹抽出物を逆相クロマトグラフィーで展開したクロマトグラムである。 図２は、竹水抽出物の脂腺細胞に対する作用を示す写真である（(a)ＤＨＴ、(B)ＤＨＴ+竹水抽出物１％）。 図３は、皮脂細胞のＤＮＡ当たりの皮脂（ＴＧ）の産生量に及ぼす竹水抽出物の影響を示す図である。

以下、本発明の皮脂産生抑制剤について詳細に説明する。
本発明の皮脂産生抑制剤は、竹の水性媒体による抽出物であって、後述する逆相クロマトグラフで展開した場合に特定のリテンションタイムとなる成分を含有する。

ここで、竹はイネ目イネ科タケ亜科のうち、茎が木質化する種の総称であり、竹の代表的な種類としては、モウソウチク(孟宗竹)、マダケ、ハチク等が挙げられる。本発明が抽出対象とする竹には、孟宗竹をはじめとする上述の代表的な竹の他に、アズマザサ、ヤダケ、アズマネザサ、スズタケ、クマザサやチシマザサなどのイネ科タケ亜科に属するササ類を含めることができる。

抽出する竹の部位としては、稈、枝、葉又は根をあげることができ、特に、稈が好ましい。

竹の抽出時の形態は、破砕物又は粉末とすることが好ましい。このような形態の竹としては、市販されているものを使用することができ、例えば、竹粉末（有限会社八起産業、ゆめ竹）等を使用することができる。

竹を抽出する水性媒体としては、水、メタノール、エタノール、１、３−ブチレングリコール等をあげることができる。

抽出方法としては、竹の破砕物、粉末等と水性媒体とを混合し、室温で撹拌すればよい。例えば、竹の破砕物１０ｇに対して水４０〜１００ｍＬを加え、室温で１〜３時間撹拌すればよい。

こうして得られた竹の抽出物は、室温（例えば２５℃）で実施例に示す逆相クロマトグラフィーで展開した場合に、低分子量の有機酸が含まれるリテンションタイム１０分以下と、それよりも疎水性度の高いリテンションタイム４０分以上５０分以下にピークがあり、特に４０分以上５０分以下のピークは概略単一のピークとなる。一方、特許文献１に記載されているように、抽出方法によっては竹抽出物に低分子量の有機酸が含まれ、それが細胞毒性を有し、皮膚刺激の原因となることが懸念される。そこで、本発明においては、細胞毒性を無くし、皮膚刺激を低減又は解消するために、リテンションタイム１０分以下の成分を除去することが好ましい。

竹の抽出物は適宜精製し、濃縮して使用することができる。例えば、上述の水性媒体による竹の抽出液を遠心分離し、それにより得られた上清を濾過し、必要に応じて減圧濃縮する。

本発明の皮脂産生抑制剤の剤型は、固形状、半固形状、液状等のいずれであってもよく、製品の形態に応じて適宜決定される。

また、本発明の皮脂産生抑制剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、ｐＨ調整剤、増粘剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、色素などの各種添加剤や賦形剤を含有することができる。

本発明の皮脂産生抑制剤の投与形態は、経口、経腸、径粘膜、注射等とすることができる。また、医薬品、化粧品、飲食品、ペットフード等に配合して使用することができる。

以下、本発明の皮脂産生抑制剤について具体的に説明する。
（１）竹水抽出物
東京都西部に自生している孟宗竹の稈の部位を粉砕したチップ１０ｇを秤量し、超純水６０ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。４℃、３０００ｘｇの条件で５分間遠心分離を行い、上清を分取した。得られた上清を０．４５ｍのフィルターを用いて限外濾過し、竹水抽出物を得た。

（２）竹水抽出物のＨＰＬＣ解析
（１）で得た竹水抽出物を試料とし、高速液体クロマトグラフ（Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｂｏｘ，５４１０ ＵＶ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，５１１０ Ｐｕｍｐ）、株式会社日立ハイテクサイエンス)を用いて次の逆相クロマトグラフィーの分析条件で展開し、図１に示したクロマトグラムを得た。

ＨＰＬＣ分析条件
・カラム Ｗａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
・カラム温度 室温
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
・分離条件
０〜１７０ｍｉｎ：移動相Ａ１００％、移動相Ｂ０％から移動相Ａ４０％、移動相Ｂ６０％へ直線的に変化、
・移動相流速 １ｍＬ／ｍｉｎ
・測定波長 ２１４ｎｍ
・試料注入量 １００μＬ

図１から、竹水抽出物ではリテンションタイム１０分以下にピークがあるが、リテンションタイム４０分以降では概略単一のピークのみが検出された。リテンションタイム１０分以下の成分には、特許文献１に記載されている、ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸などの低分子量の有機酸が含まれていると考えられる。

（３）竹水抽出物の皮脂産生抑制作用の評価
(3-1)ハムスター脂腺細胞の単離
ゴールデンハムスター（雄、５週齢）の左右耳介部を切除し、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）および硫酸ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭに浸し、１時間以上４℃にて放置した後にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ(−)）で洗浄した。耳介部周囲の毛を刈り、５×５ｍｍ程度に細切し、２．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ｄｉｓｐａｓｅ溶液中で４℃、１３．５時間静置した。酵素処理後、ピンセットにて耳介部より表皮を剥離し、皮脂腺を含む真皮を脂腺細胞培養液（ＳＧＭ）［ＤＭＥＭ/Ｆ１２／６％(v/v)ＦＢＳ／２％(v/v)ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ／０．６８ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）／硫酸ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）］に浸し、実体顕微鏡下で皮脂腺を単離した。

(3-2)ハムスター脂腺細胞に対する竹水抽出物の皮脂産生作用
継代培養したハムスター脂腺細胞（ｐ＝５）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （株式会社ＩＷＡＫＩ製）に１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。この場合、ハムスター脂腺細胞を皮脂産生促進因子であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）存在下（１０μＭＭ）において、竹水抽出液（１％）で処理し、９日間培養した。培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ(−)）にて細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、細胞標本を得た。

皮脂産生能に対する竹抽出液の影響を評価するため、得られた細胞標本をｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色法により脂肪滴を染色した。また、対照として、ＤＨＴの存在下で竹水抽出物を添加せずに作製した細胞標本（ＤＨＴ）についても同様に染色した。

ここで、ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色液は、０．３％(w/v)ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ を含む ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液と精製水を３：２(v:v)で混合し、密閉式超音波細胞破砕装置（コスモ・バイオ株式会社製）により１５分間超音波処理を行い、１０分間室温に放置し、ろ過した上清である。

この染色法では、固定した細胞標本にｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ 染色液を加えて３７℃で１５分間染色した。

染色後、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ(−)）にて洗浄し、光学顕微鏡（オリンパス社製）により脂肪滴形成を観察した。この観察写真を「ＤＨＴ」（対照）又は「ＤＨＴ＋竹水抽出物」として図３に示す。なお、写真において丸い粒に見えるのが脂肪滴である。

また、皮脂の主成分であるトリアシルグリセロール（ＴＧ）を定量するため、ＤＨＴや竹水抽出物を添加しない細胞（Ｃｔｌ）、ＤＨＴの存在下(１０μＭ)で竹水抽出物を添加せずに処理した細胞（ＤＨＴ）、皮脂産生抑制作用が知られているレチノイン酸を処理した細胞（ＲＡ）（濃度１ｎＭ）、ＤＨＴ存在下でＲＡを処理した細胞（ＤＨＴ＋ＲＡ）、ＤＨＴ存在下で竹水抽出物を処理した細胞（ＤＨＴ＋竹水抽出物）をそれぞれＰＢＳ(−)で２回洗浄し、０．２５％ (w/v) trypsin/０．０２％ (w/v) ＥＤＴＡ／ＰＢＳ(−)溶液を用いて回収した。得られた細胞懸濁液を氷冷下、密閉式超音波細胞破砕装置(コスモ・バイオ株式会社製)により超音波処理を行い、細胞を破砕した。この細胞内のＴＧ量をアクアオートカイノスＴＧ−II試薬（株式会社カイノス製）を用いて次の方法で測定した。すなわち、上記で調製した細胞懸濁液試料(５０μＬ)に反応試液Ｒ−１(９０μＬ)を添加し、３７℃で１０分間反応させた後、直ちに反応試液Ｒ−２(３０μＬ)を添加し、さらに３７℃で１０分間反応させた。反応終了後、５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。この吸光度からＴＧ量を、同様に実施したトリオレイン標準液(２００ｍｇ／ｄＬ）の吸光度に基づいて算出した。一方、細胞中のＤＮＡ量を３，５−ジアミノ安息香酸二塩酸塩（ＤＡＢＡ）法を用いて測定し、ＤＮＡ１μｇあたりの皮脂量（ＴＧ／ＤＮＡ）を求め、このＴＧ／ＤＮＡのコントロールに対する比を求めた。結果を図３に示す。

図３から、竹水抽出物は、ＤＨＴにより誘導した皮脂産生を抑制することがわかる。また、顕微鏡下で培養容器に接着している細胞の形態が観察され、細胞に形態変化がないことから、この皮脂産生抑制の竹水抽出物が脂腺細胞に対して細胞毒としては作用していないことがわかる。

Claims (3)

1. 竹の水性媒体による抽出物であって、高速液体クロマトグラフィーにて次の分析条件で展開した場合にリテンションタイムが４０分以上５０分以下の成分を含有してなる皮脂産生抑制剤。
   高速液体クロマトグラフィーの分析条件
   ・カラム Ｗａｔｅｒｓ社製ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（担体粒子径５μｍ、カラム内径４．６ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）
   ・カラム温度 室温
   ・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ
   ・分離条件
   ０〜１７０ｍｉｎ：移動相Ａ１００％、移動相Ｂ０％から移動相Ａ４０％、移動相Ｂ６０％へ直線的に変化、
   ・移動相流速 １ｍＬ／ｍｉｎ
   ・測定波長 ２１４ｎｍ
2. 前記高速液体クロマトグラフィーの分析条件において、リテンションタイム１０分以下の成分を含有しない請求項１記載の皮脂産生抑制剤。
3. 竹が孟宗竹である請求項１又は２記載の皮脂産生抑制剤。

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