JP2019033706A - D-amino acid production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、D-アミノ酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method of producing D-amino acids.
近年、ヒトを含めた高等動物においてD-アミノ酸の存在とその様々な作用が明らかにされつつある。例えば、D-セリンは中枢神経系、特に記憶学習などの高次機能を担う大脳皮質、短期記憶や感情コントロールを担う海馬で豊富に存在し、興奮性の神経伝達を担うグルタミン酸受容体の一つ、N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン受容体（N-methyl-D-Aspartate receptor :NMDAR）の調節因子として機能する。こうした生理機能により、D-セリンは記憶形成や情動反応に影響すると考えられている。 In recent years, the presence of D-amino acids and their various effects have been clarified in higher animals including humans. For example, D-serine is abundant in the central nervous system, particularly in the cerebral cortex responsible for higher-order functions such as memory learning, and in the hippocampus responsible for short-term memory and emotional control, and one of glutamate receptors responsible for excitatory neurotransmission. It functions as a regulator of N-methyl-D-aspartate type glutamine receptor (N-methyl-D-Aspartate receptor: NMDAR). Due to these physiological functions, D-serine is considered to affect memory formation and emotional response.
またD-アスパラギン酸は、ヒト真皮線維芽細胞において過酸化水素により惹起される酸化毒性を軽減しうることが報告されている。真皮におけるアスパラギン酸のうち、D-アスパラギン酸は２％を占め、加齢に伴い減少していくことが示されている。加齢による減少は他にもD-セリン、D-グルタミン酸についても認められる。さらに、D-アラニンについては表皮角化細胞のラミニン332の産生を促進することも報告されており、様々なD-アミノ酸の皮膚恒常性維持への寄与が示唆されている。 It is also reported that D-aspartic acid can reduce the oxidative toxicity caused by hydrogen peroxide in human dermal fibroblasts. Of the aspartic acids in the dermis, D-aspartic acid accounts for 2% and has been shown to decrease with age. An age-related decrease is also observed for D-serine and D-glutamic acid. Furthermore, D-alanine has also been reported to promote the production of laminin 332 in epidermal keratinocytes, suggesting the contribution of various D-amino acids to the maintenance of skin homeostasis.
一方、同一のアミノ酸種であったとしても、D-アミノ酸はL-アミノ酸とは異なった特徴ある風味を呈することも着目されている。 On the other hand, it has also been noted that D-amino acids exhibit distinctive flavors different from L-amino acids even if they are the same amino acid species.
食酢や生もと造りの日本酒、チーズ、ヨーグルトなどの発酵食品は全アミノ酸中、D-アミノ酸を比較的豊富な割合で含むことが知られているが、発酵食品中のD-アミノ酸の絶対量は微量であり、発酵食品から抽出によりD-アミノ酸を製造することは効率的ではない。 It is known that fermented foods such as vinegar and raw sake-made sake, cheese and yogurt contain relatively abundant proportion of D-amino acids in total amino acids, but the absolute amount of D-amino acids in fermented foods Is a trace amount, and it is not efficient to produce D-amino acids by extraction from fermented foods.
特許文献１〜５は乳酸菌又は乳酸菌由来酵素を用いたD-アミノ酸の製造方法を開示している。しかし特許文献１〜５ではD-アミノ酸を十分高い濃度で得られていない。また特許文献１の方法では乳酸菌由来酵素液を使用してL-アミノ酸からD-アミノ酸に変換するが、手間やコストが多くかかる。特許文献５では特許文献２〜４よりも高濃度でD-アミノ酸を産生しているが、数ヶ月に及ぶ製造工程を終えた後の結果であり、D-アミノ酸の製造という目的には適していない。
特許文献６は、炭酸カルシウムをはじめとする特定の成分を含む液体培地を用いて乳酸菌を撹拌培養することにより、乳酸菌の菌数を増加させる方法を開示している。しかし特許文献６は、炭酸カルシウムを公知の液体培地に添加して回分培養を行っても菌数の増加はわずかであり、炭酸カルシウムには菌数や乳酸濃度を増大させる効果は認められなかったことを開示している。特許文献６はD-アミノ酸の製造については記載していない。
本発明は、D-アミノ酸、例えばD-アスパラギン酸を、乳酸菌を用いて効率よく生産する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a D-amino acid such as D-aspartic acid using lactic acid bacteria.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスを始めとするラクトバチルス属菌を、増殖後に比較的高い温度でインキュベートすることにより、得られるラクトバチルス属菌培養物（発酵物）中のD-アミノ酸含量が増加すること、また脂肪酸エステルの存在下ではD-アミノ酸含量が特に顕著に増加することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of extensive investigations to solve the above problems, the present inventors incubate Lactobacillus genus bacteria such as Lactobacillus delbruchii subspecies vulgaricus at relatively high temperature after growth. Found that the D-amino acid content in the resulting Lactobacillus culture (fermented substance) is increased, and that the D-amino acid content is particularly significantly increased in the presence of a fatty acid ester, thus completing the present invention. It came to
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] ラクトバチルス属菌を培地で培養し増殖させた後、44℃以上の温度でインキュベーションしてD-アミノ酸の生成を促進し、D-アミノ酸を含む発酵物を調製することを含む、D-アミノ酸の製造方法。
[2] 44℃以上の温度が、44℃〜50℃である、上記[1]に記載の方法。
[3] 前記インキュベーションを、脂肪酸エステルの存在下で行う、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 脂肪酸エステルがグリセリン脂肪酸エステル及びショ糖脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１つである、上記[3]に記載の方法。
[5] 脂肪酸エステルが炭素数8〜18の脂肪酸部分を含む、上記[3]又は[4]に記載の方法。
[6] 脂肪酸エステルが、カプリル酸モノグリセリド、カプリル酸デカグリセリン、カプリン酸モノグリセリド、ラウリン酸モノグリセリド、ラウリン酸ジグリセリド、ラウリン酸ペンタグリセリン、ラウリン酸デカグリセリン、ミリスチン酸デカグリセリン、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、及びショ糖オレイン酸エステルからなる群から選択される少なくとも１つである、上記[3]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 培地がL-アミノ酸又はその塩を含む、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8] ラクトバチルス属菌を、アルカリを用いて培地のｐＨを制御しながら培養し増殖させる、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9] アルカリが、炭酸カルシウム又は炭酸カリウムである、上記[8]に記載の方法。
[10] ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、及びラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）からなる群から選択される、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスOLL1247株（受託番号NITE BP-01814）又はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスOLL1255株（受託番号NITE BP-76）である、上記[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12] 前記発酵物を乾燥させることをさらに含む、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13] 前記発酵物からD-アミノ酸を回収することをさらに含む、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14] 前記アミノ酸がアスパラギン酸を含む、上記[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15] 上記[1]〜[14]のいずれかに記載の方法によりD-アミノ酸を製造し、食品に添加することを含む、D-アミノ酸強化食品の製造方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] D. Cultivating and growing Lactobacillus in a culture medium and then incubating at a temperature of 44 ° C. or more to promote the formation of D-amino acids, and preparing a fermented product containing D-amino acids, D -Method of producing amino acids.
[2] The method according to the above [1], wherein the temperature of 44 ° C. or higher is 44 ° C. to 50 ° C.
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the incubation is performed in the presence of a fatty acid ester.
[4] The method according to [3] above, wherein the fatty acid ester is at least one selected from the group consisting of glycerine fatty acid ester and sucrose fatty acid ester.
[5] The method according to the above [3] or [4], wherein the fatty acid ester comprises a C 8-18 fatty acid moiety.
[6] Fatty acid esters such as caprylic acid monoglyceride, caprylic acid decaglycerin, capric acid monoglyceride, lauric acid monoglyceride, lauric acid diglyceride, pentaglyceryl laurate, decaglyceryl laurate, decaglyceryl myristate, sucrose lauric ester, sucrose The sugar according to any one of [3] to [5] above, which is at least one selected from the group consisting of sugar myristic acid ester, sucrose palmitic acid ester, sucrose stearic acid ester, and sucrose oleic acid ester Method.
[7] The method according to any one of the above [1] to [6], wherein the culture medium comprises an L-amino acid or a salt thereof.
[8] The method according to any one of the above [1] to [7], wherein Lactobacillus bacteria are cultured and grown while controlling the pH of the culture medium using an alkali.
[9] The method according to the above [8], wherein the alkali is calcium carbonate or potassium carbonate.
[10] The Lactobacillus spp. Is a group consisting of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus helveticus, and Lactobacillus fermentum. The method according to any one of the above [1] to [9], which is selected.
[11] Lactobacillus spp. Is a strain of Lactobacillus delbruchii subsp. Bulgaricus OLL 1247 (Accession No. NITE BP-01814) or a strain of Lactobacillus delbruzzi subsp. Bulgaricus OLL 1255 (Accession No. NITE BP-76) The method according to any one of the above [1] to [10], which is
[12] The method according to any one of the above [1] to [11], further comprising drying the fermented product.
[13] The method according to any one of the above [1] to [12], further comprising recovering D-amino acid from the fermented product.
[14] The method according to any one of the above [1] to [13], wherein the amino acid comprises aspartic acid.
[15] A method for producing a D-amino acid-enriched food, comprising producing the D-amino acid by the method according to any one of the above [1] to [14] and adding it to food.
本発明によれば、D-アミノ酸を効率よく製造することができる。 According to the present invention, D-amino acids can be produced efficiently.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、ラクトバチルス属菌を用いて、D-アミノ酸を含む発酵物（fermentation culture）を調製することを含む、D-アミノ酸の製造方法に関する。本発明では、ラクトバチルス属菌の培養物をアミノ酸のラセミ化促進に適した温度に曝すことにより、非処理の対照と比較してD-アミノ酸含量が増加した発酵物を調製することができる。好ましい実施形態では、本発明では、ラクトバチルス属菌を、増殖に適した温度での培養（第１工程）とその後のアミノ酸のラセミ化促進に適した温度でのインキュベーション（第２工程）を含む二段階培養により、培養物中に生成されるD-アミノ酸の量を増加させることができる。より具体的には、本発明は、ラクトバチルス属菌を培地で培養し増殖させた後、44℃以上の温度でインキュベーションしてD-アミノ酸の生成を促進し、D-アミノ酸を含む発酵物を調製することを含む、D-アミノ酸の製造方法を提供する。この方法により、得られる発酵物中でL-アミノ酸がD-アミノ酸に変換されラセミ化を促進することができると考えられる。本発明では、さらに、脂肪酸エステルを使用することにより、ラクトバチルス属菌の発酵物中に生成されるD-アミノ酸の量をさらに増加させることができる。 The present invention relates to a method for producing D-amino acids, which comprises preparing a fermentation culture containing D-amino acids using Lactobacillus sp. In the present invention, by exposing the culture of Lactobacillus to a temperature suitable for promoting the racemization of amino acids, it is possible to prepare a fermentate having an increased D-amino acid content as compared to the untreated control. In a preferred embodiment, the present invention comprises culturing Lactobacillus spp. At a temperature suitable for growth (first step) and subsequent incubation at a temperature suitable for promoting racemization of the amino acid (second step) Two-step culture can increase the amount of D-amino acids produced in the culture. More specifically, the present invention is to culture and grow Lactobacillus sp. In a culture medium and then incubate at a temperature of 44.degree. Provided is a method of producing D-amino acids, comprising preparing. By this method, it is considered that L-amino acids can be converted to D-amino acids in the resulting fermentate to promote racemization. In the present invention, further, by using a fatty acid ester, the amount of D-amino acid produced in the fermented product of Lactobacillus bacteria can be further increased.
本発明の方法で用いるラクトバチルス属菌は、ラクトバチルス属（Lactobacillus）に属する乳酸菌である。本発明では、１つの種又は菌株のラクトバチルス属菌を用いてもよいし、２つ以上の種又は菌株のラクトバチルス属菌を組み合わせて用いてもよい。本発明の方法で用いるラクトバチルス属菌の例としては、以下に限定されないが、例えば高温性乳酸菌（至適生育温度：35℃〜50℃）が挙げられる。本発明の方法で用いるラクトバチルス属菌は、以下に限定されるものではないが、好ましくはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、又はラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）である。これらのうち１つの種の菌を使用してもよいし、２つ又は３つの種の菌を組み合わせて用いてもよい。本発明の方法で用いるラクトバチルス属菌は、特に好ましくはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）である。本発明の方法で用いるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）菌株の特に好ましい例は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）OLL1247株及びOLL1255株である。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）OLL1247株は、D-アミノ酸の製造に特に適している。 Lactobacillus genus bacteria used by the method of this invention are lactic acid bacteria which belong to Lactobacillus genus (Lactobacillus). In the present invention, one species or strain of Lactobacillus may be used, or two or more species or strains of Lactobacillus may be used in combination. Examples of Lactobacillus bacteria used in the method of the present invention include, but are not limited to, for example, thermophilic lactic acid bacteria (optimum growth temperature: 35 ° C to 50 ° C). The Lactobacillus spp. Used in the method of the present invention is preferably, but not limited to, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus). Or Lactobacillus fermentum. One of these types of bacteria may be used, or two or three types of bacteria may be used in combination. Lactobacillus spp. Used in the method of the present invention are particularly preferably Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus. A particularly preferred example of a Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus strain for use in the method of the present invention is Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus OLL 1247 It is a stock and OLL 1255 stock. The Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus strain OLL 1247 is particularly suitable for the production of D-amino acids.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）OLL1247株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、2014年3月6日付で受託番号NITE BP-01814としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus OLL1 247 is an independent administrative corporation product evaluation technology foundation mechanism Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Kisazu, Kisarazu, Chiba, Japan, 2-5) No.-8-122) has been internationally deposited under the Budapest Treaty on March 6, 2014 under Accession No. NITE BP-01814.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）OLL1255株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、2005年2月10日付で受託番号NITE BP-76としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。なおこの寄託株は2009年4月1日（移管日）に国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus OLL 1255 is a National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Kisazu, Kisarazu, Chiba, Japan, 2-5) No. -82, Room 122) has been internationally deposited under the Budapest Treaty on February 10, 2005 under Accession No. NITE BP-76. This deposited strain was transferred from the domestic deposit (original deposit) on April 1, 2009 (transfer date) to the international deposit under the Budapest Treaty.
またラクトバチルス・ヘルベティカス菌株の好ましい例として、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）JCM 1120T株が挙げられる。JCM 1120T株は、理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（RIKEN BRC-JCM、日本）より、JCM番号1120Tに基づいて入手することができる。 Moreover, Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus) JCM 1120 T strain is mentioned as a preferable example of a Lactobacillus helveticus strain. The JCM 1120 T strain can be obtained from RIKEN BioResource Center, Microbial Material Development Laboratory (RIKEN BRC-JCM, Japan) based on JCM No. 1120 T.
ラクトバチルス・ファーメンタム菌株の好ましい例として、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum） JCM 1173T株が挙げられる。JCM 1173T株は、理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（RIKEN BRC-JCM、日本）より、JCM番号1173Tに基づいて入手することができる。 Preferred examples of Lactobacillus fermentum strains include Lactobacillus fermentum JCM 1173 T strain. The JCM 1173 T strain can be obtained from RIKEN BioResource Center, Microbial Material Development Laboratory (RIKEN BRC-JCM, Japan) based on JCM No. 1173 T.
本発明の方法では、まず、ラクトバチルス属菌を培養し、増殖させることが好ましい。 In the method of the present invention, it is preferable to first culture and propagate Lactobacillus bacteria.
ラクトバチルス属菌の培養に使用する培地は、ラクトバチルス属菌の乳酸発酵に適した任意の培地であってよい。培地は好ましくは液体培地であるが、それに限定されない。培地は、炭素源の他、一般的には窒素源、ミネラル等を含む。培地は、通常は、炭素源として糖質又は糖質材料を含む。本発明に関して、糖質は、糖類（単糖又は二糖）、多糖類、及び糖アルコールを包含する。例えば、糖質として、乳糖、ショ糖、グルコース、デンプン、オリゴ糖、キシリトール等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において糖質材料は、糖質を含む有機物を意味し、以下に限定するものではないが、例えば、乳及びその加工品（脱脂粉乳、ホエイ、ミルクパウダー、練乳など）、豆乳及びその加工品（豆乳加水分解物など）、穀類、果実、野菜等が挙げられる。乳はウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ラクダ、ラマ、ロバ、ヤク、ウマ、トナカイ等の任意の哺乳動物に由来するものであってよい。なお「糖質」は単離又は精製された化合物に限定されない。例えば、乳（糖質材料）を含む培地は、乳糖（糖質）を含むことになる。 The medium used to culture the Lactobacillus may be any medium suitable for lactic acid fermentation of Lactobacillus. The medium is preferably a liquid medium, but is not limited thereto. The medium generally contains a nitrogen source, minerals and the like in addition to the carbon source. The culture medium usually contains a carbohydrate or carbohydrate material as a carbon source. In the context of the present invention, carbohydrates include sugars (mono- or disaccharides), polysaccharides and sugar alcohols. For example, sugars include, but are not limited to, lactose, sucrose, glucose, starch, oligosaccharides, xylitol and the like. In the present invention, the carbohydrate material means an organic substance containing carbohydrate, and is not limited to, for example, milk and processed products thereof (defatted milk powder, whey, milk powder, condensed milk etc.), soy milk and its processing Products (soy milk hydrolyzate etc.), cereals, fruits, vegetables etc. may be mentioned. The milk may be derived from any mammal such as cows, goats, sheep, buffalo, camels, llamas, donkeys, yaks, horses, reindeers and the like. The “sugar” is not limited to the isolated or purified compound. For example, a culture medium containing milk (carbohydrate material) will contain lactose (carbohydrate).
窒素源としては、任意の無機窒素源又は有機窒素源を使用することができ、以下に限定するものではないが、例えば、酵母エキス（例えば、ビール酵母エキス）、肉エキス、カゼイン等のタンパク質、ペプトン等のタンパク質加水分解物、ペプチド、アンモニウム塩、硝酸塩等が挙げられる。 As the nitrogen source, any inorganic nitrogen source or organic nitrogen source can be used, and is not limited to, for example, proteins such as yeast extract (for example, beer yeast extract), meat extract, casein, etc. Examples include protein hydrolysates such as peptone, peptides, ammonium salts, and nitrates.
ミネラルとしては、以下に限定するものではないが、マンガン、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、リン、イオウ、微量元素等が挙げられる。
上記培地は、ビタミン（ビタミンＢ群など）、エキス類等の成分を含んでもよい。
Minerals include, but are not limited to, manganese, zinc, iron, sodium, potassium, magnesium, ammonium, calcium, phosphorus, sulfur, trace elements, and the like.
The above-mentioned culture medium may also contain ingredients such as vitamins (such as vitamin B group) and extracts.
上記培地は、L-アミノ酸又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の任意の塩）を含むことも好ましい。L-アミノ酸は、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、又はL-バリンでありうるが、これらに限定されない。上記培地は、製造目的のD-アミノ酸のエナンチオマーであるL-アミノ酸又はその塩を含むことが好ましい。上記培地は、製造目的のD-アミノ酸のエナンチオマーであるL-アミノ酸又はその塩を終濃度で0.01wt％以上、好ましくは0.01wt％〜10wt％、より好ましくは0.1 wt％〜5wt％、例えば0.3 wt％〜2wt％含み得るが、L-アミノ酸又はその塩の濃度範囲はこれらに限定されない。 It is also preferable that the medium contains L-amino acid or a salt thereof (eg, any salt such as sodium salt, potassium salt, ammonium salt and the like). L-amino acids include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartate, L-cysteine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, It may be, but is not limited to, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine or L-valine. The above-mentioned culture medium preferably contains L-amino acid or a salt thereof which is an enantiomer of D-amino acid to be produced. The above-mentioned medium has a final concentration of 0.01 wt% or more, preferably 0.01 wt% to 10 wt%, more preferably 0.1 wt% to 5 wt%, for example 0.3 wt% of L-amino acid or a salt thereof which is an enantiomer of D-amino acid for production It may contain wt% -2 wt%, but the concentration range of L-amino acid or its salt is not limited thereto.
なお本明細書において培地の成分についての単位wt％は質量％（培地100g当たりの成分のg数）を意味する。L-アミノ酸又はその塩は、培養開始前に事前に培地に添加してもよいし、培養開始後、発酵進行に伴って培地に添加してもよい。あるいはL-アミノ酸又はその塩は、インキュベーションの開始前又は開始と同時に培養物（培地）に添加してもよいし、インキュベーションの開始後に添加してもよい。 In the present specification, the unit wt% of the components of the medium means mass% (g of the components per 100 g of the medium). The L-amino acid or a salt thereof may be added to the medium in advance before the start of culture, or may be added to the medium as fermentation progresses after the start of culture. Alternatively, the L-amino acid or a salt thereof may be added to the culture (medium) before or simultaneously with the start of the incubation, or may be added after the start of the incubation.
ラクトバチルス属菌は、公知の培養条件に基づいて培養することができる。ラクトバチルス属菌は、以下に限定するものではないが、生育温度範囲内で、典型的には、20℃〜50℃で培養することができる。本発明においてラクトバチルス属菌は、液体培地で培養することが好ましい。ラクトバチルス属菌は対数増殖期又は定常期まで増殖させることが好ましく、対数増殖期後期又は定常期まで増殖させることがより好ましく、定常期まで増殖させることがさらに好ましい。本発明において対数増殖期後期とは、時間に対して生菌数の対数をプロットした増殖曲線において、対数増殖期の直線部の中央に当たる時点より後の対数増殖期を指す。増殖のための培養時間は適宜設定すればよいが、典型的には10時間以上、好ましくは10〜100時間、例えば10〜60時間、12〜60時間、10〜48時間、12〜48時間、16〜48時間、12〜24時間、14〜24時間又は16〜24時間とすることができる。 Lactobacillus bacteria can be cultured based on known culture conditions. Lactobacillus bacteria can be cultured typically at 20 ° C. to 50 ° C. within the growth temperature range, but not limited thereto. In the present invention, Lactobacillus bacteria are preferably cultured in a liquid medium. The Lactobacillus genus is preferably grown to the logarithmic growth phase or stationary phase, more preferably to the late logarithmic growth phase or to the stationary phase, and still more preferably to the stationary phase. In the present invention, the late logarithmic growth phase refers to the logarithmic growth phase after the time when it falls in the middle of the linear part of the logarithmic growth phase in the growth curve in which the number of viable bacteria is plotted against time. The culture time for growth may be set appropriately, but typically 10 hours or more, preferably 10 to 100 hours, for example 10 to 60 hours, 12 to 60 hours, 10 to 48 hours, 12 to 48 hours, It can be 16 to 48 hours, 12 to 24 hours, 14 to 24 hours or 16 to 24 hours.
ラクトバチルス属菌を始めとする乳酸菌は、培養（発酵）時に乳酸を産生するため、発酵進行に伴い、培地のpHが低下し、多くの場合は最終的に増殖阻害が生じる。そのため本発明の方法では、ラクトバチルス属菌を培養し増殖させる際、アルカリを用いて培地のpHを制御してもよい。アルカリを中和剤（pH中和剤）として用いることにより、生成される乳酸による培地のpH低下を抑制することができる。好ましい実施形態では、アルカリを用いて培地のpHを、使用するラクトバチルス属菌の培養に適した範囲内、典型的にはpH3.5〜6.5、好ましくはpH4.7〜6.5又はpH5.0〜6.0、例えばpH5.0〜5.5、pH5.2〜pH5.4、pH5.5〜pH6.5、又はpH5.7〜pH6.0に制御（調整）しながら、ラクトバチルス属菌を増殖させることができる。 Since lactic acid bacteria such as Lactobacillus bacteria produce lactic acid during culture (fermentation), the pH of the culture medium decreases with the progress of fermentation, and in many cases, finally growth inhibition occurs. Therefore, in the method of the present invention, when cultivating and growing Lactobacillus, the pH of the culture medium may be controlled using an alkali. By using an alkali as a neutralizing agent (pH neutralizing agent), it is possible to suppress the pH decrease of the culture medium due to the generated lactic acid. In a preferred embodiment, the pH of the culture medium is adjusted using an alkali within the range suitable for cultivating the Lactobacillus strain to be used, typically pH 3.5 to 6.5, preferably pH 4.7 to 6.5 or pH 5.0 to Growing Lactobacillus bacteria while controlling (adjusting) to 6.0, for example, pH 5.0 to 5.5, pH 5.2 to pH 5.4, pH 5.5 to pH 6.5, or pH 5.7 to pH 6.0 it can.
培地に添加するアルカリは、ラクトバチルス属菌の増殖を阻害しない限り任意のアルカリであってよいが、好ましくは弱酸と強塩基の塩である。弱酸としては炭酸、酢酸等が挙げられる。アルカリは、弱酸のカルシウム塩又はカリウム塩であってよい。アルカリは、炭酸カルシウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム等の炭酸塩であってもよい。アルカリの好ましい例は、炭酸カルシウム又は炭酸カリウムである。１種又は２種以上のアルカリを使用することができる。 The alkali added to the culture medium may be any alkali as long as it does not inhibit the growth of Lactobacillus, but preferably salts of weak acids and strong bases. Examples of weak acids include carbonic acid and acetic acid. The alkali may be a calcium or potassium salt of a weak acid. The alkali may be a carbonate such as calcium carbonate, potassium carbonate, magnesium carbonate, sodium carbonate and ammonium carbonate. Preferred examples of the alkali are calcium carbonate or potassium carbonate. One or more alkalis can be used.
本発明では、上記のようにしてラクトバチルス属菌を培養し増殖させた後、得られた培養物（増殖したラクトバチルス属菌）を、アミノ酸のラセミ化に適した温度、特に44℃以上の温度で、インキュベーション（インキュベート）することが好ましい。本発明では、ラクトバチルス属菌を２段階の温度（より低温＋より高温）を用いて培養してもよく、例えば、ラクトバチルス属菌を培養によって十分に増殖させた後、より高い44℃以上の温度で培養してもよく、44℃以上の温度でのそのような培養工程も本発明のインキュベーション工程に含まれる。44℃以上の温度でのインキュベーションは、以下に限定するものではないが、2時間以上、典型的には10〜100時間、好ましくは16〜60時間、例えば20〜48時間行うことができる。 In the present invention, after culturing and growing a Lactobacillus as described above, the obtained culture (grown Lactobacillus) is subjected to a temperature suitable for racemization of amino acids, particularly 44 ° C. or higher Incubation is preferred at temperature. In the present invention, Lactobacillus bacteria may be cultured using two temperatures (lower temperature + higher temperature), for example, after sufficiently growing Lactobacillus bacteria by culture, the temperature is higher than 44 ° C. or higher. The culture step may be carried out at a temperature of 44 ° C., and such a culture step at a temperature of 44 ° C. or higher is also included in the incubation step of the present invention. Incubation at a temperature of 44 ° C. or higher can be performed, but is not limited to, 2 hours or more, typically 10 to 100 hours, preferably 16 to 60 hours, for example 20 to 48 hours.
例えば、ラクトバチルス属菌を、それぞれの増殖に適した温度、好ましくは20〜50℃、例えば24〜43℃、34.5〜43.5℃、35〜40℃、20〜35℃、36〜38℃、又は37℃で上記のように培養し増殖させる。増殖させたラクトバチルス属菌を、さらに、アミノ酸のラセミ化に適した温度でインキュベーションする。ラクトバチルス属菌（培養物）は、増殖培養時よりも高い温度（増殖時の温度と比較して、典型的には１℃以上、好ましくは２℃以上、例えば10℃以上高い温度）でインキュベーションしてもよい。増殖させたラクトバチルス属菌（培養物）のインキュベーションの温度は、44℃以上であり、好ましくは44〜50℃、より好ましくは44〜47℃、例えば44〜46℃又は44.5〜45.5℃であってよい。培養は嫌気条件下で行うことが好ましい。嫌気条件下での培養は、窒素ガス、炭酸ガス等の嫌気ガスを培養系に通気しながら行うことができる。 For example, Lactobacillus spp., Temperature suitable for each growth, preferably 20 to 50 ° C., for example 24 to 43 ° C., 34.5 to 43.5 ° C., 35 to 40 ° C., 20 to 35 ° C., 36 to 38 ° C., or Incubate and grow as above at 37 ° C. The grown Lactobacillus are further incubated at a temperature suitable for amino acid racemization. The Lactobacillus genus (culture) is incubated at a temperature higher than that during growth culture (typically, 1 ° C. or higher, preferably 2 ° C. or higher, for example, 10 ° C. or higher, as compared to the temperature during growth). You may The temperature for incubation of the grown Lactobacillus (culture) is 44 ° C. or higher, preferably 44 to 50 ° C., more preferably 44 to 47 ° C., for example 44 to 46 ° C. or 44.5 to 45.5 ° C. You may The culture is preferably performed under anaerobic conditions. The culture under anaerobic conditions can be performed while aerating an anaerobic gas such as nitrogen gas or carbon dioxide gas to the culture system.
ラクトバチルス属菌は、培養し増殖させた直後に44℃以上の温度でインキュベートしてもよいし、あるいは、培養により増殖させた後、0〜15℃に冷却するなどにより一旦発酵を停止させ、一定時間保管した後に44℃以上の温度でインキュベートしてもよい。増殖後の44℃以上の温度でのインキュベーションは、培地のpH制御を行うことなく実施してもよい。 The Lactobacillus bacteria may be incubated at a temperature of 44 ° C. or higher immediately after culturing and growing, or, after growing by culturing, the fermentation is once stopped by cooling to 0 to 15 ° C., etc. After storage for a certain period of time, it may be incubated at a temperature of 44 ° C. or higher. Incubation at a temperature of 44 ° C. or higher after growth may be performed without pH control of the culture medium.
本発明では、以上のようなラクトバチルス属菌の増殖及びアミノ酸のラセミ化に適した44℃以上の温度でのインキュベーションにより、培養物におけるD-アミノ酸の生成を促進することができる。したがって本発明は、ラクトバチルス属菌を培養し増殖させた後、44℃以上の温度でインキュベートし、それにより培養物中のD-アミノ酸の生成を促進する方法も提供する。本発明では、以上のようにして、D-アミノ酸含量が増加した発酵物を調製することができる。本発明によれば、L-アミノ酸のD-アミノ酸への変換を促進することにより、D-アミノ酸の生成を促進できると考えられる。 In the present invention, the production of D-amino acid in the culture can be promoted by incubation at a temperature of 44 ° C. or higher which is suitable for the growth of Lactobacillus as described above and the racemization of amino acids. Accordingly, the present invention also provides a method of culturing and growing Lactobacillus, and then incubating at a temperature of 44 ° C. or higher, thereby promoting the production of D-amino acids in the culture. In the present invention, as described above, a fermented product having an increased D-amino acid content can be prepared. According to the present invention, it is thought that the generation of D-amino acids can be promoted by promoting the conversion of L-amino acids into D-amino acids.
本発明では、脂肪酸エステルを使用することにより、D-アミノ酸の生成をさらに促進することができる。より具体的には、増殖させたラクトバチルス属菌（培養物）のインキュベーションを、脂肪酸エステルの存在下で行うことにより、D-アミノ酸の生成をさらに促進することができる。脂肪酸エステルは、培地中に含まれることが好ましい。一実施形態では、前記インキュベーションを脂肪酸エステルの存在下で行う目的で、ラクトバチルス属菌を培養し増殖する際に脂肪酸エステルを含む培地を用いてもよい。別の実施形態では、前記インキュベーションを脂肪酸エステルの存在下で行う目的で、増殖させたラクトバチルス属菌を44℃以上の温度でインキュベートする際に、培養物（培地）に脂肪酸エステルを添加してもよい。脂肪酸エステルは、ラクトバチルス属菌の培養開始前に事前に培地に添加してもよいし、培養開始後、発酵進行に伴って培地に添加してもよい。インキュベーションの開始前又は開始と同時に培養物（培地）に脂肪酸エステルを添加してもよいし、インキュベーションの開始後に培養物（培地）に脂肪酸エステルを添加してもよい。ラクトバチルス属菌を、脂肪酸エステルの存在下でインキュベーションすることにより、D-アミノ酸の生成をさらに促進することができる。脂肪酸エステルは、アルカリと共に培地に添加してもよい。 In the present invention, fatty acid esters can be used to further promote the formation of D-amino acids. More specifically, the production of D-amino acids can be further promoted by carrying out the incubation of the grown Lactobacillus (culture) in the presence of a fatty acid ester. The fatty acid ester is preferably contained in the medium. In one embodiment, a medium containing fatty acid ester may be used when cultivating and growing Lactobacillus in order to carry out the incubation in the presence of fatty acid ester. In another embodiment, the fatty acid ester is added to the culture (medium) when incubating the grown Lactobacillus at a temperature of 44 ° C. or higher for the purpose of performing the incubation in the presence of the fatty acid ester. It is also good. The fatty acid ester may be added to the medium in advance prior to the start of culture of Lactobacillus spp., Or may be added to the medium as fermentation progresses after the start of culture. The fatty acid ester may be added to the culture (medium) before or simultaneously with the start of the incubation, or the fatty acid ester may be added to the culture (medium) after the start of the incubation. Incubation of Lactobacillus in the presence of a fatty acid ester can further promote the formation of D-amino acids. Fatty acid esters may be added to the medium along with the alkali.
脂肪酸エステルは、以下に限定するものではないが、脂肪酸エステルの終濃度で0.001 wt%以上、好ましくは0.01wt%〜20wt%、例えば0.01wt%〜10wt%、0.05wt%〜10wt%又は0.1wt%〜0.5wt%、より好ましくは0.2wt/%〜0.3wt%となるように培地（又は培養物）に添加してもよい。 Although the fatty acid ester is not limited to the following, the final concentration of the fatty acid ester is 0.001 wt% or more, preferably 0.01 wt% to 20 wt%, for example 0.01 wt% to 10 wt%, 0.05 wt% to 10 wt% or 0.1 wt% % To 0.5 wt%, more preferably 0.2 wt /% to 0.3 wt%, may be added to the culture medium (or culture).
脂肪酸エステルの存在下で、44℃以上、好ましくは44〜50℃、より好ましくは44〜47℃、例えば44〜46℃又は44.5〜45.5℃で2時間以上、典型的には10〜100時間、好ましくは16〜60時間、例えば20〜48時間反応させることにより、L-アミノ酸のD-アミノ酸への変換（ラセミ化）が促進される。 44 ° C. or higher, preferably 44 to 50 ° C., more preferably 44 to 47 ° C., for example, 44 to 46 ° C. or 44.5 to 45.5 ° C. for 2 hours or longer, typically 10 to 100 hours, in the presence of a fatty acid ester The reaction (racemization) of L-amino acid to D-amino acid is promoted by reaction for preferably 16 to 60 hours, for example 20 to 48 hours.
脂肪酸エステルを使用する方法により、D-アミノ酸の生成がさらに促進され、D-アミノ酸をより多く含有する発酵物（典型的には、発酵液）を調製することができる。ここでD-アミノ酸の生成のさらなる促進は、脂肪酸エステルを使用しないこと以外は同じ条件で試験した場合と比較して発酵物中のD-アミノ酸の濃度が増加（好ましくは統計学的に有意に増加）したことを意味し、典型的には例えば1.5倍以上に増加する場合を含む。
本発明で使用する脂肪酸エステルは、特に限定するものではないが、食品添加物として利用できるものであることが好ましい。本発明で使用する脂肪酸エステルとしては、以下に限定されないが、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられる。本発明で使用する脂肪酸エステルは、より好ましい例では、グリセリン脂肪酸エステル及びショ糖脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１つである。本発明では脂肪酸エステルを単独で又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
By the method using fatty acid ester, the production of D-amino acid is further promoted, and a fermented product (typically, a fermented liquid) containing more D-amino acids can be prepared. Here, the further promotion of the formation of D-amino acid is an increase in the concentration of D-amino acid in the fermented substance (preferably statistically significant) as compared to when tested under the same conditions except that fatty acid ester is not used. Increase), and typically includes, for example, an increase of 1.5 times or more.
The fatty acid ester used in the present invention is not particularly limited, but is preferably usable as a food additive. Examples of fatty acid esters used in the present invention include, but are not limited to, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters. The fatty acid ester used in the present invention is, in a more preferable example, at least one selected from the group consisting of glycerin fatty acid ester and sucrose fatty acid ester. In the present invention, fatty acid esters may be used alone or in combination of two or more.
グリセリン脂肪酸エステルとしては、脂肪酸モノグリセリド（モノグリセリン脂肪酸エステル）、又は脂肪酸ジグリセリドや脂肪酸トリグリセリド等のポリグリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。ポリグリセリン脂肪酸エステルを構成するポリグリセリンはジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン等であってよい。 Examples of glycerin fatty acid esters include fatty acid monoglycerides (monoglycerin fatty acid esters), and polyglycerin fatty acid esters such as fatty acid diglycerides and fatty acid triglycerides. The polyglycerin constituting the polyglycerin fatty acid ester may be diglycerin, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, octaglycerin, nonaglycerin, decaglycerin and the like.
脂肪酸エステルを構成する脂肪酸部分は、任意の脂肪酸であってよい。好ましい例では脂肪酸エステルは炭素数8〜18の脂肪酸部分、例えば炭素数8〜12又は炭素数12〜16の脂肪酸部分を含む。脂肪酸エステルを構成する脂肪酸部分は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。飽和脂肪酸としては、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸等が挙げられる。不飽和脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ネルボン酸等が挙げられる。 The fatty acid moiety constituting the fatty acid ester may be any fatty acid. In a preferred example, the fatty acid ester comprises a fatty acid moiety having 8 to 18 carbon atoms, such as a fatty acid moiety having 8 to 12 carbon atoms or 12 to 16 carbon atoms. The fatty acid portion constituting the fatty acid ester may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid. Examples of saturated fatty acids include caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, margaric acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid and the like. Examples of unsaturated fatty acids include oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, nervonic acid and the like.
好ましい実施形態では、脂肪酸エステルとして、カプリル酸モノグリセリド、カプリル酸デカグリセリン、カプリン酸モノグリセリド、ラウリン酸モノグリセリド、ラウリン酸ジグリセリド、ラウリン酸ペンタグリセリン、ラウリン酸デカグリセリン、ミリスチン酸デカグリセリン、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、及びショ糖オレイン酸エステルからなる群から選択される少なくとも１つを使用することができる。 In a preferred embodiment, as fatty acid ester, caprylic acid monoglyceride, caprylic acid decaglycerin, capric acid monoglyceride, lauric acid monoglyceride, lauric acid diglyceride, pentaglyceryl laurate, decaglyceryl laurate, decaglyceryl myristate, sucrose lauric ester At least one selected from the group consisting of sucrose myristate ester, sucrose palmitic acid ester, sucrose stearic acid ester, and sucrose oleic acid ester can be used.
本発明の方法において生成が促進されるD-アミノ酸は、D-アラニン（Ala）、D-アルギニン（Arg）、D-アスパラギン（Asn）、D-アスパラギン酸（Asp）、D-システイン（Cys）、D-グルタミン（Gln）、D-グルタミン酸（Glu）、D-ヒスチジン（His）、D-イソロイシン（Ile）、D-ロイシン（Leu）、D-リシン（Lys）、D-メチオニン（Mat）、D-フェニルアラニン（Phe）、D-プロリン（Pro）、D-セリン（Ser）、D-トレオニン（Thr）、D-トリプトファン（Trp）、D-チロシン（Tyr）、及びD-バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも１つであってよい。本発明の方法は、D-アスパラギン酸を少なくとも含むD-アミノ酸の生成を促進するものであってもよい。一実施形態では、本発明の方法により、D-アスパラギン酸に加え、D-グルタミン酸、D-セリン及びD-アラニンを含むD-アミノ酸の生成を促進させることができる。本発明の方法によれば、D-アミノ酸を高効率に生産することができる。 D-amino acids whose production is promoted in the method of the present invention are D-alanine (Ala), D-arginine (Arg), D-asparagine (Asn), D-aspartate (Asp), D-cysteine (Cys) , D-glutamine (Gln), D-glutamic acid (Glu), D-histidine (His), D-isoleucine (Ile), D-leucine (Leu), D-lysine (Lys), D-methionine (Mat), From D-phenylalanine (Phe), D-proline (Pro), D-serine (Ser), D-threonine (Thr), D-tryptophan (Trp), D-tyrosine (Tyr), and D-valine (Val) Or at least one selected from the group consisting of The method of the present invention may be to promote the production of D-amino acids which at least comprise D-aspartic acid. In one embodiment, the method of the present invention can promote the production of D-amino acids including D-glutamic acid, D-serine and D-alanine in addition to D-aspartic acid. According to the method of the present invention, D-amino acids can be produced with high efficiency.
本発明の方法では、以上のようにしてD-アミノ酸を含む発酵物を調製し、取得することができる。好ましい実施形態では、D-アミノ酸を含む発酵物は、以下に限定するものではないが、D-アミノ酸を1mM以上、好ましくは1.5mM以上、より好ましくは2mM以上（上限は特に限定されないが、例えば100mM以下又は50mM以下）の濃度で含むことができる。 In the method of the present invention, a fermented product containing D-amino acid can be prepared and obtained as described above. In a preferred embodiment, the fermented product containing D-amino acid is not limited to the following, but D-amino acid is 1 mM or more, preferably 1.5 mM or more, more preferably 2 mM or more (upper limit is not particularly limited; Can be included at a concentration of 100 mM or less or 50 mM or less).
得られた発酵物中のD-アミノ酸の濃度は、常法により測定することができる。本明細書で言及する、発酵物中のD-アミノ酸の濃度は、Carrez試薬により発酵物の除タンパク処理を行い、それを遠心し、得られた上清と四ホウ酸ナトリウム溶液とを混合した後、オルトフタルアルデヒド（OPA）及びN-アセチル-L-システイン（NAC）を添加してD-アミノ酸及びL-アミノ酸を蛍光誘導体化し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるピーク分離及び340nmの励起波長による蛍光波長450nmを蛍光検出器により検出することにより得られた測定値を基準とする。 The concentration of D-amino acid in the obtained fermented product can be measured by a conventional method. As mentioned herein, the concentration of D-amino acid in the fermented product was subjected to deproteinization of the fermented product with Carrez reagent, centrifuged, and the obtained supernatant was mixed with sodium tetraborate solution. After that, ortho-phthalaldehyde (OPA) and N-acetyl-L-cysteine (NAC) are added to fluorescently derivatize D-amino acid and L-amino acid, peak separation by high performance liquid chromatography (HPLC) and excitation wavelength of 340 nm Based on the measurement value obtained by detecting the fluorescence wavelength of 450 nm by the fluorescence detector.
本発明の方法は、上記のようにして得られたD-アミノ酸を含む発酵物を乾燥させることを含んでもよい。乾燥は、凍結乾燥、風乾、真空乾燥、真空凍結乾燥、加熱乾燥等の任意の乾燥法を用いて行うことができる。また、乾燥後又は乾燥処理と同時に、乾燥物を粉末化、顆粒化、成形、カプセル封入等の方法により任意の形態に調製してもよい。 The method of the present invention may include drying the fermented product containing D-amino acid obtained as described above. Drying can be performed using any drying method such as lyophilization, air drying, vacuum drying, vacuum lyophilization, heat drying and the like. After drying or simultaneously with the drying treatment, the dried product may be prepared in any form by methods such as powderization, granulation, molding, encapsulation and the like.
特にアルカリとして炭酸カルシウムなどのカルシウム塩を使用する場合には、発酵物を乾燥させた場合の保存性が、例えば炭酸カリウムを使用した場合と比較して、顕著に向上する。具体的には、例えば、炭酸カルシウムを使用して調製した発酵物を乾燥粉末にした場合、45℃で１ヶ月保存後の粉末性状に大きな変化は認められず、固結や褐変が抑制され、また保存後のD-アミノ酸残存率も、炭酸カリウムを使用した場合と比較して大きく改善される。したがって、本発明において炭酸カルシウムを使用する場合、得られた発酵物を保存用に乾燥することも好ましい。得られた乾燥発酵物は高い保存安定性を示し、D-アミノ酸の低減（減衰）も抑制することができる。したがってこのような乾燥発酵物は高い保存性が要求されるサプリメント製品等に配合する上で、非常に有用である。 In particular, when a calcium salt such as calcium carbonate is used as the alkali, the storage stability when the fermented material is dried is significantly improved as compared with, for example, the case where potassium carbonate is used. Specifically, for example, when a fermented material prepared using calcium carbonate is made into a dry powder, no significant change is observed in the powder properties after storage for 1 month at 45 ° C., and caking and browning are suppressed, In addition, the D-amino acid retention rate after storage is also greatly improved as compared to the case where potassium carbonate is used. Therefore, when using calcium carbonate in the present invention, it is also preferable to dry the obtained fermented product for storage. The resulting dried fermented product exhibits high storage stability and can also suppress the reduction (attenuation) of D-amino acids. Therefore, such dry fermented matter is very useful for blending into a supplement product or the like which requires high preservation.
本発明では、高いD-アミノ酸含量の発酵物を調製することができる。本発明の方法では、そのような発酵物をそのままD-アミノ酸高含有物質として使用してもよいし、乾燥、凍結、凍結乾燥、殺菌、濃縮等の処理を行ってその処理物をD-アミノ酸高含有物質として使用してもよい。本発明の方法により得られるD-アミノ酸を含む発酵物は、D-アミノ酸の供給源として用いることができる。具体的には、D-アミノ酸を食品、飼料、香料等の任意の組成物に配合する場合に、本発明の発酵物を、D-アミノ酸の供給源としてそれらの組成物に添加することができる。あるいは、本発明の発酵物は、D-アミノ酸を抽出するための原料として用いることもできる。 In the present invention, fermented products with high D-amino acid content can be prepared. In the method of the present invention, such a fermented product may be used as it is as a D-amino acid-rich substance as it is, or the treated product may be treated as drying, freezing, lyophilization, sterilization, concentration etc. It may be used as a high content material. The fermented product containing D-amino acid obtained by the method of the present invention can be used as a source of D-amino acid. Specifically, when the D-amino acid is incorporated into any composition such as food, feed, flavor and the like, the fermented product of the present invention can be added to those compositions as a source of D-amino acid . Alternatively, the fermented product of the present invention can also be used as a raw material for extracting D-amino acids.
本発明の方法は、そのような発酵物から、D-アミノ酸又はD-アミノ酸を含む画分を回収することを含んでもよい。発酵物からのD-アミノ酸又はD-アミノ酸を含む画分の回収は、D-アミノ酸の任意の分離精製法により行えばよく、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー技術、塩析、溶媒沈殿等を用いて行うことができる。D-アミノ酸又はD-アミノ酸を含む画分の回収には、光学異性体を分離可能な技法を用いてもよい。発酵物からD-アミノ酸又はD-アミノ酸を含む画分を回収する際、発酵物からラクトバチルス属菌を除去する工程を行ってもよいし、行わなくてもよい。D-アミノ酸を含む画分は、ラクトバチルス属菌を含んでもよいし、含まなくてもよい。発酵物からのラクトバチルス属菌の除去は、膜ろ過や遠心分離を用いて行うことができる。 The method of the present invention may comprise recovering D-amino acid or a fraction containing D-amino acid from such a fermentate. The recovery of the D-amino acid or the fraction containing D-amino acid from the fermented product may be performed by any separation and purification method of D-amino acid, for example, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, It can be carried out using various chromatography techniques such as high performance liquid chromatography, salting out, solvent precipitation and the like. For recovery of D-amino acids or fractions containing D-amino acids, techniques that can separate optical isomers may be used. When recovering the D-amino acid or the fraction containing the D-amino acid from the fermented product, a step of removing Lactobacillus bacteria from the fermented product may or may not be performed. The fraction containing D-amino acid may or may not contain Lactobacillus. The removal of Lactobacillus bacteria from the fermented product can be carried out using membrane filtration or centrifugation.
以上のようにして得られた発酵物やその処理物、回収したD-アミノ酸若しくはD-アミノ酸を含む画分は、食品、食品添加物、医薬品（例えば、内服薬等の経口製剤や、皮膚外用剤等の非経口製剤）、医薬部外品、化粧料、飼料等の製造に使用することができる。本発明の方法で得られたD-アミノ酸を高含有する発酵物等を使用することにより、D-アミノ酸を高濃度で含む、食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等を容易に製造することができる。D-アミノ酸を含有するそのような食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等は、D-アミノ酸補充用に好適に用いることができ、例えば、D-アミノ酸の摂取量が不足しているか又はD-アミノ酸の補充が望まれる対象におけるD-アミノ酸補充用に用いることができる。対象は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等のペット又は家畜、マウス、ラット、ハムスター等の実験動物であってよい。 The fermented product obtained as described above and the processed product thereof, and the recovered D-amino acid or D-amino acid-containing fraction can be used as a food, food additive, medicine (eg, oral preparation such as internal medicine, skin external preparation) Etc.), quasi drugs, cosmetics, feeds, etc. can be used. Food, food additive, medicine, quasi-drug, cosmetics, feed which contains D-amino acid at high concentration by using a fermented product etc. containing high D-amino acid obtained by the method of the present invention. Etc. can be easily manufactured. Such foods, food additives, medicines, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like containing D-amino acids can be suitably used for D-amino acid supplementation, for example, intake of D-amino acids Can be used for D-amino acid supplementation in subjects in which D.sup.1 amino acid deficiency or D-amino acid supplementation is desired. The subject is preferably a mammal, for example, primates such as humans, chimpanzees and gorillas, dogs, cats, rabbits, cows, horses, pigs, goats, sheep, pets such as goats, sheep, donkeys or livestock, mice, rats, hamsters etc. It may be an animal.
本発明において「食品」は、飲料であってもよいしその他の食品であってもよい。飲料としては、以下に限定するものではないが、発酵乳（ドリンクヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶及び烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水ベースの飲料等の飲料が挙げられる。飲料以外の食品としては、以下に限定するものではないが、発酵乳（セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト等）、菓子、インスタント食品、調味料等の加工食品が挙げられる。各種の食品の製造法等については、既存の参考書を参考にすることができる。 In the present invention, the "food" may be a beverage or other food. The beverage is not limited to the following, but includes fermented milk (drink yogurt and the like), lactic acid bacteria beverage, milk beverage (coffee milk, fruit milk and the like), tea-based beverages (green tea, black tea and oolong tea etc), fruits and vegetables Beverages (including orange, apple, grape juice, tomato juice, vegetable juice), alcoholic beverages (beer, low-malt beer, wine, etc.), carbonated beverages, soft drinks, water-based beverages, etc. Can be mentioned. Foods other than beverages include, but are not limited to, processed foods such as fermented milk (set type yogurt, soft yogurt, etc.), confectionery, instant foods, seasonings and the like. The existing reference books can be referred to for manufacturing methods of various foods.
本発明において食品は、機能性食品であってもよい。本発明において「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。 In the present invention, the food may be a functional food. In the present invention, "functional food" means a food having a certain functionality to a living body, and includes, for example, food for specific health (including conditional Tokuho [food for specific health]) and nutritive functional food Health food, Functional indication food, Special purpose food, Dietary supplement, Health supplement, Supplement (For example, various dosage forms such as tablets, coated tablets, sugar coated tablets, capsules and liquids) and Beauty foods (eg Diet food) And so-called health food in general. The functional food of the present invention also includes a health food to which a health claim based on Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) food standards (Health claim) is applied.
本発明の機能性食品は、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品であってもよい。 The functional food of the present invention may be special-purpose food such as food for sick persons, milk powder for pregnant and lactating women, infant formula, food for elderly people, food for nursing care and the like.
本発明は、本発明の方法によりD-アミノ酸を製造し、食品に添加することを含む、D-アミノ酸強化食品の製造方法も提供する。一実施形態では、D-アミノ酸は、本発明の方法により調製された発酵物やその処理物、回収したD-アミノ酸又はD-アミノ酸を含む画分の形態で、食品に添加することができる。D-アミノ酸は食品製造の任意の段階で添加し得る。本発明において「D-アミノ酸強化食品」とは、D-アミノ酸を添加しない同種の食品と比較して、D-アミノ酸含量を増加させた食品を意味する。一実施形態では、D-アミノ酸強化食品は機能性食品であり、D-アミノ酸補充用に用いることができる。同様に、本発明は、D-アミノ酸を飼料に添加することを含む、D-アミノ酸強化飼料の製造方法も提供する。 The present invention also provides a method for producing a D-amino acid-enriched food, comprising producing the D-amino acid by the method of the present invention and adding it to a food. In one embodiment, the D-amino acid can be added to the food in the form of a fermented product prepared by the method of the present invention or a processed product thereof, or a recovered D-amino acid or a fraction containing D-amino acid. D-amino acids may be added at any stage of food production. In the present invention, "D-amino acid-enriched food" means a food having an increased D-amino acid content as compared to the same food without D-amino acid. In one embodiment, the D-amino acid fortified food is a functional food and can be used for D-amino acid supplementation. Similarly, the present invention also provides a method of producing a D-amino acid fortified feed comprising adding the D-amino acid to the feed.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be more specifically described using examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
＜分析法＞
以下の実施例において、発酵液中のアミノ酸の定量は、発酵液に添加したCarrez試薬により発酵液の除タンパク処理を行い、それを遠心し、得られた上清と四ホウ酸ナトリウム溶液とを混合した後、オルトフタルアルデヒド（o-phthalaldehyde; OPA）及びN-アセチル-L-システイン（NAC）を添加してD-アミノ酸及びL-アミノ酸を蛍光誘導体化し、高速液相クロマトグラフィー（HPLC）によるピーク分離及び340nmの励起波長による蛍光波長450nmを蛍光検出器により検出することにより実施した。
<Analytical method>
In the following examples, the quantification of amino acids in the fermentation broth was carried out by deproteinizing the fermentation broth with the Carrez reagent added to the fermentation broth, and centrifuging it to obtain the obtained supernatant and sodium tetraborate solution. After mixing, ortho-phthalaldehyde (OPA) and N-acetyl-L-cysteine (NAC) are added to fluorescently derivatize D-amino acids and L-amino acids by high performance liquid chromatography (HPLC). It carried out by detecting the fluorescence wavelength 450 nm by peak separation and an excitation wavelength of 340 nm with a fluorescence detector.
＜D-アミノ酸含有乳酸菌発酵液の調製法＞
別途記載する一部の実施例を除き、脱脂粉乳（明治社製）を8wt%、精製乳糖を3wt%、ビール酵母エキス（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を1wt%、L-アスパラギン酸ナトリウムを0.5wt%の終濃度で水に混合した溶液を、121℃、2分の条件でオートクレーブ殺菌したものを培地として用いた。
<Method for Preparing D-Amino Acid-Containing Lactic Acid Bacteria Fermentation Solution>
8% by weight of skimmed milk powder (Meiji Co., Ltd.), 3% by weight of purified lactose, 1% by weight of brewer's yeast extract (made by Asahi Food & Healthcare Co., Ltd.), L-sodium aspartate except for some examples described separately The solution mixed with water to a final concentration of 0.5 wt% was autoclaved under conditions of 121 ° C. for 2 minutes and used as a culture medium.
乳酸菌は0.1wt%のビール酵母エキスを含む10wt%還元脱脂乳で一晩培養することで植え継ぎ、前日に植え継いだ菌液を上記の培地に対し1wt%添加し、発酵を開始した。発酵のための培養条件は以下の実施例に記載するとおりである。 The lactic acid bacteria were transferred by overnight culture with 10 wt% reduced skimmed milk containing 0.1 wt% beer yeast extract, and 1 wt% of the culture solution transferred the previous day was added to the above medium to start fermentation. The culture conditions for fermentation are as described in the following examples.
［実施例１］D-アミノ酸含有OLL1247発酵液の調製及びアミノ酸分析
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） OLL1247株（受託番号NITE BP-01814）を添加した培地を上述の調製法に従って調製した。発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースへ通気して行った。発酵過程の温度は、発酵開始より16時間は43℃、その後32時間は45℃とした。細菌増殖は、発酵開始より16時間の時点で定常期に達していた。
[Example 1] Preparation of D-amino acid-containing OLL 1247 fermented solution and amino acid analysis A medium to which Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus OLL 1247 strain (Accession No. NITE BP-01814) was added Prepared according to the preparation method described above. Fermentation was carried out by using a 3L volume jar fermenter manufactured by Biot, with a stirring blade rotational speed of 150 rpm, and passing nitrogen gas into the head space. The temperature of the fermentation process was 43 ° C. for 16 hours from the start of fermentation, and then 45 ° C. for 32 hours. Bacterial growth had reached stationary phase at 16 hours from the start of fermentation.
発酵開始より16時間までは、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いて発酵液のpHを5.90を中心に自動制御した。それ以降は発酵終了までpHの制御は実施しなかった。 The pH of the fermentation broth was automatically controlled centering on 5.90 using a 6 N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for up to 16 hours from the start of fermentation. After that, pH control was not performed until the end of fermentation.
培養後の発酵液について、上記分析法に従い、L-アミノ酸、及びD-アミノ酸の濃度を測定した。結果を表１に示した。この結果から、OLL1247株の培養物（発酵液）において、各種D-アミノ酸、特にD-アスパラギン酸が高濃度で産生されたことが示された。 The concentration of L-amino acid and D-amino acid was measured for the fermented solution after culture according to the above-mentioned analysis method. The results are shown in Table 1. From this result, it was shown that various D-amino acids, particularly D-aspartic acid, were produced at high concentrations in the culture (fermented liquid) of OLL1247 strain.
［実施例２］脂肪酸エステル添加によるラセミ化促進
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） OLL1255株（受託番号NITE BP-76）を添加した培地を上述の調製法に従って調製した。発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵温度は37℃とし、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いて発酵液のpHを5.30を中心に自動制御した。12時間の発酵後、発酵液に、終濃度0.3wt%となるように、図１に示す各種グリセリン脂肪酸エステル又はショ糖脂肪酸エステル（脂肪酸エステル）の分散液を添加し、45℃で24時間反応を行った。この24時間の反応中は、pHの制御は実施しなかった。なお細菌増殖は、発酵開始より12時間の時点で定常期に達していた。対照として、脂肪酸エステルを添加しないこと以外は同様の方法で発酵液を調製した。
[Example 2] Racemization promotion by addition of fatty acid ester A culture medium to which Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus OLL1 255 strain (Accession No. NITE BP-76) has been added according to the above-mentioned preparation method Prepared. Fermentation was carried out by using a 3L volume jar fermenter manufactured by Biot, with a stirring blade rotational speed of 150 rpm, and passing nitrogen gas through the head space. The fermentation temperature was 37 ° C., and the pH of the fermentation liquid was automatically controlled mainly at 5.30 using a 6 N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After 12 hours of fermentation, a dispersion of various glycerol fatty acid esters or sucrose fatty acid esters (fatty acid esters) shown in FIG. 1 is added to the fermentation solution to a final concentration of 0.3 wt%, and reaction is carried out at 45 ° C. for 24 hours Did. No pH control was performed during this 24 hour reaction. Bacterial growth had reached stationary phase at 12 hours from the start of fermentation. As a control, a fermentation broth was prepared in the same manner except that no fatty acid ester was added.
その後、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した結果を図１に示した。OLL1255株の発酵液に脂肪酸エステルを添加することにより、それを添加しない場合と比較してD-アスパラギン酸をより高濃度で生成できることが示された。このことは、脂肪酸エステルの添加により、発酵液中に含まれるL-アスパラギン酸のD-アスパラギン酸への変換（ラセミ化）が促進されたことを示す。 Thereafter, according to the above-mentioned analytical method, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth was measured. The results are shown in FIG. It was shown that by adding a fatty acid ester to the fermentation broth of OLL 1255 strain, D-aspartic acid can be produced at a higher concentration as compared with the case where it is not added. This indicates that the addition of the fatty acid ester promoted the conversion (racemization) of L-aspartic acid contained in the fermented solution to D-aspartic acid.
［実施例３］
１）比較試料１の調製
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） OLL1255株（受託番号NITE BP-76）を添加した培地を上述の調製法に従って調製した。発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵過程の温度は、発酵開始より16時間は37℃、その後32時間は45℃とした。
[Example 3]
1) Preparation of Comparative Sample 1 A medium to which Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus OLL1 255 strain (Accession No. NITE BP-76) was added was prepared according to the above-mentioned preparation method. Fermentation was carried out by using a 3L volume jar fermenter manufactured by Biot, with a stirring blade rotational speed of 150 rpm, and passing nitrogen gas through the head space. The temperature of the fermentation process was 37 ° C. for 16 hours from the start of fermentation, and then 45 ° C. for 32 hours.
発酵開始より16時間までは、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を中和剤として用いて発酵液のpHを5.90を中心に自動制御しながら、培養を行った。炭酸カリウム溶液の添加は発酵開始の4時間後に開始した。発酵開始より16時間後以降は、乳酸がほとんど産生されず、pHの制御は実施しなかった。 The cultivation was carried out up to 16 hours from the start of fermentation using a 6N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a neutralizing agent, while automatically controlling the pH of the fermentation solution mainly at 5.90. . The addition of potassium carbonate solution was started 4 hours after the start of fermentation. After 16 hours from the start of fermentation, almost no lactic acid was produced, and pH control was not performed.
45℃で32時間の反応後の発酵液を-30℃で予備凍結し、次いでクリスト（Christ）社製の卓上凍結乾燥機を用いて乾燥粉末（比較試料１）とした。 The fermented solution after reaction at 45 ° C. for 32 hours was pre-frozen at −30 ° C., and then made into a dry powder (comparative sample 1) using a tabletop lyophilizer manufactured by Christ.
２）試験試料１の調製
炭酸カリウムの代わりに、ラウリン酸ペンタグリセリンを2.4wt%の濃度で含む炭酸カルシウム製剤を中和剤として使用したこと以外は、比較試料１の調製と同様の方法で発酵（培養）を行った。発酵においては、比較試料１の調製における炭酸カリウムの添加量とモル濃度で同一になる量の炭酸カルシウムが添加されるように、その炭酸カルシウム製剤を使用した。炭酸カルシウム製剤の添加のタイミングは、炭酸カルシウムのアルカリとしての反応性の低さを考慮し、比較試料１の調製における炭酸カリウムの経時添加量を参考にして比較試料１についての炭酸カリウムの添加開始時から約2時間早めた時点からとし、比較試料１の調製時の炭酸カリウム相当量の炭酸カルシウム製剤を1時間間隔で添加した。
2) Preparation of
45℃で32時間の反応後の発酵液を-30℃で予備凍結し、次いでクリスト（Christ）社製の卓上凍結乾燥機を用いて乾燥粉末（試験試料１）とした。 The fermented solution after reaction at 45 ° C. for 32 hours was pre-frozen at −30 ° C. and then made into a dry powder (Test sample 1) using a tabletop lyophilizer manufactured by Christ.
３）D-アスパラギン酸の濃度測定
上記の比較試料１と試験試料１の調製における発酵中、発酵開始の16時間、32時間、及び48時間経過後に、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図２に示した。ラウリン酸ペンタグリセリンを含む炭酸カルシウム製剤を用いることで、OLL1255株の発酵液において、D-アスパラギン酸がより高濃度で生成されることが示された。
3) Measurement of concentration of D-aspartic acid During fermentation in the preparation of
［実施例４］
１）比較試料２の調製
市販の「明治ブルガリアヨーグルト」（明治社製）から当業者に一般に知られる方法によりラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス菌を単離し、それを添加した培地を上述の調製法に従って調製した。発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵過程の温度は、発酵開始より16時間は37℃、その後32時間は45℃とした。
Example 4
1) Preparation of
発酵開始より16時間までは、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を中和剤として用いて発酵液のpHを5.90を中心に自動制御しながら、培養を行った。炭酸カリウム溶液の添加は発酵開始の4時間後に開始した。発酵開始より16時間後以降は、乳酸がほとんど産生されず、pHの制御は実施しなかった。 The cultivation was carried out up to 16 hours from the start of fermentation using a 6N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a neutralizing agent, while automatically controlling the pH of the fermentation solution mainly at 5.90. . The addition of potassium carbonate solution was started 4 hours after the start of fermentation. After 16 hours from the start of fermentation, almost no lactic acid was produced, and pH control was not performed.
45℃で32時間の反応後の発酵液を-30℃で予備凍結し、次いでクリスト（Christ）社製の卓上凍結乾燥機を用いて乾燥粉末（比較試料２）とした。 The fermented solution after reaction at 45 ° C. for 32 hours was pre-frozen at −30 ° C., and then made into a dry powder (comparative sample 2) using a tabletop lyophilizer manufactured by Christ.
２）試験試料２の調製
炭酸カリウムの代わりに、ラウリン酸ペンタグリセリンを2.4wt%の濃度で含む炭酸カルシウム製剤を中和剤として使用したこと以外は、比較試料２の調製と同様の方法で発酵を行った。発酵においては、比較試料２の調製における炭酸カリウムの添加量とモル濃度で同一になる量の炭酸カルシウムが添加されるように、その炭酸カルシウム製剤を使用した。炭酸カルシウム製剤の添加のタイミングは、アルカリとしての反応性の低さを考慮し、比較試料２の調製における炭酸カリウムの経時添加量を参考にして比較試料２についての炭酸カリウムの添加開始時から約2時間早めた時点からとし、比較試料２の調製時の炭酸カリウム相当量の炭酸カルシウム製剤を1時間間隔で添加した。
2) Preparation of
45℃で32時間の反応後の発酵液を-30℃で予備凍結し、次いでクリスト（Christ）社製の卓上凍結乾燥機を用いて乾燥粉末（試験試料２）とした。 The fermented solution after reaction at 45 ° C. for 32 hours was pre-frozen at −30 ° C., and then made into a dry powder (Test sample 2) using a tabletop lyophilizer manufactured by Christ.
３）D-アスパラギン酸の濃度測定
上記の比較試料２と試験試料２の調製における発酵中、発酵開始の16時間、32時間、及び48時間経過後に、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図３に示した。ラウリン酸ペンタグリセリンを含む炭酸カルシウム製剤を用いることで、OLL1255株以外のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス菌の発酵液においても、D-アスパラギン酸がより高濃度で生成されることが示された。
3) Measurement of concentration of D-aspartic acid During fermentation in the preparation of
［実施例５］
実施例３で得られた比較試料１及び試験試料１の発酵液粉末、並びに実施例４で得られた比較試料２及び試験試料２の発酵液粉末を、45℃で1ヶ月保存し、保存期間後の粉末性状及びD-アスパラギン酸の残存性を評価した。D-アスパラギン酸の残存性は、調製直後の発酵液粉末について上記分析法に従って測定したD-アスパラギン酸の濃度に対する、保存期間後の発酵液粉末について上記分析法に従って測定したD-アスパラギン酸の濃度の比率（D-アスパラギン酸残存率［％］）として算出した。
[Example 5]
The fermented solution powder of
45℃で1ヶ月保存後の発酵液粉末について、外観写真を図４に、D-アスパラギン酸残存率を図５に示した。保存試験の結果、比較試料１及び比較試料２は、黒色に変色しており、粒子の大きさの増大や粒子同士の強固な固結状態が認められたのに対し、試験試料１及び２は、本来の白色から黄色の外観を保ち、微粉末状態へ容易に解砕が可能な物性を保持していた。またD-アスパラギン酸残存率は、いずれの菌株でも、上記の炭酸カルシウム製剤を用いた場合の方が高かった。このことから、上記炭酸カルシウム製剤を用いることにより、発酵液粉末の安定性が大きく改善することが示された。この安定性改善効果は乳酸がカルシウム塩に変換されたことによるものと考えられる。
The appearance photograph of the fermented solution powder after one month storage at 45 ° C. is shown in FIG. 4, and the D-aspartic acid residual rate is shown in FIG. As a result of the storage test,
［実施例６］
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスOLL1255株の代わりに、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）JCM 1120T株を用い、脂肪酸エステルとしてカプリル酸モノグリセリド、ラウリン酸モノグリセリド、ショ糖ラウリン酸エステル、又はショ糖パルミチン酸エステルを使用して、実施例２と類似の方法で発酵液を調製し、D-アスパラギン酸の濃度の測定を行った。
[Example 6]
Lactobacillus helveticus JCM 1120 T strain is used in place of Lactobacillus delbruchii subspecies bulgaricus strain OLL 1255, and caprylic acid monoglyceride, lauric acid monoglyceride, sucrose lauric acid ester, or fatty acid ester as a fatty acid ester A fermentation broth was prepared in a manner similar to Example 2 using sucrose palmitic acid ester, and the concentration of D-aspartic acid was measured.
具体的には、脱脂粉乳（明治社製）を8wt%、精製乳糖を3wt%、ビール酵母エキス（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を1wt%、L-アスパラギン酸ナトリウムを0.5wt%の終濃度で水に混合した溶液を、121℃、2分の条件でオートクレーブ殺菌したものを培地とした。 Specifically, final concentration of 8wt% of skimmed milk powder (Meiji Co., Ltd.), 3wt% of purified lactose, 1wt% of beer yeast extract (manufactured by Asahi Food & Health Care Co., Ltd.) and 0.5wt% of L-aspartate sodium The solution mixed with water in the above was autoclaved under conditions of 121.degree. C. for 2 minutes to obtain a culture medium.
ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM 1120T株は0.1wt%のビール酵母エキスを含む10wt%還元脱脂乳で一晩培養することで植え継ぎ、前日に植え継いで得られた菌液を上記培養培地に対し1wt%添加し、発酵を開始した。 The Lactobacillus helveticus JCM 1120 T strain is transferred by overnight culture with 10 wt% reduced skimmed milk containing 0.1 wt% brewer's yeast extract, and the bacterial solution obtained on the previous day is transferred at 1 wt. % Was added to start fermentation.
ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM 1120Tの発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵温度は37℃とし、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いpH 5.30を中心に自動制御した。22時間の発酵後、6規定の炭酸カリウムにより発酵液をpH6.0へと調整し、さらに、終濃度0.3wt%となるように、図６に示す各種グリセリン脂肪酸エステル又はショ糖脂肪酸エステルの分散液を添加し、45℃で24時間反応を進めた。発酵液のpH6.0への調整後、45℃で24時間の反応中はpHの制御は実施しなかった。対照として、脂肪酸エステルを添加しないこと以外は同様の方法で発酵液を調製した。 Fermentation of Lactobacillus helveticus JCM 1120 T was carried out using a 3L jar fermenter manufactured by Biot, with a stirring blade rotational speed of 150 rpm, and nitrogen gas flowed through the head space. The fermentation temperature was 37 ° C., and was automatically controlled mainly at pH 5.30 using a 6 N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After 22 hours of fermentation, adjust the fermented solution to pH 6.0 with 6N potassium carbonate, and further disperse the various glycerin fatty acid esters or sucrose fatty acid esters shown in FIG. 6 so that the final concentration is 0.3 wt%. The solution was added and the reaction was allowed to proceed at 45.degree. C. for 24 hours. After adjusting the fermented solution to pH 6.0, pH control was not performed during the reaction at 45 ° C. for 24 hours. As a control, a fermentation broth was prepared in the same manner except that no fatty acid ester was added.
その後、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図６に示す。 Thereafter, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth was measured according to the above-mentioned analytical method. The results are shown in FIG.
同様に、OLL1255株の代わりに、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum） JCM 1173T株を用い、脂肪酸エステルとしてカプリル酸モノグリセリドを使用して、実施例２と類似の方法で発酵液を調製し、D-アスパラギン酸の濃度の測定を行った。 Similarly, using Lactobacillus fermentum JCM 1173 T strain instead of OLL 1255 strain and using caprylic acid monoglyceride as fatty acid ester, a fermentation broth is prepared in a similar manner to Example 2, The concentration of D-aspartic acid was measured.
具体的には、脱脂粉乳（明治社製）を8wt%、精製乳糖を3wt%、ビール酵母エキス（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を1wt%、イーストリッチマンガン（オリエンタル酵母工業社製）を0.5wt%、L-アスパラギン酸ナトリウムを0.5wt%の終濃度で水に混合した溶液を、121℃、2分の条件でオートクレーブ殺菌したものを培地とした。 Specifically, 8% by weight of skimmed milk powder (manufactured by Meiji Co., Ltd.), 3% by weight of purified lactose, 1% by weight of brewer's yeast extract (manufactured by Asahi Food & Health Care), 0.5% of yeast rich manganese (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) A solution obtained by mixing wt% and sodium L-aspartate at a final concentration of 0.5 wt% in water was subjected to autoclave sterilization under conditions of 121 ° C. for 2 minutes to obtain a culture medium.
JCM 1173T株は0.5wt%のビール酵母エキス及び0.2wt%のイーストリッチマンガンを含む10wt%還元脱脂乳で一晩培養することで植え継ぎ、前日に植え継いだ菌液を上記培地に対し1wt%添加し、発酵を開始した。 The JCM 1173 T strain was transferred by overnight culture in 10 wt% reduced skimmed milk containing 0.5 wt% brewer's yeast extract and 0.2 wt% yeast rich manganese, and 1 wt of the transferred bacterial solution the day before. % Was added to start fermentation.
ラクトバチルス・ファーメンタムJCM 1173Tの発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵温度は37℃とし、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いpH 5.30を中心に自動制御した。25時間の発酵後、発酵液に、終濃度0.3wt%となるように、カプリル酸モノグリセリドの分散液を添加し、45℃で24時間反応を進めた。なお45℃で24時間の反応中は、発酵液のpHの制御は実施しなかった。 The fermentation of Lactobacillus fermentum JCM 1173 T was carried out using a 3L jar fermenter manufactured by Biot, with a stirring blade rotational speed of 150 rpm, and nitrogen gas flowed through the head space. The fermentation temperature was 37 ° C., and was automatically controlled mainly at pH 5.30 using a 6 N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After 25 hours of fermentation, a dispersion of caprylic acid monoglyceride was added to the fermentation solution to a final concentration of 0.3 wt%, and the reaction was allowed to proceed at 45 ° C. for 24 hours. During the reaction at 45 ° C. for 24 hours, control of the pH of the fermentation liquid was not performed.
その後、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図７に示した。 Thereafter, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth was measured according to the above-mentioned analytical method. The results are shown in FIG.
本実施例の結果から、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス以外の種のラクトバチルス属菌を用いた場合でも、脂肪酸エステルを使用して発酵液中のD-アスパラギン酸の生成濃度を増加させることができることが示された。 From the results of this example, even when Lactobacillus spp. Of a species other than Lactobacillus delbrueckii Subspecies vesiculica are used, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation liquid can be determined using a fatty acid ester. It has been shown that it can be increased.
［実施例７］
脱脂粉乳（明治社製）を8wt%、精製乳糖を3wt%、ビール酵母エキス（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を1wt%、L-アスパラギン酸ナトリウムを0.5wt%の終濃度で水に混合した溶液を、121℃、2分の条件でオートクレーブ殺菌したものを培地とした。乳酸菌の調製及び培地への添加は上述の実施例と同様にして行った。
[Example 7]
8% by weight of skimmed milk powder (Meiji Co., Ltd.), 3% by weight of purified lactose, 1% by weight of beer yeast extract (made by Asahi Food & Healthcare Co., Ltd.) and 0.5% by weight of sodium L-aspartate in water The solution was autoclaved under conditions of 121 ° C. for 2 minutes to obtain a culture medium. Preparation of lactic acid bacteria and addition to the medium were carried out in the same manner as in the above examples.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） MEP201603株の発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵温度は37℃とし、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いpH 5.90に制御しながら16時間発酵を行った。続いて、その後の発酵温度を37℃、41℃、又は45℃とし、さらに24時間反応を進めた。なお細菌増殖は、発酵開始より16時間の時点で定常期に達していた。発酵開始より16時間後以降はpHの制御は実施しなかった。 Fermentation of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) MEP201603 strain uses a 3L capacity jar fermenter of Biot Co., the agitation feather rotation number is 150 rpm, nitrogen gas is aerated in the head space I went. The fermentation temperature was 37 ° C., and fermentation was performed for 16 hours using a 6 N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) while controlling the pH to 5.90. Subsequently, the temperature of the subsequent fermentation was brought to 37 ° C., 41 ° C. or 45 ° C., and the reaction was allowed to proceed for another 24 hours. Bacterial growth reached a stationary phase at 16 hours from the start of fermentation. The pH was not controlled after 16 hours from the start of fermentation.
その後、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図８に示す。図８に示されるとおり、37℃での培養（増殖）後に発酵液の温度を45℃に上昇させることにより、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を顕著に増加させることができたことが示された。 Thereafter, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth was measured according to the above-mentioned analytical method. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, by raising the temperature of the fermentation broth to 45 ° C. after cultivation (growth) at 37 ° C., the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth could be significantly increased. Indicated.
［実施例８］
脱脂粉乳（明治社製）を8wt%、精製乳糖を3wt%、ビール酵母エキス（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を1wt%、L-アスパラギン酸ナトリウムを0.5wt%、ラウリン酸ペンタグリセリンを0.2wt%の終濃度で水に混合した溶液を、121℃、2分の条件でオートクレーブ殺菌したものを培地とした。対照として、ラウリン酸ペンタグリセリン0.2wt%を含まないこと以外は同じ培地を調製した。乳酸菌の調製及び培地への添加は上述の実施例と同様にして行った。
[Example 8]
8 wt% skimmed milk powder (Meiji Co., Ltd.), 3 wt% purified lactose, 1 wt% beer yeast extract (Asahi Food and Health Care), 0.5 wt% L-aspartate sodium, 0.2 wt% pentaglyceryl laurate The solution mixed with water to a final concentration of 50% was autoclaved under conditions of 121 ° C. for 2 minutes to obtain a culture medium. As a control, the same medium was prepared except that 0.2 wt% of pentaglyceryl laurate was not included. Preparation of lactic acid bacteria and addition to the medium were carried out in the same manner as in the above examples.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） MEP201603株の発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵過程の温度は、発酵開始より16時間は37℃、その後32時間は45℃とした。 Fermentation of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) MEP201603 strain uses a 3L capacity jar fermenter of Biot Co., the agitation feather rotation number is 150 rpm, nitrogen gas is aerated in the head space I went. The temperature of the fermentation process was 37 ° C. for 16 hours from the start of fermentation, and then 45 ° C. for 32 hours.
発酵開始より16時間までは、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いて発酵液のpHを5.30を中心に自動制御しながら、培養を行った。発酵開始より16時間後以降はpHの制御は実施しなかった。 The cultivation was carried out up to 16 hours from the start of fermentation using a 6 normal (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) while automatically controlling the pH of the fermented solution mainly at 5.30. The pH was not controlled after 16 hours from the start of fermentation.
その後、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図９に示す。図９に示されるとおり、ラウリン酸ペンタグリセリンを用いることにより、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度をさらに増加させることができることが示された。なお脂肪酸エステルは、一般的に、菌の増殖阻害を示すことが知られているが、本実施例に示すとおり、ラクトバチルス属菌を用いたD-アミノ酸生成においては脂肪酸エステルによる増殖阻害は示されなかった。 Thereafter, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth was measured according to the above-mentioned analytical method. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, it was shown that the concentration of D-aspartic acid in the fermented liquid can be further increased by using pentaglyceryl laurate. Fatty acid esters are generally known to show bacterial growth inhibition, but as shown in this example, D-amino acid production using Lactobacillus bacteria shows growth inhibition by fatty acid esters. It was not done.
［実施例９］
脱脂粉乳（明治社製）を8wt%、精製乳糖を3wt%、ビール酵母エキス（アサヒフードアンドヘルスケア社製）を1wt%、L-アスコルビン酸ナトリウムを0.5wt%の終濃度で水に混合した溶液を、121℃、2分の条件でオートクレーブ殺菌したものを培地とした。乳酸菌の調製及び培地への添加は上述の実施例と同様にして行った。
[Example 9]
8% by weight of skimmed milk powder (Meiji Co., Ltd.), 3% by weight of purified lactose, 1% by weight of beer yeast extract (made by Asahi Food & Healthcare Co., Ltd.) and 0.5% by weight of sodium L-ascorbate in water The solution was autoclaved under conditions of 121 ° C. for 2 minutes to obtain a culture medium. Preparation of lactic acid bacteria and addition to the medium were carried out in the same manner as in the above examples.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） MEP201603株の発酵はバイオット社の3L容ジャーファーメンターを用い、撹拌羽回転数を150rpmとし、窒素ガスをヘッドスペースに通気して行った。発酵温度は37℃とし、6規定(N)の炭酸カリウム溶液（和光純薬工業社製）を用いpH 5.30を中心に自動制御した。16時間の発酵後、発酵液に、炭酸カルシウムスラリー、ラウリン酸ペンタグリセリンを含む炭酸カルシウムスラリー製剤、炭酸カルシウム、又はラウリン酸ペンタグリセリンを含む炭酸カルシウム製剤を、炭酸カルシウム相当量が同一（2wt%）となる量で添加し、45℃で24時間反応を進めた。 Fermentation of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) MEP201603 strain uses a 3L capacity jar fermenter of Biot Co., the agitation feather rotation number is 150 rpm, nitrogen gas is aerated in the head space I went. The fermentation temperature was 37 ° C., and was automatically controlled mainly at pH 5.30 using a 6 N (N) potassium carbonate solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After 16 hours of fermentation, a calcium carbonate slurry, a calcium carbonate slurry preparation containing pentaglyceryl laurate, a calcium carbonate preparation containing calcium carbonate or pentaglyceryl laurate, and the same amount of calcium carbonate (2 wt%) The reaction was allowed to proceed at 45.degree. C. for 24 hours.
対照として、上記と同様に調製した培地を用いて、炭酸カルシウム（炭酸カルシウムスラリー、ラウリン酸ペンタグリセリンを含む炭酸カルシウムスラリー製剤、炭酸カルシウム、又はラウリン酸ペンタグリセリンを含む炭酸カルシウム製剤）を添加しないこと以外は、同様の試験を行った。 As a control, calcium carbonate (a calcium carbonate slurry, a calcium carbonate slurry preparation containing pentaglyceryl laurate, a calcium carbonate preparation containing calcium carbonate, or a calcium carbonate preparation containing pentaglyceryl laurate) using the medium prepared as described above The same test was conducted except for the above.
その後、上記分析法に従い、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度を測定した。結果を図１０に示す。炭酸カルシウムだけではD-アスパラギン酸の生成は促進されなかったが、ラウリン酸ペンタグリセリンを用いることにより、発酵液中のD-アスパラギン酸の濃度をさらに増加させることができることが示された。 Thereafter, the concentration of D-aspartic acid in the fermentation broth was measured according to the above-mentioned analytical method. The results are shown in FIG. Although calcium carbonate alone did not promote the formation of D-aspartic acid, it was shown that the concentration of D-aspartic acid in the fermentation liquid can be further increased by using pentaglyceryl laurate.
本発明では、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスをはじめとするラクトバチルス属菌を用いて、D-アミノ酸を高効率に生産することができる。本発明において使用されるラクトバチルス属菌は乳酸菌として長い食経験があるため、得られたD-アミノ酸含有発酵物を食品等に使用する場合、発酵物から乳酸菌を分離除去することなく、食品などの組成物に配合することができる。本発明により製造されるD-アミノ酸、及びD-アミノ酸を含有するラクトバチルス属菌の発酵物（培養物）は、D-アミノ酸が有する生理機能を付与すべく、医薬品（皮膚外用剤、内服薬等）、医薬部外品、化粧料、食品、食品添加物又は飼料などに使用可能である。 In the present invention, D-amino acids can be produced with high efficiency using Lactobacillus bacteria including Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus. Since the Lactobacillus genus bacteria used in the present invention have a long eating experience as lactic acid bacteria, when the obtained D-amino acid-containing fermented material is used for food or the like, the food or the like is not separated or removed from the fermented product. Can be formulated into the composition of The D-amino acid produced according to the present invention and the fermented product (culture) of a Lactobacillus bacterium containing the D-amino acid are pharmaceuticals (skin external preparations, internal medicines, etc.) in order to impart the physiological function possessed by the D-amino acid. ), Quasi drugs, cosmetics, food, food additives or feed.
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