JP2019024426A - Cell separation device and method of obtaining cell-containing liquid comprising monocytes - Google Patents

Cell separation device and method of obtaining cell-containing liquid comprising monocytes Download PDF

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Abstract

To provide a cell separation device for recovering monocytes with good recovery efficiency while removing granulocytes and erythrocytes and a method of obtaining a cell-containing liquid comprising monocytes using said cell separation device.SOLUTION: When obtaining a cell-containing liquid comprising monocytes while removing granulocytes and erythrocytes from a crude cell-containing liquid comprising monocytes, granulocytes and erythrocytes, a cell separation device is used in which a first filter and a second filter are provided in series where filter members having a prescribed permeability and comprising unwoven fibers are respectively loaded inside the first filter and the second filter in respectively prescribed states.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

本発明は、種々の細胞を含む粗細胞含有液からの単核球の回収に好適に用いられる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とに関する。   The present invention relates to a cell separation apparatus suitably used for recovering mononuclear cells from a crude cell-containing liquid containing various cells, and a method for obtaining a cell-containing liquid containing mononuclear cells using the cell separation apparatus. About.

近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。   In recent years, with rapid advances in hematology and scientific technology, only the necessary blood fractions are separated from body fluids such as whole blood, bone marrow, umbilical cord blood, and tissue extracts and administered to patients. In addition, a treatment style that suppresses side effects by not administering fractions that are not necessary for treatment is widespread.

例えば、血液輸血もその１つである。赤血球製剤は、出血又は赤血球が不足する場合、又は赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。   For example, blood transfusion is one of them. An erythrocyte product is a blood product that is used when bleeding or red blood cells are deficient, or when oxygen is deficient due to reduced function of red blood cells. The erythrocyte preparation does not require leukocytes that induce side effects such as abnormal immune reactions or graft-versus-host disease (GVHD), and it is necessary to remove leukocytes with a filter. In some cases, platelets may be removed in addition to leukocytes.

一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。   On the other hand, a platelet preparation is a blood preparation used for patients who are bleeding or tend to bleed due to a lack of blood coagulation factors. For the production of platelet preparations, unnecessary cells and components other than platelets are removed by centrifugation, and only the necessary platelet components are collected.

加えて近年、白血病に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。
また固形癌の治療に対しては樹状細胞療法が盛んに行われており、患者の血液や細胞培養液から治療のもととなる単球を含む細胞群を分離するケースがある。 In addition, hematopoietic stem cell transplantation for leukemia has been actively performed in recent years, and a method of separating and administering leukocyte groups containing hematopoietic stem cells necessary for treatment has been taken. As a source of this hematopoietic stem cell, umbilical cord blood is attracting attention in addition to bone marrow and peripheral blood because of its advantages such as low burden on donors and excellent proliferation ability. In recent years, it has been suggested that there are abundant stem cells in menstrual blood, and menstrual blood that has been discarded may be used as a valuable source of stem cells.
In addition, dendritic cell therapy is actively used for the treatment of solid cancer, and there are cases in which a group of cells containing monocytes as a base for treatment is separated from the blood or cell culture medium of the patient.

細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法も報告されている（特許文献１、特許文献２、及び特許文献３を参照）。従来は遠心分離又は比重液を使用した密度勾配遠心法によって分離操作を行っていたが、フィルターを用いることで操作の簡略化や大型のセルプロセッシング施設が必要ない等の利点がある。
しかしながら、特許文献１〜３等に記載の白血球の回収方法を、単核球の回収に適用してみても、例えば顆粒球や赤血球等の単核球以外の不要な細胞も高い割合で混入してしまい、また必ずしも十分に高い回収率で単核球を回収しにくい問題がある。 Recently, a method of collecting leukocytes using a filter material that captures only leukocytes without capturing red blood cells and platelets has also been reported as a cell separation method (see Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3). ). Conventionally, the separation operation is performed by centrifugation or density gradient centrifugation using a specific gravity solution. However, using a filter has advantages such as simplification of operation and the need for a large cell processing facility.
However, even if the method for recovering leukocytes described in Patent Documents 1 to 3 is applied to recovering mononuclear cells, unnecessary cells other than mononuclear cells such as granulocytes and erythrocytes are also mixed in at a high rate. In addition, there is a problem that it is difficult to recover mononuclear cells with a sufficiently high recovery rate.

特表２００１−５１８７９２号公報JP-T-2001-518792 国際公開第９８／３２８４０号International Publication No. 98/32840 特開平１０−３１３８５５号公報Japanese Patent Laid-Open No. 10-313855

上記のような事情に鑑み、本発明は、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とを提供することを目的とする。   In view of the circumstances as described above, the present invention includes a cell separator capable of recovering mononuclear cells with good recovery efficiency while removing granulocytes and red blood cells, and mononuclear cells using the cell separator. It is an object of the present invention to provide a method for obtaining a cell-containing solution.

本発明者らは、単核球、顆粒球、及び赤血球を含む粗細胞含有液から、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する際に、直列につながれた第１フィルターと第２フィルターとを備え、第１フィルター内、及び第２フィルター内に、それぞれ所定の通気度を示す不織布からなるフィルター部材が、それぞれ所定の状態で充填された細胞分離装置を用いることによって、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。   When the present inventors obtain a cell-containing solution containing mononuclear cells while removing granulocytes and red blood cells from a crude cell-containing solution containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells, they are connected in series. A cell separation device comprising a first filter and a second filter, each of which is filled with a filter member made of a nonwoven fabric having a predetermined air permeability in each of the first filter and the second filter in a predetermined state. By using it, it discovered that said subject could be solved and came to complete this invention.

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。   That is, the gist of the present invention is as follows.

〔１〕第１フィルターと、第２フィルターと、を備える細胞分離装置であって、
第１フィルターと、第２フィルターとが、それぞれ、液体導入口と、液体導出口と、フィルター部材収容部とを備え、
第１フィルターの液体導出口と、第２フィルターの液体導入口とが、流路で接続されており、
第１フィルターが備えるフィルター部材収容部に、通気度が１０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第１フィルター部材が、収容前の第１フィルター部材の厚さＴ１ ０が、収容後の第１フィルター部材の厚さＴ１ １の１．０倍以上１．２倍以下であるように収容され、
第２フィルターが備えるフィルター部材収容部に、通気度が３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第２フィルター部材が、収容前の第２フィルター部材の厚さＴ２ ０が、収容後の第２フィルター部材の厚さＴ２ １の１．０倍以上３．０倍以下であるように収容されている、細胞分離装置。 [1] A cell separation device comprising a first filter and a second filter,
Each of the first filter and the second filter includes a liquid inlet, a liquid outlet, and a filter member container.
The liquid outlet port of the first filter and the liquid inlet port of the second filter are connected by a flow path,
The first filter member made of a nonwoven fabric having an air permeability of 10 mL / cm 2 / sec or more and 45 mL / cm 2 / sec or less in the filter member housing portion provided in the first filter is the thickness T of the first filter member before housing. 1 0, 1.2 times the thickness T 1 1 1.0 times or more of the first filter member after receiving housed as or less,
The second filter member made of non-woven fabric having an air permeability of 3 mL / cm 2 / sec to 50 mL / cm 2 / sec in the filter member housing portion provided in the second filter is the thickness T of the second filter member before housing. 2 0, 3.0 times 1.0 times or more the thickness T 2 1 of the second filter member after receiving are accommodated such that follows, cell separation device.

〔２〕第２フィルター部材を構成する不織布に含まれる繊維の平均繊維径が１μｍ以上５μｍ以下である、〔１〕に記載の細胞分離装置。   [2] The cell separation device according to [1], wherein an average fiber diameter of fibers contained in the nonwoven fabric constituting the second filter member is 1 μm or more and 5 μm or less.

〔３〕フィルター部材収容部に収容後の第１フィルター部材の厚さＴ１ １が、第１フィルター部材が収容されたフィルター部材収容部の、第１フィルター部材の厚さ方向と同方向の高さＨ１の、０．８倍以上１．２倍以下である、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞分離装置。 [3] The thickness T 1 1 of the first filter member after accommodating the filter member receiving portion, the filter member accommodating portion in which the first filter member housed, the thickness in the same direction as the direction of the first filter member high is the H 1, is 0.8 times or more and 1.2 times or less, the cell separation device according to [1] or [2].

〔４〕第１フィルター部材と、第２フィルター部材の、フィルター部材収容部に収容された状態での厚さが、それぞれ、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置。   [4] The thicknesses of the first filter member and the second filter member in the state of being accommodated in the filter member accommodating portion are in the range of 3 mm or more and 20 mm or less, respectively [1] to [3] The cell separation device according to any one of the above.

〔５〕第１フィルター、及び第２フィルターにおけるフィルター部材収容部の断面積が、それぞれ１６０ｍｍ２以上１４００ｍｍ２以下である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置。 [5] The cell separation device according to any one of [1] to [4], wherein the cross-sectional areas of the filter member housing portions in the first filter and the second filter are 160 mm 2 or more and 1400 mm 2 or less, respectively.

〔６〕不織布を構成する繊維が、ポリエステル、ナイロン、及びポリオレフィンからなる群より選択される少なくとも１種の樹脂を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置。   [6] The cell separation device according to any one of [1] to [5], wherein the fibers constituting the nonwoven fabric include at least one resin selected from the group consisting of polyester, nylon, and polyolefin.

〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の細胞分離装置を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液から、顆粒球の少なくとも一部と、赤血球の少なくとも一部とを除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する方法であって、
液体導入口から第１フィルター内に粗細胞含有液を導入し、第１フィルターが備える液体導出口から第１ろ液を導出させることと、
液体導入口から第２フィルター内に第１ろ液を導入し、第２フィルターが備える液体導出口から第２ろ液を導出させて、第１ろ液内の単核球を、第２フィルター部材に捕捉させることと、
第２フィルターが備える液体導出口から、第２フィルター内に回収液を導入して、第２フィルター部材に捕捉された単核球を回収液に遊離させて、細胞含有液を生じさせることと、
細胞含有液を、第２フィルターが備える液体導入口から回収することと、
を含む、細胞含有液を取得する方法。 [7] Using the cell separation device according to any one of [1] to [6], at least a part of granulocytes from a crude cell-containing solution containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells. And a method for obtaining a cell-containing solution containing mononuclear cells while removing at least a part of red blood cells,
Introducing the crude cell-containing liquid into the first filter from the liquid inlet and letting out the first filtrate from the liquid outlet provided in the first filter;
The first filtrate is introduced into the second filter from the liquid inlet, the second filtrate is led out from the liquid outlet provided in the second filter, and the mononuclear sphere in the first filtrate is converted into the second filter member. To capture
Introducing a recovery liquid into the second filter from the liquid outlet provided in the second filter, releasing the mononuclear cells captured by the second filter member into the recovery liquid, and generating a cell-containing liquid;
Recovering the cell-containing liquid from the liquid inlet provided in the second filter;
A method for obtaining a cell-containing solution, comprising:

〔８〕細胞含有液に含まれる赤血球数が、粗細胞含有液に含まれる赤血球数の１０％以下である、〔７〕に記載の細胞含有液を取得する方法。   [8] The method for obtaining the cell-containing solution according to [7], wherein the number of red blood cells contained in the cell-containing solution is 10% or less of the number of red blood cells contained in the crude cell-containing solution.

〔９〕細胞含有液に含まれる顆粒球数が、粗細胞含有液に含まれる顆粒球数の４０％以下である、〔７〕又は〔８〕に記載の細胞含有液を取得する方法。   [9] The method for obtaining the cell-containing solution according to [7] or [8], wherein the number of granulocytes contained in the cell-containing solution is 40% or less of the number of granulocytes contained in the crude cell-containing solution.

本発明によれば、顆粒球、及び赤血球を効率的に除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる細胞分離装置と、当該細胞分離装置を用いて単核球を含む細胞含有液を取得する方法とを提供することができる。   According to the present invention, a cell separator capable of recovering mononuclear cells with good recovery efficiency while efficiently removing granulocytes and red blood cells, and a cell-containing solution containing mononuclear cells using the cell separator And a method for obtaining

細胞分離用フィルターの１例の概略を示す図である。It is a figure which shows the outline of one example of the filter for cell separation. フィルター部材を収容した状態の細胞分離用フィルターの１例についての断面を示す図である。It is a figure which shows the cross section about one example of the filter for cell separation of the state which accommodated the filter member. 細胞分離装置の回路の概略を示す図である。It is a figure which shows the outline of the circuit of a cell separation apparatus.

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。   Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.

≪細胞分離装置≫
細胞分離装置は、第１フィルターと、第２フィルターとを備える。
なお、細胞分離フィルターは、本発明の目的を阻害しない範囲で、第１フィルターの上流側、第１フィルターと第２フィルターとの間、又は第２フィルターの下流側等に、第１フィルター、及び第２フィルター以外の他のフィルターを備えていてもよい。細胞分離装置が他のフィルターを備える場合、他のフィルターの数は、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されず、１つであっても２以上の任意の数であってもよい。
以下、第１フィルター、第２フィルター、又は他のフィルターとして使用し得る、細胞分離用フィルター装置について説明する。 ≪Cell separation device≫
The cell separation device includes a first filter and a second filter.
In addition, the cell separation filter is a range that does not impair the object of the present invention, the first filter on the upstream side of the first filter, between the first filter and the second filter, or on the downstream side of the second filter, and the like. A filter other than the second filter may be provided. When the cell separation device includes other filters, the number of other filters is not particularly limited as long as the object of the present invention is not impaired, and may be one or any number of two or more.
Hereinafter, a filter device for cell separation that can be used as the first filter, the second filter, or another filter will be described.

〔細胞分離用フィルター〕
以下、細胞分離用フィルターの好ましい一例について、図１、図２（ａ）、及び図２（ｂ）を用いて説明する。
細胞分離用フィルター１は、細胞分離用フィルター容器２と、フィルター部材１１とを備える。
細胞分離用フィルター容器２は、液体導入口９と、液体導出口１０と、フィルター部材収容部３とを有する。
以下、細胞分離用フィルター容器について、単に「容器」とも記す。
かかる細胞分離用フィルター容器２内に、不織布からなるフィルター部材１１を収容することにより、細胞分離用フィルター１が構成される。細胞分離用フィルター容器２内に収容されたフィルター部材１１において、液体導入口９側の面が第１面であり、液体導出口１０側の面が第２面である。
以下、細胞分離用フィルターについて単に「フィルター」とも記す。 [Cell separation filter]
Hereinafter, a preferable example of the filter for cell separation will be described with reference to FIGS. 1, 2 (a), and 2 (b).
The cell separation filter 1 includes a cell separation filter container 2 and a filter member 11.
The cell separation filter container 2 has a liquid inlet 9, a liquid outlet 10, and a filter member housing 3.
Hereinafter, the filter container for cell separation is also simply referred to as “container”.
By accommodating a filter member 11 made of a nonwoven fabric in the cell separation filter container 2, the cell separation filter 1 is configured. In the filter member 11 accommodated in the cell container 2 for cell separation, the surface on the liquid inlet 9 side is the first surface and the surface on the liquid outlet 10 side is the second surface.
Hereinafter, the cell separation filter is also simply referred to as “filter”.

上記の細胞分離用フィルター容器２の構成について以下説明する。   The configuration of the cell separation filter container 2 will be described below.

（細胞分離用フィルター容器）
例えば、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示される、容器２の好ましい態様では、円筒形状の容器２が、円筒状の収容部３と、その上部及び下部にある開口部に蓋をすることができるノズル付内蓋４、５と、収容部３とノズル付内蓋４、５とを固定するための環状外蓋６、７とで構成される。 (Filter container for cell separation)
For example, in a preferred embodiment of the container 2 shown in FIGS. 1, 2 (a), and 2 (b), the cylindrical container 2 is covered with a cylindrical housing portion 3 and openings at the upper and lower portions thereof. And the inner lids 4 and 5 with nozzles, and the annular outer lids 6 and 7 for fixing the housing 3 and the inner lids 4 and 5 with nozzles.

フィルター部材収容部３は、両端に開口を有する筒状の部材である。フィルター部材収容部３は、後述するフィルター部材１１を収容する。
以下、フィルター部材収容部３について、収容部３とも記す。 The filter member accommodating portion 3 is a cylindrical member having openings at both ends. The filter member accommodating portion 3 accommodates a filter member 11 described later.
Hereinafter, the filter member housing 3 is also referred to as a housing 3.

収容部３の形状は、両端に開口を有する筒状である。筒状について、径方向の断面の形状は円形であっても、多角形のような円形以外の形状であってもよい。
収容部３の形状の好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１ｍＬ以上４００ｍＬ以下程度、内径０．１ｃｍ以上１５ｃｍ以下程度、厚さ０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下程度の円筒状や、一片の長さ０．１ｃｍ以上２０ｃｍ以下程度の正方形又は長方形で、厚さが０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下程度の四角柱状等が挙げられる。 The shape of the accommodating portion 3 is a cylindrical shape having openings at both ends. About a cylinder shape, the shape of the cross section of radial direction may be circular, or shapes other than circular shapes, such as a polygon, may be sufficient.
Preferable specific examples of the shape of the housing part 3 include, for example, a cylindrical shape having a capacity of about 0.1 mL to 400 mL, an inner diameter of about 0.1 cm to 15 cm, and a thickness of about 0.1 cm to 5 cm, or a length of one piece. Examples thereof include a square or rectangular shape having a thickness of about 0.1 cm to 20 cm and a square column shape having a thickness of about 0.1 cm to 5 cm.

良好な回収率で単核球を回収しやすい点からは、細胞分離用フィルター１の容量は４ｍＬ以上５０ｍＬ以下が好ましく、１０ｍＬ以上２５ｍＬ以下がより好ましい。
なお、細胞分離用フィルター１の容量は、筒状の収容部３と、筒状の収容部の両端を封鎖する二つの面とで囲まれる空間の容量である。図１、図２（ａ）、及び図２（ｂ）に示される細胞分離用フィルター１では、細胞分離用フィルター１の容量は、液体導入口９を含むノズル付き内蓋４と、液体導出口１０を含むノズル付き内蓋５と、収容部３とで囲まれる内部空間の容量である。
また、同じく、良好な回収率で単球を回収しやすい点からは、収容部３に収容されたフィルター部材１１のろ過面の面積が、１６０ｍｍ２以上１４００ｍｍ２以下であるのが好ましく、３００ｍｍ２以上７２０ｍｍ２以下であるのがより好ましい。 From the viewpoint of easily collecting mononuclear cells with a good recovery rate, the volume of the cell separation filter 1 is preferably 4 mL or more and 50 mL or less, and more preferably 10 mL or more and 25 mL or less.
In addition, the capacity | capacitance of the filter 1 for cell separation is a capacity | capacitance of the space enclosed by the cylindrical accommodating part 3 and the two surfaces which block the both ends of a cylindrical accommodating part. In the cell separation filter 1 shown in FIGS. 1, 2 (a), and 2 (b), the capacity of the cell separation filter 1 includes an inner lid 4 with a nozzle including a liquid inlet 9, and a liquid outlet. 10 is a capacity of an internal space surrounded by the inner lid 5 with a nozzle including 10 and the accommodating portion 3.
Similarly, the area of the filtration surface of the filter member 11 accommodated in the accommodating portion 3 is preferably 160 mm 2 or more and 1400 mm 2 or less from the viewpoint of easily collecting monocytes with a good recovery rate, and 300 mm 2. More preferably, it is 720 mm 2 or less.

ノズル付内蓋４、５には、容器２内部に液体を導入するための液体導入口９と、容器２から液体を排出するための液体導出口１０とがそれぞれ設けられている。
液体導入口９及び液体導出口１０は液体を送液するためのチューブを接続しやすくするために、ノズルで構成されている。前記ノズルの形状や大きさについては特に限定はない。
なお、便宜上、液体導入口９、液体導出口１０と称するが、フィルター１の使用時には、液体導入口９から液体が排出されてもよく、液体導出口１０から液体が導入されてもよい。 The inner lids 4 and 5 with nozzles are respectively provided with a liquid inlet 9 for introducing liquid into the container 2 and a liquid outlet 10 for discharging the liquid from the container 2.
The liquid inlet 9 and the liquid outlet 10 are constituted by nozzles in order to easily connect a tube for feeding a liquid. The shape and size of the nozzle are not particularly limited.
For convenience, the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10 are referred to, but when the filter 1 is used, the liquid may be discharged from the liquid inlet 9 or the liquid may be introduced from the liquid outlet 10.

ノズル付内蓋４、５は栓型になっており、収容部３の内腔に押し込むことで、収容部３の内面と接して固定される。
ノズル付内蓋４、５と収容部３との接触面にはシール８が設けられるのが好ましい。このシール８により、ノズル付内蓋４、５と収容部３との気密性を確実にして外部からの微生物等の侵入を防ぐことができる。シール８としては、例えば、図２（ｂ）に示すように、ノズル付内蓋４、５の表面に設けた溝の周囲に樹脂製のパッキン（Ｏリング）を設けることが挙げられるが、シール８の配置や構成については特に限定はない。 The inner lids 4 and 5 with nozzles are plug-shaped, and are fixed in contact with the inner surface of the housing portion 3 by being pushed into the inner cavity of the housing portion 3.
It is preferable that a seal 8 is provided on the contact surface between the inner lids 4, 5 with nozzles and the accommodating portion 3. The seal 8 can ensure the airtightness between the inner lids 4 and 5 with the nozzle and the accommodating portion 3 and prevent the entry of microorganisms and the like from the outside. As the seal 8, for example, as shown in FIG. 2B, a resin packing (O-ring) may be provided around a groove provided on the surface of the inner lids 4 and 5 with nozzles. There is no limitation in particular about arrangement | positioning and a structure of 8.

ノズル付き内蓋４、５は、収容部３に直接固定できるようにしてもよい（図示せず）。ノズル付き内蓋４、５と収容部３とが接触する面に、例えば、ネジを設けることでノズル付き内蓋４、５と収容部３とを固定することができる。この場合、図２（ｂ）に示す環状外蓋６、７は不要となる。
また、ノズル付き内蓋４は、フィルター１に取り付けた場合にフィルター部材１１と対向する面に、１つ又は複数の第１突起１２ａを備えていてもよい。第１突起１２ａは、ノズル付き内蓋４において、収容部３の内壁面近傍に設けられた第１環状支持体１２ｂにより支持されるのが好ましい。
ノズル付き内蓋５も、ノズル付き内蓋４と同様に、第２突起１３ａと、第２環状支持体１３ｂとを備えていてもよい。
ノズル付き内蓋４，５が、それぞれ、第１突起１２ａ、第１環状支持体１２ｂ、及び第２突起１３ａ、及び第２環状支持体１３ｂを備える場合、収容部３内で、フィルター部材１１が、第１突起１２ａ、第１環状支持体１２ｂと第２突起１３ａ、第２環状支持体１３ｂとで挟み込まれてしっかりと支持される。
これによって、収容部３内で、フィルター部材１１が弛んだ箇所を、粗細胞含有液、回収液、細胞含有液等がショートパスすることを防ぎつつ、細胞含有液を取得する操作を行うことができる。 The inner lids 4 and 5 with nozzles may be directly fixed to the housing 3 (not shown). The inner lids 4 and 5 with the nozzle and the housing part 3 can be fixed by, for example, providing a screw on the surface where the inner lids 4 and 5 with the nozzle and the housing part 3 come into contact. In this case, the annular outer lids 6 and 7 shown in FIG.
In addition, the inner lid 4 with the nozzle may include one or a plurality of first protrusions 12 a on the surface facing the filter member 11 when attached to the filter 1. The first protrusion 12a is preferably supported by the first annular support 12b provided in the vicinity of the inner wall surface of the accommodating portion 3 in the inner lid 4 with the nozzle.
Similarly to the inner lid 4 with the nozzle, the inner lid 5 with the nozzle may include a second protrusion 13a and a second annular support 13b.
When the inner lids 4 and 5 with nozzles are each provided with a first projection 12a, a first annular support 12b, a second projection 13a, and a second annular support 13b, the filter member 11 is contained in the accommodating portion 3. The first protrusion 12a, the first annular support 12b, the second protrusion 13a, and the second annular support 13b are sandwiched and supported firmly.
Thus, an operation of acquiring the cell-containing liquid can be performed while preventing the crude cell-containing liquid, the recovery liquid, the cell-containing liquid, and the like from short-passing through the portion where the filter member 11 is loosened in the storage unit 3. it can.

容器２内では、フィルター部材１１として不織布からなる細胞分離材が積層されて充填される。例えば、繊維径の異なる細胞分離材を２層以上積層したフィルターとすることにより、細胞を捕捉する箇所が分散され、目詰まりの発生が抑制されるとともに、フィルターからの細胞の分離・回収も効率的に行うことができる。なお、繊維径が同じ細胞分離材が連続して積層された部分は、積層された細胞分離材の枚数によらず１層として扱う。   In the container 2, cell separators made of nonwoven fabric are stacked and filled as the filter member 11. For example, by using a filter in which two or more cell separation materials with different fiber diameters are stacked, the locations where cells are trapped are dispersed, clogging is suppressed, and separation and recovery of cells from the filter are also efficient. Can be done automatically. Note that a portion in which cell separation materials having the same fiber diameter are successively laminated is treated as one layer regardless of the number of laminated cell separation materials.

また、容器２には、液体導入口９側に独立して細胞分離材内に留まっている非付着細胞を洗浄するための洗浄液導入口を設けたり（図示せず）、液体導出口１０側に独立して細胞分離材に捕捉された細胞を回収するための細胞回収液導入口（細胞含有液及び洗浄液の流れとは逆方向から細胞回収液を流すため）を設けてもよい（図示せず）。   In addition, the container 2 may be provided with a cleaning liquid inlet (not shown) for cleaning non-adherent cells remaining in the cell separation material independently on the liquid inlet 9 side, or on the liquid outlet 10 side. A cell recovery solution inlet for recovering the cells captured by the cell separation material independently (for flowing the cell recovery solution in the direction opposite to the flow of the cell-containing solution and the washing solution) may be provided (not shown). ).

容器２は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては、具体的には非反応性ポリマー、生体親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー（ＡＢＳ）等のアクリルニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。容器の材料として有用な金属材料（生体親和性金属、合金）としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。特に好ましくは、耐滅菌製を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。   The container 2 can be made using any structural material. Specific examples of the structural material include non-reactive polymers, biocompatible metals, alloys, and glass. Non-reactive polymers include acrylonitrile polymers such as acrylonitrile butadiene styrene terpolymer (ABS); polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers of tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene, and halogenated polymers such as polyvinyl chloride. Polyamide, polyimide, polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene, polymethylpentene and the like. Metal materials (biocompatible metals, alloys) useful as container materials include stainless steel, titanium, platinum, tantalum, gold, and alloys thereof, as well as gold-plated alloy iron, platinum-plated alloy iron, cobalt chromium alloy, and nitride. Examples thereof include titanium-coated stainless steel. Particularly preferred is a material having sterilization resistance, and specific examples include polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polyimide, polycarbonate, polysulfone, and polymethylpentene.

（フィルター部材）
フィルター部材１１としては繊維で構成される不織布が好ましく用いられる。 (Filter member)
As the filter member 11, a non-woven fabric composed of fibers is preferably used.

フィルター部材１１である不織布を構成する繊維の材質としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、及び低密度ポリエチレン等）、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル系樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート等）、ナイロン（例えば、脂肪族ポリアミド、芳香族ポリアミド（アラミド））、ポリウレタン、ポリイミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、フェノール樹脂、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等を挙げることができる。中でも、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、レーヨン、ナイロン、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート等の高分子を好適に用いることができる。これらの材質の中では、ふるい効果、細胞との接着性の面から、ポリエステル、ナイロン、及びポリオレフィンからなる群より選択される少なくとも１種の樹脂が好ましい。フィルター部材１１は、これらの材質のうち、単一の材質からなってもよいし、複数の材質を組み合わせた複合材からなってもよい。   Examples of the material of the fibers constituting the nonwoven fabric that is the filter member 11 include polyolefin (for example, polypropylene, polyethylene, high-density polyethylene, and low-density polyethylene), polyester, vinyl chloride, polyvinyl alcohol, vinylidene chloride, rayon, vinylon. , Polystyrene, acrylic resin (eg, polymethyl methacrylate, polyhydroxyethyl methacrylate, polyacrylonitrile, polyacrylic acid, polyacrylate, etc.), nylon (eg, aliphatic polyamide, aromatic polyamide (aramid)), polyurethane, polyimide , Cupra, kevlar, carbon, phenolic resin, tetron, pulp, hemp, cellulose, kenaf, chitin, chitosan, glass, cotton and the like. Among these, polymers such as polyester, polypropylene, acrylic, rayon, nylon, polybutylene terephthalate, and polyethylene terephthalate can be suitably used. Among these materials, at least one resin selected from the group consisting of polyester, nylon, and polyolefin is preferable from the viewpoint of sieving effect and adhesion to cells. The filter member 11 may be made of a single material among these materials, or may be made of a composite material obtained by combining a plurality of materials.

フィルター部材１１の平均繊維径としては、目的の細胞の種類に合わせて適宜選択すればよく特に限定はない。   The average fiber diameter of the filter member 11 may be appropriately selected according to the type of target cells, and is not particularly limited.

フィルター部材１１の性能をより向上させるために、フィルター部材１１に親水化処理を行ってもよい。
親水化処理により、目的とする必要細胞以外の細胞における非特異的な捕捉の抑制、細胞含有液を偏り無くフィルター部材１１中に通過させる性能の向上、必要細胞の回収効率向上等の効果が付与され得る。 In order to further improve the performance of the filter member 11, the filter member 11 may be subjected to a hydrophilic treatment.
Hydrophilic treatment gives effects such as suppression of non-specific capture in cells other than the necessary necessary cells, improvement in performance of allowing the cell-containing liquid to pass through the filter member 11 without bias, and improvement in recovery efficiency of necessary cells. Can be done.

親水化処理方法としては、
水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有するポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法；
水溶性高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等）を吸着させる方法；
疎水性膜に親水性高分子を固定する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）；
電子線照射する方法；
含水状態で細胞分離フィルターに放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法；
乾燥状態で熱処理することにより親水性高分子を不溶化し固定する方法；
疎水性膜の表面をスルホン化する方法；
親水性高分子と疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法；
アルカリ（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）の水溶液による処理により膜表面に親水基を付与する方法；
疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法；又は、
界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。 As a hydrophilic treatment method,
A method of adsorbing a water-soluble polyhydric alcohol, a polymer having a hydroxyl group, a cation group or an anion group, or a copolymer thereof (for example, hydroxyethyl methacrylate, dimethylaminoethyl methacrylate, or a copolymer thereof);
A method for adsorbing water-soluble polymers (polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc.);
A method of immobilizing a hydrophilic polymer on the hydrophobic membrane (for example, a method of chemically bonding a hydrophilic monomer to the surface);
Electron beam irradiation method;
A method of crosslinking and insolubilizing a hydrophilic polymer by irradiating a cell separation filter with water in a water-containing state;
A method of insolubilizing and fixing the hydrophilic polymer by heat treatment in a dry state;
A method of sulfonating the surface of a hydrophobic membrane;
A method of forming a membrane from a mixture of a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer dope;
A method of imparting a hydrophilic group to the membrane surface by treatment with an aqueous solution of alkali (NaOH, KOH, etc.);
A method in which the hydrophobic porous membrane is immersed in alcohol, treated with a water-soluble polymer aqueous solution, dried, and insolubilized by heat treatment or radiation; or
Examples thereof include a method of adsorbing a substance having a surface active action.

親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、多糖類（セルロース、キチン、キトサン等）、水溶性多価アルコール等が挙げられる。   Examples of the hydrophilic polymer include polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, ethylene-vinyl alcohol copolymer, polyhydroxyethyl methacrylate, polysaccharide (cellulose, chitin, chitosan, etc.), water-soluble polyhydric alcohol, and the like.

疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、アクリル、ウレタン、ビニロン、ナイロン、ポリエステル等が挙げられる。   Examples of the hydrophobic polymer include polystyrene, polyvinyl chloride, polyolefin (polyethylene, polypropylene, etc.), acrylic, urethane, vinylon, nylon, polyester, and the like.

さらに除去、又は回収目的とする細胞のフィルター部材１１への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や、目的とする幹細胞上に発現されている特異的抗原に対する抗体を、フィルター部材上に固定化してもよい。なお、第１フィルター内のフィルター部材１１には、粗細胞含有液内の除去されるべき細胞が捕捉され、第２フィルター内のフィルター部材１１には、後述する第１ろ液内の回収されるべき細胞（単核球）が捕捉される。細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ１４０ａ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、固定化方法としては、例えば、一般的なタンパク質の固定化方法である、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、アルキル化法、架橋法等の方法を任意に用いることができる。   Further, in order to improve the adherence of cells to be removed or collected to the filter member 11, cell adherent proteins or antibodies against specific antigens expressed on the target stem cells are applied on the filter member. You may fix to. The filter member 11 in the first filter captures the cells to be removed in the crude cell-containing liquid, and the filter member 11 in the second filter collects in the first filtrate described later. Power cells (mononuclear cells) are captured. Examples of cell adhesion proteins include fibronectin, laminin, vitronectin, collagen and the like. Examples of antibodies include, but are not limited to, CD73, CD90, CD105, CD166, CD140a and the like. Examples of immobilization methods include general protein immobilization methods such as cyanogen bromide activation method, acid azide derivative method, condensation reagent method, diazo method, alkylation method, and crosslinking method. It can be used arbitrarily.

〔細胞分離装置の具体的構成〕
以下、細胞分離装置の具体的構成について、図３を参照しつつ説明する。
前述の通り、細胞分離装置１００は、第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２と、を備える。
第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２として用いられるフィルターについて、後述する所定の条件を満たす限りにおいて特に限定されない。第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２としては、それぞれ、前述の細胞分離用フィルターが好適に使用される。
なお、細胞分離装置１００における、第１フィルター１０１の数と、第２フィルター１０２の数とは、それぞれ特に限定されず、１であっても、２以上の複数であってもよい。
第１フィルター１０１の数、及び／又は第２フィルター１０２の数が複数である場合、第１フィルター１０１、及び／又は第２フィルター１０２は、直列に配置されても、並列に配置されてもよい。
細胞分離装置１００の組み立てや、細胞分離装置１００を使用する際の通液操作が容易であることから、細胞分離装置１００は、第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２とをそれぞれ１つずつ備えるのが好ましい。 [Specific configuration of cell separation device]
Hereinafter, a specific configuration of the cell separation device will be described with reference to FIG.
As described above, the cell separation device 100 includes the first filter 101 and the second filter 102.
The filters used as the first filter 101 and the second filter 102 are not particularly limited as long as predetermined conditions described later are satisfied. As the first filter 101 and the second filter 102, the aforementioned cell separation filter is preferably used.
Note that the number of the first filters 101 and the number of the second filters 102 in the cell separation device 100 are not particularly limited, and may be one or two or more.
When the number of the first filters 101 and / or the number of the second filters 102 is plural, the first filter 101 and / or the second filter 102 may be arranged in series or in parallel. .
Since the assembly of the cell separation device 100 and the liquid passing operation when using the cell separation device 100 are easy, the cell separation device 100 includes one each of the first filter 101 and the second filter 102. Is preferred.

第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２とは、それぞれ、液体導入口９と、液体導出口１０と、フィルター部材収容部３とを備える。
第１フィルター１０１の液体導出口１０と、第２フィルター１０２の液体導入口９とは、流路１０３で接続されている。 The first filter 101 and the second filter 102 each include a liquid inlet 9, a liquid outlet 10, and a filter member housing 3.
The liquid outlet 10 of the first filter 101 and the liquid inlet 9 of the second filter 102 are connected by a flow path 103.

細胞分離装置１００には、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む後述する粗細胞含有液が、第１フィルター１０１から第２フィルター１０２に向けて流れるように供給される。
より具体的には、第１フィルター１０１の液体導入口９に供給された粗細胞含有液が、第１フィルター１０１の液体導出口１０から第１ろ液として導出され、第１ろ液が第２フィルター１０２の液体導入口９に供給された後、第２フィルター１０２の液体導出口１０から第２ろ液が導出される。
そして、第２ろ液の第２フィルター１０２からの導出後、第２フィルター１０２が備える液体導出口１０から、第２フィルター１０２内に回収液が導入される。これにより、第２フィルター部材１１ｂに捕捉された単核球が回収液に遊離され、単核球を含む細胞含有液が生じる。
第２フィルター１０２内に生成した単核球を含む細胞含有液は、第２フィルター１０２が備える液体導入口９を経由して、所望の細胞含有液回収容器１０６に回収される。細胞含有液回収容器１０６の具体的な形態としては、シリンジやバッグ等が挙げられる。 The cell separation device 100 is supplied with a crude cell-containing liquid, which will be described later, including mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells so as to flow from the first filter 101 toward the second filter 102.
More specifically, the crude cell-containing liquid supplied to the liquid inlet 9 of the first filter 101 is led out from the liquid outlet 10 of the first filter 101 as the first filtrate, and the first filtrate is second. After being supplied to the liquid inlet 9 of the filter 102, the second filtrate is led out from the liquid outlet 10 of the second filter 102.
Then, after the second filtrate is derived from the second filter 102, the recovered liquid is introduced into the second filter 102 from the liquid outlet 10 provided in the second filter 102. As a result, the mononuclear cells captured by the second filter member 11b are released into the recovery liquid, and a cell-containing liquid containing mononuclear cells is generated.
The cell-containing liquid containing mononuclear cells generated in the second filter 102 is collected in a desired cell-containing liquid collection container 106 via the liquid inlet 9 provided in the second filter 102. Specific examples of the cell-containing liquid collection container 106 include a syringe and a bag.

流路１０３は、例えば、第１フィルター１０１の液体導出口１０、及び第２フィルターの液体導入口９に対してそれぞれ着脱自在な管であってよい。かかる管は、外力により容易に変形しない硬質の管であってもよく、フレキシブルな管であってもよい。流路１０３の内径や長さは、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。
この場合、第１フィルター１０１から第１ろ液を供給する際には、第１フィルター１０１と第２フィルター１０２とが流路１０３により連結された状態で細胞分離装置１００が使用される。
そして、第２フィルター１０２の液体導出口１０から回収液を第２フィルター内に導入した後に、単核球を含む細胞含有液を、第２フィルター１０２が備える液体導入口９を経由して回収する場合、流路１０３を、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０、及び第２フィルター１０２が備える液体導入口９の少なくとも一方から取り外す。
流路１０３が、第２フィルター１０２が備える液体導入口９から取り外される場合、第２フィルター１０２が備える液体導入口９から単核球を含む細胞含有液を回収することができる。
流路１０３が、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から取り外され、第２フィルター１０２が備える液体導入口９には接続されている場合、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から取り外された流路１０３の端部から単核球を含む細胞含有液を回収することができる。 The flow path 103 may be, for example, a pipe that is detachable from the liquid outlet 10 of the first filter 101 and the liquid inlet 9 of the second filter. Such a tube may be a hard tube that is not easily deformed by an external force, or may be a flexible tube. The inner diameter and length of the flow path 103 are not particularly limited as long as the object of the present invention is not impaired.
In this case, when supplying the first filtrate from the first filter 101, the cell separation device 100 is used in a state where the first filter 101 and the second filter 102 are connected by the flow path 103.
Then, after the recovery liquid is introduced into the second filter from the liquid outlet 10 of the second filter 102, the cell-containing liquid containing mononuclear cells is recovered via the liquid inlet 9 provided in the second filter 102. In this case, the flow path 103 is removed from at least one of the liquid outlet 10 provided in the first filter 101 and the liquid inlet 9 provided in the second filter 102.
When the flow path 103 is removed from the liquid inlet 9 provided in the second filter 102, the cell-containing liquid containing mononuclear cells can be collected from the liquid inlet 9 provided in the second filter 102.
When the flow path 103 is removed from the liquid outlet 10 provided in the first filter 101 and is connected to the liquid inlet 9 provided in the second filter 102, the flow path 103 is removed from the liquid outlet 10 provided in the first filter 101. The cell-containing liquid containing mononuclear cells can be recovered from the end of the flow channel 103.

流路１０３の途中には、クッション槽（不図示）が設けられてもよい。かかるクッション槽が設けられる場合、クッション槽に一旦第１ろ液を貯留した後に、所望する給液速度に調整して第１ろ液を第２フィルター１０２に給液することが容易である。
クッション槽の流路１０３との接続部分付近には、第１フィルター１０１側と、第２フィルター１０２側とにそれぞれ弁（不図示）が設けられるのが好ましい。
クッション槽の第１フィルター１０１側に弁があると、第１ろ液のクッション槽への流入量を必要に応じて調製したり、第１ろ液のクッション槽への流入を遮断したりすることができる。
また、クッション槽の第２フィルター１０２側に弁があると、第１ろ液の第２フィルター１０２への供給速度を必要に応じて調整したり、第１ろ液の第２フィルター１０２への供給を停止したりすることができる。
クッション槽の第２フィルター１０２側には、さらにポンプ（不図示）を設けてもよい。ポンプを設ける場合、さらに第２フィルター１０２への第１ろ液の供給量の制御が容易である。 A cushion tank (not shown) may be provided in the middle of the flow path 103. When such a cushion tank is provided, it is easy to supply the first filtrate to the second filter 102 after the first filtrate is temporarily stored in the cushion tank and then adjusted to a desired liquid supply speed.
It is preferable that valves (not shown) are provided on the first filter 101 side and the second filter 102 side in the vicinity of the connection portion with the flow path 103 of the cushion tank.
If there is a valve on the first filter 101 side of the cushion tank, adjust the flow rate of the first filtrate into the cushion tank as needed, or block the flow of the first filtrate into the cushion tank. Can do.
If there is a valve on the second filter 102 side of the cushion tank, the supply rate of the first filtrate to the second filter 102 is adjusted as necessary, or the first filtrate is supplied to the second filter 102. Can be stopped.
A pump (not shown) may be further provided on the second filter 102 side of the cushion tank. When a pump is provided, it is easier to control the supply amount of the first filtrate to the second filter 102.

流路１０３の途中には、図３に図示されるように三方以上の多方弁１０４が設けられるのが好ましい。図３中では、多方弁１０４として三方弁を図示する。
流路１０３の途中に多方弁１０４を設ける場合、多方弁１０４の動作によって、液の流通方向を容易に切り替えることができる。このため、流路１０３を、第１フィルター１０１、及び／又は第２フィルター１０２から取り外すことなく、単核球を含む細胞含有液を、第２フィルター１０２から容易に回収することができる。 In the middle of the flow path 103, it is preferable to provide three or more multi-way valves 104 as shown in FIG. In FIG. 3, a three-way valve is illustrated as the multi-way valve 104.
When the multi-way valve 104 is provided in the middle of the flow path 103, the flow direction of the liquid can be easily switched by the operation of the multi-way valve 104. For this reason, the cell-containing liquid containing mononuclear cells can be easily recovered from the second filter 102 without removing the flow path 103 from the first filter 101 and / or the second filter 102.

上記の単核球を含む細胞含有液を取得する過程において、第１フィルター１０１では第１フィルター部材１１ａに顆粒球等を捕捉させることによって、主に顆粒球が除去される。一方で、単核球と赤血球とは、第１フィルター１０１を通過しやすい。そして、第２フィルター１０２では、赤血球等が第２フィルター１０２内の第２フィルター部材１１ｂを通過しやすい一方で、単核球が第２フィルター部材１１ｂに効率よく捕捉される。
以上の通り、第１フィルター１０１において主に顆粒球を除去し、第１フィルター１０１と第２フィルター１０２の双方とについて赤血球を除去し、単核球を選択性良く回収することができる。 In the process of obtaining the cell-containing liquid containing the mononuclear cells, the first filter 101 mainly removes granulocytes by causing the first filter member 11a to capture granulocytes and the like. On the other hand, mononuclear cells and red blood cells easily pass through the first filter 101. In the second filter 102, red blood cells and the like easily pass through the second filter member 11b in the second filter 102, while mononuclear cells are efficiently captured by the second filter member 11b.
As described above, granulocytes are mainly removed in the first filter 101, red blood cells are removed from both the first filter 101 and the second filter 102, and mononuclear cells can be recovered with high selectivity.

第１フィルター１０１が備えるフィルター部材収容部３には、通気度が１０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第１フィルター部材１１ａが収容される。
第１フィルター部材１１ａは、収容前の第１フィルター部材１１ａの厚さＴ１ ０が、収容後の第１フィルター部材１１ａの厚さＴ１ １の１．０倍以上１．２倍以下、好ましくは１．０倍超１．０５倍以下であるように第１フィルター１０１が備えるフィルター部材収容部３に収容される。
つまり、第１フィルター部材１１ａは、第１フィルター１０１内において圧縮されないか、ほとんど圧縮されない。 The filter member housing 3 provided in the first filter 101 houses the first filter member 11a made of a nonwoven fabric having an air permeability of 10 mL / cm 2 / sec to 45 mL / cm 2 / sec.
The first filter member 11a is a thickness T 1 0 of the first filter member 11a of the front housing, 1.2 times 1.0 times the thickness T 1 1 of the first filter member 11a after receiving less, preferably Is accommodated in the filter member accommodating portion 3 provided in the first filter 101 so as to be greater than 1.0 times and less than 1.05 times.
That is, the first filter member 11a is not compressed or hardly compressed in the first filter 101.

単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む後述する粗細胞含有液を、上記の通気度を有する第１フィルター部材１１ａが、圧縮されないか、ほとんど圧縮されない状態で内部に収容された第１フィルター１０１を通過させることによって、単核球を過度に捕捉することなく、顆粒球の少なくとも一部が第１フィルター部材１１ａに捕捉される。   The first filter member 11a having the above-mentioned air permeability is stored in a first filter member 11a having the above-described air permeability in a state in which the first filter member 11a containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells, which will be described later, is not compressed or hardly compressed. By passing through the filter 101, at least a part of the granulocytes is captured by the first filter member 11a without excessively capturing mononuclear cells.

第１フィルター部材１１ａの通気度は、１２ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が好ましく、１５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下がより好ましく、２０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上３５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が特に好ましい。
なお、第１フィルター部材１１ａの通気度は、ＪＩＳ Ｌ １９１３に準拠した方法（フラジール形法）によって測定された値である。 Air permeability of the first filter member 11a is preferably 12mL / cm 2 / sec or more 43mL / cm 2 / sec or less, more preferably 15mL / cm 2 / sec or more 40mL / cm 2 / sec, 20mL / cm 2 / It is particularly preferred that it is at least 35 mL / cm 2 / sec.
The air permeability of the first filter member 11a is a value measured by a method (fragile method) based on JIS L 1913.

第１フィルター部材１１ａは、１枚の不織布からなっても、積層された２枚以上の不織布からなってもよい。入手が容易であることや、積層される枚数を調整することによって、第１フィルター部材１１ａを所望する厚さ又は所望する圧縮状態に調整しやすいことから、第１フィルター部材１１ａは、積層された２枚以上の不織布からなるのが好ましい。   The first filter member 11a may be made of one non-woven fabric or two or more laminated non-woven fabrics. Since the first filter member 11a can be easily adjusted to a desired thickness or a desired compressed state by adjusting the number of layers to be easily obtained, the first filter member 11a is laminated. It is preferable that it consists of two or more nonwoven fabrics.

第１フィルター部材１１ａのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さは、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内であるのが好ましく、５ｍｍ以上１５ｍｍ以下の範囲内であるのがより好ましく、７ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲内であるのが特に好ましい。
第１フィルター部材１１ａのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さが、上記の範囲内であると、顆粒球等を所望する程度に除去しつつ、最終的に回収すべき単核球を過度に第１フィルター部材１１ａに捕捉させることなく第１ろ液を生成させることができる。
なお、フィルター部材収容部３に収容された第１フィルター部材１１ａの主面に凹凸がある場合、第１フィルター部材１１ａの一方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置と、第１フィルター部材１１ａの他方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置との間の距離を、第１フィルター部材１１ａのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さとする。 The thickness of the first filter member 11a in the state accommodated in the filter member accommodating portion 3 is preferably in the range of 3 mm to 20 mm, more preferably in the range of 5 mm to 15 mm, and 7 mm. It is particularly preferable that it is within the range of 10 mm or less.
If the thickness of the first filter member 11a accommodated in the filter member accommodating portion 3 is within the above range, the mononuclear to be finally recovered while removing granulocytes and the like to a desired extent The first filtrate can be generated without causing the first filter member 11a to capture the sphere excessively.
When the main surface of the first filter member 11a accommodated in the filter member accommodating portion 3 is uneven, the position closest to the center of the filter member accommodating portion 3 on one surface of the first filter member 11a, The distance between the other surface of the first filter member 11a and the position closest to the center of the filter member accommodating portion 3 is defined as the thickness in the state accommodated in the filter member accommodating portion 3 of the first filter member 11a.

フィルター部材収容部３に収容後の第１フィルター部材１１ａの厚さＴ１ １は、第１フィルター部材１１ａが収容されたフィルター部材収容部３の、第１フィルター部材１１ａの厚さ方向と同方向の高さＨ１の、０．８倍以上１．２倍以下が好ましく、０．９５倍以上１．０５倍以下がより好ましい。
Ｔ１ １とＨ１とが上記の関係を満たす場合、第１フィルター部材１１ａに顆粒球を良好に捕捉させ、粗細胞含有液から顆粒球を良好に除去しやすい。 The thickness T 1 1 of the first filter member 11a after accommodating the filter member accommodating portion 3, the filter member accommodating portion 3 first filter member 11a is housed, the thickness in the same direction as the direction of the first filter member 11a the height H 1, preferably 0.8 times or more and 1.2 times or less, more preferably 0.95 times to 1.05 times or less.
When T 1 1 and H 1 satisfy the above relationship, the first filter member 11a can easily capture granulocytes and easily remove the granulocytes from the crude cell-containing solution.

第２フィルター１０２が備えるフィルター部材収容部３には、通気度が３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下、好ましくは２０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下、より好ましくは２５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第２フィルター部材１１ｂが収容される。
第２フィルター部材１１ｂは、収容前の第２フィルター部材１１ｂの厚さＴ２ ０が、収容後の第２フィルター部材１１ｂの厚さＴ２ １の１．０倍以上３．０倍以下、好ましくは１．３倍以上３．０倍以下、より好ましくは１．５倍以上３．０倍以下、さらにより好ましくは１．５倍以上２．７倍以下、特に好ましくは１．７倍以上２．７倍以下であるように、第２フィルター１０２が備えるフィルター部材収容部３に収容される。
第２フィルター１０２において、第２フィルター部材１１ｂに所望する程度に単核球を捕捉させるためには、第２フィルター部材１１ｂは、第２フィルター１０２内において、ある程度の倍率（例えば１．３倍以上）で厚さ方向に圧縮されてフィルター部材収容部３に収容差されるのが好ましい。 The filter member housing 3 provided in the second filter 102 has an air permeability of 3 mL / cm 2 / sec or more and 50 mL / cm 2 / sec or less, preferably 20 mL / cm 2 / sec or more and 50 mL / cm 2 / sec or less. The second filter member 11b made of a nonwoven fabric that is preferably 25 mL / cm 2 / sec or more and 45 mL / cm 2 / sec or less is accommodated.
In the second filter member 11b, the thickness T 2 0 of the second filter member 11b before housing is 1.0 to 3.0 times the thickness T 2 1 of the second filter member 11b after housing, preferably Is 1.3 times to 3.0 times, more preferably 1.5 times to 3.0 times, even more preferably 1.5 times to 2.7 times, and particularly preferably 1.7 times to 2 times. It is accommodated in the filter member accommodating part 3 with which the 2nd filter 102 is provided so that it may be 7 times or less.
In the second filter 102, in order for the second filter member 11b to capture the mononuclear sphere to a desired degree, the second filter member 11b has a certain magnification (for example, 1.3 times or more) in the second filter 102. ) And compressed in the thickness direction and accommodated in the filter member accommodating portion 3.

顆粒球の少なくとも一部が粗細胞含有液から除去された、単核球と赤血球とを含む第１ろ液を、上記の通気度を有する第２フィルター部材１１ｂが、所定の状態で内部に収容された第２フィルター１０２を通過させることによって、赤血球の大部分を液体導出口から排出させつつ、単核球を第２フィルター部材１１ｂに良好に捕捉させることができる。   The second filter member 11b having the above air permeability contains the first filtrate containing mononuclear cells and erythrocytes from which at least a part of the granulocytes has been removed from the crude cell-containing solution in a predetermined state. By allowing the second filter 102 to pass through, the mononuclear spheres can be well captured by the second filter member 11b while discharging most of the red blood cells from the liquid outlet.

第２フィルター部材１１ｂの通気度は、２２ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４８ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が好ましく、２５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下がより好ましく、３０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下が特に好ましい。
なお、第２フィルター部材１１ｂの通気度は、第１フィルター部材１１ａと同様、ＪＩＳ Ｌ １９１３に準拠した方法（フラジール形法）によって測定された値である。 Air permeability of the second filter member 11b is preferably not more than 22 mL / cm 2 / sec or more 48 mL / cm 2 / sec, more preferably not more than 25 mL / cm 2 / sec or more 45mL / cm 2 / sec, 30mL / cm 2 / It is particularly preferable that it is at least 40 mL / cm 2 / sec.
The air permeability of the second filter member 11b is a value measured by a method (Fragile method) in accordance with JIS L 1913, as with the first filter member 11a.

第２フィルター部材１１ｂは、第１フィルター部材１１ａと同様に、１枚の不織布からなっても、積層された２枚以上の不織布からなってもよい。入手が容易であることや、積層される枚数を調整することによって、第２フィルター部材１１ｂを所望する厚さ又は所望する圧縮状態に調整しやすいことから、第２フィルター部材１１ｂは、積層された２枚以上の不織布からなるのが好ましい。   Similarly to the first filter member 11a, the second filter member 11b may be made of one nonwoven fabric or two or more laminated nonwoven fabrics. Since the second filter member 11b can be easily adjusted to a desired thickness or a desired compressed state by adjusting the number of layers to be easily obtained, the second filter member 11b is laminated. It is preferable that it consists of two or more nonwoven fabrics.

第２フィルター部材１１ｂのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さは、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内であるのが好ましく、５ｍｍ以上１５ｍｍ以下の範囲内であるのがより好ましく、５ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲内であるのが特に好ましい。
第２フィルター部材１１ｂのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さが、上記の範囲内であると、第２フィルター１０２において、良好に赤血球を通過させつつ、単核球を良好に第２フィルター部材１１ｂに捕捉させやすい。
なお、フィルター部材収容部３に収容された第２フィルター部材１１ｂの主面に凹凸がある場合、第２フィルター部材１１ｂの一方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置と、第２フィルター部材１１ｂの他方の面の、フィルター部材収容部３の中央に最も近い位置との間の距離を、第２フィルター部材１１ｂのフィルター部材収容部３に収容された状態での厚さとする。 The thickness of the second filter member 11b in the state accommodated in the filter member accommodating portion 3 is preferably in the range of 3 mm to 20 mm, more preferably in the range of 5 mm to 15 mm. It is particularly preferable that it is within the range of 10 mm or less.
When the thickness of the second filter member 11b accommodated in the filter member accommodating portion 3 is within the above range, the second filter 102 allows the mononuclear cells to pass well while allowing the red blood cells to pass well. It is easy to be captured by the second filter member 11b.
In addition, when the main surface of the second filter member 11b accommodated in the filter member accommodating portion 3 has irregularities, the position closest to the center of the filter member accommodating portion 3 on one surface of the second filter member 11b, 2 The distance between the other surface of the filter member 11b and the position closest to the center of the filter member accommodating portion 3 is the thickness in the state accommodated in the filter member accommodating portion 3 of the second filter member 11b.

第２フィルター部材１１ｂを構成する不織布に含まれる繊維の平均繊維径は１μｍ以上５μｍ以下であるのが好ましい。不織布の繊維径がかかる範囲内であると、単核球をより高い回収率で回収しやすい。   The average fiber diameter of the fibers contained in the nonwoven fabric constituting the second filter member 11b is preferably 1 μm or more and 5 μm or less. When the fiber diameter of the nonwoven fabric is within this range, mononuclear spheres can be easily recovered with a higher recovery rate.

以上説明した細胞分離装置１００を用いることにより、顆粒球、及び赤血球を除去しつつ、良好な回収効率で単核球を回収できる。   By using the cell separation apparatus 100 described above, it is possible to recover mononuclear cells with good recovery efficiency while removing granulocytes and erythrocytes.

≪単核球を含む細胞含有液の取得方法≫
単核球を含む細胞含有液の取得方法は、前述の細胞分離装置を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液から、顆粒球の少なくとも一部と、赤血球の少なくとも一部とを除去しつつ、単核球を含む細胞含有液を取得する方法である。
かかる方法は、
液体導入口から第１フィルター内に粗細胞含有液を導入し、第１フィルターが備える液体導出口から第１ろ液を導出させることと、
液体導入口から第２フィルター内に第１ろ液を導入し、第２フィルターが備える液体導出口から第２ろ液を導出させて、第１ろ液内の単核球を、第２フィルター部材に捕捉させることと、
第２フィルターが備える液体導出口から、第２フィルター内に回収液を導入して、第２フィルター部材に捕捉された単核球を回収液に遊離させて、細胞含有液を生じさせることと、
細胞含有液を、第２フィルターが備える液体導入口から回収することと、
を含む。 ≪Method for obtaining cell-containing solution containing mononuclear cells≫
A method for obtaining a cell-containing solution containing mononuclear cells is obtained by using the above-described cell separation apparatus, from a crude cell-containing solution containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells, at least a part of granulocytes, and red blood cells In this method, a cell-containing solution containing mononuclear cells is obtained while removing at least a part of the cell.
Such a method is
Introducing the crude cell-containing liquid into the first filter from the liquid inlet and letting out the first filtrate from the liquid outlet provided in the first filter;
The first filtrate is introduced into the second filter from the liquid inlet, the second filtrate is led out from the liquid outlet provided in the second filter, and the mononuclear sphere in the first filtrate is converted into the second filter member. To capture
Introducing a recovery liquid into the second filter from the liquid outlet provided in the second filter, releasing the mononuclear cells captured by the second filter member into the recovery liquid, and generating a cell-containing liquid;
Recovering the cell-containing liquid from the liquid inlet provided in the second filter;
including.

以下、液体導入口から第１フィルター内に粗細胞含有液を導入し、第１フィルターが備える液体導出口から第１ろ液を導出させることを、「第１ろ液導出」とも記す。
液体導入口から第２フィルター内に第１ろ液を導入し、第２フィルターが備える液体導出口から第２ろ液を導出させて、第１ろ液内の単核球を、第２フィルター部材に捕捉させることを、「単核球捕捉」とも記す。
第２フィルターが備える液体導出口から、第２フィルター内に回収液を導入して、第２フィルター部材に捕捉された単核球を回収液に遊離させて、細胞含有液を生じさせることを、「細胞含有液生成」とも記す。
細胞含有液を、第２フィルターが備える液体導入口から回収することを、「細胞含有液回収」とも記す。 Hereinafter, introducing the crude cell-containing liquid into the first filter from the liquid inlet and letting out the first filtrate from the liquid outlet provided in the first filter is also referred to as “first filtrate outlet”.
The first filtrate is introduced into the second filter from the liquid inlet, the second filtrate is led out from the liquid outlet provided in the second filter, and the mononuclear sphere in the first filtrate is converted into the second filter member. This is also referred to as “mononuclear cell capture”.
Introducing the recovery liquid into the second filter from the liquid outlet provided in the second filter, releasing the mononuclear cells captured by the second filter member into the recovery liquid, and generating a cell-containing liquid; Also referred to as “cell-containing fluid production”.
Collecting the cell-containing liquid from the liquid inlet provided in the second filter is also referred to as “cell-containing liquid recovery”.

以下、単核球を含む細胞含有液の取得方法が備える各工程について説明する。   Hereinafter, each process with which the acquisition method of the cell containing liquid containing a mononuclear cell is provided is demonstrated.

＜第１ろ液導出＞
第１ろ液導出では、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液を、前述の第１フィルター１０１内に液体導入口９から導入する。これにより、顆粒球の少なくとも一部が、第１フィルター１０１内の第１フィルター部材１１ａに捕捉される一方で、単核球と、赤血球の大部分は、第１ろ液として第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から導出される。 <Derivation of the first filtrate>
In the first filtrate derivation, a crude cell-containing liquid containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells is introduced into the first filter 101 from the liquid inlet 9. Thereby, at least a part of the granulocytes is captured by the first filter member 11a in the first filter 101, while most of the mononuclear cells and erythrocytes are the first filtrate as the first filtrate. It is derived from the liquid outlet 10 provided.

粗細胞含有液としては、少なくとも単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む懸濁液であれば特に限定されず用いることができる。例えば、臍帯等の生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理等をした後の懸濁液、血液や骨髄液、臍帯血、末梢血等の体液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理等の前処理をして調製された細胞懸濁液等が粗細胞含有液として例示される。これらの中でも、粗細胞含有液としては、血液及び／又は骨髄液が好ましい。
また、粗細胞含有液は、所望する種類の細胞を生体外で培養液や刺激因子等を用いて培養や増殖等をした後の懸濁液であってもよい。 The crude cell-containing solution is not particularly limited as long as it is a suspension containing at least mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells. For example, biological tissue such as the umbilical cord is subjected to enzyme treatment, crushing treatment, extraction treatment, decomposition treatment, ultrasonic treatment, etc., suspensions such as blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood, and other body fluids, blood and bone marrow Examples of the crude cell-containing liquid include cell suspensions prepared by pretreatment such as density gradient centrifugation, filtration, enzyme treatment, degradation treatment, and ultrasonic treatment. Among these, blood and / or bone marrow fluid is preferable as the crude cell-containing solution.
The crude cell-containing solution may be a suspension obtained by culturing or proliferating a desired type of cells in vitro using a culture solution or a stimulating factor.

第１フィルター１０１の液体導入口９から粗細胞含有液を導入する方法は特に限定されない。粗細胞含有液を導入する際には、典型的には、液体導入口９と液体導出口１０との間に差圧を生じさせる。差圧を生じさせる方法は、特に限定されず、粗細胞含有液を加圧させたり、重力を利用することで第１フィルター１０１内へ粗細胞含有液の導入させる方法や、液体導出口１０側を減圧して、第１フィルター１０１内へ粗細胞含有液を吸入する方法等が挙げられる。
このようにして、第１フィルター１０１内に粗細胞含有液を供給し、粗細胞含有液を第１フィルター部材１１ａと接触させて、顆粒球等を第１フィルター部材１１ａに捕捉させつつ、単核球や赤血球等を液体導出口１０側へ通過させる。その結果、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から、顆粒球の少なくとも一部が除去され、単核球と赤血球とを含む第１ろ液が導出される。 The method for introducing the crude cell-containing liquid from the liquid inlet 9 of the first filter 101 is not particularly limited. When the crude cell-containing liquid is introduced, typically, a differential pressure is generated between the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10. The method for generating the differential pressure is not particularly limited, and a method of pressurizing the crude cell-containing liquid or introducing the crude cell-containing liquid into the first filter 101 by using gravity, or the liquid outlet 10 side. And a method of sucking the crude cell-containing liquid into the first filter 101.
In this way, the crude cell-containing liquid is supplied into the first filter 101, the crude cell-containing liquid is brought into contact with the first filter member 11a, and granule spheres are captured by the first filter member 11a, while mononuclear. A sphere, a red blood cell, or the like is passed to the liquid outlet 10 side. As a result, at least part of the granulocytes is removed from the liquid outlet 10 provided in the first filter 101, and a first filtrate containing mononuclear cells and red blood cells is derived.

差圧の程度としては、第１フィルター１０１に破損が生じたり、粗細胞含有液に含まれる細胞の過度の破砕が生じたりしない程度であれば、特に限定されない。好ましい差圧の範囲としては、２００ｋＰａ以下が好ましい。差圧は、液体導入口９及び液体導出口１０に三方活栓を介して圧力センサーを付けることによって測定することができる。   The degree of the differential pressure is not particularly limited as long as it does not cause damage to the first filter 101 or excessive crushing of cells contained in the crude cell-containing liquid. A preferable differential pressure range is 200 kPa or less. The differential pressure can be measured by attaching a pressure sensor to the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10 via a three-way cock.

粗細胞含有液を、第１フィルター１０１内に供給する際の流速は、例えば、８．０×１０−３ｍＬ／秒以上６．７×１０−１ｍＬ／秒以下が好ましく、１．７×１０−２ｍＬ／秒以上３．３×１０−１ｍＬ／秒以下がより好ましく、２．８×１０−２ｍＬ／秒以上１．７×１０−１ｍＬ／秒以下が特に好ましい。 The flow rate when supplying the crude cell-containing solution into the first filter 101 is preferably, for example, 8.0 × 10 −3 mL / second or more and 6.7 × 10 −1 mL / second or less, and 1.7 ×. 10 −2 mL / second or more and 3.3 × 10 −1 mL / second or less is more preferable, and 2.8 × 10 −2 mL / second or more and 1.7 × 10 −1 mL / second or less is particularly preferable.

以上説明した操作は、室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。冷蔵温度下で行う場合、冷蔵された粗細胞含有液を処理することが挙げられる。粗細胞含有液の保管としては、冷蔵温度に設定した冷蔵庫による保管、ウォーターバスによる保管、及びドライアイスによる保管等が挙げられる。汎用性から冷蔵庫で保存することが好ましい。冷蔵温度としては、１℃以上６℃以下が好ましく、より好ましくは３℃以上５℃以下が好ましい。冷蔵温度が１℃未満では細胞は死滅し、６℃を超えて保存すると細菌が繁殖しコンタミネーションを起こす可能性がある。   The operation described above may be performed at room temperature or at a refrigeration temperature. When performing under refrigeration temperature, processing the refrigerated crude cell containing liquid is mentioned. Examples of storage of the crude cell-containing solution include storage by a refrigerator set at a refrigeration temperature, storage by a water bath, storage by dry ice, and the like. It is preferable to store in a refrigerator because of its versatility. The refrigeration temperature is preferably 1 ° C or higher and 6 ° C or lower, more preferably 3 ° C or higher and 5 ° C or lower. If the refrigeration temperature is less than 1 ° C, the cells die, and if the storage temperature exceeds 6 ° C, the bacteria may propagate and cause contamination.

また、第１フィルター部材１１ａの状態を整えて、顆粒球を捕捉しやすくする観点から、第１フィルター１０１内に粗細胞含有液を供給する前に、液体導入口９又は液体導出口１０から生理食塩水又は緩衝液を第１フィルター１０１内に導入し、第１フィルター部材１１ａと生理食塩水又は緩衝液とを接触させてもよい。   Further, from the viewpoint of adjusting the state of the first filter member 11a and facilitating capture of granulocytes, the physiological cell-containing liquid is supplied from the liquid inlet 9 or the liquid outlet 10 before supplying the crude cell-containing liquid into the first filter 101. A saline solution or a buffer solution may be introduced into the first filter 101, and the first filter member 11a may be brought into contact with the physiological saline solution or the buffer solution.

＜単核球捕捉＞
単核球の捕捉は、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から導出された第１ろ液を、第２フィルター１０２が備える液体導入口９から第２フィルター１０２内に導入することにより行われる。
第２フィルター１０２内の第２フィルター部材１１ｂによる単核球の捕捉は、第１フィルター１０１内の第１フィルター部材１１ａによる顆粒球の捕捉と同様にして行われる。 <Mononuclear capture>
The mononuclear sphere is captured by introducing the first filtrate derived from the liquid outlet 10 provided in the first filter 101 into the second filter 102 from the liquid inlet 9 provided in the second filter 102. .
The mononuclear cells are captured by the second filter member 11b in the second filter 102 in the same manner as the granulocytes are captured by the first filter member 11a in the first filter 101.

＜細胞含有液生成＞
細胞含有液生成では、第２フィルター１０２内に液体導出口１０から回収液を供給することで、第２フィルター部材１１ｂに捕捉された単核球を回収液中に遊離させて細胞含有液を生じさせる。
なお、第２フィルター１０２で生成した単核球を含む細胞含有液は、通常、生成後すぐに、液体導入口９を経由して回収される。 <Cell-containing fluid production>
In the production of the cell-containing liquid, the recovered liquid is supplied from the liquid outlet 10 into the second filter 102, so that the mononuclear cells captured by the second filter member 11b are released into the recovered liquid, thereby generating the cell-containing liquid. Let
In addition, the cell-containing liquid containing the mononuclear cells generated by the second filter 102 is usually collected via the liquid inlet 9 immediately after the generation.

回収液を、第２フィルター１０２内に供給する際の流速は、５ｍＬ／秒以上５０ｍＬ／秒以下が好ましく、８ｍＬ／秒以上３０ｍＬ／秒以下がより好ましく、１０ｍＬ／秒以上２５ｍＬ／秒以下が特に好ましい。このような流速で回収液を供給することにより、フィルター部材１１ｂから回収液に単核球を遊離させやすく、より高い単核球の回収率を実現しやすい。   The flow rate when the recovered liquid is supplied into the second filter 102 is preferably 5 mL / second or more and 50 mL / second or less, more preferably 8 mL / second or more and 30 mL / second or less, and particularly preferably 10 mL / second or more and 25 mL / second or less. preferable. By supplying the recovery liquid at such a flow rate, the mononuclear cells can be easily released from the filter member 11b to the recovery liquid, and a higher recovery rate of the mononuclear cells can be easily realized.

回収液は、細胞と等張である溶液であれば特に限定はないが、生理食塩液やリンゲル液等の注射溶剤として使用実績のあるものや、緩衝液、細胞培養用の培地等が挙げられる。特に、培養工程を経る際はそのまま培養が行える培地が好ましく、培養工程を経ずそのまま治療に用いる際は、生理食塩液等の点滴等に使用実績のある等張液等、安全性が保証されている回収液を使用することが好ましい。   The recovered solution is not particularly limited as long as it is a solution that is isotonic with cells, and examples thereof include those that have been used as injection solvents such as physiological saline and Ringer's solution, buffers, and culture media for cell culture. In particular, a medium that can be cultured as it is after passing through the culture step is preferable, and when it is used as it is for the treatment without passing through the culture step, safety such as an isotonic solution that has been used for infusions such as physiological saline is guaranteed. It is preferable to use the recovered liquid.

細胞含有液生成の操作は、単核球捕捉の操作と同様、室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。   The operation for producing the cell-containing liquid may be performed at room temperature or may be performed at a refrigerated temperature, similar to the operation for capturing mononuclear cells.

回収液を用いて単核球を含む細胞含有液を生じさせる前に、生理食塩水又は緩衝液を第２フィルター１０２が備える液体導入口９から導入して液体導出口１０から導出させることにより、フィルター部材１１ｂ内の夾雑成分を除去でき、これにより回収される細胞（単核球）内の不要成分を低減することができる。   Before producing a cell-containing liquid containing mononuclear cells using the collected liquid, a physiological saline or a buffer solution is introduced from the liquid inlet 9 provided in the second filter 102 and led out from the liquid outlet 10. Contaminating components in the filter member 11b can be removed, and unnecessary components in the collected cells (mononuclear cells) can thereby be reduced.

＜細胞含有液回収＞
細胞含有液回収では、細胞含有液生成で生成させた単核球を含む細胞含有液を、第２フィルター１０２内から回収する。
回収方法は特に限定されず、細胞分離装置について前述した方法により細胞含有液を回収することができる。
例えば、図３に示される細胞分離装置１００を用いる場合、流路１０３中の多方弁（三方弁）１０４を、第２フィルター１０２が備える液体導入口９と、流路１０３から分岐した枝流路１０５とが連通されるように切り替えた後、枝流路１０５の端部から単核球を含む細胞含有液を回収することができる。
この時、枝流路１０５の端部に回収専用の所定の細胞含有液回収容器１０６を接続して、単核球を含む細胞含有液を、当該細胞含有液回収容器１０６内に回収すればよい。 <Recovering cell-containing solution>
In the cell-containing liquid recovery, the cell-containing liquid containing the mononuclear cells generated by the cell-containing liquid generation is recovered from the second filter 102.
The collection method is not particularly limited, and the cell-containing solution can be collected by the method described above for the cell separation device.
For example, when the cell separation device 100 shown in FIG. 3 is used, a multi-way valve (three-way valve) 104 in the flow path 103 includes a liquid inlet 9 provided in the second filter 102 and a branch flow path branched from the flow path 103. After switching to communicate with 105, the cell-containing liquid containing mononuclear cells can be recovered from the end of the branch channel 105.
At this time, a predetermined cell-containing liquid collection container 106 dedicated for collection may be connected to the end of the branch channel 105, and the cell-containing liquid containing mononuclear cells may be collected in the cell-containing liquid collection container 106. .

上記の方法により取得された細胞含有液に含まれる赤血球数は、粗細胞含有液に含まれる赤血球数の１０％以下であるのが好ましく、７％以下であるのがより好ましく、５％以下であるのが特に好ましい。
つまり、細胞含有液を取得する際の、粗細胞含有液に対する赤血球除去率は、９０％以上が好ましく、９３％以上が好ましく、９５％以上が特に好ましい。 The number of red blood cells contained in the cell-containing solution obtained by the above method is preferably 10% or less, more preferably 7% or less, and more preferably 5% or less of the number of red blood cells contained in the crude cell-containing solution. It is particularly preferred.
That is, the red blood cell removal rate with respect to the crude cell-containing solution when obtaining the cell-containing solution is preferably 90% or more, more preferably 93% or more, and particularly preferably 95% or more.

上記の方法により取得された細胞含有液に含まれる顆粒球数は、粗細胞含有液に含まれる顆粒球数の４０％以下であるのが好ましく、３０％以下であるのがより好ましく、２０％以下であるのが特に好ましい。
つまり、細胞含有液を取得する際の、粗細胞含有液に対する顆粒球除去率は、６０％以上が好ましく、７０％以上が好ましく、８０％以上が特に好ましい。 The number of granulocytes contained in the cell-containing solution obtained by the above method is preferably 40% or less, more preferably 30% or less, and more preferably 20% of the number of granulocytes contained in the crude cell-containing solution. It is particularly preferred that
That is, the granulocyte removal rate with respect to the crude cell-containing solution when obtaining the cell-containing solution is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more.

上記の方法により取得された細胞含有液に含まれる単核球数の、粗細胞含有液に含まれる単核球数に対する比率である単核球回収率は、１５％以上が好ましく、２０％以上がより好ましく、３０％以上がさらに好ましく、５０％以上が特に好ましい。   The mononuclear cell recovery rate, which is the ratio of the number of mononuclear cells contained in the cell-containing solution obtained by the above method to the number of mononuclear cells contained in the crude cell-containing solution, is preferably 15% or more, preferably 20% or more. Is more preferable, 30% or more is further preferable, and 50% or more is particularly preferable.

以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates in detail regarding this invention, this invention is not limited only to a following example.

（実施例１〜４、及び比較例１）
第１フィルター１０１として、フィルター容量が４．９２ｍＬであり、ろ過面積５３１ｍｍ２であり、前述の高さＨ１が９ｍｍである細胞分離用フィルターを用いた。
第２フィルター１０２として、フィルター容量が３．８２ｍＬであり、ろ過面積５３１ｍｍ２であり、第１フィルター１０１における高さＨ１に相当する高さＨ２が７ｍｍである、細胞分離用フィルターを用いた。
なお、フィルター容量は、液体導入口９の開口端と、液体導出口１０の開口端との間の容積である。
第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２として、円筒状の収容部３に、丸型にカットされた、表２に記載の種類及び枚数の不織布を、表２に記載の圧縮比で充填し、収容部３の上下の開口部に、第１突起１２ａを備えるノズル付内蓋４と、第２突起１３ａを備えるノズル付き内蓋５とを差し込み、その上から環状外蓋６、７でネジ止めし、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すような構造を有する細胞分離用フィルター１を作製した。
各不織布の詳細については、表１に記す。
なお、表２に記載の第１フィルター部材１１ａの圧縮比は、収容部３に収容される前の第１フィルター部材１１ａの厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ１ ０とし、収容部３に収容された後のフィルター部材の厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ１ １とした場合の、Ｔ１ ０／Ｔ１ １の値である。
第２フィルター部材１１ｂの圧縮比は、収容部３に収容される前の第２フィルター部材１１ｂの厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ２ ０とし、収容部３に収容された後のフィルター部材の厚さ（複数の不織布の厚さの合計）をＴ２ １とした場合の、Ｔ２ ０／Ｔ２ １の値である。 (Examples 1 to 4 and Comparative Example 1)
As the first filter 101, a filter for cell separation having a filter capacity of 4.92 mL, a filtration area of 531 mm 2 , and the aforementioned height H 1 of 9 mm was used.
As the second filter 102, a filter for cell separation having a filter capacity of 3.82 mL, a filtration area of 531 mm 2 , and a height H 2 corresponding to the height H 1 of the first filter 101 is 7 mm was used. .
The filter capacity is a volume between the opening end of the liquid inlet 9 and the opening end of the liquid outlet 10.
As the first filter 101 and the second filter 102, the cylindrical housing portion 3 is cut into a round shape, and the non-woven fabric of the type and number of sheets shown in Table 2 is filled at the compression ratio shown in Table 2. The inner lid 4 with the nozzle provided with the first projection 12a and the inner lid 5 with the nozzle provided with the second projection 13a are inserted into the upper and lower openings of the accommodating portion 3, and screwed with the annular outer lids 6 and 7 from above. Thus, a cell separation filter 1 having a structure as shown in FIGS. 1, 2 (a) and 2 (b) was produced.
Details of each nonwoven fabric are shown in Table 1.
The compression ratio of the first filter member 11a according to Table 2, the thickness of the first filter member 11a before being housed in the housing portion 3 (the total thickness of the plurality of non-woven fabric) and T 1 0, It is a value of T 1 0 / T 1 1 when the thickness of the filter member after being accommodated in the accommodating portion 3 (the total thickness of the plurality of nonwoven fabrics) is T 1 1 .
Compression ratio of the second filter member 11b, the thickness of the second filter member 11b before being housed in the housing portion 3 (the total thickness of the plurality of non-woven fabric) and T 2 0, stored in the storage portion 3 This is the value of T 2 0 / T 2 1 when the thickness of the subsequent filter member (the total thickness of the plurality of nonwoven fabrics) is T 2 1 .

次に、細胞分離装置１００として、第１フィルター１０１と、第２フィルター１０２とを含む図３に示される回路を作製した。   Next, as the cell separation device 100, the circuit shown in FIG. 3 including the first filter 101 and the second filter 102 was produced.

具体的には、図３に示される回路において、第１フィルター１０１が備える液体導入口９に、三方弁１０９ａと三方弁１０９ｂとを含む分岐した流路を介して、粗細胞含有液を供給するための粗細胞含有液容器１０７と、生理食塩水等のプライミング液を供給するためのプライミング液容器１０８と、廃液容器１１０ａとを接続した。   Specifically, in the circuit shown in FIG. 3, the crude cell-containing liquid is supplied to the liquid inlet 9 provided in the first filter 101 through a branched flow path including the three-way valve 109a and the three-way valve 109b. For this purpose, a crude cell-containing liquid container 107, a priming liquid container 108 for supplying a priming liquid such as physiological saline, and a waste liquid container 110a were connected.

次いで、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０と、第２フィルター１０２が備える液体導入口９とを、流路１０３により接続した。流路１０３の途中には、多方弁（三方弁）１０４を設け、多方弁１０４に接続される枝流路１０５に細胞含有液回収容器１０６を接続した。   Next, the liquid outlet 10 provided in the first filter 101 and the liquid inlet 9 provided in the second filter 102 were connected by a flow path 103. A multi-way valve (three-way valve) 104 is provided in the middle of the flow path 103, and the cell-containing liquid collection container 106 is connected to the branch flow path 105 connected to the multi-way valve 104.

第２フィルター１０２が備える液体導出口１０には、三方弁１０９ｃを含む分岐した流路を介して、回収液を供給するための回収液容器１１１と、廃液容器１１０ｂとを接続した。   A recovery liquid container 111 for supplying a recovery liquid and a waste liquid container 110b were connected to the liquid outlet 10 included in the second filter 102 via a branched flow path including a three-way valve 109c.

上記の細胞分離装置１００を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液からの、単核球を含む細胞含有液の取得操作を実施した。なお、細胞分離装置１００に通液する液体の種類、送液する目的の手段に応じて、三方弁１０９ａ、三方弁１０９ｂ、三方弁１０９ｃ、及び多方弁１０４によって、各流路の切り替えを適宜行った。   Using the cell separation device 100 described above, an operation for obtaining a cell-containing solution containing mononuclear cells from a crude cell-containing solution containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells was performed. Depending on the type of liquid to be passed through the cell separation device 100 and the intended means for sending the liquid, the three-way valve 109a, the three-way valve 109b, the three-way valve 109c, and the multi-way valve 104 are used to appropriately switch each flow path. It was.

まず、プライミング液容器１０８に収容された生理食塩水を５０ｍＬ以上１５０ｍＬ以下程度の量用いて第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２のプライミング操作を行い、廃液容器１１０ｂに第１フィルター１０１、及び第２フィルター１０２を通過した生理食塩液を回収した。
次に、粗細胞含有液容器１０７から白血球濃厚液（ヘパリンで抗凝固したブタ血液）２０ｍＬを、第１フィルター１０１に重力を利用して通液し、第１フィルター１０１が備える液体導出口１０から第１ろ液を導出させた。その後、第１ろ液を、流路１０３を通じて、第２フィルター１０２が備える液体導入口９に供給し、第２フィルター部材１１ｂに単核球を捕捉させる一方で、赤血球等を含む第２ろ液を第２フィルター１０２が備える液体導出口１０から導出させた。第２ろ液は廃液容器１１０ｂに回収した。 First, priming operation of the first filter 101 and the second filter 102 is performed by using the physiological saline contained in the priming solution container 108 in an amount of about 50 mL to 150 mL, and the first filter 101 and the first filter 101 The physiological saline solution that passed through the two filters 102 was collected.
Next, 20 mL of a leukocyte concentrate (pig blood anticoagulated with heparin) from the crude cell-containing solution container 107 is passed through the first filter 101 using gravity, and from the liquid outlet 10 provided in the first filter 101. The first filtrate was derived. Thereafter, the first filtrate is supplied to the liquid inlet 9 provided in the second filter 102 through the flow path 103 to allow the second filter member 11b to capture mononuclear cells, while the second filtrate containing red blood cells and the like. Was led out from the liquid outlet 10 provided in the second filter 102. The second filtrate was recovered in the waste liquid container 110b.

上記操作で使用した白血球濃厚液は、ヘパリンで抗凝固したブタ血液を３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離して得たバッフィーコートより、処理する白血球数が１．０×１０９ｃｅｌｌｓ〜４．０×１０９ｃｅｌｌｓになるように調製した。 From the buffy coat obtained by centrifuging porcine blood anticoagulated with heparin at 3000 rpm for 30 minutes, the leukocyte concentrate used in the above operation has a leukocyte count of 1.0 × 10 9 cells to 4.0 × 10 6. 9 cells were prepared.

その後、プライミング液容器１０８から、第１フィルター１０１、及び流路１０３を経由して生理食塩水１００ｍＬを第２フィルター１０２に重力を利用して通液し、通過液は廃液容器１１０ｂに回収した。
最後に、回収液容器１１１としてシリンジを用いて、シリンジから回収液として生理食塩水を導入した。具体的には、生理食塩水５０ｍＬをシリンジに収容し、手押しすることで第２フィルター１０２が備える液体導出口１０より第２フィルター１０２内に生理食塩水を導入した。これにより、第２フィルター１０２内で、第２フィルター部材１１ｂに捕捉された単核球を回収液に遊離させ、単核球を含む細胞含有液を生成させた。生成した細胞含有液は、液体導入口９に、流路１０３、多方弁１０４、及び枝流路１０５を介して接続された細胞含有液回収容器１０６に回収した。 Thereafter, 100 mL of physiological saline was passed through the second filter 102 from the priming solution container 108 via the first filter 101 and the flow path 103, and the passing solution was collected in the waste solution container 110b.
Finally, using a syringe as the recovery liquid container 111, physiological saline was introduced as a recovery liquid from the syringe. Specifically, physiological saline was introduced into the second filter 102 from the liquid outlet 10 provided in the second filter 102 by storing 50 mL of physiological saline in a syringe and pressing it manually. Thereby, in the 2nd filter 102, the mononuclear cell captured by the 2nd filter member 11b was released to the collection | recovery liquid, and the cell containing liquid containing a mononuclear cell was produced | generated. The generated cell-containing liquid was recovered in a cell-containing liquid recovery container 106 connected to the liquid inlet 9 via the flow path 103, the multi-way valve 104, and the branch flow path 105.

なお、比較例１では、第１フィルター１０１内に第１フィルター部材１１ａを充填することなく試験を行った。また、比較例２では、第１フィルター１０１の液体導出口１０から導出される第１ろ液を、第２フィルター１０２に供給することなく細胞含有液として回収した。
比較例３では、通液中に、第１フィルター１０１内で目詰まりが発生したため、細胞含有液を回収できなかった。 In Comparative Example 1, the test was performed without filling the first filter member 11 a in the first filter 101. In Comparative Example 2, the first filtrate derived from the liquid outlet 10 of the first filter 101 was recovered as a cell-containing liquid without being supplied to the second filter 102.
In Comparative Example 3, since the clogging occurred in the first filter 101 during the flow, the cell-containing liquid could not be recovered.

細胞含有液、及び、粗細胞含有液に含まれる各細胞の濃度を、血球カウンター（Ｋ−４５００、シスメックス社）及びフローサイトメーター（ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ、ＢＤ社）により測定した。その後、粗細胞懸濁液と細胞含有液の体積より各細胞数を算出して、下記式：
回収率（％）＝細胞含有液中の細胞数／粗細胞含有液中の細胞数×１００
に従って、単核球回収率、顆粒球回収率、赤血球回収率をそれぞれ求めた。
そして、顆粒球回収率と、赤血球回収率とから、下記式：
顆粒球除去率（％）＝１００−顆粒球回収率
赤血球除去率（％）＝１００−赤血球回収率
に従って、顆粒球除去率と、赤血球除去率とを算出した。
なお、実施例５については、リンパ球に特異的な細胞表面マーカー（ＣＤ３）に対して蛍光標識し、上記フローサイトメーターによる解析を行うことでリンパ球回収率も求めた。
それぞれの結果を表２に示す。 The concentration of each cell contained in the cell-containing solution and the crude cell-containing solution was measured with a blood cell counter (K-4500, Sysmex) and a flow cytometer (FACS canto, BD). Thereafter, the number of each cell is calculated from the volume of the crude cell suspension and the cell-containing solution, and the following formula:
Recovery rate (%) = number of cells in cell-containing solution / number of cells in crude cell-containing solution × 100
Thus, the mononuclear cell recovery rate, granulocyte recovery rate, and red blood cell recovery rate were determined.
Then, from the granulocyte recovery rate and the red blood cell recovery rate, the following formula:
Granulocyte removal rate (%) = 100−granulocyte collection rate erythrocyte removal rate (%) = 100−red blood cell collection rate was calculated according to granulocyte removal rate and erythrocyte removal rate.
For Example 5, the cell surface marker (CD3) specific for lymphocytes was fluorescently labeled, and the lymphocyte recovery rate was also determined by analyzing with the flow cytometer.
The results are shown in Table 2.

Figure 2019024426
Figure 2019024426

Figure 2019024426
Figure 2019024426

実施例１〜５によれば、それぞれ、所定の通気度を有する不織布が、所定の状態で第１フィルター１０１及び第２フィルター１０２に充填されている細胞分離装置１００を用いる場合、良好に顆粒球と、赤血球とを除去しつつ、単核球を回収できることが分かる。   According to Examples 1 to 5, when the cell separation device 100 in which the nonwoven fabric having a predetermined air permeability is filled in the first filter 101 and the second filter 102 in a predetermined state is used, granulocytes are satisfactorily used. It can be seen that mononuclear cells can be recovered while removing red blood cells.

比較例１によれば、所定の条件を満たす第１フィルター１０１を用いることなく、第２フィルター１０２のみを用いて細胞含有液を回収する場合、顆粒球の除去が困難であることが分かる。   According to Comparative Example 1, when the cell-containing liquid is recovered using only the second filter 102 without using the first filter 101 that satisfies the predetermined condition, it is found that removal of granulocytes is difficult.

比較例２によれば、所定の条件を満たす第２フィルター１０２を用いることなく、第１フィルター１０１を通過した液を細胞含有液として回収する場合、赤血球の除去が困難であることが分かる。   According to Comparative Example 2, it is found that it is difficult to remove red blood cells when the liquid that has passed through the first filter 101 is collected as a cell-containing liquid without using the second filter 102 that satisfies a predetermined condition.

比較例３によれば、第１フィルター１０１内に充填される第１フィルター部材１１ａの圧縮比が過度に高い場合、目詰まりにより、そもそも細胞含有液の回収が困難であることが分かる。   According to Comparative Example 3, it can be seen that when the compression ratio of the first filter member 11a filled in the first filter 101 is excessively high, it is difficult to recover the cell-containing liquid in the first place due to clogging.

比較例４によれば、第２フィルター１０２内に充填される第２フィルター部材１１ｂの通気度が過度に高い場合、単核球を所望する程度に回収することが困難であることが分かる。   According to the comparative example 4, when the air permeability of the 2nd filter member 11b with which the 2nd filter 102 is filled is too high, it turns out that it is difficult to collect | recover a mononuclear sphere as desired.

１ 細胞分離用フィルター装置
２ 細胞分離用フィルター容器
３ フィルター部材収容部
４、５ ノズル付き内蓋
６、７ 環状外蓋
８ シール
９ 液体導入口
１０ 液体導出口
１１ フィルター部材
１１ａ 第１フィルター部材
１１ｂ 第２フィルター部材
１２ａ 第１突起
１２ｂ 第１環状支持体
１３ａ 第２突起
１３ｂ 第２環状支持体
１００ 細胞分離装置
１０１ 第１フィルター
１０２ 第２フィルター
１０３ 流路
１０４ 他方弁
１０５ 枝流路
１０６ 細胞含有液回収容器
１０７ 粗細胞含有液容器
１０８ プライミング液容器
１０９ａ、１０９ｂ、１０９ｃ 三方弁
１１０ａ、１１０ｂ 廃液容器
１１１ 回収液容器 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Cell separation filter apparatus 2 Cell separation filter container 3 Filter member accommodating part 4, 5 Inner lid with nozzle 6, 7 Annular outer lid 8 Seal 9 Liquid inlet 10 Liquid outlet 11 Filter member 11a First filter member 11b First 2 filter member 12a first protrusion 12b first annular support 13a second protrusion 13b second annular support 100 cell separation device 101 first filter 102 second filter 103 flow path 104 other valve 105 branch flow path 106 cell-containing liquid recovery Container 107 Crude cell-containing liquid container 108 Priming liquid container 109a, 109b, 109c Three-way valve 110a, 110b Waste liquid container 111 Recovery liquid container

Claims (9)

第１フィルターと、第２フィルターと、を備える細胞分離装置であって、
前記第１フィルターと、前記第２フィルターとが、それぞれ、液体導入口と、液体導出口と、フィルター部材収容部とを備え、
前記第１フィルターの液体導出口と、前記第２フィルターの液体導入口とが、流路で接続されており、
前記第１フィルターが備える前記フィルター部材収容部に、通気度が１０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上４５ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第１フィルター部材が、収容前の前記第１フィルター部材の厚さＴ１ ０が、収容後の前記第１フィルター部材の厚さＴ１ １の１．０倍以上１．２倍以下であるように収容され、
前記第２フィルターが備える前記フィルター部材収容部に、通気度が３ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以上５０ｍＬ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である不織布からなる第２フィルター部材が、収容前の前記第２フィルター部材の厚さＴ２ ０が、収容後の前記第２フィルター部材の厚さＴ２ １の１．０倍以上３．０倍以下であるように収容されている、細胞分離装置。 A cell separation device comprising a first filter and a second filter,
Each of the first filter and the second filter includes a liquid inlet, a liquid outlet, and a filter member accommodating portion.
The liquid outlet of the first filter and the liquid inlet of the second filter are connected by a flow path;
The first filter member made of a non-woven fabric having an air permeability of 10 mL / cm 2 / sec or more and 45 mL / cm 2 / sec or less is provided in the filter member housing portion provided in the first filter. The thickness T 1 0 is accommodated so that the thickness T 1 1 of the first filter member after accommodation is 1.0 times or more and 1.2 times or less;
The second filter member made of a nonwoven fabric having an air permeability of 3 mL / cm 2 / sec or more and 50 mL / cm 2 / sec or less is provided in the filter member housing portion of the second filter. the thickness T 2 0 is accommodated to be below 3.0 times 1.0 times or more the thickness T 2 1 of the second filter member after receiving, cell separation device. 前記第２フィルター部材を構成する不織布に含まれる繊維の平均繊維径が１μｍ以上５μｍ以下である、請求項１に記載の細胞分離装置。   The cell separation device according to claim 1, wherein an average fiber diameter of fibers contained in the nonwoven fabric constituting the second filter member is 1 µm or more and 5 µm or less. 前記フィルター部材収容部に収容後の前記第１フィルター部材の厚さＴ１ １が、前記第１フィルター部材が収容された前記フィルター部材収容部の、前記第１フィルター部材の厚さ方向と同方向の高さＨ１の、０．８倍以上１．２倍以下である、請求項１又は２に記載の細胞分離装置。 The thickness T 1 1 of the first filter member after being accommodated in the filter member accommodating portion is the same as the thickness direction of the first filter member of the filter member accommodating portion in which the first filter member is accommodated. The cell separation device according to claim 1 , wherein the height H 1 is 0.8 times or more and 1.2 times or less. 前記第１フィルター部材と、前記第２フィルター部材の、前記フィルター部材収容部に収容された状態での厚さが、それぞれ、３ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲内である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞分離装置。   The thickness of the said 1st filter member and the said 2nd filter member in the state accommodated in the said filter member accommodating part is in the range of 3 mm or more and 20 mm or less, respectively. 2. The cell separation device according to item 1. 前記第１フィルター、及び前記第２フィルターにおけるフィルター部材収容部の断面積が、それぞれ１６０ｍｍ２以上１４００ｍｍ２以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞分離装置。 The cell separation device according to any one of claims 1 to 4, wherein a cross-sectional area of a filter member housing portion in each of the first filter and the second filter is 160 mm 2 or more and 1400 mm 2 or less. 前記不織布を構成する繊維が、ポリエステル、ナイロン、及びポリオレフィンからなる群より選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞分離装置。   The cell separation device according to any one of claims 1 to 5, wherein the fibers constituting the nonwoven fabric include at least one resin selected from the group consisting of polyester, nylon, and polyolefin. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分離装置を用いて、単核球と、顆粒球と、赤血球とを含む粗細胞含有液から、前記顆粒球の少なくとも一部と、前記赤血球の少なくとも一部とを除去しつつ、前記単核球を含む細胞含有液を取得する方法であって、
前記液体導入口から前記第１フィルター内に前記粗細胞含有液を導入し、前記第１フィルターが備える前記液体導出口から第１ろ液を導出させることと、
前記液体導入口から前記第２フィルター内に前記第１ろ液を導入し、前記第２フィルターが備える前記液体導出口から第２ろ液を導出させて、前記第１ろ液内の前記単核球を、前記第２フィルター部材に捕捉させることと、
前記第２フィルターが備える前記液体導出口から、前記第２フィルター内に回収液を導入して、前記第２フィルター部材に捕捉された前記単核球を前記回収液に遊離させて、前記細胞含有液を生じさせることと、
前記細胞含有液を、前記第２フィルターが備える前記液体導入口から回収することと、
を含む、前記細胞含有液の取得方法。 Using the cell separation device according to any one of claims 1 to 6, from a crude cell-containing solution containing mononuclear cells, granulocytes, and red blood cells, at least a part of the granulocytes, and the red blood cells A method of obtaining a cell-containing solution containing the mononuclear cells while removing at least a part of
Introducing the crude cell-containing liquid into the first filter from the liquid inlet and deriving the first filtrate from the liquid outlet provided in the first filter;
The first filtrate is introduced from the liquid inlet into the second filter, the second filtrate is led out from the liquid outlet provided in the second filter, and the single nucleus in the first filtrate is introduced. Causing the second filter member to capture a sphere;
Introducing the recovery liquid into the second filter from the liquid outlet provided in the second filter to release the mononuclear cells captured by the second filter member into the recovery liquid, thereby containing the cells Producing liquid,
Recovering the cell-containing liquid from the liquid inlet provided in the second filter;
A method for obtaining the cell-containing solution. 前記細胞含有液に含まれる赤血球数が、前記粗細胞含有液に含まれる赤血球数の１０％以下である、請求項７に記載の前記細胞含有液を取得する方法。   The method for obtaining the cell-containing solution according to claim 7, wherein the number of red blood cells contained in the cell-containing solution is 10% or less of the number of red blood cells contained in the crude cell-containing solution. 前記細胞含有液に含まれる顆粒球数が、前記粗細胞含有液に含まれる顆粒球数の４０％以下である、請求項７又は８に記載の前記細胞含有液を取得する方法。   The method for obtaining the cell-containing solution according to claim 7 or 8, wherein the number of granulocytes contained in the cell-containing solution is 40% or less of the number of granulocytes contained in the crude cell-containing solution.
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