JP2019006774A - 植物成長促進剤 - Google Patents
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Abstract
Description
そうしたなか、環境保護の観点から有機肥料の注目が高まっている。近年、アミノ酸の一種であるプロリンが花芽形成促進剤(特許文献1)として、バリン、ロイシンがストレス耐性付与剤(特許文献2)として、それぞれ報告されている。一方、アミノ酸が連なったペプチドでは植物の生理活性を司る特定の受容体に作用することができるため、生理活性制御効果が非常に高いと期待され、Stomagenが報告されている(非特許文献1)。さらに、蛋白質を分解したペプチドであるSiapton(R)も上市されている(非特許文献2及び3)。
しかしながら、上記stomagenは気孔密度が向上し、農作物の収穫量が向上するものの、乾燥に弱くなることが懸念される。また、Siapton(R)のペプチドでは収穫量の向上には十分な効果が発揮できるが、外部環境からのストレスには耐性を示さず、外部環境によっては収穫量向上が見込めないため、さらに有用な農業資材用ペプチドの開発が求められている。
<ペプチド(A)>
本発明の植物成長促進剤(X)に含まれるペプチド(A)は、グルタミン酸(Glu)とプロリン(Pro)とを構成アミノ酸として含むペプチドであって、構成アミノ酸数が2〜50個である農業資材用ペプチドである。グルタミン酸は植物中のTCA回路で作用する酵素を効果的に活性化し、窒素源の吸収を促進することで、植物の生育の促進に寄与すると考えられる。一方、プロリンは細胞膜に対する浸透圧保護剤、蛋白質、酵素、細胞膜の変性保護材として寄与すると考えられる。
その他のアミノ酸(am)としては、例えば、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システィン(Cys)、グルタミンGln)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リシン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、バリン(Val)が挙げられる。
本発明の植物の生産方法は、前記植物成長促進剤(X)を使用したものである。その使用方法は、好適には、前記の形態のものを、前記の方法により使用する。
(i)組換え大腸菌作製
目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換することで組換え大腸菌を作製する。
(ii−1)発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養する。培養は寒天培地上で通常15〜43℃で3〜72時間行う。
(ii−2)培養に用いる培地を121℃、20分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で培養した組み換え細菌を本培養する。通常15〜43℃で12〜72時間行う。
(iii−1)培地中に分泌されたペプチドは、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
(iii−2)ペプチドを含む培地は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜おこなうにことよって分離精製される。
作物重量は、植物成長促進剤(X)で土壌処理する工程以外は同一条件で栽培した実施例及び比較例の現物重量又は乾燥重量を測定することで、その増加量を算出することができる。増加量は30%以上が好ましく、35%以上がより好ましく、40%以上が更に好ましい。
また、それぞれの作物を70度で5日間乾燥させその後の重量を測定する(乾燥重量)。
作物重量(現物重量)増加量(%)=〔(対象試料−ブランク)/(ブランク)〕×100
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(対象試料の乾燥重量−ブランクの乾燥重量)/(ブランクの乾燥重量)〕×100
○ペプチド(A−1)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro配列ペプチドを発現する大腸菌(α−1)を作製した。次に、大腸菌(α−1)をLB培養液(バクトトリプトン10g/L、イーストエキストラクト5g/L、NaCl10g/L、アンピシリン100mg/L)1mlに白金耳で植菌して37℃で一夜振とう培養を行った後、遠心機を用いて集菌し、集菌体の大腸菌(α−1)を得た。続いて、集菌体の大腸菌(α−1)を、100mg/L アンピシリン、0.1mM IPTG及びプロテアーゼ阻害剤ミックス(和光純薬(株)製))0.1mlを含有するTB培養液(Difco社)1mlに植菌し、37℃16時間振とう培養を行った。遠心分離機(5,000G、10分)によって集菌を行った後、集菌体を緩衝液(50mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl)に懸濁して超音波破砕(200W、10分)を行った。特開2011−217671号公報中の実施例記載の方法に準じて、ペプチド(A−1)を生産した。
生産したペプチドの量はSDS−PAGEにより解析して、Glu Pro配列であるペプチド(A−1)のバンドを定量した。蒸留水(大塚製薬社製)を用いて1g/Lペプチド溶液に調製し、以降の実験に用いた。
○ペプチド(A−2)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Pro配列ペプチドを発現する大腸菌(α−2)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、Glu Pro Pro配列であるペプチド(A−2)を得た。
○ペプチド(A−3)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Glu配列ペプチドを発現する大腸菌(α−3)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−3)を得た。
○ペプチド(A−4)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Ser Pro 配列ペプチドを発現する大腸菌(α−4)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−4)を得た。
○ペプチド(A−5)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ser Pro Glu
配列ペプチドを発現する大腸菌(α−5)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−5)を得た。
○ペプチド(A−6)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Ala Met Lys Leu Ser Phe Lys Ala配列ペプチド(1)を発現する大腸菌(α−6)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−6)を得た。
○ペプチド(A−7)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Phe Lys Pro Ala Ser Glu Met Ala Leu Lys配列ペプチド(2)を発現する大腸菌(α−7)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−7)を得た。
○ペプチド(A−8)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Glu Pro Ser Lys Tyr Ala Thr His配列ペプチド(3)を発現する大腸菌(α−8)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−8)を得た。
○ペプチド(A−9)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Glu Pro Glu Pro Tyr Ala Thr His配列ペプチド(4)を発現する大腸菌(α−9)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−9)を得た。
○ペプチド(A−10)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro配列ペプチド(5)を発現する大腸菌(α−10)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−10)を得た。
○ペプチド(A−11)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Glu Pro Glu Pro Glu Pro Pro Pro Glu配列ペプチド(6)を発現する大腸菌(α−11)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−11)を得た。
○ペプチド(A−12)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Gly Met Asn Lys His Leu Thr Tyr Lys Ser His Asn Phe Lys Met Gly Lys Thr配列ペプチド(7)を発現する大腸菌(α−12)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−12)を得た。
○ペプチド(A−13)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Tyr Leu Gly Lys Met Thr Glu Lys Met Gly Lys Asn Thr Pro Phe Ser Lys His His Asn配列ペプチド(8)を発現する大腸菌(α−13)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−13)を得た。
○ペプチド(A−14)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Pro Gly Met Asn Lys His Leu Thr Tyr Lys Ser His Asn Phe Lys Met Gly Lys Thr Gly Met Asn Lys His Leu Thr Tyr Lys Ser His Phe Lys Met Gly Lys Asn Phe Lys Met Gly Lys Thr Gly Met Asn Phe Lys Met Ser配列ペプチド(9)を発現する大腸菌(α−14)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A−14)を得た。
○ペプチド(A’−1)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ser Ser Ser配列ペプチドを発現する大腸菌(α’−1)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A’−1)を得た。
○ペプチド(A’−2)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Glu Ser Ser配列ペプチドを発現する大腸菌(α’−2)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A’−2)を得た。
○ペプチド(A’−3)の作製
特開2012−5457号公報中の実施例記載の方法に準じて、Pro Ser Ser配列ペプチドを発現する大腸菌(α’−3)を作製した。
それ以降は製造例1と同じ操作を行い、ペプチド(A’−3)を得た。
<試験培地Aの調製>
30cm×20cm×20cmのプラスチックス製のプランターに砂質土壌(川砂)
5kgを入れた。
砂質土壌8.3kgに化学肥料(窒素:リン酸:カリ=1:1:1)0.3kgを加え十分に混合した土壌を砂質土壌の入ったプランターの上に積層し、1000gの水道水を灌水して試験培地Aを作成した。なお、ペプチドを表1に示す濃度となるように添加した。結果を表1に示す。
試験培地Aにキュウリ、大根、ホウレンソウ、イネを播種した。各作物について12株ずつ用意し、室温が25℃で照度が2000ルクスの場所(ハウス内)で試験を行った。3日おきに100gの水道水を灌水し、14日間の各植物の生育状況(12株の平均値)を作物重量として評価した。
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(各実施例における乾燥重量−比較例1(ブランク)の乾燥重量)/(比較例1(ブランクの乾燥重量)〕×100
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(比較例1以外の各比較例における乾燥重量−比較例1(ブランク)の乾燥重量)/(比較例1(ブランクの乾燥重量)〕×100
外部ストレスとして、試験培地Aおよび3日おきに灌水する100gの水道水に、塩化ナトリウム1wt%を含んだ高塩条件下での植物生育状況を確認した。塩濃度以外は<実施例1〜14、比較例1〜4>と同様の条件で植物を栽培し、作物重量を評価した。なお、ペプチドを表2に示す濃度となるように添加した。結果を表2に示す。
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(各実施例における乾燥重量−比較例5(ブランク)の乾燥重量)/(比較例5(ブランクの乾燥重量)〕×100
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(比較例5以外の各比較例における乾燥重量−比較例5(ブランク)の乾燥重量)/(比較例5(ブランクの乾燥重量)〕×100
外部ストレスとして育苗用のビニールハウス内の室温を36℃に調整した、高温条件下での植物生育状況を確認した。温度条件以外は<実施例21〜34、比較例21>と同様の条件で植物を栽培し、作物重量を評価した。なお、ペプチドを表3に示す濃度となるように添加した。結果を表3に示す。
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(各実施例における乾燥重量−比較例9(ブランク)の乾燥重量)/(比較例9(ブランクの乾燥重量)〕×100
作物重量(乾燥重量)増加量(%)=〔(比較例9以外の各比較例における乾燥重量−比較例9(ブランク)の乾燥重量)/(比較例9(ブランクの乾燥重量)〕×100
Claims (3)
- グルタミン酸(Glu)とプロリン(Pro)とを構成アミノ酸として含み、構成アミノ酸数が2個〜50個であるペプチド(A)を含有する植物成長促進剤(X)。
- 前記環境外部ストレスが、塩、温度、酸化および干ばつからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項1に記載の植物成長促進剤。
- 請求項1又は2に記載の植物成長促進剤を使用した植物の生育方法。
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