JP2019006774A - 植物成長促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 植物の成長を促進するとともに、外部ストレスへの耐性も付与することができる農業資材用ペプチド（Ａ）を含有する植物成長促進剤（Ｘ）を提供する。【解決手段】 グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）とを構成アミノ酸として含むペプチドであって、構成アミノ酸数が２〜５０個であるペプチドを含有する植物成長促進剤；ペプチドを使用した植物の生育方法。また、ペプチドは、塩、温度、酸化および干ばつ等の環境外部ストレスに対する耐性付与剤として好適に使用できる。【選択図】なし
Description
本発明はペプチドを含む植物成長促進剤に関する。
現在の農業現場では、肥料を土壌に散布することが必要である。肥料は一定の効果を得やすい化学化合物を用いることが主流であるが、近年では、農業で用いられている化学化合物の大部分が植物内に取り込まれずに、土壌あるいは海水を汚染するといった問題が生じている。
そうしたなか、環境保護の観点から有機肥料の注目が高まっている。近年、アミノ酸の一種であるプロリンが花芽形成促進剤（特許文献１）として、バリン、ロイシンがストレス耐性付与剤（特許文献２）として、それぞれ報告されている。一方、アミノ酸が連なったペプチドでは植物の生理活性を司る特定の受容体に作用することができるため、生理活性制御効果が非常に高いと期待され、Stomagenが報告されている（非特許文献１）。さらに、蛋白質を分解したペプチドであるSiapton(R)も上市されている（非特許文献２及び３）。
しかしながら、上記stomagenは気孔密度が向上し、農作物の収穫量が向上するものの、乾燥に弱くなることが懸念される。また、Siapton(R)のペプチドでは収穫量の向上には十分な効果が発揮できるが、外部環境からのストレスには耐性を示さず、外部環境によっては収穫量向上が見込めないため、さらに有用な農業資材用ペプチドの開発が求められている。
そうしたなか、環境保護の観点から有機肥料の注目が高まっている。近年、アミノ酸の一種であるプロリンが花芽形成促進剤（特許文献１）として、バリン、ロイシンがストレス耐性付与剤（特許文献２）として、それぞれ報告されている。一方、アミノ酸が連なったペプチドでは植物の生理活性を司る特定の受容体に作用することができるため、生理活性制御効果が非常に高いと期待され、Stomagenが報告されている（非特許文献１）。さらに、蛋白質を分解したペプチドであるSiapton(R)も上市されている（非特許文献２及び３）。
しかしながら、上記stomagenは気孔密度が向上し、農作物の収穫量が向上するものの、乾燥に弱くなることが懸念される。また、Siapton(R)のペプチドでは収穫量の向上には十分な効果が発揮できるが、外部環境からのストレスには耐性を示さず、外部環境によっては収穫量向上が見込めないため、さらに有用な農業資材用ペプチドの開発が求められている。
「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ」Ｖｏｌ．５１(１)、ｐ１−８、２０１０年発行
「Ｐｒｏｃ．Ｆｌａ．Ｓｔａｔｅ Ｈｏｒｔ．Ｓｏｃ．」Ｖｏｌ．１１６、ｐ３０−３２、２００３年発行
「Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．９９、ｐ２３１２−２３１８、２００８年発行
本発明は、植物の成長を促進するとともに、外部ストレスへの耐性も付与することができるペプチドを含有する成長促進剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、本発明に到達した。即ち本発明は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）とを構成アミノ酸として含むペプチドであって、構成アミノ酸数が２個〜５０個であるペプチド（Ａ）を含む植物成長促進剤（Ｘ）である。
本発明の植物成長促進剤（Ｘ）は、植物の成長を促進するとともに、さらに外部ストレス（例えば、塩、温度、酸化、干ばつ）への耐性も付与することができる。上記環境外部ストレスのうち、とりわけ高温環境に対するストレス耐性付与効果が著しい。
本発明における植物成長促進剤（Ｘ）は、下記のペプチド（Ａ）を含む。
＜ペプチド（Ａ）＞
本発明の植物成長促進剤（Ｘ）に含まれるペプチド（Ａ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）とを構成アミノ酸として含むペプチドであって、構成アミノ酸数が２〜５０個である農業資材用ペプチドである。グルタミン酸は植物中のＴＣＡ回路で作用する酵素を効果的に活性化し、窒素源の吸収を促進することで、植物の生育の促進に寄与すると考えられる。一方、プロリンは細胞膜に対する浸透圧保護剤、蛋白質、酵素、細胞膜の変性保護材として寄与すると考えられる。
＜ペプチド（Ａ）＞
本発明の植物成長促進剤（Ｘ）に含まれるペプチド（Ａ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）とを構成アミノ酸として含むペプチドであって、構成アミノ酸数が２〜５０個である農業資材用ペプチドである。グルタミン酸は植物中のＴＣＡ回路で作用する酵素を効果的に活性化し、窒素源の吸収を促進することで、植物の生育の促進に寄与すると考えられる。一方、プロリンは細胞膜に対する浸透圧保護剤、蛋白質、酵素、細胞膜の変性保護材として寄与すると考えられる。
本発明における構成アミノ酸は、前記グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）以外に、その他のアミノ酸（ａｍ）を構成アミノ酸としてもよい。
その他のアミノ酸（ａｍ）としては、例えば、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システィン（Ｃｙｓ）、グルタミンＧｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）が挙げられる。
その他のアミノ酸（ａｍ）としては、例えば、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システィン（Ｃｙｓ）、グルタミンＧｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）が挙げられる。
ペプチド（Ａ）の構成アミノ酸［グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）とその他のアミノ酸（ａｍ）］の数に基づいて、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）との合計の数は、好ましくは３０〜１００％、さらに好ましくは５０〜１００％、とくに好ましくは７０〜１００％である。
また、ペプチド（Ａ）の構成アミノ酸の数は、好ましくは２〜５０個、さらに好ましくは４〜４０個、とくに好ましくは８〜３０個である。５０個を越える場合、植物に対する生理活性制御効果が低くなるため好ましくない。
本発明のペプチド（Ａ）は、公知の製造方法によって得られ、例えば、後述の方法によって製造できる。
本発明の植物成長促進剤は、前記の農業資材用ペプチド（Ａ）以外に、さらに他の化合物を含有していてもよい。
本発明の植物成長促進剤は、本発明の効果を損なわない限り、さらに任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒、担体、ｐＨ調整剤、植物体への展着力を高めるための展着剤、植物への浸透性を高めるための界面活性剤等の成分、肥効を高めるためのミネラル等の肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、例えば、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
本発明の成長促進剤の剤型は液剤、粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤等の何れの剤型でもよく、使用の為の薬剤の形態、その使用形態、使用方法は特に限定されるものではない。水に希釈して使用する場合は、０．１〜１００ｐｐｍの濃度の水溶液、水性分散液あるいは乳化液として植物の葉面や根へ散布する、あるいは栽培する土壌に含有してもよい。
本発明の植物成長促進剤（Ｘ）によって、ストレス耐性を付与することができる植物としては、特に制限されず、果菜類では、トマト、ピーマン、エンドウ、キュウリ、スイカ、エダマメ、メロン、イチゴ、ピーマン、オクラ、ナス、サヤインゲン、カボチャ、ソラマメ、トウモロコシなどが挙げられる。葉菜類としては、フキ、ネギ、ミョウガ、ニンニク、サラダナ、ラッキョウ、ブロッコリー、キャベツ、シソ、ハクサイ、チンゲンサイ、セリ、ウド、ホウレンソウ、ツケナ類、カリフラワー、レタス、メキャベツ、アスパラガス、ミツバ、タマネギ、パセリ、ニラ、シュンギク、セルリーなどが挙げられる。根菜類としては、大根、カブ、ゴボウ、ニンジン、ジャガイモ、サトイモ、サツマイモ、山芋、ショウガ、レンコンなどが挙げられる。その他に、イネ、麦類、花卉類などにも適用できる。
本発明の植物成長促進剤（Ｘ）の温度ストレス耐性付与効果としては、例えば、３５℃〜４５℃の高温条件や０℃〜１０℃の低温条件において正常な生育を促す効果が挙げられる。また、塩ストレス付与効果としては、塩化ナトリウム０．１〜３．０ｗｔ％存在下において正常な生育を可能とする。干ばつストレス耐性付与効果としては、相対湿度１０〜４０％においても正常な生育を可能とする。
＜植物の生産方法＞
本発明の植物の生産方法は、前記植物成長促進剤（Ｘ）を使用したものである。その使用方法は、好適には、前記の形態のものを、前記の方法により使用する。
本発明の植物の生産方法は、前記植物成長促進剤（Ｘ）を使用したものである。その使用方法は、好適には、前記の形態のものを、前記の方法により使用する。
以下に本発明の植物成長促進剤（Ｘ）の製造方法の一例を示す。
（ｉ）組換え大腸菌作製
目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換することで組換え大腸菌を作製する。
（ｉ）組換え大腸菌作製
目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換することで組換え大腸菌を作製する。
（ｉｉ）培養
（ｉｉ−１）発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養する。培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜７２時間行う。
（ｉｉ−２）培養に用いる培地を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で培養した組み換え細菌を本培養する。通常１５〜４３℃で１２〜７２時間行う。
（ｉｉ−１）発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養する。培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜７２時間行う。
（ｉｉ−２）培養に用いる培地を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で培養した組み換え細菌を本培養する。通常１５〜４３℃で１２〜７２時間行う。
（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ−１）培地中に分泌されたペプチドは、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ−２）ペプチドを含む培地は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜おこなうにことよって分離精製される。
（ｉｉｉ−１）培地中に分泌されたペプチドは、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ−２）ペプチドを含む培地は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜おこなうにことよって分離精製される。
上記の（ｉｉｉ）のペプチドの分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
以下の実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例における評価＜作物重量の測定方法＞は下記に記載の通りに行った。
＜作物重量の測定方法＞
作物重量は、植物成長促進剤（Ｘ）で土壌処理する工程以外は同一条件で栽培した実施例及び比較例の現物重量又は乾燥重量を測定することで、その増加量を算出することができる。増加量は３０％以上が好ましく、３５％以上がより好ましく、４０％以上が更に好ましい。
作物重量は、植物成長促進剤（Ｘ）で土壌処理する工程以外は同一条件で栽培した実施例及び比較例の現物重量又は乾燥重量を測定することで、その増加量を算出することができる。増加量は３０％以上が好ましく、３５％以上がより好ましく、４０％以上が更に好ましい。
植物成長促進剤（Ｘ）で土壌処理した作物（対象試料）とペプチドを処理していない作物（ブランク）のそれぞれの作物を土壌から取り出し、根に付いた土壌や汚れ等を流水にて十分落とし、それぞれの重量を測定する（現物重量）。
また、それぞれの作物を７０度で５日間乾燥させその後の重量を測定する（乾燥重量）。
また、それぞれの作物を７０度で５日間乾燥させその後の重量を測定する（乾燥重量）。
作物重量増加量（％）は、それぞれ以下の式に基づいて算出できる。
作物重量（現物重量）増加量（％）＝〔（対象試料−ブランク）／（ブランク）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（対象試料の乾燥重量−ブランクの乾燥重量）／（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（現物重量）増加量（％）＝〔（対象試料−ブランク）／（ブランク）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（対象試料の乾燥重量−ブランクの乾燥重量）／（ブランクの乾燥重量）〕×１００
ここで、本発明の植物成長促進剤（Ｘ）について「成長促進効果が見られる場合」とは、例えば、ストレス環境下で本発明の植物成長促進剤（Ｘ）を使用する場合と使用しない場合とを比較して、上述の現物重量増加量（％）又は乾燥重量増加量（％）が増大することをいう。植物成長促進剤（Ｘ）を使用する場合における、現物重量増加量（％）又は乾燥重量増加量（％）は、本発明の植物成長促進剤（Ｘ）を使用しない場合と比較して６０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８５％以上に増大すればよい。上記「成長促進効果がある場合」とは、本発明の植物成長促進剤（Ｘ）の使用なしには全く生育が認められない場合に、本発明の（Ｘ）の使用により生育が認められるようになる場合を含む。植物が生育する期間の内、全期間が高温条件であってもよく、一部の期間が高温条件であってもよい。また、植物が高温条件にさらされた後、植物の生育は全期間に渡って通常の生育温度条件で行われてもよい。一方、「成長促進効果がみられない場合」とは、ストレスを与える事以外は通常の生育条件で育てた場合に、現物重量増加量（％）又は乾燥重量増加量（％）が２０％以下に抑制されることをいい、全く生育が認められない場合を含む。
現物重量と乾燥重量のいずれの測定で作物重量を算出してもかまわないが、作物の正味の量を反映している乾燥重量によって評価する方がより好ましい。この作物重量増加量は物質生産及び重量の増加をあらわすものであるため、作物の生育の直接的な指標となる。
＜製造例１＞
○ペプチド（Ａ−１）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ配列ペプチドを発現する大腸菌（α−１）を作製した。次に、大腸菌（α−１）をＬＢ培養液（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ）１ｍｌに白金耳で植菌して３７℃で一夜振とう培養を行った後、遠心機を用いて集菌し、集菌体の大腸菌（α−１）を得た。続いて、集菌体の大腸菌（α−１）を、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ及びプロテアーゼ阻害剤ミックス（和光純薬（株）製））０．１ｍｌを含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）１ｍｌに植菌し、３７℃１６時間振とう培養を行った。遠心分離機（５，０００Ｇ、１０分）によって集菌を行った後、集菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁して超音波破砕（２００Ｗ、１０分）を行った。特開２０１１−２１７６７１号公報中の実施例記載の方法に準じて、ペプチド（Ａ−１）を生産した。
生産したペプチドの量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して、Ｇｌｕ Ｐｒｏ配列であるペプチド（Ａ−１）のバンドを定量した。蒸留水（大塚製薬社製）を用いて１ｇ／Ｌペプチド溶液に調製し、以降の実験に用いた。
○ペプチド（Ａ−１）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ配列ペプチドを発現する大腸菌（α−１）を作製した。次に、大腸菌（α−１）をＬＢ培養液（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ）１ｍｌに白金耳で植菌して３７℃で一夜振とう培養を行った後、遠心機を用いて集菌し、集菌体の大腸菌（α−１）を得た。続いて、集菌体の大腸菌（α−１）を、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ及びプロテアーゼ阻害剤ミックス（和光純薬（株）製））０．１ｍｌを含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）１ｍｌに植菌し、３７℃１６時間振とう培養を行った。遠心分離機（５，０００Ｇ、１０分）によって集菌を行った後、集菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁して超音波破砕（２００Ｗ、１０分）を行った。特開２０１１−２１７６７１号公報中の実施例記載の方法に準じて、ペプチド（Ａ−１）を生産した。
生産したペプチドの量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して、Ｇｌｕ Ｐｒｏ配列であるペプチド（Ａ−１）のバンドを定量した。蒸留水（大塚製薬社製）を用いて１ｇ／Ｌペプチド溶液に調製し、以降の実験に用いた。
＜製造例２＞
○ペプチド（Ａ−２）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ配列ペプチドを発現する大腸菌（α−２）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ配列であるペプチド（Ａ−２）を得た。
○ペプチド（Ａ−２）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ配列ペプチドを発現する大腸菌（α−２）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ配列であるペプチド（Ａ−２）を得た。
＜製造例３＞
○ペプチド（Ａ−３）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ配列ペプチドを発現する大腸菌（α−３）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−３）を得た。
○ペプチド（Ａ−３）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ配列ペプチドを発現する大腸菌（α−３）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−３）を得た。
＜製造例４＞
○ペプチド（Ａ−４）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ 配列ペプチドを発現する大腸菌（α−４）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−４）を得た。
○ペプチド（Ａ−４）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ 配列ペプチドを発現する大腸菌（α−４）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−４）を得た。
＜製造例５＞
○ペプチド（Ａ−５）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
配列ペプチドを発現する大腸菌（α−５）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−５）を得た。
○ペプチド（Ａ−５）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
配列ペプチドを発現する大腸菌（α−５）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−５）を得た。
＜製造例６＞
○ペプチド（Ａ−６）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ配列ペプチド（１）を発現する大腸菌（α−６）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−６）を得た。
○ペプチド（Ａ−６）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ配列ペプチド（１）を発現する大腸菌（α−６）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−６）を得た。
＜製造例７＞
○ペプチド（Ａ−７）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ配列ペプチド（２）を発現する大腸菌（α−７）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−７）を得た。
○ペプチド（Ａ−７）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ配列ペプチド（２）を発現する大腸菌（α−７）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−７）を得た。
＜製造例８＞
○ペプチド（Ａ−８）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ配列ペプチド（３）を発現する大腸菌（α−８）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−８）を得た。
○ペプチド（Ａ−８）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ配列ペプチド（３）を発現する大腸菌（α−８）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−８）を得た。
＜製造例９＞
○ペプチド（Ａ−９）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ配列ペプチド（４）を発現する大腸菌（α−９）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−９）を得た。
○ペプチド（Ａ−９）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ配列ペプチド（４）を発現する大腸菌（α−９）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−９）を得た。
＜製造例１０＞
○ペプチド（Ａ−１０）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ配列ペプチド（５）を発現する大腸菌（α−１０）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１０）を得た。
○ペプチド（Ａ−１０）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ配列ペプチド（５）を発現する大腸菌（α−１０）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１０）を得た。
＜製造例１１＞
○ペプチド（Ａ−１１）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ配列ペプチド（６）を発現する大腸菌（α−１１）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１１）を得た。
○ペプチド（Ａ−１１）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ配列ペプチド（６）を発現する大腸菌（α−１１）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１１）を得た。
＜製造例１２＞
○ペプチド（Ａ−１２）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ配列ペプチド（７）を発現する大腸菌（α−１２）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１２）を得た。
○ペプチド（Ａ−１２）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ配列ペプチド（７）を発現する大腸菌（α−１２）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１２）を得た。
＜製造例１３＞
○ペプチド（Ａ−１３）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ配列ペプチド（８）を発現する大腸菌（α−１３）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１３）を得た。
○ペプチド（Ａ−１３）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ配列ペプチド（８）を発現する大腸菌（α−１３）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１３）を得た。
＜製造例１４＞
○ペプチド（Ａ−１４）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｓｅｒ配列ペプチド（９）を発現する大腸菌（α−１４）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１４）を得た。
○ペプチド（Ａ−１４）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｓｅｒ配列ペプチド（９）を発現する大腸菌（α−１４）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ−１４）を得た。
＜比較製造例１＞
○ペプチド（Ａ’−１）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ配列ペプチドを発現する大腸菌（α’−１）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ’−１）を得た。
○ペプチド（Ａ’−１）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ配列ペプチドを発現する大腸菌（α’−１）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ’−１）を得た。
＜比較製造例２＞
○ペプチド（Ａ’−２）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ配列ペプチドを発現する大腸菌（α’−２）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ’−２）を得た。
○ペプチド（Ａ’−２）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ配列ペプチドを発現する大腸菌（α’−２）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ’−２）を得た。
＜比較製造例３＞
○ペプチド（Ａ’−３）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ配列ペプチドを発現する大腸菌（α’−３）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ’−３）を得た。
○ペプチド（Ａ’−３）の作製
特開２０１２−５４５７号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ配列ペプチドを発現する大腸菌（α’−３）を作製した。
それ以降は製造例１と同じ操作を行い、ペプチド（Ａ’−３）を得た。
＜実施例１〜１４、比較例１〜４＞
＜試験培地Ａの調製＞
３０ｃｍ×２０ｃｍ×２０ｃｍのプラスチックス製のプランターに砂質土壌（川砂）
５ｋｇを入れた。
砂質土壌８．３ｋｇに化学肥料（窒素：リン酸：カリ＝１：１：１）０．３ｋｇを加え十分に混合した土壌を砂質土壌の入ったプランターの上に積層し、１０００ｇの水道水を灌水して試験培地Ａを作成した。なお、ペプチドを表１に示す濃度となるように添加した。結果を表１に示す。
＜試験培地Ａの調製＞
３０ｃｍ×２０ｃｍ×２０ｃｍのプラスチックス製のプランターに砂質土壌（川砂）
５ｋｇを入れた。
砂質土壌８．３ｋｇに化学肥料（窒素：リン酸：カリ＝１：１：１）０．３ｋｇを加え十分に混合した土壌を砂質土壌の入ったプランターの上に積層し、１０００ｇの水道水を灌水して試験培地Ａを作成した。なお、ペプチドを表１に示す濃度となるように添加した。結果を表１に示す。
＜植物の生育＞
試験培地Ａにキュウリ、大根、ホウレンソウ、イネを播種した。各作物について１２株ずつ用意し、室温が２５℃で照度が２０００ルクスの場所（ハウス内）で試験を行った。３日おきに１００ｇの水道水を灌水し、１４日間の各植物の生育状況（１２株の平均値）を作物重量として評価した。
試験培地Ａにキュウリ、大根、ホウレンソウ、イネを播種した。各作物について１２株ずつ用意し、室温が２５℃で照度が２０００ルクスの場所（ハウス内）で試験を行った。３日おきに１００ｇの水道水を灌水し、１４日間の各植物の生育状況（１２株の平均値）を作物重量として評価した。
作物重量（乾燥重量）増加量（％）は、それぞれ以下の式に従って算出した。
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（各実施例における乾燥重量−比較例１（ブランク）の乾燥重量）／（比較例１（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（比較例１以外の各比較例における乾燥重量−比較例１（ブランク）の乾燥重量）／（比較例１（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（各実施例における乾燥重量−比較例１（ブランク）の乾燥重量）／（比較例１（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（比較例１以外の各比較例における乾燥重量−比較例１（ブランク）の乾燥重量）／（比較例１（ブランクの乾燥重量）〕×１００
＜実施例１５〜２８、比較例５〜８＞
外部ストレスとして、試験培地Ａおよび３日おきに灌水する１００ｇの水道水に、塩化ナトリウム１ｗｔ％を含んだ高塩条件下での植物生育状況を確認した。塩濃度以外は＜実施例１〜１４、比較例１〜４＞と同様の条件で植物を栽培し、作物重量を評価した。なお、ペプチドを表２に示す濃度となるように添加した。結果を表２に示す。
外部ストレスとして、試験培地Ａおよび３日おきに灌水する１００ｇの水道水に、塩化ナトリウム１ｗｔ％を含んだ高塩条件下での植物生育状況を確認した。塩濃度以外は＜実施例１〜１４、比較例１〜４＞と同様の条件で植物を栽培し、作物重量を評価した。なお、ペプチドを表２に示す濃度となるように添加した。結果を表２に示す。
作物重量（乾燥重量）増加量（％）は、それぞれ以下の式に従って算出した。
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（各実施例における乾燥重量−比較例５（ブランク）の乾燥重量）／（比較例５（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（比較例５以外の各比較例における乾燥重量−比較例５（ブランク）の乾燥重量）／（比較例５（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（各実施例における乾燥重量−比較例５（ブランク）の乾燥重量）／（比較例５（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（比較例５以外の各比較例における乾燥重量−比較例５（ブランク）の乾燥重量）／（比較例５（ブランクの乾燥重量）〕×１００
＜実施例２９〜４２、比較例９〜１２＞
外部ストレスとして育苗用のビニールハウス内の室温を３６℃に調整した、高温条件下での植物生育状況を確認した。温度条件以外は＜実施例２１〜３４、比較例２１＞と同様の条件で植物を栽培し、作物重量を評価した。なお、ペプチドを表３に示す濃度となるように添加した。結果を表３に示す。
外部ストレスとして育苗用のビニールハウス内の室温を３６℃に調整した、高温条件下での植物生育状況を確認した。温度条件以外は＜実施例２１〜３４、比較例２１＞と同様の条件で植物を栽培し、作物重量を評価した。なお、ペプチドを表３に示す濃度となるように添加した。結果を表３に示す。
作物重量（乾燥重量）増加量（％）は、それぞれ以下の式に従って算出した。
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（各実施例における乾燥重量−比較例９（ブランク）の乾燥重量）／（比較例９（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（比較例９以外の各比較例における乾燥重量−比較例９（ブランク）の乾燥重量）／（比較例９（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（各実施例における乾燥重量−比較例９（ブランク）の乾燥重量）／（比較例９（ブランクの乾燥重量）〕×１００
作物重量（乾燥重量）増加量（％）＝〔（比較例９以外の各比較例における乾燥重量−比較例９（ブランク）の乾燥重量）／（比較例９（ブランクの乾燥重量）〕×１００
表１〜３の結果から、本発明のペプチド（Ａ）を含有する植物成長促進剤は、比較のものと比べて、植物の成長を促進するとともに、外部ストレスへの耐性も付与することがわかる。
本発明のペプチド（Ａ）を含有する植物成長促進剤は、種々の農業資材として、好適に用いられ、とくに植物の成長促進剤、外部ストレス耐性付与剤としても、きわめて有用である。
Claims (3)
- グルタミン酸（Ｇｌｕ）とプロリン（Ｐｒｏ）とを構成アミノ酸として含み、構成アミノ酸数が２個〜５０個であるペプチド（Ａ）を含有する植物成長促進剤（Ｘ）。
- 前記環境外部ストレスが、塩、温度、酸化および干ばつからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の植物成長促進剤。
- 請求項１又は２に記載の植物成長促進剤を使用した植物の生育方法。
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- 2018-06-22 JP JP2018119154A patent/JP7059119B2/ja active Active
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