JP2018538287A - 多発性嚢胞腎の処置のためのアンチセンスオリゴマー - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で言及される出願公開、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の出願公開、特許、あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されるかのような同じ程度、参照により本明細書に組み込まれる。
多発性嚢胞腎
保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)
PKD2核の転写産物
PC−2タンパク質発現
(a)(i)PC−2タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
(ii)PC−2タンパク質が、同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは
(iii)PC−2タンパク質または機能的RNAが産生されない、第1の変異対立遺伝子;および
(b)(i)PC−2タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
(ii)PC−2タンパク質が、同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは
(iii)PC−2タンパク質が産生されない、第2の変異対立遺伝子を有し、ここで、
RIC mRNA前駆体は、第1の対立遺伝子および/または第2の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ASOは、第1の対立遺伝子または第2の対立遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分に結合することで、RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、PC−2タンパク質をコードするmRNAレベルの増加を引き起こし、被験体の細胞中の標的タンパク質または機能的RNAの発現の増加をもたらす。
これらの実施形態では、RIC mRNA前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングの結果として生じる、発現レベルの増加を有する標的タンパク質あるいは機能的RNAは、同等の野性型タンパク質と比較して機能性の低い形態(部分的機能的)、あるいは同等の野性型タンパク質と比較して完全な機能性を有する形態(完全機能的)、のいずれかであり得る。
PC−2タンパク質発現を増加させるためのTANGOの使用
本明細書に提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、PC−2タンパク質をコードするmRNA、またはPC−2タンパク質をコードする成熟mRNAのレベルを増加させることによって、例えば、PC−2タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた多発性嚢胞腎を有している被験体において細胞におけるPC−2タンパク質の発現を増加させることに有用である。特に、本明細書に記載されるような方法および組成物は、PC−2タンパク質をコードするPKD2 RIC mRNA前駆体の転写産物から保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、それによって、PC−2タンパク質をコードするmRNA、またはPC−2タンパク質をコードする成熟mRNAのレベルが増大し、PC−2タンパク質の発現が増大する。
本開示の一態様は、PKD2 RIC mRNA前駆体の標的部分に結合することによってスプライシングを増強するアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。本明細書で使用されるように、用語「ASO」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対またはゆらぎ塩基対(G−U)によって標的核酸(例えば、PKD2 RIC mRNA前駆体)の配列にハイブリダイズする、核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドなどのオリゴマーを指す。ASOは、標的配列に相補的なまたはほぼ相補性的である(例えば、標的配列に結合し、スプライス部位でスプライシングを増強させるのに十分な相補性)正確な配列を有し得る。ASOは、標的核酸(例えば、mRNA前駆体の転写産物の標的部分)に結合し(ハイブリダイズし)、生理学的条件下でハイブリダイズされたままであるように設計されている。典型的に、ASOは、意図した(標的とされた)核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、標的核酸でない限られた数の配列に(標的核酸以外の少数の部位に)ハイブリダイズする。ASOの設計は、mRNA前駆体の転写産物の標的部分の核酸配列、またはゲノムまたは細胞mRNA前駆体またはトランスクリプトームにおける他の場所での十分類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができ、その結果、ASOが他の部位に結合し「オフターゲット」効果を引き起こす可能性は限定される。例えば、発明の名称「Reducing Nonsense−Mediated mRNA Decay」のWO2015/035091として公開されたPCT国際出願番号PCT/US2014/054151におけるものなどの、当業者に既知のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。
記載された組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、上記方法のいずれかにおいて使用するための医薬組成物または製剤は、医薬品産業において周知の従来の技術に従って調製することができ、かつ公開文献においても記載されている。実施形態において、被験体を処置するための医薬組成物または製剤は、上記のような任意のアンチセンスオリゴマーの有効量を含むか、または薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、それらの水和物もしくはエステル、および薬学的に許容可能な希釈液を含む。医薬製剤のアンチセンスオリゴマーはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液または担体を含むこともある。
本明細書に提供される組成物のうちのいずれかが個体に投与されうる。「個体」は、「被験体」または「患者」と交換可能に使用されてもよい。個体は哺乳動物でもよく、例えば人間、または、人類以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、馬、ロバ、ヤギ、猫、犬、雌牛、ブタ、あるいは羊などの動物である。実施形態では、個体はヒトである。実施形態では、個体は胎児、胚、または小児である。他の実施形態では、個体は植物などの別の真核生物であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物は細胞にエクスビボで投与される。
本発明の範囲内にはまた、特に標的イントロンでのPKD2 RIC mRNA前駆体のスプライシングを増強する追加のASOを特定する(判定する)方法がある。mRNA前駆体の標的領域内で様々なヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするASOは、標的イントロンのスプライシングの速度および/または程度を改善するASOを特定する(判定する)ためにスクリーニングされてもよい。いくつかの実施形態では、ASOはスプライシング抑制因子/サイレンサーの結合部位をブロックまたは妨害することがある。当該技術分野において既知の任意の方法が、イントロンの標的領域にハイブリダイズされた時に所望の効果(例えばスプライシング、タンパク質または機能的RNA産生の増強)をもたらすASOを特定する(判定する)ために使用されてもよい。これらの方法はまた、保持されたイントロンに隣接するエクソン中、または保持されていないイントロン中の標的領域へ結合することにより、保持されたイントロンのスプライシングを増強するASOの特定のために使用することができる。使用されうる方法の一例が下記に提供される。
以下の実施例は本発明の例証的な実施形態を提供する。当業者であれば、本開示の精神または範囲を変更することなく実行され得る多数の修正および変更を認識するであろう。こうした修正と変更は本開示の範囲内に包含される。実施例はいかなる意味でも本明細書中に記載される開示を限定するものではない。
イントロン保持事象を特定するためにPKD2遺伝子によって生成された転写産物のスナップショットを明らかにするために、次世代配列決定を使用して、全トランスクリプトームのショットガン配列決定を実行した。このために、腎上皮細胞の核および細胞質の分画からのpolyA+ RNAを分離し、IlluminaのTruSeq Stranded mRNAライブラリPrepキットを用いてcDNAライブラリを構築した。
ライブラリを対末端配列決定(pair−end sequenced)し、結果として、ヒトゲノムにマッピングされた100ヌクレオチドの読み取りをもたらした(2009年2月、GRCh37/hg19アセンブリ)。PKD2についての配列決定の結果を、図3に示す。簡潔に言うと、図3は(UCSC Genome Informatics Group (Center for Biomolecular Science & Engineering, University of California, Santa Cruz, 1156 High Street, Santa Cruz, CA 95064)によって操作され、かつ、例えばRosenbloom, et al., 2015,”The UCSC Genome Browser database: 2015 update,”Nucleic Acids Research 43, Database Issue doi: 10.1093/nar/gku1177に記載された)UCSCのゲノムブラウザを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取り密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークをPKD2エクソン領域およびイントロン領域に一致させられるように、(読み取りシグナルの下に)UCSCゲノムブラウザによってPKD2の模式図(縮尺通りに描かれている)が提供される。このディスプレイに基づいて、HCNの核分画において高い読み取り密度を有するが、(図3の下のダイアグラム中のイントロン5について示されるように)これらの細胞の細胞質分画においては読み取りが非常に低いかまたは無い、一つのイントロン(示されるように、イントロン5)を特定した。これは、イントロン5が保持され、イントロン5含有転写産物が核内に残っていることを示し、この保持されたPKD2 RIC mRNA前駆体が、細胞質に排出されないので、非生産的であることを示唆している。
ASOウォークは、本明細書中(図4;表1、SEQ ID NOS:3〜280)に記載された方法を使用して、イントロン5を標的とするよう設計された。ヌクレオチド+497から−204eにおよびントロン5の5’スプライス部位のすぐ上流および下流の領域、および、およびヌクレオチド−496から212eに及ぶイントロン5の3’スプライス部位のすぐ上流および下流の領域が、保持されたイントロン5 PKD2 RIC mRNA前駆体を標的とするようにASOを設計するために利用される。表1は、設計された例示的なASOおよびそれらの標的配列を列挙する。この設計から、5ヌクレオチド間隔だけシフトした2’−O−MeRNA、PS骨格、18量体ASOを産生し、PC−2タンパク質産生を増加させるために、PKD2 RIC mRNA前駆体を標的化するよう利用することができる。
ASOを使用してPKD2イントロン5のスプライシング効率を改善することにより、PKD2発現における増加を達成しうるかどうかを判断するために、本明細書に記述された方法が使用されうる。対象の細胞株(例えばARPE−19細胞、すなわちヒトの網膜の上皮細胞株(American Type Culture Collection (ATCC),USA)、またはHuh−7、すなわちヒトの肝細胞腫細胞株(NIBIOHN,Japan)、またはSK−N−AS、すなわちヒトの神経芽細胞腫細胞株(ATCC))は、偽トランスフェクト(mock−transfect)されるか、または表1に記載の標的ASOでトランスフェクトされる。細胞を、製造業者の仕様書に従って、Lipofectamine RNAiMaxトランスフェクション試薬(Thermo Fisher)を用いてトランスフェクトする。簡潔に述べると、ASOを96ウェル組織培養プレートに播種し、Opti−MEMで希釈したRNAiMaxと組み合わせる。トリプシンを用いて細胞を剥離し、完全培地に再懸濁し、約25,000個の細胞をASO−トランスフェクション混合物に加える。トランスフェクション実験は三通りのプレート複製において実行される。最終的なASO濃度は80nMである。製造業者の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの6時間後に交換し、細胞をCells−to−Ct溶解試薬を用い、DNAse(Thermo Fisher)で試薬を補充し、24時間で採取する。製造業者の仕様書に従い、cDNAをCells−to−Ct RT試薬(Thermo Fisher)で生成する。対象のイントロンでのスプライシングの量を定量化するために、表1に列挙した、対応するエクソン−エクソンジャンクションに及ぶプローブでTaqmanアッセイ(Thermo Fisher)を用いて、定量PCRが実行される。Taqmanアッセイは、QuantStudio 7Flex Real−Time PCRシステム(Thermo Fisher)上で製造業者の仕様書に従い実行される。標的遺伝子アッセイ値を、RPL32(deltaCt)およびプレート適合偽トランスフェクションサンプル(delta−delta Ct)に対して正規化し、モック定量(2^−(delta−delta Ct)に対して倍率変化を生成する。3つのプレート複製のモック(mock)に対する平均倍率変化をプロットする。標的遺伝子発現を閾値量の分増加させるものと特定されたASOは、その標的イントロンでのスプライシングの増加を示唆する。標的イントロン(図3)の保持を確認する全トランスクリプトームデータと共に、これらの結果は、ASOが律速のイントロンのスプライシング効率を改善し得ることを確認する。
Claims (118)
- 被験体の細胞によって標的タンパク質または機能的RNAの発現を増加させることにより、被験体の多発性嚢胞腎を処置する方法であって、
細胞は、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)を有し、RIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、5’スプライス部位に隣接するエクソン、3’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、および、RIC mRNA前駆体は標的タンパク質または機能的RNAをコードし、
前記方法は、
標的タンパク質または機能的RNAをコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー(ASO)に、被験体の細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的RNAをコードするRIC mRNA前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAのレベルを増加させ、被験体の細胞中の標的タンパク質あるいは機能的RNAの発現を増加させる、方法。 - 保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)を有する細胞により、PC−2である標的タンパク質の発現を増加させる方法であって、
RIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、および、RIC mRNA前駆体はPC−2タンパク質をコードし、
前記方法は、
PC−2タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー(ASO)に、被験体の細胞を接触させる工程を含み、これによって、保持されたイントロンは、PC−2タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、PC−2タンパク質をコードするmRNAのレベルを増加させ、細胞中のPC−2タンパク質の発現を増加させる、方法。 - 標的タンパク質はPC−2である、請求項1に記載の方法。
- 標的タンパク質または機能的RNAは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的RNAを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的RNAである、請求項1に記載の方法。
- 細胞は、PC−2タンパク質の不足している量または活性によって引き起こされた疾病を抱える被験体中のものであるか、該被検体からのものである、請求項2に記載の方法。
- 標的タンパク質の不足している量は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は機能的な標的タンパク質をコードする第1の対立遺伝子と、標的タンパク質が生成されない第2の対立遺伝子、あるいは非機能的標的タンパク質をコードする第2の対立遺伝子とを有し、ここで、アンチセンスオリゴマーは、第1の対立遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の標的部分に結合する、請求項1−5のいずれか1つに記載の方法。
- 被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、ここで、被験体は、
(a)
(i)標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、
(ii)標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、
(iii)標的タンパク質が生成されない、
第1の変異対立遺伝子と、
(b)
(i)標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、
(ii)標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、
(iii)標的タンパク質が生成されない、
第2の変異対立遺伝子とを有し、
ここで、被験体が第1の変異対立遺伝子(a)(iii)を有するとき、第2の変異対立遺伝子は(b)(i)あるいは(b)(ii)であり、ここで、被験体が第2の変異対立遺伝子(b)(iii)を有するとき、第1の変異対立遺伝子は(a)(i)あるいは(a)(ii)であり、ここで、RIC mRNA前駆体は、(a)(i)あるいは(a)(ii)である第1の変異対立遺伝子、および/または、(b)(i)あるいは(b)(ii)である第2の変異対立遺伝子のいずれかから転写される、請求項1−5のいずれか1つに記載の方法。 - 標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成される、請求項7に記載の方法。
- 標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で生成される、請求項7に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16までの領域内の保持されたイントロンにある、請求項1−9のいずれか1つに記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、
(a)保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜+497の領域、あるいは、
(b)保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−496の領域、
の内部の保持されたイントロンにある、請求項1−9のいずれか1つに記載の方法。 - RIC mRNA前駆体の標的部分は、
(a)保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域、あるいは
(b)保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域、
の内部にある、請求項1−9のいずれか1つに記載の方法。 - RIC mRNA前駆体の標的部分は、
(a)保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して−4e〜−1,054eの領域、
(b)保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜+499の領域、
(c)保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−496の領域、あるいは、
(d)保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して+2e〜+1,912eの領域、
の内部の保持されたイントロンにある、請求項1−9のいずれか1つに記載の方法。 - 標的タンパク質はPC−2である、請求項1−13のいずれか1つに記載の方法。
- RIC mRNA前駆体は、SEQ ID NO:2に少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含む、請求項14に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体は、SEQ ID NO:1に少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる、請求項14に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、SEQ ID NO:281の少なくとも8つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含む、請求項14に記載の方法。
- ASOは、SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項14に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロン5の5’スプライス部位に対して−204e〜+497までの領域内、あるいは保持されたイントロン5の3’スプライス部位に対して−496〜+212eの領域内にある、請求項14に記載の方法。
- ASOは、SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項19に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロン5の5’スプライス部位に対して−204e〜−4eの領域内のエクソン5にある、請求項14に記載の方法。
- ASOは、SEQ ID NO:3−43のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項21に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜+497の領域内の保持されたイントロン5にある、請求項14に記載の方法。
- ASOは、SEQ ID NO:44−140のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項23に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−496の領域内の保持されたイントロン5にある、請求項14に記載の方法。
- ASOは、SEQ ID NO:141−237のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項25に記載の方法。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロン5の3’スプライス部位に対して+2e〜+212eの領域内のエクソン6にある、請求項14に記載の方法。
- ASOは、SEQ ID NO:238−280のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項27に記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは、機能的RNAまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNA前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的RNAの量を増加させない、請求項1−28のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的RNAの量を増加させない、請求項1−29のいずれか1つに記載の方法。
- RIC mRNA前駆体は、全長のmRNA前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のmRNA前駆体の部分的なスプライシングによって生成された、請求項1−30のいずれか1つに記載の方法。
- 標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAは、全長の成熟mRNA、あるいは野生型の成熟mRNAである、請求項1−31のいずれか1つに記載の方法。
- 生成された標的タンパク質は、全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、請求項1−32のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞中で生成された標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAの総量は、対照細胞中で生成された標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAの総量と比較して、約1.1〜約10倍、約1.5〜約10倍、約2〜約10倍、約3〜約10倍、約4〜約10倍、約1.1〜約5倍、約1.1〜約6倍、約1.1〜約7倍、約1.1〜約8倍、約1.1〜約9倍、約2〜約5倍、約2〜約6倍、約2〜約7倍、約2〜約8倍、約2〜約9倍、約3〜約6倍、約3〜約7倍、約3〜約8倍、約3〜約9倍、約4〜約7倍、約4〜約8倍、約4〜約9倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、あるいは少なくとも約10倍増加する、請求項1−33のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって生成された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質の総量として、約1.1〜約10倍、約1.5〜約10倍、約2〜約10倍、約3〜約10倍、約4〜約10倍、約1.1〜約5倍、約1.1〜約6倍、約1.1〜約7倍、約1.1〜約8倍、約1.1〜約9倍、約2〜約5倍、約2〜約6倍、約2〜約7倍、約2〜約8倍、約2〜約9倍、約3〜約6倍、約3〜約7倍、約3〜約8倍、約3〜約9倍、約4〜約7倍、約4〜約8倍、約4〜約9倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、あるいは少なくとも約10倍増加する、請求項1−34のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項1−35のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、2’−O−メチル、2’−フルオロ、あるいは2’−O−メトキシエチル部分を含む、請求項1−36のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは少なくとも1つの修飾された糖部を含む、請求項1−37のいずれか1つに記載の方法。
- それぞれの糖部は修飾された糖部である、請求項38に記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは、8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35の核酸塩基、12〜30の核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、あるいは12〜15の核酸塩基からなる、請求項1−39のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体の標的部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、あるいは100%相補的である、請求項1−40のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞は、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の集団を含み、ここで、RIC mRNA前駆体の集団は少なくとも1つの保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、RIC mRNA前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する、請求項1−41のいずれか1つに記載の方法。
- 最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAを生成するRIC mRNA前駆体の集団からの少なくとも1つの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、請求項42に記載の方法。
- 細胞は、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子から転写されたRIC mRNA前駆体の集団を含み、ここで、RIC mRNA前駆体の集団は2つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、RIC mRNA前駆体の集団で2番目に豊富な保持されたイントロンに結合する、請求項1−43のいずれか1つに記載の方法。
- 2番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAを生成するRIC mRNA前駆体の集団からの2つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、請求項44に記載の方法。
- 前記方法はPC−2タンパク質発現を評価する工程をさらに含む、請求項1−45のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーはPKD2 RIC mRNA前駆体の標的部分に結合し、ここで、標的部分はSEQ ID NO:3−280から選択される配列である、請求項1−46のいずれか1つに記載の方法。
- 被験体はヒトである、請求項1−47のいずれか1つに記載の方法。
- 被験体はヒト以外の動物である、請求項1−47のいずれか1つに記載の方法。
- 被験体は胎児、胚、あるいは子供である、請求項1−48のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞はエクスビボである、請求項1−47のいずれか1つに記載の方法。
- アンチセンスオリゴマーは、被験体の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される、請求項1−51のいずれか1つに記載の方法。
- 5’スプライス部位に隣接するエクソンの−3e〜−1eと、保持されたイントロンの+1〜+6にある9つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、請求項1−52のいずれか1つに記載の方法。
- 保持されたイントロンの−15〜−1と3’スプライス部位に隣接するエクソンの+1eにある16のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、請求項1−53のいずれか1つに記載の方法。
- 請求項1−54のいずれか1つの方法で使用されるアンチセンスオリゴマー。
- SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含む、アンチセンスオリゴマー。
- 請求項55または56のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体とを含む医薬組成物。
- 腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって、請求項57の医薬組成物を投与することにより被験体を処置する方法。
- 不足しているタンパク質または不足している機能的RNAに関連付けられる被験体の多発性嚢胞腎を処置するために細胞によって標的タンパク質あるいは機能的RNAの発現を増加させる方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
不足しているタンパク質または不足している機能的RNAは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする、保持されたイントロン含有mRNA前駆体(RIC mRNA前駆体)の構成的なスプライシングを増強し、
ここで、
標的タンパク質は、
(a)不足しているタンパク質、あるいは
(b)被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、
ここで、
機能的RNAは、
(c)不足しているRNA、あるいは、
(d)被験体の不足している機能的RNAを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償機能的RNAであり、
ここで、
RIC mRNA前駆体は、保持されたイントロン、5’スプライス部位に隣接するエクソン、および3’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、ここで、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的RNAをコードするRIC mRNA前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体の標的タンパク質あるいは機能的RNAの生成あるいは活性を増加させる、組成物。 - 被験体においてPC−2タンパク質に関連する疾病を処置する方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
当該方法は、被験体の細胞によってPC−2タンパク質の発現を増加させる工程であって、細胞が、保持されたイントロン、保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソンを含む、保持されたイントロン含有mRNA前駆体を有し、および、RIC mRNA前駆体がPC−2タンパク質をコードする、工程と、アンチセンスオリゴマーに細胞を接触させる工程であって、これによって、保持されたイントロンは、PC−2タンパク質をコードするRIC mRNA前駆体転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞においてPC−2タンパク質をコードするmRNAのレベルを増加させ、PC−2タンパク質の発現を増加させる、工程を含む、組成物。 - 疾病は疾患または障害である、請求項60に記載の組成物。
- 疾患または障害は多発性嚢胞腎である、請求項61に記載の組成物。
- 標的タンパク質とRIC mRNA前駆体はPKD2遺伝子によってコードされる、請求項62に記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6から、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16までの領域内の保持されたイントロンにあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする、請求項59−63のいずれか1つに記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーはRIC mRNA前駆体の一部を標的とし、これは、
(a)保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜+497の領域、あるいは、
(b)保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−496の領域、
の内部の保持されたイントロンにある、請求項59−64のいずれか1つに記載の組成物。 - アンチセンスオリゴマーは、少なくとも1つの保持されたイントロンの5’スプライス部位の約100ヌクレオチド下流から、少なくとも1つの保持されたイントロンの3’スプライス部位の約100ヌクレオチド上流までの領域内にあるRIC mRNA前駆体の一部を標的とする、請求項59−63のいずれか1つに記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、
(a)保持されたイントロンの5’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域、あるいは、
(b)保持されたイントロンの3’スプライス部位に隣接するエクソン中の+2e〜−4eの領域、
の内部にある、請求項59−63のいずれか1つに記載の組成物。 - RIC mRNA前駆体の標的部分は、
(a)保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して−4e〜−1,054eの領域、
(b)保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜+499の領域、
(c)保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−496の領域、あるいは、
(d)保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して+2e〜+1,912eの領域、
の内部にある、請求項59−63のいずれか1つに記載の組成物。 - 標的タンパク質はPC−2である、請求項59−68のいずれか1つに記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体は、SEQ ID NO:2に少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含む、請求項69に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体は、SEQ ID NO:1に少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる、請求項69に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、SEQ ID NO:281の少なくとも8つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含む、請求項69に記載の組成物。
- ASOは、SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項69に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロン5の5’スプライス部位に対して−204e〜+497までの領域内、あるいは保持されたイントロン5の3’スプライス部位に対して−496〜+212eの領域内にある、請求項69に記載の組成物。
- ASOは、SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項74に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロン5の5’スプライス部位に対して−204e〜−4eの領域内のエクソン5にある、請求項69に記載の組成物。
- ASOは、SEQ ID NO:3−43のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項76に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して+6〜+497の領域内の保持されたイントロン5にある、請求項69に記載の組成物。
- ASOは、SEQ ID NO:44−140のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項78に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して−16〜−496の領域内の保持されたイントロン5にある、請求項69に記載の組成物。
- ASOは、SEQ ID NO:141−237のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項80に記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体の標的部分は、保持されたイントロン5の3’スプライス部位に対して+2e〜+212eの領域内のエクソン6にある、請求項69に記載の組成物。
- ASOは、SEQ ID NO:238−280のいずれか1つに少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、あるいは100%相補的な配列を含む、請求項82に記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子から転写されたmRNA前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的RNAの量を増加させない、請求項59−83のいずれか1つに記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的RNAをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的RNAまたは機能的タンパク質の量を増加させない、請求項59−84のいずれか1つに記載の組成物。
- RIC mRNA前駆体は、全長のmRNA前駆体、あるいは野生型のmRNA前駆体の部分的なスプライシングによって生成された、請求項59−85のいずれか1つに記載の組成物。
- 標的タンパク質または機能的RNAをコードするmRNAは、全長の成熟mRNA、あるいは野生型の成熟mRNAである、請求項59−86のいずれか1つに記載の組成物。
- 生成された標的タンパク質は、全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、請求項59−87のいずれか1つに記載の組成物。
- 保持されたイントロンは律速イントロンである、請求項59−88のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記保持されたイントロンは前記RIC mRNA前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである、請求項59−89のいずれか1つに記載の組成物。
- 保持されたイントロンは前記RIC mRNA前駆体で2番目に豊富な保持されたイントロンである、請求項59−89のいずれか1つに記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項59−91のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項59−92のいずれか1つに記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、2’−O−メチル、2’−フルオロ、あるいは2’−O−メトキシエチル部分を含む、請求項59−93のいずれか1つに記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーは少なくとも1つの修飾された糖部を含む、請求項59−94のいずれか1つに記載の組成物。
- それぞれの糖部は修飾された糖部である、請求項95に記載の組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35の核酸塩基、12〜30の核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、あるいは12〜15の核酸塩基からなる、請求項59−96のいずれか1つに記載の組成物。
- 請求項59−97の組成物のいずれか1つのアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体とを含む医薬組成物。
- 腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって請求項98の医薬組成物を投与することにより被験体を処置する方法。
- 不足しているPKD2 mRNA転写産物の標的配列にハイブリダイズされるアンチセンスオリゴマーであって、不足しているPKD2 mRNA転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが不足しているPKD2 mRNA転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、
薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体とを含む、
医薬組成物。 - 不足しているPKD2 mRNA転写産物はPKD2 RIC mRNA前駆体転写産物である、請求項100に記載の医薬組成物。
- PKD2 RIC mRNA前駆体転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの5’スプライス部位に対して約+500〜保持されたイントロンの3’スプライス部位に対して約−500までの領域内の保持されたイントロンにある、請求項100または101に記載の医薬組成物。
- PKD2 RIC mRNA前駆体転写産物は、SEQ ID NO:1に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、あるいは100%の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる、請求項100または101に記載の医薬組成物。
- PKD2 RIC mRNA前駆体転写産物は、SEQ ID NO:2に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、あるいは100%の配列同一性を備えた配列を含む、請求項100または101に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項100に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項100に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、2’−O−メチル、2’−フルオロ、あるいは2’−O−メトキシエチル部分を含む、請求項100に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは少なくとも1つの修飾された糖部を含む、請求項100に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、8〜50の核酸塩基、8〜40の核酸塩基、8〜35の核酸塩基、8〜30の核酸塩基、8〜25の核酸塩基、8〜20の核酸塩基、8〜15の核酸塩基、9〜50の核酸塩基、9〜40の核酸塩基、9〜35の核酸塩基、9〜30の核酸塩基、9〜25の核酸塩基、9〜20の核酸塩基、9〜15の核酸塩基、10〜50の核酸塩基、10〜40の核酸塩基、10〜35の核酸塩基、10〜30の核酸塩基、10〜25の核酸塩基、10〜20の核酸塩基、10〜15の核酸塩基、11〜50の核酸塩基、11〜40の核酸塩基、11〜35の核酸塩基、11〜30の核酸塩基、11〜25の核酸塩基、11〜20の核酸塩基、11〜15の核酸塩基、12〜50の核酸塩基、12〜40の核酸塩基、12〜35の核酸塩基、12〜30の核酸塩基、12〜25の核酸塩基、12〜20の核酸塩基、あるいは12〜15の核酸塩基を含む、請求項100に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、PKD2 RIC mRNA前駆体転写産物の標的部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、あるいは100%相補的である、請求項100または101に記載の医薬組成物。
- PKD2 RIC mRNA前駆体転写産物の標的部分は、SEQ ID NO:281内にある、請求項100または101に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに対して少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、あるいは99%の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項100に記載の医薬組成物。
- アンチセンスオリゴマーは、SEQ ID NO:3−280から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項100に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される、請求項100−113のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- PC−2タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたPKD2 mRNA転写産物を生成するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているPKD2 mRNA転写産物の処理を誘発する方法であって、
前記方法は、
(a)被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、
(b)不足しているPKD2 mRNA転写産物へアンチセンスオリゴマーをハイブリダイズする工程であって、不足しているPKD2 mRNA転写産物が、PC−2タンパク質の機能的な形態をコードすることができ、少なくとも1つの保持されたイントロンを含む、工程と、
(c)PC−2タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたPKD2 mRNA転写産物を生成するために不足しているPKD2 mRNA転写産物から少なくとも1つの保持されたイントロンを除去する工程と、
(d)十分に処理されたPKD2 mRNA転写産物からPC−2タンパク質の機能的な形態を翻訳する工程、
を含む、方法。 - 保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である、請求項115に記載の方法。
- 不足しているPKD2 mRNA転写産物はPKD2 mRNA前駆体転写産物である、請求項115に記載の方法。
- PC2タンパク質の量と活性の不足によって引き起こされた疾病を抱える被験体を処置する方法であって、
SEQ ID NO:3−280のいずれか1つに対して少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、あるいは99%の配列同一性を備えたヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む、方法。
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