JP2018534942A - 単一分子対照 - Google Patents

Abstract

既知の核酸分子の所定のコピー数、例えば単一コピーをその中に有する反応塊を得るための方法が開示される。このような反応塊は、核酸増幅反応のための対照として有用であることができる。このような方法において有用な核酸構築物が更に記載される。この構築物は、第１の領域及び第２の領域を含み、ここにおいて、第２の領域は、第１及び第２のプライマー結合部位によって隣接されて、第２の領域中の増幅を可能にし、そしてここにおいて、選択的に開裂可能な領域が、第１及び第２の領域間に位置し、選択的に開裂可能な領域は、第３及び第４のプライマー結合部位によって隣接されて、選択的に開裂可能な領域中の増幅を可能にする。第２の領域は、全体の核酸分子の存在を示すレポーターとして作用し；そして選択的に開裂可能な領域は、第１の領域を第２の領域から分離するために開裂することができ、第１の領域の単離されたコピーを残す。

Description

本発明は、その中に既知の核酸分子の所定のコピー数を有する反応塊（reaction volume）を得るための方法に関する。このような反応塊は、核酸増幅反応のための対照として有用であることができる。本発明の側面は、このような方法において有用であることができる核酸分子に関する。本発明の更なる側面は、本明細書中に記載される。

分子診断試験は、これによって、ある種のＤＮＡ配列（又は他の分子種、例えばタンパク質）の存在（又は非存在）が、高い感受性及び特異性によって確認される方法である。感受性は、物理的に非常に少ない分析物のコピーが存在する場合でさえ、分析物を検出する能力である。特異性は、分析物を確実に検出するが、一方、対象の分析物と僅かにのみ異なることができる存在するいずれもの他の種を、誤って検出することができない能力である。感受性及び特異性の望ましい組合せは、多くの他の非常に類似した分子種が存在する試験試料中に存在する希薄な種が、高い正確さで検出される場合に達成される。高い感受性及び特異性は、しばしば達成することが困難であり、そして技術が目的のために適合しているか否かを判断されることに関して重要な考慮である。偽陰性は、低い感受性を有する試験によって発生されることができるが（試験の特異性に関わらず）、一方、偽陽性は、高い感受性の試験が、試験試料に非存在である分析物を検出するために使用される場合でさえ、低い特異性を有する試験の結果であることができる。

分子診断試験は、医学研究中にしばしば使用され、そして偽陰性の結果又は偽陽性の結果の帰結は、臨床の意思決定及び患者に対する適当な治療の選択に対して有害であることができる。

設定されたパラメーター内で行われた信頼性及び再現性のある結果を返すことが、いずれもの十分に最適化された分子診断試験の目的でなければならない。このような保証は、しばしば、試験試料と同時の対照試料の分析により得られる。これらの対照試料は、既知の内容であり、そして従って、これらの対照に対して行われる分子試験の結果は、予測可能である。既知の対照から予測される結果を発生することに対する失敗は、同時に試験された試験試料から発生されるいずれもの結果を、これらが正であれ又は負であれ無効にする。良好な対照は、試験試料から正の結果が発生される場合のように、実際の試験試料より失敗しやすく意識的に設計され、これは正の対照が更に正の結果を発生する場合に信頼される。良好な正の対照は、設計により、純粋に正の試験試料より標準的な試験条件下で更に失敗する可能性がある。これは、例えば、試験試料より大きい感受性に対する要求を対照に科する、試験試料中に存在するよりわずかな分析物の代表を含有する対照のためであることができる。有意義な対照管理の提供は、良好に設計され、そして信頼性のある分子診断試験の集合体に対する鍵である。

分子診断の分野において、ヒトゲノムのように複雑であることができる試験試料中の、ＤＮＡの単一分子のように低いものであることができる、非常に低いコピー数で存在するＤＮＡ分析物を、正確に試験することに対する必要性が存在する。試験分析物（ＤＮＡ配列）が、低い一桁のコピー数で存在し、そして複数の他の（類似の）ＤＮＡ種が存在することができる状況において、試験試料の正の結果の発生を証明し、そしてある程度、試験試料の負の結果の発生を証明するものであるための、低いコピー数の正の対照を提供する必要性が存在する。

対照、そして具体的には本明細書中に開示される発生の手段は、多くの増幅に基づく反応の感受性を証明するための幅広い用途を持つものであり、そして例えば、特定の法医学的ＤＮＡ増幅技術を使用する特定の法医学的標的の検出の効率を証明する法科学における用途であることができる。多くの他の適用も、既知の数の、特に単一分子である対照の提供によって更に可能にされるものである。本発明の最大の適用が予測される分野は、医学研究の分野、例えば血流感染の検出又は体細胞変異駆動発癌の分析である。

本発明の側面の目的の一つは、人工的な、そして操作可能な対照ＤＮＡ分析物の提供であり、これは、試験分析物の存在のための試験試料を調査するものと同一である試験成分（例えばＤＮＡプライマー）を使用して、試験試料と共に同時増幅することができる。対照のＤＮＡ分析物が、試験分析物（存在する場合）と同時に増幅されるために、対照ＤＮＡ分析物の検出は、構築されたような試験が、試験分析物がそれ自体非常に低い、そして恐らく単一コピーのように低いコピー数で存在するのみであっても、試験分析物の増幅が可能であり、信頼できる証明を提供する。然しながら、系の感受性は、更に、負の試験結果のある程度の証明を提供する：人工的に導入された単一コピーの対照が、大きな確実性を伴って検出された場合、この試験の設計の特徴は、負の試験試料の結果は、実際に試験試料中に試験分析物が一分子より少なく存在したためであり、そして従って試験試料は、試験分析物を真実に欠くということに、ある程度の信頼性を与える。

本発明の第１の側面によれば、第１の領域及び第２の領域を含んでなる核酸分子を含んでなる核酸カセットが提供され、ここにおいて、第２の領域は、第１及び第２のプライマー結合部位によって隣接されて、第２の領域中の（across the second region：第２の領域全体にわたる）増幅を可能にし、そしてここにおいて、選択的に開裂可能な領域は、第１及び第２の領域間に位置し、選択的に開裂可能な領域は、第３及び第４のプライマー結合部位によって隣接されて、選択的に開裂可能な領域中の（across the selectively cleavable region：選択的に開裂可能な領域全体にわたる）増幅を可能にする。

以下の詳細な説明から明白であるもののように、この核酸カセットは、反応塊が、その中に第１の領域を含んでなる所定のコピー数の核酸分子を有して調製されることを可能にする。簡単には、第２の領域は、全体の核酸分子（更に核酸カセットとも呼ばれる）の存在を示すレポーターとして作用するが；選択的に開裂可能な領域は、開裂されて、第１の領域を第２の領域から分離し、第１の領域の単離されたコピーを残すことができる。第２の領域は、本明細書中でレポーター領域と呼ぶことができる。第１の領域は、本明細書中で模倣体領域と呼ぶことができる（これが試験配列を模倣することを意図しているため）。

第１の領域は、第５及び第６のプライマー結合部位によって隣接されることができて、第１の領域中の増幅を可能にする。好ましい態様において、第５及び第６のプライマー結合部位は、所望の試験核酸配列に隣接するプライマー結合部位に対応する。“対応する”は、核酸分子中の所定のプライマー結合部位に結合することが可能なプライマーが、更に試験核酸配列中の対応するプライマー結合部位に結合することが可能であるものであることを意味する。これは、同じプライマーを、試験配列及び第１の領域（模倣体）の両方を増幅するためのアッセイ中で使用することができることを意味する。従って、第１の領域は、核酸増幅が好結果であることを確認するための対照として作用することができる。ある態様において、第５及び第６のプライマー結合部位は、対応するプライマー結合部位と同一ではあるが、他の態様においては、第５及び第６のプライマー結合部位は対応するプライマー結合部位と同じでない（例えば、これらは、１、２、３、４、５個、又はそれより多いヌクレオチドによって異なることができる）。プライマー結合部位が同じではない場合、これは、第１領域の核酸増幅の効率を減少し、これは、第１の領域が対照として使用される場合に好ましいことであることができる。

選択的に開裂可能な領域は、天然のヌクレアーゼ結合部位；例えば、制限酵素部位（これは開裂領域（又は複数）以外においてはカセット中に見出されてはならない）であることができる。合成ヌクレアーゼ、例えば金属複合体、又は操作されたヌクレアーゼ活性、例えばＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９及び誘導体も、定方向連鎖破壊を達成することができる。別の方法として、選択的に開裂可能な領域は、化学的開裂可能又は光開裂可能、或いは二つの組合せであることができる；これは、選択的に開裂されることができる修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分を含んでなることができる。例えば、核酸を感光性にするＯ−ニトロベンジル修飾、又は光活性化を可能にする７−ニトロ−インドール修飾及びその後の温和なアルカリ又は熱開裂である。

カセットは、それぞれがプライマー結合部位によって隣接される複数のレポーター領域を含んでなることができる。それぞれのレポーター領域は、その隣接物と選択的に開裂可能な領域によって分離されることができる。複数のレポーター領域は、複数の選択的に開裂可能な領域のように、好ましくは同一である。然しながら、ある態様において、複数のレポーター領域は異なっていることができる。

カセットは、複数の模倣体領域を含んでなることができる。それぞれの模倣体領域は、プライマー結合部位によって隣接されていることができる。ある態様において、複数の模倣体領域は異なっているが、一方、他において、複数の模倣体領域は同一である。同様に、複数のプライマー結合部位は、それぞれの模倣体領域が異なったプライマー対によって増幅することができるように、異なっていることができる。

カセットが複数のレポーター及び/又は模倣体領域を含んでなる場合、これらは、いずれもの特定の順序である必要はない。例えば、全てのレポーター領域は、一緒にグループ化されることができるか、又はこれらは模倣体領域と交互であることができ、或いはいずれもの他の順序を使用することができる。

核酸分子は、直鎖であることができるか、又はこれは、環状、例えば、プラスミドであることができる。
模倣体領域は、ある種の所望の特性；例えば、長さ、Ｇ／Ｃ組成、繰り返し配列の非存在、及び／又は二次構造を形成する能力を保有するために選択することができる。所望の特性は、核酸分子の所望の使用によって変化することができ；例えば、対照として使用される場合、模倣体領域の長さは、類似であるが、しかし所望の試験分析物の配列と同一である必要はなく、一つのアッセイで両者が増幅された場合、両者を容易に区別することが可能であるように選択することができる。所望の特性は、更に、対照の増幅を可能にする条件が、更に試験分析物の配列の増幅を可能にすることが予測されるものであるように、試験分析物の領域を模倣するように選択することもできる。

レポーター領域は、修飾されたヌクレオチドを含んでなることができる；例えば、ある種のヌクレオチドは、検出可能な標識で標識することができる。これは、レポーターとしてのその使用を援助することができる。別の方法として、レポーター領域は標識される必要はなく、そして幾つかの他の方法で；例えば、ｄｓＤＮＡを検出する染料の使用によって検出することができる。

核酸分子は、好ましくはＤＮＡである。
核酸分子は、固体支持体上に固定化することができる。固体支持体は、ビーズ、膜、吸着剤の表面、等であることができる。

更に提供されるものは、その上に明確に固定化された本明細書中の核酸カセットを有する固体支持体である。
本発明の更なる側面は、既知の核酸分子の所定のコピー数を得るための方法を提供し、この方法は：
（ａ） 本明細書中に記載されるとおりの核酸カセットを含有する複数の反応混合物の塊を調製し、少なくともある程度の前記塊が、前記カセットの所望の所定のコピー数を、統計的に含有する可能性があるようにし；
（ｂ） （ａ）の複数の塊のそれぞれを、カセットの選択的に開裂可能な領域を開裂することが可能な薬剤と混合して、これによって、第１の領域及び第２の領域を分離し；
（ｃ） （ｂ）の複数の塊のそれぞれを、カセットの選択的に開裂可能な領域に隣接する第３及び第４のプライマー結合部位に結合することが可能な核酸プライマーと混合し、そして増幅反応を行って、これによって開裂が起こらない塊の、選択的に開裂可能な領域中の配列を増幅し；そして増幅が起こった塊を廃棄し；
（ｄ） （ｃ）の残りの複数の塊のそれぞれを、レポーター領域に隣接する第１及び第２のプライマー結合部位と結合することが可能な核酸プライマーと混合し、そして増幅反応を行って、これによってレポーター領域中の配列を増幅し；そして増幅が起こらなかった塊を廃棄し；
（ｅ） これによって、そのそれぞれが、第１の領域を含んでなる所定のコピー数の核酸分子を含んでなる残りの複数の塊を提供すること；
の工程を含んでなる。

核酸カセットが、第１の領域に隣接する第５及び第６のプライマー結合部位を含んでなる態様において、（ｅ）中の複数の塊中の核酸分子は、更にプライマー結合部位を含んでなるものである。

（ａ）の複数の反応混合物の塊は、カセットを含んでなる水溶液の油中水乳液として調製することができる。それぞれの乳液の液滴が反応塊を表す。乳液は、好ましくはカセットを含んでなる水溶液を、油と混合することによって調製される。乳化は、油中への水溶液の混合、超音波処理、又は注入によって達成することができる。これは液滴の塊に対する大きい制御を可能にするために、この後者が好ましい。液滴は、ナノ、ピコ、又はフェムトリットル規模の塊であることができる。乳液は、液滴の分離の維持を補助するために界面活性剤を含有することができる。

乳液を調製する場合、所望のコピー数は、水溶液中の比較的低い濃度のカセットを使用することによって達成することができる。濃度は、これが、塊の大部分はカセットを含まないが、一方、少なくとも幾つかは所望のコピー数のカセットを含む（そして幾つかは所望のコピー数より多くを含むことができる）ものであるような塊内の統計的分布をもたらすように選択することができる。

好ましくは、カセットの好ましいコピー数は、１である。
核酸分子の所望のコピー数は、カセットの所望のコピー数と同じであることができる。これは、好ましくは１であり、そしてこれは、単一の第１の領域を有するカセットの使用によって達成することができる。別の方法として、核酸分子のコピー数は、カセットのコピー数より大きいことができる；カセットのコピー数の倍数であるコピー数は、一つより多い同一の第１の領域を有するカセットを使用して達成することができる。例えば、カセットが二つの第１の領域を有し、そしてカセットのコピー数が１である場合、核酸分子のコピー数は、２であるものである。

好ましくは、（ａ）の反応混合物の塊の大部分は、カセットのコピーを含まない。所望のコピー数のカセットを含有する“少なくとも幾つか”の塊によって、塊の少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．１、０．０１、０．００１％が、所望のコピー数を含有することを意味する。

一つ又はそれより多い、そして好ましくは全ての混合工程は、二つ又はそれより多い反応混合物の塊の融合によって行うことができる。これらの塊は、液滴、例えば油中水液滴の形態であることができる。液滴の融合は、マイクロ流体技術系を既知の技術で使用して行うことができる。例えば、適した技術は、マイクロチャンネル内の強制混合（Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２００６，６，１７４−１７８中に記載）又は誘電体上のエレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．２００９ Ｍａｙ ７；９（９）：１２３６−４２中に記載）による液滴間の衝突を含む。別の態様において、反応混合物の塊は、反応容器、例えばマルチウェルプレート内に含有することができる。これらの態様において、反応混合物は、これらを混合するために、反応容器に好結果で加えることができる。いずれもの方法は、核酸の増幅がｉｎ ｓｉｔｕで、例えばサーマルサイクル反応によって行われることを可能にする。

核酸の増幅は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含んでなる。核酸の増幅のために必要な試薬は、反応混合物の塊とそれぞれの工程で混合することができるか、又は最初の反応混合物の塊内に含有し、必要なプライマーのみがそれぞれの工程で加えられるようにすることができる。必要な試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、等を含むことができる。当業者は、如何に核酸の増幅を行い、そしてどの試薬が必要かを知っているものである。

核酸の増幅は、標識することができる。これは、増幅が起こっているか否かの容易な決定を可能にする。標識化は、染料、例えば蛍光染料で、反応混合物中の核酸の量を定量化するために行うことができる。例えば、ｄｓＤＮＡに結合する染料（例えばＳＹＢＲグリーン）を使用することができる。異なる増幅は、それぞれの増幅を区別することを可能にするために、異なった染料を使用することができる。別の方法として、標識されたヌクレオチドをそれぞれの増幅に組込むことができる。

工程（ｄ）は、更に増幅されたレポーター領域を定量化し、そして増幅された核酸の量が所定の閾値より上及び／又は下である反応混合物を廃棄することを含んでなることができる。例えば、これは、カセットの出発コピー数が、所望のコピー数より大きかったことを示すために使用することができる − このような場合、レポーター領域の出発コピー数は、予測より高いものであり、そして増幅されたレポーターの最終量も更に予測されたものより高いものである。

この方法は、（ｅ）の塊中に含有される第１の領域を含んでなる核酸分子を、固体支持体に結合する工程を含んでなることができる。例えば、支持体は、マイクロビーズ、膜、吸着物質、等であることができる。それぞれの塊は、別個の固体支持体に、又は固体支持体の別個の領域に結合することができる。この方法において、単一（又は所望のコピー数）の核酸分子は、固体支持体に結合することができる。この方法は、更に、固体支持体を、試験核酸を含有する反応混合物の塊と混合し、そして試験核酸を固体支持体上の結合された核酸（又は複数）にハイブリダイズすることを可能にする工程を含んでなることができる。この方法において、結合された核酸分子（既知のコピー数）を、相補的配列を含有する試験核酸を単離するために使用することができる。重要なことに、これは、既知のコピー数が単離されるものである。別の方法として、第１の領域を含んでなる核酸分子を、固体支持体（例えば、親水性及び疎油性物質、例えば、セルロース基剤濾紙）に吸着することができる。親水性及び疎油性の物質の使用は、核酸を含有する油中水液滴の水相を物質中に吸着させることを可能にするが（好ましくはその全てを）、一方、油相は吸着せず、そして除去することができる。

この方法は、更に（ｅ）において得られた塊を、核酸並びに第５及び第６のプライマー結合部位に結合するものであるプライマー対を含有する反応混合物の塊と混合し；混合した反応混合物の核酸増幅を行い；そしてｉ）第１の領域を含んでなる核酸分子の；及び／又はｉｉ）試験核酸の一部の核酸増幅が起こったか否かを決定する工程を含んでなることができる。これによって、第１の領域は、増幅反応が進行していることを示す対照として作用する。

この方法は、更に、（ｅ）において得られた塊を、異なった物理的特性を有する更なる反応混合物と混合する工程を含んでなることができる。例えば、更なる反応混合物は、より大きい塊、より大きい速度、又は両方を有することができる。

本発明の更なる側面は、試料中の試験核酸の存在を検出するための核酸アッセイを行うための方法を提供し、試験核酸は、先に記載したような核酸分子の第１の領域に隣接する第５及び第６のプライマー結合部位に対応する第５及び第６のプライマー結合部位によって隣接されている；この方法は：
（ａ）試験核酸を含有する試料を、先に記載したように調製した反応塊、及び第５及び第６のプライマー結合部位に結合するプライマー対と混合し；
（ｂ）混合した試料及び反応塊に対して核酸増幅反応を行い；
（ｃ）ｉ）第１の領域を含んでなる核酸分子の；及び／又はｉｉ）試験核酸の一部の核酸増幅反応が起こったか否かを決定すること；
を含んでなる。

本発明のなお更なる側面は、その上に吸着された既知のコピー数の核酸分子を有する親水性及び疎油性の物質を含んでなる固体支持体を提供する。
本発明のなお更なる側面は、標的既知のコピー数の核酸分子を単離するための方法を提供し、この方法は：
ａ）ｉ）それに接続された既知のコピー数の核酸分子を有する固体支持体を、ｉｉ）その少なくとも一つが、標的核酸分子の少なくとも一部が固体支持体に接続された核酸分子の一部と相補的である標的核酸分子である複数の核酸分子を含んでなる溶液と接触させ；
ｂ）固体支持体に接続された核酸分子が、標的核酸分子にハイブリダイズすることを可能にし；そして
ｃ）固体支持体を溶液から除去し；
これによって、ハイブリダイズされた標的既知のコピー数の核酸分子を単離する工程を含んでなる。

それに接続された既知のコピー数の核酸分子を有する固体支持体は、本明細書中に記載されるように、そして本発明の先行する側面に関して記載されるように調製することができる。既知のコピー数の核酸分子は、本発明の先行する側面に関して記載されるように調製することができる。

既知のコピー数の核酸分子は、二本鎖又は一本鎖であることができる。二本鎖である場合、この方法は、更にハイブリダイゼーションを可能にするための二本鎖核酸分子の変性の工程を含んでなることができる。更に、二本鎖である場合、好ましくは二本鎖分子の一本鎖のみが固体支持体に接続される。

分子の相補的部分は、好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０ヌクレオチドの長さである。相補的部分は、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％相補的である。

好ましくは既知のコピー数の核酸分子の少なくとも一部は、標的核酸分子の対応する部分に対して相補的ではない。即ち、両方の分子は、相補的部分を有し、そしてこれらに隣接する分子の部分は、分子が非相補的部分でハイブリダイズされないものであるように、相補的ではない。既知のコピー数の核酸分子の非相補的部分は、好ましくは固体支持体に接続されない分子の末端にある；好ましくはこれは３’末端である。更に又は代わりに、分子の更なる非相補的部分が、固体支持体に接続した末端に存在することができる；この部分は、既知のコピー数の核酸分子から発生されるいずれもの増幅産物に組込まれることができ、そして例えば特異的配列の標識又は更なる結合部位を組込むために使用することができる。

好ましくは既知のコピー数は、１である。
好ましくは、溶液は、標的核酸分子の複数のコピーを含んでなる；更に好ましくは、既知のコピー数より有意に多い標的核酸分子のコピーが存在する。

固体支持体は、好ましくはポリマービーズである。
好ましくは、それに接続された既知のコピー数の核酸分子をそれぞれ有する複数の固体支持体が提供される。

この方法は、更に、固体支持体及び標的核酸分子を、反応容器又は反応塊に送達する工程ｄ）を含んでなることができる。反応容器はウェルであることができる。好ましくはウェルは、単一の固体支持体のみを受け入れることが可能であるように設計される。この方法は、更に又は別に、捕獲した標的核酸分子を、既知のコピー数の核酸分子をテンプレートとして使用する重合反応によって伸長し、これによって更なる配列を、捕獲した標的核酸分子に組込む工程ｅ）を含んでなることができる。更なる配列は、好ましくは捕獲した標的に隣接して天然には見いだされない配列である；これは、例えば、既知のプライマー結合部位又は普遍的なプライマー部位を、標的分子に組込むために使用することができる。この方法は、標的核酸分子の少なくとも一部を増幅して、増幅された部分の複数のコピーを提供する工程ｆ）を、なお更に含んでなることができる。

図１は、標的分析物の配列を含有する試験核酸である。 図２は、核酸カセットを示す。 図３は、図２の核酸カセット及びカセット中のプライマー結合部位を認識するプライマーを示す。 図４は、図２の核酸カセットを含有する油中水乳液の微小液滴の調製を示す。 図５は、核酸カセット上の増幅に対するブロックの位置を示す。 図６は、核酸カセット上の感受性部位の位置、及び部位を通って増幅するプライマーの使用を示す。 図７は、開裂されたカセットの産生を示す。 図８は、カセットの感受性部位中の意図された増幅を示す。 図９は、所望の配列を含有する液滴及びそうではないもの間の識別を示す。 図１０は、既知のコピー数の既知の核酸配列を含有する反応塊を得るための方法の全体像を示す。 図１１は、この方法の結果として得られた反応混合物液滴を操作する異なった方法を示す。 図１２は、反応塊を使用する診断アッセイを示す。 図１３は、反応塊の増幅の結果を示す。 図１４は、別の核酸カセットを示す。 図１５は、別の核酸カセットを示す。 図１６は、試料中のレポーター配列の複数のコピーの検出を例示する。 図１７は、別の核酸カセットを示す。 図１８は、固体支持体に吸着された既知のコピー数の核酸分子の略図である。 図１９は、対照の模倣核酸配列の存在又は非存在を確認する方法を示す。 図２０は、固体支持体への対照の模倣核酸分子の接続を例示する。 図２１は、別の核酸カセットを示す。 図２２は、相補的核酸分子にハイブリダイズされた図２１のカセットから産生された単一分子の対照の模倣核酸を示す。 図２３は、核酸の相補的鎖にハイブリダイズされた核酸の一本鎖を安定的に接続したポリマービーズを示す。 図２４は、図２３のポリマービーズを使用する核酸の複数鎖からの核酸の一本鎖の回収を可能にする作業の流れを例示する。 図２５は、特異的にハイブリダイズされた相補的核酸鎖を非特異的に吸着された核酸鎖から区別するための方法を示す。 図２６は、捕獲された相補的に回収された核酸鎖の、新規な配列をその中に組込むための鎖の伸長を示す。 図２７は、捕獲された相補的に回収された核酸鎖の増幅及び配列決定のための表面への同時選択を示す。

本発明は、制御されたコピー数（通常１）の既知の、そして規定された核酸配列を含有する反応混合物又は反応塊の発生を可能にすることを意図する。この塊は、分子診断アッセイの対照として使用することができる。本発明は、人工的対照試料を提供する面から主として本明細書中に記載されるが、既知のコピー数の既知の核酸を含有する試料を発生することが望ましいことであることができる他の分野が存在することは認識されることである；従って、本発明は、対照配列の発生に制約されるものではない。

ＤＮＡの感受性及び特異性の試験技術は、近年増加し、試験分析物ＤＮＡ配列の単一の分子を、その試験分析物ＤＮＡ配列のクローン的増幅及び増幅された産物の、例えば次世代の配列分析による質量検出を含む多くの手段によって検出することが今や可能である。

然しながら、単一分子（又は非常に低い一桁のコピー）の検出は挑戦的である。いずれもの十分に開発されたアッセイは、非常に高い感受性及び非常に高い特異性を享受するはずであるが、しかししばしば、これらの一つを最大化することは他を損なう。例えば、血流感染（ＢＳＩ）の調査において、全血のミリリットル当り１コロニー形成単位（ＣＦＵ）のように低い病原体が存在する場合に、これは、臨床的に有意であることができる（そして患者は重症であることができる）。病原体及び恐らく特定の抗生物質の群に対する耐性を与えることができる抗細菌耐性（ＡＭＲ）遺伝子を、迅速に確認することが必要である。１０ｍｌの最小の血液抜き取り、及び病原体からのＤＮＡの調製が、そのＤＮＡの一部の損失を受けるものであることの受容により、分子診断試験が、大量（物理的及び配列の内容の両方）の‘汚染した’ＤＮＡの背景中の低い一桁のコピーの標的分析物を、正確に検出することが可能でなければならないものであり、そして適当な治療を選択する場合、臨床医が頼ることができる結果を報告すると考えることは非現実的ではない。

試験試料と同時に試験される対照の使用は、診断試験が予測される検証パラメーター内で行われるという自信を与える長く受け入れられた手段である。これは、アッセイの感受性が、試験試料中の低い単一分子の挑戦的レベルで行われるが、しかしこれまで、対照試料を、試験試料中で遭遇することができる非常に低いコピー数を正確に反映するために発生することを可能にする、簡単な、そして信頼性のある方法が存在しなかったことを証明することにおいて特別な関連性がある。

本明細書中に開示される本発明は、試験分析物の非常に低いコピー数及び配列構成を確実に模倣する人工的試験試料の提供を可能にする。試験分析物と共に同時増幅されるこのような対照の提供は、アッセイの性能を確認し、そして発生された試験の結果の正確さを確認することを可能にする。単一分子のレベルで試験される対照が納得できる正の結果を、まさに発生する場合、負の試験結果が存在する状況においても、この‘真の負’としての正確さは、かなりの程度確認される。

非常に少量のＤＮＡの増幅は、初期のサイクル中に統計的な変動性がある傾向があるが、試験分析物と同じ試験管中で、試験分析物と同じ増幅プライマー配列を使用して結果を発生する対照を試験することは、さもなければ試験アッセイの効率に影響することができる多くの実験変数の有効な‘標準化’を与える。試薬の絶対濃度、ピペット操作誤差及び温度変動、プラスチック器具並びに操作員の変動のような変数は、対照及び試験が、同じ反応容器中で試験される場合、自動的に制御される。これらの変数は、試験アッセイと別個の反応容器で行われた場合、対照の有用性を悪化させることができる。対照及び試験配列が同じ効率で増幅されることを確実にするために設計することができる他の因子は、例えば、増幅産物の長さであり、短い増幅産物をより大きい効率で増幅するための選択的バイアスが存在するためである。介在配列の‘ＧＣ’含有率も更に、如何に効率よく同一長さの配列を増幅するかに影響することができる。その対照を僅かに‘増幅し難く’することが有利であることができる場合、これらの及び他の因子は、対照中に計画的に設計することができ、そして従って、いずれもの良好な対照がそうであるべきなように、より失敗する傾向がある。可能な限り機能的に同等であるように設計した場合、プライマー結合部位、長さ及びＧＣ含有率並びに分布は、他の配列の考慮、例えばホモポリマーの実験及び二次構造を形成する能力と一緒に、標準化することができる。

本発明の詳細な説明が、例示の目的のためのみにここに与えられる。この例において、血流感染病原体の検出が見本として使用され、ここにおいて、感染の表示であるいずれもの病原体の核酸は、非常に低い（一桁）のコピー数で存在する可能性のあるものであることを予測することができる。この例は、更に、反応塊として、そして核酸カセットを含有する微小液体の使用を予想し；このような微小液体は、微小流体技術を使用することによって操作し、そして混合することを受け入れる。最初の液滴の更なる試薬との混合は、二つの液滴の融合によって、比較的素直に達成することができる。然しながら、再び、本発明は、微小液滴の使用に制約されるものではない。

図１は、試験核酸を示す。感染を示している（そして分子診断試験の標的である）ＤＮＡのセクションは、灰色斜線の箱１０１のように標識される。この試験分析物１０１は、有益なマーカーと考えることができ、そして例えば、白いブロック体矢印１０２及び１０３として表されるＰＣＲプライマーによって特異的に標的化されるＤＮＡ配列の領域によって結合又は隣接されている。ＰＣＲプライマーは、試験核酸内の適したプライマー結合部位に結合し、そしてプライマー１０２、１０３内の領域の増幅を（適した試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、及び緩衝剤の存在中で）可能にするものである。これらのブロック体矢印の方向付けを除き、順方向の１０２及び逆方向の１０３について更なる区別は行わない；この文書が“プライマー”又は“プライマー結合部位”を指す場合、このようなプライマー又は部位は、典型的には、増幅される配列に隣接するこのようなプライマー又は部位の対を指すことは理解されるものである。標的ＤＮＡの増幅のためのプライマー対の設計、選択及び使用は、よく理解され、そして当業者の能力の範囲内である。臨床試料から調製されたテンプレートＤＮＡは、この有益なマーカーの存在（そして恐らく半定量的存在）又は非存在を決定するために診断アッセイによって調べられるものである。

試験分析物１０１の診断的検出のための対照を提供するために、人工的核酸構築物が提供される。この人工的構築物は、図２に示すように、対照カセット２００と呼ばれる。対照カセット２００は、三つの共有的に結合した、別個の領域／特徴：
・分析物模倣体 ２０１
・レポーター ２０２
・感受性部位 ２０３
を含んでなる。

重要なことに、感受性部位２０３は、分析物模倣体２０１及びレポーター２０２の間に位置する。感受性部位２０３は、例えば、制限酵素開裂認識配列であることができる。分析物模倣体２０１及びレポーター２０２の配列は、必ずしもいずれもの天然に存在する配列に由来せず、そして従って、いずれもの最適に設計された配列であることができる。然しながら、典型的には、分析物模倣体２０１は、試験分析物１０１に対して少なくとも幾つかの類似性（例えば、長さ、Ｇ／Ｃ含有率、等）を有するように、しかし両方の配列が増幅される場合、それらから同等に識別可能なように選択されるものである。

分析物模倣体２０１及びレポーター２０２のＤＮＡ配列は、その選択において非拘束であるが、感受性部位２０３のＤＮＡ配列、並びに領域２０１、２０２及び２０３の三つの全てに隣接する配列は、特異的増幅プライマーが、これらの部位にハイブリダイズするために提供されることができるように拘束される。図３は、三つの領域２０１、２０２及び２０３は、互いに別個であるプライマーを使用して標的化することが可能であることを示す。然しながら、分析物模倣体２０１の増幅を標的とするプライマーは、図１の試験分析物１０１を増幅することが可能なプライマー１０２及び１０３と同一（又は少なくとも実質的に同一）であることに注目されたい。従って、試験分析物１０１及び分析物模倣体２０１が両方とも存在する試料において、これらの別個のＤＮＡ配列は、同じ順方向プライマー１０２及び逆方向プライマー１０３によって両方とも増幅されるものである。本発明のある態様において、分析物模倣体２０１の増幅は、必要ではないことができる；このような態様において、分析物模倣体２０１に隣接し、そしてプライマー１０２及び１０３に対応するプライマー結合部位の存在は、必須ではない。例えば、模倣体２０１を増幅反応の対照として使用することを意図せず、しかし所望の標的へのハイブリダイゼーションのために使用する場合、プライマー結合部位を含むことは、必須ではない。

プライマー３０１及び３０２は、レポーター２０２を増幅するために設計され、そしてプライマー３０３及び３０４は、核酸カセットがインタクトであることを条件として、感受性部位２０３を通して増幅するために設計される。ある態様において、プライマー３０３及び３０４の片方又は他方或いは両方は、アニールした場合これらのプライマーの鎖置換を援助するために、非テンプレートヌクレオチドの５’尾部を含むことができる。然しながら、これは、必須であるとは信じられず、そして好ましい態様において、プライマーは尾部を含まない。

プライマー１０２及び１０３は、カセット及び試験試料の両方へのハイブリダイゼーションを可能にし、そして従って、試験試料中に見出されるＤＮＡ配列に基づくように選択される。然しながら、プライマー３０１、３０２、３０３及び３０４は、いずれもの天然に存在する配列に由来する必要はなく、そして自由に最適化することができる。特に、プライマー３０１、３０２、３０３、及び３０４は、これらのプライマー並びにプライマー１０２及び１０３の標的部位、或いは実際に、これらのプライマー及びこれらのそれぞれの非標的部位間の望まないハイブリダイゼーションが存在しない（又は最小である）ように設計することができる。この設計戦略は、分析物模倣体２０１の意図しない増幅の機会を減少する；具体的には、プライマーは、模倣体領域２０１の望まない複製をもたらすことができるどこかをハイブリダイズすることが、これが、最終産物中のその領域の単一のコピーを産生する能力を、明らかに損なうことができるために、可能であるべきでない。同様に、模倣体領域２０１の配列は、更に望ましくないハイブリダイゼーションを減少又は排除するように設計することができる。従って、プライマー１０２及び１０３の配列並びにこれらのそれぞれの結合部位のみが、所望の標的配列によって拘束されることは理解されるものである；他の配列は、他の態様において、性能を最適化するために自由に設計することができる。ある態様において、その標的に対するプライマーのそれぞれの溶融温度も、更に又は代わりに、異なったプライマー：標的のハイブリダイゼーションの好ましい範囲の溶融温度に到達するように設計することができる。例えば、プライマー３０１及び３０２は、プライマー３０３及び３０４より低い溶融温度を有することができる。このような準備は、本発明の方法の実行中の望まない領域の増幅に対する更なる点検を可能にするすることができる。

本発明は、それによって単一コピー（又は他の既知のコピー数）の分析物模倣体２０１を、反応塊に送達し、そして従って、これを、試験分析物１０１の存在が評価される診断アッセイの対照として使用することができる方法を提供する。この方法の第１の工程は、対照カセット２００構築物を、単離された塊に、例えば‘油中水’液滴の乳液、又は他の小さい体積の反応室の形成によって分配することである。‘油中水’液滴のフォーマットは、図４及びそれ以降の見本として使用されるものである。

既知の濃度の対照カセット２００は、油と混合された場合、小さい体積（ナノ、ピコ又はフェムトリットル範囲の）液滴が作成されるように水溶液中で調製される。初期溶液中の対照カセットの濃度は十分に低く、形成される‘油中水’液滴の圧倒的な大部分が、対照カセット２００を完全に欠くものである；これらの液滴は、図４において４０２として識別されている。然しながら、非常に小さい数の液滴は、４０１として識別される対照カセット２００を含有するものであるが、しかし実質的に、いずれものこれらの４０１種は１個のコピーより多い対照カセット２００を含有しないものである。ポアソン分布を使用して、４０１液滴の大部分は、対照カセット２００の１個のコピーのみを含有するものである。従って、統計的には、液滴の少なくとも幾つかは、所望のコピー数の対照カセットを含有するものである。

初期溶液の濃度、及び使用される油の体積は、液滴中のカセットの所望の最終分布を達成するために変化することができる。
‘油中水’液滴を形成することができるための、激しい混合、超音波処理、又は油中への狭い狭窄中の水溶液の直接注入を含む、多くの手段が存在する。この最後の方法が、これが、得られる液滴の均一な体積を制御するための大きい可能性を与えるために好ましい。どの方法が選択されても、この方法の最終結果は、互いに別個に維持された非常に大きい数の液滴である（例えば、水溶液内の界面活性剤の包含による）。

液滴４０１及び４０２の混合された集団は、ここで個々に識別され、そして分離され、これは、対照カセット２００上の分析物模倣体２０１に連結した感受性部位２０３及びレポーター２０２の連続的利用によって達成される。

４０１／４０２集団が、例えば、レポーター２０２を増幅することによって直接分析された場合、これは、レポーター２０２となお同じ分子上にある模倣体２０１の望まない増幅の危険性があるものである。例えば、レポーター２０２の存在を確認する一つの可能性のある方法は、４０１／４０２混合物の個々の液滴を、プライマー３０１及び３０２を含む生化学物質を封入する液滴の別個の種と混合し、そして混合した液滴を増幅反応にかけるものである。レポーター２０２の存在は、レポーター２０２の増幅産物の蓄積をモニターすることにより（例えば）このように確認することができる。これは、ｄｓＤＮＡの増加した畜積の存在において蛍光が増加する染料を含めることによって達成することができる。然しながら、これがインタクトなカセットに対して行われる場合、プライマー３０２が、レポーター２０２を通って、プライマー３０１のための結合部位を通って、プライマー３０４のための結合部位を通って、インタクトな感受性部位２０３及びそのプライマー部位３０３を通って、そして分析物模倣体２０１によって表される領域、並びにその付属するプライマー結合部位１０２及び１０３を通って伸長するものである可能性が存在する。この望ましくない複製は、分析物模倣体２０１が、液滴内の単一のコピーとして、もはや存在しないものであることを意味するものである。分析物模倣体２０１のこの望ましくない複写は、線形であるものであり（指数関数に対して）、そして分析物模倣体２０１を一本の鎖上でのみ複製するものである。従って、分析物模倣体２０１の複製は、活性な伸長プライマー３０２の経路に対する、物理的遮断を導入することによって防止しなければならない。図５は、分析物模倣体２０１及びレポーター２０２間のこの遮断の位置決めを示す。

伸長プライマー３０２の経路を防止するものである遮断の特質は、例えば：
・ 逆方向プライマー３０２からの伸長の開始に必然的に先立つ、高親和性５’リン酸化（又は他の５’−３’エキソヌクレアーゼ消化抵抗性修飾）オリゴヌクレオチドの鎖分離テンプレートＤＮＡへのハイブリダイゼーション；
・ 脱塩基部位の組込み又は発生；
・ ‘ＰＣＲ停止物質’、例えばＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）の包含；
・ ＤＮＡ中の鎖ニック又は物理的切断の発生；
であることができる。

然しながら、遮断分子のハイブリダイゼーションに依存する系は、１００％有効であることを保証することができず、そして脱塩基部位、ＨＥＧ、又は他の化学的遮断剤の直接包含に依存する系は、対照ＤＮＡがもはや‘天然’ではないことを意味し、そして新しい標的試験分析物のための新しい対照配列を導入し、又は産生目的のための配列のコピーを発生するために必要であることができる将来の操作に対してあまり受け入れられない。

従って、本発明は、これによって模倣体２０１及びレポーター２０２が、レポーター２０２の検出の前に物理的に分離される方法を使用する。これは、レポーター２０２の増幅が、更に模倣体２０１の増幅の危険性を不注意にもたらさないことを確実にする。レポーター２０２のポリメラーゼ駆動の確認中の、分析物模倣体２０１による逆方向プライマー３０２の伸長を防止する最も魅力的な、そして有効な手段は、分析物模倣体２０１及びレポーター２０２の共有結合を、必然的にインタクトな対照カセット２００が特異的液滴４０１に送達された後に、物理的に破壊するものである。この物理的破壊は、分析物模倣体２０１及びレポーター２０２間の感受性部位２０３（しかし、対照カセット２００内のいずれもの他の領域が非存在であるとして確認された）の包含によって達成することができる。感受性部位２０３において認識又は切断する酵素を使用するカセット２００の制限酵素消化は、カセット２００を二つの部分に開裂するものである。感受性部位２０３は、オリゴヌクレオチドプライマー３０３及び３０４のハイブリダイゼーションを支持することができるＤＮＡ配列によって隣接されるために、この領域中の増幅は、開裂が起こったか否かを確認するために使用することができる。図６を参照されたい。

最初に、４０１及び４０２液滴の混合物内の液滴のどれが、対照カセット２００を実際に含有するかを決定するために、これらの液滴のそれぞれ一つを、それがこの構築物を含有するかのように処理しなければならず、そして感受性部位２０３を不活化する試みを行わなければならない（例えば、制限酵素によって）。従って混合物４０１及び４０２内に含有される液滴は、図７に示すような、感受性部位２０３の不活化（開裂）を行うために必要な生化学物質を含有する、更なる種の液滴７０１と個々に結合される。それぞれの結合された液滴は、不活化生化学物質が、その部位が存在する筈である感受性部位２０３を不活化するために十分な機会を有するようにインキュベートされる。この方法において、液滴４０１（これは対照カセット２００を実際に含有する）は、二つの可能な液滴種；感受性部位２０３の不活化が無効であり、そして分析物模倣体２０１及びレポーター２０２は連結したままである液滴７０２、及び不活化が有効であり、そして分析物模倣体２０１及びレポーター２０２が互いに分離された液滴７０３を与えるものである。対照カセット２００を含有しない液滴４０２は、液滴種７０４を与える。液滴７０４は、大多数の種であるものである。液滴７０３において、分析物模倣体２０１及びレポーター２００は、もはや官能性リンケージによって結合されていないが、両方のこれらの配列は、１：１のモル比で、そして恐らく二つの配列の単一のコピーとして存在することは注目されたい。

液滴７０２、７０３及び７０４を識別するために、プライマー３０３及び３０４による感受性部位２０３中の重合が行われる（図８）。これは、それぞれの個々の７０２、７０３及び７０４が、感受性部位２０３がなおインタクトである場合に、それ中の増幅を行うことが可能な生化学物質を含有する液滴種８０１との融合を必要とする。液滴８０１は、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝剤、及び増幅産物の蓄積のモニターを可能にするＳＹＢＲグリーン蛍光染料のようなｄｓＤＮＡ染料を含むことができる。本発明の幾つかの態様において、生化学物質の幾つかの成分は、本来発生された液滴４０１、４０２中に既に存在していることができる（例えば、対照カセットの出発溶液中のポリメラーゼ及びヌクレオチドの、しかしプライマーを含まない包含によって）。液滴種８０２、８０３及び８０４は、ＤＮＡ重合を起こすことを可能にするためにサーマルサイクルされ、そして個々の液滴のリアルタイムの、又は定点／終点の蛍光の評価が行われる。液滴８０２の蛍光の増加として評価される正の増加は、インタクトな感受性部位２０３の表示であり、そしてその液滴が種７０２から誘導されたことの識別である。液滴７０３及び７０４の両方は、プライマー３０３及び３０４によるサーマルサイクルにおける蛍光の増加の発生に失敗するものであり、そしてこれらの種８０３及び８０４は、更なる分析のために進めることができる。種８０２は、廃棄のために分離される。

最初に感受性部位２０３の不活化を評価することが、レポーター２０２領域（比較的少数の）を含有する液滴を最初に確認するより、好ましいことは注目される。これは、感受性部位２０３によって追従されるレポーター２０２を評価することが、先の正の蛍光の結果に対して構築された正の蛍光の結果の識別を必要とするものであるためである。これは不可能ではないものであるが、負の結果（感受性部位２０３中の増幅の失敗から）の後に発生される正の結果（レポーター２０２の評価から）を有することは、より明確であり、そしてより好ましいことであるものである。然しながら、この戦略は、対照カセット２００を欠く液滴種の大部分である非常に大量の種７０４の液滴の評価を要求する。

然しながら、本発明のある態様において、二つの異なった染料（例えば、異なった波長で蛍光を発する）を、レポーター２０２及び感受性部位２０３を評価するために使用する場合、レポーター２０２を最初に評価することが可能であることができる。これは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ伸長中のプローブの開裂後に蛍光を発生するＴａｑＭａｎプローブを使用することによって達成することができる。ＴａｑＭａｎプローブは、レポーター（波長１、存在の表示の正の結果）に、そして次いで感受性部位２０３（波長２、感受性部位２０３の好結果の開裂の指標の正の反応を発生することに失敗）に対して標的化することができる。

感受性部位２０３中の増幅に失敗した液滴８０３及び８０４は、レポーター２０２の存在の評価によってここに識別されなければならない。これらの液滴は、必要な生化学物質（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、等）、並びに更なるＳＹＢＲグリーンｄｓＤＮＡ染料を伴い、プライマー３０１及び３０２を潜在的に含有する液滴種９０１と、個々に結合される（図９）。図９は、これらの液滴の融合を示す。液滴９０２（レポーターを含有する）は、分析の初期段階から持ち越されたこの対照カセットのこの断片が、更に感受性部位２０３の逆方向プライマー３０４のハイブリダイゼーション（無効な）を支持することができるが、レポーター２０２の増幅を支持するものである。然しながら、先に記載したように、プライマー結合部位は、プライマーの“クロストーク”又は望ましくないハイブリダイゼーションを防止又は減少するように最適化することができる。この場合、プライマー結合部位は、プライマー３０４（感受性部位プライマー）及びプライマー３０２（レポーター２０２順方向プライマー）が重複しないように、そして互いに干渉しないように選択される。同様に、プライマー３０３（感受性部位２０３の順方向プライマー）は、初期の分析から持ち越されるものであり、そして再び、このプライマーは、これがプライマー１０３（分析物模倣体２０１逆方向プライマー）と重複しないように設計されるが、分析物模倣体２０１に無効にハイブリダイズすることができる。

結合された時点で、液滴９０２及び９０３は、レポーター２０２領域を、存在する場合、増幅するものである条件下でサーマルサイクルされる。液滴９０２のみが、この増幅を証明するものであり、そしてＳＹＢＲグリーン染料が、発生された増幅産物に結合した時点で蛍光の増加を発生するものである。

従って液滴９０２は、逐次的に：
・ インタクトな感受性部位２０３の証明に失敗した
・ レポーター２０２の存在を積極的に証明した
前駆体液滴から発生される。

従って、この液滴９０２は、感受性部位２０３の開裂によってレポーター２０２から分離された、分析物模倣体２０１及び隣接するプライマー結合部位を含んでなる核酸分子を含むことを確信的に決定する。この液滴は、対照カセット２００の本来の液滴内の低い出発濃度及び分布のために、単一のコピーの分析物模倣体２０１を含有するものであり（大部分の場合）、そして更にその独自性を確認するために使用された各種の分析の有機堆積物を含有するものである。この液滴が、プライマー１０２及び１０３による増幅によって、試験分析物１０１の存在を確認するために探索する診断アッセイに処理することができ、そして液滴９０２が宿す持ち越された生化学物質が、プライマー１０２及び１０３の性能に干渉しないと仮定すれば、この液滴９０２は、プライマー１０２及び１０３による増幅を受け入れられる単一コピーの分析物模倣体２０１を提供する。

液滴、融合及び排除の流れの全体像を、図１０に示す。液滴４０１及び４０２（液滴の出発集団、その幾つかは対照カセット２００を含有する）は、感受性部位２０３を開裂するための生化学物質を提供する液滴７０１と個々に結合される。このように作成された全ての液滴（７０２、７０３及び７０４）は、白色の箱内で、感受性部位２０３の不活化が完結するように所定の時間インキュベートされる。次いで全ての液滴７０２、７０３及び７０４は、前方へ流れ、ここでそれぞれは、灰色の円内で液滴８０１と個々に結合して、液滴８０２、８０３及び８０４を作成する。液滴８０１は、灰色の円内でサーマルサイクルされた場合、感受性部位２０３を通って増幅するための生化学物質を提供する。サーマルサイクル後、液滴８０２、８０３及び８０４は評価され（灰色の菱形）、８０２を開裂されない感受性部位中の増幅による蛍光として確認され、そして排除される。増幅を証明せず、そして従って、開裂された感受性部位２０３を含有するか、又は対照カセットを含有していないかのいずれかである液滴８０３及び８０４は、前方に流される。液滴８０３及び８０４は、黒色の円内で液滴９０１と個々に結合される。液滴９０１は、黒色の箱内でレポーター２０２を増幅するための生化学物質を提供する。

サーマルサイクル後、液滴９０２は、レポーター増幅のための蛍光があるとして（黒色の菱形内で）確認され、そしてこの方法の最終産物として回収される。非蛍光のままの、そして従ってレポーター２０２を欠く液滴９０３は、廃棄物として棄却される。

このスキームの有効性の最終的証明として、対照模倣体２０１配列にハイブリダイズするために設計されたＴａｑＭａｎプローブ及びこの領域を増幅するための生化学物質（プライマー１０２及び１０３）の提供を、液滴９０２を液滴９０３から識別するために使用することができ：種９０２のみが、レポーター２０２の存在を確認するために既に使用された染料（例えばＳｙｂｒグリーン）のものと、必然的に異なるチャンネルにおけるＴａｑＭａｎ反応の蛍光放出による正のＴａｑＭａｎ反応を支持する筈である。この確証的試験を、図１９に示すが、しかしこれは、スキームの成功の証明のみであり：この確認は、その‘単一分子’の認証情報を除外した液滴９０２内の２０１対照模倣体配列の増幅に明確に依存する。

製造中に、対照模倣体２０１の存在を確認するためのＴａｑＭａｎアッセイは行われないものである；対照模倣体２０１は、単一分子のままであるものである。液滴９０２の物理的特質を調節することは、その内容が診断アッセイに容易に導入されるようにそれを操作することを可能にするために望ましい。この操作のための多くの他の方法が存在するものであるが、図１１は、三つの代替手段を示す。選択肢１；液滴９０２の内容を、最終的な診断アッセイの反応室に、直接送達することが可能であることができる。選択肢２：液滴９０２の物理的特質を、これをもう一つの液滴１１０１（物理的に大きい塊として表されるが、しかし恐らく更に又は代わりに、高粘度／硬さを持つ）又は結合した液滴１１０２が‘処理される’（即ち、更なる反応室又は容器に、ピペットで入れ又は流されるように、容易に更に操作される）ことを可能にする幾つかの他の特徴と結合することによって変更することができる。選択肢３は、好ましい態様を示し、ここで、水性液滴９０２の全ての内容は、疎油性、親水性固体支持体マトリックス１１０３に吸着され、これは、分析物模倣体２０１の単一のコピーを安定な形式で保持し、そして産物１１０４（恐らく乾燥された）を診断アッセイに処理することを可能にし、その中で、吸着された分析物模倣体２０１の単一のコピーは、このアッセイの生化学物質のために使用可能である。固体支持体マトリックス１１０３は、例えば、セルロース又はセルロース基剤マトリックス、等を含んでなることができる。この方法の略図を図１８に示し、これは、左から右へ、その中に細孔を有するチャンネルに沿って通過する単一コピーの核酸分子を含有する液滴を例示する。細孔に隣接するものは、セルロースマトリックスである；図から知ることができるように、液滴は、その全体でマトリックスに吸着され（毛管現象及び受け入れられる親水性の組合せにより）、そして核酸はその上に保持される。マトリックスが疎油性であるため、油中水乳液からのいずれもの油は、吸着されないものであり、そしてチャンネル内に残るものである。これは、更に油の大きい粘度によって援助され、これは、細孔中の出口を遅延させるものである。このマトリックスは容易に処理され、そして運搬される。

更なる可能な操作は、再水和可能なペレットを形成するための液滴の乾燥を含むことができ、それぞれのペレットは、分析物模倣体２０１の単一の提示のみを含有する。好ましい態様において、先の分析のある程度の（又は全ての）有機堆積物は、これらの持ち越された成分が最終の診断アッセイにおいて許容され、そして除去する必要はないが、これらの成分が最終的な分子診断試験に干渉する場合、最終の所望の単一分子の液滴から除去することが有益であることができる。

他の態様において、単一コピーの核酸は、固体支持体に結合することができる（簡単に吸着させるだけでなく）；例えば、固体支持体は、ポリスチレンビーズ、誘導体化されたガラス表面、等であることができる。これは、核酸の別の用途、例えば核酸プローブとして作用することを可能にすることができる。本発明のある態様において、このような固体支持体は、それに単一コピーの核酸がハイブリダイズすることができる、もう一つの核酸の単一のコピーを単離することにおいて有用であることができる。単一コピーの核酸は、分子“釣針”（hook）又は“釣竿”（fishing rod）として作用し、そして所望の標的を含有する反応混合物中に置くことができる；標的は、釣針にハイブリダイズするものであるが、一方、固体支持体は、ハイブリダイズされた核酸が、その後操作されることを可能にする。単一のコピーの核酸の“釣竿”としての使用の更なる詳細は、図２０から２７に関連して本明細書中の他の場所に記載されている。

診断アッセイは、多くの反応容器中で行うことができる（油中水の液滴に基づくものとは対照的に）が、しかし本明細書中では、ＰＣＲ増幅に基づく系として開示される：アッセイは、抽出された試験試料（テンプレートＤＮＡ）、試験分析物１０１を増幅するために必要な生化学物質、及び分析物模倣体（本明細書中に開示される少なくとも三つの形式の一つ）の組合せを必要とするものである。この組合せは、図１２に線図的に表されている。

液滴９０２、‘修飾された’液滴１１０２又はマトリックス１１０４は、それぞれ分析物模倣体２０１の単一のコピーを宿す。これらの種の一つ（そして一つのみ）が、試験テンプレート１２０１及び試験分析物１０１／分析物模倣体２０１の増幅を支持するための生化学物質１２０２と組合される場合、反応容器１２０３は、試験分析物１０１（灰色斜線の箱）及び分析物模倣体２０１（黒色の箱）の同時増幅が可能であるものである。いずれもの適した手段による増幅された種のその後の検出／識別は、予測される正の対照分析物模倣体２０１が、試験分析物１０１から発生される正又は負の結果の有意性を報告することを可能にする。

例えば、サーマルサイクルによる容器１２０３内の増幅後、容器は、試験分析物１０１及び分析物模倣体２０１の複数のコピーを含有することができる。これらの増幅産物種は、その末端側終端において共通の配列を有するものであるが（両方がプライマー１０２及び１０３の伸長により発生されているため）、しかし別個の核配列を有するものである。図１３は、増幅後に、それぞれの種の多くのコピーが存在することができることを示す。存在する分析物模倣体２０１種の複数のコピーが存在するものであることが予測されるが、しかし、これらの絶対数は、増幅の初期のサイクル中の確率的変動の関数であるものである。従って、分析物模倣体２０１増幅産物及び試験分析物１０１増幅産物のコピー数の考慮は、最良でも半定量的であるものである。この確率的変動は、試験分析物１０１自体が非常に低いコピー数で、そして恐らく単一の提示のように低いコピー数のように存在することができる可能性によって複雑になる。試験分析物１０１が、試験試料に非存在である場合のみ、結果の１２０１は、ある意味で定量的であるものである。

容器１２０３中の試験分析物１０１の存在又は非存在とは無関係に、分析物模倣体２０１は、確信的に存在し、そして容器１３０１中で増幅されて、複数のコピーを与えるはずである。試験分析物１０１も更に存在する場合、これは増幅されるものであるが、しかしこれが非存在である場合、勿論、増幅に失敗するものである。分析物模倣体２０１増幅産物及び試験分析物１０１のコピー数の比較は、試験試料中の試験分析物１０１の相対的存在量のある程度の印象を与えることができるが、しかしこの比較は、最良でも半定量的であるものである。

図１９は、液滴、又は他の限定された種９０２として定義される反応塊が、対照模倣体２０１のコピーを実際に含有し、そして液滴種９０３が、この対照模倣体２０１を実際に欠くことの最終確認を示す。一つの最終液滴種の融合、又は他の生化学物質の送達により、対照模倣体２０１配列内でハイブリダイズするために設計された‘ＴａｑＭａｎ’プローブ１９０１は、プライマー１０２及び１０３による増幅において、プローブのフルオロフォア（Ｆ）及びクエンチャー（Ｑ）が、ＰＣＲ中のＤＮＡポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ（5’ to 3’ exonuclease）活性のために、互いに脱離した時点で、蛍光シグナルを発生するものである。ＴａｑＭａｎプローブに接続したフルオロフォアは、初期に種９０２を、種９０３と識別するために使用されたｄｓＤＮＡ結合染料のフルオロフォアと区別（スペクトル放出）されるように特異的に選択される。これは、液滴種９０２が、レポーター２０２領域の好結果の増幅及び検出のために、既に蛍光性であるものであるために必要である。液滴種９０２中のフルオロフォアＦの蛍光反応のモニター及び検出は、検出系が種９０２液滴を正しく特定することを排他的に確認する。もちろん、この最後の確認は、対照模倣体２０１配列を増幅し、そして産生スキーマを検証することにのみ使用される：これは、液滴種９０２の産生及び対照模倣体９０２の非常に低い、恐らく単一コピーの提示における単離中には、ルーチン的に使用されないものである。

系を、複数の分子の診断試験分析中の、一つより多い試験分析物を制御するために使用することを可能にする系の強化は想定されている。図１４は、別の対照カセット１４００内の更なる分析物模倣体１４０１の包含を示し、これは、なお単一のレポーター２０２を含む。二つの別個の分析物模倣遺体２０１及び１４０１は、互いに、そしてレポーター２０２から同一の（共通の）感受性部位２０３によって分離されている（そのそれぞれは、示されていない、共通のプライマー結合部位によって隣接されている）ことに注目されたい。制限消化による開裂に対して感受性である場合、図１４に示した部位における三つの部分への対照カセットの開裂を起こすものは、同じ制限酵素であるものである。それぞれの分析物模倣体２０１、１４０１は、それぞれの模倣体が模倣する試験分析物に隣接するものに対応する別個のプライマー結合部位によって隣接される。従って、それぞれの分析物模倣体２０１、１４０１は、適当なプライマリー対を使用することによって別個に増幅することができる。

両方の感受性部位２０３におけるこのカセット１４００の全部の消化は、片方又は他方或いは両方の分析物模倣体２０１及び１４０１の複製を防止することを証明する必要がある。不活化後のインタクトな感受性部位２０３の検出（部位２０３中の増幅による）は、これらが同一であるために、どちらの感受性部位２０３がインタクトなまま残っているかを明らかにできない。いずれにせよ、一つのインタクトな部位２０３は、棄却される液滴をもたらすものである。ある態様において、分析物模倣体１４０１及びレポーター２０２間に位置する感受性部位２０３のみが、レポーター２０２の分析中の分析物模倣体の複製を防止するために、絶対に必要であることができる（そして従って、二つの分析物模倣体２０１、１４０１は、感受性部位によって分離されず、そして最終液滴中で分離されないものである）。然しながら、確実さのために、そして両方の分析物模倣体を増幅するプライマーが存在する場合の増幅産物の混乱を防止するために、感受性部位２０３が分析物模倣体２０１及び１４０１間に位置することが好ましい。

系の更なる強化（図１５に示す）は、液滴４０１中に存在する対照カセット２００の単一のコピーのみが存在することを、更に確実に保証するために提供される。この強化は、レポーター２０２の増幅の初期のサイクル中に、このレポーター２０２の複数のコピーを含むことにより可能性のある、確率的変動を制約することを目標とする。図１５は、それぞれがその近辺から感受性部位２０３によって分離されたレポーター２０２の二つの同一のコピーの包含を伴う対照カセット１５００を示す。この二重のレポーター２０２の増幅は、定量化可能である反応を発生する可能性がより高く、そして分析の開始時に存在するレポーター２０２の提示の数が大きければ、確率的効果が、定量化可能な結果を供給する能力に影響するものである可能性が低い。レポーター２０２のその単一の提示を伴う本来の対照カセット２００が、レポーター２０２の分析において規模Ｎの反応を産生するものであるが、この対照カセット２００の二つのコピーは、規模２Ｎの反応を発生するものである。対照カセット１５００が使用される場合、同じシナリオは、２Ｎ（単一コピーのカセット）及び４Ｎ（二つのコピーのカセット）の反応を発生し、そして従って、差は、より大きい規模で、そして従って更に容易に識別可能であるものである。反応におけるこの工程の変化は、分析中の固定時点（終点に対して）において更に定量化可能であることができ、そして複数のコピーより、単一コピーの対照カセットの存在を確認することにおいて、より大きい確信を可能にする。

液滴４０１の異なった提示からの固定時点の（終点に対して）反応の比較は、考慮されるべき反応の分布、及び反応中のいずれもの重複を排除するための反応の二次分離に対する潜在性を可能にするものであり、ここで、最高の反応の、グレーな領域中のいずれもを一緒にした分離を排除することができる。図１６は、観察することができる反応の分布を、グラフ的に示す。対照カセット２００（又は１５００）の複数のコピーが液滴中に存在する場合、これは、制約された程度の増幅後（‘標準化された’終点ではなく、恐らく中間時点）に戻されるシグナルの強度を増加するものである。増幅の確率的特質のために、液滴内に存在する対照カセットの１、２及び３個の（及びより大きい）コピーに伴うピークが重複するものであることは可能であり、そして図１６の点線が、このレベルより大きいシグナルを示す全ての液滴４０１が、対照カセットの単一の提示より多くを含有するとして排除されるものであるレベルを示す。これらの出現が稀であるものであり、そしてこれらの液滴４０１の不十分なコピーが存在して、本明細書中に示されるように、ベル型の曲線の発生を可能にすることができることに注目されたい。この状況は、三つ又はそれより多い対照カセットの提示を含有する液滴に対して一層極端である。

図１７に示す系の最後の強化は、単一のカセット上の複数の別個の分析物模倣体２０１の提供及び複数の同一のレポーター２０２領域の提供である。これは、図１７に示すように、環状ＤＮＡ系、例えばプラスミド上であることができる。複数の分析物模倣体（単一コピー）の提供は、同じ液滴９０２を、同一アッセイ中の幾つかの異なった試験分析物１０１の多重分析において使用することを可能にする。レポーター２０２の遥かに大きい数のコピーの提供が更に示され、そして数が大きければ、単一コピーの対照カセットの存在及び一つより多い、又は複数のコピーの存在間の区別をより明確にすることができる。図１７中の例の構築物は、五つの別個の分析物模倣体２０１（異なった陰影によって示す）の単一コピーを宿し、ここで、これらのそれぞれは、（同一の）感受性部位２０３及び適当な試験分析物１０１から誘導される（別個の）プライマー結合部位によって隣接されている。対照カセットも、更に感受性部位２０３及び（同一の）プライマー結合部位（黒色のブロック体矢印、３０１及び３０２）によって同様に隣接される五つの同一のレポーター２０２（白色の箱）を示す。示されるように、それぞれの感受性部位（２０３）は、プライマー結合部位３０３及び３０４（灰色のブロック体矢印）によって隣接されている。この配置は、融通性があり、そして所望するように、更なる分析物模倣体２０１及び必要であることができるように、更なるレポーター２０２領域を適応させることができる。

上記の詳細な説明は、評価される分析物の検出を可能にする形式で、分析物の模倣体の単一のコピーを提供するために使用することができる系を提供するための、本発明の融通性及び信頼性を示す。

例示される態様を、液滴の調製の観点から記載してきたが、液滴の使用それ自体は、それに更なる成分を連続して加えることができる非常に小さい反応室（ナノリットルのウェル、例えば、Ｗａｆｅｒｇｅｎ ｏｒ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＤＸ）に依存する‘デジタルＰＣＲ’を行う方法が存在するために、必要としないことができる。例えば、デジタルＰＣＲチップのウェルへの、本来の希釈された対照カセット２００のポアソン分布後、感受性部位２０３不活化生化学物質、感受性部位２０３増幅生化学物質及びレポーター２０２増幅生化学物質を、これらのウェルに導入することができる。然しながら、対照カセットの単一コピーを含有するこれらのウェルの識別後、ウェルの全ての内容の回収が非常に困難であり得ることが予測されるために、これは好ましくない。然しながら、この方法は、このような回収を必要とせず、そして更なる反応が同じウェルで行われる場合、有用であることができる。この連続添加スキームは、一連の生化学が予測されるように行われることを証明するために、更に使用することができる。

望ましいことであることができるもう一つの強化は、制約され、そして定量化可能なレベルの増幅後のレポーター２０２配列の増幅の程度を評価することより、個々の液滴は、大量の並行増幅及び同時のリアルタイムＰＣＲ評価を、恐らく、レポーター２０２領域の存在の更に信頼性のある定量化を可能にするデバイス中で、最も有益に増幅されるものである。

先で注目したように、単一コピーの核酸配列は、分子‘釣針’又は‘釣竿’として使用するためにビーズ又は他の固体支持体に接続することができる。以下のセクションは、これを更に詳細に記載する。

単一分子捕獲ベヒクルとしての制御されたコピー数
感受性対照系としての使用を超えて、核酸の単一分子を確実に単離する能力の一つの魅力ある適用は、これ（その一本鎖の形態の）を種特異的分子‘釣針’として使用することの可能性である。固体表面、例えばポリマービーズに連結している場合、単一の連結ＤＮＡ配列の特異的ハイブリダイゼーション能力は、複数のＤＮＡ鎖を含有する溶液からの第２の単一ＤＮＡ鎖（相補的配列を保有する）の回収を可能にする。複数のＤＮＡ鎖は、全て相補的配列を保有することができるか、又は一定の比率の複数のＤＮＡ鎖のみが相補的配列を保有することができる。理想的には、ビーズ連結の単一分子が妥当な時間枠内に、相補的ＤＮＡ鎖と遭遇し、そして捕獲する可能性を最大にするために、相補的配列を保有する溶液中のＤＮＡ鎖の数は、ビーズに連結した単一分子と比較して大過剰であるものである。相補的配列は、最も好都合には、複数のＤＮＡ鎖内に存在することができるいずれもの他のＤＮＡ鎖配列との、ビーズ連結捕獲配列のクロストークハイブリダイゼーションに対する可能性を僅かに伴うか、又は伴わない高い特異性を可能にするために設計することができる。捕獲された時点で、溶液から回収されたＤＮＡ鎖は、次いで、ポリマービーズ上の非共有的に結合した‘パッセンジャー’として操作することができる。

上記の系は、ＮＧＳ反応の開始工程としての個々の分子（第２の単一のＤＮＡ鎖）の、地理的に離れたクローン増幅を播種するために、好都合に使用することができる。一つのみの非共有的に結合したパッセンジャーＤＮＡ鎖を、特異的な地理的領域に供給した後、同一配列の複数の（クローンの）コピーを発生することができる。これらのコピーの塩基の同調的ＮＧＳ照合は、ＤＮＡ鎖のそれぞれの個々の塩基位置で発生されるシグナル出力を最大にする。

配列されるＤＮＡ鎖の単一コピーの供給は、それぞれのビーズへの一つのみのＤＮＡ鎖を捕獲する能力、及びそれぞれの別個の地理的位置における単一のポリマービーズのみを収容する、地理的能力により確保される。例えば、複数のＤＮＡ鎖からの単一のＤＮＡ鎖の捕獲後、ＤＮＡ鎖を宿すビーズを、ウェルが、単一のビーズを収容するために十分に大きいが、しかし一つより多いビーズを収容するためには不十分に大きい寸法を有する別個のウェル構造に供給することができる。この地理的制約は、ウェルに付加された単一のビーズのみが常に存在するものであり、そしてこれは、ウェル当たりに付加される単一のパッセンジャーＤＮＡ鎖にのみ追従することを保証する。例えば、このような系は、ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＬｔｄへのＷＯ２０１４／０１３２６３中に記載されている。特に１５頁の２５行目から１６ページの１２行目；及び３９頁の６行目から４３頁の１５行目を参照されたい。これらの節は、ウェル当たりの制約された数のビーズを得て、そして核酸と複合したこのようなビーズの配列増幅及び／又は配列決定のために使用するための方法及び系を記載している。

溶液中の複数のＤＮＡ鎖からのＤＮＡ鎖の、ポリマービーズ表面への非特異的吸着は、配列決定系の地理的に別個の領域に供給されるＤＮＡの単一鎖（パッセンジャー）のみを確保するための吸引を、混乱させることが可能である。この可能性は、いずれものこのような非特異的吸着を制約する、捕獲後の厳密な洗浄及び／又はポリマービーズの選択／表面の化学的処理により最小にすることができる。更に、合法的に捕獲したＤＮＡ鎖（ハイブリダイゼーション捕獲）及び非特異的に吸着された配列間を、前者のみが潜在的にＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能なハイブリダイズされる３’ＯＨ末端を有することによって、識別することが可能である；ビーズに接続された捕獲配列は、ハイブリダイズ不可能な（即ち、捕獲に使用されない）要素を含むように特異的に設計することができ、これは、合法的に捕獲されたＤＮＡ鎖の３’末端の伸長において、捕獲されたＤＮＡ鎖の３’末端上のハイブリダイズ不可能な要素（捕獲に使用されない）への、相補的配列のＤＮＡポリメラーゼ仲介の組込みを駆動するものである。合法的に捕獲されたＤＮＡ鎖は、その後、クローン増殖戦略の必須の要素として使用することができるこの更なる配列を組込むその能力において独特である（下記）。

上記に詳述した系（システム）は、ここに図解の提示を使用して解明される。
図２０は、以前に示唆した、図９の最終的‘９０２液滴’種を、単一の反応性表面のポリマービーズを含有する新しい液滴種と融合した油中水液滴の操作を継続する。液滴９０２^＊（‘^＊’、この９０２種の内容は、以前と化学的に僅かに異なるため；以下を参照されたい）中に存在する単一のＤＮＡ分子の５’末端、及び液滴２００１内に含有されるポリマービーズの表面間の化学反応は促進され、９０２^＊液滴中に含有される（二本鎖）ＤＮＡの単一分子の化学的に活性な５’末端を共有的に連結する。液滴２００２内でこのように作成されたビーズ／ＤＮＡハイブリッドは、製造品であり、そしてそれのその後の使用と完全に独立して発生することができる。図２１は、単一コピーのＤＮＡ配列２０１の確認及び単離を可能にする以前に記載した‘対照カセット’である。この配列は、幾つかの試験分析物１０１に隣接するプライマーを模倣した、増幅プライマー１０２及び１０３（ここでは灰色で示される）のための結合部位によって以前は隣接されていたが、‘単一分子捕獲配列’の態様において、この‘捕獲配列’は、それ自体決して増幅されるものではないために、いずれかの特異的増幅プライマー配列によって隣接されるこの２０１配列を有する必要はない。むしろ、２０１捕獲配列は、ここで固体表面、例えばポリマービーズに連結することができる‘釣針’として作用する。従って、カセットＤＮＡのこの要素は、一つの鎖（単一コピーのままであることが予定された）の５’末端上で、ポリマービーズ上の表面の化学物質に共有連結が可能であるものである化学物質により官能化される。この官能化は、図２１中に星形２１０１によって表される。可能な官能化は、制約されるものではないが、アミン、チオール及びアルキンを含む。ビーズの表面（又は他の固体表面）の可能な対応する官能化は、ＮＨＳエステル、マレイミド又はアジド基であるが、これらの化学物質に制約されるものではない。

対照カセットが、制限消化（例えば）によって開裂され、そしてレポーター２０２の増幅により確認された時点で、放出された単一分子成分２０１は、図２２に提示されたＤＮＡ要素に似ていることができる。これは、反応性鎖２２０１及び非反応性鎖２２０２を含んでなる。反応性化学物質の修飾を宿す２２０１の５’末端は、本明細書中に示すような一本鎖である必要はないが、しかし決定的には、明るい灰色の鎖２２０２は、化学的に反応性のビーズの表面と反応し、そしてそれに安定的に接続するようになる能力を持たず、そして従って、これは、より暗色の反応性鎖２２０１の接続後、洗浄除去、又は他の方法で除去される。然しながら、本質的な接続された鎖２２０１の安定性を促進するために、２２０２鎖の持続を許容することが有益であることができる。

図２３は、製造品２３０１の一つの態様：核酸２２０１の安定的に接続した一本鎖を伴うポリマービーズを例示する。接続された２２０１鎖のより大きい統合性は、相補的２２０２鎖（明るい灰色の線）の持続を許容することによって、ビーズ／ＤＮＡハイブリッドに接続するｄｓＤＮＡの、２２０１に対する相補的配列を宿す複数のＤＮＡ鎖の存在中の変性まで促進することができる；競合は、本来ハイブリダイズした２２０２レムナント（明るい灰色の線）を伴うより、複数のＤＮＡ鎖の単一メンバーを伴うビーズに連結した２２０１捕獲配列のハイブリダイゼーションを支持するものである。解離後、接続した核酸は、特異的な、しかし人工の（即ち、必ずしもいずれもの天然に存在する核酸に関係しない）配列を曝露する。理想的には、この２３０１製造品は、大量の数で発生され、そして周囲温度で長期の時間安定であるものである。好都合には、接続した２２０１一本鎖核酸の３’末端は、複数のＤＮＡ鎖からのＤＮＡの一本鎖の捕獲に寄与しないものであるが、しかしこの３’末端へのヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼ仲介の組込みを邪魔するために十分な、少数の塩基に対して意図的に非相補的であるものである（更に図２５も参照されたい）。

図２４は、複数のＤＮＡ鎖からの単一のＤＮＡ鎖の回収及び限定された地理的位置へのその後のそれの供給を可能にする作業の流れを例示する。製造品２３０１^＊（Ｉ）は、特異的ハイブリダイゼーション能力を伴う核酸の単一の分子（この‘^＊’表示は一本鎖）を伴うポリマービーズとして表される。このビーズは、複数のＤＮＡ鎖（ＩＩ）と、ビーズ及び接続した一本鎖ＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡの‘スープ’中に存在するように、変性条件（例えば上昇した温度）で混合され、その一部は、少なくとも部分的に、そして理想的には完全に、そして差別的に、ビーズ（灰色の実線）に接続された２２０１核酸に相補的な配列を保有することができ、そしてその一部は、この相補的配列を保有することができない（灰色の点線）。変性条件が緩和された場合（例えば低温）、これは、ｄｓＤＮＡ形成（ＩＩＩ）を促進し、そして一本鎖核酸は、その相補性の程度に基づき二本鎖の会合を形成する。ＤＮＡ配列を部分的に、そして理想的には完全に、そして差別的に宿す、ビーズに接続された核酸配列に相補的な十分に過剰なＤＮＡ鎖が存在すると仮定すれば、このビーズ − 配列は、好都合には、存在する複数のＤＮＡ鎖の一つ（そして一つのみ）にハイブリダイズするものである。この特異的ハイブリダイゼーション後、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ又は幾つかのハイブリッド形態を問わない全ての他の核酸は、非接続の核酸を除去するために適当な厳密さで、しかしビーズに接続した配列からの単一の回収されたＤＮＡ鎖の会合を妨害することなく、ビーズ（ＩＶ）を洗浄することによって除去することができる。最後に、２４０１ビーズ（共有的に接続した捕獲配列及びハイブリダイズされた捕獲されたＤＮＡの単一分子）は、地理的に隔離され、サイズを狭窄された位置（Ｖ）に蓄積され、ここで、ハイブリダイズされた単一分子は、クローン的に増幅されて、明確に同時にＮＧＳに基づく照会を支持するために十分な同一のコピーを発生する。

図２５は、それによって、複数のＤＮＡ鎖から捕獲され、合法的にハイブリダイズされたＤＮＡ鎖のみを、非特異的吸着によりビーズ上に捕獲されたいずれものＤＮＡ鎖から識別することができる手段を示す。これらの非特異的に吸着されたＤＮＡ鎖の少なくとも幾つかは、ビーズに接続された配列２２０１に少なくとも部分的に相補的である配列を宿すことができる。図２５（Ｉ）において、黒色のビーズに連結した捕獲鎖２２０１に接続される一つの合法的に捕獲された鎖２５０１（明るい灰色の実線、図２４の複数の鎖から）が存在する。この捕獲された鎖２５０１は、結合された３’ＯＨ末端を有し、これは、‘伸長可能な３’末端’として標識される；これは、２２０１捕獲配列の３’末端が、設計により、伸長不可能であるために、この画像中で唯一の伸長可能な３’末端である。これは、２２０１の３’末端及び捕獲領域に隣接する捕獲された鎖２５０１の領域間の非相補性を確保することによって、最も容易に達成されるが、しかし更に、ＰＣＲ中にＤＮＡポリメラーゼによって受け入れられない、例えば、ＨＥＧスペーサー又は他の種の設置によっても達成することができる。ビーズ表面と非特異的に会合することとなることができるＤＮＡの他方の鎖は、明るい灰色の実線又は点線で示され、そして具体的には、これらの配列は、ビーズの表面に対して近位であり、そして複数のＤＮＡ断片からの２５０１分子の、初期のハイブリダイゼーション捕獲に関与しないＤＮＡ捕獲配列２２０１の、それに対する相補的配列を組込むことに失敗するものである（その伸長の可能性のない場合でさえ）。この配列（ビーズに対して近位のＤＮＡ捕獲配列に相補的な）は、図２５（ＩＩ）中の捕獲鎖の伸長可能な３’末端に加えられた、矢印付きの灰色の点線の伸長として示される。この加えられた配列は、合法的に捕獲された鎖２５０１のみ効率よく接続し、種２５０２を形成することができ、そしてこの加えられた配列は、この後、この合法的に捕獲された‘単一分子’のクローン増幅中の‘単一分子捕獲’系の必須の特質として使用することができる。

図２６は、捕獲された（２２０２餌食）配列、例えば核酸配列のライブラリーのメンバーが、捕獲（２２０１餌／釣針）配列にハイブリダイズされた場合、捕獲配列２２０２のハイブリダイズされた３’末端は伸長し、ビーズに共有的に接続していない産物２５０２を得ることができることを示し、そしてこれは、新規な３’末端を含み、これは、ビーズに対して近位の、ビーズに接続した捕獲配列２２０１の補体である。この新規な３’配列は、ライブラリー分子のクローン増幅中の必須の要素として関与するために今や使用可能であり、そして単一の捕獲ライブラリーの代表のみの増幅を可能にし、明るい灰色の鎖線区域のＮＧＳ分析を、例えば一般的な配列決定プライマーを使用して可能にする。好都合には、２２０２のハイブリダイズされた３’末端の捕獲及びＤＮＡポリメラーゼ伸長は、比較的低いＴｍで行われる。これは、その後の増幅のラウンドにおいて、Ｔｍを上昇することによる捕獲配列（餌）及び捕獲された配列（餌食）間の会合が好ましくないために、正しくハイブリダイズされた２２０２のみが伸長されるものであることを確実にし、ビーズが本来の合法的にハイブリダイズされた２２０２分子を置換し、そしてこれらの伸長を支持する時点で、いずれもの残存する非特異的に会合した鎖のために存在することができる可能性を最小にすることである。このような置換は、必須の配列が、侵入者の２５０１種上の合法的２５０１の３’末端に、増幅中の複数のＤＮＡ鎖から捕獲された一つの分子のみが、その後の増幅に打ち勝って、導入されることを潜在的に可能にするものである。新規な３’末端配列の、その後のクローン増幅のＴｍ（高いＴｍ）を識別するために、捕獲（及び初期の伸長のＴｍ（低いＴｍ）を選択することは、この可能性を最小にすることを確実にする。

図２７は、合法的にハイブリダイズされた図２６の産物のみを増幅するものである、灰色のブロック体矢印プライマー２７０１を使用する、ライブラリー分子の２５０２単一分子の増幅（ビーズ捕獲及び３’伸長；灰色の点線部分）を示す。ＰＣＲ駆動の標的ライブラリー発生中に導入される一般的配列にハイブリダイズする逆向きのプライマー２７０２（黒色のブロック体矢印）を使用して、単一分子２５０２は、地理的領域の制約（例えば、マイクロウェル）内で効率よく増幅することができる。十分な溶液相の増幅が起こった時点で、この溶液相増幅の産物は、プライマー２７０１^＊によって受け入れられるものであり、これは、これらの表面に接続したプライマー（溶液相内増幅の灰色のブロック体矢印２７０１と実質的に又は完全に同一）は、伸長するものであるように表面に接続され、そして地理的に制約された領域の表面に物理的に接続されるライブラリー増幅産物のコピーを産生する。本来のライブラリー断片のＰＣＲ駆動の産生中に、配列決定プライマーのハイブリダイゼーション域を提供する一般的配列を組込むことができ、そしてこの配列は、配列決定プライマー２７０３の接続及び一つの特異的な地理的に制約された領域内の、多くのクローン的に増幅された標的分子に対する、そして同時に、多くの別個の地理的に制約された領域（それぞれ異なった本来のライブラリー分子のコピーを含有）に対する、同じ一般的配列決定プライマー２７０３を使用する、同時のＮＧＳ反応の性能のために今や使用可能である。

１０１ 試験分析物
１０２ １０１／２０１の順方向プライマー
１０３ １０１／２０１の逆方向プライマー
２００ 対照カセット
２０１ 分析物（対照）模倣体
２０２ レポーター
２０３ 感受性部位
３０１ ２０２の順方向プライマー
３０２ ２０２の逆方向プライマー
３０３ ２０３の順方向プライマー
３０４ ２０３の逆方向プライマー
４０１ ２００を含有する液滴
４０２ ２００を含有しない液滴
７０１ ２０３の不活化のための生化学物質を含有する液滴
７０２ ２０３の不活化が無効な液滴
７０３ ２０３の不活化が有効な液滴
７０４ ２００を含有しない液滴
８０１ ２０３中の増幅を可能にする生化学物質を含有する液滴
８０２ ２０３が示された液滴
８０３ ２０３中の増幅に失敗した液滴
８０４ ２０３中の増幅に失敗した液滴
９０１ 生化学物質を含有する液滴
９０２ ２０１、２０２を含有する液滴
９０３ ２０１、２０２を含有しない液滴
１１０１ 例えばより大きい体積の液滴
１１０２ ９０２を含む、例えばより大きい体積の液滴
１１０３ 疎油性親水性固体支持体マトリックス
１１０４ ２０２を保持する固体支持体マトリックス
１２０１ 試験テンプレート
１２０２ 生化学物質
１２０３ 反応容器
１３０１ 反応容器
１４００ 別の対照カセット
１４０１ 更なる分析物模倣体
１５００ 二つの２０２を含む対照カセット
１９０１ ＴａｑＭａｎプローブ
２００１ ポリマービーズを含有する液滴
２００２ ビーズ／ＤＮＡハイブリッドを含有する液滴
２１０１ 官能化を示す星形
２２０１ 反応性鎖
２２０２ 非反応性鎖
２３０１ 製造品
２４０１ ビーズ
２５０１ 合法的に捕獲された鎖
２５０２ ビーズに接続されていない産物
２７０１ プライマー
２７０２ 反対方向プライマー
２７０３ 配列決定プライマー

Claims (59)

1. 第１の領域及び第２の領域を含む核酸分子を含む核酸カセットであって、前記第２の領域は第１及び第２のプライマー結合部位によって隣接されて、前記第２の領域中の増幅を可能にし、そして、選択的に開裂可能な領域が前記第１及び第２の領域間に位置し、前記選択的に開裂可能な領域は第３及び第４のプライマー結合部位によって隣接されて、選択的に前記開裂可能な領域中の増幅を可能にする、前記核酸カセット。
2. 前記第１の領域が、第５及び第６のプライマー結合部位によって隣接されて、前記第１の領域中の増幅を可能にする、請求項１に記載の核酸カセット。
3. 前記第５及び第６のプライマー結合部位が、所望の試験核酸に隣接するプライマー結合部位に対応する、請求項２に記載の核酸カセット。
4. 前記選択的に開裂可能な領域が、制限酵素結合及び／又は開裂部位である、請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸カセット。
5. 複数の第２の領域を含み、それぞれがプライマー結合部位によって隣接されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の核酸カセット。
6. 第２の領域のそれぞれが、その隣接物と選択的に開裂可能な領域によって分離される、請求項５に記載の核酸カセット。
7. 選択的に開裂可能な領域のそれぞれが同一である、請求項６に記載の核酸カセット。
8. 複数の第１の領域を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸カセット。
9. 複数の第１の領域のそれぞれが異なっている、請求項８に記載の核酸カセット。
10. 前記第１の領域が、所望の試験核酸配列の特性を模倣する特性を有するように選択される配列を伴う模倣領域である、請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸カセット。
11. 所望の試験核酸配列の特性を模倣する特性が、長さ、Ｇ／Ｃ組成、繰返し配列の非存在、及び二次構造を形成する能力からなる群から選択される一つ以上の特性を含む、請求項１０に記載の核酸カセット。
12. 前記第２の領域がレポーター領域である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の核酸カセット。
13. 前記カセットが、前記第１の領域の近辺の反応性基により、好ましくは前記カセットの末端で官能化されている、請求項１から１２のいずれか１項に記載の核酸カセット。
14. 前記カセットが、固体支持体上に固定化されている、請求項１から１３のいずれか１項に記載の核酸カセット。
15. 請求項１から１４のいずれか１項に記載の核酸カセットを含む、反応混合物。
16. 既知の核酸分子の所定のコピー数を得るための方法であって：
    （ａ）請求項１から１３のいずれか１項に記載の核酸カセットを含有する複数の反応混合物の塊を、少なくとも幾つかの前記塊が、前記カセットの所望の所定のコピー数を統計的に含有する可能性があるように、調製すること；
    （ｂ）（ａ）の複数の塊のそれぞれを、前記カセットの選択的に開裂可能な領域を開裂することが可能な薬剤と混合して、これによって、前記第１の領域及び前記第２の領域を分離すること；
    （ｃ）（ｂ）の複数の塊のそれぞれを、前記カセットの選択的に開裂可能な領域に隣接する前記第３及び第４のプライマー結合部位に結合することが可能な核酸プライマーと混合し、そして増幅反応を行って、これによって、開裂が起こらなかった塊の選択的に開裂可能な領域中の配列を増幅し；そして増幅が起こった塊を廃棄すること；
    （ｄ）（ｃ）の残りの複数の塊のそれぞれを、前記第２の領域に隣接する前記第１及び第２のプライマー結合部位と結合することが可能な核酸プライマーと混合し、そして増幅反応を行って、これによって、前記第２の領域中の配列を増幅し；そして増幅が起こらなかった塊を廃棄すること；
    （ｅ）これによって、そのそれぞれが、第１の領域を含む核酸分子の所定のコピー数を含む残りの複数の塊を提供すること；
    の工程を含む、前記方法。
17. 前記（ａ）の複数の反応混合物の塊が、前記カセットを含む水溶液の油中水乳液として調製される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記水溶液の濃度が、これが、前記塊の大部分はカセットを含まないが、一方、少なくとも幾つかは前記カセットの所望のコピー数を含むように、前記塊内の統計的分布をもたらすように選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記核酸分子の所望のコピー数が１である、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
20. （ａ）中の反応混合物の塊の前記大部分が、前記カセットのコピーを含まない、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記混合工程の一つ以上、そして好ましくは全てが、二つ以上の反応混合物の塊の融合或いは混合によって行われる、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記反応混合物の塊が、液滴の形態である、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅である、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 工程（ｄ）が、更に、前記増幅された第２の領域を定量化すること、及び増幅された核酸の量が、所定の閾値より上及び／又は下である反応混合物を廃棄することを含む、請求項１６から２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 更に、（ｅ）の前記塊中に含有される前記第１の領域を含む前記核酸分子を、固体支持体に結合する工程を含む、請求項１６から２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 更に、前記固体支持体を、試験核酸を含有する反応混合物の塊と混合し、そして前記試験核酸を、前記固体支持体上に結合された核酸（又は複数）にハイブリダイズすることを可能にする工程を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 更に以下の工程を含む、請求項２５に記載の方法：
    ａ’）ｉ）前記第１の領域を含む核酸分子を結合させた前記固体支持体を、ｉｉ）少なくともその一つが前記標的核酸分子である複数の核酸分子を含む溶液と接触させること、ここで、標的核酸分子の少なくとも一部が前記固体支持体に接続された核酸分子の一部と相補的である；
    ｂ’）前記固体支持体に接続された前記核酸分子を、前記標的核酸分子にハイブリダイズさせること；そして
    ｃ’）前記固体支持体を溶液から除去すること；
    これによって、前記ハイブリダイズした標的核酸分子を既知のコピー数で単離すること。
28. 前記第１の領域を含む前記核酸分子が二本鎖であり、そしてここにおいて、前記二本鎖分子の一本鎖のみが前記固体支持体に接続する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第１の領域を含む前記核酸分子の少なくとも一部が、標的核酸分子の対応する部分と相補的ではない、請求項２７又は２８のいずれかに記載の方法。
30. 前記第１の領域を含む前記核酸の非相補的部分が、前記固体支持体に接続されていない分子の末端にある、請求項２９に記載の方法。
31. 前記溶液が、前記既知のコピー数より有意に多い前記標的核酸分子のコピーを含む、請求項２７から３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記固体支持体が、ポリマービーズである、請求項２７から３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 更に、前記固体支持体及び前記標的核酸分子を、反応容器又は反応塊に送達する工程ｄ’）を含む、請求項２７から３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 更に、前記第１の領域をテンプレートとして含む前記核酸分子を使用する重合反応によって、前記捕獲された標的核酸分子を伸長し、これによって、更なる配列を、前記捕獲された標的核酸分子に組込む工程ｅ’）を含む、請求項３３に記載の方法。
35. 更に、前記標的核酸分子の少なくとも一部を増幅して、前記増幅した部分の複数のコピーを提供する工程ｆ’）を含む、請求項３３又は３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 更に、（ｅ）の塊中に含有される前記第１の領域を含む前記核酸分子を、固体支持体中に又はその上に吸着する工程を含む、請求項１６から２４のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記固体支持体が、親水性及び疎油性である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記固体支持体が、セルロース基剤マトリックスである、請求項３６又は３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 請求項１６〜２４又は３６〜３８のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の領域が、所望の試験分析物核酸配列に隣接するプライマー結合部位に対応する第５及び第６のプライマー結合部位によって隣接され；
    更に、（ｅ）中で得られた前記塊を、前記第５及び第６のプライマー結合部位に結合することになる試験核酸及びプライマー対を含有する反応混合物の塊と混合し；前記混合した反応混合物に対する核酸増幅を行い；そしてｉ）前記第１の領域を含む前記核酸分子の；及び／又はｉｉ）前記試験核酸の一部の、核酸増幅が起こったか否かを決定する工程を含む、前記方法。
40. 更に、（ｅ）中で得られた前記塊を、異なった物理的特性を有する更なる反応混合物と混合する工程を含む、請求項１６から２４のいずれか１項に記載の方法。
41. 試料中の試験核酸の存在を検出するための核酸アッセイを行うための方法であって；
    （ａ）試験核酸を含有する試料を、所望の試験核酸配列に隣接するプライマー結合部位に対応する、第５及び第６のプライマー結合部位によって隣接される第１の領域を有する既知のコピー数の核酸分子；及び前記第５及び第６のプライマー結合部位に結合するプライマー対と混合し；
    （ｂ）前記混合した試料及び反応混合物に対して核酸増幅反応を行い；
    （ｃ）ｉ）前記第１の領域を含む前記核酸分子；及び／又はｉｉ）前記試験核酸の一部の核酸増幅が起こったか否かを決定すること；
    を含む、前記方法。
42. 前記既知のコピー数の核酸分子が、請求項１２〜３８又は４０のいずれか１項に記載の方法によって調製される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記既知のコピー数が１である、請求項４１又は４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 既知のコピー数の核酸分子がその上に吸着された、親水性且つ疎油性の固体支持体を含む産物。
45. 前記固体支持体が、セルロース基剤マトリックスを含む、請求項４４に記載の産物。
46. 前記固体支持体が、ポリマービーズを含む、請求項４４に記載の産物。
47. 前記核酸分子が、所望の試験核酸配列に隣接するプライマー結合部位に対応する第５及び第６のプライマー結合部位によって隣接される第１の領域を含む、請求項４４から４６のいずれか１項に記載の産物。
48. 前記既知のコピー数の核酸分子が、請求項１２〜３８又は４０のいずれか１項に記載の方法によって調製される、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の産物。
49. 標的核酸分子を既知のコピー数で単離するための方法であって：
    ａ）ｉ）既知のコピー数の核酸分子が接続された固体支持体を、ｉｉ）少なくともその一つが標的核酸分子である、複数の核酸分子を含む溶液と接触させること、ここで、前記標的核酸分子の少なくとも一部が前記固体支持体に接続された前記核酸分子の一部と相補的である；
    ｂ）前記固体支持体に接続された前記核酸分子を、前記標的核酸分子にハイブリダイズさせること；そして
    ｃ）前記固体支持体を前記溶液から除去すること；
    これによって、前記ハイブリダイズした標的核酸分子の既知のコピー数を単離すること；
    の工程を含む、前記方法。
50. 既知のコピー数の核酸分子が接続した前記固体支持体が、請求項１４又は２５〜３８のいずれか１項によって調製される、請求項４９に記載の方法。
51. 前記既知のコピー数の核酸分子が二本鎖であり、そしてここにおいて、前記二本鎖分子の一本鎖のみが前記固体支持体に接続される、請求項４９又は５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記既知のコピー数の核酸分子の少なくとも一部が、前記標的核酸分子の対応する部分に対して相補的でない、請求項４９から５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記既知のコピー数の核酸分子の非相補的部分が、前記固体支持体に接続されていない前記分子の末端にある、請求項５２に記載の方法。
54. 前記既知のコピー数の核酸分子の非相補的部分が、前記固体支持体に接続された前記分子の末端にある、請求項５２又は５３のいずれかに記載の方法。
55. 前記溶液が、前記既知のコピー数より有意に多い前記標的核酸分子のコピーを含む、請求項４９から５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記固体支持体が、ポリマービーズである、請求項４９から５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 更に、前記固体支持体及び前記標的核酸分子を、反応容器又は反応塊に送達する工程ｄ）を含む、請求項４９から５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 更に、捕獲された前記標的核酸分子を、前記既知のコピー数の核酸分子をテンプレートとして使用する重合反応によって伸長し、これによって、前記捕獲された標的核酸分子に更なる配列を組込む工程ｅ）を含む、請求項５７に記載の方法。
59. 更に、前記標的核酸分子の少なくとも一部を増幅して、前記増幅された部分の複数のコピーを提供する工程ｆ）を含む、請求項５７又は５８のいずれか１項に記載の方法。

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